CN116179629A - 不饱和透明质酸钠二糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种不饱和透明质酸钠二糖的制备方法，涉及生物技术领域。本发明提供的不饱和透明质酸钠二糖的制备方法，包括：酶解：采用透明质酸酶对大分子透明质酸钠进行酶解反应，获得含有不饱和透明质酸钠二糖的酶解液；超滤膜分离：采用截留分子量为1‑5KDa的超滤膜对酶解液进行分离，获得超滤透过液；脱盐浓缩：采用纳滤膜对超滤透过液进行浓缩脱盐，获得纳滤浓缩液；除菌制粉：将纳滤浓缩液依次经过除菌和干燥后制备得到不饱和透明质酸钠二糖。该制备方法无有机溶剂使用，成本低，适合于大规模工业化生产，制备得到的不饱和透明质酸钠二糖得率高，纯度高，杂质少，具有更好的透皮吸收性能和更高的抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种不饱和透明质酸钠二糖的制备方法。
背景技术
(1)透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种广泛存在于人及哺乳动物体内的酸性黏多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成、无分支的单链高分子糖胺聚糖。由于透明质酸独特的物理学特性、高保湿性、粘弹性、润滑性，广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为105～107Da(道尔顿)。
(2)寡聚透明质酸钠是指分子量小于10kDa的透明质酸。有研究认为，不同的分子量的透明质酸有着不同的甚至完全相反的生物活性，高分子量透明质酸由于其保湿性、粘弹性及润滑性常被应用在滴眼液、美容填充及骨科填充等领域，但当透明质酸的分子量降低至寡糖的水平时(10kDa以下)，透明质酸寡糖表现出与高分子量透明质酸完全不同的性能，具有抗氧化性、透皮吸收、创伤修复的活性。不饱和透明质酸二糖分子量为383Da，是透明质酸经过细菌产透明质酸酶酶解制备的透明质酸二糖，与透明质酸二糖结构相区别的是，不饱和透明质酸二糖在葡萄糖醛酸的4,5糖苷键处形成不饱和键。经前期研究发现，不饱和透明质酸二糖(ΔDiHA)具有较强的抗氧化性，并能够明显促进人脐静脉内皮细胞及人角膜上皮细胞增殖，在医药领域具有广阔的应用前景。另外，高纯度不饱和透明质酸二糖(ΔDiHA)也可以作为标准品，用作透明质酸及其相关产品的含量及纯度检测。
CN107460184A公开了一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16-3及其编码基因与应用，所得透明质酸裂解酶用于降解透明质酸，从而制备不饱和透明质酸二糖。该专利所得的透明质酸裂解酶酶活低，容易引入更多杂质，降解后需要经过分子凝胶色谱柱分离纯化，并需经过冷冻干燥得到纯度较高的不饱和透明质酸二糖。该方法工艺成本高、能耗高、不适用于大规模生产。
CN110982862A公开了一种采用两步芽孢杆菌透明质酸酶酶解和两步有机溶剂纯化大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法，该方法采用两步酶解工艺步骤繁琐、两步有机溶剂纯化易污染环境，且酶解后采用活性炭吸附除杂，增加了对操作人员的炭污染问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种不饱和透明质酸钠二糖的制备方法，该制备方法简单方便，能够解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供一种不饱和透明质酸钠二糖。
第一方面，本发明提供了一种不饱和透明质酸钠二糖的制备方法，包括如下步骤：
a.酶解：采用透明质酸酶对大分子透明质酸钠进行酶解反应，获得含有不饱和透明质酸钠二糖的酶解液；
b.超滤膜分离：采用截留分子量为1-5KDa的超滤膜对a步骤获得的酶解液进行分离，获得超滤透过液；
c.脱盐浓缩：采用纳滤膜对b步骤获得的超滤透过液进行浓缩脱盐，获得纳滤浓缩液；
d.除菌制粉：将c步骤获得的纳滤浓缩液依次经过除菌和干燥后制备得到不饱和透明质酸钠二糖。
作为进一步技术方案，所述大分子透明质酸钠的分子量为1000-1800KDa。
作为进一步技术方案，所述a步骤为：向大分子透明质酸钠的溶液中添加透明质酸酶进行酶解反应，获得含有不饱和透明质酸钠二糖的酶解液。
作为进一步技术方案，所述大分子透明质酸钠的溶液中大分子透明质酸钠的浓度为0.5wt％-2wt％；
