JP2002520024A - 植物色素体における除草剤耐性遺伝子の発現 - Google Patents
植物色素体における除草剤耐性遺伝子の発現Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は植物細胞のプラスチドに除草剤耐性遺伝子を発現するための構築物および方法を提供する。構築物は植物プラスチドにおいて機能するプロモーターの構成部分、ＤＮＡ配列が該植物細胞のプラスチドに転写されたときに該植物細胞に少なくとも一つの除草化合物に対する耐性を付与できる該ＤＮＡ配列および転写終止領域を包含する。本発明の構築物でプラスチドを形質転換し、ＤＮＡ配列が転写される条件下で形質転換されたプラスチドを含んでなる植物細胞を成長させることにより除草剤耐性を創り、植物プラスチドおよびプラスチドを含む細胞に少なくとも一つの除草化合物の適用に対する耐性を付与する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、植物の遺伝子操作技術の適用に関する。特に、本発明は、植物色素
体におけるタンパク質発現増大のための組成物および方法に関する。 【０００２】 背景 高等植物の色素体は、遺伝子操作の魅力的な対象である。植物色素体（葉緑体
、アミロプラスト、エライオプラスト、エチオプラスト、有色体など）は、光合
成に加えて、アミノ酸、複合糖質、脂肪酸、および色素などの産業的に重要な化
合物の産生を担う主要な生合成中心である。色素体は、プロプラスチドとして既
知の共通の前駆体から誘導されるので、一定の植物種に存在する色素体は全て、
同一の遺伝成分を有する。植物細胞は、５００〜１０，０００コピーの小さな１
２０〜１６０キロベースの環状ゲノムを含み、その各分子は、大きな（約２５ｋ
ｂ）逆方向反復を有する。従って、非常に高レベルの外来遺伝子発現を潜在的に
得ることができる、２０，０００コピーまでの目的の特定の遺伝子を含むように
植物細胞を操作することが可能である。さらに、ほとんどの植物の色素体は、母
性遺伝である。従って、核で発現した異種遺伝子と異なる、色素体で発現した異
種遺伝子は花粉を飛散しないので、植物色素体に移入された形質は、野生型系列
に伝わらない。 【０００３】 植物色素体中の遺伝子発現用の改良された調節エレメントが依然として必要と
されている。現在まで、色素体導入遺伝子発現用に日常的に使用されている発現
シグナルは、内因性色素体遺伝子から誘導される。色素体発現シグナルは、典型
的には、１６ＳリボゾームＲＮＡオペロン（Ｐｒｒｎ）、ｐｓｂＡ遺伝子（Ｐｐ
ｓｂＡ）、またはｒｂｃＬ遺伝子（ＰｒｂｃＬ）由来のプロモーター領域などの
高発現色素体遺伝子のプロモーター領域から誘導される。ｐｓｂＡおよびｒｂｃ
Ｌ遺伝子は高度に転写されるが、その翻訳は、組織特異的因子および光調節因子
によって調節され、その有用性が制限される。Ｐｒｒｎの場合、典型的には、色
素体ｒｂｃＬ遺伝子リーダーを模倣した合成リボゾーム結合部位（ＲＢＣ）が使
用されている。しかし、このＰｒｒｎ／ＲＢＳは、リボゾーム結合が不十分であ
るために、非効率的に翻訳される。 【０００４】 完全に異種の発現系を使用して、色素体遺伝子を発現させている（米国特許第
５，５７６，１９８号（その全体が本明細書中に参照により取入れられる））。
この系は、２成分系である。第１の成分は、Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０
プロモーター／リーダー配列によって運ばれた色素体トランスジーンである。第
２の成分は、色素体区画に標的化されるＴ７ポリメラーゼをコードする核遺伝子
である。好ましい方法でＴ７ポリメラーゼを発現する核形質転換株を作製するた
めに、この系の制限が必要である。 【０００５】 高等植物の色素体は、遺伝子操作用の魅力的な標的である。上記のように、高
等植物の色素体は、母性遺伝である。これは、これらの形質が野生型系列に伝わ
らないので、天然または化学的条件（除草剤耐性）に寛容または耐性にする植物
の遺伝子操作に利点を付与する。さらに、高レベルの外来遺伝子発現は、薬学的
に重要なタンパク質の産生などの形質の操作用として魅力的である。 【０００６】 除草剤耐性を与える酵素ならびに植物色素体ゲノム由来の薬学的タンパク質を
コードする核酸配列の発現により、植物核ゲノム由来の発現の魅力的な代替物が
付与される。 【０００７】 発明の要旨 本発明は、植物色素体中で真核生物および原核生物の広範な種々の遺伝子の発
現の増大に有用な核酸配列を提供する。さらに、植物細胞の遺伝子操作に有用で
あり、ＥＰＳＰ合成タンパク質または植物細胞色素体中のｈＧＨタンパク質の発
現を増大させる色素体発現構築物を提供する。形質転換色素体は代謝活性色素体
であるべきであり、好ましくは、目的の植物組織中に高コピー数で維持され、最
も好ましくは、葉または子葉などの緑色植物組織中に見出される葉緑体である。 【０００８】 本発明で使用される色素体発現構築物には、一般に、ＤＮＡ配列の発現を増大
させることができる色素体プロモーター領域、ＥＰＳＰＳタンパク質またはｈＧ
ＨをコードするＤＮＡ配列、および植物色素体における転写を終結させることが
できる転写終結領域が含まれる。 【０００９】 本発明の色素体プロモーター領域は、植物色素体におけるｍＲＮＡ転写物の翻
訳を増大させるリボゾーム結合部位に連結していることが好ましい。 【００１０】 本発明の色素体発現構築物は、植物色素体中で発現することができる選択的マ
ーカーをコードするＤＮＡ配列を有する構築物に連結していることが好ましい。
選択的マーカーの発現により、マーカーを発現する色素体を含む植物細胞の同定
が可能である。 【００１１】 好ましい実施形態では、構築物の植物細胞への導入用のベクターには、発現構
築物および選択構築物のプラスミドゲノムへの挿入手段が含まれる。これは、構
築物に隣接する標的色素体ゲノムに対する相同性領域を含むことが好ましい。 【００１２】 本発明の構築物は、植物色素体におけるｍＲＮＡ転写物の翻訳を増大すること
ができるリボゾーム結合部位に連結したプロモーター配列を含むことが好ましい
。リボゾーム結合部位は、Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０リーダー配列から
誘導されることが好ましい。 【００１３】 本発明において、植物色素体における核酸配列の高レベルの発現が特に目的と
される。除草剤耐性に関与する酵素および薬学的タンパク質をコードする核酸の
高レベルの発現が特に目的とされる。 【００１４】 本発明の構築物は、５−エノイルピルビルシキメート−３−ホスフェートシン
ターゼ（米国特許第５，６３３，４３５号（その全体が本明細書中に参照により
取入れられる））、ニトリラーゼ、フィトエン不飽和化酵素、アプロチニンをコ
ードするＤＮＡ配列またはヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列（米国特許
第５，４２４，１９９号（その全体が本明細書中に参照により取入れられる））
を含むことが好ましい。 【００１５】 本発明において、構築物を含む色素体を含む植物細胞色素体は、構築物を含む
植物、植物の種子、植物細胞、またはその子孫であることもまた意図される。 【００１６】 本発明はまた、植物色素体中のＤＮＡ配列の発現増大方法を含む。 【００１７】 本発明はまた、植物細胞の色素体中でのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｐＣＰ４ ＥＰＥＰ株の発現によって、植物細胞における
除草剤耐性を付与する酵素の発現増大方法を含む。 【００１８】 さらに、本発明はまた、植物細胞の色素体においてｈＧＨをコードする酵素の
発現増大方法を含む。 【００１９】 従って、本発明は、除草剤耐性コード配列または薬学的タンパク質のコード配
列を含むキメラ遺伝子、除草剤耐性遺伝子または薬学的コード遺伝子に機能的に
連結した植物色素体における発現を増大させることができるＴ７バクテリオファ
ージポリメラーゼ遺伝子１０リボゾーム結合部位に機能的に連結したプロモータ
ーを含む植物色素体発現ベクター、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼ遺伝子
１０リボゾーム結合部位に連結した色素体プロモーターから発現する除草剤耐性
遺伝子または薬学的コード遺伝子を有する植物形質転換ベクター、このようなベ
クターを用いて形質転換された植物細胞、および核酸配列およびタンパク質発現
の実質的な程度を示す再生植物、ならびにこのような植物の産生法に関する。 【００２０】 図面の簡単な説明 図１は、Ｇ１０Ｌリボゾーム結合部位のヌクレオチド配列を示す図である。 【００２１】 図２は、アプロチニンをコードするアミノ酸配列を示す図である。 【００２２】 図３は、色素体において発現されるｈＧＨタンパク質の特徴づけのためのＲＰ
−ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。ピークＩ（最も大きなピーク）は、適切
に折りたたまれた天然の２２ｋＤａ ＧＰ２０００の予想保持時間を示す。 【００２３】 図４は、Ｍｉｃｏｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆエレクトロスプレー飛行時間型質
量分析計を用いたエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＭＳ）を示す図であ
る。特に、付着したプロトン数が変化するサンプル中に存在す種に対応する一連
のイオンを示す。スペクトルの軸は、存在する種の質量：電荷比に対する強度で
ある。 【００２４】 図５は、植物色素体から発現したｈＧＨの生物活性のグラフを示す。グラフに
表示のサンプルは、ウシプロラクチン（ｂＰＬ）、Ｅ．ｃｏｌｉから発現したｈ
ＧＨ（Ａｌａ−ｈＧＨ）、ポジティブコントロールとしてのウシプロラクチンで
スパイクした無効トランスジェニック（ＳＰＦＦ ＮｕｌｌＳｐｉｋｅ）、ネガ
ティブコントロールとしての無効トランスジェニック（ＳＰＦＦ Ｎｕｌｌ）、
およびセファロースカラム由来のトランスジェニックサンプル（ＳＰＦＦ Ｓａ
ｍｐｌｅ、ＳＰＦＦ Ｓａｍｐｌｅ）、ならびにｐＨ３．５でのセファロースカ
ラムから溶出されたトランスジェニックサンプル（ＳＰＦＦ ｐＨ３．５ Ｅｌ
ｎ）である。 【００２５】 図６はＰｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター／ＲＢＳハイブリッドの核酸配列を示
す。Ｐｒｒｎプロモーターはコンセンサス・プラスチド−３５および−１０プロ
モーターエレメント（下線部）およびプラスチドコード化ＲＮＡポリメラーゼ（
Ｐｌａｓｔｉｄ−Ｅｎｃｏｄｅｄ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ＰＥＰ）の
転写出発部位（太字のＧＣ）を含む。遺伝子１０リーダー（Ｇ１０Ｌ）は完全な
プラスチドリボソーム結合部位（ＲＢＳ、太字のヌクレオチド）を含む。 【００２６】 図７はＰｒｒｎ／ＮＥＰ／Ｇ１０Ｌ：：１４ａａＧＦＰ融合の核酸配列を示す
。ＮＥＰプロモーター領域には下線を付している（太字のＡは転写出発部位であ
る）。用いたＮＥＰプロモーター領域はプロモーターの上流及び下流の両方のコ
ンセンサス配列を越えて伸びている。開始ＡＴＧ、開始メチオニンはＧＦＰの１
４個のアミノ酸には数えない。 【００２７】 発明の詳細な説明 本発明によれば、一般に、植物色素体中で機能的なプロモーター、Ｔ７バクテ
リオファージポリメラーゼ遺伝子１０リーダーから誘導されるリボゾーム結合部
位、目的の遺伝子をコードするＤＮＡ配列、および植物色素体における転写を終
結することができる転写終結領域を含む色素体発現構築物が得られる。これらの
エレメントは、５’→３’の転写方向で機能的に連結した成分として得られる。 【００２８】 さらに、本発明の構築物はまた、葉緑体内のチラコイド内腔へタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列を標的化することができるペプチドをコードする核酸配列を
含む。 【００２９】 本発明では、また、核酸配列の高レベルの転写および翻訳（発現）を指向する
ための色素体発現構築物の使用を特に目的とする。このような色素体発現構築物
は、除草剤耐性に関する酵素および薬学的タンパク質の産生をコードするＤＮＡ
配列の高レベルの発現の指向に使用されている。 【００３０】 本発明では、転写されたメッセンジャーＲＮＡの高レベルの転写を指向するた
めの色素体発現構築物の使用を特に目的とする。 【００３１】 ＤＮＡ配列および生化学的データにより、色素体オルガネラの転写および翻訳
機構ならびに開始シグナルが原核生物系で見出されるそれらに類似していること
が明らかにされている。実際、色素体由来のプロモーター配列は、原核細胞中の
レポーター遺伝子の発現を指向することが報告されている。さらに、色素体遺伝
子は、しばしば、原核生物のようにポリシストロニックなオペロンを組織化して
いる。 【００３２】 色素体と原核生物との間の明らかな類似性にもかかわらず、色素体および原核
生物における遺伝子発現を調節するために使用される方法には基本的な相違が存
在する。原核生物に典型的に認められる転写調節機構が逆であるので、色素体遺
伝子発現は、トランスで活性な核がコードするタンパク質によって高レベルの翻
訳およびｍＲＮＡ安定性が優位に調節される。 【００３３】 転写は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のリボゾームへの結合を第１に含
む多段階のプロセスである。翻訳開始コドンから始まり、ｍＲＮＡコドンは、リ
ボゾームがｍＲＮＡ分子に沿って移動しながら連続的に読み取られる。次いで、
特定のアミノ酸が成長中のポリペプチド鎖に連続的に付加されてｍＲＮＡ中でコ
ードされたタンパク質またはポリペプチドを得る。 【００３４】 上述のように、翻訳プロセスの第１段階は、リボゾームへのｍＲＮＡ分子の結
合である。この相互作用（すなわち、結合）の性質は、一部が解明されているだ
けである。細菌の翻訳開始複合体から単離されたＲＮアーゼ耐性オリゴヌクレオ
チドの分析によって、約３０〜４０個のヌクレオチド長のＲＮＡフラグメントは
初期リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を含むことが示されている。従って、ＲＢＳ
は、その後、リボゾーム結合および翻訳開始を担い得る翻訳開始コドンを取り囲
むｍＲＮＡ配列を含むと理解される。 【００３５】 最近、原核生物における翻訳を指向し得るリボゾーム結合部位が同定された。
例えば、原核生物における核酸配列の発現を増大させる、Ｔ７バクテリオファー
ジ遺伝子１０リーダー（Ｇ１０Ｌ（米国特許第５，２３２，８４０号、その全体
が本明細書中に参照により取入れられる））から誘導されるリボゾーム結合部位
が同定された。 【００３６】 Ｎ−ホスホノメチルグリシン、ハロゲン化ヒドロキシベンゾニトリル、および
ニルフラゾンなどの除草剤は、多くの研究の対象とされてきた。 【００３７】 一般にグリフォセートと呼ばれるＮ−ホスホノメチルグリシンは、アミノ酸、
植物ホルモン、およびビタミンを含む芳香族化合物の生合成を誘導するシキミ酸
経路を阻害する。特に、グリフォセートは、ホスホエノイルピルビン酸（ＰＥＰ
）および３−ホスホシキミ酸の５−エノイルピルビル−３−ホスホシキミ酸への
変換を、酵素５−エノイルピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（
以後ＥＰＳＰシンターゼまたはＥＰＳＰＳと呼ぶ）を阻害することによって抑制
する。 【００３８】 グリフォセート耐性植物は、種々のＥＰＳＰシンターゼ遺伝子の植物の核ゲノ
ムへの形質転換によって作製されている。ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子は、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｐＣＰ４株（米国特許第５
，６３３，４３５号）からクローン化されており、これは、植物における高レベ
ルのグリフォセート耐性を付与する。さらに、高レベルのグリフォセート耐性は
、色素帯中での発現標的化用の葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）へのＥＰＳＰＳの
融合によって多数の作物で達成されている。さらに、ＥＰＳＰＳアミノ酸コード
配列の変化の結果としてグリフォセート耐性である種々の野生型ＥＰＳＰＳ酵素
が単離されている（Ｋｉｓｈｏｒｅ ａｎｄ Ｓｈａｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．、１９８８、５７、６２７〜６６３、Ｓｈｕｌｚｅら、Ａｒｃｈ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８４、１３７、１２１〜１２３、Ｋｉｓｈｏｒｅら
、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．、１９８６、４５、１５０６）。これらの変異体は、典型
的には、グリフォセート耐性表現型を付与する野生型ＥＰＳＰＳ酵素より高いグ
リフォセートのＫｉを有するが、これらの変異体はまた、酵素の動態学的有効性
を低くするＰＥＰの高いＫｍによって特徴づけられる（Ｋｉｓｈｏｒｅ ａｎｄ
Ｓｈａｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８、５７、６２７〜６
６３、Ｓｏｓｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８４、１７３、２３８〜２４１
、Ｓｈｕｌｚｅら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８４、１３７、１２
１〜１２３、Ｋｉｓｈｏｒｅら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．、１９８６、４５、１５０
６、Ｓｏｓｔ ａｎｄ Ａｍｒｈｅｉｎ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．、１９９０、２８２、４３３〜４３６）。 【００３９】 グリフォセート耐性のための植物操作に加えて、植物はまた、核において発現
される核酸配列を用いて、ハロゲン化ヒドロキシベンゾニトリルおよびノルフル
ラゾンなどの他のクラスの除草剤に耐性を示すように操作されている。 【００４０】 ブロモキシニルなどのハロゲン化ヒドロキシベンゾニトリルは、電子伝達を阻
害する、光化学系ＩＩのキノン結合タンパク質複合体の阻害によって除草作用を
示すと示唆されている（Ｖａｎ Ｒｅｎｓｅｎ、１９８２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐ
ｌａｎｔ、５４、５１５〜５２０、およびＳａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｐａｌｌｅ
ｔｔ、１９８６、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６、１
１６、１２２）。ノルフルラゾンなどの除草剤は、カロテノイドの産生を阻害す
る。 【００４１】 ブロモキシニルに耐性を示す植物は、植物細胞の核においてブロモキシニル（
ニトリラーゼ）を解毒することができる酵素をコードするＤＮＡ配列の発現によ
って産生されている。このようなニトリラーゼをコードするＤＮＡ配列は、Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの細菌からクローン化され、植物
細胞の核におけるＤＮＡ配列の発現を指向するためのベクターの構築に使用され
ている（米国特許第４，８１０，６４８号（この全体が本明細書中に参照により
取入れられる））。 【００４２】 ノルフルラゾンに耐性を示す植物は、植物細胞の核におけるカロテノイド生合
成経路における酵素をコードする核酸配列の発現によって操作されている。例え
ば、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来のフィトエン不飽和化酵素の発現
によって、ノルフルラゾン耐性が得られる。 【００４３】 核ゲノム由来のこのような酵素をコードする核酸配列を発現させるために形質
転換された植物が除草剤耐性植物の操作に利用されている一方で、色素体発現を
介して除草剤耐性を獲得する利点が増大するであろう。 【００４４】 本明細書中で提供した実施例では、除草剤耐性に関与する酵素をコードするＤ
ＮＡ配列を、植物色素体由来の配列の発現を指向する構築物に使用する。５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、ブロ
モキシニルニトリラーゼ（Ｂｘｎ）、フィトエン不飽和化酵素（ｃｒｔＩ（Ｍｉ
ｓａｗａら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、４、８３３〜８４０、お
よび１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ．、６、４８１〜４８９））、およびアセ
トヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ（Ｓａｔｈａｓｉｉｖａｎら、１９９０、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８、２１８８〜２１９３））をコードする
ＤＮＡ配列を、植物色素体由来の除草剤耐性ヌクレオチド配列の発現を指向する
ために、本発明の発現構築物に使用する。 【００４５】 除草剤耐性遺伝子をコードする目的のＤＮＡ配列にホモプラスミックなトラン
スプラスミックタバコ植物が同定されている。ホモプラスミック植物は、色素体
由来の高レベルのタンパク質発現を示す。さらに、ホモプラスミック植物は、そ
れぞれの除草剤への高レベルの耐性を示す。例えば、以下の実施例で詳述のよう
に、色素体由来のＥＰＳＰＳを発現させるために形質転換された植物は、除草剤
グリフォセートへの高レベルの耐性を示す。さらに、ニトリラーゼまたはフィト
エン不飽和化酵素を発現するホモプラスミックタバコ株は、除草剤ブロモキシニ
ルおよびノルフルラゾンへの高レベルの耐性を示す。 【００４６】 本発明に関連する当業者は、本発明の色素体発現構築物に更なる配列を用いて
除草剤耐性植物を産生することができることを理解するであろう。色素体発現構
築物除草剤耐性植物に使用することができる他の核酸配列には、グルフォシネー
ト耐性ｂａｒ遺伝子が含まれる（ＤｅＢｌｏｃｋら、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．
、６、２５１３〜２５１９）。 【００４７】 さらに、更なるグリフォセート耐性遺伝子を、本発明の構築物に使用すること
ができる。更なるグリフォセート耐性ＥＰＳＰＳ遺伝子が米国特許第５，６２７
，０６１号、Ｐａｄｇｅｔｔｅら、１９９６、Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ｒｅｓｉｓ
ｔａｎｔ Ｃｒｏｐｓ、Ｌｅｗｉｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、５３〜８５、およ
びＰｅｎａｌｏｚａ−Ｖａｚｑｕｅｚら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ、１４、４８２〜４８７（これらの全体が本明細書中に参照により
取入れられる）に記載されている。 【００４８】 本発明の除草剤耐性構築物には、他のストレス耐性遺伝子（例えば、昆虫また
は疾患の耐性遺伝子）に関与する配列をコードする遺伝子も含むことができるこ
とを留意すべきである。以下の実施例で詳述のように、色素体発現構築物を使用
して除草剤ブクトリルに耐性で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｓｉｓ
ｃｒｙｌＡｃタンパク質も発現する植物を再生する。 【００４９】 さらに、色素体発現構築物はまた、植物色素体由来のヒト生物学的タンパク質
（薬学的タンパク質）の産生に使用される。ｈＧＨをコードする核酸配列を、本
発明の色素体発現構築物に使用する。さらに、このような構築物を含むトランス
プラストミックタバコ植物は、高レベルのｈＧＨ発現を示す。さらに、植物色素
体から発現されたｈＧＨは、適切なプロセシングならびに適切なタンパク質折り
たたみの特徴を示す。 【００５０】 一般に、薬学的タンパク質産生の伝統的な方法は、発現および大量生産系に原
核生物および単細胞の真核生物を使用する。例えば、ヒト生物学的ヒト成長細胞
（米国特許第５，４２４，１９９号）の産生は、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＥ．ｃ
ｏｌｉ細胞で達成されている。 【００５１】 別の例は、アプロチニン産生である。アプロチニン産生の伝統的な方法は、細
菌におけるアプロチニン発現、またはより一般的にはウシの器官または組織由来
のタンパク質抽出物を使用している。従って、当該分野では、このようなヒト生
物製剤の大量生産用の別のアプローチが必要である。 【００５２】 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、正常なヒトの成長および発育の多くの調節に
関連する。この２２，０００ダルトンの下垂体ホルモンは、直線的な成長（体発
生）、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様効果および糖尿病誘発
効果などを示す（Ｃｈａｗｌａ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、１９８３、３４、
５１９、Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２３９、７６９、Ｔｈ
ｏｒｎｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９８８、８１、７４５）。子
供における成長遅滞は小人症を誘導し、これは、ｈＧＨの外因的投与によって１
０年以上首尾よく治療されている。ｈＧＨは、胎盤のラクトゲン、プロラクチン
、および他の遺伝子および種の変異体または成長ホルモンを含む相同ホルモンフ
ァミリーのメンバーである（Ｎｉｃｏｌｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅ
ｗｓ、１９８６、７、１６９）。ｈＧＨは、広い種特性を示し、クローン化体形
成（Ｌｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８７、３３、５３７）またはプロラクチ
ンレセプター（Ｂｏｕｔｉｎら、Ｃｅｌｌ、１９８８、５３、６９）のいずれか
に結合するという点で、これらのうちでも珍しい。 【００５３】 アプロチニン（ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）としても既知）
は、リンパ節、膵臓、胚、耳下腺、脾臓、および肝臓などのいくつかのウシ器官
および組織に存在する塩基性タンパク質である。 【００５４】 アプロチニンは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、およびカリクレ
インを含む種々のセリンプロテアーゼを阻害することが既知であり、急性膵炎、
種々の段階のショック症候群、線溶亢進性出血、および心筋梗塞の治療に使用さ
れている。さらに、高用量でのアプロチニンの投与により、心肺バイパスを含む
心臓手術に関連する失血が減少する（Ｂｉｄｓｔｒｕｐら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓ
ｃ．Ｓｕｒｇ．、４４、６４０〜６４５）。 【００５５】 以下の実施例でより詳細に示すように、色素体発現構築物を使用して、植物色
素体由来のアプロチニンおよびヒト成長ホルモンの発言を指向する。 【００５６】 ヒト生物製剤の産生に使用することができる他の配列には、インスリンをコー
ドする配列が含まれるか、またはインスリン前駆体は本発明の発現構築物に使用
することができる。当業者は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｅｌｍａｎ、１９９
０、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ、Ｐｅｒｇａｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、第８版、第１４章および第１５章に記
載の植物色素体などからその発現を指向するために、ヒト生物製剤をコードする
多数のヌクレオチド配列を本発明の構築物に使用することができることを認識す
るであろう。 【００５７】 構築物の発生では、調節領域およびオープンリーディングフレームを含む種々
のフラグメントを、連結、制限酵素消化、ＰＣＲ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発、
リンカーおよびアダプター添加などの種々の処理条件に供することができる。従
って、ヌクレオチドのトランジション、トランスバージョン、挿入、欠失などを
、色素体における発現用の調節領域または目的のＤＮＡ配列に使用されるＤＮＡ
に対して行うことができる。制限酵素消化、クレノウ平滑末端処理、連結などの
