AT504347A4

AT504347A4 - Verfahren zur herstellung von glucosederivaten

Info

Publication number: AT504347A4
Application number: AT0157706A
Authority: AT
Inventors: Christiane Dipl Ing Goedl; Thornthan Sawangwan; Bernd Dr Nidetzky; Mario Mag Mueller
Original assignee: Univ Graz Tech; Forschungsholding Tu Graz Gmbh
Priority date: 2006-09-21
Filing date: 2006-09-21
Publication date: 2008-05-15
Also published as: ATE462012T1; WO2008034158A3; US20090318372A1; JP2010504082A; AT504347B1; EP2069519B1; EP2069519A2; ES2340888T3; DE602007005496D1; WO2008034158A2; US10683525B2; US20180265907A1; AT504347B8; WO2008034158A8

Description

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Oie vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von a-D-Glucosylglycerin (2-0-Glyceryl-a-D-glucopyranosid).

Einfache und komplexe Kohlehydrate bestimmen einen facettenreichen Bereich von Zellfunktionen, einschließlich der Energiespeicherung, Zellwand-Struktur, Zell-Zell-Interaktion und Signalgebung („signalling"), Wirt-Pathogen-Interaktionen und Proteinglykosylierung. Sie haben auch eine Funktion als Osmoly-ten und kleine Moleküle mit extremer Lebensweise. Glycosyltrans-ferasen (GTs) sind die Enzyme, die für die Synthese von Glycosiden in der Natur verantwortlich sind, wogegen sich Glyco-sylhydrolasen (GHs) entwickelten, um diese abzubauen. Unter den GT- und GH-Klassen sind die Glycosid-phosphorylasen (GPs) in mehrerlei Hinsicht etwas Besonderes. Die GPs katalysieren die Phosphorolyse von a- und ß-D-Glycosiden, hauptsächlich Glucosi-den (Glc-OR) einschließlich Disacchariden und Oligo- oder Polysacchariden von unterschiedlichem Polymerisationsgrad. Der Glucosyl-Transfer zu Phosphat (Pi) ist in vivo thermodynamisch begünstigt, weil Phosphat üblicherweise in einem großen Überschuss gegenüber α-D-Glucose-l-phosphat (Glc 1-P) vorliegt. Die thermodynamischen Gleichgewichts-Konstanten (Keq)von mittels GP katalysierten Reaktionen liegen zwischen den Keq-Werten für die Umsetzung von GTs (Keq << 1) und GHs (Keq » 1) . Die relativ günstigen Keq-Werte und die Tatsache, dass phospho-aktivierte Zucker billiger sind als Nukleotid-aktivierte, die von den meisten GTs benötigt werden, machen die GPs zu interessanten Biokatalysatoren für die stereo- und regio-spezifische Synthese von Glucosi-den.

In jüngster Zeit wurde neuen α-D-Glucosiden, insbesondere a-D-Glucosylglycerin (2-0-Glyceryl-a-D-glucopyranosid; aGG), für welche mehrere Anwendungen derzeit entwickelt werden, vermehrte Aufmerksamkeit geschenkt. aGG fungiert als kompatible gelöste Substanz in Mikroorganismen und sieht einen gewissen Schutz gegen Stress, der von hohen Salzkonzentrationen, Hitze und UV-Strahlung herrührt, vor. Behauptungen zufolge ist aGG wegen seiner im Vergleich zu Saccharose geringen Kariogenität und seinem geringen Kalorienwert als alternatives Süßungsmittel in Nahrungsmitteln nützlich. Weiters werden aGG und Derivate desselben als therapeutische Mittel bei durch Proteinfehlfaltung verursachten Krankheiten und in der Krebstherapie untersucht. Bei Kosmetika kann aGG als Anti-Aging-Mittel und als feuchtigkeits-

NACHGEREICHT

regulierende Verbindung verwendet werden. aGG kann mit chemischen sowie enzymatischen Verfahren hergestellt werden. Die chemischen Verfahren können verschiedene Ausgangsverbindungen mit einschließen , wie Maltitol, Isomaltose, Trehalulose usw. (vgl. z.B. Takenaka F. et al., Biosci. Biotech-nol. Biochem. (2000) 64:378-385). Bei Enzymen, die die Synthese von aGG katalysieren, können α-Glucosidase (Takenaka F. und Uchiyama H., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64:1821-1826), Cyclodextrin-glucanotransferase (Nakano H. et al., J. Biosci. Bioeng. (2003) 95:583-588), Glucosyl-Glycerinphosphat-synthase (Marin K. et al., J. Bacteriol. (1998) 180:4843-4849) und Pflan- zen-Glucosidase II (Kaushal GP et al., Ärch. Biochem. Biophys. (1989) 272:481-487) eine Rolle spielen. Alle aktuellen Vorgangsweisen zur Synthese von aGG haben einen oder mehrere der folgenden wesentlichen Nachteile: zahlreiche Reaktionsschritte (einschließlich Aktivieren, Schützen und Entschützen); arbeitsintensive Synthese und Aufarbeitung; geringe Ausbeute und Produktivität; geringe Atom-Ökonomie („low atom economy"); lange Reaktionszeiten. Folglich wurde kein Industrieverfahren zur Herstellung von aGG entwickelt und das Produkt ist am Markt nicht erhältlich.

Die chemische Synthese von stereochemisch reinem natürlichem aGG ist wegen der extrem arbeitsaufwändigen Verfahren und der geringen Ausbeute technisch nicht durchführbar. Die mikrobielle Synthese von aGG wurde gezeigt, doch ist die Produktivität eine geringe. Die enzymatische Synthese von aGG unter Verwendung der Transglucosylierung durch α-Glucosidasen ist eine Möglichkeit, die beschrieben wurde, jedoch ist der Hauptnachteil des Verfahrens die falsche Regioselektivität der bekannten Enzyme, welche eher die primäre als die sekundäre Hydroxy-Gruppe von Glycerin bevorzugen. Die mittels α-Glucosidasen synthetisierte Produktmischung enthält nur 30% des richtigen natürlichen aGG, was einen beträchtlichen Arbeitsaufwand bei der Produkt-Isolierung erfordert.

Die mikrobielle Synthese von aGG ist derzeit kein ausgereiftes Verfahren, insbesondere wenn man die Ausbeute von aGG in Betracht zieht, weil sie keine Herstellung von aGG als chemische Bulkware ermöglicht. Die erreichbaren Produkt-Konzentrationen sind sehr gering (z.B. 29 mg/1; Roder et al., FEMS Microbiol. Lett. (2005) 243: 219-226) und auch die Produktivität (> 3 Tage I nachgereicht • · • ·

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Produktion) ist für die industrielle Fertigung nicht vorteilhaft .

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von stereochemisch reinem aGG in hoher Ausbeute vorzusehen, wobei die Nachteile der auf dem Gebiet bekannten Methoden überwunden werden. Weiters sollte das Verfahren vorzugsweise die Verwendung von wirtschaftlichen Substraten ermöglichen.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 2-O-Glyceryl-a-D-glucopyranosid (aGG; Fig. 1) aus einem Glucosyl-Donor und einem Glucosyl-Akzeptor, welches die Schritte umfasst: - Vorsehen einer Saccharose-Phosphorylase (Sucrosephospho-rylase, EC 2.4.1.7), - Inkubieren der Saccharose-Phosphorylase mit einer Mischung, welche einen Glucosyl-Donor und Glycerin als Glucosyl-Akzeptor aufweist, und - Isolieren und/oder Reinigen von 2-0-Glyceryl-a-D-glucopy-ranosid.

