CN116023523A

CN116023523A - 一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法

Info

Publication number: CN116023523A
Application number: CN202211712394.4A
Authority: CN
Inventors: 毕延凯; 颜少慰; 张廷志; 向静
Original assignee: Syoung Cosmetics Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Syoung Cosmetics Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2022-12-29
Filing date: 2022-12-29
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体是一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法。本发明提供的方法能够得到平均分子量约为300Da～400Da的超小分子量透明质酸钠，其透皮吸收性好，能够改善人体皮肤皱纹。该方法生产无有机溶剂、无环境污染，生产成本低。本发明提供的超小分子量透明质酸钠，其寡糖以二糖、四糖和六糖为主，含有少量八糖，无细胞毒性，透皮吸收性好，还具有无细胞毒性、促进紧致、抗皱等优点。实验表明，采用本发明所述的方法成功得到所述超小分子量透明质酸钠，产率达到了89.6％；经过测试，其在2.00％(m/V)浓度范围内未表现出成纤维细胞毒性，完全透皮时间为2h，具有较好的紧致和抗皱功效。

Description

一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体是一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种酸性黏多糖，是由N乙酰葡糖胺和D葡糖醛酸双糖重复单位通过β(1→4)糖苷键和β(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为10⁵～10⁷道尔顿(Da)。

不同分子量的透明质酸表现出不同的生物活性，低分子量透明质酸甚至表现出与高分子量透明质酸完全相反的活性。很多文献都对透明质酸在创伤修复中发挥的作用进行了报道，尤其是低分子量及透明质酸寡糖作为活性物质受到更多关注。

专利CN 112553273 A公开了一种酶解超小分子量透明质酸钠的制备方法，该方法酶解后纯化采用板框过滤、絮凝剂除杂、浓缩采用减压浓缩方法成本及能耗高。

专利CN 113801904 A公开了一种酶解透明质酸寡糖组合物的方法，该方法所用透明质酸酶为参照CN 103695448 A中的方法，该酶是利用DEAE纤维素柱纯化的，酶的纯化成本高，且纯化的酶是否含有分子量较小杂质、其该酶解透明质酸寡糖组合物的制备方法是否引入酶液中额外分子量较小杂质尚未可知，该寡糖组合物并未对产品质量说明；酶解后采用截留分子量600Da-1000Da超滤膜分离在工业放大中效率、产品得率尚未可知；

专利CN 103484513A公开了一种透明质酸制备四糖、六糖、八糖、十糖等特定小分子透明质酸的方法，该方法是利用经镍柱纯化的纯酶来酶解的，酶的成本高。该方法酶解反应体系小，放大后的酶解效果尚未可知。

专利CN 101123942A的透明质酸分子量约为0.7MDa～0.9MDa，具有保湿和抗皱效果，但其菌体来源与透明质酸钠分子量及制备工艺与本专利完全不一样。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法，本发明提供的方法能够制备得到平均分子量约为300Da～400Da的超小分子量透明质酸钠，其透皮吸收性好，能够改善人体皮肤皱纹。

本发明提供了一种超小分子量透明质酸钠，以质量份计，其寡糖成分包括：

7份～9份的二糖；

60份～70份的四糖；

20份～30份的六糖；和

0.6份～1.2份的八糖。

本发明提供的超小分子量透明质酸钠，其寡糖以二糖、四糖和六糖为主，含有少量八糖，无细胞毒性，相比市售寡聚透明质酸钠(平均分子量为3000Da～10000Da)的透皮吸收性好，还具有无细胞毒性、促进Ⅰ型胶原蛋白生成、人体上改善皮肤皱纹等优点。

本发明提供的超小分子量透明质酸钠，其质量标准高于市售超小分子量透明质酸钠，体现在本发明所述超小分子量透明质酸钠的含量为95wt％以上，蛋白含量小于0.05wt％，高于市售超小分子量透明质酸钠的含量为93wt％以上，蛋白含量小于0.1wt％。其平均分子量小于市售超小分子量透明质酸钠，所述市售超小分子量透明质酸钠的平均分子量小于1000Da，为600Da～800Da，而本申请提供的超小分子量透明质酸钠的平均分子量为300Da～400Da。

