CN115944549A - 透明质酸寡糖组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种透明质酸寡糖组合物,所述透明质酸寡糖组合物包括式(I)所示结构的透明质酸寡糖,所述透明质酸寡糖还原端为N‑乙酰基葡萄糖:其中,X选自H、K、Na、Ca或Zn;n为选自1‑4正整数;所述透明质酸寡糖组合物的重均分子量小于等于1kDa。本申请的透明质酸寡糖还原端为N‑乙酰氨基葡萄糖,可以显著促进真皮成纤维细胞胶原蛋白的生成,尤其对成纤维细胞III型、IV型胶原蛋白的生成均具有显著促进作用。
Description
技术领域
本申请属于生物工程技术领域,具体地,涉及一种透明质酸寡糖组合物及其制备方法,以及透明质酸寡糖组合物在促进III型、IV型胶原蛋白生成中的用途。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是人体中重要的成分,由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和D-葡萄糖醛酸(GlcA)二糖重复单位通过β-1,4-糖苷键和β-1,3-糖苷键构成的无分支结构的高分子酸性黏多糖,广泛分布于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。研究发现,HA发挥生理作用与其分子量的大小密切相关,分子量越小生物活性越高。
酶法制备透明质酸寡糖,专一性强,能特异性地降解化学键而不对其他分子基团产生影响,可通过控制加酶量及反应时间得到均一的不同分子量透明质酸,同时具有反应温和、重复性好等优点,因此,酶法是制备低分子量透明质酸最理想的方法。根据不同的来源、催化机制和底物与产物特异性,HAase可以分为三类。三种酶结构不同,产物也不同。第一类为HA裂解酶(EC 4.2.2.1),主要存在于细菌、噬菌体以及真菌中,通过β-消除反应裂解HA的β-1,4-糖苷键,产生还原端为N-乙酰氨基葡萄糖的不饱和双糖分子;第二类为内切-β-葡萄糖醛酸苷酶(EC 3.2.1.36),主要存在于水蛭中,通过水解HA的β-1,3-糖苷键,得到以还原端为糖醛酸结构的四糖分子HA为主的产物;第三种为内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.35),主要存在于哺乳动物以及蜜蜂、蛇、蜘蛛等毒液中,可水解HA的β-1,4-糖苷键得到以还原端为N-乙酰氨基葡萄糖的饱和四糖HA分子为主的产物。
III型胶原是构成微胶原层的主要结构,能够撑起表皮,防止肌肤塌陷。IV型胶原是基底膜最重要的结构,皮肤基底膜位于真皮和表皮之间,由多种胞外基质蛋白组成,同时把真皮和表皮牢牢地连接起来。皮肤组织的生长期大约结束于25岁,之后,成纤维细胞减少且胶原蛋白合成量逐渐下降,皮肤组织活力下降,皮肤弹性逐渐丧失,皮肤的饱和度和光泽感降低,逐渐出现一系列皮肤问题。现有技术中,尚未有以N-乙酰氨基葡萄糖为还原端的超低分子量饱和透明质酸在改善皮肤衰老如促进III型、IV型胶原蛋白生成方面的研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本申请提供一种透明质酸寡糖组合物在促进III型、IV型胶原蛋白生成中的用途。
具体来说,本申请涉及如下方面:
1.一种透明质酸寡糖组合物,所述透明质酸寡糖组合物包括式(I)所示结构的透明质酸寡糖,所述透明质酸寡糖还原端为N-乙酰基葡萄糖:
其中,X选自H、K、Na、Ca或Zn;
n为选自1-4正整数;
所述透明质酸寡糖组合物的重均分子量小于等于1kD,所述透明质酸寡糖组合物中至少含有两种透明质酸寡糖。
2.根据项1所述的透明质酸寡糖组合物,在所述透明质酸寡糖组合物中,n=2的透明质酸寡糖的质量占比为55-80%,n=1的透明质酸寡糖的质量占比为1-10%,n=3的透明质酸寡糖的质量占比为5-35%,n=4的透明质酸寡糖的质量占比为1-10%。
3.根据项1所述的透明质酸寡糖组合物,在所述透明质酸寡糖组合物中,n=2的透明质酸寡糖的质量占比为60-75%,n=1的透明质酸寡糖的质量占比为1-10%,n=3的透明质酸寡糖的质量占比为15-30%,n=4的透明质酸寡糖的质量占比为1-8%。