方法は、当業者に既知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、１９８９、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載されている。 【００５８】 構築物の調製中、ＤＮＡの種々のフラグメントは、しばしば、ＤＮＡの増幅、
ＤＮＡの修飾、または配列の連結または除去によるＤＮＡの操作などを可能にす
る適切なクローニングベクターにクローン化される。好ましくは、ベクターは、
Ｅ．ｃｏｌｉ中に少なくとも比較的高コピー数複製することができる。ｐＢＲ３
２２のようなベクター、ｐＵＣ系ベクター、Ｍ１３系ベクター、およびｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を
含む多数のベクターを容易に適用可能である。 【００５９】 所望の植物細胞の選択法を得るために、プラスミド形質転換用のベクターは、
典型的に、選択的マーカー遺伝子発現が得られる構築物を含む。マーカー遺伝子
は、選択物質（すなわち、抗生物質、除草剤など）の弱毒化または不活化によっ
て天然の阻害に耐性を示すポリペプチドを発現する植物発現ＤＮＡ配列である。 【００６０】 あるいは、マーカー遺伝子により、視覚可能な他のいくつかの反応を得ること
ができる。すなわち、植物もしくは植物細胞に直接適用するか、植物もしくは植
物細胞の成長培地中に存在するので、いくつかの物質の存在下で選択的マーカー
遺伝子を発現しない植物または植物細胞と比較して際立った外見または成長パタ
ーンを生じ得る。 【００６１】 どちらの場合も、このような選択的マーカー遺伝子を含む植物または植物細胞
は、同定の目的のために際立った表現型を有する。すなわち、これらは、非形質
転換細胞と区別可能である。特徴的な表現型により、細胞、細胞群、組織、器官
、植物の部位、または構築物を含む植物全体の同定が可能である。 【００６２】 マーカーの表現型の検出により、マーカー遺伝子が連結している第２の遺伝子
を有する細胞の選択が可能となる。この第２の遺伝子は、典型的には、形質転換
細胞において容易に区別可能ではないが植物細胞またはその誘導体が成熟してい
る場合、選択的マーカーの表現型自体が明らかではない条件下でさえ存在する所
望の表現型を含む。 【００６３】 色素体構築物を含む植物細胞の同定用のこのようなマーカーの使用については
、Ｓｖａｂら、１９９３、前出に記載されている。下記の実施例では、細菌ａａ
ｄＡ遺伝子は、葉緑体５’プロモーターおよび３’転写終結領域、特に、ｐｓｂ
Ａ遺伝子の調節領域の調節下でのマーカーとして発現される（Ｓｔａｕｂら、Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．、１９９３、１２（２）、６０１〜６０６に記載）。多数のさらな
るプロモーター領域を使用して、植物色素体において機能的な種々のプラスミド
プロモーターおよび細菌プロモーターを含む選択的マーカー遺伝子の発現を駆動
することもできる。 【００６４】 ａａｄＡ遺伝子発現により、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐
性が付与され、それにより、このマーカーを発現する植物細胞の同定が可能であ
る。ａａｄＡ遺伝子産物は、成長を継続させ、葉緑体が選択的マーカー遺伝子産
物を含む細胞を緑化させる。選択的マーカー遺伝子を含まない細胞は漂白される
。従って、ａａｄＡ遺伝子マーカーの選択は、植物成長培地中のストレプトマイ
シンまたは好ましくはスペクチノマイシンの存在によって漂白されない植物細胞
の同定に基づく。 【００６５】 クロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマイシンなどに
耐性を示す、植物細胞に使用するための多数のマーカーが開発されている。葉緑
体代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子もまた、選択的マーカーとして使
用することができる。例えば、グリフォセート、ブロモキシニル、またはイミダ
ゾリノンなどの植物除草剤耐性を得る遺伝子を特定の特定の用途に使用すること
ができる。このような遺伝子は、報告されている（Ｓｔａｌｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２６０、４７２４〜４７２８（グリフォセート耐
性ＥＰＳＰ）、Ｓｔａｌｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２６
３、６３１０〜６３１４（ブロモキシニル耐性ニトリラーゼ遺伝子）、およびＳ
ａｔｈａｓｉｖａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０、１８、２
１８８（ＡＨＡＳイミダゾリノン耐性遺伝子））。 【００６６】 粒子銃によるタバコ色素体ゲノムの安定な形質転換が報告されている（Ｓｖａ
ｂら、１９９０、前出およびＳｖａｂら、１９９３、前出）。これに記載の方法
を使用して、色素体発現構築物にホモプラスミックな植物を得ることができる。 【００６７】 一般に、粒子を撃ち込んだ組織を、細胞分裂促進培地で約２日間培養し、その
後、植物組織を阻害量の特定の選択因子、ならびに特定の植物種を再生させるた
めの特定のホルモンおよび他の物質を含む選択培地に移す。次いで、ホモプラス
ミックなシュートの産生および選択を確保するためにシュートを同一の選択培地
で継代培養する。 【００６８】 トランスプラストミックなタバコ植物を、形質転換色素体ゲノム（ホモプラス
ミック株）の純粋な集団について分析する。ホモプラスミー（ｈｏｍｏｐｌａｓ
ｍｙ）を、導入遺伝子領域および葉緑体ゲノムにわたる核酸プローブ（すなわち
、挿入領域）を用いたサザン分析を用いて評価する。ヘテロプラスミックな（す
なわち、導入遺伝子を含む色素体ゲノムと導入遺伝子を含まない色素体ゲノムと
の混合物を含む）トランスプラストミック植物を、野生型およびトランスジェニ
ックバンドのハイブリッド形成パターンによって特徴づける。ホモプラスミック
植物は、野生型のバンドを欠くハイブリッド形成パターンを示す。 【００６９】 あるいは、ホモプラスミーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて評価
することができる。挿入領域由来の配列から増幅するために標的化されたＰＣＲ
プライマーを利用する。例えば、プライマー対をＰＣＲ反応に使用することがで
きる。第１のプライマーは導入遺伝子中のある領域から増幅する一方で、第２の
プライマーは挿入領域に向かって挿入領域に近位の領域から増幅する。第２のＰ
ＣＲ反応を、挿入領域を増幅するように設計したプライマーを用いて行った。ホ
モプラスミックと同定されたトランスプラストミック株は第１の反応において予
想されたサイズのフラグメントを産生した一方で、第２の反応において予想され
たサイズのフラグメントを産生しなかった。 【００７０】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、撃ち込みまたはいくつかの他の方
法のいずれかによって形質転換法および再生法を一定の植物種に適用した場合、
確立された技術を、選択法および再生法で使用するために改変して、色素体形質
転換植物を作製することができる。例えば、本明細書中に記載のタバコ用の方法
を、トマト、ツクバネアサガオ、およびジャガイモなどの他のナス科の種に容易
に適用可能である。 【００７１】 ダイズの形質転換用の粒子銃ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転
換および再生プロトコールが記載されている（Ｈｉｎｃｈｅｅら、米国特許第５
，４１６，０１１号、Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、米国特許第５．０１５，５８０号）
。当業者は、ダイズ形質転換用に記載されたプロトコールを使用することができ
ることを認識するであろう。 【００７２】 Ｂｒａｓｓｉｃａでは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換および再生
プロトコールには、一般に、胚軸組織、色素体含有量が低くあり得る非緑色組織
の使用が含まれる。従って、Ｂａｓｓｉｃａでは、好ましい標的組織は、小胞子
由来の胚軸組織もしくは使用組織（緑色であるので、多数の色素体を含む）また
は葉組織外植片を含むであろう。このような組織からの再生速度が遅い一方で、
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換体を用いて認められたような位置効果
は予想されなかったので、所望の表現型を得るために首尾よく形質転換された多
数の植物をスクリーニングする必要はないであろう。 【００７３】 ワタ用のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとの同時培養
によるＧｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｓｕｔｕｍ Ｌ．子葉の形質転換は、Ｆｉｒｏ
ｏｚａｂａｂｙら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、１９８７、１０、１０５〜
１１６およびＵｍｂｅｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８７、５、
２６３〜２６６に記載されている。さらに、Ｂｒａｓｓｉｃａ用として、この組
織は葉緑体の形質転換用に十分な色素体含有量を含み得る。従って、Ｂｒａｓｓ
ｉｃａ用として、葉緑体を含む別の標的組織の形質転換および再生の別法（例え
ば、緑色胚形成組織の標的化）が所望され得る。 【００７４】 関連技術を用いて、他の植物種を容易に形質転換することができる。あるいは
、Ｋｌｅｉｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、２８６〜２９１などに
記載の微粒子銃法を使用して、本明細書中に記載のウイルスサブユニットＲＮＡ
ポリメラーゼ発現構築物を含む核形質転換植物を得ることもできる。粒子銃によ
るワタの形質転換は、１９９２年９月１７日に公開のＷＯ ９２／１５６７５で
報告されている。本発明の実施に適切な植物には、ダイズ、ワタ、アルファルフ
ァ、ナタネ、アマ、トマト、サトウダイコン、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、
トウモロコシ、小麦、コメ、およびレタスが含まれるがこれらに限定されない。 【００７５】 植物形質転換に使用するためのベクターには、好ましくは、色素体発現構築物
および選択的マーカー構築物の色素体ゲノムへ安定に移入される手段が含まれる
。これは、標的色素体ゲノムに相同の領域によって最も便利に得られる。相同の
領域は、導入される構築物に隣接し、ゲノムへの二重交差を介して相同性組換え
によって色素体ゲノムに移入される。タバコの色素体ゲノムの完全なＤＮＡ配列
が記載されている（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８６、５、２
０４３〜２０４９）。ゼニゴケ（Ｏｈｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８６、３
２２、５７２〜５７４）およびコメ（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．、１９８９、２１７、１８５〜１９４）由来の色素体ゲノムの完全
なＤＮＡ配列もまた報告されている。 【００７６】 相同の領域が色素体ゲノムの逆方向反復領域（ＩＲＡおよびＩＲＢとして既知
）に存在する場合、形質転換色素体あたり２コピーの導入遺伝子が予想される。
相同の領域が色素体ゲノムの逆方向反復領域の外側に存在する場合、形質転換色
素体あたり１コピーの導入遺伝子が予想される。色素体ゲノム内の相同の領域は
、約１ｋｂのサイズである。より小さな相同の領域も使用することができ、１０
０ｂｐの小ささでも色素体ゲノムへの相同性組換えを行うことができる。しかし
、組換え頻度および形質転換色素体を有する植物の獲得頻度は、相同の領域のサ
イズの減少と共に減少する。 【００７７】 色素体ゲノムに相同の領域を有する構築物の例は、Ｓｖａｂら、１９９０、前
出、Ｓｖａｂら、１９９３、前出、およびＺｏｕｂｅｎｋｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉ
ｄ Ｒｅｓ．、１９９４、２２（１９）、３８１９〜３８２４に記載されている
。 【００７８】 以下の実施例により詳細に記載のように、植物色素体におけるＤＮＡ配列の発
現を増大させる構築を記載する。種々のプロモーター／リボゾーム結合部位配列
を使用して、植物プラスミドにおける発現を指向する。１６ＳリボゾームＲＮＡ
オペロンのプロモーター配列（Ｐｒｒｎ）は、Ｔ７バクテリオファージ１０リー
ダー配列（Ｇ１０Ｌ）から誘導されるリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）に連結する
。Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ配列の調節下で発現するＤＮＡ配列は、他のプロモーター
／ＲＢＳ組み合わせの調節下で得られる得ベルよりも有意に高いレベルのタンパ
ク質発現を示す一方で、ｍＲＮＡの発現は、これらの植物において高くも低くも
なり得る。 【００７９】 以下の実施例では、ＣＰ４ ＥＰＳＰシンターゼをコードする核酸配列（米国
特許第５，６３３，４３５号）を、植物色素体由来のＥＰＳＰシンターゼ酵素発
現用の発現構築物に配置する。さらに、ｈＧＨをコードする核酸配列（米国特許
第５，４２４，１９９号）を、植物色素体由来のヒト成長ホルモン発現用の発現
構築物に配置する。植物色素体における核酸配列発現を増大させるために、調製
した構築物は、Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０リーダー（Ｇ１０Ｌ）の後ろ
に設計したリボゾーム結合部位を使用する。 【００８０】 ＥＰＳＰＳおよびｈＧＨの発現をコードする色素体発現構築物を、葉緑体形質
転換ベクターを介して移入する。 【００８１】 Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター／リボゾーム結合部位配列の調節下で、色素
体において発現されるＥＰＳＰＳ酵素に対する天然のコード配列を含むタバコ株
は、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬ ＲＢＳ配列の調節下で発現したＥＰＳＰから得られた
レベルよりも優位に高いレベルのタンパク質発現を示す。しかし、ＥＰＳＰＳ
ｍＲＮＡは、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬ（ＲＢＳ）の調節下での色素体由来のＣＰ４
ＥＰＳＰＳを発現する植物においてより高いレベルで発現される。これらの結果
は、Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０リボゾーム結合部位を含む転写物由来の
翻訳がより有効であることを示す。さらに、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ ＲＢＳの調節
下でＥＰＳＰＳを発現するトランスプラストミックタバコ株から得られたＥＰＳ
ＰＳのタンパク質発現レベルにより、高レベルのグリフォセート耐性が得られる
。 【００８２】 さらに、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター／リボゾーム結合部位配列の調節下
でｈＧＨを発現するように形質転換したトランスプラストミックタバコ株は、Ｐ
ｐｓｂＡプロモーター／ＲＢＳ配列の調節下で発現したｈＧＨから得られたレベ
ルよりも有意に高レベルのタンパク質発現を示す。 【００８３】 ＥＰＳＰＳおよびｈＧＨ発現用のＰｒｒｎ／Ｇ１０Ｌリボゾーム結合部位を使
用した構築物から、色素体発現用の他のプロモーター／ＲＢＳ組み合わせから得
た発現レベルを超える少なくとも約２００倍のタンパク質発現レベルの増加を得
ることができる。さらに、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター／ＲＢＳ配列を使用
したプラスミド発現構築物から得たタンパク質レベルは、核酸発現構築物より５
０〜３５００倍のレベルを蓄積することができる。従って、色素体発現構築物中
のＧ１０Ｌリボゾーム結合部位の封入は、植物色素体からのタンパク質発現レベ
ルの増大に使用することができる。 【００８４】 さらに、本発明の構築物はまた、特定のサブオルガネラ領域（例えば、葉緑体
のチラコイド内腔）にタンパク質発現を標的化するための配列を含むことができ
る。例えば、以下の実施例で記載のように、色素体ゲノムしとくクロムｆ由来の
ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、チラコイド膜に発現したアプロチニ
ンタンパク質を標的化する。このような発現タンパク質の標的化により、酸化安
定性の増大および適切なタンパク質折りたたみを可能にするタンパク質の区画化
が得られる。 【００８５】 このように、本発明の構築物および方法は高レベルの除草剤耐性を有するトラ
ンスプラストム植物を得る方法を提供する。高レベルの耐性には約１６オンス／
エーカー以上、好ましくは３２オンス／エーカー以上、より好ましくは６４オン
ス／エーカー以上、最も好ましくは１２８オンス／エーカー以上の量のグリフォ
セートを散布した場合の植物組織の耐性などがある。さらにまた高レベルの耐性
には約１６オンス／エーカー以上、好ましくは３２オンス／エーカー以上、最も
好ましくは６４オンス／エーカー以上の量のグリフォセートを適用した場合の生
殖組織の耐性などがある。 【００８６】 ここで本発明を概して記載したが、以下の実施例を参照することにより、より
容易に理解できよう。以下の実施例は説明のみを目的とするものであって、本発
明を限定するものではない。 【００８７】 実施例 実施例１ 発現構築物 高等植物の色素体の形質転換に使用する構築物および方法は、Ｚｏｕｂｅｎｋ
ｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、１９９４、２２（１９）、３８１９〜３８４
２、Ｓｖａｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９０、８７、
８５２６〜８５３０、およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９
３、９０、９１３〜９１７、およびＳｔａｕｂら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９３、
１２、６０１〜６０６に記載されている。核コード化色素体標的化Ｔ７ポリメラ
ーゼの調節下でＤＮＡ配列を発現するための高等植物の色素体形質転換に使用さ
れる構築物および方法は、米国特許第５，５７６，１９８号に記載されている。
タバコの色素体ゲノムの完全なＤＮＡ配列は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、ＥＭＢＯ
Ｊ．、１９８６、５、２０４３〜２０４９に記載されている。以下に記載の全
ての色素体ＤＮＡの引例は、タバコ由来のヌクレオチド番号に対応している。 【００８８】 タバコシトクロムｆ（ｐｅｔＡ）をコードする完全なヌクレオチド配列は、Ｂ
ａｓｓｈａｍら、１９９１、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、２３６０６
〜２３６１０およびＫｏｎｉｓｈｉら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．、３４、１０８１〜１０８７に記載されている。 【００８９】 １Ａ．プロモーター／リボゾーム結合部位配列 色素体１６ＳリボゾームＲＮＡオペロンのプロモーター領域（Ｐｒｒｎ）に、
色素体ｒｂｃＬ遺伝子リーダーを模倣した合成リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）に
連結してＰｒｒｎ／ｒｂｃＬＲＢＳフラグメントを作製する。Ｐｒｒｎ／ｒｂｃ
ＬＲＢＳ配列は、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬ（Ｓ）フラグメントについてＳｖａｂら、
１９９３、前出に記載されている。 【００９０】 色素体ｐｓｂＡプロモーター（ＰｐｓｂＡ）およびターミネーター配列（Ｔｐ
ｓｂＡ）のプロモーター領域は、Ｓｔａｕｂら，１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ．、１
２、６０１〜６０６に記載されている。 【００９１】 Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ配列を、２つのオリゴヌクレオチド配列（Ｔ７リード１お
よびＴ７リード２（表１））のアニーリングによって構築してＧ１０Ｌ色素体リ
ボゾーム結合部位（図１）を作製した。Ｇ１０Ｌ配列を、ＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ
フラグメントとしてＰｒｒｎプロモーター配列の３’末端に連結してＰｒｒｎ／
Ｇ１０Ｌ配列を作製した。 【００９２】 【表１】 【００９３】 好ましくはキメラ遺伝子を発現ベクターに挿入し、Ｐｒｒｎプロモーターから
の転写を指示する。このように、プラスチドゲノムではキメラ遺伝子が植物プラ
スチドのＰｒｒｎ／ＲＢＳプロモーターまたはＰｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター
から転写される。Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ融合の核酸配列は図６に示す。 【００９４】 １Ｂ．ＣＰ４ ＥＰＳＰＳプラスミド発現構築物 プラスミド発現ベクターｐＭＯＮ３０１１７を、前駆体ベクターｐＰＲＶ１１
１Ｂから構築した（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、１９９４、前出、ＧｅｎＢａｎｋ受託
番号Ｕ１２８１３）。ベクターｐＭＯＮ３０１１７は、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬＲＢ
Ｓ／Ｔｒｐｓ１６発現カセット中へのパッセンジャー遺伝子の挿入用の多数のク
ローニング部位を保有する。Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬＲＢＳ配列を、ＥｃｏＲＩ／Ｎ
ｃｏＩフラグメントとしてｐＰＲＶ１１１Ｂベクターにクローン化し、色素体ｒ
ｂｓ１６遺伝子（Ｔｒｐｓ１６）由来のターミネーター領域を、ＨｉｎｄＩＩＩ
／ＮｃｏＩフラグメントとしてＰｒｒｎプロモーターの３’にクローン化する。
Ｔｒｐｓ１６フラグメントは、タバコプラスミドＤＮＡ中のヌクレオチド５，０
８７から４，９３９までのｒｐｓ１６遺伝子３’調節領域を含む。 【００９５】 ベクターｐＭＯＮ３０１１７のｐＰＲＶ１１１Ｂバックボーンは、スペクチノ
マイシンおよびストレプトマイシン選択用のマーカー遺伝子ａａｄＡ、および相
同的組換えによるｒｒｎＶ−ｒｐｓ７／１２遺伝子間領域へのパッセンジャーＤ
ＮＡの組み込み用のｒｐｓ７／１２を含む。 【００９６】 アグロバクテリウム媒介の形質転換による植物への組み込みのための対照とし
て核発現構築物、ｐＭＯＮ１０１５４を作った。この構築物では天然のＣＰ４遺
伝子は構成フィグウォート・モザイクウイルス・プロモーターおよびペチュニア
ＨＳＰ７０リーダーから発現され、Ｅ９ターミネーターを有する。ＣＰ４遺伝子
のＮ末端に翻訳により融合したペチュニアＥＰＳＰＳの葉緑体輸送ペプチドによ
りプラスチドを標的化した。 【００９７】 プラスミド発現構築物ｐＭＯＮ３０１１８を、ベクターｐＭＯＮ３０１１７の
多数のクローニング部位へのＮｃｏＩ／ＳｎａＩフラグメントとしての色素体ｒ
ｂｃＬ（Ｓｖａｂら、１９９３、前出に記載）遺伝子由来のＮ末端の５つ（５）
アミノ酸と融合した天然のＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子のクローニングによって調
製した。 【００９８】 プラスミド発現構築物ｐＭＯＮ３０１２３は、色素体ｒｂｃＬ由来のＮ末端の
５つの（５）アミノ酸の欠失以外はｐＭＯＮ３０１１８と本質的に同一である。 【００９９】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３０１３０を、ｐＭＯＮ３０１２３の天然のＣＰ４ ＥＰＳＰＳの合成ＣＰ４遺伝子との置換によって作製した。この構築物はまた
、色素体ｒｂｃＬ遺伝子由来のＮ末端５アミノ酸融合を欠く。 【０１００】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７７３を、ｐＭＯＮ３０１２３のＰｒｒｎ／Ｒ
ＢＳ配列の上記のＰｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーターとの置換によって構築した。
ｐＭＯＮ３８７７３のＥＰＳＰＳ ＤＮＡ配列はまた、色素体ｒｂｃＬ遺伝子由
来のＮ末端５アミノ酸融合を欠く。 【０１０１】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７７６を、Ｇ１０Ｌ、ＣＰ４（天然）遺伝子コ
ード領域、およびプラスミドｒｐｓ１６遺伝子由来のターミネーター配列（Ｔｒ
ｐｓ１６）を含むＴ７ファージ遺伝子１０（Ｐ−Ｔ７）由来のプロモーターを用
いて構築した。 【０１０２】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７９７を、Ｇ１０Ｌ、ＣＰ４（合成）遺伝子コ
ード領域、およびプラスミドｒｐｓ１６遺伝子由来のターミネーター（Ｔｒｐｓ
１６）を含むＴ７ファージ遺伝子１０（Ｐ−Ｔ７）由来のプロモーターを用いて
構築した。 【０１０３】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７９８を、１６ＳｒＤＮＡオペロン（Ｐｒｒｎ
）、Ｇ１０Ｌ、ＣＰ４（合成）遺伝子コード領域、およびプラスミドｒｐｓ１６
遺伝子由来のターミネーター（Ｔｒｐｓ１６）を用いて構築した。 【０１０４】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７９３を、１６ＳｒＤＮＡオペロンのプロモー
ター（Ｐｒｒｎ）、色素体ｒｂｃＬ遺伝子を模倣した合成リボゾーム結合部位（
ＲＢＳ）、１０１位のアミノ酸位でのグリシンからアラニンへの変異を保有する
グリフォセート耐性ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成遺伝子（Ｐ−ＥＰＳＰＳ、Ｐ
ａｄｇｅｔｔｅら、１９８７、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、
２５８、５６４〜５７３）、およびプラスミドｒｐｓ１６遺伝子由来のターミネ
ーター（Ｔｒｐｓ１６）を用いて構築した。 【０１０５】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７９６を、１６ＳｒＤＮＡオペロンのプロモー
ター（Ｐｒｒｎ）、色素体ｒｂｃＬ遺伝子を模倣した合成リボゾーム結合部位（
ＲＢＳ）、１００位のアミノ酸位でのグリシンからアラニンへの変異（Ｇ１００
Ａ）を保有するグリフォセート耐性アクロモバクター（ＬＢＡＡ株）ＥＰＳＰ合
成遺伝子（米国特許第５，６２７，６１号（その全体が本明細書中に参照により
取入れられる））、およびプラスミドｒｐｓ１６遺伝子由来のターミネーター（
Ｔｒｐｓ１６）を用いて構築した。 【０１０６】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ４５２０４を、Ｇ１０Ｌを有する１６ＳｒＤＮＡオ
ペロンのプロモーター（Ｐｒｒｎ）、１００位のアミノ酸位でのグリシンからア
ラニンへの変異（Ｇ１００Ａ）を保有するグリフォセート耐性Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ（ＬＢＡＡ株）ＥＰＳＰ合成遺伝子、およびプラスミドｒｐｓ１６遺伝子
由来のターミネーター（Ｔｒｐｓ１６）を用いて構築した。 【０１０７】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ４５２０１を、１６ＳｒＤＮＡオペロンのプロモー
ター（Ｐｒｒｎ）、色素体ｒｂｃＬ遺伝子を模倣した合成リボゾーム結合部位（
ＲＢＳ）、野生型グリフォセート耐性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａ
ｒｏＥ（ＥＰＳＰＳ）（米国特許第５，６２７，０６１号）遺伝子、およびプラ
スミドｒｐｓ１６遺伝子由来のターミネーター（Ｔｒｐｓ１６）を用いて構築し
た。 【０１０８】 １６ＳｒＤＮＡオペロン（Ｐｒｒｎ）のプロモーターを、緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）の最初の１４個のアミノ酸（ＧＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＳＭ）をコー
ドするさらなる配列をＮ末端で有する合成ＣＰ４タンパク質をコードする核酸配
