TW201546451A - 低聚半乳糖的檢測和定量方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種從含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中簡易且低成本的分離出4'-GL，對4'-GL以及低聚半乳糖進行準確定量的方法。這種對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，其特徵在於，使上述檢測樣品與衍生化試劑發生反應，使檢測樣品中的糊精及低聚半乳糖產生衍生化，接下來，通過使用了C30反相色譜儀用毛細管色譜柱的高速液體色譜分析法，將該檢測樣品中的低聚半乳糖成分分離出來。

Description

低聚半乳糖的檢測和定量方法
本創作係屬於測量的領域，特別是有關對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法。
低聚半乳糖是以半乳糖為主要成分的不同結合模式的低聚糖混合物，一般來說，是利用通過β-半乳糖苷酶對乳糖進行轉移反應的方式製造出來的。據研究報告顯示，低聚半乳糖具有促使生活在腸內的雙歧桿菌數量增加的生理效應，能夠改善腸內環境，通過降低腸間膜脂肪起到預防生活方式病等效果，因此作為特定保健用食品及各種功能性食品或其生產材料，從很久以前就受到人們的珍視。低聚半乳糖被用作特定保健用食品等的成分時，為了對其品質、規格進行保證以及顯示其功能性成分的定量分析資料等，市場需要能夠確立一種高精度的定量方法。
對飲料食品中的低聚半乳糖進行定量的方法中，有一種是使β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖中發生作用，通過定量酶降解所產生的半乳糖，計算出低聚糖的方法。但是，使用這種方法檢測所生成的半乳糖，必須使用裝有昂貴的脈衝式電化學檢測器的陰離子交換高效液相色譜儀進行檢測，故而存在著通用性低的問題。而且，如果飲料食品中含有乳糖等營養成分時，則無法判別哪些是酶處理所產生的半乳糖，哪些是從乳糖中游離出的半乳糖，其結果導致低聚半乳糖的定量精度下降。
另外，還存在著一種對低聚半乳糖中的特徵性成分，例如，對4'-半乳糖乳糖(4'-GL；Galβ1-4Galβ1-4Glc)進行定量，然後通過其量進行反算，計算出低聚半乳糖全量的方法。這種方法，由於知道了所使用低聚半乳糖中的4'-GL含量，所以當該含量不存在批次差等因素，處於穩定狀態時，是非常有效的方法。作為飲料食品檢測樣品中的4'-GL定量方法，傳統上主要使用的是通過凝膠過濾色譜儀，利用各種分子的大小不同將飲料食品中的其它成分與4'-GL進行分離的方法。
但是，由於低聚半乳糖作為如上所述的功能性材料，多被用於營養成分豐富的飲料食品，例如嬰幼兒配方奶粉或發酵乳製品等中，而在該類飲料食品中，多含有與4'-GL的分子大小相同的糖類成分，所以使用凝膠過濾色譜儀，無法將這些糖類成分與4'-GL進行分離。例如，如果要使用凝膠過濾色譜儀對含有作為含糊精糖類之一的麥芽三糖的飲料食品中的4'-GL進行分離和定量時，由於麥芽三糖與4'-GL的分子大小相同，從毛細管色譜柱溶出後的兩者的峰值產生重疊，所以對4'-GL的定量，即對低聚半乳糖的定量會造成麻煩。
作為使用反相色譜儀檢測低聚糖的方法，為人所知的有一種是使用C8或C18反相色譜儀用毛細管色譜柱的方法(專利文獻1)。但是，嘗試著使用毛細管色譜柱對飲料食品中的低聚半乳糖進行分離時，卻不能將飲料食品的其它成分與低聚半乳糖成分分離開來。
因此，本發明的目的在於，提供一種低聚半乳糖的定量方法，能夠簡易且低成本地從含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中分離出4'-GL， 對4'-GL及低聚半乳糖準確地進行定量。
本發明的發明人為瞭解決上述課題，通過銳意研究，終於完成了本發明。本發明人發現，通過使含低聚半乳糖及糊精檢測樣品與衍生化試劑發生反應，使上述檢測樣品中的糊精及低聚半乳糖產生衍生化，接下來，通過使用了C30反相色譜儀用毛細管色譜柱的高速液體色譜分析法，則能夠將該檢測樣品中的低聚半乳糖成分充分分離出來。
