CN102161728A - 具有生物相容性和温敏性的半互穿网络纳米复合水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开具有生物相容性和温敏性的半互穿网络纳米复合水凝胶及其制备方法与应用。制备方法为将锂藻土分散于水中,搅拌得到均匀透明的分散液,再依次加入生物相容性海藻酸或海藻酸盐、N-异丙基丙烯酰胺单体,搅拌均匀后除氧加引发剂,将反应液装入反应模具中并密封,在15~25℃下通过原位自由基聚合反应得目标产物。所制备的水凝胶中NC凝胶交联网络提供了温度敏感性及高强高韧性,而半互穿的海藻酸或海藻酸盐提高了其生物相容性,因此,此类温度敏感性半互穿网络水凝胶在具有纳米复合水凝胶的高强高韧性的同时还具良好的有生物相容性。细胞可以在水凝胶表面粘附并增殖形成细胞片,降低凝胶所处环境温度则可实现细胞片的快速脱附。
Description
技术领域
本发明涉及生物相容性和环境敏感的高分子材料领域,具体涉及一种既具有良好生物相容性又具有温敏性的半互穿纳米复合水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
聚合物水凝胶因其在食品和生物医学工程等领域的广泛应用,如:食品添加剂、药物控制释放和生物组织填充材料等等,受到人们的普遍关注和研究。其中,温度敏感型聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAm)水凝胶由于存在体积相转变温度而被广泛用于组织工程领域。由于PNIPAm大分子链上同时具有亲水性的基团和疏水性的基团,在温度高于32 ℃时,分子链与水分子之间的氢键遭到破坏,疏水作用占优势,高分子链发生相转变产生体积收缩,水凝胶表面表现为疏水性,利于细胞的贴附和增殖;当温度低于32 ℃时,分子链与水形成氢键,亲水作用占优势,高分子链伸展,水凝胶表面表现为亲水性,可使生长在其表面的细胞或细胞片快速自动脱附。此法避免了使用胰酶消化对细胞及细胞外基质造成的破坏,保持细胞和细胞外基质及其功能的完整性。通过自然脱附得到的细胞片可以直接用于组织工程的移植,避免使用其他载体或支架,对降低移植风险和提高移植成功率十分有利。
然而,传统的温敏性水凝胶强度低韧性差,只能够用于对凝胶强度要求很低的领域;此外,传统温敏性水凝胶的生物相容性以及细胞或细胞片的自动脱附速率都亟待进一步提高。虽然有专利报道(中国专利CN101367947A,CN101328251A,CN1284811C,CN101177487C与CN100341484C)采用具有生物相容性的壳聚糖、葡聚糖、明胶、聚磷酸脂及魔芋葡甘聚糖等制备得到了生物相容性较高的水凝胶,但由于所得凝胶机械性能仍较差并且易碎而限制了其的应用。
根据文献报道Adv. Mater., 2002, 14:1120-1124),Haraguchi等将锂藻土(Laponite)纳米粒子分散在水中,使N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)单体在Laponite分散液中原位自由基聚合,Laponite纳米颗粒起到多官能度交联剂的作用,从而得到了聚N-异丙基丙烯酰胺/Laponite纳米复合水凝胶(PNIPAm/Laponite Nanocomposite Hydrogel,简称NC凝胶)。NC凝胶具有高强高韧的力学性能。另据文献报道(Biomacromocules, 2006, 7:3267-3275),此类高强高韧的NC凝胶可用于人体肝瘤细胞、人体真皮纤维原细胞以及人体脐静脉内皮细胞的培养及通过降温可实现细胞片的自动脱附。但迄今为止,仅有丙烯酰胺类单体能成功制备锂藻土纳米复合水凝胶,同时,NC凝胶表面细胞的粘附和增殖受锂藻土含量影响较大,只有在特定锂藻土含量时细胞才表现出快速增殖,因此其生物相容性受到较大限制。
就生物相容性而言,海藻酸是从天然褐藻中提取的一种多糖,其无毒、无臭并且具有良好的生物相容性,原料丰富、易得且价格低廉。它不仅在食品、纺织、造纸、医药、化妆品等领域具有广泛应用,更重要的是它在药物控释、细胞移植和组织工程等领域都有着重要的用途。钙-海藻酸凝胶可用作组织工程的三维支架,增强细胞的聚集性,还可以有助于保持细胞的活性,被用作体内细胞传输的载体。