Saccharose-Phosphorylase (SPase; EC 2.4.1.7) katalysiert die Umwandlung von Saccharose und Phosphat zu D-Fructose und Glc 1-P. SPase wurde aus einer Reihe bakterieller Quellen isoliert. Gene, die für SPase codieren, wurden aus verschiedenen Bakterien kloniert und heterolog exprimiert (Kawasaki H. et al., Biosci. Biotech. Biochem. (1996) 60:322-324; Kitao S. und Nakano E., J. Ferment. Bioeng. (1992) 73:179-184; van den Broek LAM et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004) 65:219-227). Gemäß der systematischen Klassifizierung von Glycosylhydrolasen (GH) und Gly-cosyltransferasen (GT) auf Sequenz-Basis (Coutinho PM et al., J. Mol. Biol. (2003) 328:307-317; Henrissat B., Biochem. J. (1999) 280:309-316) gehört SPase zur Familie GH13 (Clan GH-H), die häufig als die α-Amylase-Familie bezeichnet wird. Die dreidimensionale Struktur von SPase aus Bifidobacterium adolescentis wurde kürzlich gelöst, was eine (ß/a)8 Barrel-Faltung und eine katalytische Stelle enthüllte, in welcher zwei Carboxylat-Gruppen vermutlich die Rolle eines Nukleophils (Aspl92) und einer allgemeinen Säure/Base (Glu232) erfüllen.

Die Reaktion von SPase verläuft mit einer Netto-Retention der anomeren Konfiguration und erfolgt durch einen doppelten Verdrängungsmechanismus, der zwei Konfigurations-Umkehrschritte

Inachgereicht • ·· ·

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beinhaltet: Spaltung der Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung des Glu-cosyl-Donors und Bildung eines kovalenten ß-Glucosyl-Enzym(ß-Glc-E)-Zwischenprodukts; und Umsetzung des Zwischenprodukts mit Phosphat zum Erhalt von Glc 1-P. In einer Nebenreaktion kann das ß-Glc-E-Zwischenprodukt mit Wasser aufgefangen werden, was zur Hydrolyse führt. Die hydrolytische Umwandlung von Saccharose ist irreversibel, verläuft jedoch um beinahe zwei Größenordnungen langsamer als die phosphorolytische Umsetzung. SPase katalysiert auch Transglucosylierungsreaktionen, welche im Wettbewert mit der Hydrolyse auftreten und wodurch das ß-Glc-E-Zwischenprodukt durch externe Nukleophile angegriffen wird und neue a-D-Glucosi-de erzeugt werden.

Biochemische Untersuchungen zeigten, dass SPase strikt spezifisch für den Transfer eines Glucosyl-Anteils ist und keine strukturellen Modifikationen am Glucopyranosyl-Ring, einschließlich Epimerisierung und Desoxydierung, toleriert. Die Liste der bekannten Glucosyl-Donoren für SPase ist daher kurz: Saccharose, Glc 1-P und α-D-Glucose-l-fluorid. Dagegen ist die Spezifität von SPase für Glucosyl-Akzeptoren vergleichsweise weniger strikt.

Die Selektivität von SPase, die nur natürliches aGG in hoher quantitativer Ausbeute (> 95%) bildet, ist ein wesentlicher Punkt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung. Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung können sehr preiswerte Substrate verwendet werden (die beide aus großtechnischen Industrieverfahren erhältlich sind) ohne jegliche chemische De-rivatisierung (bei der chemischen Synthese erforderlich), und es ist durch eine extrem hohe Atom-Effizienz gekennzeichnet, weil das gesamte umgewandelte Substrat quantitativ in das Produkt übergeht. Während der mikrobiellen Fermentation wird beispielsweise der Großteil des Substrats für das Wachstum und die Aufrechterhaltung der Energie verwendet, und nur ein geringer Teil davon wird für die aGG-Erzeugung verwendet. Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung ist nur ein Enzym notwendig, und dieses kann natürlichen oder rekombinanten Ursprungs sein, frei oder immobilisiert, als isoliertes Enzym oder in einer anderen Katalysator-Form (permeabilisierte oder ruhende Zellen) verwendet werden.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in vitro mit gereinigtem Enzym oder mit einem Enzym-Extrakt

NACHGEREICHT 5 durchgeführt, wobei die verwendete SPase aus mindestens einer Quelle stammen kann, was heißt, dass auch SPasen von mehr als einer Art (Ursprung) verwendet werden können.

Die Synthese von aGG wird vorzugsweise unter Verwendung einer Protein-Konzentration von Saccharose-Phosphorylase durchgeführt, die eine Aktivität von zwischen 1.000 und 1,000.000 Einheiten/Liter ergibt (eine Einheit ist als die Enzym-Aktivität definiert, die 1 pmol Substrat pro Minute unter in der Literatur berichteten Standard-Reaktionsbedingungen, typischerweise 30°C, umwandelt). „Saccharose-Phosphorylase", wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf Enzyme der Klasse EC 2.4.1.7, sondern auch auf Moleküle, die dieselben Eigenschaften in Bezug auf ihre Substrate und Produkte aufweisen. Zu solchen Molekülen zählen auch Fusionsproteine von Saccharose-Phosphorylase mit anderen Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen, die potentiell auch enzymatische oder Bindungs-Aktivitäten aufweisen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Glucosyl-Donor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Saccharose und Analoga von Saccharose, bei welchen der Fructosyl-Anteil modifiziert oder durch einen anderen Ketosyl-Rest substituiert wurde, Glc 1-P, α-D-Glucose-l-fluorid, weiters stabile, aktivierte Glucosyl-Donoren, wie a-D-Glucose-l-azid, und Mischungen davon.

Der beim Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendende Glucosyl-Donor kann jeder sein, der als Substrat für die durch die SPase katalysierte Transglycosylierungs-Reaktion dient.

Die Verwendung von Saccharose (einem aus Glucose und Fructose bestehenden Disaccharid) beim Verfahren der vorliegenden Erfindung führt nicht nur zur Bildung von aGG, sondern auch zur Bidlung von Fructose. Wenn Substrate, wie Glc 1-P oder a-D-Glu-cose-l-fluorid verwendet werden, sind Phosphat oder Fluorid Produkte, die zusätzlich zu aGG gebildet werden. Die erzielbare Ausbeute hängt vom Energie-Gehalt des Glucosyl-Donors ab und ist mehr als 30%, vorzugsweise mehr als 50%, und insbesondere mehr als 90%.

Die beim Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Saccharose-Phosphorylase ist vorzugsweise mikrobiellen, vorzugsweise bakteriellen Ursprungs.

Der Vorteil der Verwendung mikrobieller SPasen ist die ein-

NACHGEREICHT fache Produktion und Isolierung und Stabilität dieser Enzyme.

