CN115287275B - 一种纯化透明质酸酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纯化透明质酸酶的方法，包括如下步骤：A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。本发明将水蛭透明质酸酶依次经板框、(低压)陶瓷膜、(高压)陶瓷超滤膜工艺及加一定浓度缓冲盐溶液流加的方式降低透明质酸酶发酵液中的菌体及小分子杂质，该工艺生产成本低，用于连续生产酶切超小分子透明质酸，不会引入额外杂质，提高酶切超小分子透明质酸产品品质，适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及纯化方法技术领域，尤其是涉及一种纯化透明质酸酶的方法。
背景技术
透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)，也称玻璃酸酶，是一种能够特异性水解透明质酸的酶类的总称。
透明质酸酶是一类能够降解透明质酸的酶的总称。早在1928年Duran Reynals在研究哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发现了一种“扩散因子”，可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散。1940年Meyer将这种“扩散因子”命名为Hyaluronidase。此后，人们在许多组织及生物体内检测到了透明质酸酶，包括细菌病毒、细菌、真菌等，非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物的毒液中也产生透明质酸酶。脊椎动物中，在蛇、蜥蜴的毒液中，睾丸及其他器官如肝脏、肾脏、淋巴系统及皮肤中均发现透明质酸酶的存在。
透明质酸酶纯化，专利CN201410007408.1公开了一种透明质酸酶编码基因及其发酵生产和纯化方法，该专利采用实验级离心除菌及离子交换方法纯化水蛭透明质酸酶，该方法所用试剂，溶剂较多，过程繁琐，生产效率慢，不适用于工业化生产制备酶切超小分子透明质酸。
现有技术中，纯化水蛭透明质酸酶多采用板框除菌、盐析法、无机陶瓷膜除菌、离子交换法，凝胶层析法，有机超滤法(三种或三种以上)等传统工业化方法酶活收率低，过程繁琐，生产成本高且效率低，不适用于酶切超小分子透明质酸工业化连续生产。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种纯化透明质酸酶的方法，本发明的方法酶活率高且不会引入额外杂质。
本发明提供了一种纯化透明质酸酶的方法，包括如下步骤：
A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；
B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；
C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。
优选的，步骤A)所述透明质酸酶来源为水蛭；所述透明质酸酶发酵液中菌体质量含量为50wt％～55wt％。
优选的，步骤A)所述透明质酸酶清液中菌体质量含量为1wt％～5wt％；
所述透明质酸酶清液的酶活为1.2×106～1.6×106U/ml。
优选的，步骤B)所述低压陶瓷膜的规格为50～200nm；所述低压陶瓷膜的膜面积为0.286m2，设备设计压力为0.3～0.35Mpa，料液温度为30～35℃。
优选的，步骤B)所述低压陶瓷膜除菌后，采用连续流加方式加缓冲盐，透析，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液的酶活为5×105～7×105U/ml；所述缓冲盐为1％～3％的氯化钠溶液。
优选的，步骤C)所述高压陶瓷超滤膜的规格为15000～25000Da；
