ES2912875T3 - Método para la detección y la determinación de la cantidad de galacto-oligosacáridos - Google Patents

Método para la detección y la determinación de la cantidad de galacto-oligosacáridos Download PDF

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Abstract

Un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido en una muestra que contiene galacto- oligosacárido y dextrina, comprendiendo dicho método: (i) hacer que un reactivo de derivación reaccione con la muestra para derivar un azúcar que incluye la dextrina y el galacto-oligosacárido, (ii) separar la 4'-galactosil lactosa como componente de galacto-oligosacárido en la muestra mediante cromatografía líquida de alto rendimiento usando una columna de cromatografía de fase inversa C30, y (iii) detectar y cuantificar la 4'-galactosil lactosa, seguido de calcular a la inversa la cantidad obtenida para determinar la cantidad total de galacto-oligosacárido en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la detección y la determinación de la cantidad de galacto-oligosacáridos
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido en una muestra que contiene galacto-oligosacárido y dextrina.
Antecedentes de la técnica
El galacto-oligosacárido es una mezcla de oligosacáridos, constituido cada uno por galactosa como componente principal y teniendo un modo de enlace diferente, y se fabrica, generalmente, haciendo que la lactosa experimente una reacción de transición usando p-galactosidasa. Se ha indicado que el galacto-oligosacárido tiene beneficios fisiológicos, tales como el aumento de las bifidobacterias en los intestinos para regular el entorno entérico y la reducción de la grasa mesentérica, contribuyendo, de ese modo, a la prevención de las enfermedades en adultos, y desde hace algún tiempo se ha considerado útil como alimento para uso sanitario especificado, alimento funcional o material del mismo. Si el galacto-oligosacárido se usa como componente de alimento para uso sanitario específico, etc., se deben mostrar los datos de análisis cuantitativo para garantizar su calidad, cumplimiento con las normas y uso como componente funcional y, por consiguiente, existe la necesidad de establecer un método de cuantificación altamente preciso.
Un método para cuantificar los galacto-oligosacáridos en bebidas o alimentos consiste en añadir p-galactosidasa para que actúe sobre el galacto-oligosacárido, cuantificar la galactosa producida como resultado de la descomposición enzimática y calcular la cantidad de oligosacárido (Bibliografía no de patentes 1). Sin embargo, la detección de la galactosa que se produce requiere una cromatografía líquida de alto rendimiento de intercambio aniónico equipada con un costoso detector electroquímico de tipo pulso, lo que mantiene baja la utilidad general de este método. Asimismo, cuando la bebida o el alimento contiene lactosa u otros componentes nutritivos, la galactosa producida mediante el tratamiento enzimático no se puede discriminar de la galactosa que se separa de la lactosa, lo que, en consecuencia, reduce la precisión de cuantificación del galacto-oligosacárido.
Está disponible otro método, mediante el que se cuantifica un componente característico en el galacto-oligosacárido, tal como 4'-galactosil lactosa (4'-GL; Galp1-4Galp1-4Glc), y se calcula a la inversa la cantidad total de galactooligosacárido a partir de la cantidad de 4'-GL. Este método resulta particularmente eficaz cuando se conoce el contenido de 4'-GL en el galacto-oligosacárido a usar y este contenido es estable de un lote a otro. En la cuantificación de 4'-GL en una muestra de bebida o alimento, convencionalmente, se usa principalmente un método para separar otros componentes en la bebida o el alimento de la 4'-GL mediante una cromatografía de filtración en gel basada en el tamaño molecular.
Tal como se ha mencionado anteriormente, sin embargo, el galacto-oligosacárido se usa a menudo como material funcional en bebidas y alimentos ricos en nutrientes, tales como leche en polvo formulada para lactantes y productos lácteos fermentados, y, en muchos casos, estas bebidas y alimentos contienen fuentes de azúcar cuya molécula es equivalente en tamaño a la de la 4'-GL, en cuyo caso estas fuentes de azúcar no se pueden separar de la 4'-GL mediante la cromatografía de filtración en gel. Por ejemplo, el intento de separar y cuantificar la 4'-GL en bebidas o alimentos que contienen maltotriosa, que es un tipo de azúcar contenido en la dextrina, mediante la cromatografía de filtración en gel, daría como resultado picos superpuestos de las dos sustancias que se han eluido de la columna porque la maltotriosa tiene el mismo tamaño molecular que la 4'-GL, lo que afecta, por tanto, a la cuantificación de la 4'-GL o, específicamente, a la cuantificación del galacto-oligosacárido.
Entre los métodos para detectar el oligosacárido mediante una cromatografía de fase inversa, se conoce uno que usa una columna de cromatografía de fase inversa C8 o C18 (Bibliografía de patentes 1). Sin embargo, el intento de separar el galacto-oligosacárido en bebidas o alimentos utilizando tal columna no lograría separar el componente de galacto-oligosacárido de otros componentes en la bebida o el alimento.
Bibliografía de los antecedentes de la técnica
Bibliografía de patentes
Bibliografía de patentes 1: traducción al japonés publicada de la solicitud de patente internacional PCT n.° 2007­ 523352
Bibliografía no de patentes
Bibliografía no de patentes 1: J. de Slegte et al. Determination of trans-Galactooligosaccharides in Selected Food Products by lon-Exchange Chromatography: Collaborative Study, Journal of AOAC International, Volumen 85, Número 2, marzo de 2002, páginas 417-423(7)
Sumario de la invención
Problemas a resolver mediante la invención
Por consiguiente, un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un método para la cuantificación con precisión de la 4'-GL y el galacto-oligosacárido mediante la separación de la 4'-GL con facilidad y a un coste bajo de una muestra que contiene galacto-oligosacárido y dextrina.
Medios para la resolución de los problemas
Después de estudiar en profundidad a fin de lograr el objeto mencionado anteriormente, los inventores de la presente invención completaron la presente invención después de hallar que, haciendo que una muestra que contiene galacto-oligosacárido y dextrina reaccione con un reactivo de derivación para derivar la dextrina y el galacto-oligosacárido en la muestra y, a continuación, sometiendo el resultado a cromatografía líquida de alto rendimiento usando una columna de cromatografía de fase inversa C30, se puede separar suficientemente la 4'-galactosil lactosa (4'-GL) como componente de galacto-oligosacárido en la muestra.