4.根据项1所述的透明质酸寡糖组合物,所述透明质酸寡糖组合物在化妆品或药械产品中的质量浓度为0.01%-5%,进一步优选为0.05%-1%。
5.一种如项1-4中任一项所述的透明质酸寡糖组合物的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
将透明质酸用透明质酸酶进行酶解反应,
分离酶解反应物以得到透明质酸寡糖组合物,
其中,所述透明质酸酶为内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,
优选,所述透明质酸酶为利用毕赤酵母工程菌表达的山大齿猛蚁透明质酸水解酶。
6.根据项5所述的方法,
在所述酶解反应中,所述透明质酸的初始浓度为40-100g/L,
优选所述透明质酸酶的初始酶活为1.8×105-2.5×105U/mL,
进一步优选所述酶解反应温度为30-50℃,更优选为37-45℃。
7.一种如项1-4中任一项所述的透明质酸寡糖组合物在促进III型和/或IV型胶原蛋白生成中的用途。
本申请的透明质酸寡糖还原端为N-乙酰氨基葡萄糖,可以显著促进真皮成纤维细胞胶原蛋白的生成,尤其对成纤维细胞III型、IV型胶原蛋白的生成均具有显著促进作用,使真皮中的胶原蛋白含量增加,减少皱纹的产生,具有一定的抗衰老活性,在护肤品及医疗器械领域有重要的应用前景。
附图说明
图1为透明质酸寡糖组合物的液相图;
图2为透明质酸二糖(HA2)、透明质酸四糖(HA4)、透明质酸六糖(HA6)、透明质酸八糖(HA8)的离子强度图;
图3为人原代真皮成纤维细胞活性测试结果;
图4为人原代真皮成纤维细胞胶原合成基因COL1A1、COL3A1、COL4A1和COL4A2的RNA-seq结果;
图5为使用透明质酸寡糖组合物样品后成纤维细胞分泌胶原蛋白的含量;
图6为使用透明质酸寡糖组合物样品后细胞的III型胶原免疫荧光染色图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请,应当理解,实施例仅用于进一步说明和阐释本申请,并非用于限制本申请。
除非另外定义,本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料,本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下,以本说明书包括其中定义为准,另外,材料、方法和例子仅供说明,而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明,但不用来限制本申请的范围。
人类的皮肤随年龄增长自然老化(内源性老化)或随着环境刺激而衰老(外源性老化),表现为皮肤胶原蛋白流失出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等。如果皮肤得不到良好的保养,严重影响美容。
为了解决皮肤衰老的问题,本申请提供一种透明质酸寡糖组合物,其特征在于,所述透明质酸寡糖组合物包括式(I)所示结构的透明质酸寡糖,所述透明质酸寡糖还原端为N-乙酰基葡萄糖:
其中,X选自H、K、Na、Ca或Zn;
n为选自1-4整数;
在所述透明质酸寡糖组合物中至少含有两种透明质酸寡糖。
n=2的透明质酸寡糖的质量占比为55-80%,n=1的透明质酸寡糖的质量占比为1-10%,n=3的透明质酸寡糖的质量占比为5-35%,n=4的透明质酸寡糖的质量占比为1-10%。
透明质酸寡糖或透明质酸寡聚糖(oligosaccharides of HA,简称oligo-HA)为分子量在104Da以下,单糖残基数量为2~25(一般为4~16)的透明质酸分子片段。Oligo-HA属于小分子多糖,其性质与普通透明质酸有很大不同。研究表明,oligo-HA具有抗氧化、免疫调节、抗炎症和促进伤口愈合、促血管生成和抗肿瘤等生物活性。尤为重要的是,因其分子较小,可渗入到皮肤角质层发挥深层保湿和滋润的功效,可广泛应用到化妆品中。
当n=1时,透明质酸寡糖为二糖,当n=2时,透明质酸寡糖为四糖,当n=3时,透明质酸寡糖为六糖,当n=4时,透明质酸寡糖为八糖。所以,在本申请的透明质酸寡糖组合物中,四糖的质量占比为55-80%;二糖的质量占比为1-10%;六糖的质量占比为5-35%;八糖的质量占比为1-10%。
其中,透明质酸四糖的质量占比为55-80%,例如可以为55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%或其之间的任意范围。