也就是說，本發明是一種對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，本方法的特徵在於，使上述檢測樣品與衍生化試劑發生反應，使檢測樣品中的糊精及低聚半乳糖產生衍生化，接下來，通過使用了C30反相色譜儀用毛細管色譜柱的高速液體色譜分析法，將該檢測樣品中的低聚半乳糖成分分離出來。
使用本發明的檢測和定量方法，能夠將檢測樣品中的低聚半乳糖與其它成分簡單廉價地進行分離，準確地進行低聚半乳糖的定量。通過使用本發明的方法對飲料食品等中的低聚半乳糖進行檢測和定量，能夠對該飲料食品等中所含的低聚半乳糖的量進行正確的管理，保證品質，同時能夠準確地取得各種有效性試驗資料，進行正確的標示。
第1圖，為使用了凝膠過濾毛細管色譜柱的HPLC的色譜圖。
第2圖，為PMP衍生物反相HPLC色譜圖(C30)。
第3圖，為PMP衍生物-反相HPLC色譜圖(C18反相毛細管色譜柱)。
第4圖，為PMP衍生物-反相HPLC色譜圖(C8反相毛細管 色譜柱)。
第5圖，為PMP衍生物反相HPLC色譜圖(C30)，磷酸鉀緩衝液(pH4)/CH3CN(78/22)
第6圖，為PMP衍生物反相HPLC色譜圖(C30)，磷酸鉀緩衝液(pH5)/CH3CN(79/21)
第7圖，為PMP衍生物反相HPLC色譜圖(C30)，磷酸鉀緩衝液(pH7)/CH3CN(81/19)
第8圖，為PMP衍生物反相HPLC色譜圖(C30)，磷酸鉀緩衝液(pH7)/CH3CN(82/18)
第9圖，為PMP衍生物反相HPLC色譜圖(C30)，磷酸鉀緩衝液(pH8)/CH3CN(82/18)
第10圖，為PMP衍生物反相HPLC色譜圖(C30)，磷酸鉀緩衝液(pH8)/CH3CN(83/17)
第11圖，為PMP衍生物反相HPLC色譜圖(C30)
本發明的檢測和定量方法，是使飲料食品等檢測樣品中所含的低聚半乳糖產生衍生化，再通過使用了C30反相色譜儀用毛細管色譜柱的高速液體色譜分析法(HPLC)，使檢測樣品中的其它成分與低聚半乳糖分離開，來實現定量的。低聚半乳糖是用化學通式：Gal-(Gal)n-Glc(式中Gal為半乳糖殘基，Glc為葡萄糖殘基，n為0~4的整數)來表述的、其分子內含有一個以上半乳糖分子的2~6糖的混合物。但是，乳糖不包括在低聚半乳糖中。
低聚半乳糖的主要成分為，乳糖的非還原性末端結合有一個半乳糖的3糖的4'-半乳糖乳糖(4'-GL)。其它具體的成分可列舉有，Galβ1-3Glc，Galβ1-2Glc，Galβ1-6Glc，Galβ1-6Galβ1-4Glc，Galβ1-6Galβ1-4Galβ1-4Glc，Galβ1-4Galβ1-4Galβ1-4Glc等。根據本發明的檢測和定量方法，既可以對低聚半乳糖混合物進行檢測和定量，又可以對單個的低聚半乳糖成分進行檢測和定量，但以4'-GL為分離對象進行分離後，進行檢測和定量，再通過其量進行反算，計算出低聚半乳糖的全量的話，可以得到令人滿意的定量精度。
低聚半乳糖可以是通過任何方法所獲取的，例如，可以使用以乳糖為原料，利用乳糖分解酶(β-半乳糖苷酶)產生的轉移反應所生產的產品。轉移反應，可以是使產生酶的微生物在原料中發生作用。作為含乳糖的原料，可以列舉出如市售的乳糖、乳汁、奶粉、乳清乾酪等。所使用的酶，只要是能夠獲得低聚半乳糖的酶就可以，沒有特殊的限定，例如，那些對原料中的乳糖進行水解後，能夠使通過水解產生的半乳糖轉移到乳糖或葡萄糖中的酶，具體可以列舉出β-半乳糖苷酶及α-半乳糖苷酶。這些酶可以是單獨使用或2種以上組合使用。酶處理條件沒有特別規定，一般來說原料濃度為10~70%，pH為3~8，酶濃度為0.01~100units/ml，溫度為20~70℃，反應時間為2小時~3天比較合適。而且，可以使用一般市售的低聚半乳糖漿，例如，可以使用OligoMate55N(Yakult藥品工業株式會社生產)。而且，還可以使用利用通用辦法從含低聚半乳糖天然產物中分離提純的產品。含低聚半乳糖天然產物的種類沒有限定，例如哺乳動物的乳汁等。
在本發明中，能夠成為低聚半乳糖檢測和定量對象的檢測樣品，只要是含低聚半乳糖及糊精的產品就沒有特別的限制，可以列舉的有：特定保健用食品、功能性食品、健康食品、營養輔助食品、嬰兒用/幼兒用/孕產婦用/病人用特殊用途食品、吞咽困難者用食品、嬰幼兒配方奶粉等飲料食品及其材料，或醫藥品等。其中特別是針對含糖類成分比較多的嬰幼兒配方奶粉使用本發明的方法時，對低聚半乳糖進行檢測和定量的精度非常高，效果令人滿意。糊精指的是有3個以上葡萄糖分子的聚合物的總稱。並且，有一種糊精叫麥芽糊精，麥芽糊精指的是，由α-1，4結合的D-葡萄糖聚合的聚合物，葡萄糖當量在20以下，通過澱粉的水解得到的產物。
