MXPA05012018A

MXPA05012018A - Plantas con niveles incrementados de uno o mas aminoacidos.

Info

Publication number: MXPA05012018A
Application number: MXPA05012018A
Authority: MX
Inventors: Gabriela Vaduva
Original assignee: Renessen Llc
Priority date: 2003-05-07
Filing date: 2004-05-06
Publication date: 2006-08-31
Also published as: WO2004101744A2; EP1620540A4; AU2004239263B2; JP2007501634A; CA2525097A1; US20050289668A1; BRPI0410339A; EP1620540A2; AU2004239263A1; WO2004101744A3

Abstract

La presente invencion provee construcciones de ADN que comprenden polinucleotidos exogenos que codifican una treonina desaminasa y/o AHAS; tambien se proveen plantas transgenicas transformadas con las construcciones, asi como semilla y progenie derivada de estas plantas; las plantas transgenicas tienen un nivel incrementado de uno o mas aminoacidos en comparacion con una planta no transgenica de la misma especie.

Description

VEGETALES CON NIVELES CRECIENTES DE UNO O MAS AMINOÁCIDOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/468,727, presentada el 7 de mayo de 2003, incorporada en la presente para su referencia de manera íntegra. El campo de la presente invención es biotecnología agrícola, Más específicamente, la presente invención concierne a procedimientos biotecnológicos para incrementar el nivel de aminoácidos en vegetales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Numerosos de los cultivos importantes, incluyendo soya y maíz, no contienen suficiente cantidad o el equilibrio correcto de varios aminoácidos para ser completos nutricionalmente. Esto es especialmente verdadero para los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) leucina, isoieucina, y valina. Los BCCA son aminoácidos esenciales ya que los humanos no son capaces de sintetizar estas moléculas y por consiguiente deben de adquirirlos a partir de su dieta. La isoleucina es un aminoácido de cadena ramificada que es sintetizado a partir de treonina. La treonina misma es sintetizada a partir de aspartato. La ruta sintética entre el aspartato y BCAA involucra varias enzimas que son aloestéricamente inhibidas por varios aminoácidos. Las enzimas usadas en la síntesis de BCAA incluyen aspartato quinasa (AS), homoserina deshidrogenasa-aspartato quinasa bifuncional (AK-HSDH), isopropilmaleato sintasa, treonina desaminasa (TD), y ácido acetohidroxi sintasa (AHAS). En particular, la treonina desaminasa (EC 4.2.1.16) (TD, treonina deshidratasa; L-treonina hidrolasa (desaminante)) y ácido acetohidroxi sintasa (AHAS; acetolactato sintasa (EC 4.1.3.18) son enzimas claves en la biosíntesis de BCAA. En E. coli, la treonina desaminasa existe en formas biosintéticas y biodegradables separadas. La forma biosintética de la treonina desaminasa es codificada por el gen ilvk y cataliza la primera etapa perpetrada en la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada en vegetales y microorganismos. Esta etapa deshidrata y desamina L-treonina para producir 2- oxobutirato por utilización de 5'-fosfato de piridoxal (PryP). La treonina desaminasa biosintética es sometida a regulación alostérica por L-isoleucina (Umbarger, Science, 123:848 (1956); Umbarger, Protein Science, 1 :1392 (1992); Changeux, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 26:313 (1961); Monod y colaboradores, J. Mol. Biol., 6:306 (1963)). Varias enzimas desrreguladas de treonina desaminasa existen tanto a partir de vegetales como de bacterias. Ver, Feldberg y colaboradores, Eur. J. Biochem., 21 :438-446 (1971 ); Mourad y colaboradores, Plant Phys., 107:43-52 (1995); Fisher y colaboradores, J. Bact, 175:6605-6613 (1993); Taillon y colaboradores, Gene, 63: 245-252 (1988); Mdckel y colaboradores, Mol. Microbiol., 13:833-842 (1994); Guillouet y colaboradores, Appl Environ Microbiol., 65:3100-3107 (1999); Slater y colaboradores, Nature Biotechnology, 7: 1011-1016 (1999), En contraste a la forma biosintética, la forma biodegradable de treonina desaminasa es activada por AMP, es insensible a la regulación retroalimentada por L-isoleucina, y se produce anaeróbicamente en medio que contenga concentraciones altas de aminoácidos y sin glucosa. Además, en E. coli, la forma biodegradable de treonina desaminasa es codificada por un gen (tdcB) separado. Las enzimas AHAS se conservan a través de numerosos organismos tales como bacterias, levaduras, y vegetales (Singh y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., 88: 4572-4576 (1991 )). En E. coli y otras enterobacterias, AHAS es una proteína heterotetrámica compuesta de dos • subunidades grandes y dos pequeñas, denominadas ilvG e ilvM, respectivamente (Weinstock y colaboradores, J. Bacteriol., 174:5560-6 (1992)). La actividad enzimática del tetrámero está contenida completamente en la subunidad grande. Se requiere la subunidad pequeña para estabilidad enzimática y propósitos de regulación. En vegetales, el estado de aglutinación varía entre las especies. En algunos vegetales, tales como Arabidopsis thaliana, un gen estructural individual codifica a la enzima AHAS (Andersson y colaboradores, Plant Cell Reports, 22: 261- 267 (2003)), aunque otras especies vegetales, tales como tabaco, pueden tener más de un gen funcional. Como las bacterias, las enzimas AHAS vegetales son también inhibidas por retroalimentación. Las enzimas AHAS vegetales son el objetivo de algunos herbicidas comerciales (patente U.S. 6,727,414). Las AHAS desempeñan un papel importante en el equilibrio de los niveles de leucina y valina por un lado e isoleucina por otro. AHAS es importante al activar la conversión de piruviato a acetolactato, el precursor tanto para leucina como para valina. AHAS también activa la conversión de 2-oxobutirato a acetohidroxibutirato, el precursor para isoleucina. Porque AHAS tiene una preferencia de sustrato por 2-oxobutirato sobre la reacción enzimática de piruviato, favorece la producción de isoleucina. Los niveles de isoleucina son retenidos por verificación de la inhibición por retroalimentación de TD por ¡soleucina mientras que AHAS es inhibida por retroalimentación por valina y leucina. La producción de leucina es también regulada por inhibición por retroalimentación de isopropilmaleato sintasa. BCAA son producidas comercialmente por extracción directa del aminoácido de hidrolizados proteínicos. Por ejemplo, el nivel corriente de producción de isoleucina es menor que 400 toneladas métricas por año pero la demanda por isoleucina es creciente. Por consiguiente, para proveer insuficientes BCAA aisladas, así como también proveer una fuente más económica de éstas, son necesarios los vegetales que son diseñados para sintetizar niveles crecientes de aminoácidos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye una construcción de ADN que comprende cassettes de expresión vegetal múltiple en donde un primer cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unidos operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a la treonina desaminasa insensible a la retroalimentación y un segundo cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unido operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a AHAS. En una modalidad, la construcción de ADN de la presente invención comprende cassettes de expresión vegetal múltiple en donde un primer cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unido operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a una treonina desaminasa insensible a la retroalimentación, un segundo cassette de expresión comprende una subunidad de AHAS grande, y un tercer cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unido operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a una subunidad pequeña de AHAS. En una modalidad, cada uno de los promotores es un promotor mejorado de semillas. En otra modalidad, cada uno de los promotores es seleccionado del grupo que consiste de: napina, 7S alfa, 7S alfa', 7S beta, USP 88, USP 88 mejorada, Arcelin 5, y Oleosina. En una modalidad, hay al menos dos promotores mejorados de semillas diferentes. En un aspecto de la presente invención, el primer cassette comprende un polinucleótido que codifica a una treonina desaminasa insensible a la retroalimentación que comprende la SEC ID NO: 22. En una modalidad, el polinucleótido es la SEC ID NO: 22. En otro aspecto de la presente invención, el primer cassette comprende un polinucleótido exógeno que codifica a una variante alela de treonina desaminasa o subunidad de la misma que comprende una sustitución de aminoácido en la posición L447F, o L481 F, o L481Y, o L481 P, o L481E, o L481T, o L481Q, o L481 I, o L481V, o L481M, o L481K. En aún otro aspecto de la presente invención, el polinucleótido que codifica a una variante alela de treonina desaminasa comprende la SEC ID NO: 2. En otro aspecto de la presente invención, el polinucleótido es la SEC ID NO: 2. En una modalidad de la presente invención, el primer cassette comprende adicionalmente un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido operablemente unido al polinucleótido que codifica a la treonina desaminasa, variante alelo de treonina desaminasa, o subunidad de las mismas. En otra modalidad, el segundo cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS. En una modalidad, el polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS comprende la SEC ID NO: 16. En una modalidad, el polinucleótido es la SEC ID NO: 16. En aún otra modalidad, un polinucleótido que codifica a un plásmido de tránsito a plástido es unido operablemente al polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS. En una modalidad, el tercer cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica a la subunidad pequeña de AHAS. En otra modalidad, el polinucleótido que codifica a la subunidad pequeña de AHAS comprende la SEC ID NO: 17. En una modalidad, el polinucleótido es la SEC ID NO: 17. En aún otra modalidad, un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido es unido operablemente al polinucleótido que codifica a la subunidad pequeña de AHAS. En un aspecto, una construcción de ADN comprende cassettes de expresión vegetal múltiple en donde un primer cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unido operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a una treonina desaminasa insensible a retroalimentación, y un segundo cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unido operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a una subunidad grande de AHAS. En otro aspecto, cada uno de los promotores es un promotor mejorado de semillas. En aún otro aspecto, cada uno de los promotores mejorados de semillas es seleccionado del grupo que consiste de: napina, 7S alfa, 7S alfa', 7S beta, USP 88, USP 88 mejorada, Arcelin 5, y oleosina. En otro aspecto, hay al menos dos promotores mejorados de semillas en la construcción. En una modalidad, el primer cassette comprende un polinucleótido que codifica a una treonina desaminasa insensible a la retroalimentación que comprende la SEC ID NO: 22. En una modalidad, el polinucleótido es la SEC ID NO: 22. En otra modalidad, el primer cassette comprende una variante alelo de treonina desaminasa que comprende una sustitución de aminoácido en posición L447F, o L481 F, o L481Y, o L481P, o L481 E, o L481T, o L481Q, o L481 I o L481V, o L481M, o L481K. En otra modalidad, el polinucleótido que codifica a una variante alelo de treonina desaminasa comprende la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución de aminoácido en posición L447F, o L481 F, o L481Y, o L481P, o L481 E, o L481T, o L481Q, o L481 I o L481V, o L481M, o L481K. En una modalidad, el polinucleótido es la SEC ID NO: 22. En un aspecto de la presente invención, el primer cassette comprende un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido operablemente unido a dicho nucleótido que codifica a una treonina desaminasa. En otro aspecto, el segundo cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS. En aún otro aspecto, el polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS comprende la SEC ID NO: 16. En una modalidad, el polinucleótido es la SEC ID NO: 16. En aún otro aspecto, un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido está operablemente unido a dicho polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS. En una modalidad, la construcción de ADN comprende cassettes de expresión vegetal múltiple en donde un cassette de expresión que comprende un promotor funcional en células de un vegetal está operablemente unido a un polinucleótido exógeno que codifica a un AHAS monomérico. En otra modalidad, la construcción de ADN comprende cassettes de expresión vegetal múltiple en donde un primer cassette de expresión que comprende un promotor funcional en células de un vegetal está operablemente unido a un polinucleótido exógeno que codifica a una subunidad grande de AHAS, y un segundo cassette de expresión que comprende un promotor funcional en células de un vegetal está operablemente unido a un polinucleótido exógeno que codifica a una subunidad pequeña de AHAS. En aún otra modalidad, cada uno de los promotores es un promotor mejorado de semillas. En aún otra modalidad, cada uno de dichos promotores mejorados de semillas es seleccionado del grupo que consiste de: napina, 7S alfa, 7S alfa', 7S beta, USP 88, USP 88 mejorado, Arcelin 5, y Oleosina. En otra modalidad, hay al menos dos promotores mejorados de semillas diferentes. En una modalidad, el primer cassette comprende una subunidad grande de AHAS que comprende la SEC ID NO: 16. En una modalidad, el polinucleótido es la SEC ID NO: 16. En otra modalidad, el primer cassette comprende un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido unido operablemente a dicho polinucleótido que codifica a dicha subunidad grande de AHAS. En otra modalidad, el segundo cassette comprende un polinucleótido que codifica a la subunidad pequeña de AHAS. En otra modalidad, el segundo cassette comprende un polinucleótido que codifica a la subunidad pequeña de AHAS que comprende SEQ ID NO: 17. En una modalidad, el polinucleótido es SEC ID NO: 17. En otra modalidad, el segundo cassette comprende un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido unido operablemente a dicho polinucleótido que codifica a dicha pequeña subunidad de AHAS. La presente invención también proporciona un método para preparar un vegetal dicotiledóneo transgénica que tenga un incremento en el nivel de aminoácidos en la semilla en comparación con una semilla de un vegetal no transgénico de la misma especie vegetal, que comprenda las etapas de: a) introducir en células regenerables de un vegetal dicotiledóneo un transgen que comprenda una construcción que comprenda un polinucleótido que codifica a una treonina desaminasa insensible a retroalimentación; b) regenerar dicha célula regenerable en un vegetal dicotiledóneo; c) cosechar la semilla de dicho vegetal; d) seleccionar uno o más semillas con un nivel creciente de aminoácidos cuando se compara con una semilla de un vegetal no transgénico de la misma especie vegetal; y e) plantar dicha semilla, en donde, si la isoleucina está presente a un nivel creciente, al menos un nivel adicional de aminoácidos es también creciente. En una modalidad, el vegetal dicotiledóneo es una planta de soya. En una modalidad, el nivel creciente de aminoácidos comprende un incremento en la concentración de: a) lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe; o b) uno o más de Arg, Asn, His, Met, Leu, Val, Gln, Tyr, Thr, Lys, Ala, Ser, y Phe. La presente invención incluye una planta de soya transgénica producida por el método. La presente invención incluye un método para preparar un vegetal dicotiledóneo transgénico que tenga un contenido creciente de aminoácidos, que comprenda las etapas de: a) introducir en células regenerables de un vegetal dicotiledóneo un transgen que comprenda una construcción que comprenda un polinucleótido que codifique a un AHAS monomérico, o a una construcción que comprenda un polinucleótido que codifique a una subunidad grande de AHAS y a un polinucleótido que codifique a una subunidad pequeña de AHAS; b) regenerar dicha célula regenerable en un vegetal dicotiledóneo; c) cosechar la semilla de dicho vegetal; d) seleccionar una o más semillas con un nivel creciente de aminoácidos cuando se compara con una semilla de un vegetal no transgénico de la misma especie vegetal; y e) plantar dicha semilla. En una modalidad, el vegetal dicotiledóneo es una planta de soya o de colza. En una modalidad, el nivel creciente de aminoácidos comprende un incremento en la concentración de Ser o Val. En una modalidad, la presente invención incluye una planta de soya transgénica producida por el método. La presente invención también incluye polvo producido de las soyas transgénicas. La presente invención está también dirigida a un contenedor que contenga semillas de la presente invención. Las semillas de un vegetal o vegetales de la presente invención pueden ser colocadas en un contenedor, tal como, por ejemplo, una bolsa. Como se usa en la presente, un contenedor es cualquier objeto capaz de retener dichas semillas. Un contenedor preferiblemente contiene más de aproximadamente 1 ,000, aproximadamente 5,000, o aproximadamente 25,000 semillas en donde al menos aproximadamente 10 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 75 %, o aproximadamente 100 % de las semillas son semillas de la presente invención. Preferiblemente, donde las semillas de la presente invención son semillas de soya, el contenedor es preferiblemente una bolsa que contenga aproximadamente 60 libras o aproximadamente 130,000 semillas. La presente invención está dirigida adicionalmente a productos alimenticios humanos o animales elaborados a partir de los vegetales o a parte vegetales transgénicas (por ejemplo, semillas) de la presente invención. Dichos productos alimenticios pueden ser elaborados de, por ejemplo, grano, polvo, harina, semilla, cereal, y los similares, incluyendo productos intermedios elaborados a partir de dichos materiales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 , es un mapa de restricción del plásmido pMON53905. La Figura 2, es un mapa de restricción del plásmido pMON25666. La Figura 3, es un mapa de restricción del plásmido pMON53910. La Figura 4, es un mapa de restricción del plásmido pMON53911. La Figura 5, es un mapa de restricción del plásmido pMON53912. La Figura 6, ilustra las propiedades cinéticas de treonina desaminasa de Arabidopsis (símbolos de diamantes) y de treonina desaminasa de E. coli (símbolos circulares) que proporcionan una gráfica de la velocidad inicial de enzimas de tipo salvaje vs. la concentración de treonina. La Figura 7, proporciona una gráfica del porcentaje de actividad enzimática para los alelos L481 de E. co//vs. la concentración de isoleucina. La Figura 8, es un mapa de restricción del plásmido pMON69657. La Figura 9, es un mapa de restricción del plásmido pMON69659. La Figura 10, es un mapa de restricción del plásmido pMON69660. La Figura 11 , es un mapa de restricción del plásmido pMON69663. La Figura 12, es un mapa de restricción del plásmido pMON69664. La Figura 13, es un mapa de restricción del plásmido pMON58143. La Figura 14, es un mapa de restricción del plásmido pMON58138. La Figura 15, es un mapa de restricción del plásmido pMON58159. La Figura 16, es un mapa de restricción del plásmido pMON58162.

DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS DE PEPTIDOS Y DE ÁCIDOS NUCLEICOS La SEC ID NO: 1 , representa una secuencia de polinucleótidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje. La SEC ID NO: 2, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. co// de tipo salvaje. La SEC ID NO: 3, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga un Phe que reemplace la Leu en posición 447, (Ilv219). La SEC ID NO: 4, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga un Phe que reemplace la Leu en posición 481 , (Ilv466). La SEC ID NO: 5, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga una Tyr que reemplace la Leu en posición 481. La SEC ID NO: 6, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga una Pro que reemplace la Leu en posición 481. La SEC ID NO: 7, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga una Glu que reemplace la Leu en posición 481. La SEC ID NO: 8, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga una Thr que reemplace la Leu en posición 481. La SEC ID NO: 9, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga una Gln que reemplace la Leu en posición 481. La SEC ID NO: 10, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga una lie que reemplace la Leu en posición 481. La SEC ID NO: 11 , representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga una Val que reemplace la Leu en posición 481. La SEC ID NO: 12, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga una Met que reemplace la Leu en posición 481. La SEC ID NO: 13, representa una secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje que tenga una Lys que reemplace la Leu en posición 481. La SEC ID NO: 14, representa una secuencia de polinucleótidos para la treonina desaminasa de E. coli L447F que tenga un Phe que reemplace la Leu en posición 447. La SEC ID NO: 15, representa una secuencia de polinucleótidos para la treonina desaminasa de E. coli L481 F que tenga un Phe que reemplace la Leu en posición 481.

La SEC ID NO: 16, representa una secuencia de polinucleótidos para una subunidad grande de AHAS ¡IvG. La SEC ID NO: 17, representa una secuencia de polinucleótidos para una subunidad pequeña de AHAS ilvM. La SEC ID NO: 18, representa una secuencia de polinucleótidos para un fragmento ¡IvG 5'. La SEC ID NO: 19, representa una secuencia de polinucleótidos para un péptido de tránsito a plástido SSU1 A de Arabidopsis. La SEC ID NO: 20, representa una secuencia de polinucleótidos para un fragmento ilvG 3'. La SEC ID NO: 21 , representa una variante de la secuencia de aminoácidos para la treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje. La SEC ID NO: 22, representa una secuencia de polinucleótidos para la treonina desaminasa OMR1 de Arabidopsis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un vegetal transgénico, cuyo genoma tiene un ácido nucleico aislado que codifica a una treonina desaminasa (TD), o a una subunidad de la misma, incluyendo mutantes y subunidades enzimáticamente funcionales. Una subunidad de treonina o treonina desaminasa tal es preferiblemente resistente a inhibición por L-isoleucina libre o por un análogo de aminoácido de isoleucina. Una modalidad preferida alternativa tiene el ácido nucleico que codifica a la treonina desaminasa, o a la subunidad de la misma, expresada de manera que el contenido de lie y el contenido de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe del vegetal incrementa indistintamente de diferencias o similaridades de características cinéticas o de inhibición de la treonina desaminasa nativa y exógena, o subunidad de la misma. Por ejemplo, usando la técnica bien conocida en la técnica, la enzima treonina desaminasa exógena podría ser causada para expresar predominantemente en compartimentos celulares que son separados de la localización de la enzima nativa. La expresión de la treonina desaminasa, o subunidad de ia misma, puede elevar el nivel de lie y elevar el nivel de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser y Phe en el vegetal sobre el nivel presente en la ausencia de dicha expresión. El ácido nucleico puede también codificar otras enzimas involucradas en la biosíntesis de isoleucina, por ejemplo, aspartato quinasa, homoserina deshidrogenasa-aspartato quinasa bifuncional, o ácido acetohidroxi sintasa. La presente invención también concierne a un método para obtener vegetales que produzcan niveles elevados de lie libre y niveles elevados de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe. Dicha sobreproducción resulta de la introducción y expresión de un ácido nucleico aislado que codifica a la treonina desaminasa. Además, la treonina desaminasa de soya nativa es sensible a la inhibición por retroalimentación por L-isoleucina y constituye un sitio de regulación de la ruta biosintética. Los métodos proporcionados en la presente invención pueden también ser usados para producir niveles crecientes de lie libre y niveles crecientes de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe en vegetales por introducción de un ácido nucleico que codifica a una treonina desaminasa que es resistente a dicha inhibición por retroalimentación. Dicha treonina desaminasa que codifica a los ácidos nucleicos pueden ser introducidos en una variedad de vegetales, incluyendo dicotiledóneas (por ejemplo, legumbres) así como también monocotiledóneas (por ejemplo, granos de cereal).

Definiciones En el contexto de esta descripción, deberán utilizarse numerosos términos. Los términos "polinucleótidos", "secuencia de polinucleótidos", "secuencia de ácido nucleico", "fragmento de ácido nucleico", y "fragmento de ácido nucleico aislado" son usados indistintamente en la presente. Estos términos abarcan secuencias de nucleótidos y las similares. Un polinucleótido puede ser un polímero de ARN o de ADN que es de una sola o de doble hebra, que opcionalmente contiene bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un polinucleótido en la forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos de cADN, ADN genómico, ADN sintético, o mezclas de los mismos. Como se usa en la presente, niveles "alterados" de lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe en un vegetal transformado, tejido vegetal, parte vegetal, o célula vegetal son niveles que son mayores o menores que los niveles encontrados en el vegetal, tejido vegetal, parte vegetal, o célula vegetal sin transformar correspondiente. En general, niveles "alterados" de lie y de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe son mayores que los niveles encontrados en el vegetal, tejido vegetal, o células vegetales sin transformar. El término "complementario a" es usado en la presente para querer decir que la secuencia de una hebra de ácido nucleico podría hibridizar a toda o a una porción, de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" tiene 100 % de identidad con una secuencia de referencia 5'-TATAC-3' pero que es 100 % complementaria a una secuencia de referencia 5'-TATAC-3'. El término "corresponde a" es usado en la presente para querer decir que un polinucleótido, por ejemplo, un ácido nucleico, es al menos parcialmente idéntico (no necesariamente de manera estricta evolutivamente relacionado) a toda o a una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Como se usa en la presente, "enzima desrregulada" se refiere a una enzima que ha sido modificada, por ejemplo, por mutagénesis, truncación y los similares, de modo que el grado de inhibición por retroalimentación de la actividad catalítica de la enzima por un metabolito es reducido de modo que la enzima exhibe actividad mejorada en la presencia del metabolito en comparación con la enzima sin modificar. Como se usa en la presente con respecto a la treonina desaminasa, la frase "un dominio del mismo" incluye un segmento estructural o funcional de una treonina desaminasa de extensión total. Un dominio estructural incluye una estructura identificable en la treonina desaminasa. Un ejemplo de un dominio estructural incluye una helicoidal alfa, una beta laminar, un sitio activo, un sustrato o sitio de enlace inhibidor, y los similares. Un dominio funcional incluye un segmento de una treonina desaminasa que realiza una función identificable tal como un núcleo aislado de enlace de isoleucina, un sitio activo o un sustrato, o sitio de enlace inhibidor. Los dominios funcionales de treonina desaminasa incluyen aquellas porciones de treonina desaminasa que pueden catalizar una etapa en la ruta biosintética de isoleucina. Por consiguiente, un dominio funcional incluye fragmentos y dominios activos enzimáticamente de treonina desaminasa. Los dominios mutantes de treonina desaminasa se contemplan también. Los ácidos nucleicos de treonina desaminasa de tipo salvaje utilizados para elaborar dominios mutantes incluyen, por ejemplo, cualquier ácido nucleico que codifica a un dominio de treonina desaminasa a partir de Escherichia coli, Salmonella typhimurium o Arabidopsis thaliana. Como se usa en la presente, una treonina desaminasa "exógena" es una treonina desaminasa que es codificada por un ácido nucleico que ha sido introducido en una célula huésped. Una treonina desaminasa "exógena" tal generalmente no es idéntica a cualquier secuencia de ADN presente en la célula en su estado nativo, sin transformar. Una treonina desaminasa "endógena" o "nativa" es una treonina desaminasa que está presente de manera natural en una célula u organismo huésped. Como se usa en la presente niveles "crecientes" o "elevados" de lie libre y de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe en una célula vegetal, tejido vegetal, parte vegetal, o vegetal, son niveles que son de aproximadamente 2 a 100 veces, preferiblemente de aproximadamente 5 a 50 veces, y más preferiblemente de aproximadamente 10-30 veces, los niveles encontrados en una célula vegetal, tejido vegetal, parte vegetal, o vegetal sin transformar, es decir, uno donde el genoma no ha sido alterado por la presencia de un ácido nucleico de treonina desaminasa exógena o dominios de ésta. Por ejemplo, los niveles de lie libre y de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe en una semilla transformada se comparan con los de una semilla vegetal precursora sin transformar o con una semilla sin transformar en un vegetal quimérico. Los nombres de los varios aminoácidos encontrados en vegetales y descritos en la presente invención, sus abreviaciones de 3 y de una letra, así como también codones de ADN que los codifican son proporcionados en el cuadro 1.

CUADRO 1 Nombres de los varios aminoácidos encontrados en vegetales, sus abreviaciones de 3 y de 1 letra, así como también los codones de ADN que los codifican.

Los ácidos nucleicos que codifican a una treonina desaminasa, y los ácidos nucleicos que codifican a un péptido de tránsito o genes marcadores/informadores son "aislados" porque fueron tomados de su fuente natural y no están más en la célula donde existen normalmente. Dichos ácidos nucleicos asilados pueden haber sido al menos parcialmente preparados o manipulados in vitro, por ejemplo, asilados de una célula en la cual se encuentran normalmente, purificados y amplificados. Dichos ácidos nucleicos aislados pueden también "recombinantes" porque han sido combinados con ácidos nucleicos exógenos. Por ejemplo, un ADN recombinante puede ser un ADN aislado que es unido operablemente a un promotor exógeno o a un promotor que sea endógeno para una célula huésped seleccionada. Como se usa en la presente, un gen o ácido nucleico "nativo" quiere decir que el gen o ácido nucleico no ha sido cambiado o manipulado in vitro, por ejemplo, es un gen o ácido nucleico de tipo salvaje que no ha sido aislado, purificado, amplificado, o mutado ¡n vitro. El término "plástido", se refiere a la clase de organelos celulares vegetales incluyendo amiloplastos, cloroplastos, elaioplastos, eoplastos, etioplastos, leucoplastos, y proplástidos. Estos organelos son autoreplicantes, y contienen lo que es comúnmente mencionado como un "genoma plástido", una molécula de ADN circular que varía de tamaño desde 120 a aproximadamente 217 kb, dependiendo de la especie vegetal, y la cual usualmente contiene una región de repetición invertida. Como se usa en la presente, "polipéptido" significa una cadena continua de aminoácidos que están todas unidas juntas por enlaces peptídicos, excepto para los aminoácidos N-terminal y C-terminal que tienen grupos amino y carboxilato, respectivamente, y que no están unidos en enlaces peptídicos. Los polipéptidos pueden tener cualquier extensión y pueden ser post-traslacionalmente modificados, por ejemplo, por glicosilación o fosforilación.

Como se usa en la presente, una célula vegetal, tejido vegetal, o vegetal que es "resistente o tolerante a la inhibición por un análogo de aminoácido de isoleucina" es una célula vegetal, tejido vegetal, o vegetal que retiene al menos aproximadamente 10 % más actividad de treonina desaminasa en la presencia de L-isoleucina o de un análogo de L-isoleucina, que una treonina desaminasa de tipo salvaje. En general, una célula vegetal, tejido vegetal, o vegetal que es "resistente o tolerante a la inhibición por isoleucina" puede crecer en una cantidad de un análogo de aminoácido de isoleucina que normalmente inhibe el crecimiento de la célula vegetal, tejido vegetal, o vegetal sin transformar, que se determina por metodologías conocidas en el arte. Por ejemplo, un vegetal endógamo convertido por retrocruzamiento homocigótico transformado con una molécula de ADN que codifica a una treonina desaminasa que es sustancialmente resistente o tolerante a la inhibición por un análogo de aminoácido de isoleucina crece en una cantidad de un análogo de aminoácido de isoleucina que inhibe el crecimiento, es decir, vegetal endógamo recurrente, sustancialmente isogénico. Como se usa en la presente, una treonina desaminasa que es "resistente o tolerante a la inhibición por isoleucina o por un análogo de isoleucina" es una treonina desaminasa que retiene más de aproximadamente 10 % más de actividad que la treonina desaminasa de "tipo salvaje" o nativa susceptible, cuando las treonina desaminasas tolerantes/resistentes y de tipo salvaje son expuestas a cantidades equivalentes de isoleucina o de un análogo de aminoácido de isoleucina. Preferiblemente la treonina desaminasa resistente o tolerante retiene más de aproximadamente 20 % más de actividad que una treonina desaminasa de "tipo salvaje" o nativa susceptible.

Conceptos generales El ácido nucleico de treonina desaminasa preseleccionado debe de ser primero aislado y, si no es de origen vegetal, debe de ser modificado ¡n vitro para incluir señales reguladores requeridas para expresión genética en células vegetales. El gen exógeno puede ser modificado para añadir secuencias que codifican a una secuencia de péptido de tránsito a plástido a fin de dirigir el producto genético a estos organelos. A fin de alterar la biosíntesis de lie y de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe, el ácido nucleico que codifica a treonina desaminasa resistente ("el gen") debe de ser introducido en las células vegetales y estas células transformadas del gen de sr identificadas ya sea directa o indirectamente. El gen puede ser incorporado establemente en el genoma de la célula vegetal. Las señales transcripcionales del gen deben de ser reconocidas y ser funcionales en las células vegetales. Esto es, deben de ser transcritas en ARN informador, y el mARN debe de ser estable en el núcleo vegetal y ser transportadas intactas al citoplasma por translación. El gen puede tener señales traslacionales apropiadas para ser reconocidas y trasladadas apropiadamente por ribosomas celulares vegetales.

El producto genético del polipéptido debe de escapar al ataque proteolítico significativo en el citoplasma y ser capaces de asumir una conformación tridimensional que confiere actividad enzimática. La treonina desaminasa puede funcionar adicionalmente en la biosíntesis de isoleucina y sus derivados; esto es, puede ser localizada cerca de las enzimas vegetales nativas que catalizan las etapas de flanqueo en la biosíntesis (presumiblemente en el plástido) a fin de obtener los sustratos requeridos y pasar sobre el producto apropiado. Aún si todas estas condiciones se satisfacen, la sobreproducción exitosa de lie y de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe no es un evento predecible. No deben de haber otros mecanismos de control compensadores para la regulación reducida en la etapa de treonina desaminasa. Esto significa no solamente ninguna inhibición diferente de la biosíntesis, sino también ningún mecanismo para incrementar la proporción de descomposición de los aminoácidos acumulados, lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe deben de ser sobreproducidos a niveles que no sean tóxicos al vegetal. Finalmente, el rasgo introducido debe de ser estable y hereditario a fin de permitir el desarrollo y el uso comercial.

Aislamiento e Identificación de Moléculas de Ácido Polinucleico que Codifican a una Treonina Desaminasa Los ácidos nucleicos que codifican a una treonina desaminasa pueden ser identificados y aislados por métodos estándares, como se describe en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2001 ). Los ácidos nucleicos que codifican a una treonina desaminasa pueden ser de cualquier especie procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica a una treonina desaminasa, o subunidad de ésta, puede ser identificado por cribado de una biblioteca de ADN genómico derivado de cualquier especie o por cribado de una biblioteca de cADN generada del ácido nucleico derivado de un tipo celular, línea celular, células primarias, o tejidos particulares. Ejemplos de bibliotecas útiles para identificar y aislar una treonina desaminasa incluyen, pero no se limitan a, una biblioteca de cADN derivada de una cepa A348 de A. tumefaciens, línea B73 endógama de maíz (Stratagene, La Jolla, California, Cat. # 97005, Clontech, Palo alto, California, Cat. # FL1032a, # FL11032b, y FL1032n), una biblioteca genómica de la línea MO17 de maíz endógarño (Stratagene, Cat. # 946102), una biblioteca genómica de la línea B73 de maíz endógamo (Clontech, Cat. # FL11032d), o una biblioteca genómica de una cepa conveniente de Escherichia coli o Salmonella typhimurium. Ejemplos de moléculas de polipéptidos o polinucleótidos de treonina desaminasa útiles para la práctica de la presente invención se describen en el Cuadro 2. Elgen (ilvA) de treonina desaminasa de tipo salvaje de E. coli (SEC ID NO: 1 ; gi:146450, acceso K03503, versión K03503.1) y su secuencia de polipéptidos correspondiente (SEC ID NO: 2) o una variante alélica que codifica a la SEC ID NO: 21 , es el gen base desde el cual se derivaron todos los otros mutantes alélicos descritos en el cuadro 2 siguiente. Los ácidos nucleicos que tienen secuencias relacionadas a estas moléculas de ácidos nucleicos de treonina desaminasa pueden ser obtenidos por métodos estándares, incluyendo clonación o reacción en cadena de polimerasa (RCP) usando cebadores de oligonucleótidos complementarios a regiones de secuencias de treonina desaminasa proporcionadas en la presente. La secuencia del ácido nucleico de treonina desaminasa aislado puede ser verificada por hibridización, análisis de secuencia parcial, o por expresión en una célula huésped apropiada.