本发明提供了一种上述超小分子量透明质酸钠的制备方法，包括以下步骤：

S1)将透明质酸钠用纯化透明质酸酶进行酶解反应，得到酶解反应物；

S2)将步骤S1)中所述酶解反应物进行超滤分离，得到总透过液；

S3)将步骤S2)中所述总透过液依次进行钠滤浓缩和除杂，得到上述超小分子量透明质酸钠。

本发明所述纯化透明质酸酶是由透明质酸酶经过纯化得到的，所述纯化的方法有很多种，应用不同的纯化方法所得到的纯化透明质酸酶用于透明质酸钠的酶解所能达到的效果各不相同。本申请发明人创造性地发现，本发明所述纯化透明质酸酶通过特定的纯化方法将透明质酸酶纯化所得到，不仅成本低廉，而且将其用于透明质酸钠的酶解反应，能够制备得到平均分子量约为300Da～400Da的超小分子量透明质酸钠，产品得率高；其透皮吸收性好，能够改善人体皮肤皱纹，而且还通过了人体测试。

本发明所述纯化透明质酸酶的纯化方法包括：将透明质酸酶发酵液依次进行板框除菌、低压陶瓷膜除菌和高压陶瓷超滤膜除杂，得到所述纯化透明质酸酶。具体而言，本发明将透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；将所述透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；将所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，得到所述纯化透明质酸酶。

本发明所述透明质酸酶的来源为水蛭；所述透明质酸酶发酵液中菌体质量含量为50wt％～55wt％，优选为1wt％～5wt％。在本发明的某些实施例中，所述透明质酸酶清液的酶活为1.2×10⁶U/mL～1.6×10⁶U/mL。

本发明所述纯化透明质酸酶的纯化方法首先将透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液。本发明对所述板框除菌的方法无特殊限制，为本领域技术人员熟知的板框除菌的方法。

本发明得到透明质酸酶清液后，将所述透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液。具体而言，本发明将所述透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌后，还包括采用连续流加方式加缓冲盐，透析，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸液。在一个实施例中，所述低压陶瓷膜的规格为50nm～200nm，优选为200nm；所述低压陶瓷膜的膜面积为0.286m²，设备设计压力为0.3Mpa～0.35Mpa，料液温度为30℃～35℃。在一个实施例中，所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液的酶活为5×10⁵U/mL～7×10⁵U/mL。在一个实施例中，所述缓冲盐为1wt％～3wt％的氯化钠溶液。

本发明得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液后，将所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，得到所述纯化透明质酸酶。具体而言，将所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂后，还包括采用连续流加方式加缓冲盐，透析至透过液尾线与缓冲盐溶液浓度一致后继续流加至透过液无色，得到所述纯化透明质酸酶。在一个实施例中，所述高压陶瓷超滤膜的规格为15000Da～25000Da，优选为15000Da；所述高压陶瓷超滤膜的膜面积为0.286m²，设备设计压力为0.5Mpa～0.9Mpa，设备运行中压力为0.70Mpa～0.75Mpa，料液温度为30℃～35℃。在一个实施例中，所述缓冲盐为1wt％～3wt％的氯化钠溶液。

为了制备得到上述超小分子量透明质酸钠，本发明首先将透明质酸钠用上述方法制得的纯化透明质酸酶进行酶解反应，得到酶解反应物。具体而言，本发明将上述方法制得的纯化透明质酸酶和水混合，向其中加入透明质酸钠，密封后在搅拌下进行酶解反应，酶解至所需分子量时，得到酶解反应物。

在本发明的某些实施例中，所述纯化透明质酸酶的酶活为8.0×10⁵U/mL～1.2×10⁶U/mL。本发明所述透明质酸钠为市售常用大分子透明质酸钠，其分子量为1300KDa。在一个实施例中，所述透明质酸钠在所述酶解反应中的含量为1g/mL～4g/mL，即所述透明质酸钠在所述酶解反应体系中的质量体积浓度为1％～4％。在一个实施例中，每存在1g所述透明质酸钠，所述纯化透明质酸酶的加入量为1.0×10⁶U～2.0×10⁶U。在一个实施例中，所述酶解反应的温度为35℃～45℃；所述酶解反应的时间为10h～25h，酶解至所需分子量时为二糖、四糖、六糖和八糖的寡糖混合物。

本发明得到酶解反应物后，将所述酶解反应物进行超滤分离，得到总透过液。具体而言，本发明将所述酶解反应物采用陶瓷超滤膜进行超滤分离，得到总透过液。在本发明的某些实施例中，将所述酶解反应物采用陶瓷超滤膜在30～35℃下进行超滤分离至所述酶解反应物的死体积为原来体积的1/3时，向其中加入纯化水流进行透析，透析至尾线折光为0，得到总透过液。在一个实施例中，所述陶瓷超滤膜采用截留分子量为1KDa～15KDa，优选为5KDa。

