CN111363779A - 交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法 - Google Patents

交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法，该方法在低温弱酸条件下对待检的交联或高分子量透明质酸类物质进行酶解处理，以降低交联或高分子量透明质酸类物质溶液的粘度，然后将粘度降低的酶解液配制检液，实现待检样品的微生物限度检测。本发明在低温弱酸下对待检样品进行处理，降低了检液的粘度，解决了交联或高分子量透明质酸类物质固体粉末溶解度低、检测过程中难以在平板培养基表面均匀涂布、无法获得微生物限度真实数据的难题，为交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测提供了方便有效的检测方法。

Description

交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法
技术领域
本发明涉及一种交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法，属于透明质酸微生物检测技术领域。
背景技术
透明质酸是一种广泛存在于动物及人体内的天然粘多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡萄糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖。由于其自身的黏弹性、润滑性等特有的物理特性，广泛应用于医药、化妆品、食品领域。
交联透明质酸是透明质酸通过化学交联修饰得到的高分子凝胶，交联后的透明质酸分子链更长，且具有更加复杂的三维结构，与天然透明质酸相比，在非常低的浓度下便可形成粘度很高的液体，溶解难度大且很难配成高浓度的水溶液，一般浓度都在1wt%以下。并且根据交联度的不同，交联透明质酸均具有一定的抗酶解活性。由于这两方面的特性，使得交联透明质酸具有广阔的应用前景，可以应用于美容填充，骨科填充，化妆品等领域。
高分子量透明质酸一般是指分子量在1000 KDa以上的透明质酸，该类透明质酸因为具有高粘性、高保湿性的优势，在化妆品等领域有广泛的应用。因为透明质酸的粘度随着分子量的增大而升高，因此高分子量的透明质酸与交联透明质酸一样在非常低的浓度下便可形成粘度很高的液体，难于溶解和混合，很难配成高浓度的溶液。
在2015版《化妆品安全技术规范》中规定，生产出售的化妆品必须满足安全性要求，其中包括对微生物限度的检测要求。所谓微生物限度，包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌等项目，都需要满足要求后才能正常销售。
透明质酸固体粉末既可以作为化妆品原料，又可以单独作为美容产品进行使用，因此对透明质酸类产品进行微生物限度检测是必要的。根据2015版《化妆品安全技术规范》中的规定，微生物限度检测需要将待检样品与无菌的生理盐水配成1:10的检液，但是这些高粘度的透明质酸类产品在配制检液过程中存在溶解困难、均匀混合时间长的问题，难以溶解至足够的浓度，且配成的检液因为粘稠度比较大很难在检测用微生物培养皿上形成均匀有效的涂布培养，给微生物限度的检测带来很大困难，也影响了结果的准确性。
为了解决上述问题，现阶段可用无菌透明质酸酶对透明质酸类产品进行预先酶解，降低溶液粘度，然后进行微生物限度检测。但是目前报道的透明质酸酶的酶解温度都是在20℃以上，最佳在37℃左右，酶解pH在中性附近，该酶解温度和pH是环境中很多微生物的最佳生长环境，在检测的过程中很容易造成微生物的快速增殖，导致最终测定的结果高于待测样品中实际的菌体含量。目前这一问题还没有引起行业内的足够重视，现有技术中并没有此问题的报道，更没有解决该问题的相关措施和研究。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法，该方法在低温弱酸条件下对待检样品进行酶解处理，然后再配制检液，降低了检液的配制难度，所得检液易于在培养基上均匀涂布，且酶解过程中微生物增殖量少，提高了检测结果的准确性，解决了目前的方法无法准确测定微生物限度的难题。
针对目前透明质酸类产品常规使用的酶解温度和pH容易导致微生物大量增殖的问题，发明人进行了研究，发现在低温弱酸的环境下虽然会延长酶解的时间，但是依然能够降低透明质酸类产品的粘度，更为重要的是，该低温弱酸环境不适宜环境中大多数的微生物繁殖，因此在检测时可以较好的维持待检样品中的原始微生物含量，大幅度提高了待检样品微生物限度指标的检测准确性。
本发明具体技术方案如下：
一种交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法，该方法包括以下步骤：在低温弱酸条件下对待检的交联透明质酸类物质或高分子量透明质酸类物质进行酶解处理，以降低交联或高分子量透明质酸类物质溶液的粘度，然后将粘度降低的酶解液用于微生物限度检测。