列と機能的に結合したＧ１０Ｌと共に用いてプラスチド発現構築物、ｐＭＯＮ４
５２５９を構築した。１４個のアミノ酸ＧＦＰ融合をコードする配列はタンパク
質の第２の位置のグリシンで始まる。構築物はまたｒｐｓ１６ターミネーターを
も含む。 【０１０９】 別のプラスチド発現構築物、ｐＭＯＮ４９２１８は核コード化ＲＮＡポリメラ
ーゼ領域を有する１６ＳｒＤＮＡオペロンのプロモーター領域（ＰｒｒｎＰＥＰ
＋ＮＥＰ）から１４個のアミノ酸ＧＦＰ融合、およびプラスチドｒｐｓ１６遺伝
子からターミネーター領域を有する合成ＣＰ４配列を発現する。Ｐｒｒｎ／ＮＥ
Ｐ／Ｇ１０Ｌ：：１４ａａＧＦＰ融合を図７に示す。 【０１１０】 １Ｃ．Ｂｃｒｉｌ（ｂｘｎ）色素体発現構築物 ｂｘｎ除草剤耐性遺伝子（米国特許第４，８１０，６４８号（その全体が本明
細書中に参照により取入れられる））を、ＮｃｏＩとしてのプラスミドｐＢｒｘ
４からＡｓｐ７１８制限フラグメントまでを取り除いてＮｃｏＩ／Ａｓｐ７１８
で切断したｐＵＣ１２０にクローン化してプラスミドｐＢｒｘ８７を得た。次い
で、プラスミドｐＢｒｘ８７をＮｃｏＩ／Ｘｂａで消化して色素体発現用のＰｒ
ｒｎ色素体プロモーターおよびｒｐｓＬ３’領域を含むプラスミドｐＬＡＡ２１
のＮｃｏ／Ｘｂａ部位にクローン化した。得られたプラスミドをｐＢｒｘ８９と
呼ぶ。プラスミドｐＢｒｘ８９を、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、プ
ラスミド発現シグナルを有する１．５ｋｂのキメラｂｘｎ遺伝子をタバコ色素体
相同性ベクターｐＯＶＺ４４Ｂ（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．、２２、３８１９〜３８２４、１９９４）のＳａｃ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位
に挿入してプラスミドｐＣＧＮ５１７５を作製した。 【０１１１】 プラスミドｐＣＧ６１１４を構築するために、プラスミドｐＢｒｘ９０（ブロ
モキシニル特異的ニトリラーゼをコードするｂｘｎ遺伝子を含むＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔプラスミド）を、ＮｃｏＩ／ＡｓｃＩで消化し、ｂｘｎ構造遺伝子をＮｃ
ｏ／Ａｓｃ消化プラスミドｐＣＧＮ５０６３中のＧＵＳ遺伝子と置換してプラス
ミドｐＣＧＮ６１０７を得た。このプラスミドは、キメラ遺伝子の５’末端での
Ｔ７プロモーター／遺伝子１０リーダーおよび３’末端でのｐｓｂＡ／Ｔ７雑種
転写ターミネーターの調節下でｂｘｎ遺伝子を含む。このＴ７プロモーター／ｂ
ｘｎキメラ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡセグメントとしてｐＣＧ
Ｎ６１０７から切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｎｏｔ部位でクロラムフェニコール
プラスミドＢＣＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に移動してプラスミドｐＣＧＮ６
１０９を作製した。次いで、キメラ遺伝子を、ｐＣＧＮ６１０９由来のＨｉｎｄ
ＩＩＩ／Ｎｏｔフラグメントとして上記の葉緑体相同性ベクターｐＯＶＺ４４Ｂ
に移動してプラスミドｐＣＧＮ６１１４を作製した。ｐＣＧＮ６１１４で形質転
換したタバコ植物は、Ｔ７プロモーターを介したキメラｂｘｎ遺伝子の転写を活
性化させるために植物色素体のバックグラウンドに得られるＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼを必要とする。この系は、以前に、ＭｃＢｒｉｄｅら、ＰＮＡＳ、９１、
７３０１〜７３０５、１９９４、およびＭｃＢｒｉｄｅらに付与された米国特許
第５，５７６，１９８号に記載されている。 【０１１２】 １Ｄ．ＢＸＮ／ＡＨＡＳ色素体発現構築物 植物色素体由来のＢＸＮおよびＡＨＡＳの発現を指向するように、色素体発現
構築物ｐＣＧＮ５０２６を構築する。ＡＨＡＳヌクレオチド配列（欧州公開番号
０ ５２５ ３８４ Ａ２（その全体が本明細書中に参照により取入れられる）
）を、ＢＸＮヌクレオチド配列（米国特許第４，８１０，６４８号（その全体が
本明細書中に参照により取入れられる））に連結する。Ｎｃｏ Ｉ／Ａｇｅ Ｄ
ＮＡフラグメントとしてのプラスミドｐＣＧＮ４２７７由来のアセトヒドロキシ
酸シンターゼをコードするＡＨＡＳ構造遺伝子を、プラスミドｐＵＣ１２０のＮ
ｅｏ／Ｘｍａ部位にクローン化してプラスミドｐＣＧＮ５０２２を作製した。次
いで、このプラスミドを、酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔで消化してブロモキシニ
ル特異的ニトリラーゼをコードするｂｘｎ遺伝子を含む１．３ｋｂのＢａｍ／Ｐ
ｓｔ ＤＮＡセグメントをプラスミドｐＢｒｘ２６から切り出し、ｐＣＧＮ５０
２２のＢａｍ／Ｐｓｔ部位にクローン化してプラスミドｐＣＧＮ５０２３を作製
した。プラスミドｐＣＧＮ５０２３は、ＡＨＡＳ／ｂｘｎオペロンセグメントお
よびこのフラグメントを含む３．３ｋｂ ＤＮＡセグメントを含んでいた。この
プラスミドを、固有のＰｓｔ部位で切断し、このＰｓｔ部位を取り除いて固有の
ＸｂａＩ制限部位を含む合成リンカーと置換してプラスミドｐＣＧＮ５０２４を
作製した。プラスミドｐＣＧＮ５０２４を、Ｎｃｏ／Ｘｂａで消化して、３．３
ｋｂ Ｎｃｏ／Ｘｂａ ＤＮＡフラグメントをＧＵＳ遺伝子を取り除くためにＮ
ｃｏおよびＸｂａで消化したプラスミドプロモーターカセットベクターｐＬＡＡ
２１（Ｐｓｔ）にクローン化した。このクローニングから得たプラスミドを、プ
ラスミドｐＣＧＮ５０２５と呼び、これは、プラスミドプロモーターＰｒｒｎお
よびｒｐｓＬ３’ＤＮＡセグメントの調節下で除草剤オペロンを含んでいた。色
素体発現エレメントの調節下で、キメラ除草剤オペロン全体を、ＳａｃＩ／Ｐｓ
ｔ ＤＮＡフラグメントとしてｐＣＧＮ５０２５から切り出し、色素体相同性カ
セットベクターｐＯＶＺ４４Ｂ（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．、２２、３８１９〜３８２４、１９９４）のＳａｃ／Ｐｓｔ部位にクローン
化して、タバコ葉緑体ゲノムへの移入を促進した。 【０１１３】 １Ｅ．ＢｔｃｒｙＩＡｃおよびｂｘｎプラスチド発現構築物 ｂｘｎＤＮＡセグメントを含むクレブシエラ由来の本来のクローンであるプラ
スミドｐＢｒｘ９（ＳｔａｌｋｅｒおよびＭｃＢｒｉｄｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ１６９：９５５−９６０（１９８７））を鋳型として用いてｂｘｎ遺伝子の
Ｎ末端を含み、４４塩基対の天然の遺伝子の５’未翻訳部分のを含む−４５０塩
基対ＢａｍＨＩ／Ｃｌａ Ｉ ＰＣＲ ＤＮＡフラグメントを作った。このフラ
グメントをプラスミドｐＢｒｘ９０の−４４０塩基対Ｂａｍ／Ｃｌａフラグメン
トと交換し、プラスミドｐＢｒｘ９０．１を得た。このプラスミドは全ｂｘｎ遺
伝子および４４塩基対の未翻訳５’ＤＮＡセグメントを含む。全ｂｘｎ遺伝子を
プラスミドｐＢｒｘ９０．１からＢａｍ／Ａｓｃ Ｉ ＤＮＡセグメントとして
切り取り、Ｂｇｌ ＩＩ／Ａｓｃ Ｉ部位でプラスミドｐＣＧＮ５１４６に挿入
し、プラスミドｐＣＧＮ５１９１を生じた。プラスミドｐＣＧＮ５１４６はＨＤ
−７３ ＢｔプロトキシンをコードするｃｒｙＩＡｃ遺伝子全長を含むｐＫＫ２
３３−２（ファルマシア）誘導体である。そしてプラスミドｐＣＧＮ５１９１に
は、ｃｒｙＩＡｃおよびｂｘｎ遺伝子がオペロンの遠位遺伝子であるｂｘｎ遺伝
子とオペロン配置で含まれる。両方の遺伝子は５１９１のＥ．ｃｏｌｉ発現のた
めのＰｔａｃプロモーターの調節下にある。プラスミドｐＣＧＮ５１９１をＮｃ
ｏ／Ａｓｃで消化し、Ｂｔ／ｂｘｎオペロンを含むＮｃｏ／ＡｓｃＤＮＡフラグ
メントをｐＯＶＺ４４Ｂの誘導体である葉緑体相同体ベクターｐＣＧＮ５１５５
のＮｃｏ／Ａｓｃ部位にクローン化した。得られたプラスミドｐＣＧＮ５１９７
はＰｒｒｎプラスチドプロモーターおよびｒｐｓＬ転写ターミネーター領域の調
節下にあるＢｔ／ｂｘｎオペロンを含む。このプラスミドはＢｔ／ｂｘｎキメラ
オペロンのタバコ・プラスチドゲノムへの転移を容易にする。 【０１１４】 １Ｆ．フィトエン不飽和化酵素色素体発現構築物 ｃｒｔＩ遺伝子を、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａ ｃｒｔオペロン（Ｍ
ｉｓａｗａら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ．、６、４８１〜４８９）を含
む元のプラスミドからＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ ＰＣＲフラグメントとして得
て、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓａｌ ＤＮＡセグメントとしてＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓ
ａｌ部位でＢＣＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化してプラスミドｐ
ＣＧＮ５１７２を作製した。ＮｃｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてのｐＣＧＮ
５１７２由来のｅｒｔＩフラグメントを、ｐＣＧＮ５０３８（ｐＯＶＺ４８８Ｂ
の誘導体）にクローン化して色素体発現構築物ｐＣＧＮ５１７７を作製した。こ
の構築物は、Ｐｒｒｎプロモーターおよびｒｐｓ１６ターミネーター配列由来の
ｃｒｔＩ配列の発現を指向する。このプラスミドは、タバコ色素体ゲノムへのキ
メラｃｒｔＩ遺伝子の導入を促進する。 【０１１５】 １Ｇ．植物形質転換用のｈＧＨ発現構築物 核発現構築物 構築物ｐＷＲＧ４７４７を、植物核ゲノムにおけるｈＧＨの発現を指向するよ
うに構築した。このベクターは、Ｆｉｇｗｏｒｔモザイクウイルスプロモーター
（米国特許第５，３７８，６１９号（その全体が本明細書中に参照により取入れ
られる））および色素体へのｈＧＨタンパク質の指向用のＣＴＰ２リーダーに機
能的に連結したｈＧＨを含む。ＦＭＶ／ＣＴＰ２Ｌ：：ｈＧＨ：：ＮｐＡフラグ
メントを、カナマイシン耐性を付与するＤＮＡ配列と共に、核ゲノムへの組み込
みを指向するためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの移
動ＤＮＡ（ｔＤＮＡ）の右境界と左境界（ＲＢおよびＬＢ）との間にクローン化
する。 【０１１６】 核形質転換ベクターｐＷＲＧ４７４４は、構築物がＣＴＰ２リーダーを欠き且
つｈＧＨタンパク質が植物細胞の細胞質に指向される以外は本質的にｐＷＲＧ４
７４７と同一のエレメントを含む。 【０１１７】 色素体発現構築物 色素体発現ベクターｐＷＲＧ４８３８を、ｐｓｂＡ遺伝子およびｐｓｂＡ遺伝
子ターミネーター、ＰｐｓｂＡ、ならびにＴｓｐｂＡ（Ｓｔａｕｂら、１９９３
、前出）由来のプロモーター領域から発現された全長ｈＧＨ遺伝子を用いて構築
した。ｐｓｂＡ遺伝子の色素体発現エレメントによっても駆動される選択的マー
カー遺伝子ａａｄＡに隣接するこのキメラプロモーター−遺伝子−ターミネータ
ー融合体（ＰｐｓｂＡ：：ｈＧＨ：：ＴｐｓｂＡ）をクローン化した。２つのキ
メラ遺伝子配列を、色素体１６ＳｒＤＮＡの上流のタバコ色素体ゲノムへのキメ
ラ遺伝子配列の組み込みを指向する２つの配列の間にクローン化する。これを、
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド維持用のｐＵＣ複製起点を含むＥ．ｃｏｌｉ選
択を行う１ｋｂのアンピシリン耐性遺伝子に連結する。 【０１１８】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７５５を、酵母ユビキチン遺伝子をＮ末端で転
写融合したｈＧＨ ＤＮＡ配列を用いて調製して、Ｕｂｉ−ｈＧＨ融合遺伝子を
作製した。スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンを含む培地での（Ｚｏ
ｕｂｅｎｋｏら、１９９４、前出に記載のｐＰＲＶ１１２Ｂから）トランスプラ
ストミックタバコの選択のために、ａａｄＡ遺伝子に隣接するＵｂｉ−ｈＧＨ融
合遺伝子をクローン化する。ｈＧＨおよびａａｄＡ発現をコードする配列の相同
性組換え用の配列が含まれる。これらの配列を、Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、１９９４
、前出に記載のベクターｐＰＲＶ１１２Ｂから得る。これを、Ｅ．ｃｏｌｉにお
けるプラスミド維持用の構築物およびｐＵＣ複製起点を含むＥ．ｃｏｌｉの選択
を行う１ｋｂアンピシリン耐性遺伝子に連結させる。 【０１１９】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７９４は、以下の例外を除いてはｐＭＯＮ３８
７５５と同一のエレメントを本質的に含む。０．１５ｋｂのｐｓｂＡプロモータ
ー配列を、上記のＰｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター配列と置換する。 【０１２０】 １Ｈ．色素体中のアプロチニン発現用の構築物 色素体から薬学的タンパク質であるアプロチニンの発現を使用するために、一
連の構築物を調製した。核発現色素体標的化Ｔ７ポリメラーゼから誘導されるＴ
７遺伝子１０リーダープロモーター由来のアプロチニン発現を調節するために、
アプロチニンをコードする核酸配列（図２）を、色素発現構築物にクローン化し
た。米国特許第５，５７６，１９８号（その全体が本明細書中に参照により取入
れられる）に記載のようにアプロチニン配列をクローン化した構築物を使用した
。色素体形質転換ベクターｐＣＧＮ６１４６を、ｐＣＧＮ４２７６由来のＧＵＳ
をコードするＤＮＡ配列（米国特許第５，５７６，１９８号）をアプロチニンの
コード配列と置換することによって設計する。タバコ色素体形質転換構築物ｐＣ
ＧＮ６１４７は、ｐＣＧＮ６１４７がアプロチニンコード配列の５’末端に連結
したＧＵＳコード配列の６つの５’アミノ酸を含むこと以外はｐＣＧＮ６１４６
と同一のエレメントを含む。アプロチニンタンパク質の翻訳を援助するように、
ＧＵＳヌクレオチド配列の５’末端の６つのアミノ酸を含む。タバコ色素体形質
転換ベクターｐＣＧＮ６１５６は、アプロチニンのコード領域をＧＵＳコード配
列の３’末端にクローン化する以外はｐＣＧＮ４２７６に本質的に同一である。
従って、ｐＣＧＮ６１５６は、機能的に連結されたＴ７プロモーター、アプロチ
ニンをコードするＤＮＡ配列と融合したＧＵＳをコードするＤＮＡ配列およびｐ
ｓｂＡ３’転写終結配列を含む。 【０１２１】 色素体発現構築物ｐＣＧＮ６１５４を、ＧＵＳコード配列をタバコ葉緑体のシ
トクロムｆのコード配列の３’末端に機能的に連結したアプロチニンタンパク質
（ｐｅｔＡ）と置換することによって、ｐＣＧＮ４２７６から構築した。従って
、ｐＣＧＮ６１５４は、ｐｅｔＡおよびアプロチニンのヌクレオチド配列に機能
的に連結したＴ７プロモーター配列を含む。チラコイドにアプロチニンタンパク
質発現を指向させるために、ｐｅｔＡ配列を含む。 【０１２２】 実施例２ 植物形質転換 ２Ａ．核形質転換 植物細胞中で構築物ｐＷＲＧ４７４４およびｐＷＲＧ４７４７を発現するよう
に形質転換したタバコ植物を、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５、２
２７、１２２９〜１２３２に記載のように得ることができる。 【０１２３】 ２Ｂ．色素体形質転換 タバコ色素体を、Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９３、９０、９１３〜９１７および本明細書中に記載の
ように微粒子の粒子銃による送達によって形質転換する。 【０１２４】 濃緑色で円形の、Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ中のＢ５ビタミンを補充した無ホルモ
ンＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ． Ｐｌａｎｔ、１５、４７３〜４９７）において、２４℃で１６時間の明
期にｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した３週間〜６週間のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂ
ａｃｕｍ ｃｖ． Ｈａｖａｎａの葉を、好ましくは、シュートの中央から切断
する。次いで、切断した各葉を、タバコシュート再生培地（ＴＳＯ培地、ＭＳ塩
、１ｍｇ／ｌ Ｎ６−ベンジルアデニン、０．１ｍｇ／ｌ １−ナフタレン酢酸
、１ｍｇ／ｌ チアミン、１００ｍｇ／ｌ イノシトール、７ｇ／ｌ寒天（ｐＨ
５．８）、および３０ｇ／ｌ スクロース）を含む滅菌濾紙に軸を平行にして置
く。葉をできるだけ培地に接触させるように、プレートの中央に置くことが好ま
しい。使用直前までにプレートを維持することが好ましいが、プラスチックバッ
グで覆って２４℃で一晩保存することによって粒子銃による形質転換の前日まで
に調製することができる。 【０１２５】 撃ち込み試験でマイクロキャリアとして使用するために、タングステンまたは
金粒子を滅菌する。粒子（５０ｍｇ）を、１ｍｌの１００％エタノールで滅菌し
、−２０℃〜−８０℃で保存する。使用直前に、粒子を遠心分離で沈殿させ、１
ｍｌの滅菌脱イオン水で２〜３回洗浄し、かき混ぜて各洗浄の間に遠心分離した
。洗浄した粒子を、５００μｌの５０％グリセロールに再懸濁した。 【０１２６】 滅菌粒子を、形質転換用のＤＮＡで被覆した。２５μｌアリコートの滅菌粒子
に１．５ｍｌの微量遠心管に添加し、５μｇの目的のＤＮＡを添加し、軽くたた
いて混合する。３５μｌの新たに調製した１．８Ｍ ＣａＣｌ２および３０ｍＭ
スペルミジン溶液を粒子／ＤＮＡ混合物に添加して穏やかに混合し、室温で２０
分間インキュベートする。被覆粒子を短時間の遠心分離によって沈殿させる。粒
子を２００μｌの７０％エタノールを添加して２回洗浄し、穏やかに混合し、短
時間遠心分離する。被覆粒子を、５０μｌの１００％エタノール中に再懸濁し、
穏やかに混合する。５〜１０μｌの被覆粒子を、各撃ち込みに使用する。 【０１２７】 粒子撃ち込みによる形質転換を、製造者によって記載の改変プロトコールを用
いて、ＰＤＳ １０００ヘリウム銃（Ｂｉｏ Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ
）を用いて行った。 【０１２８】 葉サンプルを含むプレートを、バキュームチャンバーの下から２段目の棚に置
き、１１００ｐ．ｓ．ｉ．ラプチャーディスクを用いて撃ち込んだ。撃ち込み後
、葉サンプルを含むペトリ皿プラスチックバッグで覆い、２４℃で４８時間イン
キュベートする。 【０１２９】 インキュベーション後、撃ち込んだ葉を、約０．５ｃｍ２片に切断し、５００
μｇ／ｌのスペクチノマイシンを補充したＴＳＯ培地上に軸を平行にして置く。
選択培地上で３〜４週間後、小さな緑色のスペクチノマイシン耐性シュートが葉
組織上の出現する。これらのシュートは、スペクチノマイシン含有培地で生長し
続け、これを初代推定形質転換体と呼ぶ。 【０１３０】 初代推定形質転換体が２〜３枚葉に成長した時に、２つの小さな切片（約０．
５ｃｍ２）を、各葉から切断し、選択または第２ラウンドのシュート再生に使用
する。一方の切片を、５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを補充したＴＳＯ
培地を含むプレートに軸を平行にして置き、他方の切片を５００μｇ／ｍｌのス
ペクチノマイシンおよびストレプトマイシンをそれぞれ補充したＴＳＯ培地を含
むプレートに軸を平行にして置く。ポジティブな形質転換体を、スペクチノマイ
シンおよびストレプトマイシンを含むＴＳＯ培地に緑色のカルスを形成したシュ
ートによって同定する。 【０１３１】 ３〜４週間後、スペクチノマイシンのみを含むＴＳＯ培地に組織を置き、スペ
クチノマイシンおよびストレプトマイシンを有するＴＳＯ培地緑色のシュートを
発生したものをポジティブと同定した。各ポジティブ形質転換体の２〜４シュー
トを選択し、根の再生用に５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを補充したＴ
ＳＯ培地に移す。２シュートについてサザン分析を行い、下記のようにホモプラ
スミーを確認する。ホモプラスミックな事象のシュートを、種子形成のために温
室に移し、ホモプラスミックではない形質転換体を第２ラウンドに使用するか、
ホモプラスミーを達成するために５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを有す
るＴＳＯ培地で再生する。 【０１３２】 実施例３ 除草剤耐性構築物を有するトランスプラストミックタバコ植物形質
転換体の分析 ３Ａ．サザン分析 植物の全色素体含有物が形質転換された（ホモプラスチック形質転換体）かど
うかを決定するために、ａａｄＡマーカー遺伝子発現用に選択した形質転換植物
を分析する。典型的には、以下の２ラウンドのシュート形成およびスペクチノマ
イシン選択後、色素体ＤＮＡのサザンブロット分析によって同定したところ、分
析された約５０％のトランスジェニック小植物がホモプラスチックである。ホモ
プラスミック小植物を、更なる培養用に選択する。 【０１３３】 Ｓｖａｂら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、９
１３〜９１７に記載のように、ゲノムＤＮＡを、形質転換タバコ植物から単離し
、電気泳動し、濾紙に移す。 【０１３４】 色素体中でＣＰ４ ＥＰＳＰＳを過剰に産生するように形質転換したホモプラ
スミックタバコ植物を、ベクターｐＯＶＺ２（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、１９９４、
前出に記載のｐＯＶＺ１５に類似）由来の２．４ｋｂＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフ
ラグメントから調製したプローブを用いて同定した。２．４ｋｂプローブフラグ
メントは、標的配列の一部を含む。 【０１３５】 サザンハイブリッド形成の結果により、更なる分析用に、構築物ｐＭＯＮ３０
１２３およびｐＭＯＮ３０１３０で形質転換されたタバコ由来の３つのホモプラ
スミック株およびｐＭＯＮ３８７７３で形質転換されたタバコ由来の１つの株を
同定した。 【０１３６】 組込み領域を対象とするプローブを用いた３０１２３−１９−１Ａ、３０１２
３−２３−２Ａ、３０１２３−１８−１Ｂ、３０１３０−５１−２Ａ、３０１３
０−５１−２Ｐ、３０１２３−５７−１Ｐ、および３８７７３−６における３．
２７Ｋｂの天然のタバコＢａｍＨＩフラグメントの完全な消滅、これらの形質転
換体中の挿入ＤＮＡフラグメントについての推測サイズ（５．１４ｋｂおよび０
．９ｋｂ）のバンドの出現は、形質転換植物が意図された構築物についてホモプ
ラスミックであることを証明している。 【０１３７】 サザンハイブリッド形成の結果により、ｐＣＧＮ５１７７で形質転換したタバ
コ由来の３つのホモプラスミック株（７４−１Ｂ−Ｐ、７４−２、および７４−
７）を同定した。 【０１３８】 トランスプラストミックな５１７５および６１１４タバコ株を、上記のホモプ
ラスミーについてサザンハイブリッド形成によって分析した。サザンハイブリッ
ド形成による結果により、ｐＣＧＮ６１１４で形質転換されたタバコ由来の４つ
のホモプラスミック株を同定した。 【０１３９】 ５１７５トランスプラストミックタバコ株からの結果により、ホモプラスミッ
クとして１つの株（７６−４Ａ−Ｆ）、９５％ホモプラスミックとして第２の株
を同定した。 【０１４０】 ＢＸＮ／ＡＨＡＳを過剰生産するように形質転換されたホモプラスミックタバ
コ植物を、上記のようにサザンハイブリッド形成を用いて同定した。 【０１４１】 サザンハイブリッド形成の結果により、ｐＣＧＮ５０２６で形質転換したタバ
コ由来の１４のホモプラスミック株を同定した。濾紙をＢＸＮ遺伝子フラグメン
トで再プローブし、２１株でＢＸＮ含有が見出され、そのうち１４株がホモプラ
スミックであった。 【０１４２】 ３Ｂ．ノーザン分析 トランスプラストミックタバコ植物において発現したＥＰＳＰＳ、ＢＸＮ、ま
たはＡＨＡＳのｍＲＮＡの転写レベルを同定するために、同定した各株から単離
した全ＲＮＡを用いてノーザンブロットハイブリッド形成を行った。製造者のプ
ロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて全ＲＮＡを
単離した。全ＲＮＡ（２μｇ）を、変性アガロースゲルで分離し、ナイロンメン
ブランに移した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９、前出）。放射性プローブを、
ランダムプライマー標識（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製のＲａ
ｎｄａｍ Ｐｒｉｍｅｒ標識キット）ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ、フィトエン不飽和化
酵素、ＢＸＮ、またはＡＨＡＳフラグメントを用いて調製し、ハイブリッド形成
を２×ＳＳＰＥ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９、前出）中、６０℃で行った。
濾紙を剥ぎ取り、プラスミド１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子プローブ（ｐＰＲＶ
１１２Ａ、Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、１９９４、前出）で再プローブして濾紙に均一
にロードしたＲＮＡを確認した。 【０１４３】 ＥＰＳＰＳプローブを用いて行ったノーザンハイブリッド形成の結果は、試験
した７株全てがＣＰ４ ＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡを発現したことを示す。１６Ｓリ
ボゾームプローブで行ったハイブリッド形成により、変性ゲルが各サンプルにつ
いて類似の量のＲＮＡをロードすることが確認された。さらに、Ｐｒｒｎ／ｒｂ
ｃＬ（ＲＢＳ）（ｐＭＯＮ３０１２３）調節エレメントからＥＰＳＰＳを発現す
るトランスプラストミックタバコ株は、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ（ｐＭＯＮ３８７７
３）プロモーター／ＲＢＳ配列によって調節されたＥＰＳＰＳについてホモプラ
スミックなタバコ植物より高レベルのＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡを発現する。 【０１４４】 ＢＸＮ、ＡＨＡＳ、およびｃｒｔＩプローブを用いて行ったノーザンブロット
ハイブリッド形成の結果により、全てのホモプラスミック５０２６、５１７５、
および５１７７タバコ株がｃｒｔＩ、ＢＸＮおよび／またはＡＨＡＳ ｍＲＮＡ
を発現したことが示される。 【０１４５】 ３Ｃ．タバコＣＰ４ ＥＰＳＰＳのウェスタンブロット分析。 【０１４６】 ＥＰＳＰＳの発現を同定するために、各構築物ｐＭＯＮ３０１２３、ｐＭＯＮ
３０１３０、およびｐＭＯＮ３８７７３由来の単一の株に対してウェスタンブロ
ット分析を行った。 【０１４７】 全可溶性タンパク質を、プロテアーゼインヒビターを含む２５０μｌのＰＢＳ
緩衝液（１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、２
．７ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ ７．０））中で２５０ｍｇの組織を粉砕することによ
って凍結葉組織から抽出した。ホモジネートを、５分間遠心分離し、上清を新し
いチューブに移す。上清中のタンパク質濃度を、タンパク質濃縮アッセイ（Ｂｉ
ｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて同定する。 【０１４８】 抽出した全タンパク質を、４〜２０％の１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｓｉｇｍ
ａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で塩基泳動し、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液流で
ＰＶＤＦ膜に移す（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）。定量した精製ＣＰ４ ＥＰＳＰＳタンパク質のス
タンダードを使用して植物色素体中での発現したＣＰ４ ＥＰＳＰＳの発現を定
量した。 【０１４９】 ウェスタンハイブリッド形成を、ＥＰＳＰＳで惹起した抗体の使用以外のＳｔ
ａｕｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎｎａｌ、１２
（２）、６０１〜６０６に記載のように行った。移した電気泳動タンパク質を含
むＰＶＤＦ膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）および５％ミルク
を含むＰＢＳ緩衝液のブロッキング溶液中、４℃で一晩インキュベートした。次