本发明得到总透过液后，将所述总透过液依次进行钠滤浓缩和除杂，得到本发明述超小分子量透明质酸钠。具体而言，本发明将所述总透过液经有机纳滤膜进行浓缩脱盐，得纳滤浓缩液；再对所述纳滤浓缩液进行除杂、除菌后，进行干燥制粉，得到本发明述超小分子量透明质酸钠。在本发明的某些实施例中，将所述总透过液经有机纳滤膜在30～35℃下进行浓缩脱盐，然后向其中加入纯化水流加透析，透析至尾线折光为0和电导率小于500μs/cm，得纳滤浓缩液；再对所述纳滤浓缩液经活性炭对色素等杂质进行除杂，再采用0.1μm微滤膜对微生物进行除菌后，采用离心式喷雾干燥的方法进行干燥制粉，得到本发明述超小分子量透明质酸钠。在一个实施例中，所述喷雾干燥的参数设置为：进风温度为140～160℃，优选为143℃；出风温度为70～90℃，优选为76℃。在一个实施例中，所述有机纳滤膜的截留分子量为150Da。

本发明提供了一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法。本发明提供的方法能够制备得到平均分子量约为300Da～400Da的超小分子量透明质酸钠，其透皮吸收性好，能够改善人体皮肤皱纹。该方法生产无有机溶剂、无环境污染，且水蛭来源的发酵透明质酸酶纯化及酶解后采用一步5K陶瓷超滤分离生产成本低，适合于大规模工业化生产。本发明提供的超小分子量透明质酸钠，其寡糖以二糖、四糖和六糖为主，含有少量八糖，无细胞毒性，透皮吸收性好，还具有无细胞毒性、促进Ⅰ型胶原蛋白生成、人体上改善皮肤皱纹等优点；能够广泛用于化妆品、食品、保健品、医用领域等领域。实验表明，采用本发明所述的纯化透明质酸酶对透明质酸钠进行酶解反应，并经过超滤、纳滤和除杂，能够得到本发明所述超小分子量透明质酸钠，产率达到了89.6％；经过细胞测试和人体测试，其在2.00％(m/V)浓度范围内未表现出成纤维细胞毒性，完全透皮时间为2h，具有较好的紧致和抗皱功效。

附图说明

图1为实施例1的纯化透明质酸酶酶解15h的液相色谱图；

图2为实施例1的纯化透明质酸酶酶解20h的液相色谱图；

图3为实施例2的纯化透明质酸酶酶解25h的液相色谱图；

图4为实施例3的纯化透明质酸酶酶解15h的液相色谱图；

图5为实施例4所得粉剂的液相色谱图；

图6为实施例5所得粉剂的液相色谱图；

图7为实施例6所得粉剂的液相色谱图；

图8为对比例1所得粉剂的液相色谱图；

图9为实施例4所得粉剂的细胞活力图；

图10为市售寡聚透明质酸钠和实施例4的超小分子量透明质酸钠的透皮吸收率对比图；

图11为I型胶原蛋白含量变化趋势图；

图12为Collagen I免疫荧光结果图；

图13为Collagen I积分光密度(IOD)值柱状图；

图14为第一例受试人群进行产品测试28天前后的皱纹示意图；

图15为第二例受试人群进行产品测试28天前后的皱纹示意图；

图16为第三例受试人群进行产品测试28天前后的皱纹示意图。

具体实施方式

本发明公开了一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下结合实施例对本发明进行进一步阐述：

实施例1

酶解反应：向1L烧杯中加入0.3L纯水，加入纯化透明质酸酶(酶活8.76×10⁵U/mL)54.80mL，加入分子量为1300KDa的大分子透明质酸钠24g配至0.6L(底物浓度4％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入2.0×10⁶U纯化透明质酸酶)。保鲜膜密封烧杯开启搅拌，升温至45℃后保温反应25h，分别取反应第10h、15h、20h、25h的酶解液各10mL。

样品处理：取反应第10h、15h、20h、25h的酶解液各10mL在80℃下灭活30min(取完样品立即灭活)后降温至常温，离心取上清过0.22μm过滤头后待测。