进一步的，本发明所述的检液，指的是2015版《化妆品安全技术规范》中出现的术语“检液”。
进一步的，本发明是针对难于配制检液的交联或高分子量透明质酸类物质提出的，这些物质水溶液粘度大，0.1 wt%的水溶液的粘度可以达到250 mPa·s以上，很难配成高浓度的检液。本发明所述的交联透明质酸类物质指的是采用交联技术获得的透明质酸及其各种盐，譬如交联透明质酸、交联透明质酸钠、交联透明质酸钙等，高分子量透明质酸类物质指的是透明质酸、其盐或其衍生物，包括高分子量透明质酸，高分子量透明质酸钠，高分子量透明质酸镁等。交联或高分子量透明质酸类物质的分子量一般在1000 KDa以上。
进一步的，本发明所述的低温弱酸条件指的是：酶解的温度为4℃~18℃，优选为10℃~18℃，酶解的pH为4.5~5.5。该酶解pH通过无菌的缓冲液提供，无菌缓冲液的pH为4.5~5.5。整个酶解过程在无菌缓冲液中进行。
优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液可以是本领域报道的各种pH为4.5~5.5的磷酸盐缓冲液，例如磷酸氢二钠-磷酸二氢钠-氯化钠缓冲液等，各磷酸盐缓冲液效果相当。磷酸盐缓冲液的浓度优选为5 mM~200 mM。
进一步的，本发明酶解所用的酶可以是现有技术中报道的任意可以在本发明所述的低温弱酸环境下，即pH 4.5~5.5、温度4℃~18℃的条件下对透明质酸进行降解的酶。所述酶可以是微生物产透明质酸酶、蛇毒来源透明质酸酶、水蛭来源透明质酸酶、哺乳动物来源透明质酸酶、硫酸软骨素酶等。其中，哺乳动物来源透明质酸酶最常见的为牛睾丸透明质酸酶。
从成本和操作难易程度上看，蛇毒来源透明质酸酶、水蛭来源透明质酸酶、哺乳动物来源透明质酸酶、硫酸软骨素酶不占优势。以牛睾丸透明质酸酶为例，每检测一个样品的微生物限度，需要45000~90000 单位牛睾丸透明质酸酶，即 30~60支（1500单位/支， 200~300元/支），成本高昂，且使用过程中需采用无菌缓冲液对牛睾丸透明质酸酶粉末进行预先溶解、合并，操作过程复杂，且合并过程中污染风险较高，影响检测结果的可信度。而微生物产透明质酸酶能够批量工业化大生产，成本相对较低，且操作难度也低，因此优选为微生物产透明质酸酶。
优选的，所用酶为芽孢杆菌（Bacillus sp.）产透明质酸酶，更为优选的，所用酶是申请人自行研发的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶（CN201210497017.3），该透明质酸酶能够工业化生产，单位体积酶活产率高，成本相对低，且酶比活可高达8×106 ~5×107 IU/mg，在本发明低温弱酸条件下依然具有较高的酶活性。
进一步的，当透明质酸酶为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶时，每g交联透明质酸类物质或高分子量透明质酸类物质加入10,000 IU~300,000 IU的透明质酸酶。当为其他种类的酶时，可以根据该酶的性能和实验结果调整合适的酶用量。
进一步的，酶解体系中，交联透明质酸类物质或高分子量透明质酸类物质的浓度为0.05-0.15 g/mL。
进一步的，酶解时时刻注意酶解液的粘度，实验发现，当10 wt%浓度的交联透明质酸类物质或高分子量透明质酸类物质的溶液酶解至粘度小于等于10 mPa·s时，此时酶解液肉眼可见无明显粘度或者流动性接近水，此时即可以将酶解液用于微生物限度的检测。该酶解液粘度小，配制检液容易，检液涂布培养基容易，检液浓度符合检测要求。
进一步的，酶解后，将酶解液用灭菌的生理盐水配成1:10的检液，然后进行微生物限度的检测。微生物限度的检测参照2015版《化妆品安全技术规范》中第五章微生物检验方法的步骤进行。
在本发明某一些具体实施方式中，提供了一种交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法，该方法包括以下步骤：
（1）无菌透明质酸酶溶液制备
将含有100,000 IU~3,000,000 IU的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶除菌过滤至含有适量玻璃分散珠的5~200 mM（mmol/L,下同）的无菌缓冲液 (pH4.5~ 5.5)中，制备含有透明质酸酶的无菌缓冲液90 mL。
（2）待检样品的制备
称取 10 g待检的交联或高分子量透明质酸类产品，加入到上述90 mL含有透明质酸酶的无菌缓冲液中，充分振荡混匀，使其分散混悬，在4℃~18℃水浴中振荡30~120 分钟，酶解至酶解液粘度降低、肉眼可见无明显粘度时（粘度大约10mPa·s以下），取10 mL酶解液加入到90 mL无菌生理盐水中，混匀，制成1：10 的检液。