所述高压陶瓷超滤膜的膜面积为0.286m2，设备设计压力为0.5～0.9Mpa，设备运行中压力为0.70～0.75Mpa，料液温度为30～35℃。
优选的，步骤C)所述高压陶瓷膜除杂后，采用连续流加方式加缓冲盐，透析至透过液尾线与缓冲盐溶液浓度一致后继续流加至透过液无色，即得；所述缓冲盐为1％～3％的氯化钠溶液。
优选的，所述低压陶瓷膜的规格为200nm。
优选的，所述高压陶瓷膜的规格为15000Da。
本发明提供了一种透明质酸酶，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。
与现有技术相比，本发明提供了一种纯化透明质酸酶的方法，包括如下步骤：A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。本发明将水蛭透明质酸酶依次经板框、(低压)陶瓷膜、(高压)陶瓷超滤膜工艺及加一定浓度缓冲盐溶液流加的方式降低透明质酸酶发酵液中的菌体及小分子杂质，该工艺生产成本低，用于连续生产酶切超小分子透明质酸，不会引入额外杂质，提高酶切超小分子透明质酸产品品质，适合大规模工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1透明质酸酶发酵液离心后图；
图2为本发明实施例1透明质酸酶清液离心后图；
图3为本发明实施例1低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液离心后图；
图4为本发明实施例1纯化透明质酸酶液图。
具体实施方式
本发明提供了一种纯化透明质酸酶的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种纯化透明质酸酶的方法，包括如下步骤：
A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；
B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；
C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。
本发明提供了一种纯化透明质酸酶的方法，透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液。
本发明透明质酸酶发酵液的来源本发明对此不进行限定，本领域技术人员熟知的即可，优选采用专利CN201410007408.1(一种透明质酸酶编码基因及其发酵生产和纯化方法)，进行透明质酸酶发酵。透明质酸酶来源为：水蛭来源。
本发明优选采用如下方式进行透明质酸酶活力检测：
透明质酸酶活力单位定义：在pH5.5和38℃下，每小时从透明质酸中释放1ug葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
平板透明圈法和CTAB(Hexadecyl trimethyl ammoniumBromide)浊度法检测透明质酸酶活性：透明质酸为大分子聚多糖，在一定浓度的表面活性剂水溶液中沉淀析出，被水解的小分子量低聚HA不会被沉淀析出。利用这一原理可以快速简便的鉴定透明质酸酶活性。
配置缓冲液(50mM的柠檬酸/柠檬酸钠pH5.3，150mM的NaCl，0.02％Na3N)，量取50ml缓冲液，加入1.5％的琼脂糖和1mg/ml的HA，融化后配置平板。将发酵液滴入孔径内部，平板置于37℃培养10h，在平板上覆盖适量的10％(w/v)的氯化十六烷吡啶(cetylpyridinium chloride)水溶液，约10-20min后出现透明圈，如本发明:附图2所示。CTAB浊度法检测透明质酸酶活性。在1ml反应体系中，含HA(2mg/ml)100μl，加入发酵液上清或者酶液适量，pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液补足至1ml。混匀后置于38℃水浴反应30min，立即加入2ml的CTAB(2.5g/L),室温反应5min，在400nm下进行浊度对比测定。