用高效液相色谱仪分析粉剂寡糖分布，具体检测方法为：

色谱柱：Supelco

100RP-18色谱柱(4.0*250mm，5μm)；

检测器：紫外-可见分光检测器；

检测波长：210nm；

柱温：30℃；

流动相：

流动相A：乙腈；

流动相B：0.01mol/L的四丁基氢氧化铵(精密移取12.5mL四丁基氢氧化铵～25％水溶液，加入1000mL水，混匀后用磷酸调节pH至6.0)；

流速：1.0mL/min；

进样浓度：待测样品；

进样量：5μL；

洗脱程序：见表1；

表1

时间/min	流动相A/％	流动相B/％
			0	28	72
8	30	70
			25	52	48
35	55	45
			37	28	72
45	28	72

取透明质酸二糖-十二糖寡糖(购买自contipro)按上述方法定性酶解效果，结果如表2所示：

表2

选取15h和20h图谱如图1和图2所示，图1为实施例1的纯化透明质酸酶酶解15h的液相色谱图；图2为实施例1的纯化透明质酸酶酶解20h的液相色谱图。

实施例2

酶解反应：向1L烧杯中加入0.3L纯水，加入与实施例1同一批纯化透明质酸酶(酶活8.76×10⁵U/mL)6.85mL，加入分子量为1300KDa的大分子透明质酸钠6g配至0.6L(底物浓度1％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入1.0×10⁶U纯化透明质酸酶)。保鲜膜密封烧杯开启搅拌，升温至35℃后保温反应25h，分别取反应第10h、15h、20h、25h的酶解液各10mL。

样品处理方法和实施例1一样，不再赘述。

用高效液相色谱仪分析粉剂寡糖分布，具体检测方法和实施例1一样，不再赘述。

取透明质酸二糖-十二糖寡糖(购买自contipro)按上述方法定性酶解效果，结果如表3所示：

表3

酶解时间	10h	15h	20h	25h
					酶解寡糖	二糖-十二糖	二糖-十二糖	二糖-十二糖	二糖-十二糖

选取25h图谱如图3所示，图3为实施例2的纯化透明质酸酶酶解25h的液相色谱图。

实施例3

酶解反应：向1L烧杯中加入0.3L纯水，加入与实施例1、实施例2同一批纯化透明质酸酶(酶活8.76×10⁵U/mL)20.55mL，加入分子量为1300KDa的大分子透明质酸钠12g配至0.6L(底物浓度2％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入1.5×10⁶U纯化透明质酸酶)。保鲜膜密封烧杯开启搅拌，升温至40℃后保温反应25h，分别取反应第10h、15h、20h、25h的酶解液各10mL。

样品处理和实施例1一样，不再赘述。

取透明质酸二糖-十二糖寡糖(购买自contipro)按上述方法定性酶解效果，结果如表4所示：

表4

酶解时间	10h	15h	20h	25h
					酶解寡糖	二糖-十二糖	二糖-八糖	二糖-八糖	二糖-八糖

选取15h图谱如图4所示，图4为实施例3的纯化透明质酸酶酶解15h的液相色谱图。

上述实施例1～3的酶解条件及酶解效果总结如表5所示：

表5

由上述实施例1～3所述，综合酶解反应条件及成本能耗等，优选的酶解条件为：采用质量体积浓度2％分子量1300KDa的大分子透明质酸钠，酶投量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入1.5×10⁶U纯化透明质酸酶，酶解温度40℃，酶解时间为15h，酶解液寡糖以二、四、六和八糖为主。

实施例4

(1)酶解反应

向50L不锈钢反应器中加入20L纯水，加入纯化透明质酸酶(酶活1.06×10⁶U/mL)1.27L，加入分子量为1300KDa的大分子透明质酸钠900g配至45L(底物浓度2％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入1.5×10⁶U纯化透明质酸酶)。开启搅拌，升温至40℃后保温反应15h。

(2)陶瓷超滤膜分离

取上述所述剩余反应15h结束的酶解液45L用5K陶瓷超滤膜设备分离，物料温度控制在30℃～35℃，物料浓缩至约死体积15L时加纯化水流加透析，透析至尾线折光为0时停机清洗设备，收集总透过液。

(3)脱盐浓缩

上述所述总透过液经150Da纳滤膜设备浓缩至约8L时加纯化水流加透析，透析至尾线折光为0，电导率＜500μs/cm时收集浓缩液(物料温度控制在30℃～35℃)，后加水顶洗残留物料收集与浓缩液混合，设备停机清洗设备。