En otras palabras, la presente invención es un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido, que proporciona un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido en una muestra que contiene galacto-oligosacárido y dextrina, caracterizado por que se hace que la muestra reaccione con un reactivo de derivación para derivar la dextrina y el galacto-oligosacárido en la muestra, tras lo que la 4'-GL, como componente de galacto-oligosacárido en la muestra, se separa mediante la cromatografía líquida de alto rendimiento usando una columna de cromatografía de fase inversa C30.
Efectos de la invención
De acuerdo con el método de detección y cuantificación propuesto mediante la presente invención, se pueden separar con facilidad y a un coste bajo la 4'-GL como galacto-oligosacárido y otros componentes de la muestra para permitir una cuantificación precisa del galacto-oligosacárido. Mediante el uso del método propuesto mediante la presente invención para detectar y cuantificar el galacto-oligosacárido en bebidas, alimentos, etc., se puede tratar con precisión la cantidad de galacto-oligosacárido contenida en la bebida, el alimento, etc. para permitir el aseguramiento de la calidad, al tiempo que también se permite la adquisición y visualización precisas de diversos datos de ensayo de eficacia, etc.
Breve descripción de los dibujos
[FIG. 1] Cromatograma de HPLC que usa una columna de filtración en gel
[FIG. 2] Cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP
Figure imgf000003_0001
(C30)
[FIG. 3] Cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP (columna de fase inversa C18) [FIG. 4] Cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP (columna de fase inversa C8) [FIG. 5] Cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP (C30) en solución de ta fmospfóanto d dee potasio (pH 4)/CHaCN (78/22)
[FIG. 6] Cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP (C30) en solución de tampón de fosfato de potasio (pH 5)/CHaCN (79/21)
[FIG. 7] Cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP (C30) en solución de tampón de fosfato de potasio (pH 7)/CHaCN (81/19)
[FIG. 8] Cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP (C30) en solución de tampón de fosfato de potasio (pH 7)/CHaCN (82/18)
[FIG. 9] Cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP (C30) en solución de tampón de fosfato de potasio (pH 8)/CHaCN (82/18)
[FIG. 10] Cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP (C30) en solución de tampón de fosfato de potasio (pH 8)/CHaCN (83/17)
[FiG. 11] Cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP (C30)
Modo para llevar a cabo la invención
El método de detección y cuantificación propuesto mediante la presente invención es de tal manera que el galactooligosacárido contenido en una muestra de una bebida, un alimento, etc. se deriva y, a continuación, el resultado se somete a cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés) usando una columna de cromatografía de fase inversa C30, separando, de ese modo, la 4'-galactosil lactosa (4'-GL, por sus siglas en inglés) como galacto-oligosacárido de otros componentes en la muestra y cuantificando la 4'-GL separada como galactooligosacárido. El galacto-oligosacárido es una mezcla de disacárido respecto a hexasacárido cuya molécula contiene una o más moléculas de galactosa, que se expresa mediante la Fórmula general Gal-(Gal)n-Glc (en donde Gal representa un grupo galactosa residual, Glc representa un grupo glucosa residual y n es un número entero de 0 a 4). Se debe señalar que la lactosa no está contenida en el galacto-oligosacárido.
El componente principal del galacto-oligosacárido es una 4'-galactosil lactosa (4'-GL) de trisacárido, que comprende lactosa y una galactosa unida a su extremo no reductor. Otros componentes específicos incluyen Galp1-3Glc, Galp1-2Glc, Galp1-6Glc, Galpi-6Galpi-4Glc, Galpi-6Galpi-4Galpi-4Glc y Galpi-4Galpi-4Galpi-4Glc o similares. En el método de detección y cuantificación propuesto mediante la presente invención, se puede detectar y cuantificar el galacto-oligosacárido como mezcla o se puede detectar y cuantificar un componente de galacto-oligosacárido individual; desde el punto de vista de la precisión de la cuantificación, sin embargo, la 4'-GL se separa y, a continuación, se detecta y cuantifica, seguido de un cálculo a la inversa de la cantidad obtenida para determinar la cantidad total de galacto-oligosacárido.
El galacto-oligosacárido se puede obtener de cualquier manera; por ejemplo, se puede usar el galacto-oligosacárido producido por medio de una reacción de transición usando lactosa como material y enzima de descomposición de lactosa (p-galactosidasa). Durante la reacción de transición, se puede añadir un microorganismo que produzca enzima para que actúe sobre el material. Los ejemplos de materiales que contienen lactosa incluyen lactosa, leche, leche en polvo, suero de queso o similares disponibles en el mercado. La enzima usada no está limitada de ninguna manera y se puede usar cualquier enzima siempre que esta pueda derivar galacto-oligosacárido, donde los ejemplos incluyen enzimas que pueden hidrolizar la lactosa en el material y hacer que la galactosa producida mediante descomposición se transforme en lactosa o glucosa, específicamente, p-galactosidasa o a-galactosidasa. Estas enzimas se pueden usar solas o dos o más de las mismas se pueden combinar para su uso. Las condiciones del tratamiento enzimático no están limitadas de ninguna manera y, generalmente, el intervalo adecuado de la concentración de material es del 10 al 70 %, el del pH es de 3 a 8, el de la concentración de enzima es de 0,01 a 100 unidades/ml, el de la temperatura es de 20 a 70 °C y el del tiempo de reacción es de 2 horas a 3 días. También se puede usar un azúcar líquido de galacto-oligosacárido disponible en el mercado, tal como Oligomate 55N (Yakult Pharmaceutical Industry). También resulta posible usar un galacto-oligosacárido aislado de fuentes naturales que contengan galacto-oligosacárido y purificado mediante un método convencional. El tipo de fuente natural que contiene galacto-oligosacárido no está limitado de ninguna manera y se puede usar leche de mamíferos, por ejemplo.