いで、膜を１％ミルクおよびヤギにおいてＣＰ４ ＥＰＳＰＳで惹起された一次
抗体を含むＰＢＳ−Ｔ溶液中、室温で２時間インキュベートする。０．１％ミル
クを含むＰＢＳ−Ｔ溶液中で膜を３回洗浄（各洗浄は率オンで５分間）する。次
いで、膜を、１％ミルクおよび抗ヤギ抗体を含むＰＢＳ−Ｔ溶液中、室温で１時
間インキュベートし、１％ミルクを含むＰＢＳ−Ｔ中で再び洗浄（室温で１０分
間を３回）する。非放射性検出キット（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて膜
を現像する前に、ＰＢＳ−Ｔのみを用いて最終洗浄する。 【０１５０】 【表２】 【０１５１】 表２に列挙の結果は、ＥＰＳＰＳタンパク質レベルの有意な増加がＰｒｒｎ／
Ｇ１０ＬプロモーターからＥＰＳＰＳを発現させるように形質転換した植物から
得ることができることを示す。これらの結果は、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬＲＢＳ調節
配列によって駆動するＥＰＳＰＳ発現によりＥＰＳＰＳとして全可溶性タンパク
質の約０．００１％を産生することができる一方で、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ調節配
列からＥＰＳＰＳを発現する植物では、ＥＰＳＰＳとして全可溶性タンパク質の
０．２％を発現することを示す。その後の株は、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ調節配列か
ら発現した場合、約１％のＥＰＳＰＳの全可溶性タンパク質を示した。上記のノ
ーザンハイブリッド形成の結果と考え合わせると、これらの結果は、Ｇ１０Ｌリ
ボゾーム結合部位からより効率的な転写を得ることができることを示す。 【０１５２】 さらに、ＧＦＰ由来のＮ末端の１４個のアミノ酸を含むプラスチド発現構築物
により高レベルのタンパク質発現が認められた。ｐＭＯＮ４５２５９またはｐＭ
ＯＮ４９２１８のいずれかを含むトランスプラストム系統により全可溶性タンパ
ク質に対するＣＰ４ ＥＰＳＰＳは１２％以上であることが示された。 【０１５３】 ウェスタン免疫ブロットハイブリッド形成を、ブロモキシニルで惹起した抗体
を用いて、上記の２つのホモプラスミック５０２６タバコ株に対しても行った。
ｐＣＧＮ５０２６で形質転換したタバコ株から抽出した全可溶性タンパク質のウ
ェスタン免疫ブロット分析結果は、両ホモプラスミック株がニトリラーゼタンパ
ク質を産生することを示した。 【０１５４】 ｐＣＧＮ６１１４およびｐＣＧＮ５１９７で形質転換したタバコ株から抽出し
た全タンパク質に対するウェスタン免疫ブロット分析を、上記のように行った。 【０１５５】 分析結果は、６１１４タバコ株では、全可溶性葉タンパク質の１％〜２５の範
囲でブロモキシニルを産生することを示した。 【０１５６】 ２０５１９７タバコ株のウェスタン分析の結果は、ブロモキシニルおよびＢｔ
は共に１％の全可溶性葉タンパク質として産生されることを示した。 【０１５７】 ３Ｄ．ＥＰＳＰＳ酵素活性の分析 プラスミド発現ベクターＰＭＯＮ３８７７３を含むトランスプラストミックタ
バコ植物におけるＥＰＳＰＳ酵素活性を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）アッセイを用いて同定した。 【０１５８】 ＥＰＳＰＳ酵素活性の分析方法は、Ｐａｄｇｅｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．、１９８８、２６３、１７９８〜１８０２およびＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９８７、２５８、５６４〜５７３ならびにＷｉｂｂｅ
ｎｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、
１９８８、１５３、７６０〜７６６に記載されている。 【０１５９】 結果を以下の表３に示す。 【０１６０】 【表３】 【０１６１】 これらの結果により、色素体におけるＥＰＳＰＳ発現は活性ＥＰＳＰＳ酵素を
産生することが示される。 【０１６２】 ３Ｅ．グリフォセート耐性の分析 最も高レベルのグリフォセート耐性を同定するために、構築物ｐＭＯＮ３８７
７３にホモプラスミックなトランスプラストミックタバコ株を、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで試験した。外植組織を、非トランスジェニック野生型タバココントロール、
Ｈａｖａｎｎａ、植物およびホモプラスミックタバコ株３８７７３−６の葉片か
ら調製し、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、および２００μＭの
グリフォセートレベルを補充したＴＳＯ培地（上記）でシュートを再生させるた
めに培養した。結果を以下の表４にまとめる。シュートを産生した外植数を外植
調製後３週間および６週間ならびにグリフォセート含有培地での培養時に同定し
た。 【０１６３】 【表４】 【０１６４】 上記の結果は、試験したグリフォセートの全レベルで、ｐＭＯＮ３８７７３い
ｎホモプラスミックなタバコ株から調製した外植片からシュートを再生する一方
で、非形質転換植物から調製した外植片からはシュートは再生されなかったこと
を示す。これらの結果は、色素体においてＥＰＳＰＳを発現するタバコ植物は少
なくとも２００μＭのグリフォセートレベルに耐性を示すことを示唆する。 【０１６５】 更なるトランスプラストミック株を、上記のようにグリフォセート耐性につい
てｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。結果を、表５に示す。 【０１６６】 【表５】 【０１６７】 これらの結果は、これらのトランスプラストミック株がグリフォセート耐性を
示すことを示す。括弧内の数字は、１ｍＭグリフォセートでの選択に耐性を示す
シュート数である。従って、表５で認められ得るように、１ｍＭグリフォセート
での選択に耐性を示すタバコ株が作製された。 【０１６８】 完全な植物の耐性試験のために、３８７７３−６株のホモプラスミックタバコ
植物に、０ｏｚ／エーカー、１６ｏｚ／エーカー、３２ｏｚ／エーカー、および
６４ｏｚ／エーカーに対応する濃度でトラック噴霧器（ｔｒａｃｋ ｓｐｒａｙ
ｅｒ）を用いてグリフォセートを噴霧する。グリフォセート噴霧の前後に植物の
高さを測定した。スプレーの２週間後に栄養傷害データを回収する一方で、植物
成熟時に再生損傷データを回収した。 【０１６９】 最初の結果は、噴霧したホモプラスミックタバコ株は、栄養組織傷害（表６）
で示したように、１６ｏｚ／エーカーの濃度でグリフォセート耐性を示すことを
示す。表５で認められ得るように、３２ｏｚ／エーカーで良好なレベルのグリフ
ォセート耐性を示すトランスプラスミック株が作製された。更なる形質転換株を
用いたその後の試験では、トランスプラストミック株は、６４ｏｚ／エーカーの
レベルのグリフォセートに耐性を示した。 【０１７０】 生長の継続およびグリフォセートを噴霧した組織の操作によって耐性を特徴づ
けた。しかし、グリフォセート適用濃度の増加につれて、栄養傷害レベルが増加
した。それに対して、形質転換コントロール植物は１６ｏｚ／エーカーのグリフ
ォセート濃度でも高度の感受性を示す。 【０１７１】 【表６】 【０１７２】 加えて、その他のトランスプラストム系統を前記の種々濃度のグリフォセート
の噴霧に対する耐性に関して分析した。特異活性を植物抽出物中の単位タンパク
質あたりのシキメート−３−ホスフェート（Ｓ３Ｐ）に転換した外的に添加した
ピルビン酸ホスフォエノール（ＰＥＰ）の量として測定する。グリフォセートの
添加によりグリフォセートに対するＥＰＳＰＳ酵素の感受性を試験する。結果を
表７にまとめる。 【０１７３】 【表７】 【０１７４】 これらのデータにより種々ＥＰＳＰＳ配列を発現するトランスプラストム植物
において高レベルのグリフォセート耐性を得ることができることが示される。と
りわけｐＭＯＮ４５２０４、ｐＭＯＮ４５２５９およびｐＭＯＮ４９２１８系統
は植物組織に関しては少なくとも１２８オンス／エーカー、生殖組織に関しては
少なくとも６４オンス／エーカーの濃度で適用したグリフォセートに対する耐性
を提供する。 【０１７５】 さらに、構築物ｐＭＯＮ４２２５９およびｐＭＯＮ４９２１８により、これら
の構築物で形質転換した植物プラスチドからＣＰ４ ＥＰＳＰＳが高濃度で発現
される。とりわけ、ＣＰ４のＮ末端に融合したＧＦＰの最初の１４個のアミノ酸
をコードする配列を用いた構築物では、全可溶性タンパク質の１２％以上の発現
レベルが得られる。 【０１７６】 ３Ｆ．ＢＴ／ＢＸＮ分析 完全な植物の耐性を試験するために、５１７５および５１９７株のホモプラス
ミックタバコ植物に４％の濃度のブクトリル除草剤を噴霧する。 【０１７７】 ブクトリルでの噴霧試験の結果は、ｂｘｎを発現する全ての５１９７株は、４
％ブクトリル除草剤を含む溶液を噴霧した場合完全な耐性を示すことを示した。 【０１７８】 試験した６つの５１５７株ののうちの２株は、ブクトリルの４％溶液を噴霧し
た場合、完全に耐性を示した。 【０１７９】 ３Ｇ．ノルフラゾン耐性分析 除草剤ノルフラゾン耐性に関するＣｒｔＩ形質の効率を同定するために、実験
を組み立てた。３つの５１７７形質転換株、７４−１Ｂ−ｐ、７４−２−Ａ、お
よび７４−７−Ｃおよび３つのコントロール株を植え付けた。植物を、７週間生
長させ、３μＭのノルフラゾン溶液を与える。ｃｒｔＩ色素体保有遺伝子の存在
にネガティブな植物は、ノルフラゾン処理によって漂白され、ポジティブ植物は
、緑色のままで生長を続けた。 【０１８０】 結果は、３つのホモプラスミック５１７７タバコ株は、３μＭノルフラゾン溶
液に耐性を示す一方で、コントロール植物は全て溶液に感受性を示すことを示す
（表８）。 【０１８１】 【表８】 【０１８２】 実施例４ ｈＧＨトランスジェニックタバコ植物の分析 ４Ａ．サザン分析 植物の全色素体含有物が形質転換されているかどうかを同定するために、ａａ
ｄＡマーカー遺伝子発現用に選択した形質転換植物を分析する。ホモプラスミッ
ク植物を、更なる培養用にサザンハイブリッド形成を用いて選択する。 【０１８３】 Ｓｖａｂら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、９
１３〜９１７に記載のように、ゲノムＤＮＡを、形質転換タバコ植物から単離し
、電気泳動し、濾紙に移す。 【０１８４】 ｈＧＨを発現用に形質転換されたホモプラスミックタバコ植物を、ベクターｐ
ＯＶＺ２（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、１９９４、前出に記載のｐＯＶＺ１５に類似）
由来の２．４ｋｂＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントから調整したプローブを
使用して同定した。２．４ｋｂプローブフラグメントは、標的配列の一部を含む
。 【０１８５】 組込み領域を対象とするプローブを用いた株の３．２７Ｋｂの天然のタバコＢ
ａｍＨＩフラグメントの完全な消滅およびこれらの形質転換体中の挿入ＤＮＡフ
ラグメントについての予想されたサイズ（５．６ｋｂ）の出現は、形質転換植物
が意図した構築物にホモプラスミックであることを証明する。 【０１８６】 ４Ｂ．タンパク質発現分析 ｈＧＨを発現するホモプラスミックタバコ株および核タバコ形質転換体を使用
してｈＧＨタンパク質発現を同定する。プラスミド発現用の構築物ＷＲＧ４８３
８、ｐＭＯＮ３８７５５、およびｐＭＯＮ３８７９４を含むタバコ株に対してウ
ェスタンブロット分析を行い、ｈＧＨの核発現用にｐＷＲＧ４７４４およびｐＷ
ＲＧ４７４７を含むトランスジェニックタバコ株についてＥＬＩＳＡアッセイを
使用した。 【０１８７】 全タンパク質抽出物およびウェスタンブロット法を、ｈＧＨに対して一次抗体
を産生させること以外は上記のように行った。 【０１８８】 【表９】 【０１８９】 ウェスタン分析（表９）の結果は、植物細胞の色素体において発現したｈＧＨ
は、核において発現したｈＧＨより有意に高いレベルで蓄積され、植物細胞の細
胞質または色素体のいずれかを標的化することを示す。核でｈＧｈを発現するよ
うに形質転換されたタバコ植物は、全可溶性葉タンパク質の０．００２％（細胞
質標的）〜０．０２５％（色素体標的）のｈＧＨレベルを蓄積する一方で、細胞
質でｈＧｈを発現するように形質転換されたタバコ植物は、全可溶性葉タンパク
質の０．２％〜７．０％のｈＧＨレベルを蓄積する。さらに、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０
Ｌ調節配列から指向されるｈＧＨを発現するホモプラスミックタバコ植物は、Ｐ
ｐｓｂＡプロモーター配列から指向されるｈＧＨを発言するホモプラスミックタ
バコ植物より３５倍高いレベルのｈＧＨを蓄積する。 【０１９０】 ４Ｃ．色素体において発現するｈＧＨタンパク質の特徴づけ 色素体から発現されるｈＧＨが適切にプロセシングされるかどうかを同定する
ために、試験を行って正確な折りたたみおよび生物活性を同定した。 【０１９１】 ２つの最小レベルのｐＭＯＮ３８７９４を含むトランスプラストミックタバコ
株を使用して、ｈＧＨを抽出して精製した。切り出した葉から大きな葉脈を取り
除き、葉組織を小さな切片（約０．５ｃｍ２）に切断した。葉の切片を液体窒素
中で瞬間冷凍し、冷却した乳鉢および乳棒で細かい粉末に粉砕した。１０グラム
の凍結、粉砕葉組織を、氷冷の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基性溶液（３０ｍｌ）に
添加して、ボルテックスミキサーで５分間激しく混した。溶液を、一枚のチーズ
クロスで濾過した。 【０１９２】 濾過溶液から、３つの個別のサンプルを調製した。第１のサンプルを、４ｍｌ
の濾過物を１６，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によって調製した。遠心分離
物を、１ｍｌのバイアルに等分し、ドライアイス中で凍結した。第２のサンプル
のために、残りの濾過物を、４８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、いくつかの
０．５ｍｌアリコートを上記のように凍結した。残りの遠心分離濾過物（約２５
ｍｌ）に、２００μｌの氷酢酸を添加して、ｐＨを８．２〜４．５６に低下させ
た。第３のサンプルのために、溶液を、４８００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、
上清をドライアイスで凍結した。 【０１９３】 これらのサンプル中の全可溶性タンパク質（ＴＳＰ、表１０）を、標準的なタ
ンパク質アッセイ法（Ｍａｎｉａｔｉｓ）によって計算し、ｈＧＨの純度％を、
開始物質の既知濃度を用いたウェスタンブロット分析の結果に基づいて計算した
。 【０１９４】 【表１０】 【０１９５】 ｐＨを調整して遠心分離した抽出物を、エレクトロスプレー質量分析法用に逆
相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製し、Ｎ末端アミノ酸配列決定を行っ
た。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒシリーズ２００ポンプおよび自動サンプラー、な
らびにＶｙｌａｃ Ｃ８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを用
いてＲＰ−ＨＰＬＣを行った。７５０μｌのサンプルを、２０ｍＭトリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）および５０％アセトニトリルで平衡化したカラムにロードした。
ローディング後、カラムを５０％アセトニトリル、２０ｍＭ ＴＦＡで２分間洗
浄し、２％アセトニトリルの直線的勾配で１０分間、その後１０％アセトニトリ
ル勾配で１分間溶出した。流速は、１．５ｍｌ／分で一定にし、カラムからの溶
出液をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ７８５検出器で２７８ｎｍを監視した。デー
タを回収し、ＰＥ−Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍデータシステムで分析
した。 【０１９６】 ＲＰ−ＨＰＬＣの分析結果を、図３に示す。ピークＩ（最も高いピーク）は、
適切に折りたたまれた天然の２２ｋＤａ ＧＰ２０００と推測される保持時間を
有する。このピークを回収し、Ｎ末端配列決定およびエレクトロスプレー質量分
析法用にＳａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃで乾燥させた。 【０１９７】 エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＭＳ）には、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ
Ｑ−Ｔｏｆエレクトロスプレー飛行時間型質量分析計を使用した。サンプルを、
５０％メタノール＋２％酢酸中での再懸濁によって調製し、４ｍＬ／分の速度の
質量分析計の起点に注入した。図４に示した生データは、種々の付着プロトン数
を有するサンプル中に存在する種に対応する一連のイオンを示す。このスペクト
ルの軸は、存在する種の質量：電荷比に対する強度である。逆重畳積分アルゴリ
ズムを使用してこの一連の多電荷イオンを分子量スペクトルに変換する。 【０１９８】 ＲＰ−ＨＰＬＣピークＩの質量分析法の結果により、異なる分子量の４つの主
要なタンパク質種を示す。２１，９９７ｋＤａの種は、ユビキチンプロテアーゼ
の過剰な切断によって取り除かれた推測Ｎ末端Ｐｈｅを有するｈＧＨの推測分子
量を示す。２２，１２４ｋＤａの種は、適切にプロセシングされたｈＧＨの正確
なアミノ酸配列の推測分子量を示す。２２，５０７ｋＤａおよび２２，６６４ｋ
Ｄａの種は、それぞれＮ末端Ｐｈｅを有するｈＧＨおよび植物抽出操作中に改変
されたｈＧＨを示すと考えられる。計算されたタンパク質の分子量は、色素体か
ら発現されたｈＧＨは適切に折りたたまれる（すなわち、正確なジスルフィド結
合が作製された）ことを示唆する。 【０１９９】 標準的なエドマン分解によってＮ末端配列決定を行い、上記のＮ末端配列を確
認した。 【０２００】 ４Ｄ．植物色素体において発現されるｈＧＨの生物活性 ｐＨ調整して遠心分離した抽出物の生物活性を、Ｎｂ２細胞株由来の細胞を用
いて試験した。この細胞は、成長ホルモンおよび他のエストロゲン型化合物の存
在下で増殖する。アッセイには、種々の濃度の成長ホルモン含有抽出物の９６ウ
ェルプレートへの注入が含まれる。次いで、一定量の細胞を核ウェルに添加する
。プレートを、４８時間インキュベートし、ＭＴＳと呼ばれる試薬を添加する。
代謝細胞はＭＴＳを取り込み、青色の物質に変化する。細胞数の増加につれてウ
ェル中の青色が増加する。青色を、分光光度計を用いて測定する。細胞数は、培
地中の成長ホルモン濃度に比例するはずである。いくらか高濃度で、細胞が成長
ホルモンで飽和し、用量応答が横ばいになると予想される。非常に低濃度のｈＧ
Ｈでは、本質的な生長の増大は認められない。ｈＧＨ濃度グラフに対する細胞数
（または吸収）をグラフ化すると、Ｓ字状グラフになると推測される。 【０２０１】 生物活性アッセイの結果（図５）は、ｈＧＨ濃度に対する吸収をグラフ化した
場合、植物色素体から発現したｈＧＨはＳ字状を有することを示す。 【０２０２】 実施例５ アプロチニントランスプラストミックタバコ植物のウェスタン分析 ５Ａ．色素体におけるアプロチニン発現のウェスタン分析 ホモプラスミックタバコ株発現を使用してアプロチニンタンパク質の発現を同
定する。アプロチニンの色素体発現用に、構築物ｐＣＧＮ６１４６、ｐＣＧＮ６
１４７、ｐＣＧＮ６１５４、およびｐＣＧＮ６１５６を含むタバコ株に対してウ
ェスタンブロット分析を行った。 【０２０３】 アプロチニンに対する一次抗体を惹起させる以外は、上記のように全タンパク
質抽出およびウェスタンブロット分析を行った。 【０２０４】 ウェスタンブロット分析の結果は、アプロチニンコード配列がＰｅｔＡおよび
全長ＧＵＳ遺伝子のいずれかと融合させた場合、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター
から発現されることを示す。さらに、これらの結果は、ｐｅｔＡ配列は植物細胞
チラコイドへアプロチニンタンパク質を効率的に標的することを示す。 【０２０５】 本明細書中に記載の全ての刊行物および特許出願書類は、本発明に関与する当
業者の技術レベルを示す。全ての刊行物および特許出願書類は、各刊行物および
特許出願書類がまるで明確かつ個別に参考として援用されるように同一の範囲で
本明細書中に参照により取入れられる。 【０２０６】 上記発明は、理解を明確にする目的で図面および実施例によっていくらか詳細
に記載されているが、一定の変更および修正が添付の請求項の範囲内で実施する
ことができることが自明である。 【図面の簡単な説明】 【図１】 Ｇ１０Ｌリボゾーム結合部位のヌクレオチド配列を示す図である。 【図２】 アプロチニンをコードするアミノ酸配列を示す図である。 【図３】 色素体において発現されるｈＧＨタンパク質の特徴づけのためのＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ分析の結果を示す図である。ピークＩ（最も大きなピーク）は、適切に折りた
たまれた天然の２２ｋＤａ ＧＰ２０００の予想保持時間を示す。 【図４】 図４は、Ｍｉｃｏｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆエレクトロスプレー飛行時間型質
量分析計を用いたエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＭＳ）を示す図であ
る。特に、付着したプロトン数が変化するサンプル中に存在す種に対応する一連
のイオンを示す。スペクトルの軸は、存在する種の質量：電荷比に対する強度で
ある。 【図５】 植物色素体から発現したｈＧＨの生物活性のグラフを示す。グラフに表示のサ
ンプルは、ウシプロラクチン（ｂＰＬ）、Ｅ．ｃｏｌｉから発現したｈＧＨ（Ａ
ｌａ−ｈＧＨ）、ポジティブコントロールとしてのウシプロラクチンでスパイク
した無効トランスジェニック（ＳＰＦＦ ＮｕｌｌＳｐｉｋｅ）、ネガティブコ
ントロールとしての無効トランスジェニック（ＳＰＦＦ Ｎｕｌｌ）、およびセ
ファロースカラム由来のトランスジェニックサンプル（ＳＰＦＦ Ｓａｍｐｌｅ
、ＳＰＦＦ Ｓａｍｐｌｅ）、ならびにｐＨ３．５でのセファロースカラムから
溶出されたトランスジェニックサンプル（ＳＰＦＦ ｐＨ３．５ Ｅｌｎ）であ
る。 【図６】 Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター／ＲＢＳハイブリッドの核酸配列を示す。Ｐ
ｒｒｎプロモーターはコンセンサス・プラスチド−３５および−１０プロモータ
ーエレメント（下線部）およびプラスチドコード化ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｌａ
ｓｔｉｄ−Ｅｎｃｏｄｅｄ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ＰＥＰ）の転写出
発部位（太字のＧＣ）を含む。遺伝子１０リーダー（Ｇ１０Ｌ）は完全なプラス
チドリボソーム結合部位（ＲＢＳ、太字のヌクレオチド）を含む。 【図７】 Ｐｒｒｎ／ＮＥＰ／Ｇ１０Ｌ：：１４ａａＧＦＰ融合の核酸配列を示す。ＮＥ
Ｐプロモーター領域には下線を付している（太字のＡは転写出発部位である）。
用いたＮＥＰプロモーター領域はプロモーターの上流及び下流の両方のコンセン
サス配列を越えて伸びている。開始ＡＴＧ、開始メチオニンはＧＦＰの１４個の
アミノ酸には数えない。
体におけるタンパク質発現増大のための組成物および方法に関する。 【０００２】 背景 高等植物の色素体は、遺伝子操作の魅力的な対象である。植物色素体（葉緑体
、アミロプラスト、エライオプラスト、エチオプラスト、有色体など）は、光合
成に加えて、アミノ酸、複合糖質、脂肪酸、および色素などの産業的に重要な化
合物の産生を担う主要な生合成中心である。色素体は、プロプラスチドとして既
知の共通の前駆体から誘導されるので、一定の植物種に存在する色素体は全て、
同一の遺伝成分を有する。植物細胞は、５００〜１０，０００コピーの小さな１
２０〜１６０キロベースの環状ゲノムを含み、その各分子は、大きな（約２５ｋ
ｂ）逆方向反復を有する。従って、非常に高レベルの外来遺伝子発現を潜在的に
得ることができる、２０，０００コピーまでの目的の特定の遺伝子を含むように
植物細胞を操作することが可能である。さらに、ほとんどの植物の色素体は、母
性遺伝である。従って、核で発現した異種遺伝子と異なる、色素体で発現した異
種遺伝子は花粉を飛散しないので、植物色素体に移入された形質は、野生型系列
に伝わらない。 【０００３】 植物色素体中の遺伝子発現用の改良された調節エレメントが依然として必要と
されている。現在まで、色素体導入遺伝子発現用に日常的に使用されている発現
シグナルは、内因性色素体遺伝子から誘導される。色素体発現シグナルは、典型
的には、１６ＳリボゾームＲＮＡオペロン（Ｐｒｒｎ）、ｐｓｂＡ遺伝子（Ｐｐ
ｓｂＡ）、またはｒｂｃＬ遺伝子（ＰｒｂｃＬ）由来のプロモーター領域などの
高発現色素体遺伝子のプロモーター領域から誘導される。ｐｓｂＡおよびｒｂｃ
Ｌ遺伝子は高度に転写されるが、その翻訳は、組織特異的因子および光調節因子
によって調節され、その有用性が制限される。Ｐｒｒｎの場合、典型的には、色
素体ｒｂｃＬ遺伝子リーダーを模倣した合成リボゾーム結合部位（ＲＢＣ）が使
用されている。しかし、このＰｒｒｎ／ＲＢＳは、リボゾーム結合が不十分であ
るために、非効率的に翻訳される。 【０００４】 完全に異種の発現系を使用して、色素体遺伝子を発現させている（米国特許第
５，５７６，１９８号（その全体が本明細書中に参照により取入れられる））。
この系は、２成分系である。第１の成分は、Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０
プロモーター／リーダー配列によって運ばれた色素体トランスジーンである。第
２の成分は、色素体区画に標的化されるＴ７ポリメラーゼをコードする核遺伝子
である。好ましい方法でＴ７ポリメラーゼを発現する核形質転換株を作製するた
めに、この系の制限が必要である。 【０００５】 高等植物の色素体は、遺伝子操作用の魅力的な標的である。上記のように、高
等植物の色素体は、母性遺伝である。これは、これらの形質が野生型系列に伝わ
らないので、天然または化学的条件（除草剤耐性）に寛容または耐性にする植物
の遺伝子操作に利点を付与する。さらに、高レベルの外来遺伝子発現は、薬学的
に重要なタンパク質の産生などの形質の操作用として魅力的である。 【０００６】 除草剤耐性を与える酵素ならびに植物色素体ゲノム由来の薬学的タンパク質を
コードする核酸配列の発現により、植物核ゲノム由来の発現の魅力的な代替物が
付与される。 【０００７】 発明の要旨 本発明は、植物色素体中で真核生物および原核生物の広範な種々の遺伝子の発
現の増大に有用な核酸配列を提供する。さらに、植物細胞の遺伝子操作に有用で
あり、ＥＰＳＰ合成タンパク質または植物細胞色素体中のｈＧＨタンパク質の発
現を増大させる色素体発現構築物を提供する。形質転換色素体は代謝活性色素体
であるべきであり、好ましくは、目的の植物組織中に高コピー数で維持され、最
も好ましくは、葉または子葉などの緑色植物組織中に見出される葉緑体である。 【０００８】 本発明で使用される色素体発現構築物には、一般に、ＤＮＡ配列の発現を増大
させることができる色素体プロモーター領域、ＥＰＳＰＳタンパク質またはｈＧ
ＨをコードするＤＮＡ配列、および植物色素体における転写を終結させることが
できる転写終結領域が含まれる。 【０００９】 本発明の色素体プロモーター領域は、植物色素体におけるｍＲＮＡ転写物の翻
訳を増大させるリボゾーム結合部位に連結していることが好ましい。 【００１０】 本発明の色素体発現構築物は、植物色素体中で発現することができる選択的マ
ーカーをコードするＤＮＡ配列を有する構築物に連結していることが好ましい。
選択的マーカーの発現により、マーカーを発現する色素体を含む植物細胞の同定
が可能である。 【００１１】 好ましい実施形態では、構築物の植物細胞への導入用のベクターには、発現構
築物および選択構築物のプラスミドゲノムへの挿入手段が含まれる。これは、構
築物に隣接する標的色素体ゲノムに対する相同性領域を含むことが好ましい。 【００１２】 本発明の構築物は、植物色素体におけるｍＲＮＡ転写物の翻訳を増大すること
ができるリボゾーム結合部位に連結したプロモーター配列を含むことが好ましい
。リボゾーム結合部位は、Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０リーダー配列から
誘導されることが好ましい。 【００１３】 本発明において、植物色素体における核酸配列の高レベルの発現が特に目的と
される。除草剤耐性に関与する酵素および薬学的タンパク質をコードする核酸の
高レベルの発現が特に目的とされる。 【００１４】 本発明の構築物は、５−エノイルピルビルシキメート−３−ホスフェートシン
ターゼ（米国特許第５，６３３，４３５号（その全体が本明細書中に参照により
取入れられる））、ニトリラーゼ、フィトエン不飽和化酵素、アプロチニンをコ
ードするＤＮＡ配列またはヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡ配列（米国特許