(4)除杂制粉

取上述所述混合物料经活性炭除杂后滤液，采用0.1μm微滤膜除菌，滤液用小型喷雾干燥设备制粉，进风温度143℃，出风温度76℃，得到超小分子量透明质酸钠粉剂约814g，得率约90.4％。

上述超小分子量透明质酸钠粉剂各检测指标如表6～8所示：

表6

表7

表8

用高效液相色谱仪分析粉剂寡糖分布，具体检测方法和实施例1的区别仅为：本实施例的进样浓度为2％。检测完成的结果如图5所示，图5为实施例4所得粉剂的液相色谱图。

实施例5

(1)酶解反应

向50L不锈钢反应器中加入20L纯水，加入纯化透明质酸酶(酶活8.82×10⁶U/mL)1.53L，加入分子量为1300KDa的大分子透明质酸钠900g配至45L(底物浓度2％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入1.5×10⁶U纯化透明质酸酶)。开启搅拌，升温至40℃后保温反应15h。

(2)陶瓷超滤膜分离

(3)脱盐浓缩

(4)除杂制粉

取上述所述混合物料经活性炭除杂后滤液，采用0.1μm微滤膜除菌，滤液用小型喷雾干燥设备制粉，进风温度148℃，出风温度79℃，得到超小分子量透明质酸钠粉剂约806g，得率约89.6％。

上述超小分子量透明质酸钠粉剂各检测指标如表9～11所示：

表9

外观	白色粉末
		红外鉴别	与欧洲药典对照图谱一致
钠盐	火焰鉴别鲜黄色
		含量(＞95％)	98.7
蛋白质(＜0.05％)	0.008
		吸光度A(280)(＜0.25％)	0.014
平均分子量(Da)	369
		透光率(＞99％)	99.9
PH值(6～7.5)	6.2
		重金属(≤20ppm)	符合
干燥失重(小于10％)	6.8

表10

表11

用高效液相色谱仪分析粉剂寡糖分布，具体检测方法和实施例1的区别仅为：本实施例的进样浓度为2％。检测完成的结果如图6所示，图6为实施例5所得粉剂的液相色谱图。

实施例6

(1)酶解反应

向200L不锈钢反应器中加入100L纯水，加入纯化透明质酸酶(酶活9.63×10⁶U/mL)4.67L，加入分子量为1300KDa的大分子透明质酸钠3Kg配至150L(底物浓度2％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入1.5×10⁶U纯化透明质酸酶)。开启搅拌，升温至40℃后保温反应15h。取反应后的酶解液3份各45L共计135L备用。

(2)陶瓷超滤膜分离

(3)脱盐浓缩

(4)除杂制粉

取上述所述混合物料经活性炭除杂后滤液，采用0.1μm微滤膜除菌，滤液用小型喷雾干燥设备制粉，进风温度157℃，出风温度87℃，得到超小分子量透明质酸钠粉剂约798g，得率约88.7％。

上述超小分子量透明质酸钠粉剂各检测指标如表12～14所示：

表12

外观	白色粉末
		红外鉴别	与欧洲药典对照图谱一致
钠盐	火焰鉴别鲜黄色
		含量(＞95％)	98.2
蛋白质(＜0.05％)	0.010
		吸光度A(280)(＜0.25％)	0.015
平均分子量(Da)	327
		透光率(＞99％)	99.9
PH值(6～7.5)	6.4
		重金属(≤20ppm)	符合
干燥失重(小于10％)	5.6

表13

表14

用高效液相色谱仪分析粉剂寡糖分布，具体检测方法和实施例1的区别仅为：本实施例的进样浓度为2％。检测完成的结果如图7所示，图7为实施例6所得粉剂的液相色谱图。

由上述实施例4～6所述，采用不同批次质量体积浓度2％的分子量1300KDa的大分子透明质酸钠，不同批次纯化透明质酸酶液，酶投量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入1.5×10⁶U纯化透明质酸酶，酶解温度40℃，酶解时间为15h，采用5K陶瓷超滤膜分离，150Da纳滤膜脱盐浓缩，除杂除菌后喷雾干燥制粉所得超小分子量透明质酸钠产品平均分子量为300Da～400Da，寡糖为以二糖、四糖和六糖为主的混合物，其中二糖质量占比7～9％、四糖质量占比60～70％、六糖质量占比20～30％、八糖质量占比0.6～1.2％；质量高于市售的平均分子量为600Da-800Da的超小分子量透明质酸钠。