（3）参照2015版《化妆品安全技术规范》第五章微生物检验方法对检液进行检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、在低温弱酸性条件下对待检样品进行酶解处理，然后再进行检测，降低了检液配制和涂布的难度，提高了检测的操作便利性，并且在低温弱酸条件下进行酶解，抑制了大部分微生物在酶解过程中的增殖，提高了微生物限度检测的准确性，解决了现有方法对交联或高分子量透明质酸类产品无法准确测定微生物限度的难题。
2、本发明酶解所用的酶优选采用微生物产透明质酸酶，特别优选采用芽孢杆菌产透明质酸酶，这类透明质酸酶发酵产率高，纯化回收率高，酶制备成本低，进而可以大幅降低微生物限度的检测成本。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的详细说明。然而应当理解，下述说明是为了帮助本领域技术人员更好的理解本发明，并不是对发明内容的限制。
下述实施例中，微生物限度的检测方法参照2015版《化妆品安全技术规范》第五章中记载的微生物检验方法的内容进行操作。
下述实施例中，所用的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶由华熙生物科技股份有限公司提供，所用的牛睾丸透明质酸酶为市购产品。
实施例1
（1）无菌透明质酸酶溶液制备
将含有100,000 IU的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶除菌过滤，加入到含有适量玻璃分散珠的5 mM的无菌磷酸盐缓冲液中(pH5.0)，制备含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液90 mL。
（2）待检样品的制备
称取10 g高分子量透明质酸钠，该高分子量透明质酸钠的分子量为2800 kDa，其0.1wt%水溶液的动力粘度为280 mPa·s。将10 g高分子量透明质酸钠加入到上述90 mL含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液中，充分振荡混匀，使其分散混悬，在15℃水浴中振荡40分钟后，所得酶解液均匀透明，肉眼可见无明显粘度，然后取10 mL酶解液，加入到90 mL无菌生理盐水中，混匀，制成1：10 的检液。
（3）培养基配制
按照2015版《化妆品安全技术规范》第五章制备卵磷脂、吐温 80营养琼脂培养基和0.5%氯化三苯四氮唑。
（4）检测步骤
用灭菌吸管吸取 1：10 稀释的检液 2 mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1 mL。另取 1 mL注入到9 mL灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成 1:100 检液。吸取 2 mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1 mL。
将融化并冷至 45℃~50℃的卵磷脂吐温 80 营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15 mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置 36℃±1℃培养箱内培养 48 h±2 h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15 mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养48h±2h，为空白对照。
为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100 mL卵磷脂吐温 80 营养琼脂中加入1 mL 0.5%的 TTC 溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色。
（5）菌落计数及报告方法
采用2015版《化妆品安全技术规范》第五章微生物检验方法中的菌落计数及报告方法。
实施例2
（1）无菌透明质酸酶溶液制备
将含有150,000 IU的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶除菌过滤，加入到含有适量玻璃分散珠的50 mM的无菌磷酸盐缓冲液中(pH4.5)，制备含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液90 mL。
（2）待检样品的制备
称取 10 g交联透明质酸钠，该交联透明质酸钠0.1wt%水溶液的动力粘度为450 mPa·s。将10 g交联透明质酸钠加入到上述90 mL含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液中，充分振荡混匀，使其分散混悬，在18℃水浴中振荡60 分钟后，所得酶解液均匀透明，肉眼可见无明显粘度，然后取10 mL酶解液，加入到90 mL无菌生理盐水中，混匀，制成1：10 的检液。
其他步骤（3）-（5）同实施例1。
实施例3
（1）无菌透明质酸酶溶液制备