Sie können aus Mikroorganismen erhalten werden, die natürlich oder rekombinant SPase exprimieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die bakterielle Saccharose-Phosphorylase aus Agrob-acterium vitis (NCBI P33910) , Bifidobacterium adolescentis (Q84HQ2), Bifidobacterium longum (Q84BY1), Escherichia coli (P76041), Escherichia coli 06 (Q8FHS2), Lactobacillus acidophi-lus (Q7WWP8, Q7WWQ5), Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (Q71I99), Leuconostoc mesenteroides (Q59495, Q9R5Q3), Listeria monocytogenes (Q4ENE7, Q4EQR2, Q4ETN7, Q4EHA0, Q4EJW2, Q4ELY7), Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas saccharophila (AAD40317), Rhodopirellula baltica (Q7UIS9), Shewanella baltica (Q3Q4P1), Shewanella frigidimarina (Q3NMD1), Solibacter usitatus (Q43TL5), Streptococcus mutans (P10249) und/oder Synechococcus sp. (068858, Q7U3J7) erhalten.

Es ist besonders bevorzugt, mindestens eine SPase zu verwenden, die von Leuconostoc mesenteroides stammt.

Die SPase -wird vorzugsweise rekombinant erzeugt als Gesamt-längen-Protein („full length protein") oder als katalytisch aktives Fragment davon oder als Fusionsprotein. Es ist natürlich auch möglich, SPase direkt aus dem Organismus, der natürlicherweise diese SPase erzeugt, zu verwenden. Verfahren zur rekombi-nanten Produktion von SPase sind dem Fachmann bekannt (z.B. Sambrook J. et al., Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6).

Wie hierin verwendet, bezieht sich „Gesamtlängen-Protein" auf SPase, die von einem Gen codiert ist, welches von einem Organismus, wie z.B. oben angeführt, stammt. Dieses natürlich vorkommende Gen, insbesondere die für SPase codierende Region dieses Gens, wird direkt für die rekombinante Herstellung von SPase verwendet. „Ein katalytisch aktives Fragment" von SPase bezieht sich auf Protein-Fragmente von SPase, die dieselbe oder im Wesentlichen dieselbe Aktivität und Substrat-Spezifität wie native SPase haben. Die Länge der Fragmente ist nicht ausschlaggebend, mit der Maßgabe, dass die Fragmente dieselbe oder eine ähnliche Substrat-Spezifität aufweisen und die Bildung derselben Produkte katalysieren wie native SPase.

Wie hierin verwendet, bezieht sich „ein Fusionsprotein" auf NACHGEREICI ίϊ ! φ φφ φ · φ φ φ φ φ φφ φφφ

7 φ φ φ SPase oder katalytisch aktive Fragmente davon, die rekombinant an mindestens ein weiteres Protein, Polypeptid oder Peptid fusioniert sind. Dieses mindestens eine weitere Protein, Polypeptid oder Peptid kann von jeder beliebigen Art sein (z.B. ein Enzym).

Es sei bemerkt, dass im Rahmen der Erfindung auch Varianten (d.h. Mutationen einschließlich Deletionen, Substitutionen und Insertionen) von SPase zusammengefasst sind, mit der Maßgabe, dass diese Varianten dieselbe oder im Wesentlichen dieselbe (z.B. erhöhte katalytische Aktivität) Aktivität wie native SPase aufweisen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die SPase im Inkubations-Schritt entweder als zellfreies Enzym, das teilweise gereinigt sein kann, aber nicht muss, als ein zwecks verbesserter Permeabilität der Zellmembran (Permeabilisierung) und mechanischer Stabilität physikalisch oder chemisch vorbehandeltes Ganz-zellen-System, ein eingekapselter Katalysator, in welchem das freie Enzym oder das Ganzzellen-System, vorzugsweise in Gel-artigen Strukturen, eingeschlossen ist, oder auf einem Träger immobilisiert verwendet werden. Eine neue umfassende Zusammenfassung von Methoden der Enzym-Immobilisierung, einschließlich der Permeabilisierung der Zellen, stammt von Cao L., Carrier-bound Immobilized Enzymes (2005), Wiley-VCH, Weinheim.

Vorteilhaft ist die SPase an einem Träger immobilisiert, welcher vorzugsweise ein fester Träger ist. Jedes Material, das die SPase nicht-kovalent bindet, vorzugsweise natürliche oder nicht-natürliche Polymere mit Anionenaustauscher-Eigenschaften, oder kovalent bindet, vorzugsweise ein Polymer, mehr bevorzugt ein Acryl-Polymer, insbesondere ein Copolymer von Methacrylamid, Ν,Ν'-Methylen-bis(acrylamid) und ein Oxiran-Gruppen tragendes Monomer, kann verwendet werden.

Der Träger ist vorzugsweise ein Chromatographie-Harz, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anionenaus-tausch-Chromatographie-Harz, Kationenaustausch-Chromatographie-Harz, Affinitäts-Chromatographie-Harz (z.B. umfassend immobli-sierte SPase-spezifische Antikörper) und hydrophobes Interakti-on-Chromatographie-Harz.

Die SPase der vorliegenden Erfindung kann (vorübergehend oder Kovalent) an irgendeinem Träger immobilisiert sein, vorzugsweise an Partikeln (z.B. Kügelchen), insbesondere an einem I NACHGEREICHT \ «» # · • · • · • ♦ ·· «· ··· 8 - • · ···· ·· ·· ·· « * · # · · • · · ···· ·«

Chromatographie-Harz, mit der Maßgabe, dass die enzymatische Aktivität des Enzyms nicht so beeinflusst wird, dass ihre Substrat-Spezifität verändert oder ihre Aktivität auf niedrige ümwandlungsraten verringert wird.

Der Träger kann funtkionelle Gruppen umfassen, was - um die SPase an das Harz zu binden - notwendig macht, dass auch das Enzym entsprechende Bindungspartner trägt (z.B. Streptavidin -Biotin, chelatbildende Metallionen - His6-Tag).

Um die Affinität des Enzyms zu Trägern, welchen diese funktioneilen Gruppen fehlen, zu verbessern, kann die SPase rekombi-nant als Fusionsprotein hergestellt werden, welches ein Bindungspeptid hat, vorzugsweise eines, das Ionenaustausch-Eigenschaften aufweist, oder eine Bindungsdomäne, vorzugsweise eine Polysaccharidbindungsdomäne, insbesondere eine Cellulosebindungsdomäne .

Die Verwendung unlöslicher immobilisierter Enzyme (Trägergebunden, eingekapselt, Ganzzellen-Systeme) beim Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet mehrere Vorteile: 1. das immobilisierte Enzym ist am Ende der Reaktion zwecks Wiederverwendung aus der Reaktionsmischung leicht zurück zu gewinnen, wogegen das lösliche Enzym nur schwer und unter Aktivitätsverlust wiedergewonnen wird; 2. das immobilisierte Enzym ist stabiler als das lösliche Enzym, sowohl für die Anzahl der gegenüber dem löslichen Enzym erhaltenen Enzym-Umsätze als auch für die wiedergewonnene Enzym-Aktivität am Ende einer Umsetzung oder nach längerer Lagerung in einem wässerigen Puffer.