第５，４２４，１９９号（その全体が本明細書中に参照により取入れられる））
を含むことが好ましい。 【００１５】 本発明において、構築物を含む色素体を含む植物細胞色素体は、構築物を含む
植物、植物の種子、植物細胞、またはその子孫であることもまた意図される。 【００１６】 本発明はまた、植物色素体中のＤＮＡ配列の発現増大方法を含む。 【００１７】 本発明はまた、植物細胞の色素体中でのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｐＣＰ４ ＥＰＥＰ株の発現によって、植物細胞における
除草剤耐性を付与する酵素の発現増大方法を含む。 【００１８】 さらに、本発明はまた、植物細胞の色素体においてｈＧＨをコードする酵素の
発現増大方法を含む。 【００１９】 従って、本発明は、除草剤耐性コード配列または薬学的タンパク質のコード配
列を含むキメラ遺伝子、除草剤耐性遺伝子または薬学的コード遺伝子に機能的に
連結した植物色素体における発現を増大させることができるＴ７バクテリオファ
ージポリメラーゼ遺伝子１０リボゾーム結合部位に機能的に連結したプロモータ
ーを含む植物色素体発現ベクター、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼ遺伝子
１０リボゾーム結合部位に連結した色素体プロモーターから発現する除草剤耐性
遺伝子または薬学的コード遺伝子を有する植物形質転換ベクター、このようなベ
クターを用いて形質転換された植物細胞、および核酸配列およびタンパク質発現
の実質的な程度を示す再生植物、ならびにこのような植物の産生法に関する。 【００２０】 図面の簡単な説明 図１は、Ｇ１０Ｌリボゾーム結合部位のヌクレオチド配列を示す図である。 【００２１】 図２は、アプロチニンをコードするアミノ酸配列を示す図である。 【００２２】 図３は、色素体において発現されるｈＧＨタンパク質の特徴づけのためのＲＰ
−ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。ピークＩ（最も大きなピーク）は、適切
に折りたたまれた天然の２２ｋＤａ ＧＰ２０００の予想保持時間を示す。 【００２３】 図４は、Ｍｉｃｏｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆエレクトロスプレー飛行時間型質
量分析計を用いたエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＭＳ）を示す図であ
る。特に、付着したプロトン数が変化するサンプル中に存在す種に対応する一連
のイオンを示す。スペクトルの軸は、存在する種の質量：電荷比に対する強度で
ある。 【００２４】 図５は、植物色素体から発現したｈＧＨの生物活性のグラフを示す。グラフに
表示のサンプルは、ウシプロラクチン（ｂＰＬ）、Ｅ．ｃｏｌｉから発現したｈ
ＧＨ（Ａｌａ−ｈＧＨ）、ポジティブコントロールとしてのウシプロラクチンで
スパイクした無効トランスジェニック（ＳＰＦＦ ＮｕｌｌＳｐｉｋｅ）、ネガ
ティブコントロールとしての無効トランスジェニック（ＳＰＦＦ Ｎｕｌｌ）、
およびセファロースカラム由来のトランスジェニックサンプル（ＳＰＦＦ Ｓａ
ｍｐｌｅ、ＳＰＦＦ Ｓａｍｐｌｅ）、ならびにｐＨ３．５でのセファロースカ
ラムから溶出されたトランスジェニックサンプル（ＳＰＦＦ ｐＨ３．５ Ｅｌ
ｎ）である。 【００２５】 図６はＰｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター／ＲＢＳハイブリッドの核酸配列を示
す。Ｐｒｒｎプロモーターはコンセンサス・プラスチド−３５および−１０プロ
モーターエレメント（下線部）およびプラスチドコード化ＲＮＡポリメラーゼ（
Ｐｌａｓｔｉｄ−Ｅｎｃｏｄｅｄ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ＰＥＰ）の
転写出発部位（太字のＧＣ）を含む。遺伝子１０リーダー（Ｇ１０Ｌ）は完全な
プラスチドリボソーム結合部位（ＲＢＳ、太字のヌクレオチド）を含む。 【００２６】 図７はＰｒｒｎ／ＮＥＰ／Ｇ１０Ｌ：：１４ａａＧＦＰ融合の核酸配列を示す
。ＮＥＰプロモーター領域には下線を付している（太字のＡは転写出発部位であ
る）。用いたＮＥＰプロモーター領域はプロモーターの上流及び下流の両方のコ
ンセンサス配列を越えて伸びている。開始ＡＴＧ、開始メチオニンはＧＦＰの１
４個のアミノ酸には数えない。 【００２７】 発明の詳細な説明 本発明によれば、一般に、植物色素体中で機能的なプロモーター、Ｔ７バクテ
リオファージポリメラーゼ遺伝子１０リーダーから誘導されるリボゾーム結合部
位、目的の遺伝子をコードするＤＮＡ配列、および植物色素体における転写を終
結することができる転写終結領域を含む色素体発現構築物が得られる。これらの
エレメントは、５’→３’の転写方向で機能的に連結した成分として得られる。 【００２８】 さらに、本発明の構築物はまた、葉緑体内のチラコイド内腔へタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列を標的化することができるペプチドをコードする核酸配列を
含む。 【００２９】 本発明では、また、核酸配列の高レベルの転写および翻訳（発現）を指向する
ための色素体発現構築物の使用を特に目的とする。このような色素体発現構築物
は、除草剤耐性に関する酵素および薬学的タンパク質の産生をコードするＤＮＡ
配列の高レベルの発現の指向に使用されている。 【００３０】 本発明では、転写されたメッセンジャーＲＮＡの高レベルの転写を指向するた
めの色素体発現構築物の使用を特に目的とする。 【００３１】 ＤＮＡ配列および生化学的データにより、色素体オルガネラの転写および翻訳
機構ならびに開始シグナルが原核生物系で見出されるそれらに類似していること
が明らかにされている。実際、色素体由来のプロモーター配列は、原核細胞中の
レポーター遺伝子の発現を指向することが報告されている。さらに、色素体遺伝
子は、しばしば、原核生物のようにポリシストロニックなオペロンを組織化して
いる。 【００３２】 色素体と原核生物との間の明らかな類似性にもかかわらず、色素体および原核
生物における遺伝子発現を調節するために使用される方法には基本的な相違が存
在する。原核生物に典型的に認められる転写調節機構が逆であるので、色素体遺
伝子発現は、トランスで活性な核がコードするタンパク質によって高レベルの翻
訳およびｍＲＮＡ安定性が優位に調節される。 【００３３】 転写は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のリボゾームへの結合を第１に含
む多段階のプロセスである。翻訳開始コドンから始まり、ｍＲＮＡコドンは、リ
ボゾームがｍＲＮＡ分子に沿って移動しながら連続的に読み取られる。次いで、
特定のアミノ酸が成長中のポリペプチド鎖に連続的に付加されてｍＲＮＡ中でコ
ードされたタンパク質またはポリペプチドを得る。 【００３４】 上述のように、翻訳プロセスの第１段階は、リボゾームへのｍＲＮＡ分子の結
合である。この相互作用（すなわち、結合）の性質は、一部が解明されているだ
けである。細菌の翻訳開始複合体から単離されたＲＮアーゼ耐性オリゴヌクレオ
チドの分析によって、約３０〜４０個のヌクレオチド長のＲＮＡフラグメントは
初期リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を含むことが示されている。従って、ＲＢＳ
は、その後、リボゾーム結合および翻訳開始を担い得る翻訳開始コドンを取り囲
むｍＲＮＡ配列を含むと理解される。 【００３５】 最近、原核生物における翻訳を指向し得るリボゾーム結合部位が同定された。
例えば、原核生物における核酸配列の発現を増大させる、Ｔ７バクテリオファー
ジ遺伝子１０リーダー（Ｇ１０Ｌ（米国特許第５，２３２，８４０号、その全体
が本明細書中に参照により取入れられる））から誘導されるリボゾーム結合部位
が同定された。 【００３６】 Ｎ−ホスホノメチルグリシン、ハロゲン化ヒドロキシベンゾニトリル、および
ニルフラゾンなどの除草剤は、多くの研究の対象とされてきた。 【００３７】 一般にグリフォセートと呼ばれるＮ−ホスホノメチルグリシンは、アミノ酸、
植物ホルモン、およびビタミンを含む芳香族化合物の生合成を誘導するシキミ酸
経路を阻害する。特に、グリフォセートは、ホスホエノイルピルビン酸（ＰＥＰ
）および３−ホスホシキミ酸の５−エノイルピルビル−３−ホスホシキミ酸への
変換を、酵素５−エノイルピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（
以後ＥＰＳＰシンターゼまたはＥＰＳＰＳと呼ぶ）を阻害することによって抑制
する。 【００３８】 グリフォセート耐性植物は、種々のＥＰＳＰシンターゼ遺伝子の植物の核ゲノ
ムへの形質転換によって作製されている。ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子は、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｐＣＰ４株（米国特許第５
，６３３，４３５号）からクローン化されており、これは、植物における高レベ
ルのグリフォセート耐性を付与する。さらに、高レベルのグリフォセート耐性は
、色素帯中での発現標的化用の葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）へのＥＰＳＰＳの
融合によって多数の作物で達成されている。さらに、ＥＰＳＰＳアミノ酸コード
配列の変化の結果としてグリフォセート耐性である種々の野生型ＥＰＳＰＳ酵素
が単離されている（Ｋｉｓｈｏｒｅ ａｎｄ Ｓｈａｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．、１９８８、５７、６２７〜６６３、Ｓｈｕｌｚｅら、Ａｒｃｈ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８４、１３７、１２１〜１２３、Ｋｉｓｈｏｒｅら
、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．、１９８６、４５、１５０６）。これらの変異体は、典型
的には、グリフォセート耐性表現型を付与する野生型ＥＰＳＰＳ酵素より高いグ
リフォセートのＫｉを有するが、これらの変異体はまた、酵素の動態学的有効性
を低くするＰＥＰの高いＫｍによって特徴づけられる（Ｋｉｓｈｏｒｅ ａｎｄ
Ｓｈａｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８、５７、６２７〜６
６３、Ｓｏｓｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８４、１７３、２３８〜２４１
、Ｓｈｕｌｚｅら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８４、１３７、１２
１〜１２３、Ｋｉｓｈｏｒｅら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．、１９８６、４５、１５０
６、Ｓｏｓｔ ａｎｄ Ａｍｒｈｅｉｎ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．、１９９０、２８２、４３３〜４３６）。 【００３９】 グリフォセート耐性のための植物操作に加えて、植物はまた、核において発現
される核酸配列を用いて、ハロゲン化ヒドロキシベンゾニトリルおよびノルフル
ラゾンなどの他のクラスの除草剤に耐性を示すように操作されている。 【００４０】 ブロモキシニルなどのハロゲン化ヒドロキシベンゾニトリルは、電子伝達を阻
害する、光化学系ＩＩのキノン結合タンパク質複合体の阻害によって除草作用を
示すと示唆されている（Ｖａｎ Ｒｅｎｓｅｎ、１９８２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐ
ｌａｎｔ、５４、５１５〜５２０、およびＳａｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｐａｌｌｅ
ｔｔ、１９８６、Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６、１
１６、１２２）。ノルフルラゾンなどの除草剤は、カロテノイドの産生を阻害す
る。 【００４１】 ブロモキシニルに耐性を示す植物は、植物細胞の核においてブロモキシニル（
ニトリラーゼ）を解毒することができる酵素をコードするＤＮＡ配列の発現によ
って産生されている。このようなニトリラーゼをコードするＤＮＡ配列は、Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの細菌からクローン化され、植物
細胞の核におけるＤＮＡ配列の発現を指向するためのベクターの構築に使用され
ている（米国特許第４，８１０，６４８号（この全体が本明細書中に参照により
取入れられる））。 【００４２】 ノルフルラゾンに耐性を示す植物は、植物細胞の核におけるカロテノイド生合
成経路における酵素をコードする核酸配列の発現によって操作されている。例え
ば、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来のフィトエン不飽和化酵素の発現
によって、ノルフルラゾン耐性が得られる。 【００４３】 核ゲノム由来のこのような酵素をコードする核酸配列を発現させるために形質
転換された植物が除草剤耐性植物の操作に利用されている一方で、色素体発現を
介して除草剤耐性を獲得する利点が増大するであろう。 【００４４】 本明細書中で提供した実施例では、除草剤耐性に関与する酵素をコードするＤ
ＮＡ配列を、植物色素体由来の配列の発現を指向する構築物に使用する。５−エ
ノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、ブロ
モキシニルニトリラーゼ（Ｂｘｎ）、フィトエン不飽和化酵素（ｃｒｔＩ（Ｍｉ
ｓａｗａら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、４、８３３〜８４０、お
よび１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ．、６、４８１〜４８９））、およびアセ
トヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ（Ｓａｔｈａｓｉｉｖａｎら、１９９０、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８、２１８８〜２１９３））をコードする
ＤＮＡ配列を、植物色素体由来の除草剤耐性ヌクレオチド配列の発現を指向する
ために、本発明の発現構築物に使用する。 【００４５】 除草剤耐性遺伝子をコードする目的のＤＮＡ配列にホモプラスミックなトラン
スプラスミックタバコ植物が同定されている。ホモプラスミック植物は、色素体
由来の高レベルのタンパク質発現を示す。さらに、ホモプラスミック植物は、そ
れぞれの除草剤への高レベルの耐性を示す。例えば、以下の実施例で詳述のよう
に、色素体由来のＥＰＳＰＳを発現させるために形質転換された植物は、除草剤
グリフォセートへの高レベルの耐性を示す。さらに、ニトリラーゼまたはフィト
エン不飽和化酵素を発現するホモプラスミックタバコ株は、除草剤ブロモキシニ
ルおよびノルフルラゾンへの高レベルの耐性を示す。 【００４６】 本発明に関連する当業者は、本発明の色素体発現構築物に更なる配列を用いて
除草剤耐性植物を産生することができることを理解するであろう。色素体発現構
築物除草剤耐性植物に使用することができる他の核酸配列には、グルフォシネー
ト耐性ｂａｒ遺伝子が含まれる（ＤｅＢｌｏｃｋら、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．
、６、２５１３〜２５１９）。 【００４７】 さらに、更なるグリフォセート耐性遺伝子を、本発明の構築物に使用すること
ができる。更なるグリフォセート耐性ＥＰＳＰＳ遺伝子が米国特許第５，６２７
，０６１号、Ｐａｄｇｅｔｔｅら、１９９６、Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ｒｅｓｉｓ
ｔａｎｔ Ｃｒｏｐｓ、Ｌｅｗｉｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、５３〜８５、およ
びＰｅｎａｌｏｚａ−Ｖａｚｑｕｅｚら、１９９５、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ、１４、４８２〜４８７（これらの全体が本明細書中に参照により
取入れられる）に記載されている。 【００４８】 本発明の除草剤耐性構築物には、他のストレス耐性遺伝子（例えば、昆虫また
は疾患の耐性遺伝子）に関与する配列をコードする遺伝子も含むことができるこ
とを留意すべきである。以下の実施例で詳述のように、色素体発現構築物を使用
して除草剤ブクトリルに耐性で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｓｉｓ
ｃｒｙｌＡｃタンパク質も発現する植物を再生する。 【００４９】 さらに、色素体発現構築物はまた、植物色素体由来のヒト生物学的タンパク質
（薬学的タンパク質）の産生に使用される。ｈＧＨをコードする核酸配列を、本
発明の色素体発現構築物に使用する。さらに、このような構築物を含むトランス
プラストミックタバコ植物は、高レベルのｈＧＨ発現を示す。さらに、植物色素
体から発現されたｈＧＨは、適切なプロセシングならびに適切なタンパク質折り
たたみの特徴を示す。 【００５０】 一般に、薬学的タンパク質産生の伝統的な方法は、発現および大量生産系に原
核生物および単細胞の真核生物を使用する。例えば、ヒト生物学的ヒト成長細胞
（米国特許第５，４２４，１９９号）の産生は、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＥ．ｃ
ｏｌｉ細胞で達成されている。 【００５１】 別の例は、アプロチニン産生である。アプロチニン産生の伝統的な方法は、細
菌におけるアプロチニン発現、またはより一般的にはウシの器官または組織由来
のタンパク質抽出物を使用している。従って、当該分野では、このようなヒト生
物製剤の大量生産用の別のアプローチが必要である。 【００５２】 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、正常なヒトの成長および発育の多くの調節に
関連する。この２２，０００ダルトンの下垂体ホルモンは、直線的な成長（体発
生）、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様効果および糖尿病誘発
効果などを示す（Ｃｈａｗｌａ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、１９８３、３４、
５１９、Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２３９、７６９、Ｔｈ
ｏｒｎｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９８８、８１、７４５）。子
供における成長遅滞は小人症を誘導し、これは、ｈＧＨの外因的投与によって１
０年以上首尾よく治療されている。ｈＧＨは、胎盤のラクトゲン、プロラクチン
、および他の遺伝子および種の変異体または成長ホルモンを含む相同ホルモンフ
ァミリーのメンバーである（Ｎｉｃｏｌｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅ
ｗｓ、１９８６、７、１６９）。ｈＧＨは、広い種特性を示し、クローン化体形
成（Ｌｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８７、３３、５３７）またはプロラクチ
ンレセプター（Ｂｏｕｔｉｎら、Ｃｅｌｌ、１９８８、５３、６９）のいずれか
に結合するという点で、これらのうちでも珍しい。 【００５３】 アプロチニン（ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）としても既知）
は、リンパ節、膵臓、胚、耳下腺、脾臓、および肝臓などのいくつかのウシ器官
および組織に存在する塩基性タンパク質である。 【００５４】 アプロチニンは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、およびカリクレ
インを含む種々のセリンプロテアーゼを阻害することが既知であり、急性膵炎、
種々の段階のショック症候群、線溶亢進性出血、および心筋梗塞の治療に使用さ
れている。さらに、高用量でのアプロチニンの投与により、心肺バイパスを含む
心臓手術に関連する失血が減少する（Ｂｉｄｓｔｒｕｐら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓ
ｃ．Ｓｕｒｇ．、４４、６４０〜６４５）。 【００５５】 以下の実施例でより詳細に示すように、色素体発現構築物を使用して、植物色
素体由来のアプロチニンおよびヒト成長ホルモンの発言を指向する。 【００５６】 ヒト生物製剤の産生に使用することができる他の配列には、インスリンをコー
ドする配列が含まれるか、またはインスリン前駆体は本発明の発現構築物に使用
することができる。当業者は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｅｌｍａｎ、１９９
０、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ、Ｐｅｒｇａｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、第８版、第１４章および第１５章に記
載の植物色素体などからその発現を指向するために、ヒト生物製剤をコードする
多数のヌクレオチド配列を本発明の構築物に使用することができることを認識す
るであろう。 【００５７】 構築物の発生では、調節領域およびオープンリーディングフレームを含む種々
のフラグメントを、連結、制限酵素消化、ＰＣＲ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発、
リンカーおよびアダプター添加などの種々の処理条件に供することができる。従
って、ヌクレオチドのトランジション、トランスバージョン、挿入、欠失などを
、色素体における発現用の調節領域または目的のＤＮＡ配列に使用されるＤＮＡ
に対して行うことができる。制限酵素消化、クレノウ平滑末端処理、連結などの
方法は、当業者に既知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、１９８９、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載されている。 【００５８】 構築物の調製中、ＤＮＡの種々のフラグメントは、しばしば、ＤＮＡの増幅、
ＤＮＡの修飾、または配列の連結または除去によるＤＮＡの操作などを可能にす
る適切なクローニングベクターにクローン化される。好ましくは、ベクターは、
Ｅ．ｃｏｌｉ中に少なくとも比較的高コピー数複製することができる。ｐＢＲ３
２２のようなベクター、ｐＵＣ系ベクター、Ｍ１３系ベクター、およびｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を
含む多数のベクターを容易に適用可能である。 【００５９】 所望の植物細胞の選択法を得るために、プラスミド形質転換用のベクターは、
典型的に、選択的マーカー遺伝子発現が得られる構築物を含む。マーカー遺伝子
は、選択物質（すなわち、抗生物質、除草剤など）の弱毒化または不活化によっ
て天然の阻害に耐性を示すポリペプチドを発現する植物発現ＤＮＡ配列である。 【００６０】 あるいは、マーカー遺伝子により、視覚可能な他のいくつかの反応を得ること
ができる。すなわち、植物もしくは植物細胞に直接適用するか、植物もしくは植
物細胞の成長培地中に存在するので、いくつかの物質の存在下で選択的マーカー
遺伝子を発現しない植物または植物細胞と比較して際立った外見または成長パタ
ーンを生じ得る。 【００６１】 どちらの場合も、このような選択的マーカー遺伝子を含む植物または植物細胞
は、同定の目的のために際立った表現型を有する。すなわち、これらは、非形質
転換細胞と区別可能である。特徴的な表現型により、細胞、細胞群、組織、器官
、植物の部位、または構築物を含む植物全体の同定が可能である。 【００６２】 マーカーの表現型の検出により、マーカー遺伝子が連結している第２の遺伝子
を有する細胞の選択が可能となる。この第２の遺伝子は、典型的には、形質転換
細胞において容易に区別可能ではないが植物細胞またはその誘導体が成熟してい
る場合、選択的マーカーの表現型自体が明らかではない条件下でさえ存在する所
望の表現型を含む。 【００６３】 色素体構築物を含む植物細胞の同定用のこのようなマーカーの使用については
、Ｓｖａｂら、１９９３、前出に記載されている。下記の実施例では、細菌ａａ
ｄＡ遺伝子は、葉緑体５’プロモーターおよび３’転写終結領域、特に、ｐｓｂ
Ａ遺伝子の調節領域の調節下でのマーカーとして発現される（Ｓｔａｕｂら、Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．、１９９３、１２（２）、６０１〜６０６に記載）。多数のさらな
るプロモーター領域を使用して、植物色素体において機能的な種々のプラスミド
プロモーターおよび細菌プロモーターを含む選択的マーカー遺伝子の発現を駆動
することもできる。 【００６４】 ａａｄＡ遺伝子発現により、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐
性が付与され、それにより、このマーカーを発現する植物細胞の同定が可能であ
る。ａａｄＡ遺伝子産物は、成長を継続させ、葉緑体が選択的マーカー遺伝子産
物を含む細胞を緑化させる。選択的マーカー遺伝子を含まない細胞は漂白される
。従って、ａａｄＡ遺伝子マーカーの選択は、植物成長培地中のストレプトマイ
シンまたは好ましくはスペクチノマイシンの存在によって漂白されない植物細胞
の同定に基づく。 【００６５】 クロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマイシンなどに
耐性を示す、植物細胞に使用するための多数のマーカーが開発されている。葉緑
体代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子もまた、選択的マーカーとして使
用することができる。例えば、グリフォセート、ブロモキシニル、またはイミダ
ゾリノンなどの植物除草剤耐性を得る遺伝子を特定の特定の用途に使用すること
ができる。このような遺伝子は、報告されている（Ｓｔａｌｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２６０、４７２４〜４７２８（グリフォセート耐
性ＥＰＳＰ）、Ｓｔａｌｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８５、２６
３、６３１０〜６３１４（ブロモキシニル耐性ニトリラーゼ遺伝子）、およびＳ
ａｔｈａｓｉｖａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０、１８、２
１８８（ＡＨＡＳイミダゾリノン耐性遺伝子））。 【００６６】 粒子銃によるタバコ色素体ゲノムの安定な形質転換が報告されている（Ｓｖａ
ｂら、１９９０、前出およびＳｖａｂら、１９９３、前出）。これに記載の方法
を使用して、色素体発現構築物にホモプラスミックな植物を得ることができる。 【００６７】 一般に、粒子を撃ち込んだ組織を、細胞分裂促進培地で約２日間培養し、その
後、植物組織を阻害量の特定の選択因子、ならびに特定の植物種を再生させるた
めの特定のホルモンおよび他の物質を含む選択培地に移す。次いで、ホモプラス
ミックなシュートの産生および選択を確保するためにシュートを同一の選択培地
で継代培養する。 【００６８】 トランスプラストミックなタバコ植物を、形質転換色素体ゲノム（ホモプラス
ミック株）の純粋な集団について分析する。ホモプラスミー（ｈｏｍｏｐｌａｓ
ｍｙ）を、導入遺伝子領域および葉緑体ゲノムにわたる核酸プローブ（すなわち
、挿入領域）を用いたサザン分析を用いて評価する。ヘテロプラスミックな（す
なわち、導入遺伝子を含む色素体ゲノムと導入遺伝子を含まない色素体ゲノムと
の混合物を含む）トランスプラストミック植物を、野生型およびトランスジェニ
ックバンドのハイブリッド形成パターンによって特徴づける。ホモプラスミック
植物は、野生型のバンドを欠くハイブリッド形成パターンを示す。 【００６９】 あるいは、ホモプラスミーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて評価
することができる。挿入領域由来の配列から増幅するために標的化されたＰＣＲ
プライマーを利用する。例えば、プライマー対をＰＣＲ反応に使用することがで
きる。第１のプライマーは導入遺伝子中のある領域から増幅する一方で、第２の
プライマーは挿入領域に向かって挿入領域に近位の領域から増幅する。第２のＰ
ＣＲ反応を、挿入領域を増幅するように設計したプライマーを用いて行った。ホ
モプラスミックと同定されたトランスプラストミック株は第１の反応において予
想されたサイズのフラグメントを産生した一方で、第２の反応において予想され