麥芽糊精包括由3個葡萄糖分子構成的麥芽三糖，由4個葡萄糖分子聚合成的4糖，或者由更多葡萄糖聚合而成的多糖類。麥芽三糖是由3個葡萄糖分子聚合而成的，與4'-GL的分子量及分子大小相同，只是部分羥基的立體構造不一樣。在飲料食品等檢測樣品中，如果像這樣存在與4'-GL大小相同的分子時，則使用凝膠過濾色譜儀等傳統方法不能將4'-GL與麥芽三糖等進行分離並對低聚半乳糖進行定量，而使用本發明的方法，則可以對兩者充分進行分離。葡萄糖當量指的是，用葡萄糖含量代表的檢測樣品中的還原糖，是相對於固體含量百分比所求得的值。葡萄糖當量的最大為100，意思是所有的固體含量都是葡萄糖。葡萄糖當量是表示澱粉水解率的指標，葡萄糖當量小，即水解率小的糊精中含有更多的多糖成分。另一方面，葡萄糖當量大，即水解率大的糊精中，則含有更多的低聚糖。
根據本發明的檢測和定量方法，首先要使衍生化試劑在檢測 樣品中發生反應，使檢測樣品中的糖類產生衍生化。衍生化試劑只要是能夠使低聚半乳糖產生衍生化的產品就可以，沒有特別的限制，如可以列舉出的有：可以吸收紫外線、可見光或可以進行螢光檢測的疎水性衍生物，具體來說如，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，2-氨基吡啶，2-氨基苯甲醯胺，3-氨基醌，4-氨基甲酸乙酯，4-氨基苯甲酸丁酯，4-三甲銨基苯胺等，可以從其中選擇一種使用。這其中特別是使用PMP的話，能夠使低聚半乳糖成分得到充分分離，效果最令人滿意。
衍生化，假如是通過PMP產生的衍生化，可以通過以下方法使其發生，即在檢測樣品中加入0.5M的PMP甲醇溶液和0.6M的NaOH溶液，在70℃條件下使其反應30分鐘，在反應液裡添加0.1M鹽酸和氯仿，攪拌後，去除下層氯仿。低聚半乳糖等糖類是親水性的，但在疎水性衍生化試劑作用下被衍生化後，該衍生化部分變成為了疎水性，如果將其置於固定相中含烷基的高速液體色譜分析所用的毛細管色譜柱中，則與親水性成分相比，在毛細管色譜柱內可以保持更長的時間。
針對衍生化處理後的檢測樣品，通過使用高速液體色譜分析法，分離出檢測樣品中的低聚半乳糖成分。在本發明中，高速液體色譜分析法中所使用的毛細管色譜柱，使用的是C30反相色譜儀用毛細管色譜柱，即固定相中含碳原子數30的烷基(三十烷基)毛細管色譜柱。因為要使檢測樣品中的低聚半乳糖得到充分分離，必須使用碳原子數30的毛細管色譜柱。更加具體些來說可以列舉出如，Develosil RPAQUEOUS(野村化學株式會社)，Develosil C30-UG(野村化學株式會社)，Inertosil C30 S-Select(GL Sciences株式會社)。這些產品中，含有具有雙鍵順式烷基固定相的產 品，從分離低聚半乳糖的效能角度出發最為理想，具體來說如，Develosil RPAQUEOUS(野村化學株式會社)的效果最為令人滿意。C30反相色譜儀用毛細管色譜柱非常適合於分離低聚半乳糖成分的理由，可以考慮到的為烷基的長度和其立體構造，對低聚半乳糖及麥芽三糖等保持時間的變化起到了好的作用。
高速液體色譜分析法中移動相中所使用的洗脫液，只要是不會對毛細管色譜柱及裝置帶來不良影響的產品，就沒有特別的限制都可以使用，例如可以列舉的有，僅僅由水構成的洗脫液，僅僅由緩衝液構成的洗脫液，水或緩衝液與極性有機溶劑的混合液體，特別是緩衝液與極性有機溶劑的混合液體的使用效果最令人滿意。緩衝液與極性有機溶劑的混合比(vol/vol，以下，所有的混合比單位均為vol/vol)雖然沒有特別的規定，但緩衝液/極性有機溶劑=79/21~80/20時的效果最為理想。使用這樣的洗脫液，可以使低聚半乳糖得到充分分離，獲得非常好的色譜圖。根據同樣的理由，緩衝液的pH為，pH4~8比較好，特別是pH5~6的效果更加令人滿意。