Kein spezifisches Immobilisierungsverfahren kann für ein bestimmtes Enzym mit der Erwartung gewählt werden, dass die Immobilisierung erfolgreich sein wird. Weiters ist die Erwartung einer erfolgreichen Co-Immobilisierung von mehr als einem Enzym noch weniger voraussagbar. Die Fachwelt ist sich im Allgemeinen darüber einig, dass eine erfolgreiche Immobilisierung irgendeines Enzyms durch Screenen einer Vielfalt von Verfahren entdeckt und ein optimales Ergebnis durch Ausprobieren („trial and error") erhalten werden muss. Die Immobilisierung von SPase an einem Träger stabilisiert die Enzym-Aktivität. Die Literatur zeigt, dass das Einfangen des Enzyms auch die Stabilität verbessert (Soetaert W. et al., Progress in Biotechnology, Bd. 10 (Pe-tersen S.B., Svensson, B., Pederesen, S., Hrsg.), Elsevier,

NACHGEREICHT

Amsterdam). Die Immobilisierung von Enzymen kann unter Verwendung verschiedener Techniken erfolgen, einschließlich: (1) Binden des Enzyms an einen Träger oder eine Unterlage über kovalente Befestigung, physikalische Adsorption, elektrostatische Bindung oder Affinitätsbindung, (2) Vernetzen mit bifunk-tionalen oder multifunktionalen Reagentien, (3) Einfangen in gel-Matrizen, Polymeren, Emulsionen oder irgendeiner Form von Membran, und (4) eine Kombination irgendwelcher dieser Methoden. Detaillierte Beschreibungen vieler dieser Methoden der Enzymimmobilisierung und die verschiedenen Faktoren, die die Wahl einer Immobilisierungsmethode beeinflussen, sind in den folgenden Bänden der Methods in Enzymology, K. Mosbach (Hrsg.), Academic Press, New York, gesammelt: Bd. 44 (1976), Bd. 135 (1987), Bd. 136 (1987), Bd. 137 (1988) und in den darin enthaltenen Literaturstellen.

Die Immobilisierung von SPase an Oxiran-Acryl-Kügelchen Eu-pergit C und Eupergit C-250L (Rohm Pharma) ergab einen Katalysator (Enzym + Träger), der gegen die Reaktionsbedingungen besonders stabil war und eine genügend hohe spezifische Aktivität (Einheiten von Enzymaktivität/Gramm Katalysator) aufwies. Um jedoch beim Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich zu sein, können sowohl freie als auch immobilisierte Präparate von SPase verwendet werden.

Viele der Mängel der löslichen Enzyme können jedoch durch Verwendung des immobilisierten Enzym-Katalysators eliminiert werden. Die Stabilität von immobilisierter SPase in wässerigen Puffern ist viel größer als die des löslichen Enzyms. Die Wiedergewinnung und Wiederverwendung des immobilisierten Katalysators war einfach zu bewerkstelligen durch einfaches Abfiltern des Katalysators aus der Reaktionsmischung und Rezyklieren desselben zur frischen Reaktionsmischung; auf diese Weise kann für immobilisierte SPase eine hohe Umsatzrate (d.h. die Anzahl von Substratmolekülen, die in Produkt-Moleküle pro Katalysatormolekül umgewandelt werden, vor einer Inaktivierung des Enzyms) erreicht werden.

Die bei der Umsetzung verwendete immobilisierte SPase sollte in einer wirksamen Konzentration vorliegen, üblicherweise in einer Konzentration von etwa 0,001 bis etwa 100,0 IE/ml, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 50 IE/ml. Eine IE (Internationale Einheit) ist als jene Menge an Enzym definiert, die die Trans-

NACHGEREICHT formation von einem Mikromol Substrat pro Minute katalysiert.

Nach Beendigung der Umsetzung kann die an einen Träger gebundene SPase durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt werden. Wenn die immobilisierte SPase in eine Säule (z.B. eine chromatographische Säule) gepackt ist, kann die Herstellung von aGG in kontinuierlicher Weise erreicht werden, ohne die Notwendigkeit, die immobilisierte SPase aus der Reaktionsmischung zu entfernen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Inkubation der SPase mit den Substraten bei einem pH-Wert von 4 bis 10, vorzugsweise 5 bis 9, mehr bevorzugt von 6 bis 8, insbesondere von 7, durchgeführt.

Der pH-Wert beim Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise aus den oben angeführten Bereichen ausgewählt, was eine effiziente Umwandlung der Substrate in aGG ermöglicht.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Inkubation mindestens 15 min lang, vorzugsweise mindestens 60 min lang, mehr bevorzugt mindestens 3 Stunden lang, noch mehr bevorzugt mindestens 5 Stunden lang.

Die Inkubation der Substrate mit den immobilisierten oder nicht gebundenen SPase kann mindestens 15 Minuten lang erfolgen. Es ist jedoch besonders bevorzugt, die Inkubationszeit zwischen 1 und 48 oder zwischen 5 und 24 Stunden zu wählen. Die Inkubationszeit hängt auch von der gewählten Inkubationstemperatur ab.

Das heißt, wenn die Inkubationstemperatur unter der optimalen Temperatur des Enzyms liegt, kann die Inkubationszeit verlängert sein.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Inkubation in einem Temperaturbereich von 10 bis 50°C, vorzugsweise 15 bis 40°C, mehr bevorzugt bei einer Temperatur von 30°C durchgeführt.

Die Mischung, die gemäß der vorliegenden Erfindung mit der SPase inkubiert wird, umfasst den Glucosyl-Donor, insbesondere Saccharose, in einer Konzentration von 0,01 bis 3 mol/1, vorzugsweise 0,05 bis 2 mol/1, mehr bevorzugt 0,1 bis 1,5 mol/1.

Es zeigte sich, dass die Aktivität der SPase und ihr Substrat-Umsatz, der zu aGG führt, bei den hier geoffenbarten Glu-cosyl-Donor-Konzentrationen optimal ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Substratmischung Glycerin in einer Konzen-

NACHGEREiOHT

tration von 0,01 bis 10 mol/1, vorzugsweise von 0,05 bis 5 mol/1, mehr bevorzugt 0,1 bis 3 mol/1, noch mehr bevorzugt 0,1 bis 1,5 mol/1.

Das Verhältnis von Glycerin zu Glucosyl-Donor in der Mischung liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1:1 bis 10:1, vorzugsweise von 0,5:1 bis 5:1, mehr bevorzugt von 1:1 bis 3:1.

Das mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältliche aGG a-D-Glucosylclycerin kann mit verschiedenen chromatographischen Verfahren isoliert werden, vorzugsweise durch Elutions-Chromatographie auf Aktivkohle kombiniert mit Celite als Filterhilfe. Die mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältliche Produktmischung wird auf eine in Wasser äquilibrierte Säule des Materials geladen, und die Elution von gebundenem aGG wird mit 2% Äthanol erreicht. Fraktionen, die aGG enthalten, sind frei von restlichem Glycerin und von Produkt, das sich aus der Spaltung des Glucosyl-Donors ergibt. Das aGG wird in einer Ausbeute von mehr als 70%, vorzugsweise mehr als 80%, insbesondere mehr als 90%, erhalten. Die Reinheit des Produkts nach der Chromatographie ist mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90%, insbesondere mehr als 95%. Nach einer Konzentration unter reduziertem Druck wird festes aGG vorzugsweise durch Trocknung, vorzugsweise durch Lyophilisation, erhalten.