对比例1

对比例1与实施例6的不同在于，取上述实施例6中反应15h结束的剩余备用酶解液中的45L用15K陶瓷超滤膜设备分离，其他条件与实施例6一致。得到超小分子量透明质酸钠粉剂约819g，得率约91％。

上述超小分子量透明质酸钠粉剂各检测指标如表15～17：

表15

表16

表17

用高效液相色谱仪分析粉剂寡糖分布，具体检测方法和实施例1的区别仅为：本对比例的进样浓度为0.2％。检测完成的结果如图8所示，图8为对比例1所得粉剂的液相色谱图。

对比例2

对比例2与实施例6的不同在于，取上述实施例6中反应15h结束的剩余备用酶解液中的45L用1K陶瓷超滤膜设备分离，其他条件与实施例6处理过程一致。得到超小分子量透明质酸粉剂约327g，得率约36.3％。

上述超小分子量透明质酸粉剂各检测指标如表18：

表18

外观	白色粉末
		红外鉴别	与欧洲药典对照图谱一致
钠盐	火焰鉴别鲜黄色
		含量(＞95％)	99.6
蛋白质(＜0.05％)	0.011
		吸光度A(280)(＜0.25％)	0.006
平均分子量(Da)	231
		透光率(＞99％)	99.9
PH值(6～7.5)	6.4
		重金属(≤20ppm)	符合
干燥失重(小于10％)	6.6

由上述实施例6、对比例1、对比例2所述，酶解液采用15K陶瓷超滤膜分离，透明质酸钠含量低(＜95％)，采用1K陶瓷超滤膜分离，透明质酸钠得率低(约36.3％)。综合产品质量及产品得率，优选为5K陶瓷超滤膜。

实验例1

细胞毒性评价：本实验以成纤维细胞(HFF-1)为研究对象，取实施例4中超小分子量透明质酸钠粉剂，评价超小分子量透明质酸钠对细胞的毒性实验。

(1)细胞接种：按8×10³个孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱(37℃、5％CO₂)中孵育过夜。

(2)实验分组：实验设置调零组、对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。

(3)配液：按表19的测试浓度设定表配制不同浓度的超小分子量透明质酸钠工作液。

表19

样品	①	②	③	④	⑤	⑥	⑦	⑧
									浓度	2	1	0.5	0.25	0.125	0.0625	0.0313	0.0156

(4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。对照组每孔加入200μL含10％PBS的培养液；阳性对照组每孔加入200μL含10％二甲基亚砜(DMSO)的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO₂)中培养。

(5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入含0.5mg/mL的噻唑蓝(MTT)的培养基，37℃避光孵育4h孵育结束后，弃掉上清，每孔加100μL的DMSO，在490nm处读取OD值。

(6)细胞相对活力计算：根据公式计算：细胞相对活力＝(样品孔OD-调零孔OD)/(溶剂对照孔OD-调零孔OD)。

(7)样品设定8个给药浓度，在成纤维细胞上开展细胞毒性检测实验，MTT检测结果如表20和图9所示，图9为实施例4所得粉剂的细胞活力图。

表20

由上述实验例1结果表明，样品超小分子量透明质酸钠在2.00％(m/V)浓度范围内未表现出成纤维细胞毒性。

实验例2

超小分子量透明质酸钠透皮吸收研究：

本实验基于猪皮扩散模型，以透过猪皮进入扩散池的透明质酸钠含量为指标，评价市售寡聚透明质酸钠(平均分子量3000Da～10000Da)和超小分子量透明质酸钠(实施例4中超小分子量透明质酸钠粉剂)的透皮吸收率。

(1)样品配置如表21所示：

表21

组别	类型	浓度	培养条件	检测方法
					对照组	寡聚透明质酸钠	0.5％	37℃恒温水浴	HPLC法
实验组	超小分子量透明质酸钠	0.5％	37℃恒温水浴	HPLC法

(2)扩散实验：用移液枪吸取6.5mL生理盐水加入扩散室中，放置猪皮并用夹子夹好立式扩散池，准确称取约0.500g透明质酸钠水溶液于猪皮上，用保鲜膜封住扩散池，放入37℃恒温水浴中，磁力搅拌速度为300rpm。放置15min后，用移液枪吸取0.3mL扩散室内溶液，待留存此溶液后补充加入0.3mL生理盐水。再次放入恒温水浴中，30min、1h、2h后做相同取样操作。