所述透明质酸酶的酶活为2.0×105-2.5×105IU/mL；
每1g大分子透明质酸钠的溶液中加入2.5×105-3.5×105IU的透明质酸酶；
所述酶解反应的温度为30-40℃，酶解反应的时间为8-20h。
作为进一步技术方案，所述大分子透明质酸钠的溶液中大分子透明质酸钠的浓度为1wt％；
每1g大分子透明质酸钠的溶液中加入3.0×105IU的透明质酸酶；
所述酶解反应的温度35℃，酶解反应的时间为16h。
作为进一步技术方案，b步骤中，所述超滤膜的截留分子量为1KDa。
作为进一步技术方案，步骤c中，所述纳滤膜的截留分子量为150Da。
作为进一步技术方案，d步骤中，所述除菌的方式包括过滤除菌；
优选地，采用0.1um的微滤膜进行过滤除菌。
作为进一步技术方案，d步骤中，所述干燥的方式包括喷雾干燥；
优选地，所述喷雾干燥的进风温度为140-160℃，出风温度为70-90℃。
第二方面，本发明提供了一种不饱和透明质酸钠二糖，采用所述的制备方法制备得到。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的不饱和透明质酸钠二糖的制备方法，无有机溶剂使用、无环境污染；成本低，仅采用一步透明质酸酶酶解，且酶解后采用超滤分离及纳滤浓缩，不使用活性炭去杂，避免了对操作人员的炭污染，适合于大规模工业化生产；制备得到的不饱和透明质酸钠二糖得率高，纯度高，杂质少，无细胞毒性，相比市售超小分子量透明质酸钠(平均分子量＜1000Da)具有更好的透皮吸收性能和更高的抗氧化活性，能够应用于化妆品、食品、保健品、医用等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的图谱；
图2为本发明实施例2提供的图谱；
图3为本发明实施例3提供的图谱；
图4为本发明实施例4提供的图谱；
图5为本发明实施例5提供的图谱；
图6为本发明对比例1提供的图谱；
图7为本发明实验例1提供的细胞活力曲线图；
图8为本发明实验例1提供的细胞形态学图；
图9为本发明实验例2提供的皮肤透过率曲线图；
图10为本发明实验例3的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种不饱和透明质酸钠二糖的制备方法，包括如下步骤：
a.酶解：采用透明质酸酶对大分子透明质酸钠进行酶解反应，获得含有不饱和透明质酸钠二糖的酶解液；
b.超滤膜分离：采用截留分子量为1-5KDa的超滤膜对a步骤获得的酶解液进行分离，获得超滤透过液；
c.脱盐浓缩：采用纳滤膜对b步骤获得的超滤透过液进行浓缩脱盐，获得纳滤浓缩液；
d.除菌制粉：将c步骤获得的纳滤浓缩液依次经过除菌和干燥后制备得到不饱和透明质酸钠二糖。
本发明提供的不饱和透明质酸钠二糖的制备方法，无有机溶剂使用、无环境污染；成本低，仅采用一步透明质酸酶酶解，且酶解后采用超滤分离及纳滤浓缩，不使用活性炭去杂，避免了对操作人员的炭污染，适合于大规模工业化生产；制备得到的不饱和透明质酸钠二糖得率高，纯度高，杂质少，无细胞毒性，相比市售超小分子量透明质酸钠(平均分子量＜1000Da)具有更好的透皮吸收性能和更高的抗氧化活性，能够应用于化妆品、食品、保健品、医用等领域。
在一些优选的实施方式中，所述大分子透明质酸钠的分子量为1000-1800KDa，例如可以采用分子量为1300KDa左右的大分子透明质酸钠。
在一些优选的实施方式中，所述a步骤为：向大分子透明质酸钠的溶液中添加透明质酸酶进行酶解反应，获得含有不饱和透明质酸钠二糖的酶解液。
在一些优选的实施方式中，所述大分子透明质酸钠的溶液中大分子透明质酸钠的浓度例如可以为，但不限于0.5wt％、1wt％、1.5wt％或2wt％；
所述透明质酸酶的酶活例如可以为，但不限于2.0×105IU/mL、2.1×105IU/mL、2.2×105IU/mL、2.3×105IU/mL、2.4×105IU/mL或2.5×105IU/mL；
每1g大分子透明质酸钠的溶液中加入2.5×105-3.5×105IU的透明质酸酶；
所述酶解反应的温度例如可以为，但不限于30、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃，酶解反应的时间例如可以为，但不限于8h、12h、16h或20h。
在一些优选的实施方式中，所述大分子透明质酸钠的溶液中大分子透明质酸钠的浓度为1wt％；
每1g大分子透明质酸钠的溶液中加入3.0×105IU的透明质酸酶；
所述酶解反应的温度35℃，酶解反应的时间为16h。
通过对酶解反应的进一步优化和调整，提高酶解反应稳定性，降低生产成本。
