MXPA01000372A - Expresion de genes de tolerancia a herbicidas en plastidos de plantas. - Google Patents

Abstract

Se proveen construcciones y metodos para expresar genes de tolerancia a herbicidas en plastidos de celulas vegetales; las construcciones incluyen los componentes de un promotor funcional en un plastido de planta, una secuencia de ADN que es capaz de conferir tolerancia en una celula vegetal a por lo menos un compuesto herbicida cuando dicha secuencia de ADN es transcrita en plastidos de dicha celula vegetal y una region de terminacion de transcripcion; la tolerancia a herbicida se produce transformando plastidos con las construcciones de la invencion y cultivando celulas vegetales que comprenden los plastidos transformados bajo condiciones en las que la secuencia de ADN es transcrita y los plastidos de plantas y las celulas que contienen los plastidos se vuelven tolerantes a aplicaciones de por lo menos un compuesto herbicida.

Description

EXPRESIÓN DE GENES DE TOLERANCIA A HERBICIDAS EN PLASTIPOS DE PLANTAS CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a la aplicación de técnicas de ingeniería genética en plantas. Específicamente, la invención se refiere a composiciones y métodos para intensificar la expresión de proteínas en plástidos de plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los plástidos de las plantas superiores son un objetivo atractivo para la ingeniería genética. Los plástidos de las plantas (cloroplastos, amiloplastos, elaioplastos, etioplastos, cromoplastos, etc.), son los centros biosintéticos principales que, además de la fotosíntesis, llevan a cabo la producción de compuestos industrialmente importantes tales como aminoácidos, carbohidratos complejos, ácidos grasos y pigmentos. Los plástidos se derivan de un precursor común conocido como proplástido, y de esta manera los plástidos presentes en una especie vegetal determinada, tienen todos el mismo contenido genético. Las células vegetales contienen 500-10,000 copias de un genoma circular pequeño de 120-160 kilobases, en el cual cada molécula tiene una repetición invertida larga (de aproximadamente 25 kb). De esta manera, es posible diseñar células vegetales que contengan hasta 20,000 copias de un gen de interés en particular, el cual puede potencialmente dar como resultado niveles muy altos de expresión de genes introducidos. Además, los plástidos de la mayoría de las plantas son heredados por vía materna. Por consiguiente, a diferencia de los genes heterólogos expresados en el núcleo, los genes heterólogos expresados en plástidos no son diseminados por el polen; por lo tanto, una característica introducida en un plástido no será transmitida a miembros emparentados de tipo silvestre. Existe la necesidad de elementos reguladores mejorados para la expresión de genes en un plástido. Hasta la fecha, las señales de expresión usadas habitualmente para la expresión de transgenes en plástidos derivan de genes endógenos de plástidos. Las señales de expresión en plástidos se derivan típicamente de regiones de promotor de genes de plástidos altamente expresados, tales como las regiones de promotor del operón de ARN ribosomal 16S (Prrn), el gen psbA (PpsbA) o el gen rbcL (PrbcL). Los genes psbA y rbcL son altamente transcritos, pero su traducción es controlada por factores regulados por la luz y específicos de tejidos que limitan su utilidad. En el caso de Prrn, un sitio de unión a ribosoma (RBS) sintético estructurado después de la secuencia líder del gen rbcL en plástidos, se ha usado típicamente para dirigir la traducción. Sin embargo, este Prrn/RBS es traducido ineficazmente debido a unión deficiente a ribosomas. Un sistema de expresión totalmente heterólogo se ha usado para expresar genes de plástidos (véase documento USPN 5,576,198, cuyos contenidos se incoforan en su totalidad en la presente como referencia). Este sistema es un sistema de dos componentes. El primer componente es un transgen de plástidos dirigido por una secuencia líder/promotor del gen 10 del bacteriófago T7. El segundo componente es un gen nuclear que codifica para la T7 polimerasa que es dirigida hacia el compartimento del plástido. La limitación de este sistema es la necesidad de crear líneas transformadas nucleares que expresen la T7 polimerasa en formas preferidas. Los plástidos de las plantas superiores representan un objetivo atractivo para la ingeniería genética. Como se mencionó anteriormente, los plástidos de las plantas superiores son heredados por vía materna. Esto ofrece una ventaja para el diseño genético de plantas para tolerancia o resistencia a condiciones naturales o químicas, tales como tolerancia a herbicidas, ya que estas características no serán transmitidas a miembros emparentados de tipo silvestre. Además, el alto nivel de expresión de genes introducidos es atractivo para características diseñadas tales como la producción de proteínas farmacéuticamente importantes. La expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican para enzimas que proveen tolerancia a herbicidas, así como también proteínas farmacéuticas del genoma de plástidos, ofrece una alternativa atractiva de expresión a partir del genoma nuclear de plantas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee secuencias de ácido nucleico útiles para intensificar la expresión de una amplia variedad de genes, tanto eucarióticos como procarióticos en plástidos de plantas. Además, se proveen construcciones de expresión en plástidos que son útiles para el diseño genético de células vegetales, y que proveen la expresión intensificada de las proteínas EPSP sintasa o la proteína hGH en plástidos de células vegetales. Los plástidos transformados deben ser plástidos metabólicamente activos, y son preferiblemente mantenidos a un alto número de copias en el tejido vegetal de interés, más preferiblemente los cloroplastos presentes en los tejidos verdes de la planta, tales como hojas o cotiledones. Las construcciones de expresión en plástidos para su uso en esta invención incluyen generalmente una región de promotor en plástidos capaz de proveer la expresión intensificada de una secuencia de ADN, una secuencia de ADN que codifica para una proteína EPSPS o hGH, y una región de terminación de la transcripción capaz de terminar la transcripción en plástidos de plantas. La región de promotor en plástidos de la presente invención está enlazada de preferencia a un sitio de unión a ribosoma que provee la traducción intensificada de transcritos de ARN mensajero en plástidos de plantas.

La construcción de expresión en plástidos de esta invención, está enlazada de preferencia a una construcción que tiene una secuencia de ADN que codifica para un marcador seleccionable el cual puede ser expresado en plástidos de plantas. La expresión del marcador seleccionable permite la identificación de células vegetales que comprenden un plástido que expresa el marcador. En una modalidad preferida, los vectores para transferir la construcción en una célula vegetal incluyen medios para insertar las construcciones de expresión y selección en el genoma del plástido. Esto comprende preferiblemente regiones de homología con el genoma del plástido objetivo que flanquean las construcciones. Las construcciones de la presente invención comprenden de preferencia una secuencia de promotor enlazada a un sitio de unión a ribosoma capaz de intensificar la traducción de transcritos de ARN mensajero en el plástido de la planta. El sitio de unión a ribosoma se deriva preferiblemente de la secuencia líder del gen 10 del bacteriófago T7. De particular interés en la presente invención es el alto nivel de expresión de secuencias de ácido nucleico en plástidos de plantas. De particular interés es el alto nivel de expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican para enzimas que intervienen en la tolerancia a herbicidas y que codifican para proteínas farmacéuticas. Las construcciones de la presente invención comprenden de preferencia una secuencia de ADN que codifica para una 5- enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (véase documento USPN 5,633,435, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad en la presente como referencia), nitrilasa, fitoeno desaturasa, aprotinina, o una secuencia de ADN que codifica para hormona del crecimiento humano (véase documento USPN 5,424,199, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad en la presente como referencia). Plástidos de células vegetales que contienen a las construcciones son también contemplados en esta invención, como lo son plantas, semillas de plantas, células vegetales o progenie de las mismas que contienen plástidos que comprenden la construcción. La presente invención incluye también métodos para intensificar la expresión de secuencias de ADN en plástidos de plantas. La invención incluye también un método para la expresión intensificada de una enzima que confiere tolerancia a herbicidas en una célula vegetal, mediante la expresión de la cepa CP4 EPSPS de Agrobacterium tumefaciens sp en plástidos de la célula vegetal. Además, la invención incluye también un método para la expresión intensificada de una enzima que codifica para hGH en plástidos de la célula vegetal. De esta manera, la presente invención se refiere a un gen quimérico que contiene una secuencia que codifica para tolerancia a herbicidas o la secuencia de codificación de una proteína farmacéutica, un vector de expresión en plástídos de plantas que contiene un promotor enlazado operablemente a un sitio de unión a ribosoma del gen 10 de la polimerasa del bacteriófago T7 capaz de intensificar la expresión en un plástido y enlazado operablemente a un gen que codifica para una proteína farmacéutica o para tolerancia a herbicidas, un vector de transformación en plantas que tiene insertado en el mismo un gen que codifica para una proteína farmacéutica o para tolerancia a herbicidas expresado a partir de un promotor de plástidos enlazado a un sitio de unión a ribosoma del gen 10 de polimerasa del bacteriófago T7, células vegetales transformadas usando dichos vectores, y plantas regeneradas a partir de los mismos que exhiben un grado sustancial de expresión de secuencias de ácido nucleico, y proteínas y métodos para producir dichas plantas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del sitio de unión a ribosoma de G10L. La figura 2 provee una secuencia de aminoácidos que codifica para aprotinina. La figura 3 provee los resultados del análisis de RP-CLAR para la caracterización de la proteína hGH expresada en el plástido. El pico I (pico más alto) indica el tiempo de retención esperado para la molécula GP2000 nativa y adecuadamente plegada de 22 kDa.

La figura 4 provee un análisis de espectrometría de masa (MS) de ionización por electroaspersión usando un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo por electroaspersión Micromass Q-Tof. En particular, se provee una serie de iones que corresponden a las especies presentes en la muestra con números variables de protones unidos. Los ejes del espectro son intensidad contra relación de masa: carga de las especies presentes. La figura 5 provee una representación gráfica de la bioactividad de hGH expresada a partir de plástidos de plantas. Las muestras representadas en la gráfica son prolactina de bovino (bPL), hGH expresada a partir de E. coli (Ala-hGH), y un transgénico nulo con valor máximo obtenido con prolactina de bovino (valor máximo nulo de SPFF) como controles positivos, un transgénico nulo (valor máximo nulo de SPFF) como control negativo, muestras transgénicas de una columna de sefarosa (muestra de SPFF) y una muestra transgénica eluida de la columna de sefarosa a pH 3.5 (SPFF, pH 3.5 Ein). La figura 6 provee la secuencia de ácido nucleico para el híbrido de Prrn/promotor de G10L/RBS. El promotor Prrn contiene los elementos de promotor 35 y 10 consenso en plástidos (subrayados) y los sitios de inicio de la transcripción (GC en negritas) para la ARN polimerasa codificada por plástidos (PEP). La secuencia líder del gen 10 (G10L) contiene , un sitio de unión a ribosoma perfecto en plástidos (RBS, nucleótidos en negritas). La figura 7 provee la secuencia de ácido nucleico para la fusión Prm/NEP/G10L::14aaGFP. La región de promotor NEP está subrayada (A en negritas es el sitio de inicio de la transcripción). La región de promotor NEP usada se extiende más allá de la secuencia consenso hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' del promotor. La secuencia ATG inicial, la metionina del iniciador, no se cuenta en los 14 aminoácidos de GFP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención, se proveen construcciones de expresión en plástidos que comprenden generalmente un promotor funcional en un plástido, un sito de unión a ribosoma derivado de la secuencia líder del gen 10 de polimerasa del bacteriófago T7, una secuencia de ADN que codifica para un gen de interés, y una región de terminación de la transcripción capaz de terminar la transcripción en un plástido de plantas. Estos elementos se proveen como componentes unidos operablemente en la dirección de transcripción 5' a 3'. Además, las construcciones de la presente invención pueden incluir también una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido capaz de dirigir dicha secuencia de ADN que codifica para una proteína, hacia el lumen del tilacoide dentro del cloroplasto. De particular interés en la presente invención es el uso de las construcciones de expresión en plástidos para dirigir el alto nivel de transcripción y traducción (expresión) de secuencias de ácido nucleico. Dichas construcciones de expresión en plástidos encuentran uso para dirigir el alto nivel de expresión de secuencias de ADN que codifican para enzimas que intervienen en tolerancia a herbicidas o que codifican para la producción de proteínas farmacéuticas. De interés más particular en la presente invención, es el uso de las construcciones de expresión en plástidos para dirigir el alto nivel de traducción de ARN mensajero transcrito. Los datos bioquímicos y de secuencias de ADN revelan una similitud de las señales de inicio y las maquinarias de traducción y transcripción del plástido, con la presente en sistemas procarióticos. De hecho, se ha reportado que las secuencias de promotor derivadas de plástidos dirigen la expresión de genes de reportero en células procarióticas. Además, los genes de plástidos están organizados con frecuencia en operones policistrónicos como lo están en procariontes. A pesar de las similitudes aparentes entre los plástidos y procariontes, existen diferencias fundamentales en los métodos usados para controlar la expresión génica en plástidos y procariontes. Opuestamente a los mecanismos de control de la transcripción observados típicamente en procariontes, la expresión de genes en plástidos es controlada predominantemente al nivel de traducción y estabilidad del ARN mensajero por proteínas nucleares codificadas que actúan al nivel de la posición trans. La traducción es un proceso de etapas múltiples que implica primero la unión del ARN mensajero a los ribosomas. Iniciando en el codón de inicio de la traducción, los codones de ARN mensajero son leídos secuencialmente conforme los ribosomas se mueven a lo largo de la molécula de ARN mensajero. Los aminoácidos especificados se añaden entonces secuencialmente a la cadena polipeptídica en crecimiento para producir la proteína o el polipéptido codificado en el ARN mensajero. Como se mencionó, el primer paso en el proceso de traducción es la unión de la molécula de ARN mensajero al ribosoma. La naturaleza de esta interacción (es decir, unión) sólo ha sido elucidada parcialmente. El análisis de oligonucleótidos resistentes a ARNasa aislada de complejos de inicio de la traducción en bacterias, indica que un fragmento de ARN de aproximadamente 30 a 40 nucleótidos de longitud comprende el sitio de unión inicial al ribosoma (RBS). De esta manera, se entenderá en lo consecutivo que un RBS comprende una secuencia de ARN mensajero que rodea al codón de inicio de la traducción que es responsable de la unión del ribosoma y del inicio de la traducción. Recientemente, se han identificado sitios de unión a ribosoma capaces de dirigir la traducción en procariontes. Por ejemplo, se ha identificado un sitio de unión a ribosoma derivado de la secuencia líder del gen 10 del bacteriófago T7, G10L (véase documento USPN 5,232,840, cuyos contenidos se encuentran incorporados en su totalidad en la presente como referencia), que incrementa la expresión de secuencias de ácido nucleico en procariontes.