En la presente invención, la muestra usada para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido no está limitada de ninguna manera, siempre que esta contenga galacto-oligosacárido y dextrina, y los ejemplos incluyen alimentos para uso sanitario específico, alimentos funcionales, alimentos saludables, alimentos de complementos nutritivos, alimentos especiales para lactantes/niños/mujeres embarazadas/personas enfermas, alimentos para personas que tienen dificultad para la deglución, leche en polvo formulada para lactantes u otras bebidas, alimentos o material de los mismos y productos farmacéuticos, entre otros. Entre estos, preferentemente el método propuesto mediante la presente invención se aplica a leches en polvo formuladas para lactantes que contienen un alto contenido de componentes de azúcar, debido a que este permite la detección y la cuantificación de galactooligosacárido con una precisión alta. La dextrina es un término general que se refiere a sustancias que comprenden tres o más moléculas de glucosa polimerizadas entre sí. Un tipo de dextrina es la maltodextrina, que es un polímero de D-glucosas polimerizadas entre sí mediante enlaces a-1,4, tiene un peso de dextrosa equivalente de menos de 20 y se obtiene mediante la hidrólisis de almidón.
La maltodextrina incluye maltotriosa que comprende tres moléculas de glucosa, tetrasacárido que comprende cuatro moléculas de glucosa polimerizadas entre sí y polisacárido que comprende más moléculas de glucosa polimerizadas entre sí. La maltotriosa, que comprende tres moléculas de glucosa polimerizadas entre sí, tiene el mismo peso molecular y tamaño que la 4'-GL, pero su estructura de grupo hidroxilo sólida es parcialmente diferente. En los casos en los que las moléculas del mismo tamaño que la 4'-GL estaban presentes en una muestra de una bebida, un alimento, etc., los métodos convencionales, tales como la cromatografía de filtración en gel, no pudieron separar la 4'-GL y la maltotriosa para cuantificar el galacto-oligosacárido; mediante el uso del método propuesto mediante la presente invención, sin embargo, se pueden separar suficientemente las dos. El peso de dextrosa equivalente es una representación del azúcar reductor en la muestra como glucosa, que se obtiene como porcentaje del contenido sólido. El valor máximo del peso de dextrosa equivalente es 100, lo que indica que la totalidad del contenido sólido es glucosa. El peso de dextrosa equivalente es un indicador de la tasa de hidrólisis del almidón, donde la dextrina de un menor peso de dextrosa equivalente o, específicamente, una menor tasa de hidrólisis contiene más componentes de polisacárido. Por otro lado, la dextrina de un mayor peso de dextrosa equivalente o, específicamente, una mayor tasa de hidrólisis contiene más componentes de oligosacárido.
En el método de detección y cuantificación propuesto mediante la presente invención, en primer lugar, se hace reaccionar un reactivo de derivación con la muestra para derivar el azúcar en la muestra. El reactivo de derivación no está limitado de ninguna manera, siempre que este pueda derivar el galacto-oligosacárido, donde los ejemplos incluyen derivados hidrófobos capaces de absorber la luz ultravioleta o luz visible o detectar la luz fluorescente o, específicamente, 1-fenil-3-metil-5-pirazolona (PMP, por sus siglas en inglés), 2-aminopiridina, 2-aminobenzamida, 3-aminoquinona, 4-amino benzoato de etilo, 4-amino benzoato de butilo y anilina de 4-trimetil amonio, y se puede usar cualquier tipo de derivado seleccionado de los anteriores. Particularmente, la PMP se usa preferentemente para una separación suficiente de los componentes de galacto-oligosacárido.
En el caso de la derivación mediante PMP, la derivación se puede implementar mediante, por ejemplo, la adición de una solución de metanol de PMP 0,5 M y una solución de NaOH 0,6 M a la muestra para provocar la reacción durante 30 minutos a 70 °C y, a continuación, la adición de ácido clorhídrico 0,1 M y cloroformo al líquido de reacción para agitar la mezcla, seguido de la retirada del cloroformo que constituye la capa inferior. Aunque el azúcar, tal como el galacto-oligosacárido, es hidrófilo, su derivación mediante un reactivo de derivación hidrófobo convierte la parte derivada del azúcar en hidrófoba para permanecer más tiempo en la columna si esta se alimenta a una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento que contiene grupos alquilo en la fase estacionaria, en comparación con lo que haría un componente hidrófilo.
Después del tratamiento de derivación, la muestra se somete a cromatografía líquida de alto rendimiento para separar la 4'-GL como componente de galacto-oligosacárido en la muestra. En la presente invención, la columna usada para la cromatografía líquida de alto rendimiento es una columna de cromatografía de fase inversa C30 o, específicamente, una columna que contiene grupos alquilo (grupos triacontilo) de un número de carbonos de 30 en la fase estacionaria. Esto se debe a que se debe usar una columna de un número de carbonos de 30 para separar suficientemente la 4'-GL como galacto-oligosacárido en la muestra. Los ejemplos más específicos incluyen Develosil RPAQUEOUS (Nomura Chemical), Develosil C30-UG (Nomura Chemical) e Inertosil c 30 S-Select (GL Sciences). Entre estos, se prefiere la columna con una fase estacionaria que contiene grupos alquilo cis que tienen enlaces dobles o, específicamente, se prefiere Develosil RPAQUEOUS (Nomura Chemical), desde el punto de vista de la separabilidad de la 4'-GL como galacto-oligosacárido. Las columnas de cromatografía de fase inversa C30 son adecuadas para la separación de la 4'-GL como galacto-oligosacárido, probablemente porque la longitud y la estructura sólida de los grupos alquilo provocan el cambio del tiempo de retención de la 4'-GL como galactooligosacárido, maltotriosa, etc.