在一些优选的实施方式中，b步骤中，所述超滤膜的截留分子量为1KDa。经发明人研究发现，采用截留分子量为1KDa的超滤膜能够更好的去除酶解液中的大分子物质，降低产品中蛋白含量，提高纯度。本发明对于超滤膜的类型不作具体限制，例如可以采用陶瓷超滤膜。
在一些优选的实施方式中，步骤c中，所述纳滤膜的截留分子量为150Da。经发明人研究发现，以截留分子量为150Da的纳滤膜能够更高效的脱除溶液能够的盐，最大程度的保留不饱和透明质酸钠二糖。本发明对于纳滤膜的类型不作具体限制，例如可以采用陶瓷纳滤膜。
在一些优选的实施方式中，d步骤中，所述除菌的方式包括过滤除菌；
优选地，采用0.1um的微滤膜进行过滤除菌。
在一些优选的实施方式中，d步骤中，所述干燥的方式包括喷雾干燥；
优选地，所述喷雾干燥的进风温度为140-160℃，出风温度为70-90℃。
第二方面，本发明提供了一种不饱和透明质酸钠二糖，采用所述的制备方法制备得到。
本发明提供的不饱和透明质酸钠二糖，纯度高，杂质少，无细胞毒性，相比市售超小分子量透明质酸钠(平均分子量＜1000Da)具有更好的透皮吸收性能和更高的抗氧化活性，能够应用于化妆品、食品、保健品、医用等领域。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
酶解反应：
向2L烧杯中加入1L纯水，加入纯化透明质酸酶(酶活2.2×105IU/mL)47.73mL，加入大分子透明质酸钠(分子量为1300KDa)30g加水配至1.5L(底物浓度2％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入3.5×105IU纯化透明质酸酶)。保鲜膜密封烧杯开启搅拌，升温至40℃后保温反应20h，分别取反应第8h、12h、16h、20h的酶解液各10mL。
样品处理：取反应第8h、12h、16h、20h的酶解液各10mL，80℃灭活30min(取完样品立即灭活)后降温至常温，离心取上清稀释10倍过0.22um过滤头后待测，不饱和透明质酸钠二糖对照品配置浓度0.2％过0.22um过滤头后待测。
用高效液相色谱仪分析其各样品含量(样品峰面积/对照品峰面积)，具体检测方法为：
色谱柱：Supelco
100RP-18色谱柱(4.0*250mm，5μm)；
检测器：紫外-可见分光检测器；
检测波长：210nm；
柱温：30℃；
流动相：流动相A：乙腈；
流动相B：0.01M四丁基氢氧化铵(精密移取12.5mL四丁基氢氧化铵～25％水溶液，加入1000mL水，混匀后用磷酸调节pH至6.0)；
流速：1.0mL/min；
进样浓度：待测样品；
进样量：5μL；洗脱程序：见下表：
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 28 | 72 |
| 8 | 30 | 70 |
| 25 | 52 | 48 |
| 35 | 55 | 45 |
| 37 | 28 | 72 |
| 45 | 28 | 72 |
各时间段二糖含量，见下表：
| 酶解时间 | 8h | 12h | 16h | 20h |
| 二糖含量 | 94％ | 约100％ | 约100％ | 约100％ |
酶解12h图谱如图1所示。
实施例2
酶解反应：
向2L烧杯中加入1L纯水，加入纯化透明质酸酶(酶活2.5×105IU/ml)7.81mL，加入大分子透明质酸钠(分子量为1300KDa)7.5g加水配至1.5L(底物浓度0.5％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入2.5×105IU纯化透明质酸酶)。保鲜膜密封烧杯开启搅拌，升温至30℃后保温反应20h，分别取反应第8h、12h、16h、20h的酶解液各10mL。
样品处理：取反应第8h、12h、16h、20h的酶解液各10mL，80℃灭活30min(取完样品立即灭活)后降温至常温，离心取上清稀释2.5倍过0.22um过滤头后待测，不饱和透明质酸钠二糖对照品配置浓度0.2％过0.22um过滤头后待测。
用高效液相色谱仪分析其各样品含量(样品峰面积/对照品峰面积)，具体检测方法为：
色谱柱：Supelco
100RP-18色谱柱(4.0*250mm，5μm)；
检测器：紫外-可见分光检测器；
检测波长：210nm；
柱温：30℃；
流动相：流动相A：乙腈；
流动相B：0.01M四丁基氢氧化铵(精密移取12.5mL四丁基氢氧化铵～25％水溶液，加入1000mL水，混匀后用磷酸调节pH至6.0)；