作為緩衝液，從磷酸鉀緩衝液、檸檬酸鉀緩衝液、甲酸銨緩衝液及醋酸鉀緩衝液中選擇至少一種，作為極性有機溶劑，從乙腈、甲醇、乙醇、丙醇及正丁醇中選擇至少一種，使用含有上述緩衝液與極性有機溶劑的混合液體比較理想，特別是使用磷酸鉀緩衝液與乙腈的混合液比較理想，磷酸鉀緩衝液的pH為5~6比較理想，磷酸鉀緩衝液與乙腈的混合比為，磷酸鉀緩衝液/乙腈=79/21~80/20時的效果最為令人滿意。
高速液體色譜分析，可以使用市售的HPLC裝置進行，毛 細管色譜柱的平衡化及流速等各種條件，只要根據檢測樣品的容量等適當進行設定即可。進行高速液體色譜分析後，可以使用各種檢測器對所得出的成分進行檢測和定量。例如可以使用紫外吸收率檢測器、可見光吸收率檢測器等吸收率檢測器，以及各種旋光度檢測器、螢光檢測器等。根據本發明，使用紫外吸收率檢測器，既簡便定量的精度又非常高。
作為對檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，可以列舉出如下的方法。首先，在含有已經知道4'-GL含量的低聚半乳糖檢測樣品中加進水等溶劑溶解後，適量加進內部標準物質，調製出檢測樣品溶液。另外，將同一低聚半乳糖及內部標準物質在水等當中進行溶解，調製成為標準試驗液。標準試驗液進行階段稀釋，準備好如稀釋10倍、20倍、40倍的不同稀釋液。接下來，使用PMP等衍生化試劑使檢測樣品溶液和標準試驗液產生衍生化。對衍生化後的檢測樣品溶液和標準試驗液分別進行高速液體色譜分析，通過檢測器獲得色譜圖。高速液體色譜分析的條件如上述所示。
通過所獲得的標準試驗液結果，製作出標準曲線。針對階段稀釋後的各標準試驗液，以低聚半乳糖的含量為橫軸，以4'-GL與內部標準物質的面積比為縱軸，用最小二乘法求標準曲線，可以得出以下的式子(標準曲線)。
面積比(y)=常數(a)×低聚半乳糖含量(x)
接下來，通過檢測樣品溶液的結果，算出4'-GL與內部標準物質的面積比，將該面積比代入上述的標準曲線中，就可以計算出檢測樣品中的低聚半乳糖含量。通過對根據前處理階段中檢測樣品的稀釋率等適 當算出的結果進行補充計算，可以定量得出正確的低聚半乳糖含量。
以下通過實施例對本發明的內容作進一步詳細說明，但本發明不受實施例的任何制約。
實施例
比較例1：使用凝膠過濾色譜儀進行的4'-GL的定量
(1)檢測樣品溶液的調製
以低聚半乳糖漿(OligoMate55N：Yakult藥品工業株式會社)作為低聚半乳糖，秤量出含量比例為2.3g/100g、麥芽糊精含有比例為1.5g/100g的嬰幼兒配方奶粉2.6g，加入少量溫水溶解後，放置至達到室溫溫度，加入蒸餾水使之達到20ml，製作成溶解乳。將4ml溶解乳倒入量瓶，準確地加進2ml含有0.1%內部標準物質的水溶液，再加入蒸餾水使之達到20ml，作為檢測樣品溶液(奶粉101(GOS添加))。由於每20ml溶解乳的低聚半乳糖含量為，2.6g×2.3/100=0.0598g，所以每100ml的低聚半乳糖含量為0.299g。
另外，嬰幼兒配方奶粉，其原材料中包括有：乳糖，乳清蛋白質消化物，棕櫚油，全脂奶粉，棕櫚仁精製油，精製大豆油，低聚半乳糖漿，酪蛋白酸鈣，麥芽糊精(澱粉糖化物)，精製魚油，碳酸鈣，氯化鎂，卵磷脂，磷酸K，氯化K，磷酸納，羥化K，乳鐵蛋白，V.C，氯化CA，焦磷酸鐵，牛磺酸，V.E，硫酸鋅，胱氨酸，胞苷酸納，煙酸，泛酸鈣，V.A，硫酸銅，肌苷酸鈉，尿苷酸納，鳥苷酸納，V.B1，5’-AMP，V.B6，V.B2，葉酸，胡蘿蔔素，VD，VB12等，其營養成分如表1所示。表1的碳水化合物包括，乳糖，低聚半乳糖，糊精，單糖。
(2)安慰劑檢測樣品溶液的調製
作為不含低聚半乳糖的嬰幼兒配方奶粉，按照與奶粉101(GOS添加)同樣的調製工序，調製出安慰劑檢測樣品溶液(奶粉102(安慰劑))。調製中使用的嬰幼兒配方奶粉，除了不含低聚半乳糖漿，且按照6.2g/100g的比例含有麥芽糊精外，原材料的組成與製作檢測樣品溶液(奶粉101(GOS添加))的嬰幼兒配方奶粉是相同的。奶粉101(GOS添加)中含有出自低聚半乳糖漿的乳糖、低聚半乳糖、單糖合計4.7g/100g，奶粉101(GOS添加)和奶粉102(安慰劑)的碳水化合物量相同。
(3)低聚半乳糖標準試驗液的調製
以低聚半乳糖漿(OligoMate55N：Yakult藥品工業株式會社)作為低聚半乳糖漿，為了配到2.0g/100ml的比例，用50ml容量瓶量取後，準確 地加入1ml含有1%內部標準物質的水溶液，再加進蒸餾水達到50ml，以此作為標準試驗液(OM55N)。