El eluyente que se puede usar para la fase móvil de la cromatografía líquida de alto rendimiento no está limitado de ninguna manera, siempre que este no afecte negativamente a la columna o al aparato, y los ejemplos incluyen un eluyente constituido únicamente por agua, un eluyente constituido únicamente por una solución de tampón y un líquido mixto de agua o una solución de tampón y un disolvente orgánico polar, entre los que se prefiere el uso de un líquido mixto de una solución de tampón y un disolvente orgánico polar. La relación de mezclado (vol/vol, todas las relaciones de mezclado se indican en unidades de vol/vol en lo sucesivo en el presente documento) de una solución de tampón y un disolvente orgánico polar no está limitada de ninguna manera, pero preferentemente el intervalo de la solución de tampón/el disolvente orgánico polar es de 79/21 a 80/20. Esto se debe a que, mediante el uso del eluyente en este intervalo, se separa suficientemente la 4'-GL como galacto-oligosacárido y se pueden obtener buenos cromatogramas. Por una razón similar, el pH de la solución de tampón está preferentemente en un intervalo de 4 a 8 o particular y preferentemente en un intervalo de 5 a 6.
Asimismo, preferentemente se usa una solución mixta que contiene, como solución de tampón, al menos un tipo seleccionado de una solución de tampón de fosfato de potasio, una solución de tampón de citrato de potasio, una solución de tampón de formiato de amonio y una solución de tampón de acetato de potasio y, como disolvente orgánico polar, al menos un tipo seleccionado de acetonitrilo, metanol, etanol, propanol y butanol, donde se prefiere particularmente el uso de una solución mixta de una solución de tampón de fosfato de potasio y acetonitrilo, el pH de la solución de tampón de fosfato de potasio está preferentemente en un intervalo de 5 a 6 y la relación de mezclado de la solución de tampón de fosfato de potasio y el acetonitrilo está preferentemente en un intervalo de 79/21 a 80/20, basándose en la solución de tampón de fosfato de potasio/acetonitrilo.
La cromatografía líquida de alto rendimiento se puede implementar usando un aparato de HPLC disponible en el mercado y el equilibrio de la columna, el caudal y diversas otras condiciones se pueden establecer según se considere adecuado, basándose en el volumen de la muestra, etc. Después de la cromatografía líquida de alto rendimiento, la fracción obtenida se puede detectar y cuantificar usando diversos detectores. Por ejemplo, se puede usar un detector de absorbancia de luz ultravioleta, un detector de absorbancia de luz visible u otro detector de absorbancia, cualquiera de diversos detectores ópticos de rotación o un detector de luz fluorescente, etc. En la presente invención, el uso de un detector de absorbancia de ultravioleta permite una cuantificación sencilla y precisa.
En el método de detección y cuantificación de galacto-oligosacárido en la muestra, se pueden usar los medios descritos a continuación, por ejemplo. En primer lugar, se añade agua u otro disolvente a una muestra que contiene galacto-oligosacárido cuyo contenido de 4'-GL se conoce, a fin de disolver la muestra, y, a continuación, se añade una cantidad adecuada de una sustancia de referencia interna para preparar una solución de muestra. Por separado, el mismo galacto-oligosacárido y la sustancia convencional de referencia interna se disuelven en agua, etc., a fin de preparar una solución de ensayo convencional. La solución de ensayo convencional se diluye en fases para preparar una solución diluida 10 veces, una solución diluida 20 veces y una solución diluida 40 veces, por ejemplo. A continuación, la solución de muestra y la solución de ensayo convencional se derivan con un reactivo de derivación de PMP, etc. La solución de muestra derivada y la solución de ensayo convencional se someten a cromatografía líquida de alto rendimiento, respectivamente, para obtener cromatogramas usando un detector. Las condiciones de la cromatografía líquida de alto rendimiento son tal como se ha mencionado anteriormente.
El resultado obtenido de la solución de ensayo convencional se usa para crear una curva de calibración. En cada una de las soluciones de ensayo convencionales diluidas en fases, se obtiene una curva de calibración basada en el método de mínimos cuadrados, representando el eje horizontal el contenido de galacto-oligosacárido y representando el eje vertical la relación de área de la 4'-GL y la sustancia de referencia interna, que debe proporcionar la siguiente Fórmula (curva de calibración):
Relación de área (y) = Constante (a) x Contenido de galacto-oligosacárido (x) A continuación, la relación de área de la 4'-GL y la sustancia de referencia interna se calcula a partir del resultado de la solución de muestra y la relación de área se asigna a la curva de calibración anterior, de modo que se puede calcular el contenido de galacto-oligosacárido en la muestra. Mediante el sometimiento del resultado calculado a cálculos complementarios según se considere adecuado, basándose en la relación de dilución, etc., de la muestra en la fase de tratamiento previo, se cuantifica el contenido preciso de galacto-oligosacárido.
La presente invención se describe con mayor detalle a continuación mediante la citación de ejemplos, pero se debe señalar que la presente invención no está limitada de ninguna manera por estos ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo comparativo 1: cuantificación de la 4'-GL usando la cromatografía de filtración en gel
(1) Preparación de la solución de muestra
Se pesó la leche en polvo formulada para lactantes que contenía azúcar líquido de galacto-oligosacárido (Oligomate 55N: Yakult Chemical Industry) a una relación de 2,3 g/100 g, basándose en el contenido de galacto-oligosacárido, así como maltodextrina a una relación de 1,5 g/100 g, y se pesaron y disolvieron 2,6 g de la misma mediante la adición de una pequeña cantidad de agua caliente, tras lo que la leche en polvo formulada disuelta se dejó reposar hasta que esta alcanzó la temperatura ambiente y, a continuación, se añadió agua destilada para preparar 20 ml de leche disuelta. En un matraz de medición, se introdujeron 4 ml de leche disuelta y, a continuación, se añadieron, justamente, 2 ml de la solución acuosa que contenía la sustancia de referencia interna al 0,1 %, tras lo que se añadió agua destilada para constituir el volumen total de 20 ml, a fin de obtener una solución de muestra (leche en polvo 101 (adición de GOS)). El contenido de galacto-oligosacárido por 20 ml de leche disuelta fue de 2,6 g * 2,3/100 = 0,0598 g, lo que significa que el contenido por 100 ml fue de 0,299 g.