Herbicidas tales como N-fosfonometilglicina, hidroxibenzonitrilos halogenados, y norflurazon, han sido el tema de un gran cúmulo de investigación. La N-fosfonometilglicina, referida comúnmente como glifosato, inhibe la vía de ácido shikímico que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos que incluyen aminoácidos, fitohormonas y vitaminas. Específicamente, el glifosato reprime la conversión de ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y ácido 3-fosfoshikímico a ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshikímico, inhibiendo a la enzima 5-enolpiruvishikimato-3-fosfato sintasa (referida en lo consecutivo como EPSP sintasa o EPSPS). Se han producido plantas tolerantes a glifosato mediante transformación de varios genes de EPSP sintasa en el genoma nuclear de una planta. Un gen para EPSP sintasa ha sido clonado a partir de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens sp (véase documento USPN 5,633,435), y confiere un alto nivel de tolerancia a glifosato en plantas. Además, se han logrado altos niveles de tolerancia a glifosato en un número de plantas de cultivo mediante fusión de EPSPS a un péptido de tránsito de cloroplastos (CTP) para expresión dirigida en plástidos. Además, se han aislado variantes de la enzima EPSPS de tipo silvestre que son tolerantes a glifosato, como resultado de alteraciones en la secuencia que codifica para aminoácidos de EPSPS (Kishore y Shah. Ann. Rev. Biochem. (1988) 57: 627-663; Shulze et al., Arch. Microbiol. (1984) 137: 121-123; Kishore et al., Fed. Proc. (1986) 45: 1506). Estas variantes tienen típicamente una K¡ mayor para glifosato que la enzima EPSPS de tipo silvestre que confiere el fenotipo tolerante a glifosato, pero estas variantes se caracterizan también por una Km alta para PEP que hace que la enzima sea cinéticamente menos eficiente (Kishore y Shah, Ann.

Rev. Biochem. (1988) 57: 627-663; Sost et al., FEBS Lett. (1984) 173: 238-241; Shulze et al., Arch. Microbiol. (1984) 137: 121-123; Kishore et al., Fed.

Proc. (1986) 45: 1506; Sost y Amrhein. Arch. Biochem. Biophys. (1990) 282: 433-436). Además del diseño de plantas para tolerancia a glifosato, se han diseñado también plantas para tolerar otras clases de herbicidas tales como hidroxibenzonitrilos halogenados y norflurazon, usando secuencias de ácido nucleico expresadas en el núcleo. Se sugiere que hidroxibenzonitrilos halogenados tales como Bromoxinil, actúan herbicidamente inhibiendo el complejo de proteínas de unión a quinona del fotosistema II, inhibiendo la transferencia de electrones (Van Rensen (1982) Physiol. Plant 54: 515-520, y Sanders y Pallett (1986) Pestic. Biochem. Physiol. 26: 116-122). Herbicidas tales como norflurazon inhiben la producción de carotenoides. Se han producido plantas que son resistentes a Bromoxinil mediante la expresión de secuencias de ADN que codifican para enzimas capaces de destoxificar a Bromoxinil (nitrilasas) en el núcleo de la célula vegetal. Secuencias de ADN que codifican para dichas nitrilasas han sido clonadas de bacterias tales como Klebsiella pneumoniae, y se han usado para construir vectores para dirigir la expresión de la secuencia de ADN en el núcleo de la célula vegetal (véase documento USPN 4,810,648, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad en la presente como referencia). Se han diseñado plantas que son resistentes a norflurazon mediante la expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican para enzimas de la vía de biosíntesis de carotenoides en el núcleo de células vegetales. Por ejemplo, la expresión de una fitoeno desaturasa de Erwinia uredovora, provee tolerancia a norflurazon. Aunque plantas transformadas que expresan secuencias de ácido nucleico que codifican para dichas enzimas del genoma nuclear han encontrado utilidad en el diseño de plantas tolerantes a herbicidas, sería cada vez más benéfico obtener plantas tolerantes a herbicidas mediante expresión en plástidos. En los ejemplos provistos en la presente, se usan secuencias de ADN que codifican para enzimas que intervienen en la tolerancia a herbicidas, en construcciones para dirigir la expresión de las secuencias a partir de plástidos de plantas. Secuencias de ADN que codifican para 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), 'bromoxinil nitrilasa (Bxn), fitoeno desaturasa (crtl (Mísawa et al, (1993) Plant Journal 4: 833-840, y (1994) Plant Jour 6: 481-489), y acetohidroxiácido sintasa (AHAS (Sathasiivan eí al. (1990) Nucí. Acids. Res. 18: 2188-2193)), se usan en las construcciones de expresión de la presente invención para dirigir la expresión de dichas secuencias de nucleótidos para tolerancia a herbicidas a partir de plástidos de plantas.

Se han identificado plantas de tabaco transplastómicas que son homoplásmicas para las secuencias de ADN de interés que codifican para dichos genes de tolerancia a herbicidas. Las plantas homoplásmicas demuestran un alto nivel de expresión de proteínas a partir del plástido. Además, las plantas homoplásmicas demuestran un alto nivel de tolerancia para el herbicida respectivo. Por ejemplo, como se describe en más detalle en el ejemplo siguiente, plantas transformadas que expresan EPSPS a partir del plástido, demuestran un alto nivel de tolerancia para el herbicida glifosato. Además, líneas de tabaco homoplásmicas que expresan nitrilasa o fitoeno desaturasa, demuestran altos niveles de tolerancia para los herbicidas bromoxinil y norflurazon, respectivamente. El experto en la técnica a la cual la presente invención pertenece, reconocerá que otras secuencias se pueden utilizar en las construcciones de expresión en plástidos de la presente invención para producir plantas tolerantes a herbicidas. Otra secuencia de ácido nucleico que puede encontrar uso en las construcciones de expresión en plástidos para producir plantas tolerantes a herbicidas, incluye el gen bar para tolerancia a glufosinato (DeBlock, eí al. (1987) EMBO J. 6: 2513-2519). Además, otros genes de tolerancia a glifosato se pueden utilizar en las construcciones de la presente invención. Otros genes de EPSPS para tolerancia a glifosato se describen en la patente de E.U.A. No. 5,627,061 , Padgette eí al. (1986) Herbicide Resistant Crops. Lewis Publishers, 53-85, y en Peñaloza-Vázquez eí al. (1995) Plant Cell Reports 14: 482-487, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Debe observarse que las construcciones de tolerancia a herbicidas de la presente invención pueden incluir también secuencias que codifican para genes que intervienen en otros genes de tolerancia a tensión ambiental, por ejemplo, genes de tolerancia/resistencia a insectos o enfermedades. Como se describe en más detalle en los ejemplos siguientes, se usan construcciones de expresión en plástidos para regenerar plantas que sean resistentes al herbicida Buctril, y que expresan también la proteína c/ylAc de Bacillus thuringiensis. Además, las construcciones de expresión en plástidos encuentran también uso para dirigir la producción de proteínas biológicas humanas (proteínas farmacéuticas) a partir de plástidos de plantas. Secuencias de ácido nucleico que codifican para la hormona del crecimiento humano (hGH), se utilizan en las construcciones de expresión en plástidos de la presente invención. Además, plantas de tabaco transplastómicas que contienen dichas construcciones demuestran un alto nivel de expresión de hGH. Además, la proteína hGH expresada a partir de plástidos de plantas exhibe características de procesamiento adecuado, así como también plegamento de proteína adecuado. Los métodos tradicionales que se usan para producir proteínas farmacéuticas utilizan generalmente organismos procarióticos o eucarióticos de una sola célula para sistemas de expresión y producción a gran escala. Por ejemplo, la producción de la hormona biológica humana, hormona del crecimiento humano (véase documento USPN 5,424,199), se ha logrado en células de Bacillus y E. coli. Otro ejemplo es la producción de aprotinina. Los métodos tradicionales para la producción de aprotinina han utilizado la expresión de aprotinina en bacterias, o más usualmente, la extracción de la proteína de órganos o tejidos de bovino. De esta manera, existe la necesidad en la técnica de un procedimiento alternativo para la producción a gran escala de dichas moléculas biológicas humanas. La hormona del crecimiento humano (hGH) participa en gran parte en la regulación del crecimiento y desarrollo humano normal. Esta hormona de 22,000 daltons de la pituitaria exhibe una multitud de efectos biológicos que incluyen crecimiento lineal (somatogénesis), lactancia, activación de macrófagos, efectos similares a la insulina y efectos diabetogénicos entre otros (Chawla, Ann. Rev. Med. (1983) 34: 519; Edwards, eí al., Science (1988) 239: 769; Thorner eí al., J. Clin. Invest. (1988) 81 : 745). La deficiencia del crecimiento en niños conduce a enanismo, el cual ha sido tratado exitosamente durante más de una década mediante la administración exógena de hGH. La hGH es un miembro de una familia de hormonas homologas que ¡ncluyen lactógenos placentarios, prolactinas y otras variantes genéticas y de especies de la hormona del crecimiento (Nicoll, eí al., Endocrine Reviews (1986) 7: 169). La hGH es inusual entre éstas porque exhibe un amplio carácter específico de especie, y se une al receptor somatogénico clonado (Leung, eí al., Nature (1987) 33: 537) o receptor de prolactina (Bountin et al., Cell (1988) 53: 69). La aprotinina (conocida también como inhibidor de tripsina pancreática de bovino, BPTI), es una proteína básica presente en varios órganos y tejidos de bovinos, tales como nodulos linfáticos, páncreas, pulmones, glándula parótida, bazo e hígado. La aprotinina es conocida por inhibir varias serina proteasas, incluyendo tripsina, quimiotripsina, plasmina y calicreína, y se usa terapéuticamente en el tratamiento de pancreatitis aguda, varios estados de síndrome de choque, hemorragia hiperfibrinolítica e infarto al miocardio. Además, la administración de aprotinina a altas dosis reduce significativamente la pérdida de sangre vinculada a cirugía cardiaca, incluyendo derivación cardiopulmonar (Bidstrup, et al. (1989) Cardiovasc Surg. 44: 640-645). Como se demuestra en más detalle en los ejemplos siguientes, se utilizan construcciones de expresión en plástidos para dirigir la expresión de aprotinina y una hormona del crecimiento humano a partir de plástidos de plantas. Otras secuencias que pueden encontrar uso en la producción de moléculas biológicas humanas ¡ncluyen secuencias que codifican para insulina, o precursores de insulina pueden encontrar uso en las construcciones de expresión de la presente invención. El experto en la técnica reconocerá que se pueden utilizar muchas secuencias de nucleótidos que codifican para moléculas biológicas humanas en las construcciones de la presente invención para dirigir su expresión a partir de plástidos de plantas, tales como las que se describen en Goodman y Gelman (1990) Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, octava edición, secciones 14 y 15. En el desarrollo de las construcciones, los diferentes fragmentos que comprenden las regiones reguladoras y el marco de lectura abierto se pueden someter a diferentes condiciones de procesamiento, tales como ligación, digestión con enzimas de restricción, PCR, mutagénesis in vitro, adición de enlazadores y adaptadores, y similares. De esta manera, se pueden llevar a cabo transiciones, transversiones, inserciones, deleciones, o similares de nucleótidos en el ADN que se utiliza en las regiones reguladoras o las secuencias de ADN de interés para expresión en plástidos. Métodos para realizar digestiones de restricción, tratamientos de extremos rasurados Klenow, ligaciones, y similares, son bien conocidos por los expertos en la técnica y son descritos, por ejemplo, por Maniatis eí al. (en Molecular cloning: a laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Durante la preparación de las construcciones, los diferentes fragmentos de ADN serán clonados con frecuencia en un vector de clonación apropiado que permita la amplificación del ADN, modificación del ADN o manipulación del ADN mediante unión o remoción de secuencias, enlazadores, o similares. De preferencia, los vectores serán capaces de replicarse a por lo menos un número de copias relativamente alto en E. coli. Varios vectores están disponibles fácilmente para clonación, incluyendo vectores tales como pBR322, vectores de la serie pUC, los vectores de la serie M13, y vectores pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Para proveer medios para seleccionar las células vegetales deseadas, los vectores para transformación en plástidos contienen típicamente una construcción que permite la expresión de un gen marcador seleccionable. Los genes marcadores son secuencias de ADN expresables en plantas que expresan un polipéptido que resiste una inhibición natural, pues atenúa o inactiva una sustancia selectiva, es decir, antibiótico, herbicida, etc. En forma alternativa, un gen marcador puede proveer alguna otra respuesta visiblemente reactiva, es decir, puede causar una aparición o patrón de crecimiento distintivos respecto a plantas o células vegetales que no expresan al gen marcador seleccionable en presencia de alguna sustancia, ya sea aplicada directamente a la planta o células vegetales, o presente en la planta o medios de crecimiento de células vegetales. En cualquier caso, las plantas o células vegetales que contienen dichos genes marcadores seleccionables tendrán un fenotipo distintivo para propósitos de identificación, es decir, serán distinguibles de células no transformadas. El fenotipo característico permite la identificación de células, grupos de células, tejidos, órganos, partes de plantas o plantas intactas que contienen la construcción.