流速：1.0mL/min；
进样浓度：待测样品；
进样量：5μL；洗脱程序：见下表：
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 28 | 72 |
| 8 | 30 | 70 |
| 25 | 52 | 48 |
| 35 | 55 | 45 |
| 37 | 28 | 72 |
| 45 | 28 | 72 |
各时间段二糖含量，见下表：
酶解16h图谱如图2所示。
实施例3
酶解反应：
向2L烧杯中加入1L纯水，加入纯化透明质酸酶(酶活2.4×105IU/ml)18.75mL，加入大分子透明质酸钠(分子量为1300KDa)15g加水配至1.5L(底物浓度1％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入3.0×105IU纯化透明质酸酶)。保鲜膜密封烧杯开启搅拌，升温至35℃后保温反应20h，分别取反应第8h、12h、16h、20h的酶解液各10mL。
样品处理：取反应第8h、12h、16h、20h的酶解液各10mL，80℃灭活30min(取完样品立即灭活)后降温至常温，离心取上清稀释5倍过0.22um过滤头后待测，不饱和透明质酸钠二糖对照品配置浓度0.2％过0.22um过滤头后待测。
用高效液相色谱仪分析其各样品含量(样品峰面积/对照品峰面积)，具体检测方法为：
色谱柱：Supelco
100RP-18色谱柱(4.0*250mm，5μm)；
检测器：紫外-可见分光检测器；
检测波长：210nm；
柱温：30℃；
流动相：流动相A：乙腈；
流动相B：0.01M四丁基氢氧化铵(精密移取12.5mL四丁基氢氧化铵～25％水溶液，加入1000mL水，混匀后用磷酸调节pH至6.0)；
流速：1.0mL/min；
进样浓度：待测样品；
进样量：5μL；洗脱程序：见下表：
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 28 | 72 |
| 8 | 30 | 70 |
| 25 | 52 | 48 |
| 35 | 55 | 45 |
| 37 | 28 | 72 |
| 45 | 28 | 72 |
各时间段二糖含量，见下表：
| 酶解时间 | 8h | 12h | 16h | 20h |
| 二糖含量 | 约86％ | 约98％ | 约100％ | 约100％ |
酶解16h图谱如图3所示。
上述实施例1，2，3酶解条件及酶解二糖含量如下表。
实施例1：
实施例2：
实施例3：
由上述实施例1，2，3所述，综合酶解反应条件及成本能耗、稳定性等，优选的酶解条件为：采用质量体积浓度1％大分子透明质酸钠(分子量1300KDa)，酶投量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入3.0×105IU纯化透明质酸酶，酶解温度35℃，酶解时间为16h，酶解液二糖含量约100％。
实施例4
(1)酶解反应
向50L不锈钢反应器中加入20L纯水，加入纯化透明质酸酶(酶活2.1×105IU/ml)0.64L，加入大分子透明质酸钠(分子量为1300KDa)450g配至45L(底物浓度1％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入3.0×105U纯化透明质酸酶)。开启搅拌，升温至35℃后保温反应16。
(2)陶瓷超滤膜分离
取上述所述剩余反应16h结束的酶解液45L用1K陶瓷超滤膜设备分离，物料温度控制在30-35℃，物料浓缩至约死体积15L时加纯化水流加透析，透析至尾线折光为0时停机清洗设备，收集总透过液。
(3)脱盐浓缩
上述所述总透过液经150Da陶瓷纳滤膜设备浓缩至约3L时加纯化水流加透析，透析至尾线折光为0，电导率＜100us/cm时收集浓缩液(物料温度控制在30-35℃)，后加水顶洗残留物料收集与浓缩液混合，设备停机清洗设备。
(4)除杂制粉
取上述所述混合物料采用0.1um微滤膜除菌，滤液用小型喷雾干燥设备制粉得到不饱和透明质酸钠二糖约414.9g，得率约92.2％。含量为99.5(HPLC)，蛋白为0。
用高效液相色谱仪分析粉剂含量，具体检测方法为：
色谱柱：Supelco
100RP-18色谱柱(4.0*250mm，5μm)；
检测器：紫外-可见分光检测器；
检测波长：210nm；
柱温：30℃；
流动相：流动相A：乙腈；
流动相B：0.01M四丁基氢氧化铵(精密移取12.5mL四丁基氢氧化铵～25％水溶液，加入1000mL水，混匀后用磷酸调节pH至6.0)；