La leche en polvo formulada para lactantes contiene, como materiales, lactosa, hidrolizado de proteína de suero, aceite de palma, leche en polvo entera, aceite de palma de almendra fraccionado, aceite de soja refinado, azúcar líquido de galacto-oligosacárido, calcio de caseína, maltodextrina (almidón sacarificado), aceite de pescado refinado, carbonato de calcio, cloruro de magnesio, lecitina, fosfato de potasio, cloruro de potasio, fosfato de sodio, hidróxido de potasio, lactoferrina, vitamina C, cloruro de calcio, pirofosfato de hierro, taurina, vitamina E, sulfato de zinc, cistina, citidilato de sodio, niacina, pantotenato de calcio, vitamina A, sulfato de cobre, inosinato de sodio, uridilato de sodio, guanilato de sodio, vitamina B1, 5'-AMP, vitamina B6, vitamina B2, ácido fólico, caroteno, vitamina D y vitamina B12 y los componentes nutritivos de la leche en polvo formulada para lactantes se muestran en la Tabla 1. En la Tabla 1, los carbohidratos incluyen lactosa, galacto-oligosacárido, dextrina y monosacáridos.
T l 11
Figure imgf000006_0001
(2) Preparación de la solución de muestra de placebo
Como leche en polvo formulada para lactantes que no contiene galacto-oligosacárido, se llevó a cabo un proceso de preparación similar al de la leche en polvo 101 (adición de GOS) para preparar una solución de muestra de placebo (leche en polvo 102 (placebo)). La leche en polvo formulada para lactantes usada en esta preparación tenía la misma composición de material que la leche en polvo formulada para lactantes a partir de la que se preparó la solución de muestra (leche en polvo 101 (adición de GOS)), con la excepción de que esta no contenía galactooligosacárido y contenía maltodextrina a una relación de 6,2 g/100 g. La leche en polvo 101 (adición de GOS) contenía lactosa derivada de azúcar líquido de galacto-oligosacárido, galacto-oligosacárido y monosacáridos en un total de 4,7 g/100 g y la leche en polvo 101 (adición de GOS) y la leche en polvo 102 (placebo) tenían la misma cantidad de carbohidrato.
(3) Preparación de la solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido
En un matraz de medición de 50 ml, se pesó el azúcar líquido de galacto-oligosacárido (Oligomate 55N: Yakult Chemical Industry) de modo que el contenido de azúcar líquido de galacto-oligosacárido fuera de 2,0 g/100 ml, tras lo que se añadió, justamente, 1 ml de la solución acuosa que contenía la sustancia de referencia interna al 1 % y, a continuación, se añadió agua destilada para constituir el volumen total de 50 ml, a fin de obtener la solución de ensayo convencional (OM55N).
(4) Preparación de la solución de ensayo convencional de maltodextrina
En un matraz de medición de 50 ml, se pesó el azúcar líquido de maltodextrina usado para la fabricación de la leche en polvo formulada para lactantes mencionada anteriormente (jarabe con un contenido alto de maltosa) de modo que el contenido de la solución de maltodextrina fuera de 2,0 g/100 ml, tras lo que se añadió, justamente, 1 ml de la solución acuosa que contenía la sustancia de referencia interna al 1 % y, a continuación, se añadió agua destilada para constituir el volumen total de 50 ml, a fin de obtener la solución de ensayo convencional (maltodextrina).
(5) Filtración
La solución de ensayo, la solución de ensayo de placebo, la solución de ensayo convencional de galactooligosacárido y la solución de ensayo convencional de maltodextrina se filtraron a través de un filtro de 0,45 pm y la solución filtrada se analizó en las condiciones de HPLC que se muestran a continuación.
(6) Análisis mediante HPLC
Columna: GPC (KS-802) (8,0 * 300 mm)
Eluyente: agua destilada
Caudal: 0,5 ml/min
Detector: detector de RI (Shodex SE-201)
Temperatura
de la columna: 80 °C
Los resultados fueron que, tal como se muestra en la FIG. 1, el trisacárido (maltotriosa: Mal-3) contenido en la maltodextrina y la 4'-GL de trisacárido contenida en la solución de ensayo convencional (OM55N) se eluyeron de la columna después del mismo tiempo de retención y la cromatografía de filtración en gel halló picos superpuestos de la maltotriosa en la maltodextrina y la 4'-GL en el galacto-oligosacárido y no pudieron cuantificar la 4'-GL.
Ejemplo 1: cromatograma de fase inversa de HPLC de derivado de PMP que usa la columna C30
La solución de muestra de leche en polvo formulada para lactantes, la solución de muestra de placebo, la solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido y la solución de ensayo convencional de maltodextrina se prepararon de la misma manera que en el Ejemplo comparativo 1. La solución de ensayo convencional de galactooligosacárido se diluyó adicionalmente con agua destilada para preparar una solución diluida 10 veces, una solución diluida 20 veces y una solución diluida 40 veces. Las concentraciones de azúcar líquido de galacto-oligosacárido en las soluciones diluidas fueron de 0,2 g/100 ml, 0,1 g/100 ml y 0,05 g/100 ml, respectivamente.
(1) Derivación de PMP
En un tubo de ensayo de boca roscada, se midieron 100 pl de cada una de la solución de muestra, la solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido y la solución de ensayo convencional de maltodextrina y, a continuación, se añadieron 100 pl de la solución acuosa de NaOH 0,6 M y la mezcla se agitó. A continuación, se añadieron 200 pl de la solución de metanol de PMP 0,5 M y se agitó la mezcla. La mezcla agitada se calentó a 70 °C durante 30 minutos para derivarse de PMP. Después de haberse enfriado hasta temperatura ambiente, la mezcla se volvió ligeramente ácida mediante la adición de 0,7 ml de la solución acuosa de HCl 0,1 M, seguida de la extracción basada en cloroformo para retirar el exceso de reactivo. Específicamente, se añadió aprox. 1 ml de cloroformo y la mezcla se agitó durante al menos 30 segundos y, a continuación, se centrifugó a 2.500 rpm durante 5 minutos, a fin de retirar el cloroformo que constituye la capa inferior. Se repitió dos veces la misma operación. La capa de agua se filtró a través de un filtro de 0,45 |jm y la mezcla filtrada se analizó en las condiciones de HPLC que se muestran a continuación.