因此,我们将海藻酸或海藻酸盐引入到高强高韧的NC凝胶中,在保持NC凝胶良好的力学性能和温度敏感性的基础上,再通过引入线性高聚物海藻酸或海藻酸盐制备半互穿网络得到在较宽的锂藻土含量范围内都具有良好生物相容性的NC凝胶。
发明内容
本发明的目的和内容在于针对现有NC凝胶材料的缺陷和不足,提供具有生物相容性和温敏性的半互穿网络纳米复合水凝胶及其制备方法与应用。该凝胶既具有良好的力学性能和温敏性,又在较宽的锂藻土含量范围内具有良好生物相容性,通过降低环境温度还可以实现细胞或细胞片从用于细胞培养的该水凝胶表面上快速自动脱附。
本发明所制备的具有良好生物相容性和温敏性的半互穿网络纳米复合水凝胶,是由N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)单体、锂藻土Laponite和具有生物相容性的线性高分子海藻酸或海藻酸盐溶于水通过NIPAm单体原位自由基聚合反应制备而成。本发明的目的和内容还在于提供所述水凝胶的制备方法与细胞培养和细胞片的快速脱附。本发明的具体技术方案如下。
具有生物相容性和温敏性的半互穿纳米复合水凝胶的制备方法,该方法将锂藻土分散于水中,搅拌得到均匀透明的分散液,加入海藻酸或海藻酸盐水溶液,再加入N-异丙基丙烯酰胺单体(NIPAm),锂藻土的添加量为N-异丙基丙烯酰胺单体质量的20% ~ 95%,海藻酸或海藻酸盐的用量为N-异丙基丙烯酰胺单体质量的1% ~ 10%,搅拌均匀后除氧加入质量为N-异丙基丙烯酰胺单体质量0.1% ~ 4%的引发剂,将反应液装入模具中并密封;然后将反应体系置于15 ~ 25 ℃下反应即得到所述半互穿网络纳米复合水凝胶。
上述的制备方法中,还将制备的所述复合水凝胶从模具中取出,放入到大量灭菌水中分别反复溶胀和去溶胀以除去未反应物质及其他杂质。
上述的制备方法中,所述N-异丙基丙烯酰胺单体相对于整个反应体系的质量百分比浓度为5% ~ 15%。
上述的制备方法中,在加入海藻酸或海藻酸盐水溶液和NIPAm单体后分别搅使体系充分混合均匀。
上述的制备方法中,制备过程均在无菌环境中完成,用水均为灭菌水。
上述的制备方法中,所述锂藻土包括天然及人工合成锂藻土。所述锂藻土优选 Rockwood公司生产的Laponite 系列两种溶胶型产品,其分子式分别为:
XLS型:[Mg5. 34Li0.66Si8O20(OH)4]Na0. 66,Na4P2O7改性;
RDS型:Na+ 0.7[(Si8Mg5.5Li0.3)O20(OH)4]- 0.7,Na4P2O7改性。所述引发剂为氧化还原引发体系,包括但不限于过硫酸钾和四甲基乙二胺。
本发明还提供上述半互穿纳米复合水凝胶的应用,即纯化后的所述复合水凝胶用于细胞培养和细胞片的快速脱附,包括如下步骤:
将纯化好的所述复合水凝胶切成小片,先放入细胞培养液中在37 ℃的二氧化碳培养箱中预培养;在预培养好的水凝胶表面种植细胞并在37 ℃的二氧化碳培养箱中培养;
待细胞铺满凝胶表面形成细胞片后,降低环境温度,即可使细胞片从水凝胶表面快速脱附。
上述的应用中,所述细胞培养液包括但不限于DMEM培养基;用于细胞培养的细胞包括但不限于人宫颈癌细胞(HeLa)、人肺癌细胞(A549)或人成纤维细胞(L929)。
本发明的温敏性半互穿网络纳米复合水凝胶的制备方法包括以下步骤:
本发明与现有材料和技术相比具有如下优点:
1、本发明制备方法简单,不需要特殊设备,常温常压下操作,反应简单可控,成本低,适于推广应用;
2、本发明通过引入线性生物相容性高聚物制备半互穿网络纳米复合水凝胶,线性高聚物提高了该水凝胶的生物相容性,交联网络则提供了温度敏感性和高强高韧性,因此,该水凝胶即具有纳米复合水凝胶的温度敏感性和高强高韧性,又在较宽的锂藻土含量范围内具有良好生物相容性;
3、本发明通过引入生物相容性线性高聚物,提高了纳米复合水凝胶的生物相容性,更利于细胞在水凝胶表面的粘附和增殖为细胞片;通过降低培养液的温度又能实现细胞片的快速自动脱附,避免了胰酶消化对细胞片造成的损害,更加拓宽了其在组织工程领域的应用;