流速：1.0mL/min；
进样浓度：0.2％；
进样量：5μL；洗脱程序：见下表
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 28 | 72 |
| 8 | 30 | 70 |
| 25 | 52 | 48 |
| 35 | 55 | 45 |
| 37 | 28 | 72 |
| 45 | 28 | 72 |
图谱如图4所示。
实施例5
(1)酶解反应
向200L不锈钢反应器中加入50L纯水，加入纯化透明质酸酶(酶活2.0×105IU/ml)1.35L，加入大分子透明质酸钠(分子量为1300KDa)900g配至90L(底物浓度1％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入3.0×105U纯化透明质酸酶)。开启搅拌，升温至35℃后保温反应16h，反应结束后取45L备用。
(2)陶瓷超滤膜分离
取上述所述剩余反应16h结束的剩余酶解液45L用1K陶瓷超滤膜设备分离，物料温度控制在30-35℃，物料浓缩至约死体积15L时加纯化水流加透析，透析至尾线折光为0时停机清洗设备，收集总透过液。
(3)脱盐浓缩
上述所述总透过液经150Da陶瓷纳滤膜设备浓缩至约3L时加纯化水流加透析，透析至尾线折光为0，电导率＜100us/cm时收集浓缩液(物料温度控制在30-35℃)，后加水顶洗残留物料收集与浓缩液混合，设备停机清洗设备。
(4)除杂制粉
取上述所述混合物料采用0.1um微滤膜除菌，滤液用小型喷雾干燥设备制粉得到不饱和透明质酸钠二糖约418.7g，得率约93％，含量为99.3(HPLC)，蛋白为0。
用高效液相色谱仪分析粉剂含量，具体检测方法为：
色谱柱：Supelco
100RP-18色谱柱(4.0*250mm，5μm)；
检测器：紫外-可见分光检测器；
检测波长：210nm；
柱温：30℃；
流动相：流动相A：乙腈；
流动相B：0.01M四丁基氢氧化铵(精密移取12.5mL四丁基氢氧化铵～25％水溶液，加入1000mL水，混匀后用磷酸调节pH至6.0)；
流速：1.0mL/min；
进样浓度：0.2％；
进样量：5μL；洗脱程序：见下表
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 28 | 72 |
| 8 | 30 | 70 |
| 25 | 52 | 48 |
| 35 | 55 | 45 |
| 37 | 28 | 72 |
| 45 | 28 | 72 |
图谱如图5所示。
对比例1
对比例1与实施例5的不同在于，取上述实施例5中反应16h结束的备用酶解液中的45L用5K陶瓷超滤膜设备分离，其他条件与实施例5一致。得到不饱和透明质酸钠二糖约416.7g，得率约92.6％，含量为95.8(HPLC)，蛋白为0.016。
用高效液相色谱仪分析粉剂含量，具体检测方法为：
色谱柱：Supelco
100RP-18色谱柱(4.0*250mm，5μm)；
检测器：紫外-可见分光检测器；
检测波长：210nm；
柱温：30℃；
流动相：流动相A：乙腈；
流动相B：0.01M四丁基氢氧化铵(精密移取12.5mL四丁基氢氧化铵～25％水溶液，加入1000mL水，混匀后用磷酸调节pH至6.0)；
流速：1.0mL/min；
进样浓度：0.2％；
进样量：5μL；洗脱程序：见下表
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 28 | 72 |
| 8 | 30 | 70 |
| 25 | 52 | 48 |
| 35 | 55 | 45 |
| 37 | 28 | 72 |
| 45 | 28 | 72 |
图谱如图6所示。
由上述实施例4、实施例5、对比例1所述，大分子透明质酸钠(分子量为1300KDa)浓度1％，酶的加入量为每1g大分子透明质酸钠溶液中加入3.0×105U纯化透明质酸酶)。酶解温度35℃，酶解时间16h，采用1K陶瓷超滤膜相比5K陶瓷超滤膜制备的二糖含量高，蛋白含量低，粉剂得率无显著性差异，优选为1K陶瓷超滤膜。
表如下：
| 得率 | 含量 | 蛋白 | |
| 实施例4 | 92.2％ | 99.5％ | 0 |
| 实施例5 | 93％ | 99.3％ | 0 |
| 对比例1 | 92.6％ | 95.8％ | 0.016％ |
实验例1
细胞毒性评价
本实验以成纤维细胞(HFF-1)为研究对象，取实施例4中不饱和透明质酸钠二糖粉剂，评价不饱和透明质酸钠二糖对细胞的毒性实验。