CUADRO 2 Substituciones de aminoácidos de treonina desaminasa de E. coli ilvA en alelos mutantes El cribado para fragmentos de ADN que codifican toda o una porción de la secuencia que codifica a una treonina desaminasa puede lograrse por RCP, o por medio de placas de cribado a partir de una biblioteca de cADN o genómico usando procedimientos de hibridización. La sonda puede ser derivada de un gen de treonina desaminasa obtenida de ácidos nucleicos proporcionados en la presente o a partir de otros organismos. De manera alternativa, las placas de una biblioteca de expresión de cADN pueden ser cribadas por enlace a anticuerpos que enlazan específicamente a treonina desaminasa. Los fragmentos de ADN que hibridizan a las sondas de treonina desaminasa de otros organismos, y/o a placas portadoras de fragmentos de ADN que son inmunoreactivas con anticuerpos a treonina desaminasa, pueden ser subclonados en un vector y secuenciados y/o usados para identificar a otras secuencias de cADN o genómicas que codifican todo o una porción del gen de treonina desaminasa deseado. Una biblioteca de cADN puede ser preparada por aislamiento de mARN, generación de cADN, e inserción de cADN en un vector apropiado. La biblioteca que contiene fragmentos de cADN puede ser cribada con sondas o anticuerpos específicos para treonina desaminasa. Los fragmentos de ADN que codifican a una porción de un gen de treonina desaminasa pueden ser subclonados y secuenciados y usados como sondas para identificar un ácido nucleico de treonina desaminasa genómico. Los fragmentos de ADN que codifican a una porción de una treonina desaminasa procariótica o eucariótica pueden ser verificados por determinación de la homología de secuencia con otros genes de treonina desaminasa conocidos o por hibridización a ARN informador específico de treonina desaminasa. Una vez que se obtienen los fragmentos de cADN que codifican a porciones de los extremos 5', media y 3' de una treonina desaminasa, pueden ser usados como sondas para identificar y clonar una copia genómica completa del gen de treonina desaminasa a partir de una biblioteca genómica. Porciones de la copia o copias genómicas de un gen de treonina desaminasa pueden ser aisladas por la reacción encadena de polimerasa o por cribado de una biblioteca genómica. Los clones positivos pueden ser secuenciados y el extremo 5' del gen identificado por métodos estándares incluyendo ya sea homología de ácido nucleico u otros genes de treonina desaminasa o por análisis de protección de ARNasa, como se describe en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989 y 2001 ). Los extremos 3' y 5' del gen objetivo pueden también ser localizados por búsqueda computacional de bases de datos de secuencias genómicas usando regiones que codifican a treonina desaminasa. Una vez que se identifican las porciones del gen, pueden obtenerse copias completas del gen de treonina desaminasa por métodos estándares, incluyendo clonación o síntesis por la reacción en cadena de polimerasa (RCP) usando cebadores oligonucleótidos complementarios al ácido nucleico en el extremo 5' o 3' del gen. La presencia de una copia de extensión total aislada del gen de treonina desaminasa puede ser verificada por hibridización, análisis de secuencia parcial, o por expresión de la enzima treonina desaminasa. Los mutantes que tienen actividad de treonina desaminasa creciente, sensibilidad reducida por inhibición por retroalimentación por isoleucina o análogos de la misma, y/o la habilidad para generar cantidades crecientes de lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe en un vegetal son deseables. Dichos mutantes pueden tener un cambio funcional en el nivel o tipo de actividad que exhiben y son algunas veces mencionados como "derivados" de ácidos nucleicos de treonina desaminasa de tipo salvaje y polipéptidos. Sin embargo, la presente invención también contempla variantes de treonina desaminasa así como también ácidos nucleicos de treonina desaminasa con mutaciones "silenciosas". Como se usa en la presente, una mutación silenciosa es una mutación que cambia la secuencia de nucleótidos de la treoniria desaminasa pero que no cambia la secuencia de aminoácidos de la treonina desaminasa codificada. Una treonina desaminasa variante es codificada por un ácido nucleico mutante y la variante tiene uno o más cambios de aminoácidos que no cambian sustancialmente la actividad de treonina desaminasa en comparación con la treonina desaminasa de tipo salvaje correspondiente. La presente invención está dirigida a todos estos derivados, variantes, y ácidos nucleicos de treonina desaminasa con mutaciones silenciosas. Puede obtenerse ADN que codifica a una treonina desaminasa mutada que es resistente y/o tolerante a L-isoleucina o análogos de aminoácidos de isoleucina por varios métodos. Los métodos incluyen, pero no se limitan a: 1. Variaciones espontáneas y selección directa de mutantes en cultivos; 2. Procedimientos de mutagénesis directa o indirecta en cultivos de tejidos de cualquier tipo celular o tejido, semillas o vegetales; 3. Mutación del gen de la treonina desaminasa clonada por métodos tales como por mutagénesis química; mutagénesis específica puntual o en sitio específico Sambrook y colaboradores, citada en supra), mutagénesis mediada por transposón (Berg y colaboradores, Biotechnology, 1 :417 (1983)), y mutagénesis de eliminación (Mitra y colaboradores, Molec. Gen. Genetic., 215:294 (1989)); 4. Diseño racional de mutaciones en residuos claves; y 5. Redistribución de ADN para incorporar mutaciones de interés en varios ácidos nucleicos de treonina desaminasa. Por ejemplo, la información estructural proteínica y/o genética a partir de proteínas de treonina desaminasa disponibles pueden ser usadas para diseñar racionalmente mutantes de treonina desaminasa que tengan una alta probabilidad de tener actividad creciente o sensibilidad reducida para isoleucina o análogos de isoleucina. Dicha información estructural de proteínas está disponible, por ejemplo, sobre la treonina desaminasa de E. coli (Gallagher y colaboradores, Structure, 6:465-475 (1998)). El diseño racional de mutaciones pueden lograrse por alineación de la secuencia de aminoácidos de treonina desaminasa seleccionaos con la secuencia de aminoácidos de treonina desaminasa de una treonina desaminasa de estructura conocida, por ejemplo, E. coli. La isoleucina predicha que enlaza y cataliza regiones de la proteína de treonina desaminasa puede ser asignada combinando el conocimiento de la información estructural con la homología de secuencia. Por ejemplo, residuos en el núcleo aislado que enlaza a isoleucina pueden ser identificados como candidatos potenciales para mutación para alterar la resistencia de ia enzima a la inhibición por retroalimentación por isoieucina. Usando dicha información estructural, varios mutantes de treonina desaminasa de E. coli fueron diseñados racionalmente en el sitio o dominio involucrado en el enlace de ¡soleucina. Más específicamente, análogos de aminoácidos en L481 en la treonina desaminasa de E. coli son residuos útiles potencialmente por mutación para producir treoninas desaminasas activas que puedan tener menos sensibilidad hacia la inhibición por retroalimentación de isoleucina. La presente invención contempla cualquier sustitución de aminoácidos en cualquiera de estas posiciones. Alternativamente, el aminoácido en cualquiera de estas posiciones puede ser eliminado así como también sustituido. Puede usarse la mutagénesis específica puntual para generar sustituciones, eliminaciones e inserciones de aminoácidos en una variedad de sitios. Ejemplos de mutaciones específicas hechas en la región que codifica a treonina desaminasa de E. coli incluyen las siguientes: en aproximadamente la posición 447 reemplazo de Leu con Phe (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 3); en aproximadamente la posición 481 reemplazo de Leu con Phe (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 4); en aproximadamente la posición 481 reemplazo de Leu con Tyr (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 5); en aproximadamente la posición 481 reemplazo de Leu con Pro (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 6); en aproximadamente la posición 481 reemplazo de Leu con Glu (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 7); en aproximadamente la posición 481 reemplazo de Leu con Thr (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 8); en aproximadamente la posición 481 reemplazo de Leu con Gln (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 9); en aproximadamente la posición 481 reemplazo de Leu con lie (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 10); en aproximadamente la posición 481 reemplazo de Leu con Val (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 11); en aproximadamente la posición 481 reemplazo de Leu con Met (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 12); en aproximadamente la posición 481 reemplazo de Leu con Lys (ver, por ejemplo, la SEC ID NO: 13); Pueden hacerse mutaciones similares en posiciones análogas de cualquier treonina desaminasa por alineación de la secuencia de aminoácidos de la treonina desaminasa a ser mutada con una secuencia de aminoácidos de treonina desaminasa de E. coli. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de treonina desaminasa de E. coii que puede ser usada para alineación es la SEC ID NO: 1. Los mutantes útiles pueden también ser identificados por mutagénesis clásica y selección genética. Un cambio funcional puede ser detectado en la actividad de la enzima codificada por el gen por exposición de la enzima a L-isoleucina libre o a análogos de aminoácidos; o por detección de un cambio en la molécula de ADN usando mapeo de enzimas de restricción o por análisis de secuencia de ADN. Por ejemplo, un gen que codifica a una treonina desaminasa sustancialmente tolerante a isoleucina puede ser aislado de una línea celular que sea tolerante a un análogo de isoleucina. Resumiendo, cultivos celulares vegetales diferenciados parcialmente son desarrollados y subcultivados con exposición continua a bajos niveles del análogo de isoleucina. La concentración del análogo de isoleucina es entonces aumentada gradualmente durante varios intervalos de subcultivo. Las células o tejidos que crecieron en la presencia de niveles normalmente tóxicos del análogo son subcultivados repetidamente en la presencia del análogo y caracterizados. La estabilidad del aspecto de tolerancia de las células cultivadas pueden ser evaluadas por crecimiento de las líneas celulares seleccionadas en la ausencia del análogo por períodos variables de tiempo y luego analizar el crecimiento después de la exposición del tejido al análogo. Las líneas celulares son tolerantes en virtud de tener una enzima de treonina desaminasa alterada, pueden ser seleccionadas por identificación de líneas celulares que tengan actividad enzimática en la presencia de niveles del análogo de isoleucina normalmente tóxicos, es decir, inhibidor del crecimiento. El gen de treonina desaminasa clonado desde una línea celular resistente al análogo de isoleucina puede ser evaluado por tolerancia al mismo o a otro análogo de aminoácido Por métodos estándares, como se describe en la Patente U.S. 4,581 ,847, cuya descripción se incorpora a la presente como referencia. Líneas celulares con una treonina desaminasa que tenga sensibilidad reducida a análogos de isoleucina pueden ser usadas para aislar una treonina desaminasa resistente a la retroalimentación. Una biblioteca de ADN de una línea celular tolerante a un análogo de isoleucina puede ser generado y los fragmentos de ADN que codifican doto o una porción del gen de treonina desaminasa puede ser identificado por hibridización a una sonda de cADN que codifica a una porción de un gen de treonina desaminasa. Puede obtenerse una copia completa del gen alterado por medio de procedimientos de clonación o por síntesis por RCP usando cebadores apropiados. El aislamiento del gen alterado que codifica para treonina desaminasa puede ser confirmado en células vegetales transformadas por determinación de si la treonina desaminasa que es expresada retiene actividad enzimática cuando se expone a niveles normalmente tóxicos del análogo de isoleucina. Ver, por ejemplo, Andersson y colaboradores, Patente U.S. 6,118,047. Las regiones codificadoras de cualquier molécula de ADN proporcionadas en la presente pueden también ser optimizadas por expresión en un microorganismo seleccionado, por ejemplo, un vegetal u otro tipo de célula huésped seleccionada. La generación de variantes de treonina desaminasa que son desreguladas por isoleucina se describe también en las Patentes U.S. 5,942,660 y 5,958,745 por Guys y colaboradores, por Asrar y colaboradores, Patentes U.S. 6,091 ,002 y 6,228,623; y por Slater y colaboradores, Nature Biotechnology, 17:1011 (1999).

Transgenes y Vectores Una vez que un ácido nucleico que codifica, por ejemplo, treonina desaminasa o un dominio de la misma, se obtiene y amplifica, es operablemente unido a un promotor y opcionalmente, unido con otros elementos para formar un transgen. La mayoría de los genes tienen regiones que son conocidas como promotoras y que regulan la expresión genética. Las regiones promotoras se encuentran típicamente hacia arriba de la secuencia codificadora en células tanto eucarióticas como procarióticas. Se proporciona una secuencia promotora para regulación de la transcripción de la secuencia genética corriente abajo e incluye típicamente desde aproximadamente 50 a aproximadamente 50 a aproximadamente 2,000 pares de bases de nucleótidos. Las secuencias promotoras también contienen secuencias reguladoras tales como secuencias mejoradoras que pueden influir en el nivel de expresión genética. Algunas secuencias promotoras aisladas se pueden proporcionar para expresión genética, esto es, un gen diferente del gen homólogo o nativo. Las secuencias promotoras se conocen también por ser fuertes o débiles o inducibles. Se proporciona un promotor fuerte para un alto nivel de expresión genética, mientras que un promotor débil se proporciona para un nivel de expresión genética muy bajo. Un promotor inducible es un promotor que permite comenzar o detener la expresión genética en respuesta a un agente añadido exógenamente o a un estímulo de desarrollo o ambiental. Los promotores pueden también proporcionarse para regulación de desarrollo o específico de tejido. Un promotor fuerte que se proporciona para un nivel suficiente de expresión genética y facilita la detección y la selección de células transformadas, puede ser ventajoso. También, un promotor fuerte tal puede proporcionar niveles altos de expresión genética cuando se desee. El promotor es un transgen de la presente invención se puede proporcionar para expresión de un gen de interés, por ejemplo treonina desaminasa de un ácido nucleico que codifica a treonina desaminasa. Preferiblemente, la secuencia codificadora es expresada para dar como resultado un incremento en la tolerancia de las células vegetales a inhibición por retroalimentación por L-isoleucina libre para dar como resultado un incremento en la lie total y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe contenidos en las células. El promotor puede también ser inducible de modo que la expresión genética pueda ser iniciada o detenida por medio de un agente añadido exógenamente. Puede también ser deseable combinar la región codificadora con un promotor que proporciona expresión genética en vegetales regulada por medio del desarrollo o expresión específica de tejido. Loas promotores útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, promotores virales, plástidos, bacterianos, bacteriófagos o vegetales. Los promotores útiles incluyen al promotor CaMV 35S (Odell y colaboradores, Nature, 313.810 (1985)), el promotor CaMV 19S (Lawton y colaboradores, Plant Mol. Biol. 9:31 F (1987), nos (Ebert y colaboradores, Procc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:5745 (1987)), Adh (Walkers y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci (U.S.A.), 84:6624 (1987), sacarosa sintasa (Yang y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.), 87:4144 (1990)), a-tubulina, napina, actina (Wang y colaboradores, Mol. Cell. Biol., 12:3399 (1992)), cab (Sullivan y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 215:431 (1989)), el promotor de PEPCase (Hundspeth y colaboradores, Plant Mol. Biol., 12:579 (1989)), el promotor de 7Sa' con glicina (Beachy y colaboradores, EMBO J., 4:3047 (1985)), o aquellos asociados con el complejo del gen R (Chandler y colaboradores, The Plant Cell, 1:1175 (1989)). Los promotores preferidos incluyen promotores mejorados de semillas, por ejemplo, 7sa', 7sa, Iea9 de soya, perl de Arabidopsis y napina de Brassica napin. Se contempla que otros promotores útiles en la práctica de la presente invención están disponibles para ios expertos en la técnica.