La detección del fenotipo marcador hace posible la selección de células que tienen un segundo gen al cual el gen marcador ha sido enlazado. Este segundo gen comprende típicamente un fenotipo deseable que no es fácilmente identificable en células transformadas, pero el cual está presente cuando la célula vegetal, o derivado de la misma crece hasta la madurez, incluso bajo condiciones en donde el fenotipo del marcador seleccionable mismo no es aparente. El uso de dicho marcador para la identificación de células vegetales que contienen una construcción de plástidos, ha sido descrito por Svab eí al. (1993, citado anteriormente). En los ejemplos provistos a continuación, un gen aadA bacteriano es expresado como marcador bajo el control regulador de regiones de terminación de la transcripción del promotor 5' y 3' en cloroplastos, específicamente las regiones reguladoras del gen psbA (descrito en Staub eí al., EMBO J. (1993) 12(2): 601-606). Muchas otras regiones de promotor se pueden usar también para dirigir la expresión del gen marcador seleccionable, incluyendo varios promotores de plástidos y promotores bacterianos que se ha mostrado funcionan en plástidos de plantas. La expresión del gen aadA confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina, y permite de esta manera la identificación de células vegetales que expresan este marcador. El producto del gen aadA permite el crecimiento continuo y enverdecimiento de células cuyos cloroplastos comprenden el producto del gen marcador seleccionable. Las células que no contienen al producto del gen marcador seleccionable están decoloradas. La selección del gen marcador aadA se basa así en la identificación de células vegetales que no son decoloradas por la presencia de estreptomicina, o más preferiblemente espectinomicina, en el medio de crecimiento de la planta. Se han desarrollado numerosos marcadores para su uso con células vegetales, tales como para resistencia a cloranfenicol, el aminoglucósido G418, higromicina, o similares. Otros genes que codifiquen para un producto que interviene en el metabolismo de cloroplastos, se pueden usar también como marcadores seleccionables. Por ejemplo, genes que confieren resistencia a herbicidas tales como glifosato, bromoxinil o imidazolinona, pueden encontrar uso particular. Dichos genes han sido reportados (Stalker et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 4724-4728 (gen de EPSP resistente a glifosato); Stalker eí al., J. Biol. Chem. (1985) 263: 6310-6314 (gen de nitrilasa resistente a bromoxinilo); y Sathasivan eí al., Nucí. Acids Res. (1990) 18: 2188 (gen de resistencia a AHAS imidazolinona)). Se ha reportado la transformación estable de genomas de plástidos de tabaco mediante bombardeo de partículas (Svab eí al. (1990), citado anteriormente) y Svab eí al. (1993), citado anteriormente). Los métodos descritos ahí se pueden utilizar para obtener plantas homoplásmicas para construcciones de expresión en plástidos. Por lo general, el tejido bombardeado es cultivado durante aproximadamente 2 días en medios promotores de la división celular, después de lo cual el tejido vegetal es transferido a medios selectivos que contengan una cantidad inhibidora del agente selectivo en particular, así como también las hormonas particulares y otras sustancias necesarias para obtener la regeneración de esa especie de planta en particular. Los brotes son entonces subcultivados en los mismos medios selectivos para asegurar la producción y selección de brotes homoplásmicos. Las plantas de tabaco transplastómicas son analizadas para una población pura de genomas de plástidos transformados (líneas homopiásmicas). La homoplasmía se verifica usando análisis Southern que utiliza sondas de ácido nucleico que abarcan una región del transgen y el genoma del cloroplasto (es decir, la región de inserción). Las plantas transplastómicas que son heteroplásmicas (es decir, que contienen una mezcla de genomas de plástidos que contienen y que carecen del transgen) se caracterizan por un patrón de hibridación de bandas transgénicas y de tipo silvestre. Las plantas homoplásmicas muestran un patrón de hibridación que carece de la banda de tipo silvestre. En forma alternativa, la homoplasmía se puede verificar usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Se utilizan iniciadores de PCR que son dirigidos para amplificar a partir de secuencias de la región de inserción. Por ejemplo, se puede utilizar un par de iniciadores en una reacción de PCR. Un iniciador amplifica a partir de una región en el transgen, mientras que el segundo iniciador amplifica a partir de una región próxima a la región de inserción hacia esta última. Se lleva a cabo una segunda región de PCR usando iniciadores diseñados para amplificar la región de inserción. Las líneas transplastómicas identificadas como homoplásmicas producen el fragmento de tamaño esperado en la primera reacción, aunque no producen el fragmento de tamaño predicho en la segunda reacción. En los casos en donde se han adaptado métodos de transformación y regeneración para una especie vegetal determinada, ya sea mediante transformación mediada por Agrobacterium, bombardeo o algún otro método, las técnicas establecidas pueden ser modificadas para usarse en métodos de selección y regeneración para producir plantas transformadas en sus plástidos. Por ejemplo, los métodos descritos en la presente para el tabaco son fácilmente adaptables para otras especies de solanáceas, tales como tomate, petunia y papa. Para la transformación de la soya, se ha descrito bombardeo de partículas, así como también protocolos de regeneración y transformación nuclear mediada por Agrobacterium (Hinchee eí al., USPN 5,416,011 , y Christou et al., USPN 5,015,580). El experto en la técnica reconocerá que se pueden usar protocolos descritos para la transformación de la soya. En Brassica, los protocolos de regeneración y transformación mediadas por Agrobacterium implican generalmente el uso de tejido del hipocotilo, un tejido no verde que podría tener un bajo contenido de plástidos. De esta manera, para Brassica, los tejidos objetivo preferidos incluirían hipocotilo derivado de microsporas o tejidos de cotiledones (los cuales son verdes y de esta manera contienen numerosos plástidos), o explantes de tejido foliar. Aunque los índices de regeneración a partir de dichos tejidos pueden ser bajos, no se esperan efectos de posición tales como los que se observan con la transformación mediada por Agrobacterium; de esta manera, no sería necesario seleccionar numerosas plantas exitosamente transformadas para obtener un fenotipo deseado. Para el algodón, la transformación de cotiledones de Gossypium hirsutum L, mediante co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens, ha sido descrita por Firoozabady et al., Plant. Mol. Bio. (1987) 10: 105-116, y Umbeck eí al., Bio/Technology (1987) 5: 263-266. De nuevo, como para Brassica, este tejido puede tener un contenido insuficiente de plástidos para transformación de cloroplastos. De esta manera, como para Brassica, puede ser deseable un método alternativo para transformación y regeneración de un tejido objetivo alternativo que contenga cloroplastos, por ejemplo, mediante dirección a un tejido embriogénico verde. Otras especies de plantas pueden ser transformadas en forma similar usando técnicas relacionadas. En forma alternativa, se pueden usar también métodos de bombardeo de microproyectiles, tales como los descritos por Klein eí al. (Bio/Technology 10: 286-291), para obtener plantas transformadas nucleares que comprendan las construcciones de expresión de ARN polimerasa de la subunidad individual viral descritas en la presente. La transformación del algodón mediante bombardeo de partículas se reporta en el documento WO 92/15675, publicado en septiembre 17, 1992. Plantas adecuadas para la práctica de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, soya, algodón, alfalfa, colza oleaginosa, lino, tomate, remolacha azucarera, girasol, papa, tabaco, maíz, trigo, arroz y lechuga. Los vectores para su uso en la transformación en plástidos ¡ncluyen de preferencia medios para proveer una transferencia estable de la construcción de expresión en plástidos y construcción de marcador seleccionable en el genoma del plástido. Esto se provee más convenientemente mediante regiones de homología con el genoma del plástido objetivo. Las regiones de homología flanquean la construcción que va a ser transferida, y proveen la transferencia hacia el genoma del plástido mediante recombinación homologa, mediante un entrecruzamiento doble en el genoma. Se ha reportado la secuencia de ADN completa del genoma de plástidos del tabaco (Shinozaki et al., EMBO J. (1986) 5: 2043-2049). También se han reportado las secuencias de ADN completas del genoma de los plástidos de hepáticas (Ohyama eí al., Nature (1986) 322: 572-574) y arroz (Hiratsuka et al., Mol. Gen. Genet. (1989) 217: 185-194). Cuando las regiones de homología están presentes en las regiones de repetición invertida del genoma del plástido (conocidas como IRA e IRB), se esperan dos copias del transgen por plástido transformado. Cuando las regiones de homología están presentes fuera de las regiones de repetición invertidas del genoma del plástido, se espera una copia del transgen por plástido transformado. Las regiones de homología dentro del genoma del plástido son de aproximadamente 1 kb de tamaño. También se pueden usar regiones de homología más pequeñas, y tan pequeñas como de 100 pb pueden proveer recombinación homologa en el genoma del plástido. Sin embargo, la frecuencia de recombinación y de esta manera la frecuencia para obtener plantas que tengan plástidos transformados, disminuye conforme disminuye el tamaño de las regiones de homología. Ejemplos de construcciones que tienen regiones de homología en el genoma del plástído se describen en Svab eí al. (1990, citado anteriormente), Svab eí al. (1993, citado anteriormente), y Zoubenko eí al. (Nucí Acid Res (1994) 22(19): 3819-3824). Como se describe en más detalle en los ejemplos siguientes, se describen construcciones que proveen la expresión incrementada de secuencias de ADN en plástidos de plantas. Varias secuencias de sitio de unión a ribosoma/promotor se utilizan para dirigir la expresión en plástidos de plantas. Secuencias de promotor del operón de ARN ribosomal 16S (Prrn) son enlazadas a un sitio de unión a ribosoma (RBS) derivado de la secuencia líder del gen 10 del bacteriófago T7 (G10L). Las secuencias de ADN expresadas bajo el control regulador de la secuencia Prrn/GIOL, muestran un nivel de expresión de proteínas significativamente mayor que los niveles obtenidos bajo el control de otras combinaciones de promotor/RBS, mientras que la expresión del ARN mensajero puede ser o no mayor en estas plantas. En los ejemplos siguientes, las secuencias de ácido nucleico que codifican para CP4 EPSP sintasa (véase documento USPN 5,633,435), se colocan en construcciones de expresión para la expresión de la enzima EPSP sintasa a partir de plástidos de plantas. Además, una secuencia de ADN que codifica para hGH (véase documento USPN 5,424,199), se coloca también en la construcción de expresión para la expresión de la hormona del crecimiento humano a partir de plástidos de plantas. Las construcciones preparadas utilizan un sitio de unión a ribosoma designado en lo consecutivo como la secuencia líder del gen 10 del bacteriófago T7 (G10L) para incrementar la expresión de las secuencias de ácido nucleico en plástidos de plantas. Las construcciones de expresión en plástidos que codifican para la expresión de EPSPS y hGH, se introducen mediante un vector de transformación en cloroplastos. Líneas de tabaco que contienen la secuencia nativa que codifica para ia enzima EPSPS expresada en plástidos bajo el control de la secuencia del sitio de unión a ribosoma/pro motor de GIOL/Prrn, demuestran un nivel de expresión de proteínas significativamente mayor que los niveles obtenidos a partir de EPSPS expresada bajo el control de la secuencia Prrp/rbcL RBS. Sin embargo, el ARN mensajero de EPSPS es expresado a un nivel superior en plantas que expresan CP4 EPSPS del plástido bajo el control de P/77?/rbcL(RBS). Estos resultados indican que la traducción de transcritos que contienen el sitio de unión a ribosoma del gen 10 del bacteriófago T7, es más eficiente. Además, los niveles de expresión de proteína de EPSPS obtenida de plantas de tabaco transplastómicas que expresan EPSPS bajo el control de P/777/G10L RBS, proveen un alto nivel de tolerancia a glifosato. Además, las líneas de tabaco transplastómicas transformadas que expresan hGH bajo el control de la secuencia del sitio de unión a ribosoma/promotor de G10L/P/77?, demuestran un nivel de expresión de proteínas significativamente mayor que los niveles obtenidos a partir de hGH expresada bajo el control de la secuencia de RBS/promotor de PpsbA. Incrementos en los niveles de expresión de proteínas de por lo menos aproximadamente 200 veces, se pueden obtener a partir de construcciones utilizando el sitio de unión a ribosoma de G10L/Prm para la expresión de EPSPS y hGH sobre ios niveles de expresión obtenidos a partir de otras combinaciones de promotor/RBS para expresión en plástidos. Además, los niveles de proteína obtenidos de construcciones de expresión en plástidos que utilizan la secuencia de RBS/promotor de GIOL/P/rn, pueden acumular niveles 50 a 3,500 veces mayores que a partir de construcciones de expresión nuclear. De esta manera, la inclusión del sitio de unión a ribosoma de G10L en construcciones de expresión en plástidos, puede encontrar uso para incrementar los niveles de expresión de proteínas a partir de plástidos de plantas. Además, las construcciones de la presente invención pueden incluir también secuencias para dirigir la proteína expresada hacia una región suborganelar particular, por ejemplo, el lumen de los tilacoides del cloroplasto. Por ejemplo, como se describe en los ejemplos siguientes, una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido a partir del citocromo f del genoma del plástido dirige la proteína aprotinina expresada hacia la membrana del tilacoide. Dicha dirección de proteínas expresadas puede proveer una compartimentalización de la proteína que permite estabilidad oxidante incrementada y plegamento apropiado de la proteína. De esta manera, las construcciones y los métodos de la presente invención proveen medios para obtener plantas transplastómicas con alto nivel de tolerancia a herbicidas. Los altos niveles de tolerancia incluyen tolerancia de tejidos vegetativos cuando se aplican cantidades mayores de aproximadamente 453.44 g/hectárea de glifosato, de preferencia mayores de aproximadamente 906.88 g/hectárea, más preferiblemente mayores de aproximadamente 1813.76 g/hectárea, muy preferiblemente mayores de aproximadamente 3627.52 g/hectárea. Además, los altos niveles de tolerancia pueden incluir también tolerancia de tejidos reproductores cuando se aplican cantidades mayores de aproximadamente 453.44 g/hectárea de glifosato, de preferencia mayores de aproximadamente 906.88 g/hectárea, más preferiblemente mayores de aproximadamente 1813.76 g/hectárea. La invención que se está describiendo ahora generalmente, se entenderá más fácilmente con relación a los siguientes ejemplos, los cuales se incluyen únicamente para propósitos de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcciones de expresión Construcciones y métodos para su uso en la transformación de plástidos de plantas superiores, se describen en Zoubenko eí al. (Nucí Acid Res (1994) 22(19): 3819-3824), Svab eí al. (Proc. Nati. Acad. Sci. (1990) 87: 8526-8530 y Proc. Nati. Acad. Sci. (1993) 90: 913-917) y Staub eí al. (EMBO J.) (1993) 12: 601-606). Construcciones y métodos para su uso en la transformación de plástidos de plantas superiores para expresar secuencias de ADN bajo el control de una polimerasa del bacteriófago T7 dirigida a plástidos y codificada nuclearmente, se describen en la patente de E.U.A. No. 5,576,198. Las secuencias de ADN completas del genoma de plástidos del tabaco son reportadas por Shinozaki eí al. (EMBO J (1986) 5: 2043-2049). Todas las referencias del ADN de plástidos en la siguiente descripción son para el número de nucleótidos del tabaco. La secuencia de nucleótidos completa que codifica para el citocromo f del tabaco (peíA) es descrita en Bassham et al. (1991 ) J Biol Chem 266: 23606-23610 y Konishi et al. (1993) Plant Cell Physiol 34: 1081-1087. lA. Secuencias del sitio de unión a ribosoma/promotor La región de promotor de operón de ARN ribosomal 16S de plástidos (Prrn) es enlazada a un sitio de unión a ribosoma (RBS) sintético estructurado sobre la secuencia líder del gen rbcL en plástidos para crear el fragmento Prrp/rbcLRBS. La secuencia P/777/rbcLRBS es como se describe en Svab et al. (1993, citado anteriormente), para el fragmento Prm/rbcL(S). La región de promotor del promotor psbA (PpsbA) y secuencias de terminador en plástidos (TpsbA), se describen en Staub eí al. (1993, EMBO J., 12, 601-606). La secuencia Prrn/G10L fue construida uniendo dos secuencias de oligonucleótidos, secuencia líder 1 de T7 y secuencia líder 2 de T7 (cuadro 1), para crear el sitio de unión a ribosoma de G10L en plástidos (figura 1 ). La secuencia de G10L fue ligada al extremo 3' de la secuencia de promotor Prrn como un fragmento EcoRI/?/col, para crear la secuencia P/777/GIOL.