たサイズのフラグメントを産生しなかった。 【００７０】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、撃ち込みまたはいくつかの他の方
法のいずれかによって形質転換法および再生法を一定の植物種に適用した場合、
確立された技術を、選択法および再生法で使用するために改変して、色素体形質
転換植物を作製することができる。例えば、本明細書中に記載のタバコ用の方法
を、トマト、ツクバネアサガオ、およびジャガイモなどの他のナス科の種に容易
に適用可能である。 【００７１】 ダイズの形質転換用の粒子銃ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転
換および再生プロトコールが記載されている（Ｈｉｎｃｈｅｅら、米国特許第５
，４１６，０１１号、Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、米国特許第５．０１５，５８０号）
。当業者は、ダイズ形質転換用に記載されたプロトコールを使用することができ
ることを認識するであろう。 【００７２】 Ｂｒａｓｓｉｃａでは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換および再生
プロトコールには、一般に、胚軸組織、色素体含有量が低くあり得る非緑色組織
の使用が含まれる。従って、Ｂａｓｓｉｃａでは、好ましい標的組織は、小胞子
由来の胚軸組織もしくは使用組織（緑色であるので、多数の色素体を含む）また
は葉組織外植片を含むであろう。このような組織からの再生速度が遅い一方で、
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換体を用いて認められたような位置効果
は予想されなかったので、所望の表現型を得るために首尾よく形質転換された多
数の植物をスクリーニングする必要はないであろう。 【００７３】 ワタ用のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとの同時培養
によるＧｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｓｕｔｕｍ Ｌ．子葉の形質転換は、Ｆｉｒｏ
ｏｚａｂａｂｙら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、１９８７、１０、１０５〜
１１６およびＵｍｂｅｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８７、５、
２６３〜２６６に記載されている。さらに、Ｂｒａｓｓｉｃａ用として、この組
織は葉緑体の形質転換用に十分な色素体含有量を含み得る。従って、Ｂｒａｓｓ
ｉｃａ用として、葉緑体を含む別の標的組織の形質転換および再生の別法（例え
ば、緑色胚形成組織の標的化）が所望され得る。 【００７４】 関連技術を用いて、他の植物種を容易に形質転換することができる。あるいは
、Ｋｌｅｉｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、２８６〜２９１などに
記載の微粒子銃法を使用して、本明細書中に記載のウイルスサブユニットＲＮＡ
ポリメラーゼ発現構築物を含む核形質転換植物を得ることもできる。粒子銃によ
るワタの形質転換は、１９９２年９月１７日に公開のＷＯ ９２／１５６７５で
報告されている。本発明の実施に適切な植物には、ダイズ、ワタ、アルファルフ
ァ、ナタネ、アマ、トマト、サトウダイコン、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、
トウモロコシ、小麦、コメ、およびレタスが含まれるがこれらに限定されない。 【００７５】 植物形質転換に使用するためのベクターには、好ましくは、色素体発現構築物
および選択的マーカー構築物の色素体ゲノムへ安定に移入される手段が含まれる
。これは、標的色素体ゲノムに相同の領域によって最も便利に得られる。相同の
領域は、導入される構築物に隣接し、ゲノムへの二重交差を介して相同性組換え
によって色素体ゲノムに移入される。タバコの色素体ゲノムの完全なＤＮＡ配列
が記載されている（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８６、５、２
０４３〜２０４９）。ゼニゴケ（Ｏｈｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８６、３
２２、５７２〜５７４）およびコメ（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．、１９８９、２１７、１８５〜１９４）由来の色素体ゲノムの完全
なＤＮＡ配列もまた報告されている。 【００７６】 相同の領域が色素体ゲノムの逆方向反復領域（ＩＲＡおよびＩＲＢとして既知
）に存在する場合、形質転換色素体あたり２コピーの導入遺伝子が予想される。
相同の領域が色素体ゲノムの逆方向反復領域の外側に存在する場合、形質転換色
素体あたり１コピーの導入遺伝子が予想される。色素体ゲノム内の相同の領域は
、約１ｋｂのサイズである。より小さな相同の領域も使用することができ、１０
０ｂｐの小ささでも色素体ゲノムへの相同性組換えを行うことができる。しかし
、組換え頻度および形質転換色素体を有する植物の獲得頻度は、相同の領域のサ
イズの減少と共に減少する。 【００７７】 色素体ゲノムに相同の領域を有する構築物の例は、Ｓｖａｂら、１９９０、前
出、Ｓｖａｂら、１９９３、前出、およびＺｏｕｂｅｎｋｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉ
ｄ Ｒｅｓ．、１９９４、２２（１９）、３８１９〜３８２４に記載されている
。 【００７８】 以下の実施例により詳細に記載のように、植物色素体におけるＤＮＡ配列の発
現を増大させる構築を記載する。種々のプロモーター／リボゾーム結合部位配列
を使用して、植物プラスミドにおける発現を指向する。１６ＳリボゾームＲＮＡ
オペロンのプロモーター配列（Ｐｒｒｎ）は、Ｔ７バクテリオファージ１０リー
ダー配列（Ｇ１０Ｌ）から誘導されるリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）に連結する
。Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ配列の調節下で発現するＤＮＡ配列は、他のプロモーター
／ＲＢＳ組み合わせの調節下で得られる得ベルよりも有意に高いレベルのタンパ
ク質発現を示す一方で、ｍＲＮＡの発現は、これらの植物において高くも低くも
なり得る。 【００７９】 以下の実施例では、ＣＰ４ ＥＰＳＰシンターゼをコードする核酸配列（米国
特許第５，６３３，４３５号）を、植物色素体由来のＥＰＳＰシンターゼ酵素発
現用の発現構築物に配置する。さらに、ｈＧＨをコードする核酸配列（米国特許
第５，４２４，１９９号）を、植物色素体由来のヒト成長ホルモン発現用の発現
構築物に配置する。植物色素体における核酸配列発現を増大させるために、調製
した構築物は、Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０リーダー（Ｇ１０Ｌ）の後ろ
に設計したリボゾーム結合部位を使用する。 【００８０】 ＥＰＳＰＳおよびｈＧＨの発現をコードする色素体発現構築物を、葉緑体形質
転換ベクターを介して移入する。 【００８１】 Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター／リボゾーム結合部位配列の調節下で、色素
体において発現されるＥＰＳＰＳ酵素に対する天然のコード配列を含むタバコ株
は、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬ ＲＢＳ配列の調節下で発現したＥＰＳＰから得られた
レベルよりも優位に高いレベルのタンパク質発現を示す。しかし、ＥＰＳＰＳ
ｍＲＮＡは、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬ（ＲＢＳ）の調節下での色素体由来のＣＰ４
ＥＰＳＰＳを発現する植物においてより高いレベルで発現される。これらの結果
は、Ｔ７バクテリオファージ遺伝子１０リボゾーム結合部位を含む転写物由来の
翻訳がより有効であることを示す。さらに、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ ＲＢＳの調節
下でＥＰＳＰＳを発現するトランスプラストミックタバコ株から得られたＥＰＳ
ＰＳのタンパク質発現レベルにより、高レベルのグリフォセート耐性が得られる
。 【００８２】 さらに、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター／リボゾーム結合部位配列の調節下
でｈＧＨを発現するように形質転換したトランスプラストミックタバコ株は、Ｐ
ｐｓｂＡプロモーター／ＲＢＳ配列の調節下で発現したｈＧＨから得られたレベ
ルよりも有意に高レベルのタンパク質発現を示す。 【００８３】 ＥＰＳＰＳおよびｈＧＨ発現用のＰｒｒｎ／Ｇ１０Ｌリボゾーム結合部位を使
用した構築物から、色素体発現用の他のプロモーター／ＲＢＳ組み合わせから得
た発現レベルを超える少なくとも約２００倍のタンパク質発現レベルの増加を得
ることができる。さらに、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター／ＲＢＳ配列を使用
したプラスミド発現構築物から得たタンパク質レベルは、核酸発現構築物より５
０〜３５００倍のレベルを蓄積することができる。従って、色素体発現構築物中
のＧ１０Ｌリボゾーム結合部位の封入は、植物色素体からのタンパク質発現レベ
ルの増大に使用することができる。 【００８４】 さらに、本発明の構築物はまた、特定のサブオルガネラ領域（例えば、葉緑体
のチラコイド内腔）にタンパク質発現を標的化するための配列を含むことができ
る。例えば、以下の実施例で記載のように、色素体ゲノムしとくクロムｆ由来の
ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、チラコイド膜に発現したアプロチニ
ンタンパク質を標的化する。このような発現タンパク質の標的化により、酸化安
定性の増大および適切なタンパク質折りたたみを可能にするタンパク質の区画化
が得られる。 【００８５】 このように、本発明の構築物および方法は高レベルの除草剤耐性を有するトラ
ンスプラストム植物を得る方法を提供する。高レベルの耐性には約１６オンス／
エーカー以上、好ましくは３２オンス／エーカー以上、より好ましくは６４オン
ス／エーカー以上、最も好ましくは１２８オンス／エーカー以上の量のグリフォ
セートを散布した場合の植物組織の耐性などがある。さらにまた高レベルの耐性
には約１６オンス／エーカー以上、好ましくは３２オンス／エーカー以上、最も
好ましくは６４オンス／エーカー以上の量のグリフォセートを適用した場合の生
殖組織の耐性などがある。 【００８６】 ここで本発明を概して記載したが、以下の実施例を参照することにより、より
容易に理解できよう。以下の実施例は説明のみを目的とするものであって、本発
明を限定するものではない。 【００８７】 実施例 実施例１ 発現構築物 高等植物の色素体の形質転換に使用する構築物および方法は、Ｚｏｕｂｅｎｋ
ｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、１９９４、２２（１９）、３８１９〜３８４
２、Ｓｖａｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９０、８７、
８５２６〜８５３０、およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９
３、９０、９１３〜９１７、およびＳｔａｕｂら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９３、
１２、６０１〜６０６に記載されている。核コード化色素体標的化Ｔ７ポリメラ
ーゼの調節下でＤＮＡ配列を発現するための高等植物の色素体形質転換に使用さ
れる構築物および方法は、米国特許第５，５７６，１９８号に記載されている。
タバコの色素体ゲノムの完全なＤＮＡ配列は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、ＥＭＢＯ
Ｊ．、１９８６、５、２０４３〜２０４９に記載されている。以下に記載の全
ての色素体ＤＮＡの引例は、タバコ由来のヌクレオチド番号に対応している。 【００８８】 タバコシトクロムｆ（ｐｅｔＡ）をコードする完全なヌクレオチド配列は、Ｂ
ａｓｓｈａｍら、１９９１、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、２３６０６
〜２３６１０およびＫｏｎｉｓｈｉら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．、３４、１０８１〜１０８７に記載されている。 【００８９】 １Ａ．プロモーター／リボゾーム結合部位配列 色素体１６ＳリボゾームＲＮＡオペロンのプロモーター領域（Ｐｒｒｎ）に、
色素体ｒｂｃＬ遺伝子リーダーを模倣した合成リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）に
連結してＰｒｒｎ／ｒｂｃＬＲＢＳフラグメントを作製する。Ｐｒｒｎ／ｒｂｃ
ＬＲＢＳ配列は、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬ（Ｓ）フラグメントについてＳｖａｂら、
１９９３、前出に記載されている。 【００９０】 色素体ｐｓｂＡプロモーター（ＰｐｓｂＡ）およびターミネーター配列（Ｔｐ
ｓｂＡ）のプロモーター領域は、Ｓｔａｕｂら，１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ．、１
２、６０１〜６０６に記載されている。 【００９１】 Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ配列を、２つのオリゴヌクレオチド配列（Ｔ７リード１お
よびＴ７リード２（表１））のアニーリングによって構築してＧ１０Ｌ色素体リ
ボゾーム結合部位（図１）を作製した。Ｇ１０Ｌ配列を、ＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ
フラグメントとしてＰｒｒｎプロモーター配列の３’末端に連結してＰｒｒｎ／
Ｇ１０Ｌ配列を作製した。 【００９２】 【表１】 【００９３】 好ましくはキメラ遺伝子を発現ベクターに挿入し、Ｐｒｒｎプロモーターから
の転写を指示する。このように、プラスチドゲノムではキメラ遺伝子が植物プラ
スチドのＰｒｒｎ／ＲＢＳプロモーターまたはＰｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター
から転写される。Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ融合の核酸配列は図６に示す。 【００９４】 １Ｂ．ＣＰ４ ＥＰＳＰＳプラスミド発現構築物 プラスミド発現ベクターｐＭＯＮ３０１１７を、前駆体ベクターｐＰＲＶ１１
１Ｂから構築した（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、１９９４、前出、ＧｅｎＢａｎｋ受託
番号Ｕ１２８１３）。ベクターｐＭＯＮ３０１１７は、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬＲＢ
Ｓ／Ｔｒｐｓ１６発現カセット中へのパッセンジャー遺伝子の挿入用の多数のク
ローニング部位を保有する。Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬＲＢＳ配列を、ＥｃｏＲＩ／Ｎ
ｃｏＩフラグメントとしてｐＰＲＶ１１１Ｂベクターにクローン化し、色素体ｒ
ｂｓ１６遺伝子（Ｔｒｐｓ１６）由来のターミネーター領域を、ＨｉｎｄＩＩＩ
／ＮｃｏＩフラグメントとしてＰｒｒｎプロモーターの３’にクローン化する。
Ｔｒｐｓ１６フラグメントは、タバコプラスミドＤＮＡ中のヌクレオチド５，０
８７から４，９３９までのｒｐｓ１６遺伝子３’調節領域を含む。 【００９５】 ベクターｐＭＯＮ３０１１７のｐＰＲＶ１１１Ｂバックボーンは、スペクチノ
マイシンおよびストレプトマイシン選択用のマーカー遺伝子ａａｄＡ、および相
同的組換えによるｒｒｎＶ−ｒｐｓ７／１２遺伝子間領域へのパッセンジャーＤ
ＮＡの組み込み用のｒｐｓ７／１２を含む。 【００９６】 アグロバクテリウム媒介の形質転換による植物への組み込みのための対照とし
て核発現構築物、ｐＭＯＮ１０１５４を作った。この構築物では天然のＣＰ４遺
伝子は構成フィグウォート・モザイクウイルス・プロモーターおよびペチュニア
ＨＳＰ７０リーダーから発現され、Ｅ９ターミネーターを有する。ＣＰ４遺伝子
のＮ末端に翻訳により融合したペチュニアＥＰＳＰＳの葉緑体輸送ペプチドによ
りプラスチドを標的化した。 【００９７】 プラスミド発現構築物ｐＭＯＮ３０１１８を、ベクターｐＭＯＮ３０１１７の
多数のクローニング部位へのＮｃｏＩ／ＳｎａＩフラグメントとしての色素体ｒ
ｂｃＬ（Ｓｖａｂら、１９９３、前出に記載）遺伝子由来のＮ末端の５つ（５）
アミノ酸と融合した天然のＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子のクローニングによって調
製した。 【００９８】 プラスミド発現構築物ｐＭＯＮ３０１２３は、色素体ｒｂｃＬ由来のＮ末端の
５つの（５）アミノ酸の欠失以外はｐＭＯＮ３０１１８と本質的に同一である。 【００９９】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３０１３０を、ｐＭＯＮ３０１２３の天然のＣＰ４ ＥＰＳＰＳの合成ＣＰ４遺伝子との置換によって作製した。この構築物はまた
、色素体ｒｂｃＬ遺伝子由来のＮ末端５アミノ酸融合を欠く。 【０１００】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７７３を、ｐＭＯＮ３０１２３のＰｒｒｎ／Ｒ
ＢＳ配列の上記のＰｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーターとの置換によって構築した。
ｐＭＯＮ３８７７３のＥＰＳＰＳ ＤＮＡ配列はまた、色素体ｒｂｃＬ遺伝子由
来のＮ末端５アミノ酸融合を欠く。 【０１０１】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７７６を、Ｇ１０Ｌ、ＣＰ４（天然）遺伝子コ
ード領域、およびプラスミドｒｐｓ１６遺伝子由来のターミネーター配列（Ｔｒ
ｐｓ１６）を含むＴ７ファージ遺伝子１０（Ｐ−Ｔ７）由来のプロモーターを用
いて構築した。 【０１０２】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７９７を、Ｇ１０Ｌ、ＣＰ４（合成）遺伝子コ
ード領域、およびプラスミドｒｐｓ１６遺伝子由来のターミネーター（Ｔｒｐｓ
１６）を含むＴ７ファージ遺伝子１０（Ｐ−Ｔ７）由来のプロモーターを用いて
構築した。 【０１０３】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７９８を、１６ＳｒＤＮＡオペロン（Ｐｒｒｎ
）、Ｇ１０Ｌ、ＣＰ４（合成）遺伝子コード領域、およびプラスミドｒｐｓ１６
遺伝子由来のターミネーター（Ｔｒｐｓ１６）を用いて構築した。 【０１０４】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７９３を、１６ＳｒＤＮＡオペロンのプロモー
ター（Ｐｒｒｎ）、色素体ｒｂｃＬ遺伝子を模倣した合成リボゾーム結合部位（
ＲＢＳ）、１０１位のアミノ酸位でのグリシンからアラニンへの変異を保有する
グリフォセート耐性ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成遺伝子（Ｐ−ＥＰＳＰＳ、Ｐ
ａｄｇｅｔｔｅら、１９８７、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、
２５８、５６４〜５７３）、およびプラスミドｒｐｓ１６遺伝子由来のターミネ
ーター（Ｔｒｐｓ１６）を用いて構築した。 【０１０５】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７９６を、１６ＳｒＤＮＡオペロンのプロモー
ター（Ｐｒｒｎ）、色素体ｒｂｃＬ遺伝子を模倣した合成リボゾーム結合部位（
ＲＢＳ）、１００位のアミノ酸位でのグリシンからアラニンへの変異（Ｇ１００
Ａ）を保有するグリフォセート耐性アクロモバクター（ＬＢＡＡ株）ＥＰＳＰ合
成遺伝子（米国特許第５，６２７，６１号（その全体が本明細書中に参照により
取入れられる））、およびプラスミドｒｐｓ１６遺伝子由来のターミネーター（
Ｔｒｐｓ１６）を用いて構築した。 【０１０６】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ４５２０４を、Ｇ１０Ｌを有する１６ＳｒＤＮＡオ
ペロンのプロモーター（Ｐｒｒｎ）、１００位のアミノ酸位でのグリシンからア
ラニンへの変異（Ｇ１００Ａ）を保有するグリフォセート耐性Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ（ＬＢＡＡ株）ＥＰＳＰ合成遺伝子、およびプラスミドｒｐｓ１６遺伝子
由来のターミネーター（Ｔｒｐｓ１６）を用いて構築した。 【０１０７】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ４５２０１を、１６ＳｒＤＮＡオペロンのプロモー
ター（Ｐｒｒｎ）、色素体ｒｂｃＬ遺伝子を模倣した合成リボゾーム結合部位（
ＲＢＳ）、野生型グリフォセート耐性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａ
ｒｏＥ（ＥＰＳＰＳ）（米国特許第５，６２７，０６１号）遺伝子、およびプラ
スミドｒｐｓ１６遺伝子由来のターミネーター（Ｔｒｐｓ１６）を用いて構築し
た。 【０１０８】 １６ＳｒＤＮＡオペロン（Ｐｒｒｎ）のプロモーターを、緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）の最初の１４個のアミノ酸（ＧＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＳＭ）をコー
ドするさらなる配列をＮ末端で有する合成ＣＰ４タンパク質をコードする核酸配
列と機能的に結合したＧ１０Ｌと共に用いてプラスチド発現構築物、ｐＭＯＮ４
５２５９を構築した。１４個のアミノ酸ＧＦＰ融合をコードする配列はタンパク
質の第２の位置のグリシンで始まる。構築物はまたｒｐｓ１６ターミネーターを
も含む。 【０１０９】 別のプラスチド発現構築物、ｐＭＯＮ４９２１８は核コード化ＲＮＡポリメラ
ーゼ領域を有する１６ＳｒＤＮＡオペロンのプロモーター領域（ＰｒｒｎＰＥＰ
＋ＮＥＰ）から１４個のアミノ酸ＧＦＰ融合、およびプラスチドｒｐｓ１６遺伝
子からターミネーター領域を有する合成ＣＰ４配列を発現する。Ｐｒｒｎ／ＮＥ
Ｐ／Ｇ１０Ｌ：：１４ａａＧＦＰ融合を図７に示す。 【０１１０】 １Ｃ．Ｂｃｒｉｌ（ｂｘｎ）色素体発現構築物 ｂｘｎ除草剤耐性遺伝子（米国特許第４，８１０，６４８号（その全体が本明
細書中に参照により取入れられる））を、ＮｃｏＩとしてのプラスミドｐＢｒｘ
４からＡｓｐ７１８制限フラグメントまでを取り除いてＮｃｏＩ／Ａｓｐ７１８
で切断したｐＵＣ１２０にクローン化してプラスミドｐＢｒｘ８７を得た。次い
で、プラスミドｐＢｒｘ８７をＮｃｏＩ／Ｘｂａで消化して色素体発現用のＰｒ
ｒｎ色素体プロモーターおよびｒｐｓＬ３’領域を含むプラスミドｐＬＡＡ２１
のＮｃｏ／Ｘｂａ部位にクローン化した。得られたプラスミドをｐＢｒｘ８９と
呼ぶ。プラスミドｐＢｒｘ８９を、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、プ
ラスミド発現シグナルを有する１．５ｋｂのキメラｂｘｎ遺伝子をタバコ色素体
相同性ベクターｐＯＶＺ４４Ｂ（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．、２２、３８１９〜３８２４、１９９４）のＳａｃ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位
に挿入してプラスミドｐＣＧＮ５１７５を作製した。 【０１１１】 プラスミドｐＣＧ６１１４を構築するために、プラスミドｐＢｒｘ９０（ブロ
モキシニル特異的ニトリラーゼをコードするｂｘｎ遺伝子を含むＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔプラスミド）を、ＮｃｏＩ／ＡｓｃＩで消化し、ｂｘｎ構造遺伝子をＮｃ
ｏ／Ａｓｃ消化プラスミドｐＣＧＮ５０６３中のＧＵＳ遺伝子と置換してプラス
ミドｐＣＧＮ６１０７を得た。このプラスミドは、キメラ遺伝子の５’末端での
Ｔ７プロモーター／遺伝子１０リーダーおよび３’末端でのｐｓｂＡ／Ｔ７雑種
転写ターミネーターの調節下でｂｘｎ遺伝子を含む。このＴ７プロモーター／ｂ
ｘｎキメラ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ ＤＮＡセグメントとしてｐＣＧ
Ｎ６１０７から切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｎｏｔ部位でクロラムフェニコール
プラスミドＢＣＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に移動してプラスミドｐＣＧＮ６
１０９を作製した。次いで、キメラ遺伝子を、ｐＣＧＮ６１０９由来のＨｉｎｄ
ＩＩＩ／Ｎｏｔフラグメントとして上記の葉緑体相同性ベクターｐＯＶＺ４４Ｂ
に移動してプラスミドｐＣＧＮ６１１４を作製した。ｐＣＧＮ６１１４で形質転
換したタバコ植物は、Ｔ７プロモーターを介したキメラｂｘｎ遺伝子の転写を活
性化させるために植物色素体のバックグラウンドに得られるＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼを必要とする。この系は、以前に、ＭｃＢｒｉｄｅら、ＰＮＡＳ、９１、
７３０１〜７３０５、１９９４、およびＭｃＢｒｉｄｅらに付与された米国特許
第５，５７６，１９８号に記載されている。 【０１１２】 １Ｄ．ＢＸＮ／ＡＨＡＳ色素体発現構築物 植物色素体由来のＢＸＮおよびＡＨＡＳの発現を指向するように、色素体発現
構築物ｐＣＧＮ５０２６を構築する。ＡＨＡＳヌクレオチド配列（欧州公開番号
０ ５２５ ３８４ Ａ２（その全体が本明細書中に参照により取入れられる）
）を、ＢＸＮヌクレオチド配列（米国特許第４，８１０，６４８号（その全体が
本明細書中に参照により取入れられる））に連結する。Ｎｃｏ Ｉ／Ａｇｅ Ｄ
ＮＡフラグメントとしてのプラスミドｐＣＧＮ４２７７由来のアセトヒドロキシ
酸シンターゼをコードするＡＨＡＳ構造遺伝子を、プラスミドｐＵＣ１２０のＮ
ｅｏ／Ｘｍａ部位にクローン化してプラスミドｐＣＧＮ５０２２を作製した。次
いで、このプラスミドを、酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔで消化してブロモキシニ
ル特異的ニトリラーゼをコードするｂｘｎ遺伝子を含む１．３ｋｂのＢａｍ／Ｐ
ｓｔ ＤＮＡセグメントをプラスミドｐＢｒｘ２６から切り出し、ｐＣＧＮ５０
２２のＢａｍ／Ｐｓｔ部位にクローン化してプラスミドｐＣＧＮ５０２３を作製
した。プラスミドｐＣＧＮ５０２３は、ＡＨＡＳ／ｂｘｎオペロンセグメントお
よびこのフラグメントを含む３．３ｋｂ ＤＮＡセグメントを含んでいた。この
プラスミドを、固有のＰｓｔ部位で切断し、このＰｓｔ部位を取り除いて固有の
ＸｂａＩ制限部位を含む合成リンカーと置換してプラスミドｐＣＧＮ５０２４を
作製した。プラスミドｐＣＧＮ５０２４を、Ｎｃｏ／Ｘｂａで消化して、３．３
ｋｂ Ｎｃｏ／Ｘｂａ ＤＮＡフラグメントをＧＵＳ遺伝子を取り除くためにＮ
ｃｏおよびＸｂａで消化したプラスミドプロモーターカセットベクターｐＬＡＡ
２１（Ｐｓｔ）にクローン化した。このクローニングから得たプラスミドを、プ
ラスミドｐＣＧＮ５０２５と呼び、これは、プラスミドプロモーターＰｒｒｎお
よびｒｐｓＬ３’ＤＮＡセグメントの調節下で除草剤オペロンを含んでいた。色
素体発現エレメントの調節下で、キメラ除草剤オペロン全体を、ＳａｃＩ／Ｐｓ
ｔ ＤＮＡフラグメントとしてｐＣＧＮ５０２５から切り出し、色素体相同性カ
セットベクターｐＯＶＺ４４Ｂ（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．、２２、３８１９〜３８２４、１９９４）のＳａｃ／Ｐｓｔ部位にクローン
化して、タバコ葉緑体ゲノムへの移入を促進した。 【０１１３】 １Ｅ．ＢｔｃｒｙＩＡｃおよびｂｘｎプラスチド発現構築物 ｂｘｎＤＮＡセグメントを含むクレブシエラ由来の本来のクローンであるプラ
スミドｐＢｒｘ９（ＳｔａｌｋｅｒおよびＭｃＢｒｉｄｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ１６９：９５５−９６０（１９８７））を鋳型として用いてｂｘｎ遺伝子の
Ｎ末端を含み、４４塩基対の天然の遺伝子の５’未翻訳部分のを含む−４５０塩
基対ＢａｍＨＩ／Ｃｌａ Ｉ ＰＣＲ ＤＮＡフラグメントを作った。このフラ