其中,透明质酸二糖的质量占比为1-10%,例如,可以为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、10.0%或其之间的任意范围。
其中,透明质酸六糖的质量占比为5-35%,例如,可以为5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、10.0%、11.0%、12.0%、13.0%、14.0%、15.0%、16.0%、17.0%、18.0%、19.0%、20.0%、21.0%、22.0%、23.0%、24.0%、25.0%、26.0%、27.0%、28.0%、29.0%、30.0%、31.0%、32.0%、33.0%、34.0%、35.0%或其之间的任意范围。
其中,透明质酸八糖的质量占比为1-10%,例如,可以为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、10.0%或其之间的任意范围。
在本申请的一些实施方式中,在所述透明质酸寡糖组合物中,n=2的透明质酸寡糖的质量占比为60-75%,n=1的透明质酸寡糖的质量占比为1-10%,n=3的透明质酸寡糖的质量占比为15-30%,n=4的透明质酸寡糖的质量占比为1-8%。
在本申请的一些实施方式中,所述透明质酸寡糖组合物的重均分子量小于等于1kDa,例如可以为1kDa、990Da、980Da、970Da、960Da、950Da、940Da、930Da、920Da、910Da、900Da、890Da、880Da、870Da、860Da、850Da、840Da、830Da、820Da、810Da、800Da、790Da、780Da、770Da、760Da、750Da、740Da、730Da、720Da、710Da、700Da。
在本申请的一些实施方式中,所述透明质酸寡糖组合物用于化妆品或药械产品,优选在所述化妆品或药械产品中的质量浓度为0.01%-5%,进一步优选为0.05%-1%;例如,透明质酸寡糖组合物在所述化妆品或保健品中的质量浓度可以为0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%或其之间的任意范围。可以根据所述透明质酸寡糖组合物在化妆品或药械产品中的不同用途进一步调整其在化妆品或药械产品中的质量浓度。
本申请还提供了一种上述透明质酸寡糖组合物的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:将透明质酸用透明质酸酶进行酶解反应,分离酶解反应物以得到产物原液,对所述产物原液进行浓缩以得到产物浓缩液;去除所述产物浓缩液中的杂质,过滤,得到透明质酸寡糖组合物,其中,所述透明质酸酶为内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,
优选,所述透明质酸酶为利用毕赤酵母工程菌表达的山大齿猛蚁透明质酸水解酶,
进一步优选,所述分离为超滤;
进一步优选,所述浓缩为纳滤;
进一步优选,使用活性炭吸附来去除杂质。
制备方法中所使用的透明质酸酶为内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,保证透明质酸寡糖还原端为N-乙酰基葡萄糖。
在一个具体的实施方式中,所述透明质酸酶为利用毕赤酵母工程菌表达的山大齿猛蚁透明质酸水解酶,具体参见专利文献CN 103695448 A中描述的方法。
其中超滤是一种膜分离技术,能够将溶液净化,分离或者浓缩。一般来说,超滤膜的孔径在0.05μm-1nm之间,操作压力为0.1-0.5Mpa。主要用于截留去除水中的悬浮物、胶体、微粒、细菌和病毒等大分子物质。超滤膜根据膜材料,可分为有机膜和无机膜。按膜的外型,又可分为:平板式、管式、毛细管式、中空纤维和多孔式。
纳滤是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程,纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右。纳滤用于将相对分子质量较小的物质,如无机盐或葡萄糖、蔗糖等小分子有机物从溶剂中分离出来。纳滤又称为低压反渗透,是膜分离技术的一种新兴领域,其分离性能介于反渗透和超滤之间,允许一些无机盐和某些溶剂透过膜,从而达到分离的效果。