CUADRO 1 Secuencia líder 1 de T7 5'-AATTGTAGAAAT AAT TTT GTT TAA CTTTAA GAA GGA GAT ATA CC-3' Secuencia líder 2 de T7 5'-CAT GGG TAT ATC TCC TTC TTA AAG TTAAAC AAA ATTATT TCT AC-3' Genes quiméricos son insertados preferiblemente en el vector de expresión para dirigir su transcripción a partir del promotor Prrn. De esta manera, en el genoma del plástido, los genes quiméricos son transcritos a partir del promotor Prrp/RBS, o el promotor de G10L/Prrn en plástidos de plantas. La secuencia de ácido nucleico de la fusión Prm/G10L se provee en la figura 6.

IB. Construcciones de expresión CP4 EPSPS en plástidos Se construye un vector de expresión de plástido pMON30117 de un vector precursor pPRV111 B (Zoubenko, eí al., 1994, arriba, acceso a GenBank U12813). El vector pMON30117 porta un sitio de clonación múltiple para la inserción de un gen pasajero en un cassette de expresión Prrp/rbcLRBS/T/ps16. La secuencia Prrp/rbcLRBS se clona en el vector pPRV111B como un fragmento EcoRI/Ncol, y la región terminadora del gen rps16 de plástido (Trps16) se clona 3' del promotor Prrn como un fragmento H/pd/lll/NcoI. El fragmento Trps16 comprende la región 3'-reguladora del gen /ps16 de los nucleótidos 5,087 a 4,939 en el ADN plasmídico de tabaco. La estructura de base pPRV111 B del vector pMON30117 contiene un gen marcador, aadA, para la selección en espectinomicina y estreptomicina, y rps 7/12 para la integración, mediante recombinación homologa, del ADN pasajero en la región intergénica írpV-rps7/12. Se preparó una construcción de expresión nuclear, pMON10154, como un control para la integración en plantas por medio de transformación mediada por Agrobacterium. En esta construcción, el gen nativo CP4 se expresa del promotor de Virus de Mosaico de la Escrofularia constitutivo y el líder HSP70 de Petunia, y tiene el terminador E9. La dirección a plástidos es por medio del péptido de tránsito a cloroplasto de la EPSPS de Petunia fusionada traduccionalmente al término N del gen CP4. La construcción de expresión de plástido pMON30118 se preparó clonando el gen CP4 EPSPS nativo fusionado con los cinco (5) aminoácidos de la terminal N del gen rbcL (descrito en Svab eí al., 1993 arriba) de plástido como un fragmento Nco\/Sma\ en el sitio de clonación múltiple del vector pMON30117. La construcción de expresión de plástido pMON30123 es esencialmente la misma que pMON30118 con la excepción de la deleción de los cinco (5) aminoácidos N-terminales del plástido rbcL. La construcción de expresión de plástido pMON30130 se creó reemplazando la CP4 EPSPS nativa de pMON30123, con un gen CP4 sintético. Esta construcción también carece de la fusión de 5 aminoácidos N-terminales del gen rbcL de plástido. La construcción de expresión de plástido pMON38773 se construyó reemplazando la secuencia Prrp/RBS de pMON30123 con la secuencia de promotor Prrp/G10L descrita arriba. La secuencia de ADN EPSPS de pMON38773 carece también de la fusión de 5 aminoácidos N-terminales del gen rbcL de plástido.