4、本发明所制备的半互穿纳米复合水凝胶的生物相容性和力学性能均可以通过改变聚合反应体系各组分和锂藻土的用量来进行调节优化,以满足不同使用情况下的需求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。对实施例中得到的半互穿网络纳米复合水凝胶,采用Xiong等Macromolecules, 2009, 42: 3811-3817文献公开方法测定凝胶机械性能,采用Hou等Biomaterials, 2008, 29: 3175-3184文献公开方法进行温敏性检测,采用Haraguchi等Biomacromocules, 2006, 7:3267-3275文献公开方法进行生物相容性检测。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
首先,在无菌实验室中将1.8 g锂藻土Laponte XLS分散于27 g灭菌水中,搅拌3 h得到均匀透明的分散液;然后加入1.5 mL预先制备好的浓度为20 mg/mL的海藻酸水溶液并继续搅拌2 h;再加入3 g单体NIPAm并继续搅拌2 h;最后往反应液中通入氩气10 min,加入引发剂过硫酸钾(KPS,20 mg/mL) 1.5 mL和四甲基乙二胺(TEMED) 60 μL,搅拌均匀后分别注入到玻璃试管和(或)厚度为2 mm的反应模具中,密封并置于20 ℃培养箱中反应24 h即可得到半互穿网络纳米复合水凝胶。玻璃试管制备所得的水凝胶用于测定力学性能和温敏性,该水凝胶的断裂伸长率为1030 %,断裂强度190 kPa,相转变温度为33.2 ℃。片状玻璃模具内水凝胶被置于大量灭菌水中在20 ℃和40 ℃环境中反复溶胀和去溶胀纯化10 d以去除未反应物质及其他杂质,每天更换一次水。将纯化好的水凝胶用模具切成圆片,放入细胞培养液DMEM中在37 ℃二氧化碳培养箱中预培养2天,中间更换一次培养液。在预培养好的水凝胶表面种植密度为3 × 104个 / cm2的人宫颈癌细胞(HeLa),并在37 ℃二氧化碳培养箱中培养,二氧化碳浓度控制在5 %。培养过程中每两天对凝胶表面的细胞进行计数并更换培养液。6天后,细胞密度为80 × 104个/cm2;更换培养液,并将培养液温度降低至室温,观察到细胞片35 min内实现自动脱附。
实施例2
本实施例除下述特征外同实施例1:在无菌实验室中将2.4 g锂藻土Laponte XLS分散于24 g灭菌水中;然后加入4.5 mL浓度为20 mg/mL的海藻酸钠水溶液;该水凝胶的断裂伸长率为1000 %,断裂强度300kPa,相转变温度为34.5 ℃;6天后,HeLa细胞密度为95 × 104个/cm2;将培养液温度降低至室温,观察到细胞片30 min内实现自动脱附。
实施例3
本实施例除下述特征外同实施例1:在无菌实验室中将1.8 g锂藻土Laponte RDS分散于22.5 g灭菌水中;然后加入6 mL浓度为20 mg/mL的海藻酸水溶液;该水凝胶的断裂伸长率为1060 %,断裂强度260kPa,相转变温度为34 ℃;6天后,HeLa细胞密度为98 × 104个/cm2;将培养液温度降低至室温,观察到细胞片25 min内实现自动脱附。
实施例4
本实施例除下述特征外同实施例1:在无菌实验室中将1.5 g锂藻土Laponte RDS分散于19.5 g灭菌水中;然后加入9 mL浓度为20 mg/mL的海藻酸钠水溶液;该水凝胶的断裂伸长率为980 %,断裂强度175 kPa,相转变温度为34.5 ℃;6天后,HeLa细胞密度为95 × 104个/cm2;将培养液温度降低至室温,观察到细胞片30 min内实现自动脱附。
实施例5
本实施例除下述特征外同实施例1:所用细胞为人肺癌细胞(A549)。培养6天后细胞密度为50 × 104个/cm2;将培养液温度降低至室温,观察到细胞片30 min内实现自动脱附。
实施例6
本实施例除下述特征外同实施例1:所用细胞为人成纤维细胞(L929)。培养6天后细胞密度为30 × 104个/cm2;将培养液温度降低至室温,观察到细胞片20 min内实现自动脱附。