(3)检测(高效液相色谱测定含量)

将取样留存的溶液透过0.45μm的滤膜，用微量进样针吸取10μL打入液相色谱中进行检测，待样品峰被洗脱后计算峰面积。以峰面积与原液面积比标定扩散池中透明质酸钠浓度(原液透明质酸钠浓度已知)。

上述液相色谱检测的条件为：

固定相：Diamonsil C18柱(4.6×250mm，5μm)

流动相：乙腈：水＝90:10

流速：1mL/min

柱温：25℃

检测波长：194nm

上述液相色谱检测结果如表22和图10所示，图10为市售寡聚透明质酸钠和实施例4的超小分子量透明质酸钠的透皮吸收率对比图：

表22

上述实验例2结果表明：(1)实验组超小分子量透明质酸钠的透皮速率显著高于对照组寡聚透明质酸钠，30min透皮率即可达到52.7％，15min内初始透皮速率是对照组的约3倍。

(2)对照组寡聚透明质酸钠的完全透皮(透皮率>90％)时间为24h，而实验组超小分子量透明质酸钠的完全透皮时间为2h，完全透皮时间缩短至对照组的1/12。

实验例3

超小分子量透明质酸钠体外功效活性评价-紧致：本实验以成纤维细胞(HFF-1)为研究对象，取实施例4中超小分子量透明质酸钠粉剂，评价超小分子量透明质酸钠促进Ⅰ型胶原蛋白实验。具体步骤如下：

(1)接种：按1×10⁵个孔的接种密度接种细胞至24孔板，培养箱(37℃、5％CO₂)中孵育过夜。

(2)配液：按照表23的实验设计表配置受试物工作液。

表23

(3)给药：在培养箱(37℃，5％CO₂)中培养24h后，根据细胞毒性结果，按照表5加入药物，以TGF-β作为阳性对照，以未处理细胞作为空白对照，每组设置3个重复孔。

(4)检测：加药后在培养箱(37℃，5％CO₂)中继续培养24h，收集培养液。采用试剂盒进行培养液中蛋白含量的检测。

(5)Ⅰ型胶原蛋白含量检测

基于实验方法，收集细胞上清，进行I型胶原蛋白含量检测，检测结果如表24所示，变化趋势如图11所示，图11为I型胶原蛋白含量变化趋势图。

表24

备注：用t-test方法进行统计分析时，样品组、PC组与BC组相比，显著性以*表示，p-value<0.05表示为*，p-value<0.01表示为**。

由上述实验例3结果表明，I型胶原蛋白含量检测结果中，与空白对照相比，样品水解透明质酸钠在0.125％(mN)浓度下作用成纤维细胞24h后，I型胶原蛋白含量显著提高，具有一定的紧致功效。

实验例4

超小分子量透明质酸钠体外功效活性评价-抗皱：本测试采用30J/cm²UVA刺激成纤维细胞，通过检测I型胶原(Collagen I)蛋白含量变化，评价待测实施例4中超小分子量透明质酸钠样品的抗皱功效。

(1)接种：按4E4个/孔的接种密度接种成纤维细胞至24孔板，培养箱(37℃、5％CO₂)中孵育过夜。

(2)配液：按照表25所示测试方案配置受试物工作液。

表25

(3)给药：根据测试方案，待24孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱(37℃、5％CO₂)中培养24h。

(4)UVA辐照：根据试验分组，对有UVA照射的组别进行30J/cm²的UVA辐照，置于培养箱(37℃、5％CO₂)中继续培养24h。

(5)免疫荧光测试：取用于免疫荧光检测的模型，用4％的多聚甲醛进行固定处理，固定24h后，进行Collagen I免疫荧光检测，显微镜下拍照观察，采集图片并分析。

(6)结果统计分析：应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。

(7)Collagen I测试结果如表26和图12～13所示，图12为Collagen I免疫荧光结果图；图13为Collagen I积分光密度(IOD)值柱状图；其中，图12中的A～C分别为BC组的复孔1、复孔2和复孔3的测试结果；图12中的D～F分别为NC组的复孔1、复孔2和复孔3的测试结果；图12中的G～I分别为PC(TGF-β1)组的复孔1、复孔2和复孔3的测试结果；图12中的J～L分别为超小分子量透明质酸钠-5mg/mL组的复孔1、复孔2和复孔3的测试结果。

表26

备注：用t-test方法进行统计分析时，与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC组相比，显著性以*表示P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。