(1)细胞接种：按8×103个孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
(2)实验分组：实验设置调零组(无细胞接种，仅含培养液，用于避免细胞培养液的影响)、对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。
(3)配液：按测试浓度设定表配制不同浓度的超小分子量透明质酸钠工作液。浓度设定表如下：
(4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。对照组每孔加入200μL含10％PBS的培养液；阳性对照组每孔加入200μL含10％DMSO的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养。
(5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入含0.5 mg/mL的MTT的培养基,37℃避光孵育4h孵育结束后，弃掉上清，每孔加100μLDMSO,在490 nm处读取OD值。
(6)细胞相对活力计算：根据公式计算：
细胞相对活力＝(样品孔OD-调零孔OD)/(溶剂对照孔OD-调零孔OD)。
(7)样品设定8个给药浓度，在成纤维细胞上开展细胞毒性检测实验，MTT检测结果见下表。
各样品的细胞活力曲线图如图7所示，各样品的细胞形态图如图8所示。
由上述实验例1结果表明，根据MTT结果和形态学结果，认为样品不饱和透明质酸钠二糖基于成纤维细胞，在5mg/mL的浓度范围内未表现出明显的细胞毒性。
实验例2
不饱和透明质酸钠二糖透皮吸收研究
本实验基于猪皮扩散模型，以透过猪皮进入扩散池的透明质酸钠含量为指标，评价市售超小分子量透明质酸钠(平均分子量＜1000Da，600-800Da)和不饱和透明质酸钠二糖(实施例4中不饱和透明质酸钠二糖粉剂)的透皮吸收率。
(1)样品配置：
| 组别 | 类型 | 浓度 | 培养条件 | 检测方法 |
| 对照组 | 超小分子量透明质酸钠 | 0.5％ | 37℃恒温水浴 | HPLC法 |
| 实验组 | 不饱和透明质酸钠二糖 | 0.5％ | 37℃恒温水浴 | HPLC法 |
(2)扩散实验：用移液枪吸取6.5mL生理盐水加入扩散室中，放置猪皮并用夹子夹好立式扩散池，准确称取约0.500g透明质酸钠水溶液于猪皮上，用保鲜膜封住扩散池，放入37℃恒温水浴中，磁力搅拌速度为300rpm。放置15min后，用移液枪吸取0.3mL扩散室内溶液，待留存此溶液后补充加入0.3mL生理盐水。再次放入恒温水浴中，10min、20min、30min、1h、2h后做相同取样操作。
(3)检测(高效液相色谱测定含量)
将取样留存的溶液透过0.45μm的滤膜，用微量进样针吸取10μL打入液相色谱中，待样品峰被洗脱后计算峰面积。以峰面积与原液面积比标定扩散池中透明质酸钠浓度(原液透明质酸钠浓度已知)。
固定相：Diamonsil C18柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：乙腈：水＝90:10；
流速：1mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：194nm。
(4)测试结果见下表：
| 对照组 | 实验组 | |
| 时间 | 计算所得透皮率 | 计算所得透皮率 |
| 10min | 21.8％ | 56.8％ |
| 20min | 37.2％ | 82.9％ |
| 30min | 63％ | 98.4％ |
| 1h | 87.1％ | - |
| 2h | 96.4 | - |
| 4h | - | - |
图9为实验组和对照组皮肤透过率结果。
由上述实验例2结果表明，(1)实验组不饱和透明质酸钠二糖的透皮速率显著高于对照组市售超小分子量透明质酸钠，20min透皮率即可达到82.9％，初始透皮速率(15min内)是对照组的约2.6倍。
(2)对照组市售超小分子量透明质酸钠的完全透皮(透皮率>95％)时间为2h，而实验组不饱和透明质酸钠二糖的完全透皮时间为30min，完全透皮时间缩短至对照组的1/4。
实验例3
不饱和透明质酸钠二糖抗氧化研究
本实验采用DPPH自由基清除实验，评价市售超小分子量透明质酸钠(平均分子量＜1000Da，600-800Da)和不饱和透明质酸钠二糖(实施例4中不饱和透明质酸钠二糖粉剂)的抗氧化性。