Aktivkohle kann vorzugsweise als Suspension verwendet werden, oder mehr bevorzugt in eine Säule (z.B. eine Chromatographie-Säule) gepackt sein. Die eventuell das Enzym oder restliches Enzym und Substrat enthaltende Reaktionsmischung wird mit der Aktivkohle in Kontakt gebracht (z.B. auf eine Aktivkohlensäule aufgetragen) und nacheinander eluiert. Dieses Eluat, oder selbst die Reaktionsmischung selbst, kann (weiter) gereinigt werden, wobei beispielsweise ein Ionenaustauscher-Harz verwendet wird.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Saccharose-Phosphorylase aus Leucono-stoc mesenteroides (Q59495, Q9R5Q3) erhalten und als freie oder vorzugsweise immobilisiertes Enzym-Präparat verwendet, vorzugsweise immobilisiert an einem Acryl-Polymer, insbesondere einem Copolymer von Methacrlyamid, N,N'-Methylen-bis(acrylamid) und einem Oxiran-Gruppen tragenden Polymer, wobei die immobilisierte Saccharose-Phosphorylase mit Saccharose als Glucosyl-Donor inkubiert wird. I-—---

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Insbesondere war eine von Leuconostoc mesenteroides stammende SPase, die an Oxiran-Gruppen tragenden Polymer-Partikeln (oder Gelen) immobilisiert war, außergewöhnlich stabil und beispielsweise für kontinuierliche Reaktionen gut geeignet.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft a-D-Glucosylglycerin (aGG) oder ein a-D-Glucosylglycerin (aGG) umfassendes Produkt, das mit einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist.

Das aGG oder das aGG umfassende Produkt, welches mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, umfasst das natürlich vorkommende aGG (2-0-Glyceryl-a-D-glucopyra-nosid) in großen Mengen, weil die SPase die Bildung dieses aGG spezifisch katalysieren kann, ohne signifikante Bildung von Nebenprodukten, die sich aus einer Transglucosylierung ergeben. Es ist daher besonders wichtig, dass keine Regioisomeren-Mischung, die zusätzlich zum gewünschten 2-0-Glyceryl-a-D-glucopyranosid auch 1-0-Glyceryl-a-D-glucopyrahosid enthält, vorhanden ist. Die Trennung dieser beiden Produkte wäre überaus schwierig. Es ist auch besonders wichtig, dass unter den Reaktionsbedingungen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung die Bildung eines Hydrolyse-Produkts effizient verhindert wird, so dass mehr als 90%, vorzugsweise mehr als 95%, mehr bevorzugt mehr als 98% des Glu-cosyl-Anteils des umgewandelten Donors in das gewünschte Produkt transferiert werden.

Wenn beispielsweise Saccharose als Glucosyl-Donor verwendet wird, wird ein Produkt, das natürliches aGG und Fruktose umfasst, erhalten. Wenn Glc-1-P als Glucosyl-Donor verwendet wird, wird ein Produkt, das natürliches aGG und Phosphat umfasst, erhalten.

Daher kann ein mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältliches Produkt weiters Fructose umfassen, vorzugsweise in einer äquimolaren Menge zum aGG a-D-Glucosylglycerin. ____ aGG ist ein natürlich vorkommendes Molekül (ein Glycosid; ein Kohlehydrat-Derivat), welches die Funktion einer osmoprotek-tiven Substanz und eines Stabilisators in verschiedenen Mikroorganismen erfüllt. „Mehrere Publikationen zeigten, dass isoliertes aGG ein Spektrum außerordentlicher Eigenschaften hat, die für eine technologische Anwendung von wesentlichem Interesse sind. Verwendungen von aGG und Derivaten davon inkludieren - ohne darauf eingeschränkt zu sein - die Gebiete der Medizin (Krebs-The- nachgereicht ·· · · ·« ·· ·· · · ·« ··

rapie), Kosmetik (feuchtigkeitsspendender und stabilisierender Zusatz zu einer Reihe von Produkten) und Nahrungsmittelprodukte (Antidiabetika). Weiters ist aGG ein sehr effizienter Stabilisator von Biomolekülen (Proteinen, Lipiden) und Mikroorganismen.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein kosmetisches Präparat, das aGG gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.

Die kosmetischen Produkte der vorliegenden Erfindung sind besonders durch die Tatsache gekennzeichnet, dass sie nur natürliches aGG aufweisen, welches mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat, das aGG gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nahrungsergänzungsmittel, das aGG umfasst oder ein Produkt, das aGG gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von aGG oder von einem Produkt, das aGG gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, als Süßungsmittel. Ein besonderer Aspekt ist die Verwendung als Süßungsmittel aus Mischungen von aGG und Fructose, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich sind.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von aGG als stabilisierender Zusatz zu Präparaten von Biomolekülen während der Lagerung oder Verarbeitung, insbesondere während der Trocknung. Insbesondere kann aGG als Stabilisator lebender Mikroorganismen, Proteine und von Lipid abstammenden Strukturen dienen. Es kann Protein-Präparate, beispielsweise -ohne darauf eingeschränkt zu sein - Antikörper, Antikörperfragmente und Enzyme, gegen Denaturierung und Verlust der biologischen Aktivität stabilisieren.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von aGG als Zusatz, der die Protein-Faltung, insbesondere jene von rekombinanten Proteinen, unter Bedingungen in vitro wie auch in vivo erleichtern kann.

aGG kann insbesondere als Hautreinigungsmittel (JP 2004/331583), als kosmetisches Mittel auf Wasserbasis (JP 2004/331582), Akkumulations-Inhibitor von neutralem Fett (JP 2004/331580) Produktions-Promoter der Corium-Matrix (JP nachgereicht 14 • ♦ · · · · « • · · · · · ···♦ · · « ψ • · · · · • ···♦ ·· *··· 2004/331579), Zellaktivator (JP 2004/331578) und antibakterielles Mittel (JP 2004/331577) verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Figuren und Beispiele weiter veranschaulicht, ohne auf diese beschränkt zu sein.

Fig. 1 zeigt die chemische Struktur von aGG.

Tabelle 1 zeigt die NMR-Daten für aGG, das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt und gereinigt wurde, und demonstriert eindeutig die chemische Struktur in Fig. 1.

Tabelle 1: NMR-Verschiebungs-Zuordnungen in 2-O-Glyceryl-a-D-glucopyranosid (aGG), direkt aus der Reaktionsmischung in D20 bei 300 K unter Verwendung der externen Eichung mit Aceton gemessen (2,22 ppm Ή; 31,5 ppm 13C) .

Position *H [ppm] Mult Koppl. [Hz] Int 13c [ppm] 1 5,21 d 3,8 1H 98,2 2 3,66 m 1H 72,4 3 3,84 m 1H 73,3 4 3,52 m 1H 69,9 5 3,93 m 1H 71,9 6a 3,95 m 1H 6b 3,83 m 1H 61,0 l'a 3,80 m 2H l'b 3,75 m 2H 63,8 2' 3, 91 m 1H 79,2

Suhr, R.; Scheel, O.; Thiem, J. J. Carbohydr. Chem. (1998) 17: 937-968

Fig. 2 zeigt die Herstellung von aGG aus Saccharose und Glycerin unter Verwendung von freier SPase aus Leuconostoc mesente-roides. Die enzymatische Reaktion wurde in einem gerührten Chargen-System durchgeführt. Ein 50 mM MES-Puffer (pH 7) wurde verwendet, welcher 300 mM Saccharose und 2 M Glycerin als Substrate enthielt. Die Enzym-Konzentration war 20 IE/ml. Im Detail wurde die Reaktionsmischung, enthaltend 300 mM Saccharose, 2 M Glycerin und 20 IE/ml SPase, in 50 mM MES-Puffer (pH 7) bei 30°C und 550 U/min 7,5 h lang inkubiert. Unter diesen ausgewählten optimalen Bedingungen war die Ausbeute an aGG höher als 95%. Die Menge der freigesetzten Glucose wurde von der Menge der freigesetzten Fructose subtrahiert, um das Produkt zu definieren.