通过控制酶解反应的条件,如底物和酶的用量、底物的分子量、反应温度和反应时间等,以及超滤、纳滤和过滤所采用的不同型号的膜,可以获得不同分子量,不同寡聚糖占比的透明质酸寡糖组合物。
在所述酶解反应中,所述透明质酸的初始浓度为40-100g/L,优选,所述透明质酸的分子量为1000-3000kDa,进一步优选所述透明质酸酶的初始酶活为1.8×105-2.5×105U/mL;
例如,在所述酶解反应中,所述透明质酸的初始浓度可以为40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L、50g/L、51g/L、52g/L、53g/L、54g/L、55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L、65g/L、66g/L、67g/L、68g/L、69g/L、70g/L、71g/L、72g/L、73g/L、74g/L、75g/L、76g/L、77g/L、78g/L、79g/L、80g/L、81g/L、82g/L、83g/L、84g/L、85g/L、86g/L、87g/L、88g/L、89g/L、90g/L、91g/L、92g/L、93g/L、94g/L、95g/L、96g/L、97g/L、98g/L、99g/L、100g/L或其之间的任意范围;
在所述酶解反应中,所述透明质酸的分子量可以为1000kDa、1100kDa、1200kDa、1300kDa、00kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa、2100kDa、2200kDa、2300kDa、2400kDa、2500kDa、2600kDa、2700kDa、2800kDa、2900kDa、3000kDa或其之间的任意范围;
在所述酶解反应中,所述透明质酸酶的初始酶活可以为1.8×105U/mL、1.9×105U/mL、2.0×105U/mL、2.1×105U/mL、2.2×105U/mL、2.3×105U/mL、2.4×105U/mL、2.5×105U/mL或其之间的任意范围。
在本申请中,透明质酸酶活力单位(U)定义为:在pH5.5和38℃下,每小时从透明质酸糖链中释放1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量。
在本申请的一些实施方式中,超滤采用截留分子量为2000-4000Da的超滤膜,纳滤采用截留分子量为200-500Da的纳滤膜,过滤采用孔径为0.1-0.45μm的微孔滤膜;
例如,超滤膜的截留分子量可以为2000Da、2100Da、2200Da、2300Da、2400Da、2500Da、2600Da、2700Da、2800Da、2900Da、3000Da、3100Da、3200Da、3300Da、3400Da、3500Da、3600Da、3700Da、3800Da、3900Da、4000Da或其之间的任意范围;
纳滤膜的截留分子量可以为200Da、210Da、220Da、230Da、240Da、250Da、260Da、270Da、280Da、290Da、300Da、310Da、320Da、330Da、340Da、350Da、360Da、370Da、380Da、390Da、400Da或其之间的任意范围;
微孔滤膜的孔径可以为0.1μm、0.15μm、0.22μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm或其之间的任意范围。
在本申请的一些实施方式中,在酶解反应中,酶解反应的温度为30-50℃,优选为37-45℃,酶解反应的时间为12-48h;
例如,酶解反应的温度可以为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃或其之间的任意范围;
酶解反应的时间可以为12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h或其之间的任意范围。本申请所述的截留分子量是使用分子量大小表示的超滤膜的截留性能,又称作切割分子量。由于直接测定超滤膜或纳滤膜的孔径相当困难,所以使用已知分子量的球状物质进行测定。如膜对被截留物质的截留率大于90%时,就用被截留物质的分子量表示膜的截留性能,称为膜的截留分子量。例如截留分子量为10kDa的膜可以截留分子量大于10kDa的物质,而允许分子量小于10kDa的物质通过。