グメントをプラスミドｐＢｒｘ９０の−４４０塩基対Ｂａｍ／Ｃｌａフラグメン
トと交換し、プラスミドｐＢｒｘ９０．１を得た。このプラスミドは全ｂｘｎ遺
伝子および４４塩基対の未翻訳５’ＤＮＡセグメントを含む。全ｂｘｎ遺伝子を
プラスミドｐＢｒｘ９０．１からＢａｍ／Ａｓｃ Ｉ ＤＮＡセグメントとして
切り取り、Ｂｇｌ ＩＩ／Ａｓｃ Ｉ部位でプラスミドｐＣＧＮ５１４６に挿入
し、プラスミドｐＣＧＮ５１９１を生じた。プラスミドｐＣＧＮ５１４６はＨＤ
−７３ ＢｔプロトキシンをコードするｃｒｙＩＡｃ遺伝子全長を含むｐＫＫ２
３３−２（ファルマシア）誘導体である。そしてプラスミドｐＣＧＮ５１９１に
は、ｃｒｙＩＡｃおよびｂｘｎ遺伝子がオペロンの遠位遺伝子であるｂｘｎ遺伝
子とオペロン配置で含まれる。両方の遺伝子は５１９１のＥ．ｃｏｌｉ発現のた
めのＰｔａｃプロモーターの調節下にある。プラスミドｐＣＧＮ５１９１をＮｃ
ｏ／Ａｓｃで消化し、Ｂｔ／ｂｘｎオペロンを含むＮｃｏ／ＡｓｃＤＮＡフラグ
メントをｐＯＶＺ４４Ｂの誘導体である葉緑体相同体ベクターｐＣＧＮ５１５５
のＮｃｏ／Ａｓｃ部位にクローン化した。得られたプラスミドｐＣＧＮ５１９７
はＰｒｒｎプラスチドプロモーターおよびｒｐｓＬ転写ターミネーター領域の調
節下にあるＢｔ／ｂｘｎオペロンを含む。このプラスミドはＢｔ／ｂｘｎキメラ
オペロンのタバコ・プラスチドゲノムへの転移を容易にする。 【０１１４】 １Ｆ．フィトエン不飽和化酵素色素体発現構築物 ｃｒｔＩ遺伝子を、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａ ｃｒｔオペロン（Ｍ
ｉｓａｗａら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ．、６、４８１〜４８９）を含
む元のプラスミドからＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ ＰＣＲフラグメントとして得
て、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓａｌ ＤＮＡセグメントとしてＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓ
ａｌ部位でＢＣＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化してプラスミドｐ
ＣＧＮ５１７２を作製した。ＮｃｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてのｐＣＧＮ
５１７２由来のｅｒｔＩフラグメントを、ｐＣＧＮ５０３８（ｐＯＶＺ４８８Ｂ
の誘導体）にクローン化して色素体発現構築物ｐＣＧＮ５１７７を作製した。こ
の構築物は、Ｐｒｒｎプロモーターおよびｒｐｓ１６ターミネーター配列由来の
ｃｒｔＩ配列の発現を指向する。このプラスミドは、タバコ色素体ゲノムへのキ
メラｃｒｔＩ遺伝子の導入を促進する。 【０１１５】 １Ｇ．植物形質転換用のｈＧＨ発現構築物 核発現構築物 構築物ｐＷＲＧ４７４７を、植物核ゲノムにおけるｈＧＨの発現を指向するよ
うに構築した。このベクターは、Ｆｉｇｗｏｒｔモザイクウイルスプロモーター
（米国特許第５，３７８，６１９号（その全体が本明細書中に参照により取入れ
られる））および色素体へのｈＧＨタンパク質の指向用のＣＴＰ２リーダーに機
能的に連結したｈＧＨを含む。ＦＭＶ／ＣＴＰ２Ｌ：：ｈＧＨ：：ＮｐＡフラグ
メントを、カナマイシン耐性を付与するＤＮＡ配列と共に、核ゲノムへの組み込
みを指向するためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの移
動ＤＮＡ（ｔＤＮＡ）の右境界と左境界（ＲＢおよびＬＢ）との間にクローン化
する。 【０１１６】 核形質転換ベクターｐＷＲＧ４７４４は、構築物がＣＴＰ２リーダーを欠き且
つｈＧＨタンパク質が植物細胞の細胞質に指向される以外は本質的にｐＷＲＧ４
７４７と同一のエレメントを含む。 【０１１７】 色素体発現構築物 色素体発現ベクターｐＷＲＧ４８３８を、ｐｓｂＡ遺伝子およびｐｓｂＡ遺伝
子ターミネーター、ＰｐｓｂＡ、ならびにＴｓｐｂＡ（Ｓｔａｕｂら、１９９３
、前出）由来のプロモーター領域から発現された全長ｈＧＨ遺伝子を用いて構築
した。ｐｓｂＡ遺伝子の色素体発現エレメントによっても駆動される選択的マー
カー遺伝子ａａｄＡに隣接するこのキメラプロモーター−遺伝子−ターミネータ
ー融合体（ＰｐｓｂＡ：：ｈＧＨ：：ＴｐｓｂＡ）をクローン化した。２つのキ
メラ遺伝子配列を、色素体１６ＳｒＤＮＡの上流のタバコ色素体ゲノムへのキメ
ラ遺伝子配列の組み込みを指向する２つの配列の間にクローン化する。これを、
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド維持用のｐＵＣ複製起点を含むＥ．ｃｏｌｉ選
択を行う１ｋｂのアンピシリン耐性遺伝子に連結する。 【０１１８】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７５５を、酵母ユビキチン遺伝子をＮ末端で転
写融合したｈＧＨ ＤＮＡ配列を用いて調製して、Ｕｂｉ−ｈＧＨ融合遺伝子を
作製した。スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンを含む培地での（Ｚｏ
ｕｂｅｎｋｏら、１９９４、前出に記載のｐＰＲＶ１１２Ｂから）トランスプラ
ストミックタバコの選択のために、ａａｄＡ遺伝子に隣接するＵｂｉ−ｈＧＨ融
合遺伝子をクローン化する。ｈＧＨおよびａａｄＡ発現をコードする配列の相同
性組換え用の配列が含まれる。これらの配列を、Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、１９９４
、前出に記載のベクターｐＰＲＶ１１２Ｂから得る。これを、Ｅ．ｃｏｌｉにお
けるプラスミド維持用の構築物およびｐＵＣ複製起点を含むＥ．ｃｏｌｉの選択
を行う１ｋｂアンピシリン耐性遺伝子に連結させる。 【０１１９】 色素体発現構築物ｐＭＯＮ３８７９４は、以下の例外を除いてはｐＭＯＮ３８
７５５と同一のエレメントを本質的に含む。０．１５ｋｂのｐｓｂＡプロモータ
ー配列を、上記のＰｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター配列と置換する。 【０１２０】 １Ｈ．色素体中のアプロチニン発現用の構築物 色素体から薬学的タンパク質であるアプロチニンの発現を使用するために、一
連の構築物を調製した。核発現色素体標的化Ｔ７ポリメラーゼから誘導されるＴ
７遺伝子１０リーダープロモーター由来のアプロチニン発現を調節するために、
アプロチニンをコードする核酸配列（図２）を、色素発現構築物にクローン化し
た。米国特許第５，５７６，１９８号（その全体が本明細書中に参照により取入
れられる）に記載のようにアプロチニン配列をクローン化した構築物を使用した
。色素体形質転換ベクターｐＣＧＮ６１４６を、ｐＣＧＮ４２７６由来のＧＵＳ
をコードするＤＮＡ配列（米国特許第５，５７６，１９８号）をアプロチニンの
コード配列と置換することによって設計する。タバコ色素体形質転換構築物ｐＣ
ＧＮ６１４７は、ｐＣＧＮ６１４７がアプロチニンコード配列の５’末端に連結
したＧＵＳコード配列の６つの５’アミノ酸を含むこと以外はｐＣＧＮ６１４６
と同一のエレメントを含む。アプロチニンタンパク質の翻訳を援助するように、
ＧＵＳヌクレオチド配列の５’末端の６つのアミノ酸を含む。タバコ色素体形質
転換ベクターｐＣＧＮ６１５６は、アプロチニンのコード領域をＧＵＳコード配
列の３’末端にクローン化する以外はｐＣＧＮ４２７６に本質的に同一である。
従って、ｐＣＧＮ６１５６は、機能的に連結されたＴ７プロモーター、アプロチ
ニンをコードするＤＮＡ配列と融合したＧＵＳをコードするＤＮＡ配列およびｐ
ｓｂＡ３’転写終結配列を含む。 【０１２１】 色素体発現構築物ｐＣＧＮ６１５４を、ＧＵＳコード配列をタバコ葉緑体のシ
トクロムｆのコード配列の３’末端に機能的に連結したアプロチニンタンパク質
（ｐｅｔＡ）と置換することによって、ｐＣＧＮ４２７６から構築した。従って
、ｐＣＧＮ６１５４は、ｐｅｔＡおよびアプロチニンのヌクレオチド配列に機能
的に連結したＴ７プロモーター配列を含む。チラコイドにアプロチニンタンパク
質発現を指向させるために、ｐｅｔＡ配列を含む。 【０１２２】 実施例２ 植物形質転換 ２Ａ．核形質転換 植物細胞中で構築物ｐＷＲＧ４７４４およびｐＷＲＧ４７４７を発現するよう
に形質転換したタバコ植物を、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５、２
２７、１２２９〜１２３２に記載のように得ることができる。 【０１２３】 ２Ｂ．色素体形質転換 タバコ色素体を、Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９３、９０、９１３〜９１７および本明細書中に記載の
ように微粒子の粒子銃による送達によって形質転換する。 【０１２４】 濃緑色で円形の、Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ中のＢ５ビタミンを補充した無ホルモ
ンＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ． Ｐｌａｎｔ、１５、４７３〜４９７）において、２４℃で１６時間の明
期にｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した３週間〜６週間のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂ
ａｃｕｍ ｃｖ． Ｈａｖａｎａの葉を、好ましくは、シュートの中央から切断
する。次いで、切断した各葉を、タバコシュート再生培地（ＴＳＯ培地、ＭＳ塩
、１ｍｇ／ｌ Ｎ６−ベンジルアデニン、０．１ｍｇ／ｌ １−ナフタレン酢酸
、１ｍｇ／ｌ チアミン、１００ｍｇ／ｌ イノシトール、７ｇ／ｌ寒天（ｐＨ
５．８）、および３０ｇ／ｌ スクロース）を含む滅菌濾紙に軸を平行にして置
く。葉をできるだけ培地に接触させるように、プレートの中央に置くことが好ま
しい。使用直前までにプレートを維持することが好ましいが、プラスチックバッ
グで覆って２４℃で一晩保存することによって粒子銃による形質転換の前日まで
に調製することができる。 【０１２５】 撃ち込み試験でマイクロキャリアとして使用するために、タングステンまたは
金粒子を滅菌する。粒子（５０ｍｇ）を、１ｍｌの１００％エタノールで滅菌し
、−２０℃〜−８０℃で保存する。使用直前に、粒子を遠心分離で沈殿させ、１
ｍｌの滅菌脱イオン水で２〜３回洗浄し、かき混ぜて各洗浄の間に遠心分離した
。洗浄した粒子を、５００μｌの５０％グリセロールに再懸濁した。 【０１２６】 滅菌粒子を、形質転換用のＤＮＡで被覆した。２５μｌアリコートの滅菌粒子
に１．５ｍｌの微量遠心管に添加し、５μｇの目的のＤＮＡを添加し、軽くたた
いて混合する。３５μｌの新たに調製した１．８Ｍ ＣａＣｌ２および３０ｍＭ
スペルミジン溶液を粒子／ＤＮＡ混合物に添加して穏やかに混合し、室温で２０
分間インキュベートする。被覆粒子を短時間の遠心分離によって沈殿させる。粒
子を２００μｌの７０％エタノールを添加して２回洗浄し、穏やかに混合し、短
時間遠心分離する。被覆粒子を、５０μｌの１００％エタノール中に再懸濁し、
穏やかに混合する。５〜１０μｌの被覆粒子を、各撃ち込みに使用する。 【０１２７】 粒子撃ち込みによる形質転換を、製造者によって記載の改変プロトコールを用
いて、ＰＤＳ １０００ヘリウム銃（Ｂｉｏ Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ
）を用いて行った。 【０１２８】 葉サンプルを含むプレートを、バキュームチャンバーの下から２段目の棚に置
き、１１００ｐ．ｓ．ｉ．ラプチャーディスクを用いて撃ち込んだ。撃ち込み後
、葉サンプルを含むペトリ皿プラスチックバッグで覆い、２４℃で４８時間イン
キュベートする。 【０１２９】 インキュベーション後、撃ち込んだ葉を、約０．５ｃｍ２片に切断し、５００
μｇ／ｌのスペクチノマイシンを補充したＴＳＯ培地上に軸を平行にして置く。
選択培地上で３〜４週間後、小さな緑色のスペクチノマイシン耐性シュートが葉
組織上の出現する。これらのシュートは、スペクチノマイシン含有培地で生長し
続け、これを初代推定形質転換体と呼ぶ。 【０１３０】 初代推定形質転換体が２〜３枚葉に成長した時に、２つの小さな切片（約０．
５ｃｍ２）を、各葉から切断し、選択または第２ラウンドのシュート再生に使用
する。一方の切片を、５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを補充したＴＳＯ
培地を含むプレートに軸を平行にして置き、他方の切片を５００μｇ／ｍｌのス
ペクチノマイシンおよびストレプトマイシンをそれぞれ補充したＴＳＯ培地を含
むプレートに軸を平行にして置く。ポジティブな形質転換体を、スペクチノマイ
シンおよびストレプトマイシンを含むＴＳＯ培地に緑色のカルスを形成したシュ
ートによって同定する。 【０１３１】 ３〜４週間後、スペクチノマイシンのみを含むＴＳＯ培地に組織を置き、スペ
クチノマイシンおよびストレプトマイシンを有するＴＳＯ培地緑色のシュートを
発生したものをポジティブと同定した。各ポジティブ形質転換体の２〜４シュー
トを選択し、根の再生用に５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを補充したＴ
ＳＯ培地に移す。２シュートについてサザン分析を行い、下記のようにホモプラ
スミーを確認する。ホモプラスミックな事象のシュートを、種子形成のために温
室に移し、ホモプラスミックではない形質転換体を第２ラウンドに使用するか、
ホモプラスミーを達成するために５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを有す
るＴＳＯ培地で再生する。 【０１３２】 実施例３ 除草剤耐性構築物を有するトランスプラストミックタバコ植物形質
転換体の分析 ３Ａ．サザン分析 植物の全色素体含有物が形質転換された（ホモプラスチック形質転換体）かど
うかを決定するために、ａａｄＡマーカー遺伝子発現用に選択した形質転換植物
を分析する。典型的には、以下の２ラウンドのシュート形成およびスペクチノマ
イシン選択後、色素体ＤＮＡのサザンブロット分析によって同定したところ、分
析された約５０％のトランスジェニック小植物がホモプラスチックである。ホモ
プラスミック小植物を、更なる培養用に選択する。 【０１３３】 Ｓｖａｂら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、９
１３〜９１７に記載のように、ゲノムＤＮＡを、形質転換タバコ植物から単離し
、電気泳動し、濾紙に移す。 【０１３４】 色素体中でＣＰ４ ＥＰＳＰＳを過剰に産生するように形質転換したホモプラ
スミックタバコ植物を、ベクターｐＯＶＺ２（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、１９９４、
前出に記載のｐＯＶＺ１５に類似）由来の２．４ｋｂＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフ
ラグメントから調製したプローブを用いて同定した。２．４ｋｂプローブフラグ
メントは、標的配列の一部を含む。 【０１３５】 サザンハイブリッド形成の結果により、更なる分析用に、構築物ｐＭＯＮ３０
１２３およびｐＭＯＮ３０１３０で形質転換されたタバコ由来の３つのホモプラ
スミック株およびｐＭＯＮ３８７７３で形質転換されたタバコ由来の１つの株を
同定した。 【０１３６】 組込み領域を対象とするプローブを用いた３０１２３−１９−１Ａ、３０１２
３−２３−２Ａ、３０１２３−１８−１Ｂ、３０１３０−５１−２Ａ、３０１３
０−５１−２Ｐ、３０１２３−５７−１Ｐ、および３８７７３−６における３．
２７Ｋｂの天然のタバコＢａｍＨＩフラグメントの完全な消滅、これらの形質転
換体中の挿入ＤＮＡフラグメントについての推測サイズ（５．１４ｋｂおよび０
．９ｋｂ）のバンドの出現は、形質転換植物が意図された構築物についてホモプ
ラスミックであることを証明している。 【０１３７】 サザンハイブリッド形成の結果により、ｐＣＧＮ５１７７で形質転換したタバ
コ由来の３つのホモプラスミック株（７４−１Ｂ−Ｐ、７４−２、および７４−
７）を同定した。 【０１３８】 トランスプラストミックな５１７５および６１１４タバコ株を、上記のホモプ
ラスミーについてサザンハイブリッド形成によって分析した。サザンハイブリッ
ド形成による結果により、ｐＣＧＮ６１１４で形質転換されたタバコ由来の４つ
のホモプラスミック株を同定した。 【０１３９】 ５１７５トランスプラストミックタバコ株からの結果により、ホモプラスミッ
クとして１つの株（７６−４Ａ−Ｆ）、９５％ホモプラスミックとして第２の株
を同定した。 【０１４０】 ＢＸＮ／ＡＨＡＳを過剰生産するように形質転換されたホモプラスミックタバ
コ植物を、上記のようにサザンハイブリッド形成を用いて同定した。 【０１４１】 サザンハイブリッド形成の結果により、ｐＣＧＮ５０２６で形質転換したタバ
コ由来の１４のホモプラスミック株を同定した。濾紙をＢＸＮ遺伝子フラグメン
トで再プローブし、２１株でＢＸＮ含有が見出され、そのうち１４株がホモプラ
スミックであった。 【０１４２】 ３Ｂ．ノーザン分析 トランスプラストミックタバコ植物において発現したＥＰＳＰＳ、ＢＸＮ、ま
たはＡＨＡＳのｍＲＮＡの転写レベルを同定するために、同定した各株から単離
した全ＲＮＡを用いてノーザンブロットハイブリッド形成を行った。製造者のプ
ロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて全ＲＮＡを
単離した。全ＲＮＡ（２μｇ）を、変性アガロースゲルで分離し、ナイロンメン
ブランに移した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９、前出）。放射性プローブを、
ランダムプライマー標識（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製のＲａ
ｎｄａｍ Ｐｒｉｍｅｒ標識キット）ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ、フィトエン不飽和化
酵素、ＢＸＮ、またはＡＨＡＳフラグメントを用いて調製し、ハイブリッド形成
を２×ＳＳＰＥ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９、前出）中、６０℃で行った。
濾紙を剥ぎ取り、プラスミド１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子プローブ（ｐＰＲＶ
１１２Ａ、Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、１９９４、前出）で再プローブして濾紙に均一
にロードしたＲＮＡを確認した。 【０１４３】 ＥＰＳＰＳプローブを用いて行ったノーザンハイブリッド形成の結果は、試験
した７株全てがＣＰ４ ＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡを発現したことを示す。１６Ｓリ
ボゾームプローブで行ったハイブリッド形成により、変性ゲルが各サンプルにつ
いて類似の量のＲＮＡをロードすることが確認された。さらに、Ｐｒｒｎ／ｒｂ
ｃＬ（ＲＢＳ）（ｐＭＯＮ３０１２３）調節エレメントからＥＰＳＰＳを発現す
るトランスプラストミックタバコ株は、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ（ｐＭＯＮ３８７７
３）プロモーター／ＲＢＳ配列によって調節されたＥＰＳＰＳについてホモプラ
スミックなタバコ植物より高レベルのＥＰＳＰＳ ｍＲＮＡを発現する。 【０１４４】 ＢＸＮ、ＡＨＡＳ、およびｃｒｔＩプローブを用いて行ったノーザンブロット
ハイブリッド形成の結果により、全てのホモプラスミック５０２６、５１７５、
および５１７７タバコ株がｃｒｔＩ、ＢＸＮおよび／またはＡＨＡＳ ｍＲＮＡ
を発現したことが示される。 【０１４５】 ３Ｃ．タバコＣＰ４ ＥＰＳＰＳのウェスタンブロット分析。 【０１４６】 ＥＰＳＰＳの発現を同定するために、各構築物ｐＭＯＮ３０１２３、ｐＭＯＮ
３０１３０、およびｐＭＯＮ３８７７３由来の単一の株に対してウェスタンブロ
ット分析を行った。 【０１４７】 全可溶性タンパク質を、プロテアーゼインヒビターを含む２５０μｌのＰＢＳ
緩衝液（１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、２
．７ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ ７．０））中で２５０ｍｇの組織を粉砕することによ
って凍結葉組織から抽出した。ホモジネートを、５分間遠心分離し、上清を新し
いチューブに移す。上清中のタンパク質濃度を、タンパク質濃縮アッセイ（Ｂｉ
ｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて同定する。 【０１４８】 抽出した全タンパク質を、４〜２０％の１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｓｉｇｍ
ａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で塩基泳動し、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液流で
ＰＶＤＦ膜に移す（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）。定量した精製ＣＰ４ ＥＰＳＰＳタンパク質のス
タンダードを使用して植物色素体中での発現したＣＰ４ ＥＰＳＰＳの発現を定
量した。 【０１４９】 ウェスタンハイブリッド形成を、ＥＰＳＰＳで惹起した抗体の使用以外のＳｔ
ａｕｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ、１９９３、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎｎａｌ、１２
（２）、６０１〜６０６に記載のように行った。移した電気泳動タンパク質を含
むＰＶＤＦ膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）および５％ミルク
を含むＰＢＳ緩衝液のブロッキング溶液中、４℃で一晩インキュベートした。次
いで、膜を１％ミルクおよびヤギにおいてＣＰ４ ＥＰＳＰＳで惹起された一次
抗体を含むＰＢＳ−Ｔ溶液中、室温で２時間インキュベートする。０．１％ミル
クを含むＰＢＳ−Ｔ溶液中で膜を３回洗浄（各洗浄は率オンで５分間）する。次
いで、膜を、１％ミルクおよび抗ヤギ抗体を含むＰＢＳ−Ｔ溶液中、室温で１時
間インキュベートし、１％ミルクを含むＰＢＳ−Ｔ中で再び洗浄（室温で１０分
間を３回）する。非放射性検出キット（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて膜
を現像する前に、ＰＢＳ−Ｔのみを用いて最終洗浄する。 【０１５０】 【表２】 【０１５１】 表２に列挙の結果は、ＥＰＳＰＳタンパク質レベルの有意な増加がＰｒｒｎ／
Ｇ１０ＬプロモーターからＥＰＳＰＳを発現させるように形質転換した植物から
得ることができることを示す。これらの結果は、Ｐｒｒｎ／ｒｂｃＬＲＢＳ調節
配列によって駆動するＥＰＳＰＳ発現によりＥＰＳＰＳとして全可溶性タンパク
質の約０．００１％を産生することができる一方で、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ調節配
列からＥＰＳＰＳを発現する植物では、ＥＰＳＰＳとして全可溶性タンパク質の
０．２％を発現することを示す。その後の株は、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌ調節配列か
ら発現した場合、約１％のＥＰＳＰＳの全可溶性タンパク質を示した。上記のノ
ーザンハイブリッド形成の結果と考え合わせると、これらの結果は、Ｇ１０Ｌリ
ボゾーム結合部位からより効率的な転写を得ることができることを示す。 【０１５２】 さらに、ＧＦＰ由来のＮ末端の１４個のアミノ酸を含むプラスチド発現構築物
により高レベルのタンパク質発現が認められた。ｐＭＯＮ４５２５９またはｐＭ
ＯＮ４９２１８のいずれかを含むトランスプラストム系統により全可溶性タンパ
ク質に対するＣＰ４ ＥＰＳＰＳは１２％以上であることが示された。 【０１５３】 ウェスタン免疫ブロットハイブリッド形成を、ブロモキシニルで惹起した抗体
を用いて、上記の２つのホモプラスミック５０２６タバコ株に対しても行った。
ｐＣＧＮ５０２６で形質転換したタバコ株から抽出した全可溶性タンパク質のウ
ェスタン免疫ブロット分析結果は、両ホモプラスミック株がニトリラーゼタンパ
ク質を産生することを示した。 【０１５４】 ｐＣＧＮ６１１４およびｐＣＧＮ５１９７で形質転換したタバコ株から抽出し
た全タンパク質に対するウェスタン免疫ブロット分析を、上記のように行った。 【０１５５】 分析結果は、６１１４タバコ株では、全可溶性葉タンパク質の１％〜２５の範
囲でブロモキシニルを産生することを示した。 【０１５６】 ２０５１９７タバコ株のウェスタン分析の結果は、ブロモキシニルおよびＢｔ
は共に１％の全可溶性葉タンパク質として産生されることを示した。 【０１５７】 ３Ｄ．ＥＰＳＰＳ酵素活性の分析 プラスミド発現ベクターＰＭＯＮ３８７７３を含むトランスプラストミックタ
バコ植物におけるＥＰＳＰＳ酵素活性を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）アッセイを用いて同定した。 【０１５８】 ＥＰＳＰＳ酵素活性の分析方法は、Ｐａｄｇｅｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．、１９８８、２６３、１７９８〜１８０２およびＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９８７、２５８、５６４〜５７３ならびにＷｉｂｂｅ
ｎｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、
１９８８、１５３、７６０〜７６６に記載されている。 【０１５９】 結果を以下の表３に示す。 【０１６０】 【表３】 【０１６１】 これらの結果により、色素体におけるＥＰＳＰＳ発現は活性ＥＰＳＰＳ酵素を
産生することが示される。 【０１６２】 ３Ｅ．グリフォセート耐性の分析 最も高レベルのグリフォセート耐性を同定するために、構築物ｐＭＯＮ３８７
７３にホモプラスミックなトランスプラストミックタバコ株を、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで試験した。外植組織を、非トランスジェニック野生型タバココントロール、
Ｈａｖａｎｎａ、植物およびホモプラスミックタバコ株３８７７３−６の葉片か
ら調製し、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、および２００μＭの
グリフォセートレベルを補充したＴＳＯ培地（上記）でシュートを再生させるた
めに培養した。結果を以下の表４にまとめる。シュートを産生した外植数を外植
調製後３週間および６週間ならびにグリフォセート含有培地での培養時に同定し
た。 【０１６３】 【表４】 【０１６４】 上記の結果は、試験したグリフォセートの全レベルで、ｐＭＯＮ３８７７３い
ｎホモプラスミックなタバコ株から調製した外植片からシュートを再生する一方
で、非形質転換植物から調製した外植片からはシュートは再生されなかったこと
を示す。これらの結果は、色素体においてＥＰＳＰＳを発現するタバコ植物は少
なくとも２００μＭのグリフォセートレベルに耐性を示すことを示唆する。 【０１６５】 更なるトランスプラストミック株を、上記のようにグリフォセート耐性につい
てｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。結果を、表５に示す。 【０１６６】 【表５】 【０１６７】 これらの結果は、これらのトランスプラストミック株がグリフォセート耐性を
示すことを示す。括弧内の数字は、１ｍＭグリフォセートでの選択に耐性を示す
シュート数である。従って、表５で認められ得るように、１ｍＭグリフォセート
での選択に耐性を示すタバコ株が作製された。 【０１６８】 完全な植物の耐性試験のために、３８７７３−６株のホモプラスミックタバコ
植物に、０ｏｚ／エーカー、１６ｏｚ／エーカー、３２ｏｚ／エーカー、および
６４ｏｚ／エーカーに対応する濃度でトラック噴霧器（ｔｒａｃｋ ｓｐｒａｙ
ｅｒ）を用いてグリフォセートを噴霧する。グリフォセート噴霧の前後に植物の
高さを測定した。スプレーの２週間後に栄養傷害データを回収する一方で、植物
成熟時に再生損傷データを回収した。 【０１６９】 最初の結果は、噴霧したホモプラスミックタバコ株は、栄養組織傷害（表６）
で示したように、１６ｏｚ／エーカーの濃度でグリフォセート耐性を示すことを
示す。表５で認められ得るように、３２ｏｚ／エーカーで良好なレベルのグリフ
ォセート耐性を示すトランスプラスミック株が作製された。更なる形質転換株を
用いたその後の試験では、トランスプラストミック株は、６４ｏｚ／エーカーの
レベルのグリフォセートに耐性を示した。 【０１７０】 生長の継続およびグリフォセートを噴霧した組織の操作によって耐性を特徴づ