NACHGEREICHT φφ • · · · · · · · « • · · ···♦ · · · · • · · ····· ·· ··· · ···· ·· ···· - 15 -

Fig. 3 zeigt die Anwendungsstabilität der SPase. aus Leucono-stoc mesenteroides, immobilisiert an einem Oxiran-Gruppen tragenden Polymer. Die Ergebnisse einer kontinuierlichen Umwandlung von Saccharose in einem Festbett-Enzym-Reaktor sind gezeigt. Die Substratlösung enthielt je 600 mM Saccharose und Phosphat in 20 mM MES-Puffer, pH 7,0. Die Umsetzung erfolgte bei 30°C und mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit von 6 ml*h-l, entsprechend einer durchschnittlichen Verweilzeit von 8,8 h (53 ml, ·) bzw. 18,5 h (111 ml, o).

Fig. 4 zeigt die Synthese von aGG durch enzymatische Glyco-sylierung von Glycerin unter Verwendung von SPase aus Leucono-stoc mesenteroides bei verschiedenen pH-Werten. Die Reaktionsmischung enthielt 0,1 M Glc 1-P, 3 M Glycerin und 3 IE/ml SPase in 40 mM MES-Puffer (pH 6,0, 6,5, 7,0) bzw. 40 mM TES-Puffer (pH 7,5, 8,0). Die Umwandlungen wurden bei 30°C und einer Rührgeschwindigkeit von 550 U/min durchgeführt. Die Menge der freigesetzten Glucose (cglc) wurde von der Menge des freigesetzten Phosphats (cP) subtrahiert, um die Produktivität zu definieren.

Fig. 5 zeigt den nukleophilen Wettbewerb bei der Hydrolyse von Saccharose durch SPase, was zur Synthese von neuen a-D-Glu-cosiden führt. BEISPIELE:

Beispiel 1: Herstellung von SPase SPase kann gemäß Berichten in der Literatur (Guibert A. und Monsan P, Ann. N.Y. Acad. Sei. (1988) 504:307-311; Vandamme EJ et al., Adv. Appl. Microbiol. (1987) 32:163-201; Kawasaki H. et al., Biosci. Biotech. Biochem. (1996) 60:322-324; Kitao S. und Nakano E, J. Ferment. Bioeng. (1992) 73:179-184; van den Broek LAM et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004) 65:219-227) als natives Enzym oder als rekombinantes Enzym erhalten werden (beispielsweise - jedoch ohne Einschränkung darauf - in Escherichia coli erzeugt). Sie kann natürlich in verschiedenem Maßstab erzeugt werden, was durch Schüttelkolben-Kulturen eines geeigneten Mikroorganismus und Bioreaktoren, vorzugsweise einen belüfteten oder nicht-belüfteten Rührtankreaktor oder einen Säulenreaktor, wie einen Blasensäulenreaktor oder einen Airlift-Reaktor, dargestellt wird. Eine teilweise Reinigung oder Isolierung des Enzyms erfolgt unter Verwendung von für SPase beschriebenen Vorgangweisen oder durch Befolgung allgemeiner Protokolle der Proteinrei-

NACHGEREICHT • · • ·

nigung gemäß dem Stand der Technik. Immobilisierungsverfahren wie beispielsweise - ohne Einschränkung auf diese - kovalente und nicht-kovalente Bindung an unlösliche Träger, Verkapselung und Ganzzellen-Systeme, erfolgen unter Verwendung von bereits für SPase entwickelten Protokollen oder durch Befolgung allgemeiner Protokolle gemäß dem Stand der Technik (Pimentei MCB und Ferreira MSS, Appl. Biochem. Biotechnol. (1991) 27:37-43; Soer-taert W. et al., Progress in Biotechnology, Bd. 10 (Petersen S.B., Svensson, B., Pederesen, S., Hrsg.), Elsevier, Amsterdam; Vandamme EJ et al., Adv. Appl. Microbiol. (1987) 32:163-201).

Beispiel 2: Enzym-Tests

Die SPase-Aktivität wurde unter Verwendung eines kontinuierlich gekoppelten Enzym-Tests bei 30°C bestimmt, bei welchem die Herstellung von Glc 1-P aus Saccharose und anorganischem Phosphat mit der Reduktion von NAD+ in Anwesenheit von Phosphogluco-mutase (PGM) und Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6P-DH) gekoppelt wird. Der Standard-Test wurde im Wesentlichen wie an anderer Stelle beschrieben in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0, enthaltend 10 mM EDTA, 10 mM MgCl2und 10 μΜ α-D-Glucose-1,6-biphosphat, durchgeführt. Die Reaktionsmischung enthielt 250 mM Saccharose, 2,5 mM NAD+, 3 E-ml'1 PGM, 3,4 E-ml'1 NAD+-ab-hängige G6P-DH und die Enzymlösung in geeigneter Verdünnung. Die Bildung von NADH im Laufe der Zeit wurde spektrophotometrisch bei 340 nm überwacht. Eine Einheit SPase-Aktivität entspricht der Menge Enzym, die die Reduktion von 1 pmol NAD+ pro Minute unter den oben beschriebenen Bedingungen bewirkte. Die Protein-Konzentrationen wurden unter Verwendung des BioRad-Farbstoff-Bindungsverfahrens mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Das Phosphat wurde kolorimetrisch bei 850 nm bestimmt, und Glc 1-P wurde in einem gekoppelten Enzym-System mit PGM und G6P-DH getestet.

Beispiel 3: Immobilisierung von LmSPase an einem Oxiran-Gruppen enthaltenden Polymer

Eine Gesamtmenge von 700 E eines Präparats aus roher SPase mit einer spezifischen SPase-Aktivität von 50 E*mg_1 wurde bei 4°C mit 10 g Eupergit C in 0,7 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0, 14 h lang inkubiert. Die Rührgeschwindigkeit war 250 U/min. Das Immobilisat wurde mehrere Male mit 20 mM MES-Puffer, pH 7,0, gewaschen. Die Bindungseffizienz, angegeben durch das Verhältnis der im Überstand nach der Immobilisierung gemessenen Restaktivi-

NACHGEREICHT ··

• * ·· ·· ·· • · · f » · · · t • · · · · · · • ···· · · · · • · · · · · ··· · ···· ι· ·»·· 17 tät und der gesamten verwendeten Aktivität (E) , war 0,5.