所述方法中的干燥可以采用现有技术中的各种方式的干燥。在一个具体的实施方式中,所采用的干燥为喷雾干燥。喷雾干燥中所采用的进风温度为120℃-160℃,出风温度为60℃-80℃;
例如,喷雾干燥中所采用的进风温度为120℃、121℃、122℃、123℃、124℃、125℃、126℃、127℃、128℃、129℃、130℃、131℃、132℃、133℃、134℃、135℃、136℃、137℃、138℃、139℃、140℃、141℃、142℃、143℃、144℃、145℃、146℃、147℃、148℃、149℃、150℃、151℃、152℃、153℃、154℃、155℃、156℃、157℃、158℃、159℃、160℃或其之间的任意范围;
出风温度可以为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或其之间的任意范围。进一步地,所述方法得到的透明质酸寡糖组合物为上述的透明质酸寡糖组合物,即式(I)所示结构的透明质酸寡糖:
其中,n为选自1-4的整数,X选自H、K、Na、Ca或Zn,优选为Na。
其中,透明质酸寡糖产物中各种寡糖的鉴定可以采用质谱进行检测,各种寡糖的含量可以采用高效液相色谱进行检测,透明质酸寡糖产物的重均分子量可以通过各种寡糖的峰响应值及理论分子量计算得到。
皮肤衰老的原因主要由以下几点体现:1.真皮层细胞外基质的改变。胶原是真皮细胞外基质的主要成分,在人体真皮中约占蛋白质的90%。真皮中的蛋白主要由Ⅰ型胶原(80%)和少量的Ⅲ型胶原(10%)组成,胶原使皮肤有强度和弹性。随着年龄的增长,皮肤中胶原纤维减少,使皮肤失去弹性,产生皱纹。2.基底膜带结构的改变。IV型胶原是基底膜带致密层的主要成分,使真皮与表皮紧密连接。随着年龄的增长,IV型胶原流失,基底膜带结构松弛,由褶皱状变平,细胞连接稀松,使得真皮-表皮间的物质交换效率降低。从而导致表皮营养不足,表皮细胞不能正常地增殖与分化。进而使得表皮变薄,产生松弛等现象。
针对上述皮肤衰老的主要原因,本申请提供了上述所述透明质酸寡糖组合物在促进III型、IV型胶原蛋白生成中的用途。
在本申请的一些实施方式中,上述透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老中的用途;优选地,上述透明质酸寡糖组合物通过促进III型、IV型胶原蛋白生成抗皮肤衰老。
关于透明质酸寡糖组合物,参见上文关于透明质酸寡糖组合物的描述,在此不再赘述。
在本申请的一些实施方式中,所述透明质酸寡糖组合物施用于皮肤,优选地,施用于皮肤的方式为通过化妆品或医疗器械。
在本申请的一些实施方式中,所述透明质酸寡糖组合物在所述化妆品或医疗器械中的质量浓度为0.01%-5%,优选为0.05%-1%;例如,可以为0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%或其之间的任意范围。
在本申请的一些实施方式中,上述透明质酸寡糖组合物具有促进III型、IV型胶原蛋白生成中的用途。
关于透明质酸寡糖组合物,参见上文关于透明质酸寡糖组合物的描述,在此不再赘述。
实施例
实施例1透明质酸寡糖组合物的制备
于5L反应器中加入3.6×108U透明质酸酶(该酶为重组山大齿猛蚁毒液透明质酸酶,制备方法参考专利文献CN114350691A中的描述方法),体系酶活1.8×105U/mL,加入50mM乙酸钠,用乙酸调pH至5.5,反应体系为2L。加入4%高分子透明质酸(分子量为1000-1300kDa),在37℃下搅拌溶解24h,微滤收集过滤液。用3000Da有机膜超滤处理,收集透过液。用300Da有机膜纳滤截留,截留浓缩液先热处理30min以使残酶完全失活,活性炭处理,再用0.22um滤膜过滤。在进风温度150℃、出风温度为70℃、泵速为25mL/min条件下进行喷雾干燥,得到还原端为N-乙酰基葡萄糖的透明质酸寡糖组合物粉末。
将透明质酸寡糖组合物使用高效液相色谱仪分析其寡聚糖分布,具体的色谱条件为:
色谱柱:SuperdexTM 75Increase 10/300GL