水蛭透明质酸酶发酵液采用板框除菌。本发明所述透明质酸酶发酵液中菌体质量含量为50wt％～55wt％。
因水蛭透明质酸酶发酵液菌体含量高，工业上采用板框和无机陶瓷膜除菌相结合的工艺相比离心机，无机陶瓷膜工艺(一种或两种)设备投入成本,运行能耗低且除菌效果好。
透明质酸酶发酵液过板框除菌后为透明质酸酶清液；所述透明质酸酶清液中菌体质量含量为1wt％～5wt％；所述透明质酸酶清液的酶活为1.2×106～1.6×106U/ml。
其中，菌体含量测定为湿菌体含量(检测方法：以离心机转速为10000rpm/min，时间为15min为标准，取菌体后称重计算所得含量；该方法为判断板框纯菌效果所设计)。板框除菌后检测透明质酸酶清液酶活。
透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液。
本发明所述低压陶瓷膜规格为50～200nm，膜面积为0.286m2，所述低压陶瓷膜的规格为50～200nm，所述规格为50nm,200nm两种。
板框除菌后发酵透明质酸酶清液用上述无机陶瓷膜除菌，所述低压陶瓷膜的压力为0.3～0.35Mpa；选取该压力为行业低压陶瓷膜处理物料稳定性最好，适用于工业生产，设备运行中料液温度控制在30～35℃(设备运行中控温正常波动范围)。
其中，所述低压陶瓷膜除菌后，采用连续流加方式加缓冲盐，透析，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；所述缓冲盐为1％～3％的氯化钠溶液。
具体为：经无机陶瓷膜浓缩约3倍(板框除菌后透明质酸酶清液的1/3)后加缓冲盐采用连续流加方式；
透析得到总的透明质酸酶清液，测定清液经离心后无肉眼可见菌体沉淀，测定含有透明质酸酶清液的酶活为5×105～7×105U/ml；(体积为板框除菌后清液2倍)。
将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。
陶瓷超滤膜的最大特点就是使用寿命长，孔径极微小，能够过滤截留极为微小的有机物，它能够在常温的情况下进行分离，运用的能耗较低，水的利用率高。
低压陶瓷膜除菌后透明质酸酶液用15000-25000Da高压陶瓷超滤膜降低小分子杂质含量；所述高压陶瓷膜包括但不限于15000，25000Da两种膜。
本发明人发现，相同条件下处理透明质酸酶液，陶瓷超滤膜处理量为更加稳定，具备使用寿命长，耐污染、耐有机溶剂，运行稳定等优点。
操作压力为0.70Mpa，高压陶瓷超滤膜设计膜面积约0.286m2。本发明高压陶瓷超滤膜设备设计压力为0.5～0.9Mpa，设备运行中压力为0.70～0.75Mpa，该压力为正常波动范围，选取该压力为行业高压超滤陶瓷膜处理物料稳定性最好，适用于工业生产。设备运行中料液温度为30～35℃(设备运行中控温正常波动范围)。
所述高压陶瓷膜除杂后，采用连续流加方式加缓冲盐，透析至透过液尾线与缓冲盐溶液浓度一致后继续流加至透过液无色，即得；所述缓冲盐为1％～3％的氯化钠溶液；具体为：物料浓缩后连续流加氯化钠溶液溶液透析至透过液尾线与缓冲盐溶液浓度(折光仪检测)一致后继续流加至透过液无色，收集浓缩液加氯化钠溶液溶液混匀(保持与板框除菌后透明质酸酶液体积一致，离心后无肉眼可见菌体沉淀，检测透明质酸酶酶活)。
所述高压陶瓷超滤膜设备设计压力为0.5～0.9Mpa，设备运行中压力为0.70～0.75Mpa，料液温度为30～35℃。
本发明的方法可以有效提高酶活收率且不会引入额外杂质，操作简单、过程可控、生产成本低，适用于酶切超小分子透明质酸的工业化连续生产。
本发明提供了一种透明质酸酶，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。