(4)麥芽糊精標準試驗液的調製
以製造上述嬰幼兒配方奶粉中使用的麥芽糊精液糖(高麥芽糖漿)作為麥芽糊精溶液，為了配到2.0g/100ml的比例，用50ml容量瓶量取後，準確地加入1ml含有1%內部標準物質的水溶液，再加進蒸餾水達到50ml，以此作為標準試驗液(麥芽糊精)。
(5)篩檢程式處理
對試驗溶液、安慰劑試驗溶液、低聚半乳糖標準試驗液及麥芽糊精標準試驗液使用0.45μm篩檢程式進行過濾，並按照以下的HPLC條件進行了分析。
(6)HPLC分析
Column：GPC(KS-802)(8.0×300mm)
Eluent：蒸餾水
Flow rate：0.5ml/min
Detector：RI檢測器(Shodex SE-201)
Column temp：80℃
其結果如圖1所示，含有麥芽糊精的3糖(麥芽三糖：Mal-3)及，標準試驗液(OM55N)中所含3糖的4'-GL，按照相同的保持時間從毛細管色譜柱中溶出，在凝膠過濾色譜儀上麥芽糊精中的麥芽三糖與低聚半乳糖中4'-GL的峰值產生重疊，因此未能對4'-GL實現定量。
實施例1：使用了C30毛細管色譜柱的PMP衍生物-HPLC 反相色譜圖。
與比較例1同樣，調製出嬰幼兒配方奶粉的檢測樣品溶液、安慰劑檢測樣品溶液、低聚半乳糖標準試驗液、麥芽糊精標準試驗液。對低聚半乳糖標準試驗液，進一步通過蒸餾水進行10倍、20倍、40倍稀釋，製作成稀釋液。稀釋液的低聚半乳糖漿濃度分別為，0.2g/100ml，0.1g/100ml，0.05g/100ml。
(1)PMP衍生化
用螺口試管分別取檢測樣品溶液、低聚半乳糖標準試驗液、麥芽糊精標準試驗液各100μl，加入100μl的0.6M NaOH水溶液後進行攪拌。接下來，加入200μl的0.5M PMP甲醇溶液後進行攪拌。在70℃條件下加熱30分鐘，使PMP產生衍生化。冷卻到室溫後，加入0.7ml的0.1M HCl水溶液形成弱酸性，去除掉通過氯仿萃取的過量的試劑。即加入約1ml的氯仿，攪拌30秒以上，按照2500rpm，進行5分鐘離心分離後去除掉下層的氯仿。同樣的操作重複了兩次。使用0.45μm篩檢程式對水層進行過濾，並按照以下的HPLC條件進行了分析。
(2)HPLC分析條件
Column：Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)(C30)
Eluent：磷酸鉀緩衝液(pH6)/CH3CN(80/20)
Flow rate：1.0ml/min
Detection：UV245nm
Column temp：35℃
其結果如圖2的虛線所示，在檢測樣品溶液(奶粉101)中檢測到的 4'-GL峰值，在安慰劑檢測樣品溶液(奶粉102)中沒有檢測到，PMP產生衍生化後，通過進行使用了C30反相色譜儀用毛細管色譜柱的高速液體色譜分析，確認到4'-GL與麥芽三糖能夠分離。
(3)低聚半乳糖含量的計算
針對通過低聚半乳糖標準試驗液製作的稀釋液，按照與上述相同的分析條件進行了HPLC，利用內部標準物質與4'-GL的面積比，製作出低聚半乳糖漿的標準曲線。HPLC分析的結果如表2所示。
以低聚半乳糖漿的含量作為x，以面積比作為y，用最小二乘法求標準曲線，得出的標準曲線為，y=3.9909x。在該標準曲線的y中，代入檢測樣品溶液中的內部標準物質與4'-GL的面積比(0.5526)，再考慮到檢測樣品溶液的稀釋率等因素，計算出檢測樣品中的低聚半乳糖量(表3)。具體來說，在標準曲線y=3.9909x公式中，代入y=0.5526的話，x(檢測樣品溶液中的低聚半乳糖漿濃度)等於0.138(g/100ml)。由於檢測樣品溶液為稀釋5倍的溶解乳，所以溶解乳中的低聚半乳糖漿量為，0.138×5=0.690(g/100ml)。又由於液糖中的固體成分含量為75%，固體成分中的低聚半乳糖含量為56.4%，所以溶解乳中的低聚半乳糖含量為，0.690×0.75×0.564=0.292(g/100ml)。由於溶解乳中的嬰幼兒配方奶粉濃度為2.6g/20ml，每100ml溶解乳中含有13g的嬰幼兒配方奶粉，其中含有0.292g/100ml的低 聚半乳糖，所以計算出每100g嬰幼兒奶粉中，含有2.25g/100g的低聚半乳糖，與低聚半乳糖的調配量(2.3g/100g)基本上一致。