けた。しかし、グリフォセート適用濃度の増加につれて、栄養傷害レベルが増加
した。それに対して、形質転換コントロール植物は１６ｏｚ／エーカーのグリフ
ォセート濃度でも高度の感受性を示す。 【０１７１】 【表６】 【０１７２】 加えて、その他のトランスプラストム系統を前記の種々濃度のグリフォセート
の噴霧に対する耐性に関して分析した。特異活性を植物抽出物中の単位タンパク
質あたりのシキメート−３−ホスフェート（Ｓ３Ｐ）に転換した外的に添加した
ピルビン酸ホスフォエノール（ＰＥＰ）の量として測定する。グリフォセートの
添加によりグリフォセートに対するＥＰＳＰＳ酵素の感受性を試験する。結果を
表７にまとめる。 【０１７３】 【表７】 【０１７４】 これらのデータにより種々ＥＰＳＰＳ配列を発現するトランスプラストム植物
において高レベルのグリフォセート耐性を得ることができることが示される。と
りわけｐＭＯＮ４５２０４、ｐＭＯＮ４５２５９およびｐＭＯＮ４９２１８系統
は植物組織に関しては少なくとも１２８オンス／エーカー、生殖組織に関しては
少なくとも６４オンス／エーカーの濃度で適用したグリフォセートに対する耐性
を提供する。 【０１７５】 さらに、構築物ｐＭＯＮ４２２５９およびｐＭＯＮ４９２１８により、これら
の構築物で形質転換した植物プラスチドからＣＰ４ ＥＰＳＰＳが高濃度で発現
される。とりわけ、ＣＰ４のＮ末端に融合したＧＦＰの最初の１４個のアミノ酸
をコードする配列を用いた構築物では、全可溶性タンパク質の１２％以上の発現
レベルが得られる。 【０１７６】 ３Ｆ．ＢＴ／ＢＸＮ分析 完全な植物の耐性を試験するために、５１７５および５１９７株のホモプラス
ミックタバコ植物に４％の濃度のブクトリル除草剤を噴霧する。 【０１７７】 ブクトリルでの噴霧試験の結果は、ｂｘｎを発現する全ての５１９７株は、４
％ブクトリル除草剤を含む溶液を噴霧した場合完全な耐性を示すことを示した。 【０１７８】 試験した６つの５１５７株ののうちの２株は、ブクトリルの４％溶液を噴霧し
た場合、完全に耐性を示した。 【０１７９】 ３Ｇ．ノルフラゾン耐性分析 除草剤ノルフラゾン耐性に関するＣｒｔＩ形質の効率を同定するために、実験
を組み立てた。３つの５１７７形質転換株、７４−１Ｂ−ｐ、７４−２−Ａ、お
よび７４−７−Ｃおよび３つのコントロール株を植え付けた。植物を、７週間生
長させ、３μＭのノルフラゾン溶液を与える。ｃｒｔＩ色素体保有遺伝子の存在
にネガティブな植物は、ノルフラゾン処理によって漂白され、ポジティブ植物は
、緑色のままで生長を続けた。 【０１８０】 結果は、３つのホモプラスミック５１７７タバコ株は、３μＭノルフラゾン溶
液に耐性を示す一方で、コントロール植物は全て溶液に感受性を示すことを示す
（表８）。 【０１８１】 【表８】 【０１８２】 実施例４ ｈＧＨトランスジェニックタバコ植物の分析 ４Ａ．サザン分析 植物の全色素体含有物が形質転換されているかどうかを同定するために、ａａ
ｄＡマーカー遺伝子発現用に選択した形質転換植物を分析する。ホモプラスミッ
ク植物を、更なる培養用にサザンハイブリッド形成を用いて選択する。 【０１８３】 Ｓｖａｂら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０、９
１３〜９１７に記載のように、ゲノムＤＮＡを、形質転換タバコ植物から単離し
、電気泳動し、濾紙に移す。 【０１８４】 ｈＧＨを発現用に形質転換されたホモプラスミックタバコ植物を、ベクターｐ
ＯＶＺ２（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら、１９９４、前出に記載のｐＯＶＺ１５に類似）
由来の２．４ｋｂＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントから調整したプローブを
使用して同定した。２．４ｋｂプローブフラグメントは、標的配列の一部を含む
。 【０１８５】 組込み領域を対象とするプローブを用いた株の３．２７Ｋｂの天然のタバコＢ
ａｍＨＩフラグメントの完全な消滅およびこれらの形質転換体中の挿入ＤＮＡフ
ラグメントについての予想されたサイズ（５．６ｋｂ）の出現は、形質転換植物
が意図した構築物にホモプラスミックであることを証明する。 【０１８６】 ４Ｂ．タンパク質発現分析 ｈＧＨを発現するホモプラスミックタバコ株および核タバコ形質転換体を使用
してｈＧＨタンパク質発現を同定する。プラスミド発現用の構築物ＷＲＧ４８３
８、ｐＭＯＮ３８７５５、およびｐＭＯＮ３８７９４を含むタバコ株に対してウ
ェスタンブロット分析を行い、ｈＧＨの核発現用にｐＷＲＧ４７４４およびｐＷ
ＲＧ４７４７を含むトランスジェニックタバコ株についてＥＬＩＳＡアッセイを
使用した。 【０１８７】 全タンパク質抽出物およびウェスタンブロット法を、ｈＧＨに対して一次抗体
を産生させること以外は上記のように行った。 【０１８８】 【表９】 【０１８９】 ウェスタン分析（表９）の結果は、植物細胞の色素体において発現したｈＧＨ
は、核において発現したｈＧＨより有意に高いレベルで蓄積され、植物細胞の細
胞質または色素体のいずれかを標的化することを示す。核でｈＧｈを発現するよ
うに形質転換されたタバコ植物は、全可溶性葉タンパク質の０．００２％（細胞
質標的）〜０．０２５％（色素体標的）のｈＧＨレベルを蓄積する一方で、細胞
質でｈＧｈを発現するように形質転換されたタバコ植物は、全可溶性葉タンパク
質の０．２％〜７．０％のｈＧＨレベルを蓄積する。さらに、Ｐｒｒｎ／Ｇ１０
Ｌ調節配列から指向されるｈＧＨを発現するホモプラスミックタバコ植物は、Ｐ
ｐｓｂＡプロモーター配列から指向されるｈＧＨを発言するホモプラスミックタ
バコ植物より３５倍高いレベルのｈＧＨを蓄積する。 【０１９０】 ４Ｃ．色素体において発現するｈＧＨタンパク質の特徴づけ 色素体から発現されるｈＧＨが適切にプロセシングされるかどうかを同定する
ために、試験を行って正確な折りたたみおよび生物活性を同定した。 【０１９１】 ２つの最小レベルのｐＭＯＮ３８７９４を含むトランスプラストミックタバコ
株を使用して、ｈＧＨを抽出して精製した。切り出した葉から大きな葉脈を取り
除き、葉組織を小さな切片（約０．５ｃｍ２）に切断した。葉の切片を液体窒素
中で瞬間冷凍し、冷却した乳鉢および乳棒で細かい粉末に粉砕した。１０グラム
の凍結、粉砕葉組織を、氷冷の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基性溶液（３０ｍｌ）に
添加して、ボルテックスミキサーで５分間激しく混した。溶液を、一枚のチーズ
クロスで濾過した。 【０１９２】 濾過溶液から、３つの個別のサンプルを調製した。第１のサンプルを、４ｍｌ
の濾過物を１６，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によって調製した。遠心分離
物を、１ｍｌのバイアルに等分し、ドライアイス中で凍結した。第２のサンプル
のために、残りの濾過物を、４８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、いくつかの
０．５ｍｌアリコートを上記のように凍結した。残りの遠心分離濾過物（約２５
ｍｌ）に、２００μｌの氷酢酸を添加して、ｐＨを８．２〜４．５６に低下させ
た。第３のサンプルのために、溶液を、４８００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、
上清をドライアイスで凍結した。 【０１９３】 これらのサンプル中の全可溶性タンパク質（ＴＳＰ、表１０）を、標準的なタ
ンパク質アッセイ法（Ｍａｎｉａｔｉｓ）によって計算し、ｈＧＨの純度％を、
開始物質の既知濃度を用いたウェスタンブロット分析の結果に基づいて計算した
。 【０１９４】 【表１０】 【０１９５】 ｐＨを調整して遠心分離した抽出物を、エレクトロスプレー質量分析法用に逆
相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製し、Ｎ末端アミノ酸配列決定を行っ
た。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒシリーズ２００ポンプおよび自動サンプラー、な
らびにＶｙｌａｃ Ｃ８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを用
いてＲＰ−ＨＰＬＣを行った。７５０μｌのサンプルを、２０ｍＭトリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）および５０％アセトニトリルで平衡化したカラムにロードした。
ローディング後、カラムを５０％アセトニトリル、２０ｍＭ ＴＦＡで２分間洗
浄し、２％アセトニトリルの直線的勾配で１０分間、その後１０％アセトニトリ
ル勾配で１分間溶出した。流速は、１．５ｍｌ／分で一定にし、カラムからの溶
出液をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ７８５検出器で２７８ｎｍを監視した。デー
タを回収し、ＰＥ−Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍデータシステムで分析
した。 【０１９６】 ＲＰ−ＨＰＬＣの分析結果を、図３に示す。ピークＩ（最も高いピーク）は、
適切に折りたたまれた天然の２２ｋＤａ ＧＰ２０００と推測される保持時間を
有する。このピークを回収し、Ｎ末端配列決定およびエレクトロスプレー質量分
析法用にＳａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃで乾燥させた。 【０１９７】 エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＭＳ）には、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ
Ｑ−Ｔｏｆエレクトロスプレー飛行時間型質量分析計を使用した。サンプルを、
５０％メタノール＋２％酢酸中での再懸濁によって調製し、４ｍＬ／分の速度の
質量分析計の起点に注入した。図４に示した生データは、種々の付着プロトン数
を有するサンプル中に存在する種に対応する一連のイオンを示す。このスペクト
ルの軸は、存在する種の質量：電荷比に対する強度である。逆重畳積分アルゴリ
ズムを使用してこの一連の多電荷イオンを分子量スペクトルに変換する。 【０１９８】 ＲＰ−ＨＰＬＣピークＩの質量分析法の結果により、異なる分子量の４つの主
要なタンパク質種を示す。２１，９９７ｋＤａの種は、ユビキチンプロテアーゼ
の過剰な切断によって取り除かれた推測Ｎ末端Ｐｈｅを有するｈＧＨの推測分子
量を示す。２２，１２４ｋＤａの種は、適切にプロセシングされたｈＧＨの正確
なアミノ酸配列の推測分子量を示す。２２，５０７ｋＤａおよび２２，６６４ｋ
Ｄａの種は、それぞれＮ末端Ｐｈｅを有するｈＧＨおよび植物抽出操作中に改変
されたｈＧＨを示すと考えられる。計算されたタンパク質の分子量は、色素体か
ら発現されたｈＧＨは適切に折りたたまれる（すなわち、正確なジスルフィド結
合が作製された）ことを示唆する。 【０１９９】 標準的なエドマン分解によってＮ末端配列決定を行い、上記のＮ末端配列を確
認した。 【０２００】 ４Ｄ．植物色素体において発現されるｈＧＨの生物活性 ｐＨ調整して遠心分離した抽出物の生物活性を、Ｎｂ２細胞株由来の細胞を用
いて試験した。この細胞は、成長ホルモンおよび他のエストロゲン型化合物の存
在下で増殖する。アッセイには、種々の濃度の成長ホルモン含有抽出物の９６ウ
ェルプレートへの注入が含まれる。次いで、一定量の細胞を核ウェルに添加する
。プレートを、４８時間インキュベートし、ＭＴＳと呼ばれる試薬を添加する。
代謝細胞はＭＴＳを取り込み、青色の物質に変化する。細胞数の増加につれてウ
ェル中の青色が増加する。青色を、分光光度計を用いて測定する。細胞数は、培
地中の成長ホルモン濃度に比例するはずである。いくらか高濃度で、細胞が成長
ホルモンで飽和し、用量応答が横ばいになると予想される。非常に低濃度のｈＧ
Ｈでは、本質的な生長の増大は認められない。ｈＧＨ濃度グラフに対する細胞数
（または吸収）をグラフ化すると、Ｓ字状グラフになると推測される。 【０２０１】 生物活性アッセイの結果（図５）は、ｈＧＨ濃度に対する吸収をグラフ化した
場合、植物色素体から発現したｈＧＨはＳ字状を有することを示す。 【０２０２】 実施例５ アプロチニントランスプラストミックタバコ植物のウェスタン分析 ５Ａ．色素体におけるアプロチニン発現のウェスタン分析 ホモプラスミックタバコ株発現を使用してアプロチニンタンパク質の発現を同
定する。アプロチニンの色素体発現用に、構築物ｐＣＧＮ６１４６、ｐＣＧＮ６
１４７、ｐＣＧＮ６１５４、およびｐＣＧＮ６１５６を含むタバコ株に対してウ
ェスタンブロット分析を行った。 【０２０３】 アプロチニンに対する一次抗体を惹起させる以外は、上記のように全タンパク
質抽出およびウェスタンブロット分析を行った。 【０２０４】 ウェスタンブロット分析の結果は、アプロチニンコード配列がＰｅｔＡおよび
全長ＧＵＳ遺伝子のいずれかと融合させた場合、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター
から発現されることを示す。さらに、これらの結果は、ｐｅｔＡ配列は植物細胞
チラコイドへアプロチニンタンパク質を効率的に標的することを示す。 【０２０５】 本明細書中に記載の全ての刊行物および特許出願書類は、本発明に関与する当
業者の技術レベルを示す。全ての刊行物および特許出願書類は、各刊行物および
特許出願書類がまるで明確かつ個別に参考として援用されるように同一の範囲で
本明細書中に参照により取入れられる。 【０２０６】 上記発明は、理解を明確にする目的で図面および実施例によっていくらか詳細
に記載されているが、一定の変更および修正が添付の請求項の範囲内で実施する
ことができることが自明である。 【図面の簡単な説明】 【図１】 Ｇ１０Ｌリボゾーム結合部位のヌクレオチド配列を示す図である。 【図２】 アプロチニンをコードするアミノ酸配列を示す図である。 【図３】 色素体において発現されるｈＧＨタンパク質の特徴づけのためのＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ分析の結果を示す図である。ピークＩ（最も大きなピーク）は、適切に折りた
たまれた天然の２２ｋＤａ ＧＰ２０００の予想保持時間を示す。 【図４】 図４は、Ｍｉｃｏｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆエレクトロスプレー飛行時間型質
量分析計を用いたエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＭＳ）を示す図であ
る。特に、付着したプロトン数が変化するサンプル中に存在す種に対応する一連
のイオンを示す。スペクトルの軸は、存在する種の質量：電荷比に対する強度で
ある。 【図５】 植物色素体から発現したｈＧＨの生物活性のグラフを示す。グラフに表示のサ
ンプルは、ウシプロラクチン（ｂＰＬ）、Ｅ．ｃｏｌｉから発現したｈＧＨ（Ａ
ｌａ−ｈＧＨ）、ポジティブコントロールとしてのウシプロラクチンでスパイク
した無効トランスジェニック（ＳＰＦＦ ＮｕｌｌＳｐｉｋｅ）、ネガティブコ
ントロールとしての無効トランスジェニック（ＳＰＦＦ Ｎｕｌｌ）、およびセ
ファロースカラム由来のトランスジェニックサンプル（ＳＰＦＦ Ｓａｍｐｌｅ
、ＳＰＦＦ Ｓａｍｐｌｅ）、ならびにｐＨ３．５でのセファロースカラムから
溶出されたトランスジェニックサンプル（ＳＰＦＦ ｐＨ３．５ Ｅｌｎ）であ
る。 【図６】 Ｐｒｒｎ／Ｇ１０Ｌプロモーター／ＲＢＳハイブリッドの核酸配列を示す。Ｐ
ｒｒｎプロモーターはコンセンサス・プラスチド−３５および−１０プロモータ
ーエレメント（下線部）およびプラスチドコード化ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｌａ
ｓｔｉｄ−Ｅｎｃｏｄｅｄ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ＰＥＰ）の転写出
発部位（太字のＧＣ）を含む。遺伝子１０リーダー（Ｇ１０Ｌ）は完全なプラス
チドリボソーム結合部位（ＲＢＳ、太字のヌクレオチド）を含む。 【図７】 Ｐｒｒｎ／ＮＥＰ／Ｇ１０Ｌ：：１４ａａＧＦＰ融合の核酸配列を示す。ＮＥ
Ｐプロモーター領域には下線を付している（太字のＡは転写出発部位である）。
用いたＮＥＰプロモーター領域はプロモーターの上流及び下流の両方のコンセン
サス配列を越えて伸びている。開始ＡＴＧ、開始メチオニンはＧＦＰの１４個の
アミノ酸には数えない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ネーラ，ナレンダー
アメリカ合衆国、ミズーリ・63017、チエ
スタフイールド、アパレイチヤン・トレイ
ル・14971
(72)発明者 シヤーフ，デイビツド・ジエイ
アメリカ合衆国、カリフオルニア・95616、
デイビス、ブレントウツド・プレイス・
2780
(72)発明者 ストーカー，デイビツド・エム
アメリカ合衆国、カリフオルニア・95695、
ウツドランド、ウエスト・サウスウツド・
870
(72)発明者 ストーブ，ジエフリー・エム
アメリカ合衆国、ミズーリ・63017、チエ
スタフイールド、“ジエイ”フオツクスス
プリング・ドライブ・819
(72)発明者 イエー，クアンニン
アメリカ合衆国、ミズーリ・63011、エリ
スビル、クリムソン・ビユー・コート・
2325
Ｆターム(参考） 2B030 AD05 AD08 CA06 CA14 CA15
CA17 CA19
4B024 AA08 BA03 BA07 BA79 CA02
CA07 CA09 DA01 FA02 FA07
FA08 FA10 FA20 GA11 GA17
GA27 HA13 HA14
4B065 AA03Y AA19Y AA41Y AA89X
AA93Y AB01 AC14 AC20
BA02 BA25 BB01 BC31 BC47
BD50 CA24 CA27 CA53
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 転写の５’から３’の方向で成分： ａ）植物プラスチドにおいて機能するプロモーター； ｂ）ＤＮＡ配列が植物細胞のプラスチドで転写されたときに該植物細胞におい
て少なくとも一つの除草化合物に対する耐性を付与できる該ＤＮＡ配列； ｃ）転写終止領域； を含んでなる構築物。 【請求項２】 該構築物がさらに（ｄ）マーカーを発現するプラスチドを含
んでなる植物細胞を選別するための該選択的マーカーをコードする遺伝子および
（ｅ）該プラスチドのゲノムに相同のＤＮＡ領域を含んでなり、（ｅ）の相同の
該領域が成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に隣接する請求項１に記載の
構築物。 【請求項３】 該構築物がさらに（ｆ）該プロモーター成分（ａ）に結合し
たリボソーム結合部位を含んでなる請求項１に記載の構築物。 【請求項４】 該リボソーム結合部位（ｆ）が、プラスチド、細菌またはバ
クテリオファージリーダー配列から誘導された部位からなる群から選択されるリ
ーダー配列に由来する請求項３に記載の構築物。 【請求項５】 前記リボゾーム結合部位が、遺伝子１０リーダー部位および
ｒｂｃＬＲＢＳ部位の結合部位からなる群から選択される、請求項４に記載の構
築物。 【請求項６】 前記ＤＮＡ配列が、除草剤グリフォセートに耐性を付与する
遺伝子をコードする、請求項１に記載の方法。 【請求項７】 前記ＤＮＡコード配列がグリフォセート耐性５−エノールピ
ルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼをコードする、請求項６に記載
の方法。 【請求項８】 前記ＤＮＡコード配列が、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ ａｒｏＡの遺伝子、ＣＰ４遺伝子、ペチュニアＥＰＳＰＳ遺伝子およ
びＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓＬＢＡＡ株の変異体ＥＰＳＰＳ遺伝子、ならびにＢａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｒｏＥ遺伝子からなる群から選択される、
請求項７に記載の方法。 【請求項９】 該ＤＮＡコード化配列がグリフォセート修飾酵素をコードす
る請求項６に記載の構築物。 【請求項１０】 該グリフォセート修飾酵素はｇｏｘ、ｈｐｈ、ｇｌｐＡお
よびｇｌｐＢからなる群から選択される請求項９に記載の構築物。 【請求項１１】 該ＤＮＡコード化配列が該遺伝子に対して天然コード化配
列である請求項１に記載の構築物。 【請求項１２】 該ＤＮＡコード化配列が該遺伝子に対して合成コード化配
列である請求項１に記載の構築物。 【請求項１３】 該ＤＮＡ配列がスルホニル尿素耐性ＡＨＡＳ遺伝子をコー
ドする請求項１に記載の構築物。 【請求項１４】 該ＤＮＡ配列がイミジザリノン耐性ＡＨＡＳ遺伝子をコー
ドする請求項１に記載の構築物。 【請求項１５】 該ＤＮＡコード化配列がＡＬＳ遺伝子である請求項１４に
記載の構築物。 【請求項１６】 該ＤＮＡ配列がホスフィノスリシン耐性遺伝子をコードす
る請求項１に記載の構築物。 【請求項１７】 該ＤＮＡコード化配列がＢＡＲ遺伝子である請求項１６に
記載の構築物。 【請求項１８】 該ＤＮＡ配列がカロテノイド経路の酵素をコードする請求
項１に記載の構築物。 【請求項１９】 該ＤＮＡコード化配列がｃｒｔＩ遺伝子である請求項１８
に記載の構築物。 【請求項２０】 該ＤＮＡ配列がボロモキシニル耐性遺伝子をコードする請
求項１に記載の構築物。 【請求項２１】 該ボロモキシニル耐性遺伝子がＢＸＮ遺伝子である請求項
２０に記載の構築物。 【請求項２２】 請求項１に記載の構築物を含む植物細胞プラスチド。 【請求項２３】 請求項２２に記載の植物プラスチドを含む植物、植物の種
子、植物細胞またはその子孫。 【請求項２４】 転写の５’から３’の方向で機能的に結合した成分として
： ａ）植物プラスチドにおいて機能するプロモーター； ｂ）ＤＮＡ配列が植物細胞のプラスチドで転写されたときに該植物細胞におい
て少なくとも一つの除草化合物に対する耐性を付与できる該ＤＮＡ配列； ｃ）転写終止領域； を含んでなる構築物で植物細胞のプラスチドを形質転換し、 該形質転換プラスチドを含んでなる植物細胞を該ＤＮＡ配列が転写される条件
下で成長させ、それにより該植物プラスチドを含有する植物細胞に少なくとも一
つの除草化合物の適用に対する耐性を付与することからなる、植物細胞において
除草剤耐性を創る方法。 【請求項２５】 該構築物がさらに（ｄ）マーカーを発現するプラスチドを
含んでなる植物細胞を選別するための該選択的マーカーをコードする遺伝子およ
び（ｅ）該プラスチドのゲノムに相同のＤＮＡ領域を含んでなって、（ｅ）の相
同の該領域が成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に隣接する請求項２４に
記載の方法。 【請求項２６】 該構築物がさらに目的の第２のＤＮＡ配列を含んでなる請
求項２４に記載の方法。 【請求項２７】 該第２のＤＮＡ配列が該プロモーター（ａ）とは独立した
プロモーターから発現された遺伝子を含んでなる請求項２６に記載の方法。 【請求項２８】 該第２のＤＮＡ配列がポリシストロン性の情報として（ｂ
）の該ＤＮＡ配列と共に該プロモーター（ａ）から発現される遺伝子を含んでな
る請求項２６に記載の方法。 【請求項２９】 該第２のＤＮＡ配列が植物細胞において該除草化合物に対
する耐性を付与できる遺伝子以外の遺伝子を含んでなる請求項２６に記載の方法
。 【請求項３０】 該第２のＤＮＡ配列が植物細胞において第２の除草化合物
に対する耐性を付与できる遺伝子を含んでなる請求項２６に記載の方法。 【請求項３１】 該構築物がさらに（ｆ）該プロモーター成分（ａ）に結合
したリボソーム結合部位を含んでなる請求項２４に記載の方法。 【請求項３２】 該リボソーム結合部位は遺伝子１０リーダーの結合部位お
よびｒｂｃＬＲＢＳ部位からなる群から選択される請求項３１に記載の構築物。 【請求項３３】 該ＤＮＡ配列が除草剤グリフォセートに対する耐性を付与
する遺伝子をコードする請求項２４に記載の方法。 【請求項３４】 該ＤＮＡコード化配列がグリフォセート耐性５−エノール
ピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼをコードする請求項３３に記
載の方法。 【請求項３５】 該ＤＮＡコード化配列はＥ．ｃｏｌｉまたはサルモネラ（
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ａｒｏＡ遺伝子、ＣＰ４遺伝子、変異体ペチュニアＥＰ
ＳＰＳ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株ＬＢＡＡの変異体ＥＰＳ
ＰＳ遺伝子および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｒｏＥ遺伝
子からなる群から選択される請求項３４に記載の方法。 【請求項３６】 該ＤＮＡコード化配列がグリフォセート修飾酵素をコード
する請求項３３に記載の方法。 【請求項３７】 該グリフォセート修飾酵素はｇｏｘ、ｈｐｈ、ｇｌｐＡお
よびｇｌｐＢからなる群から選択される請求項３６に記載の方法。 【請求項３８】 該ＤＮＡコード化配列が該遺伝子に対して天然コード化配
列である請求項２４に記載の方法。 【請求項３９】 該ＤＮＡコード化配列が該遺伝子に対して合成コード化配
列である請求項２４に記載の方法。 【請求項４０】 該ＤＮＡ配列がスルフォニル尿素耐性ＡＨＡＳ遺伝子をコ
ードする請求項２４に記載の方法。 【請求項４１】 該ＤＮＡ配列がミジザリノン耐性ＡＨＡＳ遺伝子をコード
する請求項２４に記載の方法。 【請求項４２】 該ＤＮＡコード化配列がＡＬＳ遺伝子である請求項４１に
記載の方法。 【請求項４３】 該ＤＮＡ配列がカロテノイド経路の酵素をコードする請求
項２４に記載の方法。 【請求項４４】 該ＤＮＡコード化配列がｃｒｔＩ遺伝子である請求項４３
に記載の方法。 【請求項４５】 該ＤＮＡ配列がブロモキシニル耐性遺伝子をコードする請
求項２４に記載の方法。 【請求項４６】 該ブロモキシニル耐性遺伝子がＢＸＮ遺伝子である請求項
４５に記載の方法。 【請求項４７】 請求項２４に記載の方法により製造した除草剤耐性植物細
胞。 【請求項４８】 請求項４７に記載の植物細胞を含んでなる植物、植物の種
子または植物の部分。 【請求項４９】 該除草剤耐性遺伝子から発現されるタンパク質として全可
溶性タンパク質の約０．０１％以上を含んでなる請求項４７に記載の植物細胞。 【請求項５０】 該除草剤耐性遺伝子から発現されるタンパク質として全可
溶性タンパク質の約０．１％以上を含んでなる請求項４７に記載の植物細胞。 【請求項５１】 該除草剤耐性遺伝子から発現されるタンパク質として全可
溶性タンパク質の約０．２％以上を含んでなる請求項４７に記載の植物細胞。 【請求項５２】 該除草剤耐性遺伝子から発現されるタンパク質として全可
溶性タンパク質の１％またはそれ以上を含んでなる請求項４７に記載の植物細胞
。 【請求項５３】 該除草剤耐性遺伝子から発現されるタンパク質として全可
溶性タンパク質の１２％またはそれ以上を含んでなる請求項４７に記載の植物細
胞。 【請求項５４】 該除草剤耐性遺伝子がグリフォセート耐性５−エノールピ
ルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼである請求項４７に記載の植物
細胞。 【請求項５５】 請求項５３に記載の植物細胞を含んでなる植物、植物の種
子または植物の部分。 【請求項５６】 除草剤グリフォセートをエーカーあたり約１６オンスまた
はそれ以上の率で散布した場合に該除草剤に対して耐性を示す請求項５５に記載
の植物。 【請求項５７】 除草剤グリフォセートをエーカーあたり約３２オンスまた
はそれ以上の率で散布した場合に該除草剤に対して耐性を示す請求項５５に記載
の植物。 【請求項５７】 除草剤グリフォセートをエーカーあたり約６４オンスまた
はそれ以上の率で散布した場合に該除草剤に対して耐性を示す請求項５５に記載
の植物。 【請求項５８】 除草剤グリフォセートをエーカーあたり約１２８オンスま
たはそれ以上の率で散布した場合に該除草剤に対して耐性を示す請求項５５に記
載の植物。 【請求項６０】 請求項２４に記載の方法により作った除草剤耐性を用いて
該構築物により形質転換された細胞を形質転換されていない細胞から選別する方
法。 【請求項６１】 該除草剤耐性遺伝子が除草剤グリフォセートに対する耐性
を付与する請求項６０に記載の方法。 【請求項６２】 少なくとも約５０μＭないし約２００μＭの濃度でグリフ
ォセートを含有する培地において該除草剤耐性に関する選別が行われる請求項６
１に記載の方法。 【請求項６３】 約１ｍＭからの濃度でグリフォセートを含有する培地にお
いて該除草剤耐性に関する選別が行われる請求項６２に記載の方法。 【請求項６４】 請求項６０に記載の方法により製造した植物細胞。 【請求項６５】 １６オンス／エーカー、３２オンス／エーカー、６４オン
ス／エーカーおよび１２８オンス／エーカーからなる群から選択される量の除草
剤の散布に対して該植物細胞が耐性を示す請求項２４に記載の方法。 【請求項６６】 該除草剤がグリフォセートである請求項６５に記載の方法
。
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