本发明对于上述制备方法已经有了清楚的描述，对此不再赘述。
本发明提供了一种纯化透明质酸酶的方法，包括如下步骤：A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。本发明将水蛭透明质酸酶依次经板框、(低压)陶瓷膜、(高压)陶瓷超滤膜工艺及加一定浓度缓冲盐溶液流加的方式降低透明质酸酶发酵液中的菌体及小分子杂质，该工艺生产成本低，用于连续生产酶切超小分子透明质酸，不会引入额外杂质，提高酶切超小分子透明质酸产品品质，适合大规模工业化生产。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种纯化透明质酸酶的方法进行详细描述。
实施例1
(1)水蛭透明质酸酶发酵液板框除菌
280L发酵液搅拌均匀后取140L发酵液(取100ML发酵液经离心后菌体含量为50％)过板框除菌后透明质酸酶清液为66L(取100ML清液经离心后菌体含量为3.7％)，板框除菌后的透明质酸酶的含量为1.38×106U/ml。
(2).低压陶瓷膜除菌
取板框纯菌后透明质酸酶清液66L用200nm的低压陶瓷膜设备除菌，控制操作压力为0.32Mpa，控制料液温度为30-35℃，物料浓缩约3倍时加2％浓度氯化钠溶液连续流加透析，透析至尾线与2％浓度氯化钠溶液折光一致时继续流加氯化钠溶液，流加至总透过液为132L时停机清洗设备，总的处理时间约为136min,将132L总透过液混匀取样检测(离心后无肉眼可见菌体沉淀，透明质酸酶酶活为6.32×105U/ml)。
(3).高压陶瓷超滤膜除杂
取200nm低压陶瓷膜除菌后的透明质酸酶清液132L用15000Da的高压陶瓷超滤膜除杂，控制操作压力为0.7Mpa，控制料液温度为30-35℃，物料浓缩透过液为25L时加2％浓度氯化钠溶液连续流加透析，透析至尾线与2％浓度氯化钠溶液折光一致时继续流加氯化钠溶液，流加至透过液为无肉眼可见颜色时，收集总的透过液为148L取样检测酶活，将浓缩液收集，并加2％浓度氯化钠溶液漂洗两次，将浓缩液与漂洗液混合配至66L，停机清洗设备，总的处理时间约为274min,将66L总浓缩液混匀取样检测(离心后无肉眼可见菌体沉淀，148L总透过液透明质酸酶酶活为24864U/ml，66L总浓缩液透明质酸酶酶活为1.08×106U/ml离心后无肉眼可见沉淀)。
经验证140L水蛭透明质酸酶发酵液通过该工艺制备纯化后的透明质酸酶液(离心后无肉眼可见菌体)，酶活为1.08×106U/ml(酶活损耗约22％，该酶活检测值在同等条件下检测所得)，低压陶瓷膜处理时间约为136min,高压陶瓷超滤膜处理时间约为274min。
实施例2
(1).水蛭透明质酸酶发酵液板框除菌
取147L发酵液(取100ML发酵液经离心后菌体含量为53％)过板框除菌后透明质酸酶清液为69L(取100ML清液经离心后菌体含量为4.6％)，板框除菌后的透明质酸酶的含量为1.53×106U/ml。
(2).低压陶瓷膜除菌
取板框纯菌后发酵透明质酸酶清液69L用200nm的无机陶瓷膜设备除菌，控制操作压力为0.7Mpa，控制料液温度为30-35℃，物料浓缩3倍时加2％浓度氯化钠溶液连续流加透析，透析至尾线与2％浓度氯化钠溶液折光一致时继续流加氯化钠溶液，流加至总透过液为138L时停机清洗设备，总的处理时间约为168min,将138L总透过液混匀取样检测(离心后无肉眼可见菌体沉淀，透明质酸酶酶活为6.96×105U/ml)。
(3).高压陶瓷超滤膜除杂
取200nm无机陶瓷膜除菌后的透明质酸酶清液138L用25000Da的高压陶瓷超滤膜除杂，控制操作压力为0.7Mpa，控制料液温度为30-35℃，物料浓缩透过液为25L时加2％浓度氯化钠溶液连续流加透析，透析至尾线与2％浓度氯化钠溶液折光一致时继续流加氯化钠溶液，流加至透过液为无肉眼可见颜色时，收集总的透过液为154L取样检测酶活，将浓缩液收集，并加2％浓度氯化钠溶液漂洗两次，将浓缩液与漂洗液混合配至69L，停机清洗设备，总的处理时间约为196min,将69L总浓缩液混匀取样检测(离心后无肉眼可见沉淀，154L总透过液透明质酸酶酶活为178920U/ml，69L总浓缩液透明质酸酶酶活为9.37×105U/ml)。