Beispiel 4: Operative Stabilität der immobilisierten SPase

Eupergit C, an welchem die SPase befestigt war, wurde in eine GE Healthcare XK26/40 Glassäule (2,6 cm; 53 ml oder 111 ml, 34 E*g_1 Eupergit C), die mit einem thermostatischen Mantel ausgerüstet war, gepackt. Die Säule wurde mit 20 mM MES-Puffer, pH 7,0, äquilibriert. Die Substratlösung enthielt je 600 mM Saccharose und Phosphat im selben Puffer und wurde durch Inkubation in einem Wasserbad auf Reaktionstemperatur (30°C) gebracht. Die Lösung wurde mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit von 6 ml-h'1, die von einer GE Healthcare Kolbenpumpe (Modell P-500) geliefert wurde, durch das Festbett gepumpt. Die Temperatur am Ausgang des Reaktors wurde kontinuierlich überwacht. Zu bestimmten Zeiten wurden 1 ml-Proben entnommen und zur weiteren Analyse verwendet.

Fig. 3 zeigt den Zeitverlauf der Glc 1-P-Erzeugung in einem kontinuierlichen Festbett-Reaktor, der mit einer konstanten axialen Fließgeschwindigkeit von 1,13 cm’h-1 betrieben wurde. Je nach der durchschnittlichen, durch die Betthöhe bestimmten Verweilzeit, 8,8 h oder 18,5 h, betrug die Umwandlung von Saccharose (600 mM) 68% bzw. 91%. Die entsprechenden Produktivitäten, berechnet als g*l_1 Produkt x reziproker Verweilzeit, waren 15,4 g'(l'h)'1 und 10,9 g· (1‘h)'1. Es sei beachtet, dass die Umwandlungsrate konstant blieb bis zu verlängerten Reaktionszeiten von 650 h, was die ausgezeichnete Stabilität von immobilisierter SPase unter den Herstellungsbedingungen unterstreicht.

Beispiel 5: Synthese von aGG unter Verwendung von Glc 1-P als Donor

Die Reaktionsmischung enthielt 0,1 M Glc 1-P, 3 M Glycerin und 3 ΙΕτηΙ*1 LmSPase in 40 mM MES-Puffer (pH 6,0, 6,5, 7,0) oder 40 mM TES-Puffer (pH 7,5, 8,0). Die enzymatische Umwandlung im Laufe der Zeit bei 30°C und einer Rührgeschwindigkeit von 550 U/min wurde verfolgt. Die Konzentrationen von freigesetztem Phosphat (cP) und Glucose (cglc) wurden bestimmt. Die Menge des gebildeten Transglucosylierungsprodukts entspricht cP - cglc.

Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.

Beispiel 6: Synthese von aGG unter Verwendung von Saccharose als Donor

Die Reaktionsmischung, die 300 mM Saccharose, 2 M Glycerin und 20 E/ml SPase in 50 mM MES-Puffer (pH 7) enthielt, wurde bei

NACHGEREICHT • · • ·

·· · · · · I • · * · · fl • ···· · · fl • · · · fl ··· · ···« ·· 18 30°C und 550 U/min 7,5 h lang inkubiert. Unter diesen gewählten optimalen Bedingungen war die Ausbeute an aGG höher als 95% (Fig. 2). Eine Produktanalyse wurde unter Verwendung von HPLC vorgenommen, wobei eine BioRad HPX-87C-Säule und Reflexionsindex-Detektion benützt wurden. Die Säule wurde auf 85°C gehalten, und entionisiertes Wasser wurde als Elutionsmittel mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml/min verwendet. Die Menge der freigesetzten Glucose wurde unter Verwendung eines Stand-der-Technik- Glucose-Oxidase / Peroxidase-Tests gemessen. Die NMR-Analysen, die in Tabelle 1 gezeigt sind, bestätigten die richtige Struktur von aGG und die Zusammensetzung der Produktmischung. Es sei bemerkt, dass die Hydrolyse (d.h. die Bildung von Glucose) unter den in den Beispielen 5 und 6 verwendeten Bedingungen wirksam verhindert wird.

Beispiel 7: Reinigung von aGG

Etwa 90 ml Produkt, das wie in Beispiel 6 erhalten wurde, außer dass 800 m Saccharose verwendet wurden, wurden auf eine Säule (XK 50/60, GE Healthcare) geladen, die mit etwa 1 Liter einer l:l-Mischung von Aktivkohle Norit® (Type Norit SX Ultra) und Celite® 501 (Filter Aid, gebrannt) gepackt war. Die Säule wurde mit Wasser äquilibriert. Die Produktlösung enthielt 16,3 g aGG, 12,4 g Fructose, 2,2 g Saccharose, 13,1 g Glycerin und 0,8 g Glucose. Die Elution wurde unter Verwendung eines Stufen-Gradienten von Ethanol in Wasser durchgeführt, wobei 4 Liter Wasser benützt -wurden, gefolgt von 4 Liter von 2% Ethanol und schließlich 2 Liter von 15% Ethanol. aGG eluiert bei 2% Ethanol, getrennt von nicht umgesetzter Saccharose sowie Fructose. Glycerin ist in der Wasserfraktion anwesend. Die Ausbeute des gewonnenen aGG ist 56%, und die Reinheit von aGG, mittels HPLC beurteilt, ist höher als 98%.

Beispiel 8: Stabilisierung von Proteinen während des Gefriertrocknens

Das Protein, an dem ein Interesse besteht (z.B. Mannit-Dehy-drogenase, MDH), wird mit einer Konzentration von 0,8 mg/ml in Anwesenheit von 0, 20, 50, 100, 500, 1000 oder 1500 mM aGG in 100 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,0, inkubiert. Die Proben werden über Nacht lyophilisert und im selben Puffer wieder gelöst. Die spezifische Enzym-Aktivität wird bestimmt, wobei vor und nach dem Gefriertrocknen geeignete Tests für das entsprechende Enzym, wie an anderer Stelle beschrieben (Slatner M. et al., Bioche-

NACHGEREICHT ·· • • ·· • · * · · · • · • • t · · • · • ·♦·· · · • · • • · · • · · · · · ·* ·£^ · ···· ·« mistry 38: 10489-10498), verwendet wurden. Ohne jeglichen zugesetzten Stabilisator fällt die enzymatische Aktivität des MDH nach dem Gefriertrocknen auf 2%, wogegen aGG - unabhängig von der zugesetzten aGG-Konzentration - die enzymatische Aktivität bis zu 48% erhalten kann.

NACHGEREICHT

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung von 2-O-Glyceryl-a-D-glucopyrano-sid (aGG) aus einem Glucosyl-Donor und einem Glucosyl-Akzeptor, welches die Schritte umfasst: - Vorsehen einer Saccharose-Phosphorylase (EC 2.4.1.7), - Inkubieren der Saccharose-Phosphorylase mit einer Mischung, welche einen Glucosyl-Donor und Glycerin als Glu-kosyl-Akzeptor aufweist, und - Isolieren und/oder Reinigen von 2-0-Glyceryl-a-D-glucopy-ranosid.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Glucosyl-Donor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Saccharose und Analoga von Saccharose, bei welchen der Fructosyl-Anteil modifiziert oder durch einen anderen Ketosyl-Rest substituiert ist, α-D-Glucose-l-phosphat, α-D-Glucose-l-fluorid, stabilen, aktivierten Glucosyl-Donoren, wie α-D-Glucose-l-azid, und Mischungen davon.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Saccharose-Phosphorylase mikrobiellen, vorzugsweise bakteriellen Ursprungs ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die bakterielle Saccharose-Phosphorylase erhalten ist aus Agrobacte-rium vitis (NCBI P33910) Bifidobacterium adolescentis (Q84HQ2), Bifidobacterium longum (Q84BY1), Escherichia coli (P76041), Escherichia coli 06 (Q8FHS2), Lactobacillus acidophilus (Q7WWP8, Q7WWQ5), Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (Q81I99), Leu-conostoc mesenteroides (Q59495, Q9R5Q3), Listeria monocytogenes (Q4ENE7, Q4EQR2, Q4ETN7, Q4EHA0, Q4EJW2, Q4ELY7), Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas saccharophila (AAD40317), Rhodopirel-lula baltica (Q7UIS9), Shewanella baltica (Q3Q4P1), Shewanella frigidimarina (Q3NMD1), Solibacter usitatus (Q43TL5), Streptococcus mutans (P10249) und/oder Synechococcus sp. (068858, Q7U3J7)
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Saccharose-Phosphorylase rekombinant als Ge- NACHGEREICHT ·· ·· I · • · · • ···· ·· • · • ·

