ES2647101T3 - Composición para un cultivo microbiano embebido - Google Patents

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ES2647101T3 ES12813897.1T ES12813897T ES2647101T3 ES 2647101 T3 ES2647101 T3 ES 2647101T3 ES 12813897 T ES12813897 T ES 12813897T ES 2647101 T3 ES2647101 T3 ES 2647101T3
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Abstract

Composición para el cultivo microbiano embebido tridimensional, comprendiendo dicha composición una celulosa nanofibrilar derivada de plantas desintegrada mecánicamente y por lo menos una fuente de nutrientes, en la que dicha celulosa nanofibrilar se encuentra en forma de hidrogel.

Description

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DESCRIPCION
Composición para un cultivo microbiano embebido.
Campo de la invención
La invención se refiere a nuevas aplicaciones de celulosa fibrilar en el campo de la microbiología. En particular, la invención se refiere a una composición que comprende celulosa fibrilar para procedimientos de cultivo microbiano embebido, que incluyen procedimientos de cultivo microbiano anaerobio y semianaerobio. La invención se refiere además a una matriz tridimensional que comprende celulosa fibrilar para procedimientos de cultivo microbiano embebido, que incluyen procedimientos de cultivo microbiano anaerobio y semianaerobio. La invención se refiere además a la utilización, y a un procedimiento de utilización, de celulosa fibrilar en una matriz para procedimientos de cultivo microbiano embebido y a un procedimiento para el cultivo microbiano embebido.
Antecedentes
En las operaciones de cultivo en las que resulta necesario material de soporte hidrófilo se utilizan materiales de hidrogel, por ejemplo se utilizan ampliamente hidrocoloides de tipo agar en el cultivo de células vegetales, células bacterianas y hongos con diversos fines microbiológicos.
El agar es un polisacárido lineal y no iónico que consiste en D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa y que es producido por algas marinas. En los cultivos sólidos, se extienden suspensiones de células microbianas sobre la superficie del hidrogel de agar, que típicamente contiene 1,5% en peso de agar y líquido nutritivo. Los microorganismos crecen y forman colonias macroscópicas, las cuales pueden separarse y obtenerse cultivos puros. La utilización de placas de agar sólido proporciona un crecimiento bidimensional y requiere la separación mecánica mediante el corte.
Se han propuesto varias alternativas a la utilización de placas de agar, por ejemplo la goma gelano producida por Pseudomonas elodea. La goma gelano es soluble en agua caliente, forma un gel rígido tras el enfriamiento y muestra una estabilidad mejorada a temperaturas más altas. Los hidrogeles basados en goma gelano son muy sensibles a los nutrientes y aditivos y requieren una formulación cuidadosa del medio. Además, la utilización de placas de goma gelano sólida proporciona un crecimiento bidimensional.
En Deguchi S. et al., Preparation and characterisation of nanofibrous cellulose plates as a new solid support for microbial culture, Soft Matter 3(9):1170-1175, 2007, se propone una placa de celulosa nanofibrilar para el cultivo sólido de microorganismos en la que la celulosa se obtiene mediante dispersión de celulosa microcristalina en una solución acuosa saturada de Ca(SCN)2 formando un complejo entre celulosa e iones de tiocianato de calcio, seguido de la disolución de la celulosa mediante calentamiento y la obtención de una solución viscosa. A continuación dicha solución se vierte en una placa de cultivo, se deja solidificar, seguido del lavado con metanol y agua. Tras el lavado, se fija la gelación. La concentración óptima de celulosa en las placas era de entre 2% y 3% en peso. Los poros de las placas se llenaron con un líquido nutritivo apropiado. Sobre las placas de celulosa creció E. coli, B. subtilis y S. cerevisiae, además de T. thermophilus.
La patente US n° 5.254.471 da a conocer un portador para el cultivo de células realizado en fibras ultrafinas. El documento n° WO 2009/126980 da a conocer un hidrogel a base de celulosa, que contiene celulosa con un grado medio de polimerización de 150 a 6.200.
Las técnicas de cultivo microbiano anaerobio y semianaerobio típicamente se consideran difíciles de poner en práctica con los medios de cultivo y sistemas de siembra en placa actuales. Existen varias especies microbianas con una fuerte sensibilidad al oxígeno, tales como las especies de clostridios y, de esta manera, resulta esencial eliminar el oxígeno del medio de cultivo. Además, las colonias microbianas típicamente se recortan del medio de cultivo y después debe eliminarse el medio de cultivo.
Los microbios anaerobios y semianaerobios con frecuencia se cultivan en sistemas embebidos. En dichos sistemas, por ejemplo, se han propuesto cultivos de microbios incluidos en parafina, así como cultivos entre dos capas o placas de agar.
Respecto al cultivo microbiano, la fermentación y el almacenamiento de muestras microbianas, en la actualidad se aplica ampliamente la detección, enumeración y cuantificación de los microbios basadas en técnicas en las que se llevan a cabo reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. En la PCR, se rompen los microbios, liberando su ADN, y éste seguidamente es cuantificado mediante la utilización de cebadores oligonucleótidos específicos, ADN polimerasa termoestable y un ciclador térmico apropiado. Muchos materiales, especialmente los materiales poliméricos, inhiben las reacciones de PCR y provocan que la cuantificación microbiana resulte no fiable. Típicamente, dichos materiales son utilizados como medios de fermentación, medios de cultivo, matriz de almacenamiento de muestras, intensificadores de fermentación y matriz de transporte, que interfieren con los procedimientos de detección y cuantificación.
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Los materiales existentes de cultivo celular tridimensional (3D) no permiten transferir la matriz de hidrogel, por ejemplo con una aguja, sin dañar gravemente las células en cultivo.
De esta manera, existe la necesidad de proporcionar composiciones, matrices y procedimientos mejorados de cultivo microbiano embebido, incluyendo los procedimientos anaerobios y semianaerobios, en los que puedan evitarse, o por lo menos reducirse sustancialmente, las desventajas de los materiales del estado de la técnica.
Sumario
La presente descripción se basa en estudios sobre hidrogeles compuestos de celulosa fibrilar, que se dispersan en un medio acuoso. Las fibras de la celulosa fibrilar son altamente hidrófilas debido a las funcionalidades hidroxilo de los polímeros de celulosa y se encuentran parcialmente recubiertas con polisacáridos de hemicelulosa.
La invención se refiere a una composición que comprende celulosa fibrilar para el cultivo microbiano embebido, en particular a una composición que comprende celulosa fibrilar para el cultivo microbiano 3D incluido. Dicha composición resulta particularmente adecuada para el cultivo microbiano anaerobio y semianaerobio de microbios, tales como bacterias, mohos, levaduras y protozoos. Se entiende que el cultivo microbiano incluye en la presente memoria cualquier tipo de cultivo y de procedimientos de fermentación.
La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de una composición para el cultivo microbiano embebido, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de:
- proporcionar celulosa fibrilar,
- mezclar dicha celulosa fibrilar con agua y fuentes opcionales de nutrientes y aditivos con el fin de obtener una mezcla/composición.
La composición se transfiere o introduce convenientemente en un medio para el cultivo 3D embebido de microbios.
La invención se refiere a la utilización de la composición en una matriz para el cultivo microbiano 3D embebido.
La invención se refiere además a una matriz 3D para el cultivo microbiano embebido, comprendiendo dicha matriz una composición que comprende celulosa fibrilar, fuentes nutricionales y aditivos opcionales, y células microbianas vivas.