Se construyó una construcción de expresión de plástido, pMON38766, usando el promotor del gen de fago T7 10(P-T7), incluyendo G10L, la región de codificación de gen (nativo) CP4 y la secuencia terminadora del gen rps16 de plástido (Trps16). Se construyó una construcción de expresión de plástido, pMON38797, usando el promotor del gen de fago T7 10(P-T7), incluyendo G10L, región de codificac.on de gen (sintética) CP4, y el terminador del gen rps16 de plástido (Trps16). Se construyó una construcción de expresión de plástido, pMON38798, usando el promotor del operón 16SrDNA (Prrn), G10L, región de codificación de gen (sintética) CP4, terminador del gen rps 16 de plástido (Trps16). Se construyó una construcción de expresión de plástido, pMON38793, usando el promotor del operón 16SrDNA (Prrn), un sitio de unión a ribosoma sintético (RBS) diseñado a partir del gen rbcL de plástido, gen de Petunia EPSP sintasa tolerante a glifosato (P-EPSPS, Padgette, eí al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 258:564-573) que porta la mutación de Glicina a Alanina en la posición de aminoácido 101 , el terminador del gen rps16 de plástido (Trps16). Se construyó una construcción de expresión de plástido, pMON38796, usando el promotor del operón 16SrDNA (Prrn), sitio de unión a ribosoma sintético (RBS) diseñado a partir del gen rbcL de plástido, el gen de EPSP sintasa de Achromobacter (cepa LBAA) tolerante a glifosfato (patente de E.U.A. No. 5,627,061 , cuya totalidad se incorpora en la presente a manera de referencia) que porta la mutación de Glicina a Alanina en la posición de aminoácido 100 (G100A), terminador del gen rps16 de plástido (Trps16). < Se construyó una construcción de expresión de plástido, pMON45204, usando el promotor del operón 16SrDNA (Prrn), con el G10L, el gen de EPSP sintasa de Pseudomonas (cepa LBAA) tolerante a glifosato que porta la mutación de Glic.na a Alanina en la posición de aminoácido 100 (G100A), terminador del gen rps16 de plástido (Trps16). Se. construyó una construcción de expresión de plástido, pMON45201 , usando el promotor del operón 16SrDNA (Prrn), sitio de unión a ribosoma sintético (RBS) diseñado a partir del gen rbcL de plástido, el gen aroE (EPSPS) (patente de E.U.A. No. 5,627,061 ) de Bacillus subtilis tolerante a glifosato tipo silvestre, terminador del gen de plástido rps16 (Trps16). Se construyó una construcción de expresión de plástido, pMON45259, usando el promotor del operón 16SrDNA (Prrn) con la secuencia G10L asociada funcionalmente con la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína CP4 sintética que tiene una secuencia adicional en el término N que codifica para los primeros 14 aminoácidos de la proteína fluorescente verde (GFP) (GKGGEELFTGWPSM). La secuencia que codifica para la fusión GFP de 14 aminoácidos comienza en la glicina en la segunda posición de la proteína. La construcción contiene también al terminador rps16. Se construyó otra construcción de expresión de plástido, pMON49218, para expresar la secuencia CP4 sintética con la fusión GFP de 14 aminoácidos de la región promotora del operón 16SrDNA que tiene la región de ARN polimerasa codificada nuclear (PrmPEP+NEP) y la región terminadora del gen rps 16 de plástido. La secuencia de ADN de la fusión Prrn/NEP/G10L::14aaGFP se provee en la figura 7. 1C. Construcciones de Expresión de plástido bucrilo (bxn) El gen de r áistencia a herbicida bxn (patente de E.U.A. No. 4,810,648, cuya totalidad se incorpora en la presente a manera de referencia) se removió del plásmido pBrx47 como un fragmento de restricción Neo I a \sp718 y se clonó en pUC120 cortado con Nco/Asp7 8 dando como resultado el plásmido pBrx87. El plásmido pBrx47 se digirió después con Nco/Xba y se clonó en los sitios Nco/Xba del plásmido pLAA21 que contiene al promotor de plástido Prrp y la región 3' de rpsL para la expresión de plástidos. El plásmido resultante se designó pBrx89. El plásmido pBrx89 fue digerido con Sac I y Hind lll y el gen bxn quimérico de 1.5 kb con señales de expresión de plástido se insertó en los sitios Sac I y Hind lll del vector de homología a plástido de tabaco pOVZ44B (Zoubenko, eí al., 1994, Nuc. Acids Res 22:3819-3824 (1994)) para crear el plásmido pCGN5175. Para construir el plásmido pCGN6114, el plásmido pBrx90 (un plásmido Bluescript que contenía al gen bxn que codifica para la nitrilasa específica para bromoxinilo) fue digerido con Neo \/Asc I y el gen estructural bxn se sustituyó por el gen GUS en el plásmido pCGN5063 digerido con Nco/Asc dando como resultado el plásmido pCGN6107. Este plásmido contiene al gen bxn bajo el control del promotor T7/líder de gen 10 en el extremo 5' y el terminador transcripcional híbrido psbAÍT7 en el extremo 3' del gen quimérico. Este promotor T7/gen quimérico bxn fue extirpado de pCGN6107 como un segmento de ADN de Hind lll/?/oí I y se movió en el plásmido cloromfenical BCSK+ (Stratagene) en los sitios Hind lll/?/oí para crear el plásmido pCGN6109. El gen quimérico se movió después como un fragmento Hind lll/?/oí de ?CGN6109 en el vector de homología a cloroplasto pOVZ44B descrito arriba para crear el plásmido pCGN6114. Plantas de tabaco transformadas con pCGN6114 requieren que la ARN polimerasa de T7 sea provista en el fondo del plástido de la planta para activar la transcripción del gen bxn quimérico por medio del promotor T7. Este sistema se ha detallado previamente en McBride eí al., PNAS 91 :7301-7305 (1994) y McBride et al., patente de E.U.A. No. 5,576,198. 1 D. Construcciones de expresión de plástido BXN/AHAS Se preparó una construcción de expresión de plástido, pCGN5026, para dirigir la expresión de BXN y AHAS desde el plástido de la planta. La secuencia de nucleótidos AHAS (descrita en la publicación europea No. 0 525 384 A2, cuya totalidad se incorpora en la presente a manera de referencia) se une traduccionalmente a la secuencia de nucleótidos de BXN (patente de E.U.A. No. 4,810,648, cuya totalidad se incorpora en la presente a manera de referencia). El gen estructural AHAS que codifica para acetohidroxiácido sintasa se clonó a partir del plásmido pCGN4277 como un fragmento de ADN de Neo I a Age en los sitios ?/co/Xma del piásmido pUC120 para crear el plásmido pCGN5022. Este plásmido se digirió después con las enzimas BamH I y Pst y un segmento de ADN Bam/Pst de 1.3 Kb que contenía al gen bxn que codifica para la nitrilasa específica para bromoxinilo se extirpó del plásmido pBrx26 y se clonó en los sitios Bam/Pst de pCGN5022 para crear el plásmido pCGN5023. El plásmido pCGN5023 contenía un segmento de ADN de 3.3 Jb que contenía el segmento del operón AHAS/bxn y este fragmento. Este plásmido se cortó en el sitio Pst único y este sitio Pst fue removido y reemplazado con un enlazador sintético que contenía un sitio de restricción Xba I único generando el plásmido pCGN5024. El plásmido pCGN5024 fue digerido con Nco/Xba y el fragmento de ADN Nco/Xba de 3.3 Kb fue clonado en el vector de cassette de promotor de plástido pLAA21 (Pst) que había sido digerido con Neo y Xba para remover al gen GUS. El plásmido que resulta de esta clonación fue designado plásmido pCGN5025 y contenía al operón de herbicida bajo el control del promotor de plástido Prrp y el segmento de ADN 3' rpsL. El operón de herbicida quimérico completo bajo el control de los elementos de expresión de plástido fue extirpado de pCGN5025 como un fragmento de ADN Sac UPst y clonado en los sitios Sac/Pst del vector de cassette de homología a plástido pOVZ44B (Zoubenko eí al., Nuc. Acids Res 22:3819-3824 (1994)) para facilitar la transferencia en el genoma del cloroplasto de tabaco. 1 E. Construcción de expresión de plástido Bt c y1Ac y bxn El plásmido pBrx9 (Stalker y McBride, (1987) J. Bacteriol 169:955-960), un clon original de Klebsiella que contenía un segmento de ADN de gen bxn, se usó como un molde para generar un fragmento de ADN de PCR BamH MCIa I de -450 pb que abarca el extremo N-terminal del gen bxn e incluye 44 pb de la porción no traducida 5' del gen nativo. Este fragmento fue intercambiado con el fragmento Bam/Cla de -400 pb en el plásmido pBrx90 dando como resultado el plásmido pBrx90J . Este plásmido contiene al gen bxn completo y ai segmento de ADN 5' no traducido de 44 pb. El gen bxn fue extirpado del plásmido pBrx90J como un segmento de ADN Bam/Asc I e insertado en el plásmido pCGN5146 en los sitios Bgl /Ase I para generar el plásmido pCGN5191. El plásmido pCGN5146 es un derivado pKK233-2 (Pharmacia) que contiene al gen crylAc de longitud completa que codifica para la protoxina HD-73 Bt. El plásmido pCGN5191 contiene entonces a los genes c ylAc y bxn en una configuración de operón con el gen bxn siendo el gen distante en el operón. Ambos genes se encuentran bajo el control del promotor Píac para la expresión de E coli en 5191. El plásmido pCGN5191 fue digerido con Nco/Asc y el fragmento de ADN Ncol Ase que contiene al operón BUbxn se clonó en los sitios Nco/Asc del vector de homología a cloroplasto pCGN5155, un derivado de pOVZ44B. El plásmido resultante, pCGN5197, contiene al operón B /bxn bajo el control del promotor de plástido Prrp y las regiones terminadoras de transcripción rpsL. Este plásmido facilitó la transferencia del operón quimérico B /bxn en el genoma del plástido de tabaco. 1F. Construcciones de expresión de plástido de fitoeno desaturasa El gen crt\ se obtuvo como un fragmento de PCR Hind lll/Sa/ I del plásmido original que contenía al operón de Erwina carotova crt (Misawa eí al., (1994) Plant Jour 6:481-489)) y se clonó como un segmento de ADN Hind lll/Sa/ 1 en BCSK+ (Stratagene) en los sitios Hind lll/Sa/ 1 para generar el plásmido pCGN5172. El fragmento crtl se clonó de pCGN5172 como un fragmento Neo l/Sal I en pCGN5038 (un derivado de pOVZ44B) para crear la construcción de expresión de plástido pCGN5177. Esta construcción dirige la expresión de la secuencia crtl del promotor Prrn y la secuencia terminadora pJs16. Este plásmido facilitó la transferencia del gen críl quimérico en el genoma del plástido de tabaco. 1G. Construcciones de expresión hGH para la transformación de plantas Construcciones de expresión nuclear La construcción pWRG4747 se construyó para dirigir la expresión de hGH en el genoma nuclear de la planta. Este vector contiene al hGH unido operablemente al promotor del Virus de Mosaico de la Escrofularia (USPN 5,378,619, cuya totalidad se incorpora en la presente a manera de referencia) y al líder CTP2 para dirigir la proteína hGH en el plástido. El fragmento FMV/CTP2L::hGH::NpA se clona junto con ia secuencia de ADN, confieriendo resistencia a kanamicina entre los bordes derecho e izquierdo (RB y LB) del ADN de transferencia (ADNt) de Agrobacterium tumefaciens para dirigir la integración en el genoma nuclear. El vector de transformación nuclear pWRG4744 contiene esencialmente los mismos elementos que pWRG4747, excepto que la construcción carece del líder CTP2 y la proteína hGH es dirigida al citoplasma de la célula vegetal.

Construcciones de expresión de plástido El vector de expresión de plástido pWRG4838 se construyó usando el gen de hGH de longitud completa expresado de la región promotora del gen psbA y el terminador del gen psbA, PpsbA y TspbA respectivamente (descritos en Staub et al., (1993), arriba). Esta fusión de promotor quimérico-gen-terminador (PpsbA::hGH: :TpsbA) se clona adyacente al gen de marcador seleccionable aadA también conducido por los elementos de expresión de plástido del gen psbA. Las dos secuencias de gen quimérico se clonan en un vector entre dos secuencias que dirigen la integración de las secuencias de gen quimérico en el genoma del plástido de tabaco hacia el extremo 5' del ADN16Srde plástido. Este se une a un gen de resistencia a ampicilina de 1 kb que provee la selección de E coli que contiene la construcción y el origen de replicación pUC para el mantenimiento del plásmido en E coli.

La construcción de expresión de plástido pMON38755 se preparó usando la secuencia de ADN de hGH fusionada traduccionalmente en el término N con el gen de ubiquitina de levadura, creando el gen de fusión Ubi-hGH. El gen de fusión Ubi-hGH se clona junto al gen aadA para la selección de tabaco transplastómico en medios que contienen espectinomicina o estreptomicina (de pPRV112B descrito en Zoubenko eí al., 1994, arriba). Se incluyen secuencias para la recombinación homologa de secuencias que codifican para hGH y expresión de aadA. Estas secuencias se obtienen del vector pPRV112B descrito en Zoubenko eí al. (1994, arriba). Este se une a un gen de resistencia a ampicilina de 1 kb que provee la selección de E coli que contiene la construcción y el origen de aplicación pUC para el mantenimiento del plásmido en E coli. La construcción de expresión de plástido pMON38794 contiene esencialmente los mismos elementos que pMON38755, con la siguiente excepción. La secuencia de promotor psbA de 0J5 kb es reemplazada con la secuencia de promotor Prrp/G10L descrita arriba. 1 H. Construcciones para la expresión de aprotinina en plástidos Se preparó una serie de construcciones para dirigir la expresión de la proteína farmacéutica aprotinina desde el plástido. La secuencia de ácido nucleico que codifica para aprotinina (figura 2) se clonó en una construcción de expresión de plástido para controlar la expresión de aprotinina del gen T7 de promotor líder 10 que se induce desde una T7 polimerasa dirigida a plástido y expresada nuclearmente. Las construcciones usadas en las cuales se clonó la secuencia de aprotinina son como las descritas en la patente de E.U.A. No. 5,576,198, cuya totalidad se incorpora en la presente a manera de referencia. El vector de transformación de plástido pCGN6146 es diseñado reemplazando la secuencia de ADN que codifica para GUS de pCGN4276 (descrita en USPN 5,576,198) con la secuencia de codificación de aprotinina. La construcción de transformación de plástido de tabaco pCGN6147 contiene los mismos elementos que pCGN6146, excepto que pCGN6147 contiene los seis aminoácidos 5' de la secuencia de codificación GUS ligada al termino 5' de la secuencia de codificación de aprotinina. Los seis aminoácidos del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos de GUS se incluyen para ayudar a la traducción de la proteína aprotinina. El vector de transformación de plástido de tabaco pCGN6156 es esencialmente el mismo que pCGN4276, excepto que la región de codificación de aprotinina es clonada hacia el extremo 3' de la secuencia de codificación de GUS. De esta manera, pCGN6156 contiene como unida operablemente al promotor T7, una secuencia de ADN que codifica para GUS fusionada con la secuencia de ADN que codifica para aprotinina y la secuencia de terminación de transcripción psbA 3'. Se construyó una construcción de expresión de plástido, pCGN6154, a partir de pCGN4276 reemplazando la secuencia de codificación de GUS con la proteína aprotinina unida operablemente al extremo 3' de la secuencia de codificación de citocroma / (petA) del cloroplasto de tabaco. De esta manera, pCGN6154 contiene la secuencia promotora T7 unida operablemente a la secuencia de nucleótidos de petA y aprotinina. La secuencia de petA se incluye para dirigir la proteína aprotinina expresada hacia el tilacoide.