将含有3,000,000 IU的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶除菌过滤，加入到含有适量玻璃分散珠100 mM的无菌磷酸盐缓冲液中(pH4.8)，制备含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液90 mL。
（2）待检样品的制备
称取 10 g交联透明质酸镁，该交联透明质酸镁0.1wt%水溶液的动力粘度为1500mPa·s。将10 g交联透明质酸镁加入到上述90 mL含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液中，充分振荡混匀，使其分散混悬，在10℃水浴中振荡120分钟后，所得酶解液均匀透明，肉眼可见无明显粘度，然后取10 mL酶解液，与90mL无菌生理盐水混合，制成 1：10 的检液。
其他步骤（3）-（5）同实施例1。
实施例4
（1）无菌透明质酸酶溶液制备
将含有1,000,000 IU的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶除菌过滤，加入到含有适量玻璃分散珠的100 mM的无菌磷酸盐缓冲液中(pH5.5)，制备含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液90 mL。
（2）待检样品的制备
称取 10 g交联透明质酸钙，该交联透明质酸钙0.1wt%水溶液的动力粘度为800 mPa·s。将10 g交联透明质酸钙加入到上述90 mL含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液中，充分振荡混匀，使其分散混悬，在12℃水浴中振荡80分钟后，所得酶解液均匀透明，肉眼可见无明显粘度，然后取10 mL酶解液，与90 mL无菌生理盐水混合，制成 1：10 的检液。
其他步骤（3）-（5）同实施例1。
实施例5
（1）无菌透明质酸酶溶液制备
将含有2,000,000 IU的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶除菌过滤，加入到含有适量玻璃分散珠的150 mM的无菌磷酸盐缓冲液中(pH5.0)，制备含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液90 mL。
（2）待检样品的制备
称取 10 g交联透明质酸钾，该交联透明质酸钾0.1wt%水溶液的动力粘度为1250mPa·s。将10 g交联透明质酸钾加入到上述90 mL含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液中，充分振荡混匀，使其分散混悬，在16℃水浴中振荡90分钟后，所得酶解液均匀透明，肉眼可见无明显粘度，然后取10 mL酶解液，与90 mL无菌生理盐水混合，制成 1：10 的检液。
其他步骤（3）-（5）同实施例1。
实施例6
（1）无菌透明质酸酶溶液制备
将含有3,000,000 IU的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶除菌过滤，加入到含有适量玻璃分散珠的200 mM的无菌磷酸盐缓冲液中(pH5.2)，制备含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液90 mL。
（2）待检样品的制备
称取 10 g交联透明质酸，该交联透明质酸0.1%水溶液的动力粘度为250 mPa·s。将10g交联透明质酸加入到上述90 mL含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液中，充分振荡混匀，使其分散混悬，在4℃水浴中振荡120分钟后，所得酶解液均匀透明，肉眼可见无明显粘度，然后取10 mL酶解液，与90 mL无菌生理盐水混合，制成 1：10 的检液。
其他步骤（3）-（5）同实施例1。
实施例7
（1）无菌透明质酸酶溶液制备
将含有1,500,000 IU的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶除菌过滤，加入到含有适量玻璃分散珠的200 mM的无菌磷酸盐缓冲液中(pH5.4)，制备含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液90 mL。
（2）待检样品的制备
称取 10 g交联透明质酸钠，该交联透明质酸钠0.1wt%水溶液的动力粘度为850 mPa·s。将10 g交联透明质酸钠加入到上述90 mL含有透明质酸酶的无菌磷酸盐溶液中，充分振荡混匀，使其分散混悬，在16℃水浴中振荡75分钟后，所得酶解液均匀透明，肉眼可见无明显粘度，然后取10mL酶解液，与90mL无菌生理盐水混合，制成 1：10 的检液。
其他步骤（3）-（5）同实施例1。
实施例8