• ·· ·
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Saccharose-Phosphorylase vor dem Inkubationsschritt an einem Träger immobilisiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein fester Träger, vorzugsweise ein Polymer, mehr bevorzugt ein Acryl-Polymer, insbesondere ein Copolymer von Methacrylamid, N,N'-Methylen-bis(acrylamid) und ein Oxiran-Grup-pen tragendes Monomer ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Chromatographie-Harz, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anionenaustausch-Chroma-tographie-Harz, Kationenaustausch-Chromatographie-Harz, Affini-täts-Chromatographie-Harz und hydrophobes Interaktion-Chromatographie-Harz, ist.
• 9 • · • 9 · · weiters Fructose, vorzugsweise in einer äquimolaren Menge zu a-D-Glucosylglycerin aufweist.

·· #· • 9 · · · • · ·

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation bei einem pH-Wert von 4 bis 10, vorzugsweise 5 bis 9, mehr bevorzugt 6 bis 8, insbesondere 7, durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation mindestens 15 min lang, vorzugsweise mindestens 60 min lang, mehr bevorzugt mindestens 3 Stunden lang, noch mehr bevorzugt mindestens 5 Stunden lang durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation bei einem Temperaturbereich von 10 bis 50°C, vorzugsweise 15 bis 40°C, mehr bevorzugt bei einer Temperatur von 30°C durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung den Glucosyl-Donor in einer Konzentration von 0,01 bis 3 mol/1, vorzugsweise 0,05 bis 2 mol/1, mehr bevorzugt von 0,1 bis 1,5 mol/1 aufweist. NACHGEREICHT ·· • · +» *· ·· • · ·· · · · · · • · • • • · · · · · • • · • ···· · · · • • ♦ • · · · · • ♦ · ··· · ···· ·· ·#·· - 22 -
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung Glycerin in einer Konzentration von 0,01 bis 10 mol/1, vorzugsweise von 0,05 bis 5 mol/1, mehr bevorzugt von 0,1 bis 3 mol/1, noch mehr bevorzugt von 0,1 bis 1,5 mol/1 aufweist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Glycerin zu Glucosyl-Donor in der Mischung im Bereich von 0,1:1 bis 10:1, vorzugsweise von 0,5:1 bis 5:1, mehr bevorzugt von 1:1 bis 3:1, liegt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das α-D-Glucosylglycerin durch Elutions-Chromatographie auf Aktivkohle in einer Ausbeute von 55%, vorzugsweise 70%, mehr bevorzugt 85%, isoliert wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Saccharose-Phosphorylase aus Leuconostoc mesentoroides (Q59495, Q9R5Q3) erhalten und an einem Acryl-Polymer immobilisiert wird, insbesondere an einem Copolymer von Me-thacrylamid, N,N'-Methylen-bis(acrylamid) und einem Oxiran-Gruppen tragenden Polymer, wobei die immobilisierte Saccharose-Phosphorylase mit Saccharose als Glucosyl-Donor inkubiert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung einer a-D-Gluco-sylglycerin und Fructose .enthaltenden Mischung, welches die Schritte umfasst: - Vorsehen einer Saccharose-Phosphorylase (EC 2.4.1.7), - Inkubieren der Saccharose-Phosphorylase mit einer Mischung, welche Saccharose und Glycerin als Glucosyl-Akzep-tor aufweist, und - Isolieren und/oder Reinigen der α-D-Glucosylglycerin- und Fructose-Mischung.
18. α-D-Glucosylglycerin oder ein α-D-Glucosylglycerin aufweisendes Produkt, erhältlich mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17.
19. Produkt nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es NACHGEREICHT
20. Kosmetisches Präparat, welches α-D-Glucosylglycerin oder ein a-D-Glucosylglycerin aufweisendes Produkt nach Anspruch 18 umfasst.
21. Pharmazeutisches Präparat, welches a-D-Glucosylglycerin oder ein a-D-Glucosylglycerin aufweisendes Produkt nach Anspruch 18 umfasst.

• · • · • · 21 samtlängen-Protein oder als ein katalytisch aktives Fragment davon, oder als Fusionsprotein erzeugt wird.
22. Nahrungsergänzungsmittel, welches a-D-Glucosylglycerin oder ein a-D-Glucosylglycerin aufweisendes Produkt nach Anspruch 18 umfasst.
23. Verwendung von α-D-Glucosylglycerin oder einem a-D-Glucosylglycerin aufweisenden Produkt nach Anspruch 18 als Süßungsmittel .
24. Verwendung von α-D-Glucosylglycerin oder einem a-D-Glucosylglycerin aufweisenden Produkt nach Anspruch 18 als Stabilisator von Biomolekülen, insbesondere Proteinen oder Proteinfragmenten und von Lipid stammenden Strukturen während der Verarbeitung und Lagerung.
25. Verwendung von α-D-Glucosylglycerin oder einem a-D-Gluco-sylglycerin aufweisenden Produkt nach Anspruch 18 als Stabilisator lebender Mikroorganismen während der Verarbeitung und Lagerung.
26. Verwendung von α-D-Glucosylglycerin oder einem a-D-Glucosylglycerin aufweisenden Produkt nach Anspruch 18 als Stabilisator von Proteinen während der Trocknung, insbesondere während der Lyophilisation.
27. Verwendung von α-D-Glucosylglycerin oder einem a-D-Glucosylglycerin aufweisenden Produkt nach Anspruch 18 als Zusatz zur Unterstützung der Protein-Wiederfaltung aus Einschlusskörpern und zur Verhinderung der Protein-Missfaltung und Aggregation in vivo, insbesondere in Escherichia coli. NACHGEREICHT
28. Verwendung von α-D-Glucosylglycerin oder einem a-D-Gluco-sylglycerin aufweisenden Produkt nach Anspruch 18 als Zusatz zur Verbesserung der Lebensfähigkeit von Zellen während einer rekom-binanten Proteinerzeugung, insbesondere bei Escherichia coli.
29. Verwendung von α-D-Glucosylglycerin oder einem a-D-Gluco-sylglycerin aufweisenden Produkt nach Anspruch 18 als Zusatz zur Verbesserung der Stabilität von Enzymen unter Reaktionsbedingungen . NACHGERE1CHT j