EJEMPLO 2 Transformación de plantas 2A. Transformación Nuclear Plantas de tabaco transformadas para expresar las construcciones pWRG4744 y pWRG4747 en el núcleo de una célula vegetal pueden obtenerse como se describe por Horsch eí al. (Science (1985) 227:1229-1232). 2B. Transformación de plástidos Se transforman plástidos de tabaco mediante el suministro por pistola de partículas de microproyectiles como se describe por Svab y Maliga (Proc. Nati. Acad. Sci. (1993) 90:913-917), y se describe en la presente. Se cortan hojas redondas verde oscuro, de preferencia de la parte de en medio de los brotes, de habanos Nicotiana tabacum cv. de 3 a 6 semanas de edad que habían sido mantenidos in vitro sobre medio MS libre de hormonas (Murashige y Skoog, (1962) Physiol Plant, 15, 473-497) complementado con vitaminas B5 en bandejas Phytatray o copas con un fotoperiodo de 16 horas a 24°C. Cada hoja cortada se coloca después con el lado adaxial hacia arriba en papel filtro estéril sobre medio de regeneración de brotes de tabaco (medio TSO: sales de MS, 1 mg/l de N6-benciladenina, OJ mg/l de ácido 1-naftalenacético, 1 mg/l de tiamina, 100 mg/l de inositol, 7 g/l de agar, pH 5.8, y 30 g/l de sacarosa). Las hojas se colocan de preferencia en el centro de la placa haciendo el mayor contacto posible con el medio. Las placas se preparan de preferencia inmediatamente antes de usar, pero pueden preparase hasta un día antes de su transformación por bombardeo de partículas envolviéndolas en bolsas de plástico y almacenándolas a 24°C durante la noche. Se esterilizan partículas de tungsteno u oro para usarse como microvehículos en experimentos de bombardeo. Las partículas (50 mg) se esterilizan con 1 ml de etanol al 100% y se almacenan a -20°C o 80°C. Justo antes de usar, las partículas se sedimentan mediante centrifugación, se lavan con 2 a 3 lavados de 1 ml de agua destilada desionizada estéril; se someten a acción de remolino y se centrifugan entre cada lavado. Las partículas lavadas se resuspenden en 500 µl de glicerol al 50%. Las partículas esterilizadas se recubren con ADN para su transformación. Se añaden alícuotas de veinticinco microlitros de partículas esterilizadas a un tubo microcentrífugo de 1.5 ml, y 5 µg de ADN de interés se añaden y se mezclan mediante inclinación. Se añaden treinta y cinco microlitros de una solución recién preparada de CaCI2 1.8 M y 30 mM de espermidína a la mezcla de partículas/ADN, se mezcla suavemente y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las partículas recubiertas se sedimentan mediante centrifugación breve. Las partículas se lavan dos veces añadiendo 200 µl de etanol al 70%, mezclando suavemente y centrifugando brevemente. Las partículas cubiertas se resuspenden en 50 µl de etanol al 100% y se mezclan suavemente. Se usan cinco a diez microlitros de partículas recubiertas para cada bombardeo. La transformación mediante bombardeo con partículas se lleva a cabo usando la pistola de helio PDS 1000 (Bio. Rad. Richmond, CA), usando un protocolo modificado descrito por el fabricante. Las placas que contienen las muestras de hoja se colocan sobre la segunda bandeja desde el fondo de la cámara de vacío y se bombardean usando el disco de ruptura de 77.33 kg/cm2. Después del bombardeo, las cajas de Petri que contienen las muestras de hoja se envuelven en bolsas de plástico y se incuban a 24°C durante 48 horas. Después de la incubación, las hojas bombardeadas se cortan en pedazos de aproximadamente 0.5 cm2 y se colocan con el lado abaxial hacia arriba sobre medio TSO complementado con 500 µg/ml de espectinomicina. Después de 3 a 4 semanas en el medio de selección, aparecerán brotes verdes y pequeños resistentes a espectinomicina sobre el tejido de la hoja. Esos brotes continuarán creciendo sobre el medio que contiene espectinomicina y se refieren como transformantes putativos primarios. Cuando los transformantes putativos primarios han desarrollado 2 a 3 hojas, dos pedazos pequeños (aproximadamente 0.5 cm2) se cortan de cada hoja y se usan ya sea para la selección o para una segunda ronda de regeneración de brotes. Un pedazo se coloca con el lado abaxial hacia arriba sobre placas que contienen medio TSO complementado con 500 µg/ml de espectinomicina, y el otro pedazo se coloca con el lado abaxial hacia arriba sobre medio TSO complementado con 500 µg/ml cada uno de espectinomicina y estreptomicina. Los transformantes positivos se identifican como los brotes que forman callos verdes sobre el medio TSO que contiene espectinomicina y estreptomicina. Después de 3 a 4 semanas, el tejido colocado sobre medio TSO que contiene sólo espectinomicina, el cual ha sido identificado como positivo en el medio TSO con espectinomicina y estreptomicina, desarrollará brotes verdes. Dos a cuatro brotes de cada transformante positivo se seleccionan y transfieren al medio TSO complementado con 500 µg/ml de espectinomicina para la generación de brotes. Se lleva a cabo análisis Southern en dos brotes para confirmar la homoplasmia como se describe abajo. Los brotes de eventos homoplásmicos se transfieren al invernadero para la producción de semillas, mientras que los transformantes que no son homoplásmicos se envían a través de una segunda ronda o regeneración sobre medio TSO con 500 µg/ml de espectinomicina para lograr la homoplasmia.

EJEMPLO 3 Análisis de plantas de tabaco transplastómicas transformadas con construcciones con tolerancia a herbicida 3.A Análisis Southern Plantas transformadas seleccionadas para la expresión del gen marcador aadA se analizan para determinar si el contenido de plástido completo de la planta ha sido transformado (transformantes homoplásticos). Típicamente, después de dos rondas de formación de brotes y selección de espectinomicina, aproximadamente 50% de las plántulas transgénicas que se analizan son homoplásticas, como se determina mediante el análisis por transferencia de Southern del ADN del plástido. Las plántulas homoplásmicas se seleccionan para cultivo adicional. Se aisla ADN genómico de plantas de tabaco transformadas, se somete a electroforesis y se transfiere a filtros como se describe en Svab eí al., ((1993), Proc Nati Acad Sci., 90:913-917). Se identificaron plantas de tabaco homoplásmicas transformadas para expresar CP4 EPSPS en plástidos usando una sonda preparada a partir de un fragmento EcoRI/EcoRV de 2.4 kb del vector pOVZ2 (similar a pOVZ15 descrito en Zoubenko eí al., 1994, arriba). El fragmento de sonda de 2.4 kb abarca parte de la secuencia de dirección. Los resultados de las hibridaciones de Southern identificaron 3 líneas homoplásmicas de tabaco transformado con las construcciones pMON30123 y pMON30130 y 1 línea de tabaco transformado con pMON38773 para análisis adicional. La desaparición completa del fragmento SamHI de tabaco nativo de 3.27 Kb en las líneas 30123-19-1A, 30123-23-2A, 30123-18-1 B, 30130-51-2A, 30130-51-2P, 30130-57-1 P y 38773-6 con una sonda que cubre la región de integración, y la aparición de bandas de tamaño esperado para los fragmentos de ADN insertados en esos transformantes, 5J4 kb y 0.9 kb, establece que las plantas transformadas son homoplásmicas para las construcciones deseadas. Los resultados de las hibridaciones Southern identificaron 3 líneas homoplásmicas de tabaco transformado con pCGN5177, líneas 74-1 B- P, 74-2 y 74-7. Se analizaron líneas de tabaco 5175 y 6114 transplastómicas mediante hibridación Southern para homoplasmia como se describió arriba. Los resultados de las hibridaciones Southern identificaron 4 líneas homoplásmicas de tabaco transformado con pCGN6114. Los resultados de las hibridaciones de 5175 líneas de tabaco transpiastómicas identificaron una línea, 76-4A-F, como homoplásmicas, y una segunda línea como 95% homoplásmica. Las plantas de tabaco homoplásmicas transformadas para expresar BXN/AHAS en plástidos fueron identificados usando hibridaciones Southern como se describió arriba.

Los resultados de las hibridaciones Southern identificaron 14 líneas homoplásmicas de tabaco transformado con pCGN5026. Los filtros fueron sondeados otra vez con un fragmento de gen BXN, y se encontró que 21 líneas contenían BXN, 14 líneas de las cuales eran homoplásmicas. 3B. Análisis Northern Para determinar el nivel de transcripción del ARNm de EPSPS, BXN o AHAS expresado en las plantas de tabaco transplastómicas, se llevaron a cabo hibridaciones por transferencia Northern con ARN total aislado de cada una de las líneas identificadas. Se aisló ARN total usando reactivo TRIzol (Gibco-BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se separó ARN total, 2 µg, en un gel de agarosa de desnaturalización y se transfirió a una membrana de nylon (Maniatis eí al., 1989, arriba). Se prepararon sondas radioactivas para las hibridaciones usando fragmentos de CP4 EPSPS, fitoeno desaturasa, BXN o AHAS (usando equipo de marcado Random Primer de Boehringer Mannheim) y las hibridaciones se llevaron a cabo en 2 x SSPE (Maniatis eí al., 1989, arriba), a 60°C. Los filtros fueron vaporizados y vueltos a sondear con una sonda génica de ARN ribosómica 16S de plástido (de pPRV112A, Zoubenko eí al., 1994, arriba) para confirmar la carga homogénea de ARN en el filtro. Los resultados de las hibridaciones Northern llevadas a cabo con sondas EPSPS demuestran que todas las siete (7) líneas examinadas expresan ARNm de CP4 EPSPS. Las hibridaciones llevadas a cabo con la sonda de ribosoma 16S confirman que los geles de desnaturalización fueron cargados con cantidades similares de ARN total para cada muestra. Además, líneas de tabaco transplastómicas que expresaban EPSPS de los elementos reguladores de Prrp/rbcL(RBS) (pMON30123) expresan ARNm de EPSPS a niveles más altos que plantas de tabaco homoplásmicas para EPSPS controladas por las secuencias promotora/RBS de'Prrp/G10L (pMON38773). Los resultados de las hibridaciones Northern llevadas a cabo con sondas BXN, AHAS y críl demuestran que todas las líneas de tabaco homoplásmicas 5026, 5175 y 5177 expresaron ARNm de c/tl, BXN y/o AHAS. 3C. Análisis por transferencia de Western de CP4 EPSPS de tabaco Para determinar la expresión del EPSPS, se llevaron a cabo análisis por transferencia de Western en una sola línea de cada construcción, pMON30123, pMON30130 y pMON38773. Se extrajo proteína soluble total de tejido foliar congelado pulverizando 250 mg de tejido en 250 µl de regulador de pH de PBS (1 mM de KH2PO4, Na2HPO4, NaCI 0.137M, 2.7 mM de KCl, pH 7.0) que contenía inhibidores de proteasa. El homogenato se centrifuga durante 5 minutos, y el sobrenadante se transfiere a un tubo fresco. Se determina la concentración de la proteína en el sobrenadante usando una prueba de concentración de proteína (BioRad, Richmond, CA).

La proteína extraída total se somete a electroforesis en un gel SDS-PAGE al 4-20% (Sigma, San Luís, MO), y se transfiere a una membrana de PVDF en 1x regulador de pH de SDS-PAGE (Maniatis eí al., 1989, Cold Spring Harbor Press). Se usaron estándares de proteína CP4 EPSPS purificada y cuantificada para cuantificar la expresión de la CP4 EPSPS según se expresó en el plástido de planta. Las hibridaciones Western se llevan a cabo como se describe en Staub y Maliga (1993) EMBO Journal, 12(2) 601-606, excepto que se usaron anticuerpos expuestos a EPSPS. Las membranas de PVDF que contenían la proteína sometidas a electroforesis transferidas fueron incubadas en una solución de bloqueo de regulador de pH PBS que contenía 0.05% de Tween-10 (PBS-T) y 5% de leche durante la noche a 4°C. Las membranas se incuban después en una solución de PBS-T que contiene 1 % de leche y un anticuerpo primario generado en cabras a la CP4 EPSPS durante 2 horas a temperatura ambiente. Las membranas se lavan tres veces en una solución de PBS-T que contiene 0.1 % de leche, cada lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se incuban después en una solución de PBS-T que contiene 1% de leche y anticuerpo anti-cabra de borrego durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lavan de nuevo en PBS-T que contiene 0.1 % de leche, tres veces durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se lleva a cabo un lavado final usando sólo PBS-T antes de revelar las membranas usando un equipo de detección no radiactivo (ECL, Amersham).

CUADRO 2 Los resultados listados en el cuadro 2 demuestran que pueden obtenerse incrementos significativos en el nivel de proteína EPSPS de plantas transformadas para expresar EPSPS del promotor Prrp/G10L. Estos resultados demuestran que la expresión de EPSPS conducida por las secuencias reguladoras Prrp/rbcLRBS pueden producir aproximadamente 0.001 % de la proteína soluble total como EPSPS, mientras que en plantas que expresaban EPSPS de las secuencias reguladoras de Prrp/G10L expresan 0.2% de la proteína soluble total como EPSPS. Las líneas subsecuentes han demostrado proteína soluble total de aproximadamente 1 % de EPSPS cuando son expresadas desde las secuencias reguladoras de Prrp/G10L. Estos resultados, tomados junto con los resultados de las hibridaciones Northern arriba, indican que puede obtenerse una traducción más eficiente del sitio de unión a ribosoma G10L. Además, las construcciones de expresión de plástido que contienen al aminoácido 14 de la terminal N de GFP demostraron altos niveles de expresión de proteína. Líneas transplastómicas que contenían pMON45259 ó pMÓN49218 demostraron proteína soluble total de más de 12% de CP4 EPSPS. También se llevó a cabo hibridación por inmunotransferencia de Western en 2 líneas de tabaco 5026 homoplásmicas como las descritas arriba, usando anticuerpos generados contra bromoxinilo. Los resultados del análisis por inmunotransferencia de Western de proteína soluble total extraída de líneas de tabaco transformadas con pCGN5026 demostraron que ambas líneas homoplásmicas produjeron proteína nitrilasa. El análisis por inmunotransferencia de Western se llevó a cabo como se describió arriba a partir de proteína total extraída de líneas de tabaco transformadas con pCGN6114 y pCGN5197. Los resultados del análisis demostraron que se produjo bromoxinilo en líneas de tabaco 6114 que variaban de 1 % a 2% de la proteína de hoja soluble total. Los resultados del análisis Western de las 20 líneas de tabaco 5197 demostraron que se produjeron bromoxinilo y Bt como 1 % de la proteína de hoja soluble total. 3D. Análisis de actividad de enzima EPSPS Se determinó la actividad de la enzima EPSPS en plantas de tabaco transplastómicas que contenían al vector de expresión de plástido pMON38773 usando una prueba de cromatografía de líquidos de alta presión (CLAP). Los métodos para el análisis de la actividad de la enzima EPSPS se describen en Padgette eí al., (J. Biol. Chem. (1988)263:1798-1802 y Arch. Biochem. Biophys. (1987) 258:564-573) y Wibbenmeyer eí al., (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1988) 153:760-766). Los resultados se resumen en el siguiente cuadro 3.