Pueden usarse también los promotores. La mayoría de los genes de plástidos contienen un promotor para la ARN polimerasa codificada por plástido con subunidad múltiple (PEP) así como también la ARN polimerasa codificada por la subunidad nuclear individual y listado de secuencias de promotores específicos para varios genes plástidos nativos pueden ser encontrados en Hajdukiewicz y colaboradores, EMBO J., 16:4041-4048 (1997), el cual se incorpora íntegramente a la presente como referencia. Los ejemplos de promotores de plástidos que pueden ser usados incluyen el promotor RRN de plástido de Zea mays (ZMRRN). El promotor ZMRRN puede conducir la expresión de un gen cuando está presente la ARN polimerasa de plástido de Arabidopsis thaliana. Promotores similares que pueden ser usados en la presente invención son el RRN de plástido de Glicina max (SOYRRN) y los promotores RRN de plástido de Nicotina tabacum (NTRRN). Los tres promotores pueden ser reconocidos por la ARN polimerasa de plástido de Arabidopsis. Los aspectos generales de los promotores RRN se describen en la Patente U.S. 6,218,145. Además, pueden usarse mejoradores de transcripción o duplicados de mejoradores para incrementar la expresión a partir de un promotor particular. Ejemplos de dichos mejoradores incluyen, pero no se limitan a elementos del promotor de CaMV 35S y genes de octopina sintasa (Last y colaboradores, Patente U.S. 5,290,924). Por ejemplo, se contempló que vectores para uso de conformidad con la presente invención pueden ser construidos para incluir el elemento mejorador oes. Este elemento fue primero identificado como un mejorador palindrómico de 16 pb a partir del gen de octopina sintasa (oes) de Agrobacterium (Ellis y colaboradores, EMBO J., 6:3203 (1987), y está presente en al menos 10 promotores diferentes (Bouchez y colaboradores, EMBO J., 8:4197 (1989)). Se propuso que el uso de un elemento mejorador, tal como el elemento oes y particularmente copias múltiples del elemento, actuarán para incrementar el nivel de transcripción desde promotores adyacentes cuando se aplican en el contexto de la transformación monocotiledónea. Promotores específicos de tejido, que incluyen pero no se limitan a, promotores de células de raíces (Conling y colaboradores, Plant Physiol., 93:1203 (1990)), y mejoradores específicos de tejido (Fromm y colaboradores, The Plant Cell, 1 :977 (1989)), se contemplan también para ser particularmente útiles, como son promotores útiles tales como promotores ¡nducibles de turgencia y de ABA, y los similares. Cuando la secuencia de ADN entre el sitio de iniciación de transcripción y el inicio de la secuencia de codón, es decir, la secuencia líder sin trasladar, puede influir la expresión genética, uno puede también desear emplear una secuencia líder particular. Se contempla que secuencias líderes preferidas incluyan secuencias predichas para dirigir la expresión óptima del gen fijado, es decir, incluir una secuencia líder consensus preferida que pueda incrementar o mantener la estabilidad de mARN y prevenir la iniciación inapropiada de la traslación (Joshi, Nucí. Acid Res., 14:6643 (1987)). La selección de dichas secuencias puede hacerse fácilmente por los expertos en la materia. Se prefieren secuencias que se derivan de genes que son muy expresados en dicotiledóneas y en soya en particular. Los ácidos nucleicos que codifican al gen de interés, por ejemplo, treonina desaminasa, pueden incluir también un péptido de tránsito a plástido para facilitar el transporte del polipéptido de treonina desaminasa en plástidos, por ejemplo, en cloroplastos. Un ácido nucleico que codifica al péptido de tránsito a plástido seleccionado está generalmente unido en estructura con la secuencia codificadora de la treonina desaminasa. No obstante, el péptido de tránsito a plástido puede ser colocado ya sea en el extremo N-terminal como en el C-terminal de la treonina desaminasa. Las construcciones incluirán también el ácido nucleico de interés junto con el ácido nucleico en el extremo 3' que actúa como una señal para terminar la transcripción y permitir la poliadenilación del mARN resultante. Ejemplos de elementos 3' incluyen aquellos del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Bevan y colaboradores, Nucí. Acid. Res., 11 :369 (1983)), El terminador para el transcrito T7 del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, y el extremo 3' de los genes inhibidos por el inhibidor II de proteasa de papa o tomate, aunque otros elementos 3' conocidos por los expertos en la materia se contemplan también. Elementos reguladores tales como el intron 1 de Adh (Callis y colaboradores, Genes Develop., 1 :1183 (1987)), el intrón de sacarosa sintasa (Vasil y colaboradores, Plant Physiol., 91 : 5175 (1989)), o el elemento TMV omega (Gallie y colaboradores, The Plant Cell, 1 :301 (1989) puede ser incluido adicionalmente donde se desee. Estas secuencias reguladoras no trasladadas de 3' pueden ser obtenidas como se describe en An, Methods in Enzymology, 153:292 (1987) o están ya presentes en plásmidos disponibles desde fuentes comerciales tales como Clontech, Palo Alto, California. Las secuencias reguladoras no trasladadas de 3' pueden ser unidas operablemente al terminus 3' de un gen de treonina desaminasa por métodos estándares. Dichos elementos reguladores diferentes útiles en la práctica de la presente invención están disponibles en y pueden ser usados por los expertos en la materia. Genes marcadores seleccionares o genes informadores son también útiles en la presente invención. Dichos genes pueden impartir un fenotipo distinto a células que expresan al gen marcador y permitir así que dichas células transformadas sean distinguidas de células que no tengan el marcador. Los genes marcadores seleccionares confieren un rasgo que uno puede "seleccionar" por medios químicos, es decir, a través del uso de un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico o los similares). Los genes informadores o genes cribables, confieren un rasgo que uno puede identificar a través de la observación o prueba, es decir por "cribado" (por ejemplo, el rasgo R-locus). Por supuesto, muchos ejemplos de genes marcadores adecuados se conocen en la técnica y pueden ser empleados en la práctica de la presente invención. Marcadores seleccionares posibles para uso en conexión con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, un gen neo (Potrykus y colaboradores, Mol. Gen. Genet., 199:183 (1985)) que codifica para resistencia a neomicina y puede ser seleccionadopor el uso de neomicina, kanamicina, G418, y los similares; un gen bar que codifica para resistencia a bialafos; un gen que codifica una proteína sintasa de EPSP (Hinchee y colaboradores, Biotech., 6:915 (1988)) confiriendo así resistencia a glicosato; un gen nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia a bromoxinil (Stalker y colaboradores, 242:419 (1988)); un gen de acetolactato sintasa mutante (ALS) que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea u otros productos químicos que inhiben ALS (EP 0 154 204); un gen de DHFR resistente a metotrexate (Thillet y colaboradores, J. Biol. Chem., 263:12500 (1988)); un gen de dalapon deshidrogenasa que confiere resistencia al herbicida dalapon; o un gen de treonina desaminasa mutada que confiere resistencia a 5-metil isoleucina. Cuando se emplea un gen de EPSP sintasa mutante, un plástido adecuado o péptido de tránsito a cloroplasto (CTP) se fusionaría a la región codificadora de EPSPS. En una modalidad, el marcador seleccionable es resistencia a N-fosfonometil glicina, comúnmente mencionada como glifosato. El glifosato inhibe la ruta del ácido shiquímico que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos que incluyen aminoácidos y vitaminas. Específicamente, el glifosato inhibe la conversión del ácido fosfoenolpirúvico y ácido 3-fosfoshiquímico a ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico por inhibición de la enzima del ácido 5-enolpiruvil- 3- fosfoshiquímico sintasa (EPSP sintasa o EPSPS). Se mostró que vegetales resistentes a glifosato pueden ser producidos por inserción en el genoma del vegetal la capacidad de producir niveles más altos de EPSP sintasa cuya enzima es preferiblemente tolerante al glifosato (Shah y colaboradores, Science, 233:478-481 (1981)). Variantes de la enzima EPSPS de tipo salvaje se han aislado, que son tolerantes al glifosato como un resultado de alteraciones en la secuencia que codifica al aminoácido de EPSPS. Ver, Kishore y colaboradores, Ann. Rev. Biochem., 57:627-663 (1988); Schulz y colaboradores, Arch. Microbiol., 137:121-123 (1984); Sost y colaboradores, FEBS Lett., 173: 238-241 (1984); Kishore y colaboradores, Fed. Proc., 45:1506 (1986). La introducción en vegetales de un ácido nucleico que codifica a una EPSP sintasa tolerante a glifosato o a una enzima de degradación de glifosato puede hacer al vegetal tolerante a glifosato. Están disponibles métodos para elaborar vegetales tolerantes a glifosato, por ejemplo, en la Patente U.S. 5,776,760 y 5,627,061 ; y WO 92/00377, cuyas descripciones se incorporan a la presente como referencia. Otra modalidad ilustrativa de un gen marcador seleccionable capaz de ser usado en sistemas para seleccionar transformantes es el gen que codifica a la enzima fosfinotricin acetiltransferasa, tal como el gen bar de Streptomyces hygroscopicus o el gen pat de Streptomyces viridochromogenes (Patente U.S. 5,550,318). La enzima fosfinotricin acetil transferasa (PAT) inactiva al ingrediente activo en el herbicida bialafos, fosfinotricina (PPT). PPT inhibe a la glutamina sintetasa, (Murakami y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 205:42 (1986); Twell y colaboradores, Plant Physiol., 91 :1270 (1989) que causa acumulación rápida de amoníaco y muerte celular.

Marcadores cribables que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, una ß-glucuronidasa o gen uidA (GUS) que codifica a una enzima para la cual son conocidos varios sustratos cromogénicos; un gen R-locus, que codifica á un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta y colaboradores, en Chromosome Structure and Function, pag. 263-282 (1988); un gen de ß-lactamasa (Sutcliffe, Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.), 75:3737 (1978)), que codifica a una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen xyIE. (Zukowsky y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. (U.S.A.), 80:1101 (1983)) que codifica a un catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen a-amilasa (Ikuta y colaboradores, Biotech., 8:241 (1990)); un gen de tirosinasa (Katz y colaboradores, J. Gen. Microbiol., 129:2703 (1983)) que codifica a una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa para formar la melanina compuesta detectable fácilmente; un gen ß-galactosidasa, que codifica a una enzima para la cual hay sustratos cromogénicos; un gen de luciferasa (lux) (Ow y colaboradores, Science, 234:856 (1986)), que permite la detección por bioluminiscencia; o aún un gen de aequorin (Prasher y colaboradores, Biochem Biophys. Res. Comm., 126:1259 (1985)), que pueden ser empleados en detección por bioluminiscencia sensible al calcio, o un gen de proteína fluorescente verde (Niedz y colaboradores, Plant Cell Reports, 14:403 (1995)). La presencia del gen lux en células transformadas puede ser detectada usando, por ejemplo, película de rayos X, conteo por centelleo, espectrofotometría fluorescente, cámaras de video de luz baja, cámaras por conteo de fotones, o luminometría multipocillo. Se contempló también que este sistema puede ser desarrollado por cribado de poblaciones por bioluminiscencia, tal como sobre placas de cultivo de tejido, o aún para cribado vegetal completo. De manera adicional, los transgenes pueden ser construidos y empleados para proporcionar la llegada del producto genético a un compartimento intracelular en células vegetales o para dirigir una proteína al medio extracelular. Esto se logrará generalmente uniendo un ácido nucleico que codifica a una secuencia de péptido de señal o de tránsito a la secuencia codificadora de un gen particular. El péptido, o señal, de tránsito resultante, transportará la proteína a un destino intracelular o extracelular particular, respectivamente. En muchos casos el péptido, o señal, de tránsito es removido después de facilitar el transporte de la proteína en un compartimento celular. Los péptidos de señal o de tránsito actúan facilitando el transporte de proteínas a través de membranas intracelulares, por ejemplo, vacuola, vesícula, plástido, y membranas mitocondriales, mientras que los péptidos de señal dirigen las proteínas a través de la membrana extracelular. Facilitando el transporte de la proteína en compartimentos adentro o afuera de la célula, estas secuencias pueden incrementar la acumulación del producto genético. Un ejemplo particular de un uso tal concierne a la dirección del gen de interés, por ejemplo, una treonina desaminasa a un organelo particular tal como el plástido preferiblemente al citoplasma. Esto es ejemplificado por el uso del péptido de tránsito SSU1A de Arabidopsis, que confiere objetividad específica hacia el plástido de proteínas. De manera alternativa, el transgen puede comprender un ácido nucleico que codifica a un péptido de tránsito a plástido o un ácido nucleico que codifica al péptido de tránsito rbcS (RuBISCO) operablemente unido entre un promotor y el ácido nucleico que codifica a una treonina desaminasa (para una revisión de péptidos que terminan en plástidos, ver Heijne y colaboradores, Eur. J. Biochem, ,180:535 (1989); Keegstra y colaboradores, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40:471 (1989)). Si el transgen es para ser introducido en una célula vegetal, el transgen puede contener también terminación transcripcional vegetal y señales de poliadenilación y señales traslacionales unidas ai terminus 3' de un gen de treonina desaminasa vegetal. Puede usarse un péptido de tránsito a plástido que no sea codificado en un gen de treonina desaminasa vegetal nativo. Un péptido de tránsito a plástido es típicamente de 40 a 70 aminoácidos de extensión y funciona post-traslacionalmente para dirigir una proteína al plástido. El péptido de tránsito es fragmentado ya sea durante o justo después de importar en el plástido para producir la proteína madura. La copia completa de un gen que codifica a una treonina desaminasa vegetal puede contener una secuencia de péptido de tránsito a plástido. En ese caso, puede no ser necesario combinar una secuencia de péptido de tránsito a plástido exógenamente en el transgen. Pueden obtenerse secuencias que codifican al péptido de tránsito a plástido exógeno a partir de una variedad de genes nucleares vegetales, mientras que los productos de los genes son expresados como pre-proteínas que comprenden un péptido de tránsito amino terminal y son transportados en un plástido seleccionado. Ejemplos de productos genéticos vegetales conocidos por incluir dichas secuencias de péptido de tránsito incluyen, pero no se limitan a, la subunidad pequeña de bifosfato de ribulosa carboxilasa, ferredoxina, proteínas de enlace a/b de clorofila, proteínas ribosómicas de cloroplasto codificadas por genes nucleares, ciertas proteínas de choque cefálico, enzimas biosintéticas de aminoácidos tales como ácido acetolactato sintasa, 3-enolpiruvilfosfoshiquimato sintasa, dihidrodipicolinato sintasa, y los similares, De manera alternativa, el fragmento de ADN que codifica para el péptido de tránsito puede ser sintetizado químicamente ya sea integralmente o en parte de las secuencias de péptidos de tránsito conocidas tales como las enlistadas posteriormente. Independientemente de la fuente del fragmento de ADN que codifica para el péptido de tránsito, se incluirá un codón de iniciación de traslación y será expresado como una secuencia de aminoácidos que es reconocida por y funcionará apropiadamente en plástidos del vegetal huésped. Se dará atención también a la secuencia de aminoácidos en la unión entre el péptido de tránsito y la enzima treonina desaminasa, donde es fragmentada para producir la enzima madura. Ciertas secuencias de aminoácidos conservadas han sido identificadas y muchas sirven como una guía. La fusión precisa de la secuencia que codifica al péptido de tránsito con la región que codifica a la treonina desaminasa puede requerir manipulación de uno o de ambos ácidos nucleicos para introducir, por ejemplo, un sitio de restricción conveniente. Esto puede lograrse por medio de métodos que incluyen mutagénesis específica puntual, inserción de enlazadores de oligonucleótidos sintetizados químicamente, y los similares. Una vez obtenida la secuencia del péptido de tránsito a plástido puede ser enlazada apropiadamente al promotor y a una región que codifica a la treonina desaminasa en un transgen usando métodos estándares. Un plásmido que contenga un promotor funcional en células vegetales y que tenga sitios de clonación múltiples corriente abajo puede ser construido u obtenido desde fuentes comerciales. La secuencia del péptido de tránsito a plástido puede ser insertado corriente abajo del promotor usando enzimas de restricción. Una región que codifica a la treonina desaminasa puede entonces ser insertada inmediatamente corriente debajo de y en marco con el 3' terminus de la secuencia del péptido de tránsito a plásmido, de modo que el péptido de tránsito a plástido es translacionalmente fusionado a amino terminus de la treonina desaminasa. Una vez que es formado, el transgen puede ser subclonado en otros plásmidos o vectores. Se contempló que la llegada del producto genético a un compartimento intracelular en células vegetales puede lograrse también por liberación dirigida de un gen al compartimento celular. Por ejemplo, la transformación del plástido de vegetales se ha descrito por Maliga (Current Opinión in Plant Biology, 5:164-172 (2002)); Heifetz (Biochimie, 82:655-666 (2000)); Bock (J. Mol. Biol., 312: 425-438 (2001)); y Daniell y colaboradores, (Trends in Plant Science 7:84-91 (2002)). Después de construir un trasngen que contenga un gen de treonina desaminasa y/u otro gen de interés, el cassette puede entonces ser introducido en una célula vegetal. Dependiendo del tipo de célula vegetal, el nivel de expresión genética, y la actividad de la enzima codificada por el gen, introducción del ADN que codifica a una treonina desaminasa en la célula vegetal puede conferir tolerancia a isoleucina o un análogo de aminoácido de isoleucina, y alterar el contenido de isoleucina de la célula vegetal. Varias construcciones contempladas en la presente invención se describen en el cuadro 3.

CUADRO 3 Uso de Combinaciones de Ácidos Nucleicos Una combinación de la presente invención involucra la combinación de un ácido nucleico que codifica a una treonina desaminasa con los genes ilvG y/o ilvM de E. coli, los cuales codifican a AHAS II (ácido acetohidroxi sintasa). Dichas enzimas ácido acetoxihidroxi sintasa no son sometidas a inhibición por retroalimentación de aminoácidos y tienen una preferencia por 2-acetobutirato como un sustrato. En una modalidad, la actividad es confinada a un polipéptido de fusión individual. Otra modalidad involucra la combinación de un aspartato quinasa-homoserina deshidrogenasa (AK-HSDH) insensible a aminoácidos con treonina desaminasa y potencialmente con AHASIL. En una modalidad, el gen thrA1 mutante de S. marcescens, (Omori y Komatubara, J. Bact., 175:959 (1993)es el alelo de AK-ASDH. Estos ácidos nucleicos pueden ser fusionados translacionalmente a péptidos de tránsito a plástidos. La enzima AHAS es conocida por estar presente en todas los vegetales superiores, así como también que se encuentran en una variedad de microorganismos, tales como la levadura Saccharomyces cerevisiae, y la bacteria entérica, E. coli y Salmonella typhimurium (Patente U.S. 5,731 , 180).La base genética para la producción de AHAS normal en numerosas de estas especies han sido también bien caracterizada. Por ejemplo, en ambos E. coli y Salmonella typhimurium existen tres isozimas de AHAS; dos de estos son sensibles a herbicidas mientras que el tercero no lo es. Cada uno de estas isozimas poseen una subunidad proteínica pequeña y una grande; y mapeo en los operones IMH, llvGM e llvBN. En levaduras, la isozima AHAS individual ha sido mapeada en el locus ILV2. En cada caso, se identificaron las formas sensibles y resistentes y se determinaron I as secuencias de los varios alelos (Friden y colaboradores, Nucí. Acid. Res., 13:3979-3998 (1985); Lawther y colaboradores, PNAS USA, 78:922-928 (1982); Squires y colaboradores, Nucí. Acids Res., 811 :5299-5313 (1983); Wek y colaboradores, Nucí. Acids. Res., 13:4011-4027 (1985); Falco y Dumas, Genetics, 109: 21-35 (1985); Falco y colaboradores, Nucí. Acids Res., 13:4011-4027 (1985)). En tabaco la función de AHAS es codificada por dos genes sin unión, SuRA y SuRB. Hay una sustancial identidad entre los dos genes, ambos al nivel de nucleótidos y al nivel de aminoácidos en la proteína madura, aunque la región de tránsito putativa, N- terminal difiere más sustancialmente (Lee y colaboradores, EMBO J., 7:1241-1248 (1988). Arabidopsis, por otro lado tiene un gen de AHAS individual, el cual ha sido también completamente secuenciado (Mazur y colaboradores, Plant Physiol., 85:1110-1117 (1987). Las comparaciones entre secuencias de genes de AHAS en vegetales superiores indican un alto nivel de conservación de ciertas regiones de la secuencia; específicamente, hay al menos 10 regiones de conservación de secuencias. Se ha asumido previamente que estas regiones conservadas son críticas para la función de la enzima, y que la retención de esa función es dependiente de la conservación sustancial de la secuencia. Por consiguiente, la presente invención contempla la sobre-expresión de AHAS en vegetales para incrementar el nivel de lie y de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe en ellos. La aspartato quinasa (AK) es la enzima que cataliza la primera etapa en la biosíntesis de treonina, isoleucina, lisina, y metionina. La biosíntesis de la familia aspartato de aminoácidos en vegetales tiene lugar en los plástidos, (ver, Bryan (1980) In: The Biochemistry of Plants, Vol. 5, B. Miflin (Ed.) Academic Press, NY, p. 403). Se ha mostrado previamente que la sobre-expresión de una treonina desregulada aumenta en los niveles intracelulares de L-treonina libre en la hoja en 55 % (Shaul y Galili, Plant Physiol., 100:1157 (1992)), y en la semilla en 15 veces (Karchi y colaboradores, Plant J., 3:721 (1993)). La sobre-expresión ya sea de una aspartato quinasa desregulada o de tipo salvaje incrementará los grupos disponibles de treonina libre en los plástidos. Cuando se combina con la sobre-expresión de una treonina desaminasa de tipo salvaje, mutante o desregulada, la cantidad de treonina convertida a isoleucina es creciente. Además de aspartato quinasa (AK), homoserina deshidrogenasa (HSD) y treonina sintasa pueden ser usadas para incrementar adicionalmente los niveles de treonina libre. Aspartato quinasas desreguladas útiles en la presente invención pueden poseer un nivel de insensibilidad a la treonina de modo que a la concentración de Km de aspartato en la presencia de 0.1 mM de treonina, la enzima aspartato quinasa exhibe más de 10 % de actividad en relación a las condiciones de ensayo en la cual está ausente la treonina. Homoserinas deshidrogenasas desreguladas útiles en la presente invención preferiblemente poseen un nivel de insensibilidad a la treonina de modo que a concentraciones de 0.1 mM de treonina y Km de aspartato semialdehido, las enzimas exhiben más de 10 % de actividad en relación a las condiciones de ensayo en las cuales la treonina está ausente. Los valores de Vma? para las enzimas aspartato quinasa y homoserina deshidrogenasa pueden caer en el intervalo de 0.1 - 100 veces que los de sus enzimas de tipo salvaje correspondientes. Los valores de Km para las enzimas aspartato quinasa y homoserina deshidrogenasa pueden caer en el intervalo de 0.01 - 10 veces el de sus enzimas de tipo salvaje correspondientes. Treonina sintasa, la enzima responsable de convertir fosfohomoserina a treonina, se ha mostrado que mejora el nivel de treonina aproximadamente 10 veces encima del nivel endógeno cuando es sobre-expresada en Methylobacillus glycogenes (Motoyama y colaboradores; Appl. Microbiol. Biotech., 42:67 (1994)). Además, treonina sintasa de E. coli sobre-expresada en cultivos celulares de tabaco da como resultado un nivel de treonina 10 veces mejorado a partir de un incremento de 6 veces en la actividad total de treonina sintasa (Muhitch, Plant Physiol., 108 (2 Suppl.): 71 (1995)). Por consiguiente, la presente invención contempla la sobre-expresión de treonina sintasa en vegetales para incrementar el nivel de treonina en ellas. Esta puede ser empleada en la presente invención para asegurar un suministro mejorado de treonina para la producción de lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe por medio de treonina desaminasa.