Dicha matriz puede utilizarse además como matriz de inmovilización en procedimientos de fermentación y para el almacenamiento y transporte de microbios, en particular en el que los microbios se seleccionan de entre bacterias, mohos, levaduras y protozoos.
La descripción se refiere además a la utilización, y a un procedimiento de utilización, de celulosa fibrilar en una matriz 3D para el cultivo microbiano embebido, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de:
- proporcionar células microbianas vivas en donde el microbio se selecciona de entre bacterias, mohos, levaduras y protozoos,
- proporcionar una composición que comprende celulosa fibrilar y fuentes nutricionales opcionales y aditivos opcionales,
- incorporar dichas células microbianas en la composición con el fin de obtener una organización tridimensional.
La invención se refiere además a un procedimiento para el cultivo embebido de microbios, en particular para el cultivo embebido 3D de microbios, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de:
- proporcionar células microbianas vivas, en donde el microbio se selecciona de bacterias, mohos, levaduras y protozoos,
- poner en contacto las células con una composición que comprende celulosa fibrilar,
- cultivar las células dentro de dicha matriz en una organización tridimensional en un medio para el cultivo microbiano embebido.
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La presente invención se basa en la utilización de celulosa fibrilar en la matriz de cultivo microbiano 3D embebido.
Las células microbianas se dividen sobre y dentro del medio, inician la proliferación y empiezan a crecer espontáneamente agrupaciones celulares sin acumularse células sobre el fondo de la plataforma de cultivo celular. La división homogénea de las células en la celulosa fibrilar es un requisito previo para que el material funcione como medio de cultivo microbiano 3D.
La celulosa fibrilar es inerte y no emite fondo fluorescente y, de esta manera, no interfiere en el análisis. El medio que comprende celulosa fibrilar puede inyectarse, dispersarse y bombearse. Esta propiedad se explica en las propiedades reológicas de los hidrogeles basados en celulosa fibrilar. La inyección puede llevarse a cabo de manera que las células se mantienen estables dentro de la matriz y se distribuyen homogéneamente en la misma después de la inyección.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención proporciona medios para el cultivo embebido y la fermentación de los microbios utilizando una composición que comprende celulosa fibrilar, en la que la composición se encuentra en una forma de hidrogel. Dicho procedimiento de cultivo resulta particularmente adecuado para los sistemas de cultivo anaerobio y semianaerobio, tanto a escala pequeña como a escala más grande de fermentación industrial y a escala muy grande, tal como en procedimientos de biolixiviación.
Los elementos característicos de la invención se presentan en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra gráficamente el número de células de la bacteria de referencia Clostridium perfringens al inicio (0 h) y después de la incubación durante la noche sobre celulosa fibrilar.
La figura 2 ilustra gráficamente una PCR cuantitativa llevada a cabo a partir de una serie de dilución de C. perfringens, que muestra una elevada correlación lineal entre la dilución y la respuesta en la PCR en presencia o en ausencia de celulosa fibrilar de origen vegetal al 1,5% en peso.
La figura 3 ilustra la cuantificación microbiana de C. perfringens en presencia de celulosa fibrilar y la detección de colonias.
La figura 4 ilustra una serie de dilución de C. perfringens cultivada en la combinación de celulosa fibrilar y medio de agar base Perfringens. Las colonias de C. perfringens son visibles como puntos negros.
La figura 5 ilustra las diluciones de C. perfringens. Dilución 10-8 y dilución 1-6 de la combinación de celulosa fibrilar y medio agar base Perfringens.
La figura 6 ilustra la difusión de dextranos de diferente peso molecular (20 kDa, 70 kDa y 250 kDa) por hidrogel de nanofibrillas de celulosa natural al 1%.
La figura 7 ilustra la viscosidad de hidrogeles de celulosa fibrilar al 0,5% como función del esfuerzo cortante aplicado en comparación con una solución al 0,5% de los polímeros solubles en agua poliacrilamida (5.000 kDa) y CMC (250 kDa).
La figura 8 ilustra la viscosidad de hidrogeles CNF al 0,5% como función de la tasa de cizalla medida en una comparación con poliacrilamida al 0,5% y CMC. Las regiones típicas de la tasa de cizalla de diferentes procedimientos físicos han sido marcados en la figura con flechas.
La figura 9 ilustra una presentación esquemática de células que contienen hidrogel de celulosa fibrilar fluyendo dentro de una aguja. La región de tasa de cizalla elevada (baja viscosidad) se encuentra localizada en la interfaz gel-aguja y la región de baja tasa de cizalla (viscosidad muy elevada) se encuentra localizada en la parte intermedia de la aguja.
La figura 10 ilustra la estabilidad de dos suspensiones de grava en hidrogel de celulosa fibrilar natural al 0,5% (fila superior) y en hidrogel de celulosa fibrilar aniónica al 0,5% (fila inferior) durante un periodo de 17 días. La grava era arena de estándar CEN (EN 196-1) con un tamaño de partícula medio de entre 1 y 2 mm y de entre 2 y 3 mm. Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente.
Definiciones
A menos que se indique lo contrario, los términos que se utilizan en la memoria y en las reivindicaciones presentan los significados utilizados comúnmente en el campo de la microbiología y de las macromoléculas. Específicamente, los términos siguientes presentan los significados indicados a continuación.
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La expresión "cultivo microbiano embebido" el contexto de la presente memoria se refiere a un cultivo microbiano 3D en el que los cultivos que se cultivan se encuentran parcial o totalmente incluidos en el medio de cultivo o matriz que comprende celulosa fibrilar. Se entiende que en la presente memoria el cultivo microbiano embebido comprende los cultivos anaerobios y semianaerobios de los microbios en que los microbios presentan un acceso nulo o limitado a oxígeno.
La expresión "cultivo microbiano" se refiere en la presente memoria a cualquier cultivo o fermentación de microbios, incluyendo procedimientos de biolixiviación.
La expresión "cultivo anaerobio" se refiere en la presente memoria a un cultivo microbiano en un medio que no contiene oxígeno. El cultivo anaerobio resulta particularmente adecuado para, por ejemplo, anaerobios obligados.
La expresión "cultivo semianaerobio" se refiere en la presente memoria a un cultivo microbiano en un medio que contiene cantidades limitadas de oxígeno. Dicho cultivo resulta particularmente adecuado para, por ejemplo, organismos aerotolerantes y aerobios facultativos.
El término "microbios" se refiere en la presente memoria a mohos, levaduras, bacterias y protozoos. Son ejemplos de dichos microbios, en particular, especies pertenecientes a cualquiera de los grupos de anaerobios obligados, organismos aerotolerantes y aerobios facultativos.
El término o expresión "medio" o "medio de cultivo" se refiere en la presente memoria a medio nutricional que resulta necesario para la propagación de cualquier microbio. El medio bioquímico (nutricional) se encuentra disponible en forma de un medio de cultivo. Los medios de cultivo se utilizan en el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de microbios y también se utilizan para la identificación de, por ejemplo, bacterias según sus propiedades bioquímicas y fisiológicas.