比較例2：使用了C8、C18毛細管色譜柱的PMP衍生物-反相HPLC色譜圖。
以低聚半乳糖漿(OligoMate55N：Yakult藥品工業株式會社)作為低聚半乳糖，精密地取5g其含量比例為2.3g/100g、麥芽糊精含有比例為1.5g/100g的嬰幼兒配方奶粉，加入少量溫水溶解後，放置至達到室溫溫度。準確地加入1ml含有1%內部標準物質的水溶液，再加進蒸餾水達到50ml，以此作為檢測樣品溶液(奶粉101(GOS添加))。
且作為不含低聚半乳糖嬰幼兒配方奶粉，按照與奶粉101(GOS添加)同樣的調製工序，調製出安慰劑檢測樣品溶液(奶粉102(安慰劑))。調製中使用的嬰幼兒配方奶粉，除不含低聚半乳糖，麥芽糊精含有比例為6.2g/100g外，原材料的組成與製作檢測樣品溶液(奶粉101(GOS添加))的嬰幼兒配方奶粉是相同的。
以低聚半乳糖漿作為低聚半乳糖，為了配到3.0g/100ml的比例，用50m1容量瓶量取後，準確地加入1ml含有1%內部標準物質的水溶液，再 加進蒸餾水達到50ml，以此作為低聚半乳糖標準試驗液。
以製造上述嬰幼兒配方奶粉中使用的麥芽糊精液糖(高麥芽糖漿)作為麥芽糊精溶液，為了配到2.0g/100ml的比例，用50ml容量瓶量取後，準確地加入1ml含有1%內部標準物質的水溶液，再加進蒸餾水達到50ml，以此作為標準試驗液(麥芽糊精)。
PMP衍生化
用螺口試管分別取檢測樣品溶液、低聚半乳糖標準試驗液、麥芽糊精標準試驗液各100μl，加入100μl的0.6M NaOH水溶液後進行攪拌。接下來加入200μl的0.5M PMP甲醇溶液後進行攪拌。在70℃條件下加熱30分鐘，使PMP產生衍生化。冷卻到室溫後，加入0.7ml的0.1M HCl水溶液形成弱酸性，去除掉通過氯仿萃取的過量的試劑。即加入約1ml的氯仿，攪拌30秒以上，按照2500rpm，進行5分鐘離心分離後去除掉下層的氯仿。同樣的操作重複了兩次。使用0.45μm的篩檢程式對水層進行過濾，並按照以下2個HPLC條件進行了分析。
HPLC分析条件
(1)使用了C18毛細管色譜柱的HPLC
Column：Inertosil ODS-3(4.6×250mm)(C18反相毛細管色譜柱)
Eluent：磷酸鉀緩衝液(pH6)/CH3CN(80/20)
Flow rate：1.0ml/min
Detection：UV245nm
Column temp：35℃
(2)使用了C8毛細管色譜柱的HPLC
Column：Imtakt UK-8(4.6×150mm)(C8反相毛細管色譜柱)
Eluent：磷酸鉀緩衝液(pH6)/CH3CN(80/20)
Flow rate：1.0ml/min
Detector：UV245nm
Column temp：35℃
其結果，C18反相色譜儀用毛細管色譜柱方面，雖然4'-GL與麥芽三糖(Mal-3)產生了分離，但4'-GL與其它低聚半乳糖成分的峰值產生了重疊，4'-GL沒能被分離出來。即如圖3所示，從低聚半乳糖標準試驗液(OM55N)及檢測樣品溶液(奶粉101)的結果看，4'-GL的峰值，其頂部的左側與其它物質的峰值產生重疊，形成為一個梯段形狀。
使用C8反相色譜儀用毛細管色譜柱時，我們看到雖然4'-GL與麥芽三糖(Mal-3)產生了分離，但4'-GL與其它低聚半乳糖成分的峰值產生重疊，4'-GL沒能被分離出來(圖4)。也就是說，如果與使用C30反相色譜儀用毛細管色譜柱時(圖2)進行比較的話，相對於圖2中其它低聚半乳糖成分的峰值在4'-GL的左邊，在圖4中這些峰值與4'-GL的峰值形成重疊，其結果是峰值變高了。這樣的結果顯示出，無論使用C8還是C18毛細管色譜柱時，4'-GL都沒能被分離出來實現定量。
實施例2：有關HPLC中洗脫液的探討。
與比較例2一樣，調製出檢測樣品溶液(奶粉101(GOS添加)、奶粉102(安慰劑))、低聚半乳糖標準試驗液及麥芽糊精標準試驗液，且分別與比較例2同樣使PMP產生衍生化後，按照以下的6種HPLC條件進行了分析。
(1)在緩衝液為pH4條件下的HPLC
Column：Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent：磷酸鉀緩衝液(pH4)/CH3CN(78/22)
Flow rate：1.0ml/min
Detection：UV245nm