实施例7
本实施例除下述特征外同实施例2:所用细胞为人肺癌细胞(A549)。培养6天后细胞密度为50 × 104个/cm2;将培养液温度降低至室温,观察到细胞片30 min内实现自动脱附。
实施例8
本实施例除下述特征外同实施例2:所用细胞为人成纤维细胞(L929)。培养6天后细胞密度为40 × 104个/cm2;将培养液温度降低至室温,观察到细胞片25 min内实现自动脱附。
实施例9
本实施例除下述特征外同实施例3:所用细胞为人成纤维细胞(L929)。培养6天后细胞密度为50 × 104个/cm2;将培养液温度降低至室温,观察到细胞片30 min内实现自动脱附。
实施例10
本实施例除下述特征外同实施例3:所用细胞为人肺癌细胞(A549)。培养6天后细胞密度为45 × 104个/cm2;将培养液温度降低至室温,观察到细胞片30 min内实现自动脱附。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.具有生物相容性和温敏性的半互穿纳米复合水凝胶的制备方法,其特征在于将锂藻土分散于水中,搅拌得到均匀透明的分散液,加入海藻酸或海藻酸盐水溶液,再加入N-异丙基丙烯酰胺单体,锂藻土的添加量为N-异丙基丙烯酰胺单体质量的20% ~ 95%,海藻酸或海藻酸盐的用量为N-异丙基丙烯酰胺单体质量的1% ~ 10%,搅拌均匀后除氧加入质量为N-异丙基丙烯酰胺单体质量0.1% ~ 4%的引发剂,将反应液装入模具中并密封;然后将反应体系置于15 ~ 25 ℃下反应即得到所述半互穿网络纳米复合水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于将制备的所述复合水凝胶从模具中取出,放入到大量灭菌水中分别反复溶胀和去溶胀以除去未反应物质及其他杂质。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述N-异丙基丙烯酰胺单体相对于整个反应体系的质量百分比浓度为5% ~ 15%,制备过程均在无菌环境中完成,用水均为灭菌水。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是在加入海藻酸或海藻酸盐水溶液和NIPAm单体后分别搅使体系充分混合均匀。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述锂藻土包括天然及人工合成锂藻土。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述锂藻土为 Rockwood公司生产的Laponite 系列两种溶胶型产品,其分子式分别为:
XLS型:[Mg5. 34Li0.66Si8O20(OH)4]Na0. 66,Na4P2O7改性;
RDS型:Na+ 0.7[(Si8Mg5.5Li0.3)O20(OH)4]- 0.7,Na4P2O7改性。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述引发剂为氧化还原引发体系,包括过硫酸钾和四甲基乙二胺。
8.由权利要求1~7任一项所述制备方法制得的具有生物相容性和温敏性的半互穿纳米复合水凝胶。
9.权利要求2所述制备方法制得的复合水凝胶的应用,其特征是纯化后的所述复合水凝胶用于细胞培养和细胞片的快速脱附,包括如下步骤:
将纯化好的所述复合水凝胶切成小片,先放入细胞培养液中在37 ℃的二氧化碳培养箱中预培养;在预培养好的水凝胶表面种植细胞并在37 ℃的二氧化碳培养箱中培养;
待细胞铺满凝胶表面形成细胞片后,降低环境温度,即可使细胞片从水凝胶表面快速脱附。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于所述细胞培养液包括DMEM培养基;用于细胞培养的细胞包括人宫颈癌细胞、人肺癌细胞或人成纤维细胞。
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