经验证147L水蛭透明质酸酶发酵液通过该工艺制备纯化后的透明质酸酶液(离心后无肉眼可见菌体沉淀)，酶活为9.37×105U/ml(酶活损耗约39％，该酶活检测值在同等条件下检测所得)，低压陶瓷膜处理时间约为168min,高压陶瓷超滤膜处理时间约为196min。
实施例3
(1).水蛭透明质酸酶发酵液板框除菌
取146L发酵液(取100ML发酵液经离心后菌体含量为51％)过板框除菌后透明质酸酶清液为66L(取100ML清液经离心后菌体含量为3.4％)，板框除菌后的透明质酸酶的含量为1.41×106U/ml。
(2).低压陶瓷膜除菌
取板框纯菌后发酵透明质酸酶清液66L用50nm的无机陶瓷膜设备除菌，控制操作压力为0.32Mpa，控制料液温度为30-35℃，物料浓缩3倍时加2％浓度氯化钠溶液连续流加透析，透析至尾线与2％浓度氯化钠溶液折光一致时继续流加氯化钠溶液，流加至总透过液为132L时停机清洗设备，总的处理时间约为246min,将132L总透过液混匀取样检测(离心后无肉眼可见菌体沉淀，透明质酸酶酶活为6.03×105U/ml)。
(3)高压陶瓷超滤膜除杂
取50nm无机陶瓷膜除菌后的透明质酸酶清液132L用15000Da的高压陶瓷超滤膜除杂，控制操作压力为0.7Mpa，控制料液温度为30-35℃，物料浓缩透过液为25L时加2％浓度氯化钠溶液连续流加透析，透析至尾线与2％浓度氯化钠溶液折光一致时继续流加氯化钠溶液，流加至透过液为无肉眼可见颜色时，收集总的透过液为160L取样检测酶活，将浓缩液收集，并加2％浓度氯化钠溶液漂洗两次，将浓缩液与漂洗液混合配至66L，停机清洗设备，总的处理时间约为148min,将66L总浓缩液混匀取样检测(离心后无肉眼可见菌体沉淀，160L总透过液透明质酸酶酶活为19672U/ml，66L总浓缩液透明质酸酶酶活为9.98×105U/ml)。
经验证146L水蛭透明质酸酶发酵液通过该工艺制备纯化后的透明质酸酶液(离心后无肉眼可见菌体)，酶活为9.98×105U/ml(酶活损耗约29％，该酶活检测值在同等条件下检测所得)，低压陶瓷膜处理时间约为246min,高压陶瓷超滤膜处理时间约为148min。
由上述实施例1，2，3验证
实施例1低压陶瓷膜除菌工艺选取200nm,处理时间约为136min,高压陶瓷超滤膜除杂工艺选取15000Da，处理时间约为274min，酶活损耗约22％.
实施例2低压陶瓷膜除菌工艺选取200nm,处理时间约为168min,高压陶瓷超滤膜除杂工艺选取25000Da，处理时间约为196min，酶活损耗约39％。
实施例3低压陶瓷膜除菌工艺选取50nm,处理时间约为246min,高压陶瓷超滤膜除杂工艺选取15000Da，处理时间约为148min，酶活损耗约29％。
由实施例1和2检测值(包括所有过程样)可验证，约同等条件下高压陶瓷超滤膜孔径大物料损耗大且经多次实验验证。
由实施例1和3检测值(包括所有过程样)可验证，约同等条件下低压陶瓷膜孔径大处理时间短且经多次实验验证。
经上述验证，低压陶瓷膜除菌工艺选取200nm，高压陶瓷超滤膜除杂工艺选取15000Da生产效率快，酶活损耗低。
表1为上述实施例1，2，3的数据表
对比例1
对比例1与实施例1的不同在于，取实施例1剩余140L发酵液按板框除菌，低压陶瓷膜除菌(与实施例1条件一致)，得到约132L透明质酸酶清液，取66L低压陶瓷膜除菌后清液用10K有机超滤膜(设计膜面积约0.75m2，三支1812膜并联)除杂，控制操作压力为0.32Mpa(处理物料设计使用压力为0.30-0.35Mpa，选取该压力为行业有机超滤膜处理物料稳定性最好)，控制料液温度为30-35℃，物料浓缩至约20L时加2％浓度氯化钠溶液连续流加透析，加盐水不足10L透析时膜堵塞，透过液尾线颜色较深。总透过液约为53L。浓缩液收集，并加2％浓度氯化钠溶液漂洗两次，将浓缩液与漂洗液混合配至66L，停机清洗设备，总的处理时间约为165min,将66L总浓缩液混匀取样检测(离心后无肉眼可见菌体沉淀，酶活损耗约27％)。