检测器:紫外-可见分光检测器
流动相:5mM乙酸铵溶液
进样浓度:1.0g/L
进样量:20μL
流速:0.3mL/min
检测波长:200nm
结果如图1所示,在透明质酸寡糖组合物中,透明质酸寡聚二糖的质量占比为3.36%,透明质酸寡聚四糖的质量占比为68.95%,透明质酸寡聚六糖的质量占比为25.41%,透明质酸寡聚八糖的质量占比为2.27%。
透明质酸寡糖组合物重均分子量计算公式如下式I所示:
其中:ru1为样品溶液中透明质酸八糖的峰响应值,Mw1是透明质酸八糖的分子量;ru2为样品溶液中透明质酸六糖的峰响应值,Mw2是透明质酸六糖的分子量;ru3为样品溶液中透明质酸四糖的峰响应值,Mw3是透明质酸四糖的分子量;ru4为样品溶液中透明质酸二糖的峰响应值,Mw4是透明质酸二糖的分子量;rt为样品溶液中透明质酸八糖、六糖、四糖、二糖的峰响应值之和。
透明质酸二糖的理论分子量为397.1,透明质酸四糖的理论分子量为776.1,透明质酸六糖的理论分子量为1155.2,透明质酸八糖的理论分子量为1534.3。
按照式II计算,透明质酸寡糖组合物的重均分子量为877Da。
实施例2透明质酸寡糖组合物的制备
于5L反应器中加入5.0×108U透明质酸酶(该酶为重组山大齿猛蚁毒液透明质酸酶,制备方法参考专利文献CN114350691A中的描述方法),体系酶活2.5×105U/mL,加入50mM乙酸钠,用乙酸调pH至5.5,反应体系为2L。加入10%高分子透明质酸(分子量为1000-1300kDa),在37℃下搅拌溶解24h,微滤收集过滤液。用3000Da有机膜超滤处理,收集透过液。用300Da有机膜纳滤截留,截留浓缩液先热处理30min以使残酶完全失活,活性炭处理,再用0.22um滤膜过滤。在进风温度150℃、出风温度70℃、泵速为25mL/min条件下进行喷雾干燥,得到还原端为N-乙酰基葡萄糖的透明质酸寡糖组合物粉末。
将透明质酸寡糖组合物使用高效液相色谱仪分析其寡聚糖分布,具体的色谱条件为同实施例1。
在透明质酸寡糖组合物中,透明质酸寡聚二糖的质量占比为3.81%,透明质酸寡聚四糖的质量占比为66.05%,透明质酸寡聚六糖的质量占比为25.45%,透明质酸寡聚八糖的质量占比为4.15%。
按照式II计算,透明质酸寡糖组合物的重均分子量为885Da。
实施例3透明质酸寡糖组合物的制备
于5L反应器中加入3.6×108U透明质酸酶(该酶为重组山大齿猛蚁毒液透明质酸酶,制备方法参考专利文献CN114350691A中的描述方法),体系酶活1.8×105U/mL,加入50mM乙酸钠,用乙酸调pH至5.5,反应体系为2L。加入7.5%高分子透明质酸(分子量为1000-1300kDa),在45℃下搅拌溶解24h,微滤收集过滤液。用3000Da有机膜超滤处理,收集透过液。用300Da有机膜纳滤截留,截留浓缩液先热处理30min以使残酶完全失活,活性炭处理,再用0.22um滤膜过滤。在进风温度150℃、出风温度为70℃,泵速为25mL/min条件下进行喷雾干燥,得到还原端为N-乙酰基葡萄糖的透明质酸寡糖组合物粉末。
将透明质酸寡糖组合物使用高效液相色谱仪分析其寡聚糖分布,具体的色谱条件同实施例1。
在透明质酸寡糖组合物中,透明质酸寡聚二糖的质量占比为9.88%,透明质酸寡聚四糖的质量占比为66.6%,透明质酸寡聚六糖的质量占比为22.06%,透明质酸寡聚八糖的质量占比为1.46%。
按照式II计算,透明质酸寡糖组合物的重均分子量为833Da。
试验例
试验例1
(1)质谱检测
用岛津公司的LCMS-IT-TOF液质联用仪对实施例1得到的透明质酸寡糖组合物进行分析,采用C18色谱柱,流动相为乙腈和水,流速为0.2mL/min,乙腈浓度线性递增至12%,至10min降为0。质谱在负离子模式下进行,每10s扫描一次,m/z范围为100-1500。在相同的操作条件下进行多级质谱分析。
结果如图2所示,在质谱总离子流峰图上的1.83min出现的质谱峰在阴离子模式下[M-H]-为396.11,鉴定为透明质酸二糖(图2中a);在质谱总离子流峰图上的3.75min和4.05min出现的质谱峰在阴离子模式下[M-H]-为775.22,鉴定为透明质酸四糖(图2中b);在质谱总离子流峰图上的5.15min和5.40min出现的质谱峰在阴离子模式下[M-H]-为1154.33、[M-H]2-为576.66,鉴定为透明质酸六糖(图2中c);在质谱总离子流峰图上的6.30min出现的质谱峰在阴离子模式下[M-H]2-为766.21,鉴定为透明质酸八糖(图2中d)。