Transformación de Células Huéspedes Un transgen que comprende un gen de interés, por ejemplo, un gen de treonina desaminasa, puede ser subclonado en un vector de expresión conocido, y la expresión de treonina desaminasa puede ser detectada y/o cuantificada. Este método de cribado es útil para identificar la expresión de un gen de treonina desaminasa, y la expresión de una treonina desaminasa en el plástido de una célula vegetal transformada. Los vectores plásmidos incluyen ácidos nucleicos adicionales que se proporcionan para la selección, amplificación, y transformación fácil del transgen en células procariotas y eucariotas, por ejemplo, vectores derivados de pUC tales como pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pUC23, pUC119, y pUC120, vectores derivados de pSK, vectores derivados de pGEM, vectores derivados de pSP, o vectores derivados de pBS. Los ácidos nucleicos adicionales incluyen orígenes de replicación para proporcionar replicación autónoma del vector en un huésped bacteriano, genes marcadores seleccionares, preferiblemente que codifican resistencia antibiótico o a herbicida, sitios únicos de clonación múltiple que se proporcionan para múltiples sitios para insertar ácidos nucleicos o genes que codifican en el transgen, y secuencias que mejoran la transformación de células procarióticas y eucarióticas. Otro vector que es útil para expresión en ambas células procarióticas y vegetales es el plásmido Ti binario, como se describe en Schilperoort y colaboradores, patente U.S. 4,940,838, como se ejemplifica por el vector pGA582. El vector plásmido T-i binario ha sido caracterizado previamente por An, citado en supra. Este vector Ti binario puede ser replicado en bacterias procarióticas tales como E. coli o Agrobacterium. Los vectores plásmidos de Agrobacterium pueden también ser usados para transferir el transgen a células vegetales. Los vectores T1 binarios incluyen el ADN T de nopalina limites derecho e izquierdo para proporcionar eficiente transformación celular vegetal, un gen marcador seleccionable, sitios únicos de clonación múltiple en las regiones limitantes de T, la replicación de colE1 de origen y un amplio replicón en el rango del huésped. Los vectores binarios Ti que portan un transgen de la presente invención pueden ser usados para transformar tanto células procarióticas como eucarióticas, pero son usados preferiblemente para transformar células vegetales. Ver, por ejemplo, Glassman y colaboradores, Patente U.S. 5,258,300. El vector de expresión puede entonces ser introducido en células procarióticas o eucarióticas por métodos disponibles. Los métodos de transformación especialmente efectivos para dicotiledóneas, incluyen, pero no se limitan a, bombardeo de microproyectiles de embriones inmaduros (Patente U.S. 5,990,390) o células de callus embriogénico de Tipo II como se describe en W.J. Gordon-Kamm, Plant Cell, 2: 603 (1990); M. E. Fromm y colaboradores, Bio/Technology, 8:833 (1990); y D.A. Walters y colaboradores, Plant Molecular Biology, 18: 189 (1992), o por electroporación de tipo callus embiogénico de Tipo I descritos por D'Halluin y colaboradores, The Plant Cell, 4: 1495 (1992); o por Krzyzek, Patente U.S. 5,384,253. Puede usarse también la transformación de células vegetales sometiendo a vórtice triquitas de tungsteno recubiertas de ADN (Coffee y colaboradores, Patente U.S. 5,302,523) y transformación por exposición de células a liposomas que contengan ADN.

Estrategia para la Selección de Líneas Celulares Sobre-productoras de Isoleucina La selección eficiente de un análogo de isoleucina resistente deseado, variante sobre-productora de isoleucina usando técnicas de cultivo de tejido requirió la determinación cuidadosa de las condiciones de selección. Estas condiciones son optimizadas para permitir el crecimiento y la acumulación de isoleucina o de análogos de isoleucina resistentes, células sobre-productoras de isoleucina en el cultivo siempre que inhiban el crecimiento de la densidad de la población celular. La situación es complicada por el hecho de que la vitalidad de células individuales en una población puede ser muy dependiente de la vitalidad de las células vecinas. Las condiciones bajo las cuales son expuestos los cultivos celulares a isoleucina o a un análogo de isoleucina son determinadas por las características de la interacción del compuesto con el tejido. Factores tales como el grado de toxicidad y la velocidad de inhibición deberán ser considerados. La acumulación de los compuestos por células en cultivo, y la persistencia y estabilidad de los compuestos, ambos en el medio y en las células, también necesitan ser considerados. Los efectos de isoleucina o de los análogos de ¡soleucina sobre la viabilidad y la morfología de los cultivos se evaluó cuidadosamente. Es especialmente importante seleccionar las condiciones de exposición al análogo que no tengan impacto sobre la capacidad de regeneración vegetal de cultivos. La selección de las condiciones de exposición al análogo es también influenciada ya sea por células destructoras del análogo o bien simplemente inhibición de las divisiones celulares. La selección de un protocolo de selección es dependiente de las consideraciones descritas anteriormente. Los protocolos descritos brevemente posteriormente pueden ser utilizados en el procedimiento de selección. Por ejemplo, para seleccionar células que sean resistentes a la inhibición del crecimiento por medio de isoleucina o por un análogo de la misma, células finamente divididas en cultivo en suspensión líquida pueden ser expuestas a niveles altos de isoleucina o de análogos por breves períodos de tiempo. Las células supervivientes se recuperan y acumulan y son entonces re-expuestas por períodos de tiempo más prolongados subsecuentemente. De manera alternativa, cultivos celulares diferenciados parcialmente organizados son desarrollados y sub-cultivados con exposición continua a niveles bajos ¡nicialmente de L-isoleucina libre o a un análogo se ésta. Las concentraciones son gradualmente incrementadas durante varios intervalos de subcultivo. Aunque estos protocolos pueden ser utilizados en un procedimiento de selección, la presente invención no se limita a estos procedimientos.

Selección y Caracterización de Líneas Celulares Resistentes Las selecciones se llevan a cabo hasta que las células o tejidos son recuperados, los cuales son observados en el pocilio de crecimiento en la presencia de niveles normalmente inhibidores de análogos de isoleucina. Estas "líneas" celulares son subcultivadas varias veces adicionales en la presencia de uno o más análogos de isoleucina para remover células no resistentes y luego son caracterizadas. La cantidad de resistencia que se ha obtenido se determina por comparación del crecimiento de estas líneas celulares con el crecimiento de células o tejidos no seleccionados en la presencia de varias concentraciones de análogos. La estabilidad del rasgo de resistencia de las células cultivadas puede ser evaluada simplemente por el desarrollo de las líneas celulares seleccionadas en la ausencia de un análogo por varios períodos de tiempo y luego por medio del análisis del crecimiento después de re-exposición del tejido al análogo. Las líneas celulares resistentes pueden también ser evaluadas usando estudios químicos in vitro para verificar que el sitio de acción del análogo es en treonina desaminasa y/o si hay y que mutación se ha formado para conferir menos sensibilidad a la inhibición por análogo(s) de isoleucina. La expresión transitoria de un gen de treonina desaminasa puede ser detectada y cuantificada en las células transformadas. La expresión del gen puede ser cuantificada por análisis por medio de la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR), análisis por tinción Western usando anticuerpos específicos para la treonina desaminasa clonada o por detección de la actividad enzimática en la presencia de isoleucina o de un aminoácido análogo de isoleucina. La localización subcelular y de tejido de la treonina desaminasa clonada puede ser determinada por medio de métodos de tinción inmunoquímica usando anticuerpos específicos para la treonina desaminasa clonada o la fraccionamiento subcelular y análisis inmunoquímico y/o bioquímico subsecuentes. Puede evaluarse la sensibilidad de la treonina desaminasa clonada a agentes. Transgenes que se proporcionan para la expresión de una treonina desaminasa o treonina desaminasa tolerante a la inhibición por un aminoácido análogo de ¡soleucina o de ¡soleucina-libre pueden entonces ser usados para transformar células de tejido vegetal de dicotiledóneas/ o de monocotiledóneas y para regenerar vegetales y semillas transformadas. Las células transformadas pueden ser seleccionadas por la presencia de un gen marcador seleccionable o de un gen informador, tal como la resistencia a herbicidas. La expresión transitoria de un gen de treonina desaminasa puede ser detectada en el calli embiogénico transgénico usando anticuerpos específicos para la treonina desaminasa clonada, o por análisis por RT-PCR.

Ganes para Modificación Vegetal Como se describió anteriormente en la presente, los genes que funcionan como genes marcadores seleccionares y genes informadores pueden ser combinados operablemente con el ácido nucleico que codifica a la treonina desaminasa, o dominio de la misma, en transgenes, vectores, y vegetales de la presente invención. De manera adicional, otros rasgos agronómicos pueden ser añadidos a los transgenes, vectores, y vegetales de la presente invención. Dichos rasgos incluyen, pero no se limitan a, resistencia o tolerancia a insectos; resistencia o tolerancia a enfermedades (viral, bacteriana, fúngica, por nemátodos); la resistencia o tolerancia a la fatiga, como se ejemplifica por la resistencia o tolerancia a la sequía, , al calor, al frío, a la congelación, a la humedad excesiva, fatiga a las sales, fatiga oxidativa, rendimientos crecientes; contenido de alimento y elaboración; apariencia física; esterilidad masculina; descenso del secado; responsabilidad; prolificidad; propiedades de almidón; cantidad y calidad de aceites; y los similares. Uno puede incorporar uno o más genes que confieran dichos rasgos en los vegetales de la presente invención.

Resistencia o Tolerancia al Medio Ambiente o a la Fatiga El mejoramiento de una capacidad del vegetal para tolerar varias fatigas ambientales puede efectuarse por medio de la expresión de genes. Por ejemplo, la resistencia creciente a temperaturas de congelamiento puede ser conferida a través de la introducción de una proteína "anti-congelamiento" tal como la de Winter Flounder (Cutler y colaboradores, J. Plant Physiol., 135:351 (1989)) o gen sintético derivados de la misma. La tolerancia al frío mejorada puede también ser conferida a través de expresión creciente de glicerol-3-fosfato acetiltransferasa en plástidos (Wolter y colaboradores, EMBO J., 11 :4685 (1992). La resistencia a la fatiga oxidante puede ser conferida por expresión de superóxido dismutasa (Gupta y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.), 90:1629 (1993)), y puede ser mejorada por la glutatión reductasa (Bowler y colaboradores, Ann. Rev. Plant. Physiol., 43:83 (1992)).

Se contempló que la expresión de genes que afectan favorablemente el contenido de agua del vegetal, agua potencial total, potencial osmótico, y turgencia mejorará la capacidad del vegetal para tolerar la sequía, y por consiguiente será útil. Se propuso, por ejemplo que la expresión de genes que codifican para la biosíntesis de solutos activos osmóticamente puede impartir protección contra la sequía. En esta clase están genes que codifican para manitol deshidrogenasa (Lee y Saier, J. Bacteriol., 258:10761 (1982)) y trehalosa-6-fosfato sintasa (Kaasen y colaboradores J. Bacteriol., 174:889 (1992)). De manera similar, otros metabolitos pueden proteger ya sea a la función enzimática o bien a la integridad de la membrana (Loomis y colaboradores, J. Expt. Zoology, 252:9 (1989)), y por consiguiente la expresión de genes que codifican para la biosíntesis de estos compuestos pueden conferir resistencia a la sequía de una manera similar a o complementaria al manitol. Otros ejemplos de metabolitos que se encuentran de manera natural que son osmóticamente activos y/o proporcionan algún efecto protector directo durante la sequía y/o desecación incluyen fructosa, eritritol, sorbitol, dulcitol, glucosilglicerol, sacarosa, almidonosa, rafinosa, prolina, glicina, betaína, ononitol, y pinitol. Ver, por ejemplo, la Patente U.S. 6,281 ,411. Se han asignado tres clases de Proteínas Embriogénicas Tardías con base en similaridades estructurales (ver, Dure y colaboradores, Plant Molecular Biology, 12: 475 (1989)). La expresión de genes estructurales de los 3 grupos LEA puede conferir tolerancia a la sequía. Otros tipos de proteínas inducidas durante la fatiga al agua, que pueden ser útiles, incluyen tiol proteasas, aldolasas, y transportadores transmembrana, los cuales pueden conferir varias funciones protectoras y/o de tipo reparador durante la fatiga por sequía. Ver, por ejemplo, PCT/CA99/00219 (genes de polipéptidos ¡ntercambiadores de Na+/H+). Genes que efectúan biosíntesis lipídica pueden también ser útiles al conferir resistencia a la sequía. Puede también ser útil, la expresión de los genes involucrados con rasgos morfológicos específicos que permiten extracciones de agua crecientes de suelo seco. La expresión de genes que mejoran la aptitud reproductiva durante tiempos de fatiga puede también ser útil. Se propuso también que la expresión de genes que minimizen la absorción del grano durante tiempos de fatiga aumentarían la cantidad de grano a ser cosechado y por consiguiente es valiosa. La facilidad de las plantas para utilizar agua más eficientemente, a través de la introducción y expresión de genes, puede mejorar los resultados globales aún cuando la disponibilidad del agua del suelo no sea limitante. Por introducción de genes que mejoren la capacidad para maximizar el uso del agua a través de un intervalo total de fatigas relacionadas con la disponibilidad de agua, puede realizarse estabilidad de rendimiento, o consistencia de los resultados de rendimiento.

Composición o Calidad Vegetal La composición del vegetal puede ser alterada, por ejemplo, para mejorar el equilibrio de aminoácidos en una variedad de maneras que incluyan elevar la expresión de proteínas nativas, disminución de la expresión de aquellos con pobre composición, cambiar la composición de proteínas nativas, o introducir genes que codifican completamente a otras proteínas nuevas que posean composición superior. Ver, por ejemplo, La Patente U.S. 6,160,208 (alteración de la expresión de proteínas de almacenamiento de semillas). La introducción de genes que alteran el contenido de aceite del vegetal puede ser de valor. Ver, por ejemplo, Patentes US 6,069,289 y 6,268,550 (gen de ACCasa). Pueden introducirse genes que mejoren el valor nutritivo de los componentes de almidón del vegetal, por ejemplo incrementando el grado de ramificación, da como resultado la utilización del almidón en vacas para retardar su metabolismo.

Características Agronómicas del Vegetal Dos de los factores que determinan donde pueden cultivarse los vegetales con la temperatura promedio diaria durante la estación de cultivo y el espacio de tiempo entre heladas. La expresión de genes que están involucrados en la regulación del desarrollo del vegetal puede ser útil, por ejemplo, los genes no ligulados, de vaina rugosa que han sido identificados en maíz. Los genes pueden ser introducidos en maíz que tendría la posibilidad de conservación y otras características de cultivo vegetal mejoradas. La expresión de genes que confieren pecíolos más fuertes, sistemas de raíces mejoradas, o prevenir o reducir la caída de las espigas, sería de valor para el granjero.

Utlización de Nutrientes La habilidad para utilizar nutrientes adecuados puede ser un factor limitante en ei cultivo de vegetales. Puede ser posible alterar la captación de nutrientes, tolerar pH extremos, movilización a través del vegetal, conjuntos de almacenamiento, y disponibilidad para actividades metabólicas por la introducción de genes. Estas modificaciones permitirían a un vegetal utilizar más eficientemente los nutrientes disponibles. Por ejemplo, un incremento en la actividad de una enzima que está normalmente presente en el vegetal e involucrada en la utilización de nutrientes puede incrementar la disponibilidad de un nutriente. Un ejemplo de una enzima tal sería la fitasa.

Esterilidad Masculina La esterilidad masculina es útil en la producción de semillas híbridas, y la esterilidad masculina puede ser producida a través de la expresión genética. Puede ser posible a través de la introducción de TURF-13 vía transformación para separar la esterilidad masculina de la sensibilidad a la enfermedad. Ver, Levings, (Science, 250:942-947, (1990)). Puede ser necesario retaurar la fertilidad masculina para propósitos de reproducción y para la producción de granos, pueden también ser introducidos genes que codifican la restauración de la fertilidad masculina.