对比例2
对比例2与实施例1及对比例1的不同在于，取对比例1剩余66L低压陶瓷膜除菌后清液用20K有机超滤膜(设计膜面积约0.75m2，三支1812膜并联)除杂，控制操作压力为0.32Mpa(处理物料设计使用压力为0.30-0.35Mpa，选取该压力为行业有机超滤膜处理物料稳定性最好)，控制料液温度为30-35℃，物料浓缩至约20L时加2％浓度氯化钠溶液连续流加透析，加盐水约14L透析时膜堵塞，透过液尾线颜色较深。总透过液约为60L。浓缩液收集，并加2％浓度氯化钠溶液漂洗两次，将浓缩液与漂洗液混合配至66L，停机清洗设备，总的处理时间约为147min,将66L总浓缩液混匀取样检测(离心后无肉眼可见菌体沉淀，酶活损耗约37％)。
由上述实施例1与对比例1验证，相同条件下(有机超滤膜面积大于高压陶瓷超滤)处理透明质酸酶液，陶瓷超滤膜处理量大且更加稳定。
由上述对比例1与对比例2验证，20K有机超滤膜相比10K有机超滤膜处理透明质酸酶液效率快，损耗大。
由上述实施例1与对比例1及对比例2验证，相同条件下处理透明质酸酶液，陶瓷超滤膜相比有机超滤膜处理量大且更加稳定(多次实验验证)。
表2为上述实施例1和对比例1，2的数据表
对比例3
对比例3与实施例1的不同在于，高压陶瓷超滤膜操作压力为0.90Mpa(运行过程中压力在0.85-0.90Mpa之间)，其他的条件与实施例1相同。低压陶瓷膜除菌处理时间约为146min,高压陶瓷超滤膜除杂处理时间约为258min，纯化后酶液离心无肉眼可见菌体沉淀，活损耗约28％.
由上述实施例1与对比例3验证，高压陶瓷超滤膜操作压力为0.90Mpa相比操作压力为0.70Mpa运行时间及酶活损耗(经多次试验验证)无显著性影响，高压陶瓷超滤膜操作压力升高能耗较高。
对比例4
对比例4与实施例1及对比例3的不同在于，高压陶瓷超滤膜操作压力为0.55Mpa(运行过程中压力在0.50-0.55Mpa之间)，其他的条件与实施例1及对比例3相同。低压陶瓷膜除菌处理时间约为157min,高压陶瓷超滤膜除杂处理时间约为326min，纯化后酶液离心无肉眼可见菌体沉淀，酶活损耗约26％.
由上述实施例1与对比例3及对比例4验证，高压陶瓷超滤膜操作压力为0.90Mpa以下，纯化后酶液离心无肉眼可见菌体沉淀，酶活损耗(经过程样酶活及结果多次试验验证)无显著性影响，结合生产效率高压陶瓷超滤膜处理透明质酸酶液操作压力为0.7MPa为最佳操作压力(符合高压陶瓷超滤膜处理物料的运行规律)。
表3为上述实施例1及对比例3，4的数据表
对比例5
对比例5与实施例1的不同在于，缓冲盐氯化钠溶液变为纯水，其他的条件与实施例1相同。低压陶瓷膜除菌处理时间约为164min,低压陶瓷膜总透过液离心有微量菌体沉淀，高压陶瓷超滤膜除杂处理时间约为367min，纯化后酶液离心有菌体沉淀，酶活损耗约34％.
对比例6
对比例6与实施例1及对比例5的不同在于，缓冲盐氯化钠溶液浓度为1％，其他的条件与实施例1及对比例5相同。低压陶瓷膜除菌处理时间约为139min,低压陶瓷膜总透过液离心有微量可见菌体沉淀，高压陶瓷超滤膜除杂处理时间约为295min，纯化后酶液离心有微量菌体沉淀，酶活损耗约25％.
对比例7
对比例7与实施例1及对比例5及对比例6的不同在于，缓冲盐氯化钠溶液浓度为3％，其他的条件与实施例1及对比例5及对比例6相同。低压陶瓷膜除菌处理时间约为151min,低压陶瓷膜总透过液离心无肉眼可见沉淀，高压陶瓷超滤膜除杂处理时间约为265min，纯化后酶液离心有微量菌体沉淀，酶活损耗约27％.