CUADRO 3 Estos resultados demuestran que la expresión de EPSPS en plástidos produce enzima EPSPS activa. 3E. Análisis para tolerancia a qlifosato Una línea de tabaco transplastómica homoplásmica para la construcción pMON38773 fue probada in vitro para determinar el nivel más alto de tolerancia a glifosato. Se preparó tejido de explante de pedazos de hoja de plantas Havanna de tabaco de control tipo silvestre no transgénicas y la línea de tabaco homoplásmíca 38773-6 y se cultivaron para la regeneración de brotes en medio TSO (descrito arriba) complementado con niveles de glifosato de 50 µM, 75 µM, 100 µM, 150 µM y 200 µM. Los resultados se resumen en el cuadro 4 abajo. Se determinó el número de explantes que producían brotes tres semanas y seis semanas después de la preparación del expíante y cultivando sobre medio que contenía glifosato. CUADRO 4 Los resultados anteriores demuestran que a todos los niveles de glifosato examinados, se regeneraron brotes de explantes preparados de una línea de tabaco homoplásmica para pMON38773, mientras que no se regeneraron brotes de explantes preparados de plantas de control no transformadas. Estos resultados sugieren que las plantas de tabaco que expresan EPSPS en plástidos demuestran tolerancia a niveles de glifosato de por lo menos 200 µM. Líneas transplastómicas adicionales fueron probadas in vitro para tolerancia a glifosato como se describió arriba. Los resultados se muestran en el cuadro 5.

CUADRO 5 Resumen de experimentos de transformación de plástido de tabaco con varias construcciones que contienen genes de EPSPS Estos resultados demuestran que estas líneas transpiastómicas muestran tolerancia a glifosato. Los números en paréntesis son el número de brotes resistentes a selección a 1 mM de glifosato. De esta manera, como puede observarse en el cuadro 5, se generan líneas de tabaco que son tolerantes de selección a 1 mM de glifosato. Plantas de tabaco homoplásmicas de la línea 38773-6 son asperjadas con glifosato usando un aspersor de rastreo a concentraciones que corresponden a 0 g/hectárea, 453.6 g/hectárea, 907.2 g/hectárea y 1814.37 g/hectárea para probar la tolerancia de planta completa. Los datos de lesión vegetativa se recabaron dos semanas después de la aspersión, mientras que los datos de lesión reproductiva se recabaron en la madurez de la planta. Los resultados iniciales indican que las líneas de tabaco homoplásmicas asperjadas son tolerantes a glifosato a la concentración de 453.6 g/hectárea como se demostró en la lesión de tejido vegetativo (cuadro 6). Como puede observarse en el cuadro 5, se generaron líneas transplastómicas que demostraron un nivel adecuado de tolerancia a glifosato a 907.2 g/hectárea. En experimentos subsecuentes con líneas transformadas adicionales, las líneas transplastómicas han mostrado tolerancia a glifosato a un nivel de 1814.37 g/hectárea. La tolerancia se caracteriza por el crecimiento y verdeo continuos de tejidos asperjados con glifosato. Sin embargo, al incrementar la concentración de glifosato aplicada, hubo un incremento correspondiente en el nivel de lesión vegetativa. En cshtraste, las plantas de control no transformadas fueron altamente susceptibles a concentraciones de glifosato tan bajas como 453.6 g/hectárea.

CUADRO 6 Lesiones vegetativas: 0 = planta normal 1 = clorosis ligera de hojas nuevas y empequeñecimiento 2 = clorosis severa de hojas nuevas, malformación de hojas nuevas y empequeñecimiento severo 3 = planta muriéndose 4 = planta muerta índices de fertilidad: 0 = fértil, sin retraso en madurez, demasiada semilla 1 = cierto aborto, retraso ligero en aparición de semilla, semilla 2 = aborto significativo, retraso significativo en aparición de semilla, algunas semillas 3 = aborto muy severo, semillas inmaduras, pocas semillas 4 = flores mal formadas; si floreció, retraso extremo en el florecimiento y no se produjeron semillas 5 = planta muerta Además, se analizaron otras líneas transplastómicas para tolerancia a aspersión con varios niveles de glifosato como se describió arriba. La actividad específica se mide como la cantidad de piruvato de fosfoenol (PEP) añadido exógenamente convertido en shikimato-3-fosfato (S3P) por proteína unitaria en el extracto de planta. La adición de glifosato prueba la sensibilidad de la enzima EPSPS a glifosato. Los resultados se resumen en el cuadro 7.

CUADRO 7 Estos datos demuestran que niveles altos de tolerancia a glifosato pueden obtenerse en plantas transplastómicas que expresan varias secuencias de EPSPS. En particular, las líneas pMON45204, pMON45259 y pMON49218 proveen tolerancia a glifosato aplicado a niveles de por lo menos 3628 g/0.405 ht sobre tejidos vegetativos, y por lo menos 1814 g/0.405 ht en tejidos reproductivos. Además, las construcciones pMON42259 y pMON49218 proveen expresión de alto nivel de CP4 EPSPS de plástidos de plantas transformados con estas construcciones. En particular, se obtienen niveles de expresión de más de aproximadamente 12 por ciento de proteína soluble total en construcciones que emplean secuencias que codifican para los primeros 14 aminoácidos de GFP fusionados al término N de CP4. 3F. Análisis de BT/BXN Plantas de tabaco homoplásmicas de las líneas 5175 y 5197 son asperjadas con herbicida Buctril a una concentración de 4% para probar tolerancia de planta completa. Los resultados de la prueba de aspersión con Buctril demostraron que todas las líneas 5197 que expresan bxn eran completamente resistentes cuando se asperjaron con una solución que contenía 4% de herbicida Buctril. Dos líneas de seis líneas 5175 fueron completamente resistentes al herbicida cuando fueron asperjadas con una solución al 4% que contenía Buctril. 3G. Análisis de resistencia a Norflurazon Se estableció un experimento para determinar la eficacia de la característica Crt I con respecto a la resistencia al herbicida Norflurazon. Tres líneas transformadas 5177, 74-1 B-P. 74-2-A y 74-7-C y tres líneas de control fueron plantadas. Las plantas se cultivaron durante siete semanas y después se regaron con una solución 3 µM de Norflurazon. Las plantas negativas para la presencia del gen de plástido críl fueron blanqueados mediante tratamiento con Norflurazon, las plantas positivas permanecieron verdes y continuaron creciendo. Los resultados muestran que las tres líneas de tabaco 5177 homoplásmicas fueron resistentes a la solución 3 µM de Norflurazon, mientras que las plantas de control fueron todas susceptibles a la solución (cuadro 8).

CUADRO 8 EJEMPLO 4 Análisis de plantas de tabaco trans énicas hGH 4A. Análisis Southern Plantas transformadas seleccionadas para la expresión del gen marcador aadA se analizan para determinar si el contenido completo de plástido de la planta ha sido transformado (transformantes homoplásticos). Se seleccionan plantas homolásmicas usando hibridación Southern para cultivo adicional. Se aisla ADN genómico de plantas de tabaco transformadas, se somete a eiectroforesis y se transfiere a filtros como se describe en Svab eí al., ((1993), Proc Nati Acad Sci., 90:913-917). Se identificaron plantas de tabaco homoplásmicas transformadas para expresar hGH usando una sonda preparada a partir de un fragmento EcoRI/EcoRV de 2.4 kb del vector pOVZ2 (similar a pOVZ15 descrito en Zoubenko eí al., 1994, arriba). El fragmento de sonda de 2.4 kb abarca parte de la secuencia de dirección. La desaparición completa del fragmento SamHI de tabaco nativo de 3.27 Kb en las líneas con una sonda que cubre la región de integración, y la aparición de la banda de tamaño esperado para los fragmentos de ADN en esos transformantes, 5.6 kb, establece que las plantas transformadas son homoplásmicas para las construcciones deseadas. 4B. Análisis de expresión de proteína Se usan líneas de tabaco homopiásmicas que expresan hGH y transformantes de tabaco nucleares para determinar la expresión de la proteína hGH. Se llevó a cabo el análisis por transferencia de Western en líneas de tabaco que contenían construcciones pWRG4838, pMON38755 y pMON38794 para la expresión de plástido y se usó una prueba ELISA para líneas de tabaco transgénicas que contenían pWGR4744 y pWRG4747 para la expresión nuclear de hGH. Se llevaron a cabo extracciones de proteína total y procedimientos de transferencia de Western como se describió arriba, con la excepción de que el anticuerpo primario se creó contra hGH.

CUADRO 9 Niveles de expresión de hGH en qenoma nuclear de tabaco y genoma de plástido Los resultados del análisis Western (cuadro 9) demuestran que hGH expresada en plástidos de células vegetales se acumula a niveles significativamente más elevados que la hGH expresada en el núcleo y dirigida al citoplasma o plástido de células vegetales. Las plantas de tabaco transformadas para expresar hGH en el núcleo acumularon niveles de hGH de 0.002% (dirigida a citoplasma) a 0.025% (dirigida a plástido) de proteína foliar soluble total, al mismo tiempo que las plantas de tabaco que expresaban hGH en el plástido acumularon niveles de hGH de 0.2% a 7.0% de proteína foliar soluble total como hGH. Además, las plantas de tabaco homoplásmicas que expresaban hGH dirigida de las secuencias reguladoras Prrp/G10L acumularon niveles 35 veces más elevados de hGH que las plantas de tabaco homoplásmicas que expresaban hGH dirigida a partir de la secuencia del promotor PpsbA. 4C. Caracterización de proteína hGH expresada en el plástido Para poder determinar si la hGH expresada a partir de plástidos estaba apropiadamente procesada, se llevaron a cabo experimentos para determinar plegamiento y bioactividad correctos. Dos hojas inferiores de líneas de tabaco transplastómicas que contenían pMON38794 se utilizaron para extraer y purificar hGH. Grandes nervaduras se removieron de hojas cortadas, y el tejido foliar se cortó en pequeñas secciones (aproximadamente 0.5 cm2). Los pedazos de hoja se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se molieron hasta lograr un polvo fino en un mortero y pestillo enfriado. Diez gramos de tejido foliar molido y congelado se agregaron a una solución base de 100 mM Tris enfriada con hielo (30 ml) y se mezcló vigorosamente por acción de remolino durante 5 minutos. La solución se filtró a través de una sola capa de gasa.

Se prepararon tres muestras por separado a partir de la solución filtrada. La primera muestra se preparó centrifugando 4 ml del material filtrado durante 1 minuto a 16,000 r.p.m. El material centrifugado se prorrateó en frascos de 1 ml y se congeló en hielo seco. El material filtrado restante se centrifugó durante 10 minutos a 4800 r.p.m., y varias alícuotas de 0.5 ml se congelaron como antes para la segunda muestra. Al material filtrado restante (aproximadamente 25 ml), se le añadió 200 µl de ácido acético glacial para reducir el pH de 8.2 a 4.56. La solución se centrifugó a 4800 r.p.m. durante 30 minutos, y el sobrenadante se congeló sobre hielo seco para la tercera muestra. La proteína soluble total (PST, cuadro 10) se calculó en estas muestras mediante procedimientos de prueba de proteína estándares (Maniatis eí al.), y el porcentaje de pureza de hGH se calculó con base en los resultados del análisis por transferencia de Western utilizando concentraciones conocidas de material de partida.

CUADRO 10 El extracto con pH ajustado y centrifugado se purificó por CLAR de Fase Inversa (RP-CLAR) para espectrometría de masa por electroaspersión y secuenciación de aminoácidos amino-terminal. La RP-CLAR se llevó a cabo utilizando una bomba Perkin-Elmer serie 200 y un automuestreador y una columna de RP-CLAR Vydac C8 (250 por 4.6 mm). 750 microlitros de la muestra se cargaron en la columna equilibrada con 20 mM de ácido trifluoroacético (TFA) y acetonitrilo al 50%. Después de la carga, la columna se lavó durante 2 minutos con acetonitrilo al 50%, 20 mM de TFA seguido de una gradiente de acetonitrilo lineal al 2% durante 10 minutos, seguido de un gradiente de acetonitrilo al 10% durante 1 minuto. La velocidad de fluido fue una constante de 1.5 ml/minuto con el eluato de columna visualizando a 278 nm con un detector Perkin-Elmer 785. Los datos se recolectaron y analizaron con un sistema de datos PE-Nelson Turbochrom. Los resultados del análisis de RP-CLAR se muestran en la figura 3. El pico I (pico más alto) tiene el tiempo de retención esperado para GP2000 de 22 kDa nativa, apropiadamente plegada. Este pico se recolectó y se secó en un Savant Speed-Vac para secuenciación amino-terminal y espectrometría de masa por electroaspersión. El análisis de espectrometría de masa de ionización por electroaspersión (MS) utilizó un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo de electroaspersión Micromass Q-Tof. Las muestras se prepararon mediante resuspensión en metanol al 50% + ácido acético al 2%, y se infundieron en la fuente del espectrómetro de masa a una velocidad de 4 mL/min. Los datos sin procesar mostrados en la figura 4 presentan una serie de ¡ones correspondientes a la especie(s) presente en la muestra con números variantes de protones unidos. Los ejes de este espectro son intensidad contra relación de masa a carga de la especie(s) presente. Un algoritmo de desconvolución es utilizado para convertir esta serie de iones múltiplemente cargados en un espectro de peso molecular. Los resultados de la espectrometría de masa del pico I de RP-CLAR muestran 4 especies de proteína mayores de diferente masa molecular.