(2)透明质酸寡糖组合物的还原端鉴定
对实施例1-3得到的透明质酸寡糖组合物进行还原端鉴定。
利用Morgan-Elson反应,根据比色法确定透明质酸寡糖组合物的还原端。如果变红证明还原端为N-乙酰葡糖胺,如果不变红证明还原端为糖醛酸。
反应缓冲液:碱性硼酸盐溶液(在10mL水中溶解1.73g H3BO3和0.78gKOH,在使用前加入其体积十分之一的0.8g ml-1K2CO3)、对二甲基氨基苯甲醛溶液(将2g对二甲基氨基苯甲醛溶液溶于2.5mL浓盐酸和7.5mL冰醋酸中,使用前用用冰醋酸稀释4倍)。
取10g/L的透明质酸寡糖组合物溶液400μL,加入到110μL碱性硼酸盐溶液中,充分混匀后,煮沸4min,加入1.5mL的对二甲基氨基苯甲醛,充分混匀后在37℃下孵育20min。
使用水解透明质酸钠(分子量1000Da,华熙生物科技股份有限公司,参考专利文献CN113801904A,还原端为糖醛酸)、透明质酸四糖(HA4,购自Sigma,还原端为N-乙酰葡糖胺)溶液作为对照。
结果如表1所示,实施例1-3制备的透明质酸寡糖组合物经Moran-Elson反应变为红色,证明还原端为N-乙酰基葡萄糖。
表1
试验例2人原代真皮成纤维细胞活性测试
人原代真皮成纤维细胞在5% CO2、37℃的培养条件下,利用成纤维细胞培养基扩增培养,当细胞生长至80-90%汇合时,用胰酶将其消化并接种于96孔板。细胞在96孔板中贴附培养48h后,配制不同质量浓度的透明质酸寡糖组合物样品处理细胞(N=3),透明质酸寡糖组合物的质量浓度分别为5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%。另外,对照组(NT)不使用透明质酸寡糖组合物处理。48h后,按照说明书加入CCK-8试剂孵育1h,用酶标仪在450nm处读取OD值。通过计算样品组和对照组(NT)的平均OD值之比得到相对细胞活性数值,判断样品的细胞毒性作用。
相对细胞活性%=(样品组OD值/对照组OD值)×100%
结果如图3,透明质酸寡糖组合物在质量浓度0.01%-5%的范围内均没有细胞毒性作用。
试验例3人原代真皮成纤维细胞的转录组测序及数据分析
当体外培养的成纤维细胞生长至80-90%汇合时,用胰酶将其消化并接种于12孔板。细胞在12孔板中贴附培养48h后,对成纤维细胞使用不含血清的饥饿培养基饥饿过夜,使细胞群体生长同步化,随后用饥饿培养基配制质量浓度为0.1%的透明质酸寡糖组合物样品(N=3)处理细胞,对照组(NT)为不使用透明质酸寡糖组合物样品处理细胞。24h后,吸去上清液,向每孔加入Trizol试剂,充分吹打消化裂解细胞,裂解液转入-80℃低温保存备用。总RNA抽提质检合格后进行文库构建,采用Illumina Hiseq测序平台的双端测序模式对样本进行高通量测序。
I型胶原蛋白由2条α1(I)链(COL1A1编码)与1条α2(I)链交互缠绕所形成,III型胶原是由三条完全相同的α1(III)链组成,由COL3A1编码。IV型胶原由六条α链组装,有3种不同的异源三聚体α1α1α2(IV),α5α5α6(IV),α3α4α5(IV),皮肤组织中主要是前两种,COL4A1编码α1(IV)链,COL4A2编码α2(IV)链。结果如图4,与空白对照相比,0.1%的透明质酸寡糖组合物处理真皮成纤维细胞后,COL1A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2的表达显著上调。
试验例4人原代真皮成纤维细胞的胶原蛋白生成量测试
当体外培养的成纤维细胞生长至80-90%汇合时,用胰酶将其消化并接种于96孔板。细胞在96孔板中贴附培养48h后,对成纤维细胞使用不含血清的饥饿培养基饥饿过夜,使细胞群体生长同步化,随后用饥饿培养基配制不同质量浓度的透明质酸寡糖组合物样品(N=3)处理细胞,透明质酸寡糖组合物样品的质量浓度为0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%。同时设置含10ng/mL TNF-α的处理组为阳性对照组。不使用透明质酸寡糖组合物处理的为空白对照组(NT)。48h后,取细胞培养上清液用于I型胶原蛋白、III型胶原蛋白的ELISA测试,所测得样品组的胶原蛋白含量与空白对照组(NT)进行统计比较,评估透明质酸寡糖组合物对胶原蛋白生成量的影响。