本实验采用ROS自由基清除实验，评价市售超小分子量透明质酸钠(平均分子量＜1000Da，600-800Da)和不饱和透明质酸钠二糖(实施例4中不饱和透明质酸钠二糖粉剂)的抗氧化性。
1.细胞接种：Ha CAT细胞分别按照一定数量接种至孔板，37℃，5％CO2培养箱孵育过夜；
2.实验分组：分别设置调零组(无细胞接种，仅含培养液，用于避免细胞培养液的影响)、溶剂对照组(即不添加样品的对照组)、样品组。每个样品设置2个浓度，每个浓度梯度下设置4个复孔；
3.配液：按照测试浓度要求配置不同浓度的样品工作液；
| 组别 | 类型 | 浓度1 | 浓度2 |
| 对照组 | 超小分子量透明质酸钠 | 0.2％ | 0.5％ |
| 实验组 | 不饱和透明质酸钠二糖 | 0.2％ | 0.5％ |
4.上样：细胞融合度为45％-60％。去除旧培养基，加入200μL含有不同浓度待测样品的培养基，上样完成后37℃，5％CO2培养箱孵育；
5.诱导孵育结束后，不弃液，除调零组和溶剂对照组外，其余孔均需进行H2O2诱导；
6.诱导完毕后除溶剂对照组外，弃掉其余孔中的培养基，用PBS清洗3次后，每孔加入1mL DCFH-DA工作液，CO2培养箱孵育一定时间，孵育结束后，PBS清洗各孔内细胞3次；
7.将操作结束后的孔板，置于显微镜载物台上，采用FITC通道，入射光波长525nm，激发光波长488nm，物镜20倍镜下，设置相同的曝光时间，进行拍照。结果如图10所示。
由上述实验例3结果表明，基于ROS自由基清除实验，不饱和透明质酸钠二糖相比市售超小分子量透明质酸钠有更好的抗氧化活性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种不饱和透明质酸钠二糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.酶解：采用透明质酸酶对大分子透明质酸钠进行酶解反应，获得含有不饱和透明质酸钠二糖的酶解液；
b.超滤膜分离：采用截留分子量为1-5KDa的超滤膜对a步骤获得的酶解液进行分离，获得超滤透过液；
c.脱盐浓缩：采用纳滤膜对b步骤获得的超滤透过液进行浓缩脱盐，获得纳滤浓缩液；
d.除菌制粉：将c步骤获得的纳滤浓缩液依次经过除菌和干燥后制备得到不饱和透明质酸钠二糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大分子透明质酸钠的分子量为1000-1800KDa。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述a步骤为：向大分子透明质酸钠的溶液中添加透明质酸酶进行酶解反应，获得含有不饱和透明质酸钠二糖的酶解液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述大分子透明质酸钠的溶液中大分子透明质酸钠的浓度为0.5wt％-2wt％；
所述透明质酸酶的酶活为2.0×105-2.5×105IU/mL；
每1g大分子透明质酸钠的溶液中加入2.5×105-3.5×105IU的透明质酸酶；
所述酶解反应的温度为30-40℃，酶解反应的时间为8-20h。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述大分子透明质酸钠的溶液中大分子透明质酸钠的浓度为1wt％；
每1g大分子透明质酸钠的溶液中加入3.0×105IU的透明质酸酶；
所述酶解反应的温度35℃，酶解反应的时间为16h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，b步骤中，所述超滤膜的截留分子量为1KDa。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c中，所述纳滤膜的截留分子量为150Da。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，d步骤中，所述除菌的方式包括过滤除菌；
优选地，采用0.1um的微滤膜进行过滤除菌。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，d步骤中，所述干燥的方式包括喷雾干燥；
优选地，所述喷雾干燥的进风温度为140-160℃，出风温度为70-90℃。
10.一种不饱和透明质酸钠二糖，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到。
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