El término "biolixiviación" o "biolixiviación en pilas" se refiere en la presente memoria a un procedimiento de biooxidación en el que se utilizan bacterias para convertir los compuestos metálicos insolubles en minerales, que contienen metales, tales como cobre, oro, cinc, cobalto, níquel y uranio, en compuestos metálicos solubles en agua, que pueden convertirse adicionalmente en metales elementales.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "celulosa fibrilar" se entiende que comprende todas las celulosas microfibriladas (MFC) y nanocelulosas. Además, existen algunos otros sinónimos ampliamente utilizados para la celulosa fibrilar. Por ejemplo: nanofibras de celulosa, celulosa nanofibrilada (CNF), celulosa nanofibrilar (NFC), celulosa fibrilar a nanoescala, celulosa microfibrilar y microfibrillas de celulosa.
Además, la celulosa fibrilar que es producida por determinados microbios también presenta diversos sinónimos, por ejemplo, celulosa bacteriana (BC), celulosa microbiana (MC), biocelulosa, nata de coco (NDC) o coco de nata (CDN).
Descripción detallada de la invención
Inesperadamente se ha encontrado que una composición que comprende celulosa fibrilar resulta adecuada para el cultivo microbiano 3D embebido, en particular en el caso de que la celulosa fibrilar se encuentre en la forma de hidrogel. Dicha composición puede utilizarse en una matriz para el cultivo microbiano embebido en el que resulta esencial proporcionar condiciones anaerobias o semianaerobias para el crecimiento microbiano. De esta manera, la invención proporciona medios para el cultivo microbiano embebido, así como un procedimiento para el cultivo embebido de microbios, en particular para el cultivo anaerobio y semianaerobio de microbios.
Las células microbianas se dividen en la composición, empiezan a proliferar y las agrupaciones celulares empiezan a crecer espontáneamente. Las células se dividen homogéneamente en el medio de cultivo que comprende celulosa fibrilar. La división homogénea de las células en la celulosa fibrilar es un requisito previo para que el material funcione en el cultivo microbiano 3D embebido. El cultivo embebido permite el cultivo con cantidades limitadas de aire u oxígeno, así como sin aire u oxígeno, si se desea.
La estructura de hidrogel permite que los microbios crezcan y se dividan uniformemente en la matriz de gel sin sedimentarse o acumularse sobre el fondo del recipiente, tal como un recipiente fermentador. El hidrogel también presenta la capacidad de estabilizar los nutrientes, sustratos y cualesquiera otros componentes incluidos en la composición o en el medio de fermentación y evita la posible sedimentación de los mismos. Las propiedades del hidrogel pueden ajustarse según las necesidades de más o menos viscoso mediante la selección de un grado adecuado de celulosa fibrilar o mediante la modificación de la cantidad de celulosa fibrilar en el hidrogel.
Las características anteriormente indicadas resultan valiosas en cultivo a pequeña escala, así como en el cultivo a escala más grande en recipientes fermentadores, y en particular en grandes procedimientos de biolixiviación,
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en los que el hidrogel de celulosa fibrilar proporciona el medio de crecimiento óptimo para los microbios al evitar la sedimentación del sustrato sólido de mineral/piedra. El medio de crecimiento se mantiene más homogéneo y el procedimiento de biolixiviación se mantiene más estable y resulta más fácilmente controlable.
La celulosa fibrilar puede obtenerse a particular de cualquier materia prima de celulosa de origen vegetal o puede originarse a partir de microbios productores de celulosa, es decir, celulosa microbiana.
La expresión "materia prima de celulosa" se refiere a cualquier fuente de materia prima de celulosa que contiene celulosa y que puede utilizarse en la producción de pulpa de celulosa, pulpa refinada y celulosa fibrilar.
El material vegetal puede ser madera y dicha madera puede proceder de una especie de árbol de madera blanda, tal como pícea, pino, abeto, alerce, abeto de Douglas o tsuga, o de una especie de árbol de madera dura, tal como abedul, álamo, chopo, aliso, eucalipto o acacia, o de una mezcla de especies de árbol de madera blanda y de madera dura. El material no madera puede ser de residuos agrícolas, hierbas u otras sustancias vegetales, tales como paja, hojas, corteza, semillas, cáscaras, flores, verduras o frutos del algodón, maíz, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, lino, cáñamo, cáñamo de Manila, cáñamo de sisal, yute, ramio, kenaf, bagazo, bambú o caña.
La materia prima de celulosa también puede obtenerse a partir de microbios productores de celulosa, tal como de procesos de fermentación bacteriana. Los microbios pueden ser del género Acetobacter, Agrobacterium, Rhizobium, Pseudomonas o Alcaligenes, preferentemente del género Acetobacter, y más preferentemente de la especie Acetobacter xylinum o Acetobacter pasteurianus.
La expresión "pulpa de celulosa" se refiere a fibras de celulosa, las cuales se aíslan a partir de cualquier materia prima de celulosa mediante procedimiento químico, mecánico, termo-mecánico o quimio-termo-mecánico de pulpeado.
La pulpa de celulosa de origen vegetal, especialmente la madera (pulpa de madera blanda o de madera dura, por ejemplo pulpa de madera de abedul blanqueada), y en donde las moléculas de celulosa son oxidadas en uno de los procedimientos anteriormente indicados, resulta fácil de desintegrar formando celulosa fibrilar utilizando cualquiera de los procedimientos mecánicos de desintegración.
La expresión "celulosa fibrilar" se refiere a una colección de microfibrillas de celulosa aisladas (nanofibras) o haces de microfibrillas obtenidas a partir de materia prima de celulosa. Las microfibrillas típicamente presentan una relación de aspecto elevada: la longitud es superior a un micrómetro mientras que el diámetro medio en número típicamente es inferior a 200 nm. El diámetro de los haces de microfibrillas también puede ser mayor aunque generalmente es inferior a 1 pm. Las microfibrillas más pequeñas son similares a las denominadas fibrillas elementales, que típicamente presentan 2 a 12 nm de diámetro. Las dimensiones de las fibrillas o haces de fibrillas dependen de la materia prima y del procedimiento de desintegración.
La celulosa fibrilar se caracteriza por valor de retención del agua muy elevados, un elevado grado de accesibilidad química y la capacidad de formar geles estables en agua o en otros solventes polares. El producto de celulosa fibrilar típicamente es una malla densa de celulosas altamente fibriladas. La celulosa fibrilar también puede contener algunas hemicelulosas; la cantidad depende del origen vegetal.
Con el fin de obtener celulosa fibrilar, se lleva a cabo la desintegración mecánica de la materia prima de pulpa de celulosa o celulosa oxidasa con equipos adecuados, tales como un refinador, triturador, homogeneizador, coloidador, triturador de fricción, sonicador de ultrasonidos, fluidificador, tal como un microfluidificador, macrofluidificador u homogeneizador de tipo fluidificador. Preferentemente se utiliza celulosa fibrilar que ha sido desintegrada mecánicamente.
Se han desarrollado diferentes grados de celulosa fibrilar utilizando diversas técnicas de producción. Los grados presentan diferentes propiedades dependiendo del procedimiento de fabricación, grado de fibrilación y composición química. Las composiciones químicas de los grados también varían. Según la fuente de materia prima, por ejemplo, pulpa de peso elevado vs. pulpa de peso bajo, la composición de polisacáridos es diferente en el producto final de celulosa fibrilar. Típicamente, los grados no iónicos o nativos presentan un diámetro de fibrilla más grande, mientras que los grados modificados químicamente son mucho más delgados. La distribución de tamaños también es más estrecha en el caso de grados modificados.