由上述实验例4结果表明，与BC组相比，NC组的Collagen I含量显著上升，说明本次实验刺激条件有效。与NC组相比，PC组的Collagen I含量显著下降，说明本次阳性对照检测有效。与NC组相比，样品超小分子量透明质酸钠-5mg/mL的Collagen I含量显著上升(P＜0.01)，提升率为52.87％。

实验例5

超小分子量透明质酸钠人体抗皱功效研究：超小分子量透明质酸钠(实施例4中酶切法制备的超小分子量透明质酸钠粉剂)在化妆品中的功效研究，以一种以超小分子量透明质酸钠为功效成分的精华液为例，所述精华液包括以下物质制备：超小分子量透明质酸钠0.5％、甘油、防腐剂(丁二醇、己二醇、戊二醇中的一种或几种)，纯水溶解；料液经0.1um微滤膜除菌后灌入100ML瓶子中密封好(上述操作均在洁净环境下操作)。经产品质量检验合格后既得超小分子量透明质酸钠精华液，产品置于常温、避光条件下保存待用。

本实验以30人以上使用产品后仪器测试的方法，前后对照，验证产品使用后28天抗皱的效果：

招募身体健康的35人，年龄35-60岁之间，确认受试者无严重系统性疾病、无免疫缺陷或自身免疫性疾病、无活动性过敏性疾病、对护肤类化妆品无过敏史、1个月内未曾全身使用激素类药物及免疫抑制剂、非妊娠或哺乳期、无伦理学禁忌。要求受试者有明显细纹，每人每天早晚在脸部涂抹一次精华液，连续使用28天，分别于使用前，使用后7，14，28天后，用仪器对志愿者进行皱纹面积占比的检测，测试数据取平均值，抗皱功效测试结果见表27。三例进行产品测试28天后的受试人群的皮肤前后对照如图14～16所示，图14为第一例受试人群进行产品测试28天前后的皱纹示意图，图15为第二例受试人群进行产品测试28天前后的皱纹示意图，图16为第三例受试人群进行产品测试28天前后的皱纹示意图，图14～16中的左图为进行产品测试前的皱纹示意图，右图为进行产品测试后的皱纹示意图

表27测试参数变化表

由上述实验例5结果表明，在使用28天后，受试人群皱纹面积平均占比减少16.07％。受试者在使用产品后，根据皱纹面积占比前后统计结果，P值＜0.05，具有显著差异。因此，以超小分子量透明质酸钠为主要功效成分的精华液具有明显的抗皱功效。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种超小分子量透明质酸钠，其特征在于，以质量份计，其寡糖成分包括：

7份～9份的二糖；

60份～70份的四糖；

20份～30份的六糖；和

0.6份～1.2份的八糖。

2.根据权利要求1所述的超小分子量透明质酸钠，其特征在于，其平均分子量为300Da～400Da。

3.一种权利要求1或2所述的超小分子量透明质酸钠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S3)将步骤S2)中所述总透过液依次进行钠滤浓缩和除杂，得到所述超小分子量透明质酸钠。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述纯化透明质酸酶的纯化方法包括：将透明质酸酶发酵液依次进行板框除菌、低压陶瓷膜除菌和高压陶瓷超滤膜除杂，得到所述纯化透明质酸酶。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1)中所述纯化透明质酸酶的来源为水蛭；

步骤S1)中所述透明质酸酶发酵液中菌体的质量含量为50wt％～55wt％。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1)中所述低压陶瓷膜的规格为50nm～200nm；所述低压陶瓷膜的膜面积为0.286m²，设备设计压力为0.3Mpa～0.35Mpa，料液温度为30℃～35℃。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1)中所述高压陶瓷超滤膜的规格为15000Da～25000Da；所述高压陶瓷超滤膜的膜面积为0.286m²，设备设计压力为0.5Mpa～0.9Mpa，设备运行中压力为0.70Mpa～0.75Mpa，料液温度为30℃～35℃。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1)中所述纯化透明质酸酶的酶活为8.0×10⁵U/mL～1.2×10⁶U/mL。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1)中所述透明质酸钠在所述酶解反应中的含量为1g/mL～4g/mL；

每存在1g所述透明质酸钠，所述纯化透明质酸酶的加入量为1.0×10⁶U～2.0×10⁶U。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1)中所述酶解反应的温度为35℃～45℃；所述酶解反应的时间为10h～25h。