Column temp：35℃
(2)在緩衝液為pH5條件下的HPLC
Column：Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent：磷酸鉀緩衝液(pH5)/CH3CN(79/21)
Flow rate：1.0ml/min
Detection：UV245nm
Column temp：35℃
(3)在緩衝液為pH7條件下的HPLC
Column：Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent：磷酸鉀緩衝液(pH7)/CH3CN(81/19)
Flow rate：1.0ml/min
Detection：UV245nm
Column temp：35℃
(4)在緩衝液為pH7條件下的HPLC
Column：Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent：磷酸鉀緩衝液(pH7)/CH3CN(82/18)
Flow rate：1.0ml/min
Detection：UV245nm
Column temp：35℃
(5)在緩衝液為pH8條件下的HPLC
Column：Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent：磷酸鉀緩衝液(pH8)/CH3CN(82/18)
Flow rate：1.0ml/min
Detection：UV245nm
Column temp：35℃
(6)在緩衝液為pH8條件下的HPLC
Column：Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent：磷酸鉀緩衝液(pH8)/CH3CN(83/17)
Flow rate：1.0ml/min
Detection：UV245nm
Column temp：35℃
根據實施例1的結果，使用pH6的磷酸鉀緩衝液時，4'-GL能夠被分離出來，能夠進行低聚半乳糖的定量。相對於這樣的結果，如圖5、7~10所示，使用pH4、7、8的磷酸鉀緩衝液時，4'-GL與其它低聚半乳糖成分的峰值產生重疊，4'-GL沒能被分離出來、沒能實現定量。即，相對於圖2中其它低聚半乳糖成分的峰值在4'-GL的左邊，使用pH4的磷酸鉀緩衝液時，在OM55N的色譜圖中，該峰值為一個，4'-GL沒能被分離出來(圖5)。
而且，使用磷酸鉀緩衝液(pH7)與CH3CN的比例為81/19的洗脫液時(圖7)，在OM55N的色譜圖中，4'-GL的峰值頂部右側與其它低聚半乳 糖成分的峰值產生重疊，其結果4'-GL峰值的面積變大了。
使用磷酸鉀緩衝液(pH7)與CH3CN的比例為82/18的洗脫液時(圖8)，在OM55N的色譜圖中，本來應該在4'-GL左邊檢測到的峰值沒有出現，該峰值與4'-GL的峰值重疊在了一起。
使用磷酸鉀緩衝液(pH8)與CH3CN的比例為82/18的洗脫液時(圖9)，或使用83：17的洗脫液時(圖10)，OM55N與麥芽糊精的色譜圖進行比較可以看出，4'-GL沒能夠與麥芽三糖及其它低聚糖成分產生分離，OM55N與安慰劑檢測樣品溶液(奶粉102)的色譜圖進行比較可以看出，4'-GL的峰值與奶粉102所含成分的峰值相一致，4'-GL沒能被單獨分離出來。
另一方面，使用磷酸鉀緩衝液(pH5)與CH3CN的比例為79/21的洗脫液時(圖6)，實現了4'-GL與麥芽三糖及其它低聚半乳糖成分的分離。
實施例3：以營養食品為檢測樣品時的PMP衍生物-反相HPLC色譜圖(C30)。
通過對表4中所示的原材料進行混合，調製出營養食品。在10g該營養食品中加進蒸餾水達到50ml後，進行20000g×30分鐘離心分離，然後再進行20000g×30分鐘離心分離。離心分離後，營養食品被分離成為3層，即下層、中間層、上層。選取其中間層，使用0.45μm的篩檢程式對這樣選取的檢測樣品進行了過濾。另外，作為標準檢測樣品，低聚半乳糖標準試驗液使用OligoMate55(Yakult藥品工業株式會社)，與比較例1同樣進行了調製。用螺口試管分別取過濾後的檢測樣品及低聚半乳糖標準試驗液各100μl，進行了減壓乾燥。加入100μl含有0.02%內部標準物質的水溶液， 再加入200μl的0.5M的PMP甲醇溶液後進行攪拌。接下來在70℃條件下加熱30分鐘，使PMP產生衍生化，並按照以下的HPLC條件進行了分析。