Se entiende que la celulosa fibrilar comprende en la presente memoria cualesquiera derivados química o físicamente modificados de celulosa, celulosa fibrilar o haces de nanofibras, obtenidos de cualesquiera materias primas de celulosa de origen vegetal. La modificación química puede basarse en, por ejemplo, la reacción de carboximetilación, de oxidación, incluyendo la oxidación mediada por TEMPO, de esterificación o de eterificación de las moléculas de celulosa. La modificación también puede llevarse a cabo mediante adsorción física de sustancias aniónicas, catiónicas o no iónicas o cualquier combinación de las mismas sobre la superficie de la celulosa. La modificación indicada puede llevarse a cabo antes, después o durante la producción de la celulosa
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fibrilar. Determinadas modificaciones pueden conducir a materiales que son degradables en el cuerpo humano. Los grados modificados típicamente se preparan a partir de pulpas blanqueadas. En los grados modificados, las hemicelulosas también son modificadas junto con el dominio celulosa. Con toda probabilidad, la modificación no es homogénea, es decir, algunas partes resultan más modificadas que otras. De esta manera, el análisis químico detallado no resulta posible: los productos modificados en todos los casos son mezclas complejas de diferentes estructuras de polisacárido.
Los grados modificados químicamente, en particular los derivados modificados química o físicamente, tales como los grados aniónicos y catiónicos, típicamente presentan una carga superficial modificada y convenientemente pueden utilizarse en forma de polvos secos o de un gel acuoso.
Los polvos secos de celulosa fibrilar pueden fabricarse convenientemente mediante secado por pulverización y/o liofilización de una suspensión o de dispersiones que contienen dicha celulosa fibrilar, utilizando cualesquiera procedimientos convencionales conocidos de la técnica. Convenientemente, los grados modificados químicamente se secan mediante pulverización y opcionalmente se granulan. Estos pueden reconstituirse en gel con agua. Convenientemente, la materia prima de celulosa, tal como la pulpa e celulosa, se pretrata con ácido y base antes de la desintegración mecánica. El pretratamiento se lleva a cabo sometiendo la pulpa de celulosa a tratamiento ácido, preferentemente con ácido clorhídrico, para eliminar cualesquiera iones cargados positivamente con una carga superior a +1, seguido del tratamiento con una base inorgánica que contiene iones cargados positivamente con una carga de +1, preferentemente NaOH, en donde los iones Na+ sustituyen a los iones anteriores. La ausencia de cualesquiera iones cargados positivamente con una carga superior a +1 resulta particularmente ventajosa en aplicaciones de ciencias biológicas y de biología molecular en las que pueda evitarse la formación de complejo de ADN con iones con cargas superiores a +1. El pretratamiento proporciona al producto final excelentes propiedades de gelificación y de transparencia. La celulosa fibrilar obtenida a partir de la materia prima de celulosa pretratada se denomina en la presente memoria celulosa fibrilar de iones intercambiados.
La pureza microbiana de la celulosa fibrilar con frecuencia resulta esencial. Por lo tanto, la celulosa fibrilar puede esterilizarse antes de la utilización, convenientemente en forma de un gel. Además, resulta importante minimizar la contaminación microbiana del producto antes y durante la desintegración mecánica, tal como la fibrilación. Antes de la fibrilación/desintegración mecánica, resulta ventajoso recoger asépticamente la pulpa de celulosa de la procesadora de pulpa inmediatamente después de la etapa de blanqueamiento cuando la pulpa todavía es estéril.
La expresión "celulosa fibrilar" se refiere en la presente memoria a un grado o tipo de celulosa fibrilar o a una combinación de dos o más grados o tipos diferentes de celulosa fibrilar. Por ejemplo, pueden mezclarse grados modificados químicamente de celulosa fibrilar con grado nativo.
El gel o hidrogel de celulosa fibrilar se refiere en la presente memoria a una dispersión acuosa de celulosa fibrilar. La celulosa fibrilar presenta una excelente capacidad de gelificación, lo que implica que forma un hidrogel ya a una consistencia baja en un medio acuoso.
Convenientemente, en la presente invención se utiliza celulosa fibrilar de origen vegetal.
La fuente de nutrientes se selecciona según los requisitos específicos de cada microbio, que se somete a cultivo. En particular en los procedimientos de biolixiviación, la fuente de nutrientes incluye sustratos seleccionados de entre minerales de metal triturados para proporcionar metales valiosos, tales como cobre, cinc, níquel, cobalto, etc.
Opcionalmente, pueden incluirse en la composición aditivos adicionales bien conocidos por el experto en la materia, utilizados generalmente en el cultivo microbiano, tales como factores de crecimiento, sales inorgánicas, antibióticos, etc.
La celulosa fibrilar de origen vegetal convenientemente se utiliza en forma de un hidrogel, que puede obtenerse también mediante la reconstitución de unos polvos secos antes de la utilización mediante la puesta en contacto de los mismos con agua. En particular, los grados modificados, tales como los grados aniónicos y catiónicos, pueden proporcionarse en forma de productos secos, tales como polvos e hidrogeles. Los grados nativos y no iónicos preferentemente se proporcionan en forma de hidrogeles.
La composición puede proporcionarse en forma de un hidrogel listo para la utilización, que puede preesterilizarse y empaquetarse en paquetes estériles, o puede envasarse en forma de un hidrogel, por ejemplo, por ejemplo en un aplicador o recipiente o jeringa, que puede utilizarse para la aplicación del gel.
El diámetro medio en número de las fibrillas de celulosa convenientemente es de entre 1 y 200 nm, preferentemente el diámetro medio en número de las fibrillas de los grados nativos es de entre 1 y 100 nm y en grados modificados químicamente es de entre 1 y 20 nm.
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La composición comprende entre 0,05% y 80% en peso de celulosa fibrilar. En el caso de que la composición sea un hidrogel, puede comprender entre 0,05% y 5% en peso, convenientemente entre 0,1 y 3% en peso de celulosa fibrilar. Una composición seca, tal como unos polvos, puede comprender cantidades más elevada de celulosa fibrilar, típicamente de hasta aproximadamente 95% en peso. La composición seca puede reconstituirse con agua antes de la utilización.
La composición puede comprender entre 0,05% y 80% en peso, convenientemente entre 0,1% y 50% en peso, en particular entre 0,1% y 40% en peso de la fuente de nutrientes. Dicha fuente de nutrientes puede comprender por lo menos uno de los siguientes: una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de minerales y una fuente de elementos traza. La fuente rica en nutrientes se refiere en particular a procedimientos de biolixiviación en los que el sustrato de mineral de metal está comprendido en la fuente de nutrientes.
La composición puede comprender agua, convenientemente agua desionizada o esterilizada, dependiendo del procedimiento de cultivo. Convenientemente, la celulosa fibrilar se mezcla cuidadosamente con agua con el fin de evitar la formación de burbujas de aire y la inclusión de aire en el hidrogel.
Los hidrogeles de celulosa fibrilar presentan típicamente un elevado límite elástico y una viscosidad de corte cero elevada a concentraciones bajas. De esta manera, los hidrogeles estabilizan eficazmente las partículas sólidas frente a la sedimentación, tal como se muestra en el Ejemplo 6. Las mismas características físicas también evitan las burbujas de gas, que posiblemente se formen en el gel, emergentes de los hidrogeles de celulosa fibrilar. Sin embargo, la flotabilidad de las burbujas de gas puede incrementarse mediante la reducción de la presión de gas (por ejemplo de 15 mmHg) sobre el gel, lo que reduce la solubilidad del gas en la fase de hidrogel y que por consiguiente incrementa el volumen de burbujas de gas iniciales. Las burbujas de gas incrementadas se escapan fácilmente a la fase gaseosa superior, mientras que los microbios en cultivo se mantienen en la fase gel. Este ciclo de presiones también puede repetirse si se desea con el fin de recoger los productos gaseosos formados.