数据统计结果如图5所示,透明质酸寡糖组合物仅在较窄的起效浓度(0.05%)下对成纤维细胞的I型胶原蛋白生成量具有显著促进作用(p<0.05),如图5a,而透明质酸寡糖组合物在较宽的起效浓度(0.02%-0.5%)内对成纤维细胞III型胶原蛋白生成量均具有显著促进作用(p<0.05),与空白对照组(NT)相比提高了20%以上,如图5b。专利文献CN113876623A公开了一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老中的用途,其中所述透明质酸寡糖组合物包括还原端为糖醛酸结构的透明质酸寡糖,对I型胶原蛋白具有显著的促进作用。说明透明质酸寡糖的结构不同,功效也存在差异。
试验例5III胶原蛋白免疫荧光染色
当体外培养的成纤维细胞生长至80-90%汇合时,用胰酶将其消化;在12孔板中放置好TC处理细胞爬片,随后将成纤维细胞悬液接种到细胞爬片上。细胞在爬片上贴附培养48h后,使用不含血清的饥饿培养基饥饿过夜,使细胞群体生长同步化,随后用饥饿培养基配制质量浓度为0.1%的透明质酸寡糖样品(N=3)处理细胞,同时设置含10ng/mL TNF-α的处理组为阳性对照组。处理48h后,吸去细胞培养上清,用DPBS润洗细胞爬片2次,随后用多聚甲醛固定液固定爬片至少30min。对细胞爬片进行免疫荧光染色,采用0.5%Triton X-100通透细胞10min,用5%BSA封闭1h;加Anti-Collagen III一抗孵育90min,随后加GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)二抗孵育60min,DAPI复染细胞核30min;封片,避光4封保存。采用正置荧光显微镜拍摄显微细胞荧光图像。
如图6蓝色荧光为细胞核、红色荧光为胶原蛋白。结果显示,质量浓度为0.1%的透明质酸寡糖组合物对成纤维细胞III型胶原蛋白的生成具有显著促进作用。
Claims (7)
2.根据权利要求1所述的透明质酸寡糖组合物,其特征在于,在所述透明质酸寡糖组合物中,n=2的透明质酸寡糖的质量占比为55-80%,n=1的透明质酸寡糖的质量占比为1-10%,n=3的透明质酸寡糖的质量占比为5-35%,n=4的透明质酸寡糖的质量占比为1-10%。
3.根据权利要求1所述的透明质酸寡糖组合物,其特征在于,在所述透明质酸寡糖组合物中,n=2的透明质酸寡糖的质量占比为60-75%,n=1的透明质酸寡糖的质量占比为1-10%,n=3的透明质酸寡糖的质量占比为15-30%,n=4的透明质酸寡糖的质量占比为1-8%。
4.根据权利要求1所述的透明质酸寡糖组合物,其特征在于,所述透明质酸寡糖组合物在化妆品或药械产品中的质量浓度为0.01%-5%,进一步优选为0.05%-1%。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述的透明质酸寡糖组合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
将透明质酸用透明质酸酶进行酶解反应,
分离酶解反应物以得到透明质酸寡糖组合物,
其中,所述透明质酸酶为内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,
优选,所述透明质酸酶为利用毕赤酵母工程菌表达的山大齿猛蚁透明质酸水解酶。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,
在所述酶解反应中,所述透明质酸的初始浓度为40-100g/L,
优选所述透明质酸酶的初始酶活为1.8×105-2.5×105U/mL,
进一步优选所述酶解反应温度为30-50℃,更优选为37-45℃。
7.一种如权利要求1-4中任一项所述的透明质酸寡糖组合物在促进III型和/或IV型胶原蛋白生成中的用途。
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PB01 | Publication | ||
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