Regeneración Vegetal y Producción de Semillas Cali embriogénico transformado, tejido de meristema, embriones, discos de hojas, y los similares pueden ser usados para generar vegetales transgénicos que exhiban herencia estable del gen de la treonina desaminasa transformada. Las líneas celulares vegetales que exhiben niveles satisfactorios de tolerancia para un aminoácido análogo de isoleucina o de L-isoleucina libre son puestas a través de un protocolo de regeneración vegetal para obtener vegetales maduros y semillas que expresan los rasgos de tolerancia por medio de métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, ver, Patentes U.S. 5,990,390 y 5,489,520; y Laursen y colaboradores, Plant Mol. Biol., 24:51 (1994)). El protocolo de regeneración vegetal permite el desarrollo de embriones somáticos y el subsecuente cultivo de raíces y vastagos. Para determinar que el rasgo de tolerancia es expresado en órganos diferenciados del vegetal, y no solamente en cultivos celulares sin diferenciar, los vegetales regenerados pueden ser ensayados para los niveles de lie y de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe presentes en varias porciones del vegetal en relación a vegetales regenerados no transformados. Los vegetales y semillas transgénicas pueden ser generados a partir de células y tejidos transformados que muestran un cambio en contenidos de lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe o en resistencia a un análogo de isoleucina usando métodos estándares. Es especialmente preferido que el contenido de lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe de las hojas o semillas es creciente. Un cambio en la actividad específica de la enzima en la presencia de cantidades inhibidoras de isoleucina o de un análogo de ésta puede ser detectado por medición de la actividad enzimática en las células transformadas como se describe en Widholm, Biochimica et Biophysica Acta, 279:48 (1972). Un cambio en el contenido total de lie y de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe puede también ser examinado por métodos estándares tales como los descritos por Jones y colaboradores, Analyst, 106:968 (1981). Los vegetales maduros son obtenidos entonces d a partir de líneas celulares que son conocidas por expresar el rasgo. Si es posible los vegetales regenerados son auto-polinizados. Además, el polen obtenido a partir de los vegetales regenerados es cruzado para cultivo de semillas de vegetales de líneas endógamas importantes agronómicamente. En algunos casos, el polen de vegetales de estas líneas endógamas es usado para polinizar vegetales regenerados. El rasgo es caracterizado genéticamente por evaluación de la segregación del rasgo en progenie de primera generación y posteriores. La posibilidad de herencia y de expresión en vegetales de los rasgos seleccionados en cultivo de tejido son de particular importancia si los rasgos son comercialmente útiles.

El valor comercial de la sobreproducción de lie y de uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe es semillas de soya, otras legumbres, cereales, y otros vegetales es máximo si muchas combinaciones híbridas diferentes están disponibles para venta. El granjero típicamente cultiva más de una clase de híbridos basados en dichas diferencias como madurez, posibilidad de conservación, u otros rasgos agronómicos. Adicionalmente, los híbridos adaptados a una parte del país no están adaptados a otra parte a causa de diferencias en rasgos tales como madurez, resistencia a la enfermedad, e insectos. A causa de esto, es necesario para seleccionar la reproducción de lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe en un gran número de líneas endógamas precursoras de modo que puedan producirse muchas combinaciones híbridas. Un proceso de conversión (retrocruzamiento) se lleva a cabo por cruza de la línea sobreproductora original a líneas élite normales y luego cruzar la progenie anterior al precursor normal. La progenie de esta cruza se segregará de modo que algunos vegetales porten el gen responsable de la sobreproducción mientras que algunos no. Vegetales que portan dichos genes serán cruzados otra vez al precursor normal dando como resultado que la progenie que se segrega para sobreproducción y producción normal una vez más. Esto se repite hasta que el precursor normal original ha sido convertido en una línea sobreproductora, que aún posee todos los otros atributos importantes que se encontraron originalmente en el precursor normal. Un programa de retrocruzamiento separado es implementado por cada línea élite que va a ser convertida a las líneas sobreproductoras de He y de una o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe. Posteriormente al retrocruzamiento, las nuevas líneas sobreproductoras y las combinaciones apropiadas de líneas que hacen buenos híbridos comerciales son evaluadas para sobreproducción así como también una batería de rasgos agronómicos importantes. Las líneas e híbridos sobreproductores son producidos de modo que sean verdaderos al tipo de las líneas e híbridos normales originales. Esto requiere evaluación bajo un rango de condiciones ambientales donde las líneas de híbridos generalmente serán cultivados comercialmente. Para producción de semillas de soya altas en lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe. Puede ser necesario que ambos progenitores de semillas híbridas sean homozigóticos por el carácter alto en lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe. Las líneas precursoras de híbridos que resultan satisfactoriamente son crecientes y son usadas para la producción de híbridos usando prácticas de producción de semillas híbridas estándares. Los vegetales transgénicos producidos en la presente se espera que sean útiles para una variedad de propósitos comerciales y de investigación. Los vegetales transgénicos pueden ser creados para uso en agricultura tradicional, poseer rasgos benéficos al consumidor del grano cosechado del vegetal (por ejemplo, contenido nutritivo mejorado en alimentación humana o alimento animal). En dichos usos, los vegetales son generalmente cultivados para el uso de su grano en alimentación humana o animal. No obstante, otras partes de los vegetales, incluyendo pecíolo, cascara, raíces, tubérculos, flores, partes vegetativas, y las similares, pueden también tener utilidad, incluyendo el uso como parte de ensilado animal, alimentación de fermentación, biocatalizador o para propósitos ornamentales. Los vegetales trasngénicos pueden también encontrar uso en la fabricación comercial de proteínas o de otras moléculas, donde la molécula de interés es extraída o purificada a partir de partes, semillas vegetales y los similares. Las células o tejidos de los vegetales pueden ser cultivados, cultivados in vitro, o fermentados para la fabricación de dichas moléculas. Los vegetales transgénicos pueden también ser usados en programas de reproducción comerciales, o pueden ser cruzados o reproducidos para vegetales de especies de cultivo relacionados. Las mejoras codificadas por el ADN recombinante pueden ser transferidas, por ejemplo, de células de soya o células de otras especies, por ejemplo, por fusión de protoplasto. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención.

EJEMPLO 1 Este ejemplo expone la construcción de vectores de expresión vegetal que contienen variantes alélicas de polinucleótidos que codifican a enzimas treonina desaminasa. En particular, el aminoácido L481, fue seleccionado por diseño racional de una treonina desaminasa desregulada. Se generaron varios alelos mutantes teniendo cada uno valores de IC5o"e más bajos o más altos que la variante alélica ilvA L481 F. Estos alelos fueron usados para determinar el intervalo de insensibilidad a la retroalimentación para treonina desaminasa para uso en vegetales transgénicos. El Cuadro 2 (anterior) enlista las sustituciones de aminoácidos hechas en ilvA en la posición del aminoácido 481. En los ejemplos descritos en la presente, enzimas modificadoras del ADN que incluyen enzimas de restricción fueron adquiridas de New England Biolabs (Beverly, MA). Se sintetizaron cebadores oligonucleótidos por Invitrogen Life Technologies (Carisbad, California). Todos los otros productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Las determinaciones de proteínas se efectuaron como describe (Bradford, anal. Biochem., 72:248-2544(1976)). Los alelos ilvA usados fueron derivados del gen de treonina desaminasa ilvA de E. coli (SEC ID NO: 1 ), el cual codifica a la SEC ID NO: 2 que fue disponible de la base de datos de GenBank (número de acceso K03503; Lawther y colaboradores, Nucleic Acids Res., 15:2137 (1987)). Variantes de treonina desaminasa desregulada-isoleucina fueron generadas por mutagénesis de E. coli y fueron aisladas como describe (Gruys y colaboradores, Patente U.S. 5,942,660; Asrar y colaboradores, Patentes U.S. 6,0091 ,002 y 6,228,623; Y Slater y colaboradores, nature Biotechnology, 7:1011-1016 (1999)). La secuencia de nucleótidos del gen de treonina desaminasa de E. coli mutagenizado que contenía la mutación ilvA219 (L447F) es la SEC ID NO: 14 y su secuencia de polipéptidos trasladada respectiva es la SEC ID NO: 3. La secuencia de nucleótidos del gen de la treonina desaminasa de E. coli mutagenizada que contenía la mutación ilvA466 es la SEC ID NO: 15. Todas las mutaciones fueron confirmadas por análisis de la secuencia de ADN. El plásmido pMON53905 (Figura 1) fue digerido con la enzima de restricción BamH1 para generar un fragmento principal de 5.0 Kpb. Este fragmento sirvió como el fragmento principal común para las construcciones descritas posteriormente. El plásmido pMON25666 (Figura 2) fue digerido con BamH1 para generar 2 fragmentos de 3.8 y de 2.8 Kpb. El fragmento de 2.8 Kpb fue entonces ligado en el fragmento principal de 5.9 Kpb de pMON53905 para generar el plásmido denominado pMON53910 (Figura 3). Este plásmido contuvo el gen ilvA de tipo salvaje (SEC ID NO: 1 ) y sirvió como un control. El plásmido pMON25694 fue digerido con BamH1 para generar 2 fragmentos de 3.8 y de 2.8 Kpb. El fragmento de 2.8 Kpb fue entonces ligado en el fragmento principal de 5.9 Kpb (de pMON53905) para generar el plásmido denominado pMON53911 (Figura 4). Este plásmido contuvo el gen de treonina desaminasa de E. coli mutagenizado, ilvA219 (L447F) (SEC ID NO: 14). El plásmido pMON25695 fue digerido con BamH1 para generar 2 fragmentos de 3.8 y de 2.8 Kpb. El fragmento de 2.8 Kpb fue entones ligado en el fragmento principal de 5.9 Kpb para generar el plásmido denominado pMON53912 (Figura 5). Este plásmido contuvo el gen de treonina desaminasa biosintético de E. coli mutagenizado, ilvA466 (L481 F) (SEC ID NO: 15).

EJEMPLO 2 Antes de conducir experimentos de transformación adicionales usando los alelos ilvA aislados en vegetales transgénicos, cada alelo fue sobre-expresado en E. coli para determinar sus parámetros cinéticos. Los datos cinéticos sobre treoninas desaminasas que contenían varias mutaciones, y una comparación de datos disponibles para treonina desaminasas de Arabidopsis, se proporcionan en el Cuadro 4. Las variantes ilvA481 de E. coli fueron subclonadas en pSE380 (Invitrogen, Carisbad, California) y la expresión fue inducida con 0.2 mM de IPTG a 37 °C por 3 horas. La expresión de los alelos de E. coli fue alta y casi consistente como se visualiza por SDS-PAGE. Cada treonina desaminasa variante representó más de 50 % de la proteína soluble total en E. coli. La única excepción fue la treonina desaminasa variante L481K, que tuvo pobre expresión y pobre actividad enzimática. Los efectos de sustituciones de aminoácidos en Leu481 en ilvA fueron evaluados por análisis cinético en estado estacionario en la presencia y ausencia de L-isoleucina. Polipéptidos de treonina desaminasa para uso en estudios cinéticos in vitro fueron extraídos de células de E. coli en regulador de ensayo que contenía 50 mM de fosfato de potasio (pH de 7.5), 1 mM de ditiotreitol (DTT), y 0.5 mM de etilendiamina-tetraacetato. Un método de ensayo continuo fue empleado para monitorear la formación de a-cetobutirato directamente a 239 nm (e230 (pH 7.5) = 540 M-1 cm"1 mientras que la absorción de treonina fue despreciable (~1 %)). El ensayo fue iniciado por adición de 20 µl de extracto crudo diluido 1 :20 en volumen al recipiente de ensayo que contenía L-treonina (entre 2.5 mM y 50 mM) en un volumen final de 1 ml. Por inhibición de L-isoleucina, se añadió L-isoleucina entre 0 mM y 20 mM. Los parámetros cinéticos fueron determinados por ajuste de los puntos de datos en la ecuación usando el "software" GraFit 4.0 (Erithacus Software, Surrey, UK). Por comparación, los valores de kcat de los alelos L481 fueron normalizados al valor de kcat para la enzima livA de tipo salvaje. Los resultados de estos análisis se proporcionan en las Figuras 6 y 7. Las enzimas representadas en la Figura 7 son: treonina desaminasa de E. coli de tipo salvaje (círculos), enzima TD L481Y (diamantes), enzima TD L481F (triángulos), y la enzima TD L481T (cuadrados). El Cuadro 4 también resume los parámetros cinéticos de las enzimas variantes de treonina desaminasa producidas por los varios alelos ilvA de E. coli.

CUADRO 4 Datos cinéticos para ciertas treoninas desaminasas expresadas en E. coli Todos los alelos L481 presentaron cooperatividad positiva (una curva sigmida) en enlace de sustrato, mientras que la treonina desaminasa de Arabidopsis mostró actividad independiente (una curva hiperbólica típica) (Figura 6). El grado de cooperatividad (coeficiente de Hill) de los mutantes estuvo en el intervalo de 1.1 (pMON25868, L481Y) a 1.6 (pMON25865, L481Q; pMON25861 , L481 I) (Cuadro 4). De manera interesante, una curva de datos cinéticos para L481Y (n = 1.1 ) ajustada en una curva hiperbólica con 99 % de confianza por la Prueba de F ("software" estadístico JMP (SAS INSTITUTE, Cary, NC). En la presencia de isoleucina, las actividades de enzimas mutantes L481 fueron inhibidas con valores de IC50 que varían desde 97 µM (pMON25867, L481V) a 1 ,600 µM (pMON25868, L481Y) (Figura 7 y Cuadro 4). Ninguno de los mutantes L481 comprometió la afinidad de enlace de sustrato (Km) con los valores más grandes de IC50 (Cuadro 4). Por consiguiente, la afinidad de enlace de sustrato (Km) no fue afectada comparativamente por la mutación del núcleo aislado de enlace de ¡soleucina en el residuo 481. De manera diferente a los mutantes L481 , el mutante il vA219 de L447F presentó una posibilidad de comparación negativa (n = 0.5) aunque este mutante fue solamente inhibido ligeramente por isoleucina(IC5o > 20,000 µM). Con base en estos datos cinéticos, cuatro alelos L481 , que variaron en IC50 He desde 100 µM (L481 M) a 1 ,600 (L481Y) fueron seleccionados para transformación de Arabidopsis. Cada alelo L481 fue entonces subclonado a partir de plásmidos de expresión de E. coli descritos en el Cuadro 4 en plásmidos de expresión vegetal específicos de semilla para transformación en vegetales de Arabidopsis. Los alelos ilvA481 de E. coli fueron excisados de plásmidos de expresión de E. coli enlistados en el Cuadro 4 y fueron clonados en un vector intermediario como "cassettes" que contendrán un promotor mejorado de semillas (7Sa'; Doyle y colaboradores, J. Biol. Chem., 261 :9228-9238 (1986)), un marco de lectura abierto que codifica a un péptido de tránsito a SSUIA de Arabidopsis (Stark y colaboradores, Science, 258:287 (1992)) fusionado a un marco de lectura abierto que contenía uno de los cinco los alelos ilvA481 , y una región 3' sin trasladar (NOS; Depicker y colaboradores, J. Mol. Appl. Genet., 1(4):361-370 (1982)). Los plásmidos de transformación vegetal binaria pMON69657 (L481 P) (Figura 8), pMON69659 (L481Y) (Figura 9), pMON69660 (L481 F) (Figura 10), pMON69663 (L481 I) (Figura 11 ), y pMON69664 (L481M) (Figura 12) fueron transformados en Arabidopsis por infiltración mediada por Agrobacterium (Beachtold y colaboradores, C.R. Acad. Sci. Ser. 111 , 316: 1194-1199 (1993)). Los transformantes fueron seleccionados en presencia de 50 mM de glifosato. Extractos vegetales transformados fueron cribados por actividad de treonina desaminasa usando en ensayo de punto final colorimétrico (Szamosi y colaboradores, Plant Phys., 101:999-1004 (1993)). El ensayo del punto final corrido en regulador de reacción que contenía 100 mM de Tris-HCl pH de 9.0, 100 mM de KCl, 12.5 mM de L-treonina. La reacción fue iniciada por adición de 50 µl de extracto enzimático hasta un volumen final de 333 µl. Las reacciones fueron incubadas a 37 °C por 30 minutos y detenida con 333 µl de DNPH (dinitrofenilhidrazina) al 0.05 % en HCl 1 N. Esta fue incubada por 10 minutos a temperatura ambiente antes de neutralizar con 333 µl de NaOH 4N. Los productos de reacción fueron transferidos a celdas desechables (Sarstedt) y se leyeron a 540 nm usando un espectrofotómetro con distribución de diodo HP8453. Se generaron varios eventos independientes que contenían los varios alelos L481. La transformación con pMON69657 (L481P) (Figura 8) tuvo una frecuencia de transformación inusualmente baja. La baja eficiencia se atribuyó a las condiciones de selección de la transformación y no se empleó el alelo de treonina desaminasa particular (datos no mostrados). Todos los vegetales transformados que sobrevivieron con los varios alelos L481 fueron indistinguibles fenotípicamente a partir de los controles y tuvieron grupo de semillas normales indicando que la expresión de los alelos de treonina desaminasa no fueron perjudiciales para la salud del vegetal. A fin de determinar las concentraciones de isoleucina en vegetales transformados, semillas de Arabidopsis maduras, desecadas y de otros tejidos vegetales diferentes fueron colectados y sometidos a análisis de aminoácidos estándar. Resumiendo, 5 mg de tejido vegetal diferente de semilla fueron extraídos en 100 µl de ácido tricloroacético al 5 % por vórtice a temperatura ambiente por 15 minutos. Los extractos fueron centrifugados a 16,000 g por 15 minutos, y el sobrenadante fue transferido a frasquitos de HPLC para análisis de conformidad con Agilent (Technical Publication, Abril de 2000). Se midieron las concentraciones de aminoácidos por espectroscopia de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 340 nm y de emisión de 450 nm. A fin de determinar la concentración de aminoácidos en semillas, 20 mg de semillas de Arabidopsis maduras, 500 µl de perlas de zirconio/sílice de 0.5 mm (Boise Products, Inc.) y 400 µl de regulador de extracción (100 mM de fosfato de potasio pH de 7.4, 5 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de EGTA, 2 mM de DTT, 2 mM de fluoruro de 4-2 aminoetil bencensulfonilo (AEBSF), 100 µM leupeptina, glicerol al 10 %) fueron alicuotadas en 2 ml de frasquitos con tapa de rosca de 2 ml. Las semillas fueron pulverizadas a 4 °C por 2 corridas de 45 segundos sobre una batidora de perlas (Biospec Products, Inc.) en el ajuste máximo. El homogeneizado celular fue centrifugado a 16,000 g por 10 minutos a 4 °C y el sobrenadante fue analizado por espectroscopia de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 340 nm y de emisión de 450 nm. Los Cuadros 5A-5B muestran la acumulación de isoleucina (ppm) en la semilla de la generación R2 para los eventos pMON69659 (L481Y) (Figura 9), pMON69660 (L481F) (Figura 10), pMON69663 (L481I) (Figura 11 ), y pMON69664 (L481 M) (Figura 12). Como se esperó hubo una amplia distribución de acumulación de isoleucina en los vegetales transgénicos a partir de diferentes eventos. Los eventos transformados con pMON69659 (L481Y) produjeron un promedio de 85.9 ± 37.4 ppm de lie con un intervalo de 38.1 a 153.9 ppm. Los eventos transformados con pMON69660 (L481F) produjeron un promedio de 319.6 ± 397.4 ppm de lie con un intervalo de 41.4 a 2592 ppm. Los eventos transformados con pMON69663 (L481 I) produjeron un promedio de 204.3 + 159.1 ppm de lie con un intervalo de 55.4 a 728.2 ppm. Los eventos transformados con pMON69664 (L481 M) produjeron un promedio de 168.1 ± 232.0 ppm de He con un intervalo de 42.3 a 1308.6 ppm. Los eventos control que no fueron transformados con genes que codifican a la treonina desaminasa produjeron un promedio de 74.75 ± 2.5 ppm de lie. Un evento, 8315, que se basó en el alelo L481F (ilvA466), produjo un incremento de 23 veces en He, el incremento máximo observado.