La especie de 21 ,997 kDa representa la masa pronosticada de hGH con el Phe N-terminal predicho removido por sobre-desdoblamiento de la proteasa ubiquitina. La especie 22,124 kDa representa la masa pronosticada de la secuencia de aminoácidos correcta, apropiadamente procesada de hGH. Se cree que las especies 22,507 kDA y 22,664 kDA representan una hGH con el Phe N-terminal y hGH que han sido modificados durante procedimientos de extracción de planta, respectivamente. La masa molecular calculada de las proteínas sugiere que la hGH expresada a partir del plástido está plegada de manera apropiada (es decir, se crean las uniones de disulfuro correctas). La secuenciación amino terminal se llevó a cabo mediante degradación Edman estándar, y confirmó las secuencias N-terminales discutidas con anterioridad. 4D. Bioactividad de hGH expresada en plástidos de plantas La bioactividad del extracto de pH ajustado y centrifugado se evaluó utilizando células de una línea de células Nb2. Estas células proliferaron en presencia de hormona de crecimiento y otros compuestos de tipo estrogénico. La prueba comprende colocar diversas concentraciones de extracto que contiene hormona de crecimiento en una placa de 96 cavidades. Después, una cantidad constante de células es agregada a cada cavidad. La placa es incubada durante 48 horas y después se agrega un reactivo llamado MTS. Células meta bol izantes toman el MTS y lo convierten en una sustancia de color azul. A mayor número de células mayor color azul en la cavidad. El color azul es medido usando un espectrofotómetro. El número de células deberá ser proporcional a la concentración de hormona de crecimiento en el medio. A cierta concentración elevada se espera que las células se saturarán con hormona de crecimiento y que la respuesta de dosis se nivelará. A concentraciones muy bajas de hGH esencialmente no se observa crecimiento incrementado. Se espera que se produzca una gráfica de forma sigmoidea representando gráficamente el número de células (o absorbancia) contra la gráfica de concentración de hGH. Los resultados de la prueba de bioactividad (figura 5) demuestran que la hGH expresada a partir de un plástido de planta tiene una forma sigmoidea cuando se representa gráficamente como absorbancia contra concentración de hGH.

EJEMPLO 5 Análisis de aprotinina en plantas de tabaco transplastómicas 5A. Análisis Western de expresión de aprotinina en plástidos Las líneas de tabaco homoplásmicas son utilizadas para determinar la expresión de la proteína aprotinina. El análisis por transferencia de Western se llevó a cabo sobre líneas de tabaco que contenían construcciones pCGN6146, pCGN6147, pCGN6154 y pCGN6156 para expresión en plástidos de aprotinina. Las extracciones de proteína total y los procedimientos por transferencia de Western se llevaron a cabo como se describió con anterioridad, con la excepción de que el anticuerpo primario fue incrementado contra aprotinina.

Los resultados del análisis Western indican que la aprotinina es expresada a partir del promotor T7 polimerasa cuando la secuencia de codificación de aprotinina es fusionada con PetA o el gen GUS de longitud completa. Además, estos resultados indican que la secuencia de PetA dirige de manera eficiente la proteína aprotinina al tilacoide de la célula vegetal. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta descripción indican el nivel de experiencia de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada como incorporada por referencia. Aunque la invención ha sido descrita con detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de esclarecer el entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110>CalgeneLLC <120> Expresión de genes de tolerancia a herbicidas en plástidos de plantas <130>15336/00/WO <140> PCT/US 99/15472 <141> 1999-07-09 <150>09/113,257 <151> 1998-07-10 <160>3 <170> FastSEQ para Windows versión 4.0 <210> 1 <211>44 <212>ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 1 aattgtagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tace 44 <210> 2 <211 > 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 2 catgggtata tctccttctt aaagttaaac aaaattattt ctac 44 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Humana <400> 3 Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 10 15 Arg He lie Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45 Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala

Claims (66)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una construcción que comprende los siguientes componentes en la dirección 5' a 3' de transcripción: a) un promotor funcional en un plástido de planta; b) una secuencia de ADN que es capaz de conferir tolerancia en una célula vegetal a por lo menos un compuesto herbicida cuando dicha secuencia de ADN es transcrita en plástidos de dicha célula vegetal; y c) una región de terminación de transcripción.

2.- La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha construcción comprende además d) un gen que codifica para un marcador elegible para selección de células vegetales que comprenden un plástido que expresa dicho marcador y e) regiones de ADN de homología al genoma de dicho plástido, en donde dichas regiones de homología en e) flanquean componentes a), b), c) y d).

3.- La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha construcción comprende adicionalmente f) un sitio de unión a ribosoma unido a dicho componente promotor a).

4.- La construcción de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque dicho sitio de unión a ribosoma f) es de una secuencia líder seleccionada del grupo que consiste en sitios derivados de secuencias líder de plástidos, bacterias o bacteriófagos.

5.- La construcción de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicho sitio de unión a ribosoma se selecciona del grupo que consiste en el sitio de unión de la secuencia líder del gen 10 y el sitio rbcLRBS.

6.- La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de ADN codifica para un gen que confiere tolerancia al herbicida glifosato.

7.- La construcción de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicha secuencia de codificación de ADN codifica para una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa tolerante a glifosato.

8.- La construcción de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicha secuencia de codificación de ADN se selecciona del grupo que consiste en el gen aroA de E. Coli o Salmonella, el gen CP4, EPSPS de petunia mutante, gen EPSPS mutante de Pseudomonas cepa LBAA, y el gen aroE de Bacillus subtilis.

9.- La construcción de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicha secuencia de codificación de ADN codifica para una enzima de modificación de glifosato.

10.- La construcción de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha enzima de modificación de glifosato se selecciona del grupo que consiste en gox, hph, glpA y glpB.

11.- La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de codificación de ADN es la secuencia de codificación nativa para dicho gen.

12.- La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de codificación de ADN es una secuencia de codificación sintética para dicho gen.

13.- La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de ADN codifica para un gen AHAS tolerante a sulfonilurea.

14.- La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de ADN codifica para un gen AHAS tolerante a imidizalinona.

15.- La construcción de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicha secuencia de codificación de ADN es el gen ALS.

16.- La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de ADN codifica para un gen tolerante a fosfinotricina.

17.- La construcción de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque dicha secuencia de codificación de ADN es el gen BAR.

18.- La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de ADN codifica para una enzima de la trayectoria carotenoide.

19.- La construcción de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque dicha secuencia de codificación de ADN es el gen crtl.

20.- La construcción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de ADN codifica para un gen tolerante a bromoxinilo.

21.- La construcción de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque dicho gen tolerante a bromoxinilo es el gen BXN.

22.- Un plástido de célula vegetal que contiene la construcción de conformidad con la reivindicación 1.

23.- Una planta, semilla de planta, célula vegetal o progenie de la misma que contiene un plástido de planta de conformidad con la reivindicación 22.

24.- Un método para producir tolerancia de un herbicida en una célula vegetal, en donde dicho método comprende transformar plástidos de dicha célula vegetal con una construcción que comprende lo siguiente como componentes operativamente unidos en la dirección 5' a 3' de transcripción: a) un promotor funcional en un plástido de planta; b) una secuencia de ADN que es capaz de conferir tolerancia en una célula vegetal a por lo menos un compuesto herbicida cuando dicha secuencia de ADN es transcrita en plástidos de dicha célula vegetal; y c) una región de terminación de transcripción, y cultivar células vegetales que comprenden dichos plástidos transformados bajo condiciones en las cuales dicha secuencia de ADN es transcrita, mediante el cual las células vegetales que contienen dichos plástidos de plantas se vuelven tolerantes a aplicaciones de dicho por lo menos un compuesto herbicida.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha construcción comprende también d) un gen que codifica un marcador elegible para selección de células vegetales que comprenden un plástido que expresa dicho marcador y e) regiones de ADN de homología al genoma de dicho plástido, en donde dichas regiones de homología en e) flanquean componentes a), b), c) y d).

26.- Ei método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha construcción comprende adicionalmente una segunda secuencia de ADN de interés.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicha segunda secuencia de ADN comprende un gen expresado a partir de un promotor independiente de dicho promotor a).

28.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicha segunda secuencia de ADN comprende un gen expresado a partir de dicho promotor a) como un mensaje policistrónico con dicha secuencia de ADN en b).

29.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicha segunda secuencia de ADN comprende un gen distinto de un gen capaz de conferir en una célula vegetal tolerancia a dicho compuesto herbicida.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicha segunda secuencia de ADN comprende un gen capaz de conferir en una célula vegetal tolerancia a un segundo compuesto herbicida.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha construcción comprende también f) un sitio de unión a ribosoma unido a dicho componente promotor a).

32.- La construcción de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque dicho sitio de unión a ribosoma se selecciona del grupo que consiste en el sitio de unión de la secuencia líder del gen 10 y el sitio rbcLRBS.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha secuencia de ADN codifica para un gen que confiere tolerancia al herbicida glifosato.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicha secuencia de codificación de ADN codifica para una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa tolerante a glifosato.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque dicha secuencia de codificación de ADN se selecciona del grupo que consiste en el gen aroA de E. Coli o Salmonella, el gen CP4, EPSPS de petunia mutante, gen EPSPS mutante de Pseudomonas cepa LBAA, y el gen aroE de Bacillus subtilis.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicha secuencia de codificación de ADN codifica para una enzima de modificación de glifosato.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque dicha enzima de modificación de glifosato se selecciona del grupo que consiste en gox, hph, glpA y glpB.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha secuencia de codificación de ADN es la secuencia de codificación nativa para dicho gen.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha secuencia de codificación de ADN es una secuencia de codificación sintética para dicho gen.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha secuencia de ADN codifica para un gen AHAS tolerante a sulfonilurea.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha secuencia de ADN codifica para un gen AHAS tolerante a imidizalinona.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque dicha secuencia de codificación de ADN es el gen ALS.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha secuencia de ADN codifica para una enzima de la trayectoria carotenoide.

44.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque dicha secuencia de codificación de ADN es el gen crtl.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha secuencia de ADN codifica para un gen tolerante a bromoxinilo.

46.- El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque dicho gen tolerante a bromoxinilo es el gen BXN.

47.- Una célula vegetal tolerante a herbicida producida de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 24.

48.- Una planta, semilla de planta o parte de planta que contiene una célula vegetal de conformidad con la reivindicación 47.

49.- Una célula vegetal de conformidad con la reivindicación 47 y que comprende más de alrededor de 0.01 % de proteína soluble total como una proteína expresada a partir de dicho gen de tolerancia a herbicida.

50.- Una célula vegetal de conformidad con la reivindicación 47 y que comprende más de alrededor de 0.1 % de proteína soluble total como una proteína expresada a partir de dicho gen de tolerancia a herbicida.

51.- Una célula vegetal de conformidad con la reivindicación 47 y que comprende más de alrededor de 0.2% de proteína soluble total como una proteína expresada a partir de dicho gen de tolerancia a herbicida.

52.- Una célula vegetal de conformidad con la reivindicación 47 y que comprende 1% o más de proteína soluble total como una proteína expresada a partir de dicho gen de tolerancia a herbicida.

53.- Una célula vegetal de conformidad con la reivindicación 47 y que comprende 12% o más de proteína soluble total como una proteína expresada a partir de dicho gen de tolerancia a herbicida.

54.- Una célula vegetal de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque dicho gen de tolerancia a herbicida es una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa tolerante a glifosato.

55.- Una planta, semilla de planta o parte de planta que comprende una célula vegetal de conformidad con la reivindicación 53.

56.- Una planta de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 55 tolerante al herbicida glifosato cuando dicho herbicida es aplicado a un régimen de aproximadamente 453.58 gramos o más por hectárea.

57.- Una planta de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 55 tolerante al herbicida glifosato cuando dicho herbicida es aplicado a un régimen de aproximadamente 907.2 gramos o más por hectárea.

58.- Una planta de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 55 tolerante al herbicida glifosato cuando dicho herbicida es aplicado a un régimen de aproximadamente 1814.33 gramos o más por hectárea.

59.- Una planta de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 55 tolerante al herbicida glifosato cuando dicho herbicida es aplicado a un régimen de aproximadamente 3628.67 gramos o más por hectárea.

60.- Un método en donde la tolerancia a herbicida producida de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 24 es utilizado para seleccionar células transformadas por dicha construcción a partir de células no transformadas.

61.- Un método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado además porque dicho gen tolerante a herbicida confiere tolerancia al herbicida glifosato.

62.- Un método de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque dicha selección para dicha tolerancia a herbicida se lleva a cabo en medios que contienen glifosato a una concentración de por lo menos alrededor de 50 µm a aproximadamente 200 µm.

63.- Un método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado además porque dicha selección para dicha tolerancia a herbicida se lleva a cabo en medios que contienen glifosato a una concentración de alrededor de 1 mM.

64.- Una célula vegetal producida de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 60.

65.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dichas células vegetales son tolerantes a aplicaciones de cantidades de herbicida seleccionadas del grupo que consiste en 453.58 gramos/hectárea, 907.2 gramos/hectárea, 1814.33 gramos/hectárea y 3628.67 gramos/hectárea.

66.- El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque dicho herbicida es glifosato.