HPLC分析條件
Column：Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent：磷酸鉀緩衝液(pH6)/CH3CN(80/20)
Flow rate：1.0ml/min
Detection：UV245nm
Column temp：35℃
其結果如圖11所示，可以看出4'-GL的峰值出現在保持時間24.324分鐘處，從樣品中所含其它成分中分離出來。4'-GL的峰值出現在保持時間24.324分鐘處這一現象，通過按照同一HPLC分析條件對低聚半乳糖標準試驗液進行的分析，也得到了確認。
由於使用本發明的檢測和定量方法，能夠將檢測樣品中的低聚半乳糖與其它成分簡單廉價地進行分離，準確地進行低聚半乳糖的定量，所以能夠對這些檢測樣品中所含的低聚半乳糖量進行正確的管理，同時能夠準確地取得各種有效性試驗資料，進行正確的標示。

Claims (9)

  1. 一種對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，其特徵在於，使上述檢測樣品與衍生化試劑發生反應，使檢測樣品中的糊精及低聚半乳糖產生衍生化，接下來，通過使用了C30反相色譜儀用毛細管色譜柱的高速液體色譜分析法，將該檢測樣品中的低聚半乳糖成分分離出來。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，其中，作為在高速液體色譜分析法中使用的洗脫液，採用緩衝液與極性有機溶劑的混合液體。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，其中，所述緩衝液採用ph值在5至6的緩衝液。
  4. 如申請專利範圍第2或3項中所述之對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，其中，所述混合液體的緩衝液與極性有機溶劑的混合比(vol/vol)為：緩衝液/極性有機溶劑=79/21~80/20。
  5. 如申請專利範圍第2至4項中所述之對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，其中，作為用於調製所述混合液體的緩衝液，採用從磷酸鉀緩衝液、檸檬酸鉀緩衝液、甲酸銨緩衝液及醋酸鉀緩衝液中選擇的至少一種，作為極性有機溶劑，採用從乙腈、甲醇、乙醇、丙醇及正丁醇中選擇的至少一種。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中所述之對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中 的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，其中，含低聚半乳糖及糊精檢測樣品為飲料食品。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中所述之對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，其中，被分離的低聚半乳糖的成分為4'-半乳糖乳糖。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中所述之對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，其中，作為衍生化試劑採用從1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，2-氨基吡啶，2-氨基苯甲醯胺，3-氨基醌，4-氨基甲酸乙酯，4-氨基苯甲酸丁酯，4-三甲銨基苯胺中選擇的一種。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之對含低聚半乳糖及糊精檢測樣品中的低聚半乳糖進行檢測和定量的方法，其中，C30反相色譜儀用毛細管色譜柱，為具備含有雙鍵順式烷基的固定相的毛細管色譜柱。
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