La mayoría de los transformantes no acumulan isoleucina para incrementar los niveles en relación al control. Además, no parece que exista alguna correlación entre la IC5o"e y la cantidad de isoleucina que se acumula en las plantas transgénicas. Por ejemplo, las líneas transformadas con pMON69659 (L481Y) tienen las ICso"6 pero no producen algún evento con niveles significativamente elevados de isoleucina.

CUADRO 5A La concentración de lie (ppm) en vegetales Arabidopsis transformadas con cuatro construcciones de treonina desaminasa diferentes.

CUADRO 5B La concentración de He (ppm) en vegetales de Arabidopsis ilustrada, transformada con cuatro diferentes construcciones de Treonina desaminasa.

Para determinar si hubo cualquier correlación entre los niveles de isoleucina producida y los niveles de expresión relativa de treonina desaminasa, se efectuó el análisis de la actividad enzimática por tinción Western sobre varias de las líneas de acumulaciones alta de isoleucina y de acumulación baja de isoleucina. Resumiendo, aproximadamente 10 µg de extracto crudo soluble fue cargado sobre geles de SDS-PAGE con gradiente de 4 %-20 % (Zaxis). Se transfirió la proteína a membranas PVDF (Biorad). Las manchas fueron bloqueadas con leche al 5 % en TBST (solución salina regulada con Tween 20 al 0.05 %-Tris) por 1 hora. La mancha fue sondeada con una dilución 1 :3000 (usando TBST con BSA al 0.5 %) de suero de conejo (MR324) que contenía anticuerpos policlonales contra la enzima purificada por 1 hora. Después del sondeo con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina anti-conejo se revelaron las membranas usando tabletas BCIP/NBT Sigma Fast (Sigma, St Louis, MO). Los resultados indicaron que no hubo correlación clara entre expresión, actividad y acumulación de isoleucina (no se presentan datos). La actividad fue solamente detectable en líneas que contenían los niveles máximos de acumulación de treonina desaminasa aunque todos los alelos L481 mostraron señales Western positivas acumuladas. A fin de detectar la actividade n líneas con menor expresión un ensayo más sensible podría usarse (Gruys y colaboradores, 1999).

EJEMPLO 3 Este ejemplo expone un método para incrementar las concentraciones de isoleucina y de valina en un vegetal de Arabidopsis por combinación de isoleucina-enzima treonina desaminasa desregulada (TD) (ilvA466, SEC ID NO: 15) con enzimas adicionales involucradas en la ruta de biosíntesis de valina e isoleucina, es decir, moléculas de polinucleótidos que codifican a la subunidad grande de acetolactato sintasa de ilvG de E. coli (EC:2.2.1.6; SEC ID NO: 16) y a la subunidad pequeña (EC:2.2.1.6; SEC ID NO: 17), acetato lactato sintasa II de ilvM. La treonina desaminasa del alelo ilvA466 de E. coli (SEC ID NO: 15) fue excisada de pMON53912 usando las enzimas de restricción Smal y Pvull, y se ligó en el vector base pMON38207 en los sitios de restricción Smal y Pmel para crear pMON58143. Se usó el vector pMON58143 (Figura 13) en transformación mediada por Agrobacterium conducida bajo selección de kanamicina. Los genes que codifican a ilvG e ¡IvM fueron aislados por la reacción en cadena de polimerasa (RCP) usando pares de cebadores basados en sus secuencias primarias respectivas. pMON58131 contiene el gen ilvG (SEC ID NO: 16). La SEC ID NO: 16 fue ligada en un vector pGEM-Teasy (Promega Corporation, USA) para elaborar el vector TTFAGA018992. Un fragmento del polinucleótido 5' del gen ilvG (SEC ID NO: 18) fue excisado de TTFAGA018992, usando las enzimas de restricción BspH1 y Kpnl, fue ligado en un vector intermediario que contenía el péptido de tránsito a SSU1A de Arabidopsis (SEC ID NO: 19; Stark y colaboradores, Science, 258:287 (1992) para crear pMON58145. El péptido de tránsito a SSU1A (SEC ID NO: 19) y el fragmento del gen ilvG (SEC ID NO: 18) unidos operablemente fueron entonces excisados con las enzimas de restricción Kpnl y Ncol, y fue ligado en pMON58132. Las SEC ID Nos: 18 y 19 unidas operablemente fueron entonces excisadas de pMON58132, usando las enzimas de restricción Bgl ll y Kpnl, y fueron ligados en un vector transportador, pMON36220, fue excisado usando las enzimas de restricción Smal y Kpnl, y fue ligado en pMON58146. El fragmento del polinucleótido ilvG 3' (SEC ID NO: 20) remanente fue excisado de TTFAGA018992 usando las enzimas de restricción Kpnl y ScoRI, fue ligado en pMON58146 en unión operable con las SEC ID Nos: 18 y 19 para crear pMON58147. El péptido de tránsito a SSU1A (SEC ID NO: 19) y la región dosificadora de ilvG (SEC ID NO: 16) fueron entonces excisados de pMON58147 usando las enzimas de restricción Notl y EcoRI y fueron ligados en pMON64205. El péptido de tránsito a SSUIA/y el "cassette" de ¡IvG que fueron a su vez excisados de pMON64205 usando las enzimas de restricción Pmel y Bgl ll, fueron entonces unidos operablemente al promotor 7s-alfa (Publicación U.S. No. 2003/0093828) y la región sin trasladar 3' de Arcelin 5 (WO 02/50295) para crear pMON58136. El "cassette" completo fue excisado de pMON58136 usando las enzimas de restricción Notl y BspHI y fue ligado en el vector de transformación pMON38207 para crear pMON58138. pMON58133 contiene la secuencia de polinucleótidos ilvM (SEC ID NO: 17). La SEC ID NO: 17 fue ligada en PGEM-Teasy (Promega, supra) para crear pMON58137. La SEC ID NO: 17 fue entonces excisada de pMON58137 usando las enzimas de restricción BspHI y Notl, y fue ligada en pMON58129 (previamente digerida con Pmel y Ncol). Esto causó que la SEC ID NO: 17 sea operablemente unida al promotor Napin (Patente U.S. 5,420,034), el péptido de tránsito a SSU1A de Arabidopsis y la región sin trasladas-3' de ADR12 (Patente U.S. 5,981 ,841). Este plásmido fue denominado pMON58140. El "cassette" de expresión fue excisado usando las enzimas de restricción BspHI y Notl y fue ligado en el vector de transformación vegetal pMON38207 (previamente digerido con la enzima de restricción Notl) para crear pMON58151. El cassette de ilvM fue excisado de su vector intermediario pMON58140 usando las enzimas de restricción Notl y BspHI, y fue ligado en pMON58138, que contuvo el cassette ilvG y la estructura principal de transformación vegetal para crear pMON58159. Además, ilvA466 fue excisado de pMON53912 usando las enzimas de restricción Pvull y Smal y fue unido operablemente con los cassettes ilvG e ilvM de pMON58159 para crear pMON58162 (Figura 16). Los plásmidos de transformación vegetal binaria resultantes pMON58143 (ilvA466) (Figura 13), pMON58159 (ilvG + ilvM) (Figura 14), y pMON58162 (ilvA466 + ilvM) (Figura 15), fueron transformados en Arabidopsis por infiltración mediada por Agrobacterium (Beachtold y colaboradores, C.R. Acad. Sci. Ser. 111 , 316: 1194-1199 (1993)). Los transformantes fueron seleccionados en la presencia de kanamicina. A fin de medir la concentración de aminoácidos en semillas, 5 mg de tejido de semilla madura fueron triturados a un polvo fino, y el polvo se extrajo en 100 µl de ácido tricioroacético al 5 % por vórtice a temperatura ambiente por 15 minutos. Los extractos fueron centrifugados a 16,000 g por 15 minutos, y el sobrenadante fue transferido a frasquitos de HPLC para análisis como describe el fabricante (Agilent Technologies, USA). Las concentraciones de aminoácidos fueron medidas por espectroscopia de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 340 nm y de emisión de 450 nm. Se generaron varios eventos independientes para cada construcción. Las semillas de Arabidopsis que se segregaron maduras, desecadas fueron colectadas como un conjunto de cada evento, y fueron sometidas a análisis de aminoácidos. La semilla de los vegetales transformados con ilvA466 (pMON58143) contuvieron niveles elevados de isoleucina que muestra un incremento de aproximadamente 69 veces sobre los niveles promedio de isoleucina encontrados en semillas de vegetales que no fueron transformados con ilvA466 (Cuadro 6a). Una correlación positiva, definida como un coeficiente (r) de correlación de Pearson de 0.60 o más alto (Snedecor y Cochran, In: Statistical Methods, 1990), se observó con otras concentraciones de aminoácidos libres, incluyendo arginina, glutamina, leucina, lisina, treonina, tirosina, fenilalanina, y valina. Las semillas de los vegetales transformados con ilvG, ilvM (pMON58159) contuvieron niveles elevados de valina que fueron incrementos de aproximadamente 15 veces sobre la semilla control que no contenía ¡IvG e ilvM, con una correlación positiva (r > 0.60) para triptofano, alanina, arginina, glutamina, glicina, serina, fenilalanina, leucina, lisina, treonina, y tirosina (Cuadro 6B). Las semillas de los vegetales transformados con iivG e ilvA466 (pMON58162) contuvieron niveles elevados de isoleucina (incremento de 15 veces) y valina (incremento de 19 veces) con correlaciones positivas (r > 0.6) con lisina, fenilalanina, treonina, tirosina, y valina con respecto a isoleucina; y alanina, glutamina, serina, treonina, ¡soleucina y tirosina con respecto a valina (Cuadro 6C).

CUADRO 6A Concentraciones de aminoácidos en vegetales de Arabidopsis gue expresan al alelo ilvA466 de E. coli y correlaciones con las CUADRO 6B Concentraciones de aminoácidos en vegetales de Arabidopsis gue expresan a ilvG v a ilvM v correlaciones con las concentraciones de He y Val.

CUADRO 6C Concentraciones de aminoácidos en vegetales de Arabidopsis gue expresan a HvA466, a ilvG y a ilvM. v correlaciones con las concentraciones de He y de Val.

EJEMPLO 4 Este ejemplo expone la transformación de vegetales de soya con vectores de expresión que contengan alelos mutantes de treonina desaminasa usando métodos mediados por Agrobacterium y por bombardeo de partículas. Se germinaron toda la noche semillas de soya disponibles comercialmente (Asgrow A3244, A4922) (aproximadamente 18 - 24 horas) y los tejidos de meristema extirpados y mantenidos en cultivo fueron excisados. Las hojas primarias fueron retiradas para exponer las meristemas y los tejidos extirpados fueron colocados en medio objetivo con las meristemas colocadas perpendiculares a la dirección de la liberación de partículas. Los vectores de transformación que contenían las regiones codificadoras para los diferentes alelos pMON53910, pMON.53911 , y pMON53912 fueron precipitados sobre partículas microscópicas de oro con CaCI2 y espermidina y subsecuentemente. fueron resuspendidos en etanol. La suspensión fue recubierta sobre una lámina de Mylard que fue luego colocada sobre el dispositivo de descarga eléctrica. Las partículas fueron aceleradas en tejido vegetal por descarga eléctrica a aproximadamente 60 % de capacitancia. Después del bombardeo, los tejidos extirpados y mantenidos en cultivo fueron colocados en Medio Vegetal de Woody (WPM) (McCown & Lloyd, Proc. International Plant Propagation Soc, 30: 421 (1981 )) más 75 mM de glifosato por 5 - 7 semanas para permitir la selección y el cultivo de vastagos transgénicos. Los vastagos positivos al glifosato fueron cosechados aproximadamente 5-7 semanas post-bombardeo y fueron colocados en Medio de Arraigo de Semillas (BRM, "Bean Rooting Media") más 25 mM de glifosato por 2-3 semanas. La composición de BRM se da en el Cuadro 7. Los vastagos que produjeron raíces fueron transferidos al invernadero y enmacetado en el suelo. Los vastagos que permanecieron saludables en la selección, pero que no produjeron raíces fueron transferidos a medio de arraigo no selectivo (medio de arraigo de semillas ("BRM") sin glifosato) por 2 semanas adicionales. Las raíces de cualquiera de los vastagos que produjeron raíces afuera de la selección fueron probados para expresión del marcador seleccionable de glifosato antes de transferirlo al invernadero y enmacetado en el suelo. Los vegetales se mantuvieron bajo las condiciones de invernadero estándares hasta que se cosecharon las semillas, esta semilla se definió como la semilla R-i.

CUADRO 7 Composición y separación de medio de arraigo de semillas (BRM).

*SBRM/Hormona TSG Madre (para 1 litro de BRM, añadir lo siguiente) 3.0 ml de IAA (0.033 mg/ml) 2.0 ml de agua destilada estéril Almacenar la solución madre en la oscuridad a 4 °C **Vitamina SBRM Madre (para 1 litro de solución madre) Glicina 1.0 g Acido nicotínico 0.25 g Piridoxina HCl 0.25 g Tiamina HCl 0.25 g ***Sales de MS (Murashige y Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497 (1962). Este medio es usado con o sin la adición de glifosato (típicamente 0.025 mM o 0.040 mM). Todos los ingredientes se disolvieron uno a la vez. La mezcla se llevó al volumen con agua destilada estéril y se almacenó en botellas cubiertas con hoja metálica a 4 °C por no más de un mes. Los vegetales de soya fueron también transformados con pMON5028, pMON58029, y pMON58031 usando un método de transformación mediado por Agrobacterium, como se describe en (Martinello y colaboradores, Patente U.S. No. 6,384,301). Por este método, cultivos de toda la noche de Agrobacterium tumefaciens que contenían el plásmido que incluyen un gen de interés fueron cultivados hasta la fase logarítmica y luego fueron diluidos hasta una densidad óptica final de 0.3 a 0.6 usando los métodos estándares conocidos por un experto en la materia. Estos cultivos fueron usados para inocular los tejidos extirpados de embriones de soya preparados como se describe posteriormente. Resumiendo, el método es una transformación de línea germinal directa en células individuales de soya en la meristema de un embrión de soya extirpado. El embrión de soya es retirado después de esterilización de la superficie y germinación de la semilla. Los tejidos extirpados y mantenidos en cultivo se plaquearon entonces sobre medio OR, un medio de MS estándar modificado por Barwale y colaboradores, Plants, 167:473-481 (1986), más 3 mg/l de BAP, 200 mg/l de Carbenicilina, 62.5 mg/l de Cefotaxima, y 60 mg/l de Benomilo, y se almacenaron a 15 °C toda la noche en la oscuridad. Al día siguiente, los tejidos extirpados fueron heridos con una cuchilla de escalpelo y fueron inoculados con el cultivo de Agrobacterium preparado como se describió anteriormente. Los tejidos extirpados inoculados se cultivaron entonces por 3 días a temperatura ambiente. Después de la post-transformación del cultivo, la región meristémica es entonces cultivada sobre medio de cultivo de tejido vegetal estándar en la presencia del herbicida glifosato (Monsanto Company.St. Louis, MO), el cual actúa tanto como un agente de selección como una hormona que induce vastagos. Las composiciones del medio y la duración del cultivo se detallan en Martinelli y colaboradores, Patente U.S. 6,384,301. Después de 5 a 6 semanas, los tejidos extirpados mantenidos en cultivo sobrevivientes que tuvieron un fenotipo positivo se transfirieron al suelo y se cultivaron bajo condiciones de invernadero hasta la madurez. Las concentraciones de isoleucina (como se describen en el Ejemplo 2) de 5 individuos que segregaron semillas R-i se determinaron y aquellos eventos con altas concentraciones fueron cultivados en vegetales R-]. De cada uno de los eventos, se plantaron 24 semillas. Las semillas R2 resultantes se cosecharon y se midieron las concentraciones de isoleucina, y se analizó la presencia del transgen. Se efectuaron los mismos análisis para semillas R2, plantas R2 y semillas R2.