由上述实施例1与对比例5及对比例6及对比例7验证，缓冲盐氯化钠溶液浓度为0，1％，纯化后酶液离心有菌体沉淀；缓冲盐氯化钠溶液浓度为2％，3％纯化后酶液离心无菌体沉淀(在生产过程中酶液易染菌，一定缓冲盐氯化钠溶液有抑制菌落繁殖作用)，酶活损耗均无显著性影响(除缓冲盐氯化钠溶液浓度为0)，结合酶液纯化后离心菌体情况及生产成本，缓冲盐氯化钠溶液最佳浓度为2％。
表4为上述实施例1及对比例5，6,7的数据表
对比例8
对比例8与实施例1不同在于，物料温度控制在25℃-30℃，其他的条件与实施例1相同。低压陶瓷膜除菌处理时间约为174min,低压陶瓷膜总透过液离心无肉眼可见菌体沉淀，高压陶瓷超滤膜除杂处理时间约为341min，纯化后酶液离心无肉眼可见菌体沉淀，酶活损耗约23％.
对比例9
对比例9与实施例1及对比例8的不同在于，物料温度控制在35℃-40℃，其他的条件与实施例1相同。低压陶瓷膜除菌处理时间约为128min,低压陶瓷膜总透过液离心有微量可见菌体沉淀，高压陶瓷超滤膜除杂处理时间约为260min，纯化后酶液离心有微量菌体沉淀，酶活损耗约30％.
由上述实施例1与对比例8验证，相同条件下处理透明质酸酶液，物料温度控制在30℃-35℃相比25-30℃，生产效率高，酶活损耗无显著性差异，且纯化后酶液离心均无肉眼可见沉淀。
由上述实施例1与对比例9验证，相同条件下处理透明质酸酶液，物料温度控制在30℃-35℃相比35-40℃，生产效率及酶活损耗无显著性差异，且纯化后酶液离心菌体沉淀少(温度升高后生产过程易产生菌体)。
由上述实施例1与对比例8及对比例9验证，结合生产效率及纯化后酶液离心菌体沉淀情况，物料温度控制在30℃-35℃为最佳物料温度。
表5为上述实施例1及对比例8，9的数据表
经上述实施例，对比例，数据表及多次生产验证，工业化纯化水蛭透明质酸酶采用板框纯菌，200nm低压陶瓷膜纯菌及15000Da高压陶瓷超滤膜除杂生产工艺，物料温度控制在30-35℃，缓冲盐溶液采用2％浓度氯化钠溶液流加的方式，该条件下生产水蛭透明质酸酶酶活损耗低，生产成本低，效率高，酶液菌体少，连续生产酶切超小分子透明质酸不会引入额外杂质，提高酶切超小分子透明质酸产品品质，适用于连续生产酶切超小分子透明质酸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种纯化透明质酸酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；所述透明质酸酶来源为水蛭；所述透明质酸酶发酵液中菌体质量含量为50wt％～55wt％；所述透明质酸酶清液中菌体质量含量为1wt％～5wt％；所述透明质酸酶清液的酶活为1.2×106～1.6×106U/ml；
B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；所述低压陶瓷膜的规格为50～200nm；所述低压陶瓷膜的膜面积为0.286㎡，设备设计压力为0.3～0.35Mpa，料液温度为30～35℃；所述低压陶瓷膜除菌后，采用连续流加方式加缓冲盐，透析，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液的酶活为5×105～7×105U/ml；
C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得；所述高压陶瓷超滤膜的规格为15000～25000Da；所述高压陶瓷超滤膜的膜面积为0.286㎡，设备设计压力为0.5～0.9Mpa，设备运行中压力为0.70～0.75Mpa，料液温度为30～35℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)所述缓冲盐为1％～3％的氯化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C)所述高压陶瓷膜除杂后，采用连续流加方式加缓冲盐，透析至透过液尾线与缓冲盐溶液浓度一致后继续流加至透过液无色，即得；所述缓冲盐为1％～3％的氯化钠溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低压陶瓷膜的规格为200nm，所述高压陶瓷膜的规格为15000Da。
5.由权利要求1～4任意一项所述的制备方法制备得到的透明质酸酶在制备透明质酸降解产品中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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