(2) Condiciones de análisis mediante HPLC
Columna: Develosil RPAQUEOUS (4,6 * 250 mm) (C30)
Eluyente: solución de tampón de fosfato de potasio (pH 6)/CH3CN (80/20) Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 245 nm
Temperatura de la columna: 35 °C
Los resultados fueron que, tal como se muestra mediante la línea de puntos en la FIG. 2, el pico de la 4'-GL detectado en la solución de muestra (leche en polvo 101) no se detectó en la solución de muestra de placebo (leche en polvo 102) y, se confirmó que, mediante el sometimiento de la solución derivada de PMP a cromatografía líquida de alto rendimiento usando una columna de cromatografía de fase inversa C30, se pudieron separar la 4'-GL y la maltotriosa.
(3) Cálculo del contenido de galacto-oligosacárido
Las soluciones diluidas preparadas a partir de la solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido se sometieron a HPLC en las mismas condiciones que se han mostrado anteriormente y, mediante el uso de la relación de área de la sustancia de referencia interna y la 4'-GL, se obtuvo una curva de calibración del azúcar líquido de galacto-oligosacárido. Los resultados del análisis mediante HPLC se muestran en la Tabla 2.
T l 21
Figure imgf000008_0001
Cuando se obtuvo una curva de calibración mediante el método de mínimos cuadrados, representando x el contenido de azúcar líquido de galacto-oligosacárido y representando y la relación de área, la curva de calibración se expresó mediante y = 3,9909x. La relación de área de la sustancia de referencia interna y la 4'-GL en la solución de muestra (0,5526) se asignó a y de esta curva de calibración y la cantidad de galacto-oligosacárido en la muestra se calculó mediante la consideración de la relación de dilución, etc., de las soluciones de muestra (Tabla 3). Específicamente, la asignación de y = 0,5526 a la curva de calibración y = 3,9909x proporcionó 0,138 (g/100 ml) como x (concentración de azúcar líquido de galacto-oligosacárido en la solución de muestra). Dado que la solución de muestra se preparó mediante la dilución de la leche disuelta cinco veces, la cantidad de azúcar líquido de galacto-oligosacárido en la leche disuelta se proporcionó como 0,138 * 5 = 0,690 (g/100 ml). Dado que el contenido de sólidos en el azúcar líquido era del 75 % y el contenido de galacto-oligosacárido en los sólidos era del 56,4 %, el contenido de galacto-oligosacárido en la leche disuelta fue de 0,690 * 0,75 * 0,564 = 0,292 (g/100 ml). Dado que la concentración de la leche en polvo formulada para lactantes en la leche disuelta era de 2,6 g/20 ml, 100 ml de leche disuelta contenían 13 g de leche en polvo formulada para lactantes, que a su vez contenían 0,292 g/100 ml de galacto-oligosacárido, lo que significa que el galacto-oligosacárido estaba contenido en 2,25 g/100 g por 100 g de leche en polvo formulada para lactantes, lo que concuerda aproximadamente con la cantidad mezclada de galactooligosacárido (2,3 g/100 g).
T l 1
Figure imgf000008_0002
_____ ____
Ejemplo comparativo 2: cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP que usa las columnas C8, C18 Se pesó la leche en polvo formulada para lactantes que contenía azúcar líquido de galacto-oligosacárido (Oligomate 55N: Yakult Chemical Industry) a una relación de 2,3 g/100 g, basándose en el contenido de galacto-oligosacárido, así como maltodextrina a una relación de 1,5 g/100 g, y, justamente, se pesaron 5 g de la misma y se disolvieron mediante la adición de una pequeña cantidad de agua caliente, tras lo que la leche en polvo formulada disuelta se dejó reposar hasta que esta alcanzó la temperatura ambiente. Justamente, se añadió 1 ml de la solución acuosa que contenía la sustancia de referencia interna al 1 %, tras lo que se añadió agua destilada para constituir el volumen total de 50 ml para obtener una solución de muestra (leche en polvo 101 (adición de GOS)).
Asimismo, como leche en polvo formulada para lactantes que no contiene galacto-oligosacárido, se llevó a cabo un proceso de preparación similar al de la leche en polvo 101 (adición de GOS) para preparar una solución de muestra de placebo (leche en polvo 102 (placebo)). La leche en polvo formulada para lactantes usada en esta preparación tenía la misma composición de material que la leche en polvo formulada para lactantes a partir de la que se preparó la solución de muestra (leche en polvo 101 (adición de GOS)), con la excepción de que esta no contenía galactooligosacárido y contenía maltodextrina a una relación de 6,2 g/100 g.
En un matraz de medición de 50 ml, se pesó el azúcar líquido de galacto-oligosacárido de modo que el contenido de galacto-oligosacárido llegara a ser de 3,0 g/100 ml, tras lo que se añadió, justamente, 1 ml de la solución acuosa que contenía la sustancia de referencia interna al 1 % y, a continuación, se añadió agua destilada para constituir el volumen total de 50 ml, a fin de obtener una solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido.
En un matraz de medición de 50 ml, se pesó el azúcar líquido de maltodextrina usado para la fabricación de la leche en polvo formulada para lactantes mencionada anteriormente (jarabe con un contenido alto de maltosa) de modo que el contenido de la solución de maltodextrina fuera de 2,0 g/100 ml, tras lo que se añadió, justamente, 1 ml de la solución acuosa que contenía la sustancia de referencia interna al 1 % y, a continuación, se añadió agua destilada para constituir el volumen total de 50 ml, a fin de obtener una solución de ensayo a convencional (maltodextrina). Derivación de PMP
En un tubo de ensayo de boca roscada, se midieron 100 pl de cada una de la solución de muestra, la solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido y la solución de ensayo convencional de maltodextrina y, a continuación, se añadieron 100 pl de la solución acuosa de NaOH 0,6 M y la mezcla se agitó. A continuación, se añadieron 200 pl de la solución de metanol de PMP 0,5 M y se agitó la mezcla. La mezcla agitada se calentó a 70 °C durante 30 minutos para derivarse de PMP. Después de haberse enfriado hasta temperatura ambiente, la mezcla se volvió ligeramente ácida mediante la adición de 0,7 ml de la solución acuosa de HCl 0,1 M, seguida de la extracción basada en cloroformo para retirar el exceso de reactivo. Específicamente, se añadió aprox. 1 ml de cloroformo y la mezcla se agitó durante al menos 30 segundos y, a continuación, se centrifugó a 2.500 rpm durante 5 minutos, a fin de retirar el cloroformo que constituye la capa inferior. Se repitió dos veces la misma operación. La capa de agua se filtró a través de un filtro de 0,45 pm y la mezcla filtrada se analizó en las dos condiciones de HPLC que se muestran a continuación.