Dicha composición de hidrogel puede comprender además componentes adicionales, dependiendo de los microbios que se cultiven.
La composición puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
- proporcionar celulosa fibrilar,
- mezclar dicha celulosa fibrilar de origen vegetal y fuentes de nutrientes opcionales y aditivos opcionales con agua con el fin de obtener la composición. En el caso de que se prepare una composición seca para la reconstitución, se incluye una etapa opcional de secado.
Dicha composición puede convenientemente ponerse en contacto con un inóculo de células microbianas vivas, en la que dichos microbios se seleccionan de entre bacterias, levaduras, mohos y protozoos y se transfieren o introducen en un medio para el cultivo embebido de dichos microbios.
La descripción se refiere además a una matriz tridimensional (3D) que comprende la composición que comprende celulosa fibrilar y células microbianas vivas, para el cultivo microbiano embebido.
El procedimiento de utilización de celulosa fibrilar en una matriz para el cultivo microbiano embebido comprende las etapas de:
- proporcionar células microbianas vivas,
- proporcionar una composición que comprende celulosa fibrilar y fuentes opcionales de nutrientes y aditivos opcionales,
- cultivar las células en dicha composición en una organización 3D en un medio para el cultivo microbiano embebido.
El medio para el cultivo microbiano embebido se refiere a un medio en el que se elimina el oxígeno parcial o totalmente.
La invención se refiere además a un procedimiento para el cultivo 3D embebido de los microbios, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- proporcionar células microbianas vivas, en el que dichos microbios se seleccionan de entre bacterias, levaduras, mohos y protozoos,
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- poner en contacto las células microbianas con una composición que comprende celulosa fibrilar para formar una matriz 3D,
- cultivar las células dentro de dicha matriz 3D en una organización tridimensional en un medio para el cultivo embebido.
Pueden seleccionarse componentes y fuentes de nutrientes adicionales en la composición, en la matriz y en el procedimiento de cultivo considerando los requisitos de los microbios en cada caso.
Además, la matriz que contiene celulosa fibrilar, en forma de hidrogel, permite la fácil difusión de partículas pequeñas, lo que posibilita el lavado de, por ejemplo, virus pequeños junto con el agua. Este efecto de difusión también se ejemplifica en los ejemplos.
Dicha composición resulta particularmente adecuada como matriz o como componente en una matriz para el cultivo microbiano embebido para procedimientos analíticos, y en procedimientos de fermentación anaerobia o semianaerobia de microbios. Dichos procedimientos de fermentación pueden operarse por lotes o en continuo y pueden llevarse a cabo a una escala pequeña o a escala mayor, industrial, y a escala muy grande, tal como los procedimientos de biolixiviación, en particular en pilas de tipo biológico. La composición también puede utilizarse convenientemente en procedimientos de fermentación líquida o semilíquida a gran escala, en los que se producen enzimas industriales, cultivos de inóculo, etc. y también en procedimientos de biolixiviación. Por ejemplo, la fuente de nutrientes puede recircularse a través del recipiente fermentador.
Dicha composición y matriz también pueden utilizarse para el almacenamiento y transporte de microbios, y como matriz de inmovilización en procedimientos de fermentación, en particular de microbios anaerobios.
La celulosa fibrilar por sí sola no proporciona una fuente de carbono adecuada y, de esta manera, por sí sola no proporciona un crecimiento suficiente. Sin embargo, la estructura 3D mejora el crecimiento microbiano bajo condiciones de crecimiento adecuadas. La estructura 3D de hidrogel proporciona una difusión molecular libre, soporte suficiente aunque, por otra parte, también suficiente flexibilidad.
Tras completar el procedimiento, resulta fácil retirar el material de hidrogel remanente basado en celulosa fibrilar del material de crecimiento celular, por ejemplo utilizando la dilución con líquido acuoso o no acuoso, seguido de decantación, filtración o sedimentación utilizando una centrifugación moderada; o enzimas degradadores de la celulosa, tales como celulasas. En el caso de que los microbios en cultivo no sean patogénicos, también resulta posible utilizar el material de celulosa fibrilar separado remanente como pienso para animales.
La composición puede encontrarse en la forma de hidrogel listo para la utilización, que puede preesterilizarse y envasarse en recipientes estériles, paquetes, etc., o puede pre-empaquetarse en forma de un hidrogel, por ejemplo en recipientes o jeringas de menor tamaño, que pueden utilizarse para la aplicación del gel. La viscosidad del hidrogel puede modificarse fácilmente según los requisitos de utilización.
Además, la composición puede incorporarse en un kit, que puede utilizarse, por ejemplo, con fines analíticos. Dicho kit puede comprender un recipiente transparente, delgado y sellado que comprende hidrogel preesterilizado, tal como una cubeta pequeña o un recipiente delgado que presente esencialmente una longitud y altura mayores que el grosor. La muestra de microbios puede inyectarse en dicho hidrogel, seguido de la incubación bajo condiciones anaerobias o semianaerobias para dicha muestra de microbios, y la enumeración y detección pueden llevarse a cabo utilizando cualesquiera procedimientos adecuados, tales como procedimientos visuales automáticos en el caso de que los microbios proporcionen colonias visibles (por ejemplo el anaerobio Clostridium perfringens), mediante UV o utilizando procedimientos de enumeración de PCR. Puede resultar conveniente mezclar la muestra de microbio con una pequeña cantidad del hidrogel antes de la inyección en el recipiente de ensayo.
En el procedimiento de cultivo embebido, las células microbianas típicamente se suspenden homogéneamente en la fase continua (hidrogel) debido al soporte mecánico proporcionado por las fibras de celulosa fibrilar. El notablemente elevado límite elástico estabiliza las células microbianas y las agrupaciones de células que aparecen, frente a la sedimentación.
Los hidrogeles de celulosa fibrilar proporcionan propiedades próximas a óptimas en particular para el cultivo 3D:
- son hidrogeles transparentes, no tóxicos, de origen no animal y altamente viscosos,
- presentan un poder de suspensión elevado, elevada retención de agua y buena adhesión mecánica,
- son insensible a sales, a la temperatura o al pH,
- son no degradables bajo las condiciones de cultivo,
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- no presentan autofluorescencia debido a la estructura química del material,
- son dispensables, bombeables, inyectables mediante jeringa,
- la celulosa fibrilar es inerte y no interfiere con el análisis.
La matriz que comprende celulosa fibrilar también resulta particularmente adecuada para el almacenamiento y el transporte de microbios, así como a modo de matriz de inmovilización para la fermentación microbiana y el enriquecimiento microbiano, sin ningún riesgo de detección potencial o problemas de enumeración, en particular microbios anaerobios.
La cuantificación y enumeración de los microbios actualmente se lleva a cabo normalmente. Resulta esencial que el medio de cultivo no comprenda materiales que interfieran o inhiban las reacciones de PCR y provoquen que la cuantificación de microbios resulte no fiable. La composición o matriz que comprende celulosa fibrilar no interactúa o inhibe la detección de PCR o la enumeración microbiana basada en la PCR, comprendiendo la utilización de la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en tiempo real, en la que los microbios se rompen, liberando su ADN, seguidamente este ADN es cuantificado mediante la utilización de cebadores oligonucleótidos específicos, ADN polimerasa termoestable y un ciclador térmico apropiado. Lo anterior se ilustra en los ejemplos.