EJEMPLO 5 Este ejemplo expone la caracterización de vegetales de soya transformados con construcciones genéticas de treonina desaminasa. Para determinar la actividad de treonina desaminasa, se cultivo individualmente una semilla (~ 100 mg) en 100 µl de regulador trituración 1X (Cuadro 8). La mezcla fue entonces centrifugada por 2-3 minutos a máxima velocidad. El sobrenadante resultante fue desalado por una aplicación de una columna desaladora Bio-Rad Bio-Gel P-30. El extracto proteínico desalado (25-50 µl) se añadió a la mezcla de ensayo 5X (Cuadro 8) para un volumen final de 100 µl. La mezcla fue incubada a 37 °C por 30 minutos. Se terminó la reacción por adición de 100 µl de dinitrofenil-hidrazina al 0.5 % en HCl 1 N, seguido por incubación a temperatura ambiente por 10 minutos. Una alícuota de 100 µl de NaOH 4N se añadió entonces y se midió la absorbancia espectrofotométricamente.

CUADRO 8 Reguladores usados en el ensayo de la enzima treonina desaminasa.

Se determinó la concentración de isoleucina libre por trituración de aproximadamente 50 mg de semilla, colocando el material triturado en un frasquito de centrífuga, y luego se pesó. Se añadió 1 ml de ácido tricloroacético al 5 % a cada frasquito de muestra. Se mezclaron las muestras, usando un mezclador por vórtice, a temperatura ambiente por 15 minutos. Las muestras fueron luego giradas en una microcentrífuga por 15 minutos a 14,000 rpm. Algo del sobrenadante se removió entonces, se colocó en un frasquito de HPLC y se selló. Las muestras fueron conservadas a 4 °C antes de análisis. Se efectuó un análisis de una semilla individual sobre todas las semillas de soya R-j, con 5 semillas por evento, y una inyección por semilla. Para generaciones subsecuentes que se representan por semillas R2 y R3, se usó un ensayo de densidad que tenía 10 semillas por cada evento, y una inyección por evento. Se analizaron las muestras usando el sistema para HPLC Agilent Technologies Serie 1100. Una alícuota de 0.5 µl de la muestra se derivó con 2.5 µl de reactivo OPA (o-ftalaldehido y ácido 3-mercaptopropiónico en regulador de borato, reactivo PN 5061-3335 de Hewlett-Packard) en 10 µl de regulador de borato 0.4 N a pH de 10.2 (PN 5061-3339 de Hewlett-Packard). Los derivados fueron inyectados sobre un Agilent Technologies Eclipse® XDB-C18 de 3.5 µm, 4.6 x 7.5 mm a gasto de 2 ml/min. CUADRO 9 Condiciones experimentales de HPLC.

Regulador A de HPLC: 40 mM de Na2HPO4 al 95 %, pH = 7.8 + Regulador B al 5 % + NaN3 al 0.1 %. Regulador B de HPLC: 45 %: 45 %: 10 % :: Metanol:Acetonitrilo: Agua. Se midieron las concentraciones de ¡soleucina usando detección por fluorescencia (excitación a 340 nm, emisión a 450 nm) y los valores fueron calculados a partir de una curva estándar que varía desde 10 a 800 µg/ml. Los resultados para esta evaluación de concentraciones de isoleucina libre en los vegetales de soya transformados mostraron que la concentración de ¡soleucina libre para el control nulo fue de aproximadamente 100 µg/g en la semilla, mientras que los vegetales transformados con los alelos ¡lvA219 e ¡lvA466 fueron mayores de 600 y 1300 µg/g, respectivamente. Estos datos indican que los niveles de ¡soleucina libre son significativamente mayores en vegetales transformados con los genes de treonina desaminasa desregulados en comparación con los vegetales no transformados. Para determinar la presencia de la proteína de treonina desaminasa en plantas de soya transformados con construcciones de treonina desaminasa, semillas de soya maduras de lineas generadas a partir de alelos mutantes de treonina desregulada. Isoleucina y de tipo salvaje fueron sometidos a análisis por tinción Western. Las semillas de soya fueron secadas y trituradas en un polvo. A 20 mg del polvo, se añadieron 200 µl de regulador de muestra SDS-PAGE 1X y la mezcla fue incubada, con rotación, a 4 °C por 4 horas. La reacción se terminó por ebullición por 5 - 10 minutos. La mezcla fue entonces centrifugada por 10 minutos a 14,000 rpm. El sobrenadante resultante fue apartado y se repitió la centrifugación. Las fracciones de sobrenadante combinadas se analizaron para proteína usando en equipo para ensayo de proteína Bio-Rad (Bio-Rad). La fracción sobrenadante fue entonces separada por SDS-PAGE usando un regulador Tris-HCl al 10 %. Después de añadir un colorante a la muestra (10 % en volumen), se cargó 1 ml de la muestra preparada en cada pocilio de muestra. Se corrió el gel a 140 voltios por 1 hora en reguiador de Tris-glicina.. Las proteínas en el gel fueron entonces transferidas a una membrana de PVDF que había sido pre-humedecida con metanol y regulador de transferencia. Después de cargar en el cartucho, se hizo la transferencia a 100 voltios por 1 hora en regulador de Tris-glicina-metanol frío. La etapa de bloqueo se hizo usando una solución de leche al 10 % (5 gramos de leche pulverizada sin grasa en el volumen total de 50 ml de regulador de TBS (20 mM de Tris, pH de 7.5 y 150 mM de NaCI) que contenía Tween 20 al 0.1 %). El anticuerpo primario fue un anticuerpo anti-treonina desaminasa de conejo policlonal que se diluyó a 1 :1000 en regulador de TBS que contenía Tween 20 al 1 %, y solución de leche al 1 %. La incubación se corrió a temperatura ambiente por 1 hora o toda la noche a 4 °C. El anticuerpo secundario fue un anticuerpo anti-conejo policlonal obtenido de Sigma Chemical Co. La etapa de desarrollo se hizo por lavado 3 veces por 10 minutos cada una con TBS que contenía Tween 20 al 1 %, seguido por un lavado de 10 minutos con TBS, y luego se tiñó. Los resultados de análisis por tinción Western de extractos de semillas R3 de vegetales de soya transformados, en 3 etapas diferentes de madurez de semilla, para una línea heterozigótica y una línea nula indicaron que la concentración de la proteína mutante aumenta cuando la semilla madura. En los geles resultantes la localización de la banda correspondiente a la proteína de treonina desaminasa mutante es visible y la banda aparece en los carriles correspondientes a los vegetales transformados mientras que está ausente en los carriles correspondientes a las líneas nulas. De manera adicional, la intensidad de las bandas incrementa claramente cuando la madurez va de precoz a tardía.

EJEMPLO 6 Este ejemplo expone los resultados del análisis de aminoácidos de semillas de soya R3 transformadas con secuencias de polinucleótidos que codifican a treonina desaminasa. Los Cuadros 10A-10R proporcionan las medias estadísticas y los errores de las concentraciones de aminoácidos medidas para los eventos de soya R3 transformados con treonina desaminasa usando el "software" estadístico JMP (SAS Institute, Cary, NC, USA) Los datos son ordenados por zigozidad y por evento.

CUADRO 10A Niveles de He en vegetales de soya gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10B Niveles de Asp en vegetales de soya gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10C Niveles de Glu en vegetales de soya gue expresan a treonina desaminasa CUADRO 10 D Niveles de Asn en vegetales de soya gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10E Niveles de Ser en vegetales de soya que expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10F CUADRO 10G Niveles de His en vegetales de soya gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10H CUADRO 101 Niveles de Thr en vegetales de soya gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10J Niveles de Arg en vegetales de soya gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10K Niveles de Ala en vegetales de soya gue expresan a treoniná desaminasa.

CUADRO 10L Niveles de Tyr en vegetales de sova gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10M Niveles de Val en vegetales de sova gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10N Niveles de Met en vegetales de soya gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10O Niveles de Trp en vegetales de sova gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10P CUADRO 10Q Niveles de Leu en vegetales de soya gue expresan a treonina desaminasa.

CUADRO 10R Niveles de Lys en vegetales de soya gue expresan a treonina desaminasa.

Los resultados del análisis de aminoácidos presentados en los Cuadros 10A hasta 10R muestran que la concentración de numerosos aminoácidos incrementa en vegetales de soya transformados con secuencias de polinucleotidos que codifican a treonina desaminasa. Los datos son segregados por la fórmula genética. Se proporciona también un estimado conjunto, que elimina el efecto de la fórmula genética. Los datos fueron sometidos a análisis de correlación usando el método de Pearson (Snedecor y Cochran, In: Statistical Methods, 1982; "software" estadístico JMP (SAS Institute, Cary, NC, USA). Los valores numéricos representan el coeficiente de correlación de Pearson ®. Los valores positivos de 0.60 o más alto demuestran una correlación positiva en la concentración de un aminoácido con la concentración de lie. En la condición heterozigótica los aminoácidos Asn, Ser, His, Gly, Thr, Arg, Val, Met, Phe, Leu, y Lys, fueron correlacionados positivamente con los niveles. En la condición homozigótica, Phe y Lys fueron correlacionadas positivamente con la concentración.

CUADRO 11 Correlación de la concentración de He con otros aminoácido Todas las publicaciones y patentes se incorporan como referencia a la presente, como si fueran individualmente incorporadas como referencia. La presente invención no se limita al detalle exacto mostrado y descrito, se comprenderá que pueden hacerse muchas variaciones y modificaciones mientras que permanezcan en el espíritu y el alcance de la presente invención definida por las declaraciones.

Claims

NOVEDAD PE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una construcción de ADN que comprende múltiples cassettes de expresión vegetal caracterizada porque un primer cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unido operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a una treonina desaminasa insensible a la retroalimentación y un segundo cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unido operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a AHAS.

2.- Una construcción de ADN que comprende múltiples cassettes de expresión vegetal caracterizada porque un primer cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unido operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a una treonina desaminasa insensible a la retroalimentación y un segundo cassette de expresión que comprende una subunidad grande de AHAS y un tercer cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unido operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a una subunidad pequeña de AHAS.

3. -La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque cada uno de los promotores mencionados es un promotor mejorado de semillas.

4.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque cada uno de los promotores mencionados es seleccionado del grupo que consiste de: napina, 7S alfa, 7S alfa', 7S beta, USP 88, USP 88 mejorado, Arcelin 5, y Oleosina.

5.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque hay al menos dos diferentes promotores mejorados de semillas.

6.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque el primer cassette mencionado comprende un polinucleótido que codifica a una treonina desaminasa insensible a la retroalimentación que comprende la SEC ID NO: 22.

7.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque el primer cassette mencionado comprende un polinucleótido exógeno que codifica a un alelo variante de treonina desaminasa o a una subunidad del mismo que comprende una sustitución de aminoácido en posición L447F, o L481 F, o L481Y, o L481 P, o L481 E, o L481T, o L481Q, o L481 I, o L481V, o L481 M, o L481 K.

8.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque el polinucleótido que codifica a un alelo variante de treonina desaminasa es la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución de aminoácido en posición L447F, o L481 F, o L481Y, o L481 P, o L481 E, o L481T, o L481Q, o L481 I, o L481V, o L481 M, o L481K.

9.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque el primer cassette comprende adicionalmente un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido unido operablemente al polinucleótido que codifica a la treonina desaminasa.

10.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el segundo cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS.

11.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS comprende la SEC ID NO: 16.

12.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido es operablemente unido al polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS.

13.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el tercer cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica a la subunidad pequeña de AHAS.

14.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque el polinucleótido que codifica a la subunidad pequeña de AHAS comprende la SEC ID NO: 17.

15.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido es operablemente unido al polinucleótido que codifica a la subunidad pequeña de AHAS.

16.- Una construcción de ADN que comprende múltiples cassettes de expresión vegetal caracterizada porque un primer cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal unido operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica a una treonina desaminasa insensible a la retroalimentación, y un segundo cassette de expresión comprende un promotor funcional en células de un vegetal operablemente unido a un polinucleótido exógeno que codifica a una subunidad grande de AHAS.

17.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque cada uno de los promotores es un promotor mejorado de semillas.

18.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque cada uno de los promotores mejorados de semillas es seleccionado del grupo que consiste de: napina, 7S alfa, 7S alfa", 7S beta, USP 88, USP 88 mejorado, Arcelin 5, y Oleosina.

19.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizada además porque hay al menos dos diferentes promotores mejorados de semillas.

20.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el primer cassette comprende un polinucleótido que codifica a una treonina desaminasa insensible a la retroalimentación que comprende la SEC ID NO: 22.

21.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el primer cassette comprende un alelo variante de treonina desaminasa que comprende una sustitución de aminoácido en posición L447F, o L481 F, o L481Y, o L481 P, o L481 E, o L481T, o L481Q, o L481 I, o L481V, o L481M, o L481K.

22.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el polinucleótido que codifica a un alelo variante de treonina desaminasa es la SEC ID NO: 2 que comprende una sustitución de aminoácido en posición L447F, o L481F, o L481Y, o L481P, o L481 E, o L481T, o L481Q, o L481 I, o L481V, o L481 M, o L481K.

23.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el primer cassette comprende un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido unido operablemente al polinucleotido que codifica a una treonina desaminasa.

24.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el segundo cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS.

25.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque el polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS comprende la SEC ID NO: 16.

26.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido es operablemente unido al polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS.

27.- Una construcción de ADN que comprende múltiples cassettes de expresión vegetal caracterizada porque un cassette de expresión que comprende un promotor funcional en células de un vegetal es operablemente unido a un polinucleótido exógeno que codifica a un AHAS monomérico.

28.- Una construcción de ADN que comprende múltiples cassettes de expresión vegetal caracterizada porque un primer cassette de expresión que comprende un promotor funcional en células de un vegetal es operablemente unido a un polinucleótido exógeno que codifica a una subunidad grande de AHAS, y un segundo cassette de expresión que comprende un promotor funcional en células de un vegetal es operablemente unido a un polinucleótido exógeno que codifica a una subunidad pequeña de AHAS.

29.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque cada uno de dichos promotores es un promotor mejorado de semillas.

30.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque cada uno de los promotores mejorados es seleccionado del grupo que consiste de: napina, 7S alfa, 7S alfa', 7S beta, USP88, USP 88 mejorado, Arcelin 5 y Oleosina.

31.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque hay al menos dos diferentes promotores mejorados de semillas.

32.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el primer cassette comprende una subunidad grande de AHAS que consiste de la SEC ID NO: 16.

33.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque el primer cassette comprende un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido operablemente unido al polinucleótido que codifica a la subunidad grande de AHAS.

34.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el segundo cassette comprende un polinucleótido que codifica a la subunidad pequeña de AHAS.

35.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el segundo cassette comprende un polinucleótido que codifica a la subunidad pequeña de AHAS que consiste de la SEC ID NO: 17.

36.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque el segundo cassette comprende un polinucleótido que codifica a un péptido de tránsito a plástido unido operablemente al polinucleótido que codifica a la unidad pequeña de AHAS.

37.- Un método para preparar un vegetal dicotiledóneo transgénico que tenga un incremento en el nivel de aminoácidos en la semilla en comparación con una semilla de un vegetal no transgénico de la misma especie vegetal, caracterizado porque comprende las etapas de: a) introducir en células regenerables de un vegetal dicotiledóneo un transgen que comprenda la construcción de conformidad con la reivindicación 1 o 2; b) regenerar dicha célula regenerable en un vegetal dicotiledóneo; c) cosechar la semilla de dicho vegetal; d) seleccionar una o más semillas con un nivel creciente de aminoácidos cuando se compara con una semilla de un vegetal no transgénico de la misma especie vegetal; y e) plantar dicha semilla, en donde, si la ¡soleucina está presente a un nivel creciente, al menos un nivel adicional de aminoácidos es también creciente.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el vegetal dicotiledóneo es un vegetal de soya.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el nivel creciente de aminoácidos comprende un incremento en la concentración de: a) He y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe; o b) uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Leu, Val, Gln, Tyr, Thr, Lys, Ala, Ser, y Phe.

40.- Un vegetal de soya transgénico caracterizado porque es producido por medio del método de conformidad con la reivindicación 37.

41.- Un método para preparar un vegetal dicotiledóneo transgénico que tenga un contenido creciente de aminoácidos en la semilla en comparación con una semilla de un vegetal no transgénico de la misma especie vegetal, caracterizado porque comprende las etapas de: a) introducir en células regenerables de un vegetal dicotiledóneo un transgen que comprenda la construcción de conformidad con la reivindicación 16; b) regenerar dicha célula regenerable en un vegetal dicotiledóneo; c) cosechar la semilla de dicho vegetal; d) seleccionar una o más semillas con un nivel creciente de aminoácidos cuando se compara con una semilla de un vegetal no transgénico de la misma especie vegetal; y e) plantar dicha semilla, en donde, si la isoleucina está presente a un nivel creciente, al menos un nivel adicional de aminoácidos es también creciente.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque el vegetal dicotiledóneo es un vegetal de soya o un vegetal de colza.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque el nivel creciente de aminoácidos comprende un incremento en la concentración de: a) lie y uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Ala, Leu, Thr, Val, Gln, Tyr, Lys, Ser, y Phe; o b) uno o más de Arg, Asn, Asp, His, Met, Leu, Val, Gln, Tyr, Thr, Lys, Ala, Ser, y Phe.

44.- Un vegetal de soya transgénico caracterizado porque es producido por medio del método de conformidad con la reivindicación 41.

45.- Un método para preparar un vegetal dicotiledóneo transgénico que tenga un contenido creciente de aminoácidos en la semilla en comparación con una semilla de un vegetal no transgénico de la misma especie vegetal, caracterizado porque comprende las etapas de: a) introducir en células regenerables de un vegetal dicotiledóneo un transgen que comprenda la construcción de conformidad con la reivindicación 27 o 28; b) regenerar dicha célula regenerable en un vegetal dicotiledóneo; c) cosechar la semilla de dicho vegetal; d) seleccionar una o más semillas con un nivel creciente de aminoácidos cuando se compara con una semilla de un vegetal no transgénico de la misma especie vegetal; y e) plantar dicha semilla.

46.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque el vegetal dicotiledóneo es un vegetal de soya o de colza.

47.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque el nivel creciente de aminoácidos comprende un incremento en la concentración de Ser o de Val.

48.- Un vegetal de soya transgénico caracterizado porque es producido por medio del método de conformidad con la reivindicación 45.

49.- Harina producida a partir de la soya de conformidad con las reivindicaciones 40, 44, o 48.