Condiciones de análisis mediante HPLC
(1) HPLC que usa la columna C18
Columna: Inertosil ODS-3 (4,6 * 250 mm) (columna de fase inversa C18) Eluyente: solución de tampón de fosfato de potasio (pH 6)/CH3CN (80/20) Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 245 nm
Temperatura
de la columna: 35 °C
(2) HPLC que usa la columna C8
Columna: Imtakt UK-8 (4,6 * 150 mm) (columna de fase inversa C8)
Eluyente: solución de tampón de fosfato de potasio (pH 6)/CH3CN
(80/20)
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 245 nm
Temperatura
de la columna: 35 °C
Los resultados fueron que, aunque la 4'-GL y maltotriosa (Mal-3) se habían separado en la columna de cromatografía de fase inversa C18, los picos de la 4'-GL y otros componentes de galacto-oligosacárido se superpusieron y la 4'-GL no se pudo separar. Específicamente, tal como se muestra en la FIG. 3, los resultados de la solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido (OM55N) y la solución de muestra (leche en polvo 101) fueron de tal manera que el pico de la 4'-GL se superpuso con el pico de otras sustancias en el lado izquierdo, lo que muestra un pico escalonado.
Cuando se usó la columna de cromatografía de fase inversa C8, la 4'-GL y la maltotriosa (Mal-3) se habían separado, pero los picos de la 4'-GL y otros componentes de galacto-oligosacárido se superpusieron y no se pudo lograr la separación (FIG. 4). Específicamente, la comparación con el análisis usando la columna de cromatografía de fase inversa C30 (FIG. 2) halló que, aunque el pico de otros componentes de galacto-oligosacárido está presente en el lado izquierdo inmediato de la 4'-GL en la FIG. 2, este pico se superpone con el pico de la 4'-GL para crear un pico combinado más alto en la FIG. 4. Estos resultados sugieren que la 4'-GL no se puede separar ni cuantificar usando la columna C8 o la columna C18.
Ejemplo 2: examen del eluyente en la HPLC
Las soluciones de muestra (leche en polvo 101 (adición de GOS), leche en polvo 102 (placebo)), la solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido y la solución de ensayo convencional de maltodextrina se prepararon de la misma manera que en el Ejemplo comparativo 2 y, a continuación, se derivaron de PMP de la misma manera que en el Ejemplo comparativo 2 y se analizaron en las seis condiciones de HPLC que se muestran a continuación, respectivamente.
(1) Condiciones de HPLC en la solución de tampón a pH 4
Columna: Develosil RPAQUEOUS (4,6 * 250 mm)
Eluyente: solución de tampón de fosfato de potasio (pH 4)/CH3CN
(78/22)
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 245 nm
Temperatura
de la columna: 35 °C
(2) Condiciones de HPLC en la solución de tampón a pH 5
Columna: Develosil RPAQUEOUS (4,6 * 250 mm)
Eluyente: solución de tampón de fosfato de potasio (pH 5)/CH3CN
(79/21)
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 245 nm
Temperatura
de la columna: 35 °C
(3) Condiciones de HPLC en la solución de tampón a pH 7
Columna: Develosil RPAQUEOUS (4,6 * 250 mm)
Eluyente: solución de tampón de fosfato de potasio (pH 7)/CH3CN
(81/19)
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 245 nm
Temperatura
de la columna: 35 °C
(4) Condiciones de HPLC en la solución de tampón a pH 7
Columna: Develosil RPAQUEOUS (4,6 * 250 mm)
Eluyente: solución de tampón de fosfato de potasio (pH 7)/CH3CN
(82/18)
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 245 nm
Temperatura de
la columna: 35 °C
(5) Condiciones de HPLC en la solución de tampón a pH 8
Columna: Develosil RPAQUEOUS (4,6 * 250 mm)
Eluyente: solución de tampón de fosfato de potasio (pH 8)/CH3CN
(82/18)
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 245 nm
Temperatura
de la columna: 35 °C
(6) Condiciones de HPLC en la solución de tampón a pH 8
Columna: Develosil RPAQUEOUS (4,6 * 250 mm)
Eluyente: solución de tampón de fosfato de potasio (pH 8)/CH3CN
(83/17)
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 245 nm
Temperatura
de la columna: 35 °C
Los resultados del Ejemplo 1 mostraron que, cuando se usó la solución de tampón de fosfato de potasio de pH 6, se pudo separar la 4'-GL y se pudo cuantificar el galacto-oligosacárido. Por otro lado, tal como se muestra en las FIG.
5, 7 a 10, el uso de las soluciones de tampón de fosfato de potasio de pH 4, 7 y 8 hizo que los picos de la 4'-GL y otros componentes de galacto-oligosacárido se superpusieran y, como resultado, la 4'-Gl no se pudo separar ni cuantificar. Específicamente, aunque el pico de otros componentes de galacto-oligosacárido está presente en el lado izquierdo inmediato de la 4'-GL en la FlG. 2, el uso de la solución de tampón de fosfato de potasio de pH 4 dio como resultado un pico individual, tal como se muestra en el cromatograma de OM55N, lo que indica que la 4'-GL no se pudo separar (FIG. 5).
Adicionalmente, cuando se usó el eluyente que contenía la solución de tampón de fosfato de potasio (pH 7) y CH3CN a una relación de 81/19 (FIG. 7), el pico de otros componentes de galacto-oligosacárido se superpuso con el pico de la 4'-GL en su lado derecho, tal como se muestra en el cromatograma de OM55N, haciendo, por tanto, que el área del pico de la 4'-GL fuera más grande.