Una ventaja significativa es que el medio de cultivo, la composición o la matriz que comprende celulosa fibrilar de origen vegetal puede inyectarse o, a escala más grande, bombearse. Lo anterior permite una manipulación y transferencia muy sencillas del material sin necesidad de utilizar medios mecánicos, tales como el corte, etc. La inyectabilidad se explica por las propiedades reológicas únicas de la celulosa fibrilar de origen vegetal. La inyección puede llevarse a cabo de manera que las células se mantengan estables dentro del hidrogel o matriz y se mantengan distribuidas homogéneamente en el hidrogel o matriz después de la inyección o bombeo. Puede recolectarse con facilidad una cantidad pequeña o una única colonia a partir de la matriz mediante, por ejemplo, la utilización de una pipeta estéril, seguido de la caracterización o análisis, proporcionando una detección simple y un aislamiento de colonias nada complicado.
Además, el hidrogel no altera las técnicas de biología molecular utilizadas frecuentemente para caracterizar los microbios aislados. El cultivo embebido anaerobio de Clostridium perfringens, en una matriz que comprende hidrogel de celulosa fibrilar de origen vegetal se ilustra en los ejemplos.
La composición y el hidrogel de celulosa fibrilar puede esterilizarse previamente y pueden enfriarse antes de la utilización, permitiendo de esta manera mantener una reserva de matrices de hidrogel de celulosa fibrilar esterilizada en estantes listos para la utilización cuando se desee. Por lo tanto, por ejemplo los trabajadores de un laboratorio pueden disponer de reservas de composiciones de celulosa fibrilar esterilizada sobre estantes. Resulta muy conveniente mezclar una muestra microbiana en las mismas y llevar a cabo la incubación bajo condiciones adecuadas para el cultivo microbiano. Lo anterior permite ahorra tiempo y resulta poco agresivo para los microbios. La celulosa fibrilar permite una fácil inoculación, buenas características de crecimiento, en particular la suavidad del hidrogel de celulosa fibrilar permite un buen crecimiento de los microbios incluidos en el mismo.
La composición y matriz también resultan adecuados en aplicaciones analíticas y diagnósticas, en las que se utilizan robots de laboratorio, en particular preferentemente en el cultivo anaerobio y semianaerobio de microbios.
Según una forma de realización preferida de la invención resulta particularmente adecuado para el cultivo de bacterias anaerobias, bacterias facultativas, bacterias aerotolerantes, protozoos, mohos y levaduras.
A una escala más grande, industrial, los microorganismos pueden cultivarse en recipientes fermentadores en un medio de cultivo que comprende componentes líquidos y componentes sólidos y la composición de la invención, o también en pilas de tipo biológico de mayor tamaño en procedimientos de biolixiviación.
El hidrogel 3D que comprende celulosa fibrilar proporciona una matriz excelente para el cultivo embebido anaerobio y semianaerobio, en particular el cultivo de bacterias anaerobias, tales como Clostridium perfringens. La invención proporciona además una excelente composición y matriz para el cultivo de varios organismos patogénicos y microbios del suelo, los cuales con frecuencia resultan difícil de cultivar utilizando técnicas convencionales de cultivo. Lo anterior resulta particularmente útil en los procedimientos de detección y caracterización en el campo de la microbiología y el diagnóstico. Son ejemplos de dichos organismos Streptococcus de grupo A y de grupo B, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Acinetobacter baumannii, Coxiella burnetii, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Leptospira species, Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria meningitides, y los ejemplos de bacterias del suelo Pseudomonas putida y Arthrobacter globiformis.
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Ejemplos
Los ejemplos a continuación son ilustrativos de formas de realización de la presente invención, tal como se ha descrito anteriormente, y no pretenden limitar la invención en modo alguno.
Materiales y métodos
a) Muestras de celulosa fibrilar. La celulosa fibrilar natural se produjo mediante homogeneización a alta presión (cinco ciclos sucesivos) de pulpa de abedul blanqueada altamente purificada, seguido de la esterilización en autoclave. Tras la fluidificación, la celulosa fibrilar era hidrogel diluido (1,8% en peso). Se obtuvo celulosa fibrilar natural de iones intercambiados de una manera similar pero adicionalmente antes de la fibrilación se sometió a tratamiento ácido-base con el fin de eliminar los cationes de valencia elevada (método descrito en secciones anteriores). Tras la homogeneización a alta presión (15 ciclos sucesivos), la celulosa fibrilar de iones intercambiados forma un hidrogel fuerte de turbidez más baja en comparación con la otra muestra. La celulosa fibrilar se esterilizó mediante autoclavado en caso necesario. Se obtuvo celulosa fibrilar aniónica transparente en forma de hidrogel (al 0,9% en peso) mediante un procedimiento de homogeneización similar al de una pulpa de celulosa modificada químicamente (pulpa de celulosa oxidada con TEMPO).
b) Cepas microbianas y cultivo. En todos los experimentos, se utilizaron cultivos de durante la noche frescos en la inoculación. Los cultivos inoculados no contenían celulosa fibrilar. El cultivo microbiano se llevó a cabo bajo condiciones y medios de crecimiento óptimos. La cepa microbiana utilizada era Clostridium perfringens Gram- positiva anaerobia y el medio de crecimiento era agar base Perfringens.
c) Detección microbiana. Se detectó visualmente el crecimiento microbiano en el momento en que la formación de colonias era observable. El medio de agar base Perfringens con metasulfito sódico y citrato amónico férrico produjo colonias negras en cultivos de Clostridium perfringens debido a la reducción del sulfito. También se determinó el número de células mediante análisis de PCR cuantitativo (qPCR) tal como se indica a continuación.
Se utilizó 0,1 ml de muestra del cultivo bacteriano para la enumeración microbiana basada en la PCR. El procedimiento de enumeración se basa en el protocolo Ruminolyze, en el que la muestra microbiana en primer lugar se diluye con tampón de lavado y las células microbianas se sedimentan mediante centrifugación (10 min a 18.000 x g). Se descartó el sobrenadante y se suspendió el pellet en tampón de lisis enzimático y después se batió vigorosamente con perlas de vidrio con el fin de lisar enzimática y mecánicamente las células microbianas para liberar su contenido de ADN. El ADN liberado se purificó mediante extracción con fenol-cloroformo, después se precipitó con etanol y finalmente se disolvió con el tampón de almacenamiento de ADN. Las enumeraciones de Clostridium perfringens se llevaron a cabo con dos cebadores de ADN selectivos para Clostridium perfringens y reacción Sybergreen I.
Ejemplo 1: celulosa fibrilar como única fuente de energía para bacterias
Los procedimientos de fabricación de celulosa fibrilar de origen vegetal pueden comprender etapas que incrementan el riesgo de contaminación microbiana. Por lo tanto, se sometió a ensayo celulosa fibrilar natural para su capacidad de proporcionar soporte al crecimiento microbiano como única fuente de energía. En la figura 1, se expuso la celulosa fibrilar a una fuente de contaminación microbiana por Clostridium perfringens y se presentan gráficamente el número de células bacterianas al inicio (0 h) y después de la incubación durante la noche sobre celulosa fibrilar. Las células bacterianas de referencia se incubaron sobre celulosa fibrilar (al 1,5% en peso) durante la noche y se realizó un recuento del número de células bacterianas. Además, el grado de contaminación era elevado, superior a 106-107 células/ml (puede calcularse una estimación aproximada del número de células mediante la división del número de genes 16S por 10). Los resultados indican claramente que la cepa bacteriana no presentaba crecimiento sobre la celulosa fibrilar. Sin embargo, el control sin ninguna inoculación microbiana mostraba un valor elevado en el análisis de PCR. Podría deberse a una contaminación previa de microbios muertos o podría ser un artefacto causado por la celulosa fibrilar. La celulosa fibrilar como una fuente de energía no proporciona soporte efectivo al crecimiento microbiano.