将实施例1中的透明质酸酶替换为牛睾丸透明质酸酶，其他条件与实施例1相同，测定样品中的细菌含量。本操作需要预先采用缓冲液分批溶解透明质酸酶冻干粉，操作步骤较多，透明质酸酶缓冲液合并过程中不易将溶解的酶液完全收集，每次加入的酶量平行性较差，且成本较高。
实施例9
将实施例1中的透明质酸酶替换为水蛭透明质酸酶，其他条件与实施例1相同，测定样品中的细菌含量。
实施例10
将实施例1中的透明质酸酶替换为硫酸软骨素酶，采购于sigma公司。其他条件与实施例1相同，测定样品中的细菌含量。本操作同样需要预先采用缓冲液分批溶解透明质酸酶冻干粉，操作步骤较多，透明质酸酶缓冲液合并过程中不易将溶解的酶液完全收集，每次加入的酶量平行性较差，且成本较高。
比较例1
按照实施例1的方法检测微生物限度，不同的是：步骤（2）中，水浴振荡温度为37℃。本操作中酶解温度较高，容易造成活跃细菌增殖的风险。
比较例2
将实施例2的交联透明质酸钠不进行酶解，直接用5 mM的无菌磷酸盐缓冲液 (pH5.0)进行稀释，结果显示，交联透明质酸钠无法完全溶解，无法分散均匀，检液定量困难，即使采用无菌磷酸盐缓冲液稀释100倍，1000倍都无法定量稀释，检测无法进一步施行。
上述实施例1-10和比较例1的菌落总数检测结果如下表1所示。
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从上表结果可以看出，采用本发明低温弱酸条件酶解的样品菌落总数明显低于比较例1中采用常规酶解温度的菌落总数，这说明酶解条件选择在微生物易增殖的条件容易造成活跃细菌增殖的风险，使检测结果不准确。从实施例8、9、10看，使用市售的冻干透明质酸酶粉因为溶解冻干粉操作步骤较多，污染风险较高，也会存在检测结果偏高的现象。

Claims (10)

1.一种交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法，其特征是：在低温弱酸条件下对待检的交联透明质酸类物质或高分子量透明质酸类物质进行酶解处理，以降低交联或高分子量透明质酸类物质溶液的粘度，然后将粘度降低的酶解液用于微生物限度检测。
2.根据权利要求1所述的微生物限度检测方法，其特征是：所述交联透明质酸类物质或高分子量透明质酸类物质的0.1 wt%水溶液的粘度大于等于250 mPa·s。
3.根据权利要求1或2所述的微生物限度检测方法，其特征是：所述交联透明质酸类物质为将透明质酸或透明质酸盐进行交联得到的物质，所述高分子量透明质酸类物质为透明质酸、透明质酸盐或透明质酸衍生物。
4.根据权利要求1所述的微生物限度检测方法，其特征是：酶解所用的酶为可以在低温弱酸条件下对透明质酸进行降解的酶；优选的，所述酶包括微生物产透明质酸酶、蛇毒来源透明质酸酶、水蛭来源透明质酸酶、哺乳动物来源透明质酸酶或硫酸软骨素酶；更优选的，所述酶为微生物产透明质酸酶；更更优选的，所述酶为芽孢杆菌（Bacillus sp.）产透明质酸酶；最优选的，所述酶为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶。
5.根据权利要求4所述的微生物限度检测方法，其特征是：当用芽孢杆菌（Bacillussp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶进行降解时，每g交联透明质酸类物质或高分子量透明质酸类物质加入10000 IU~300000 IU的透明质酸酶。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的微生物限度检测方法，其特征是：所述低温弱酸条件指的是：酶解的温度为4℃~18℃，优选为10℃~18℃，酶解的pH为4.5~5.5。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的微生物限度检测方法，其特征是：通过无菌的缓冲液提供酶解时的弱酸条件，所述缓冲液的pH为4.5~5.5，优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度优选为5 mmol/L~200 mmol/L。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的微生物限度检测方法，其特征是：酶解体系中，交联透明质酸类物质或高分子量透明质酸类物质的浓度为0.05~0.15 g/mL。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的微生物限度检测方法，其特征是：当10 wt%浓度的交联透明质酸类物质或高分子量透明质酸类物质溶液酶解至粘度小于等于10 mPa·s时，将所得酶解液用于微生物限度检测。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的微生物限度检测方法，其特征是：将酶解液用灭菌的生理盐水配成1:10的检液，然后进行微生物限度的检测。
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