Cuando se usó el eluyente que contenía la solución de tampón de fosfato de potasio (pH 7) y CH3CN a una relación de 82/18 (FIG. 8), el cromatograma resultante de OM55N no mostró un pico en el lado izquierdo inmediato de la 4'-GL donde se debería detectar, sino que, en su lugar, este pico se superpuso con el pico de la 4'-GL.
Cuando se usó el eluyente que contenía la solución de tampón de fosfato de potasio (pH 8) y CH3CN a una relación de 82/18 (FIG. 9) o a una relación de 83/17 (FIG. 10), la comparación del cromatograma de OM55N y el de la maltodextrina halló que la 4'-GL se pudo separar de la maltotriosa y otros componentes de oligosacárido; sin embargo, la comparación del cromatograma de OM55N y el de la solución de muestra de placebo (leche en polvo 102) halló que el pico de la 4'-GL concuerda con el pico de otros componentes en la leche en polvo 102, evitando, por tanto, que se separe la 4'-GL sola.
Cuando se usó el eluyente que contenía la solución de tampón de fosfato de potasio (pH 5) y CH3CN a una relación de 79/21 (FIG. 6), por otro lado, la 4'-GL se pudo separar de la maltotriosa y otros componentes de galactooligosacárido.
Ejemplo 3: cromatograma de HPLC de fase inversa de derivado de PMP (C30) de la muestra de alimento nutritivo Los materiales que se muestran en la Tabla 4 se mezclaron para preparar alimentos nutritivos. Se añadió agua destilada a 10 g de este alimento nutritivo para constituir el volumen total de 50 ml, tras lo que la mezcla se centrifugó a 20.000 g durante 30 minutos y nuevamente a 20.000 g durante 30 minutos. El alimento nutritivo centrifugado se había separado en tres capas de la capa inferior, capa intermedia y capa superior. La capa intermedia se separó y la muestra separada se filtró a través de un filtro de 0,45 pm. Por separado, como muestra convencional, se preparó la solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido usando Oligomate 55 (Yakult Chemical Industry) de la misma manera que en el Ejemplo comparativo 1. En un tubo de ensayo de boca roscada, se midieron 100 pl de la muestra filtrada y la solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido y, a continuación, se secaron y solidificaron a presión reducida. A esto, se le añadieron 100 pl de la solución acuosa que contenía la sustancia de referencia interna al 0,02 % y, a continuación, se le añadieron 200 pl de la solución de metanol de PMP 0,5 M y la mezcla se agitó. A continuación, la mezcla se calentó a 70 °C durante 30 minutos para derivarse de PMP y se analizó en las condiciones de HPLC que se muestran a continuación.
T l 41
Figure imgf000011_0001
continuación
Figure imgf000012_0001
Condiciones de análisis mediante HPLC
Columna: Develosil RPAQUEOUS (4,6 * 250 mm)
Eluyente: solución de tampón de fosfato de potasio (pH 6)/CH3CN
(80/20)
Caudal: 1,0 ml/min
Detección: UV a 245 nm
Temperatura
de la 35 °C
columna:
Los resultados son que, tal como se muestra en la FIG. 11, el pico de la 4'-GL apareció después de 24,324 minutos de tiempo de retención, revelando que esta se separó de otros componentes contenidos en la muestra. Se debe señalar que la aparición del pico de la 4'-GL después de 24,324 minutos de tiempo de retención se confirmó mediante el análisis de la solución de ensayo convencional de galacto-oligosacárido en las mismas condiciones de análisis mediante HPLC.
Campo de aplicación industrial
De acuerdo con el método de detección y cuantificación propuesto mediante la presente invención, se pueden separar con facilidad y a un coste bajo el galacto-oligosacárido y otros componentes de la muestra para permitir una cuantificación precisa del galacto-oligosacárido, lo que permite un tratamiento preciso de la cantidad de galactooligosacárido en la muestra, así como la adquisición y visualización precisas de diversos datos de ensayo de eficacia, etc.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido en una muestra que contiene galactooligosacárido y dextrina, comprendiendo dicho método:
(i) hacer que un reactivo de derivación reaccione con la muestra para derivar un azúcar que incluye la dextrina y el galacto-oligosacárido,
(ii) separar la 4'-galactosil lactosa como componente de galacto-oligosacárido en la muestra mediante cromatografía líquida de alto rendimiento usando una columna de cromatografía de fase inversa C30, y
(iii) detectar y cuantificar la 4'-galactosil lactosa, seguido de calcular a la inversa la cantidad obtenida para determinar la cantidad total de galacto-oligosacárido en la muestra.
2. Un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que un líquido mixto de una solución de tampón y un disolvente orgánico polar se usa como eluyente para la cromatografía líquida de alto rendimiento.
3. Un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que, como solución de tampón, se usa una solución de tampón de pH 5 a 6.
4. Un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, caracterizado por que la relación de mezclado (vol/vol) de la solución de tampón y el disolvente orgánico polar en el líquido mixto está en un intervalo de 79/21 a 80/20, basándose en la solución de tampón/el disolvente orgánico polar.
5. Un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado por que, en el caso de la solución de tampón usada en la preparación del líquido mixto, se usa al menos un tipo seleccionado de una solución de tampón de fosfato de potasio, una solución de tampón de citrato de potasio, una solución de tampón de formiato de amonio y una solución de tampón de acetato de potasio y, en el caso del disolvente orgánico polar, se usa al menos un tipo seleccionado de acetonitrilo, metanol, etanol, propanol y butanol.
6. Un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la muestra que contiene galacto-oligosacárido y dextrina es una bebida o un alimento.
7. Un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que, en el caso del reactivo de derivación, se usa un tipo seleccionado de 1-fenil-3-metil-5-pirazolona, 2-aminopiridina, 2-aminobenzamida, 3-aminoquinona, 4-amino benzoato de etilo, 4-amino benzoato de butilo y anilina de 4-trimetil amonio.
8. Un método para la detección y la cuantificación de galacto-oligosacárido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la columna de cromatografía de fase inversa C30 tiene una fase estacionaria que contiene grupos alquilo cis que tienen enlaces dobles.
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