Ejemplo 2: enumeración de microorganismos a partir del portador de celulosa fibrilar
La bacteria Clostridium perfringens se cultivó en dos medios diferentes: uno que contenía 1,5% en peso de celulosa fibrilar natural y uno sin ella. Se utilizó la enumeración basada en PCR en el ensayo y proporcionó un ejemplo excelente de interacción con la celulosa fibrilar con la detección mediante PCR.
El medio de cultivo utilizado en el experimento era medio agar Perfringens estándar y se preparó siguiendo las instrucciones del fabricante y se autoclavó para esterilizarlo. Antes del autoclavado, el medio de cultivo se dividió en dos partes, y a una de ellas se añadió 1,5% en peso de celulosa fibrilar. Se preparó una serie de dilución (dilución de 10, 100 y 1.000 veces) de cultivo denso de Clostridium perfringens (aproximadamente 109 células/ml) en presencia de 1,5% en peso de celulosa fibrilar y sin ella. Se muestrearon ambos medios de ensayo 0 y 24 horas después de la inoculación. Se utilizó 0,1 ml de muestra de cultivo para la enumeración
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microbiana basada en PCR. El procedimiento de enumeración se basó en el protocolo Ruminolyze, en el que la muestra microbiana en primer lugar se diluyó con tampón de lavado y las células microbianas se sedimentaron mediante centrifugación (10 min. a 18.000 x g). Se descartó el sobrenadante y el pellet se suspendió en tampón de lisis enzimática y después se batió vigorosamente con perlas de vidrio para lisar tanto enzimática como mecánicamente las células microbianas a fin de liberar su contenido de ADN. El ADN liberado se purificó mediante extracción con fenol-cloroformo, después se precipitó con etanol y finalmente se disolvió con el tampón de almacenamiento de ADN. Tras el aislamiento del ADN, se utilizaron muestras de ADN para la enumeración basada en la PCR mediante la utilización de cebadores específicos para C. perfringens y la reacción Sybergreen I. Los resultados de la cuantificación mediante PCR se muestran gráficamente en la figura 2. Los datos muestran una fuerte correlación lineal entre los resultados de la PCR y la dilución calculada sin ninguna interferencia con la celulosa fibrilar, es decir, entre la dilución y la respuesta de PCR en presencia o en ausencia de 1,5% en peso de celulosa fibrilar.
El presente experimento referido a una PCR cuantitativa ejecutada a partir de una serie de dilución de C. perfringens muestra una fuerte correlación lineal entre la dilución y la respuesta de PCR en presencia o en ausencia de 1,5% de celulosa fibrilar.
Ejemplo 3: cuantificación microbiana en presencia de celulosa fibrilar - detección de colonias
Las técnicas anaerobia y semianaerobia típicamente resultan complicadas de llevar a cabo con los medios de cultivo y sistemas de siembra en placa actuales. A título de ejemplo de bacterias Gram-positivas de especies clostridiales, puede mencionarse Clostridium perfringens en la que el crecimiento se detecta en forma de colonias negras.
Las especies clostridiales con frecuencia requieren cultivo. Existen dificultades debido a la fuerte sensibilidad al oxígeno. El presente experimento describe un sistema que facilita el cultivo de las mismas mediante la utilización de una matriz de soporte que comprende celulosa fibrilar. El medio agar Perfringens esterilizado (MEDIO DE CRECIMIENTO) y la celulosa fibrilar natural (al 1,5% en peso) se esterilizaron en botellas de suero anaerobio de pared gruesa para recipientes de almacenamiento de larga duración para los ensayos de cultivo. El cultivo de C. perfringens se diluyó anaeróbicamente y se transfirió mediante jeringa y aguja a través de un sello de goma del recipiente a la parte superior del medio. Después, los recipientes se agitaron por vórtex para mezclar los microbios y el medio, y se cultivaron a una temperatura óptima hasta resultar visible un claro crecimiento de C. perfringens. La bacteria C. perfringens era capaz de formar un punto negro en el medio que podía calcularse fácilmente o incluso registrarse automáticamente mediante instrumentos adecuados. En la figura 3, se presenta la serie de dilución de C. perfringens cultivado en la combinación de celulosa fibrilar y medio agar base Perfringens. Las colonias de C. perfringens son visibles en forma de puntos negros. Las figuras 4 y 5 muestran diluciones de C. perfringens: dilución 10:8 y dilución 10:6 en la combinación de celulosa fibrilar y medio agar base Perfringens. Esta técnica es simple y rápida para el cultivo de microbios anaerobios.
Ejemplo 4: difusión de dextranos a través de hidrogeles de celulosa fibrilar
Es importante disponer de un conocimiento detallado de las propiedades de difusión de un material de cultivo celular. El material de cultivo celular debe ser suficientemente poroso para permitir la difusión de nutrientes y oxígeno a las células en cultivo, además de permitir una difusión eficiente de los metabolitos de las células. Las propiedades de difusión del hidrogel de celulosa fibrilar se demostraron con dextranos de diferente peso molecular de la manera siguiente:
se inocularon 400 pl de celulosa fibrilar (al 1%) aniónica (oxidada) o natural en cada filtro en el compartimiento apical de placas de pocillos con filtro Transwell™ (tamaño de poro del filtro: 0,4 pm). Se añadió 1 ml de PBS al lado basolateral y se añadieron 100 pl (25 pg) de dextranos marcados fluorescentemente en la parte superior de los hidrogeles (PM de 20k, 70k y 250 k). La placa se fijó firmemente y se dejó sin perturbaciones en un agitador basculante de placa de pocillos. Se extrajeron muestras de 100 pl del lado basolateral y se sustituyó una cantidad igual por PBS. En primer lugar se extrajeron muestras a intervalos de 15 minutos, se extrajeron otras muestras en diferentes puntos temporales entre los 30 minutos y las 2 horas y se extrajeron muestras finales a las 24 horas. En total se extrajeron 168 muestras. Se midió la placa diana (OptiPlate-96 F) a las longitudes de onda de excitación y de emisión de 490 nm y 520 nm, respectivamente.
En la figura 6 se presenta la difusión de dextranos de diferente peso molecular a través de un gel de nanofibras de celulosa natural al 1%. La difusión de los compuestos modelo tiene lugar a tasa constante y es altamente dependiente del peso molecular (tamaño) del compuesto. Resulta evidente que en los hidrogeles de celulosa fibrilar, las moléculas pueden difundirse eficientemente aunque la estructura del gel es suficientemente firme para estabilizar la suspensión celular.
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Ejemplo 5: propiedades de flujo del hidrogel de celulosa fibrilar
Las propiedades reológicas de flujo de los hidrogeles de celulosa fibrilar muestran varias características que resultan beneficiosas en la utilización en cultivo celular. Los hidrogeles presentan una elevada viscosidad a baja cizalla (o en reposo) para una capacidad de suspensión óptima de las células aunque también muestra un comportamiento pseudoplástico a tasas de cizalla más altas para permitir una fácil dispensación e inyección. La capacidad de la celulosa fibrilar de proporcionar dichos tipos de propiedad reológica se demostró en una serie de ensayo en la que se midió la viscosidad de dispersiones de celulosa fibrilar en un amplio intervalo de esfuerzos cortantes (tasas) en un reómetro rotacional (AR-G2, TA Instruments, Reino Unido).
Las dispersiones de celulosa fibrilar muestran viscosidades a corte cero (la región de viscosidad constante a esfuerzos cortantes pequeños) que otros polímeros solubles en agua, tal como se muestra en la figura 7. La viscosidad a corte cero resulta muy incrementada por un diámetro más pequeño de las nanofibrillas inducido por el pretratamiento químico anterior de la materia prima. La tensión a la que se inicia el comportamiento pseudoplástico ("límite elástico") también es considerablemente elevado para las dispersiones de celulosa fibrilar. La capacidad de suspensión de un material es mejor cuanto mayor sea el límite elástico. Las células se estabilizan eficazmente frente a la sedimentación por los efectos combinados de una elevada viscosidad a corte cero y elevado límite elástico y elevado módulo de almacenamiento. La fuerza gravitacional aplicada por las células es mucho más débil que el límite elástico. De esta manera, las células en suspensión resultan "congeladas" dentro de la matriz de gel en el caso de que la mezcla de la celulosa fibrilar o "congeladas" sobre el gel en caso de depositarse sobre la parte superior del gel.
En la figura 8 se presenta la viscosidad como función de la tasa de cizalla medida. A partir de la figura 6 resulta evidente que la viscosidad de las dispersiones de celulosa fibrilar cae a tasas de cizalla relativamente pequeñas y alcanza un nivel similar al medido para los materiales de referencia a tasas de cizalla de aproximadamente 200 s-1.
La estructura de malla de la celulosa fibrilar se rompe al aplicar cizalladura (figura 8). Al aplicar una determinada tensión, la viscosidad del sistema cae drásticamente y se produce una transición de un comportamiento de tipo sólido a un comportamiento de tipo líquido. Este tipo de comportamiento resulta beneficioso porque permite la mezcla de las células homogéneamente en la suspensión de celulosa fibrilar mediante cizalladura mecánica moderada. En el caso de que se cizallen (por ejemplo en un reómetro o en un tubo) líquidos en dos fases, tales como dispersiones de celulosa fibrilar floculada, la fase dispersada tiende a alejarse de los límites sólidos, conduciendo a la creación de una capa de viscosidad más baja de líquido en las paredes del recipiente (figura 9). Este fenómeno implica que la resistencia al flujo, es decir, la viscosidad, es más baja en los límites que en la masa de la dispersión. De acuerdo con lo anterior, la inyección del hidrogel de celulosa fibrilar con una jeringa y una aguja o con una pipeta resulta sencilla incluso a concentraciones elevadas (1% a 4%). El fenómeno permite también una fácil dispensación de las suspensiones celulares con una perturbación mínima de las células, es decir, la mayoría de las células está localizada en la parte intermedia de la aguja y se encuentran prácticamente en reposo (figura 9).
Ejemplo 6: estabilidad
Las dispersiones incluso muy diluidas de celulosa fibrilar presentan una viscosidad muy elevada a bajas tasas de cizalla. La estructura de hidrogel también se recupera al cesar la cizalladura, tal como la inyección. Bajo condiciones estáticas, la celulosa fibrilar forma una red de hidrogel de elevado módulo elástico y límite elástico excepcionalmente elevado. Debido a estas propiedades, la celulosa fibrilar presenta un poder de suspensión muy elevado de las partículas 'solidas incluso a una concentración muy baja.
La capacidad de suspensión bajo condiciones estáticas se demuestra con suspensiones de grava. Las dispersiones al 0,5% de celulosa fibrilar natural y celulosa fibrilar aniónica son capaces de estabilizarse incluso con partículas de grava de 2 a 3 mm de tamaño durante periodos de tiempo muy prolongados; ver la figura 10. Debe indicarse que la celulosa fibrilar aniónica es capaz de estabilizar las suspensiones de partículas a una concentración más baja que la celulosa fibrilar natural.

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    REIVINDICACIONES
    1. Composición para el cultivo microbiano embebido tridimensional, comprendiendo dicha composición una celulosa nanofibrilar derivada de plantas desintegrada mecánicamente y por lo menos una fuente de nutrientes, en la que dicha celulosa nanofibrilar se encuentra en forma de hidrogel.
  2. 2. Composición según la reivindicación 1, en la que la celulosa nanofibrilar se selecciona de entre celulosas nanofibrilares naturales y celulosas nanofibrilares modificadas químicamente, preferentemente la celulosa nanofibrilar es la celulosa nanofibrilar de iones intercambiados natural.
  3. 3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la composición comprende 0,05 a 80% en peso de celulosa nanofibrilar.
  4. 4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición se encuentra en forma de hidrogel o polvo, en la que el polvo puede reconstituirse con agua para formar un hidrogel.
  5. 5. Procedimiento para la fabricación de una composición para el cultivo microbiano embebido tridimensional, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de proporcionar celulosa nanofibrilar derivada de plantas desintegrada mecánicamente, en el que dicha celulosa nanofibrilar se encuentra en forma de hidrogel y mezclar dicha celulosa nanofibrilar con agua y por lo menos una fuente de nutrientes y aditivos opcionales para obtener una mezcla.
  6. 6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la celulosa nanofibrilar se selecciona de entre celulosas nanofibrilares naturales y celulosas nanofibrilares modificadas químicamente, preferentemente la celulosa nanofibrilar es la celulosa nanofibrilar de iones intercambiados natural.
  7. 7. Procedimiento según la reivindicación 5 o 6, en el que la cantidad de celulosa nanofibrilar es de 0,05 a 80% en peso.
  8. 8. Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un cultivo microbiano anaerobio o semianaerobio, en procedimientos de fermentación y en procedimientos de biolixiviación.
  9. 9. Matriz tridimensional para el cultivo microbiano embebido, comprendiendo dicha matriz la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y células microbianas vivas en las que el microbio se selecciona de entre bacterias, levaduras, mohos y protozoos.
  10. 10. Matriz según la reivindicación 9, en la que las células microbianas son células de bacterias anaerobias, bacterias facultativas o bacterias aerotolerantes.
  11. 11. Utilización de la matriz según la reivindicación 9 o 10, como matriz de cultivo en cultivo microbiano, como matriz de inmovilización en procedimientos de fermentación y para el almacenamiento y el transporte de microbios.
  12. 12. Procedimiento para el cultivo embebido tridimensional de microbios, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de proporcionar unas células microbianas vivas, en el que el microbio se selecciona de entre bacterias, mohos, levaduras y protozoos, poner en contacto las células con la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para formar una matriz, cultivar las células dentro de dicha matriz en una disposición tridimensional en un ambiente para el cultivo microbiano embebido.
  13. 13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el gas inerte se pasa a través de la matriz y/o sobre la matriz.
  14. 14. Procedimiento según la reivindicación 12 o 13, en el que el procedimiento se lleva a cabo a una presión inferior a la presión atmosférica.
  15. 15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el procedimiento es un procedimiento analítico, un procedimiento de fermentación o un procedimiento de biolixiviación.
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