BRPI0712648A2 - gene quimÉrico, vetor, cÉlula vegetal transplatÕmica, planta transplastâmica e/ou progÊnie desta, partes cultivÁveis de um aplanta , mÉodos para a produÇço de uma planta tranplastâmica , para a obtenÇço de um peptÍdeo, para a produÇço de peptideo e uso de um pepetideo sinal bacteriano - Google Patents

Abstract

GENE QUIMÉRICO, VETOR, CÉLULA VEGETAL TRANSPLASTâMICA, PLANTA TRANSPLASTâMICA E/OU PROGIÊNE DESTA, PARTES CULTIVÁVEIS DE UMA PLANTA, MÉTODOS PARA A PRODUÇçO DE UMA PLANTA TRANSPLASTâMICA E/OU PROGIÊNE DESTA, D EPRODUÇçO D EUM PEPTÍDEO, DE PRODUÇçO DE UMA PLANTA TRANSPLASTâMICA, PARA A OBTENÇçO DE UM PEPTÍDEO, PARA A PRODUÇçO DE UM PEPTÍDEO E USO DE UM PEPTÍDEO SINAL BACTERIANO. A presente invenção refere-se a sequências de ácidos nucléicos e métodos úteis no direcionamento de uma proteína recombinante codificada por um transgene integrado ao genoma do cloroplasto para o lúmen do titacóide do cloroplasto, pelo qual as ditas sequências de ácido nucléico codificam peptídeos sinasi bacterianos. A invenção também relaciona-se a meios e métodos para expressar uma proteína de interesse que contem ligações de dissulfeto em uma célula vegetal transplastômica.

Description

"GENE QUIMÉRICO, VETOR, CÉLULA VEGETAL TRANSPLASTÔMICA, PLANTA TRANSPLASTÔMICA E/OU PROGÊNIE DESTA, PARTES CULTIVÁVEIS DE UMA PLANTA, MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSPLASTÔMICA E/OU PROGÊNIE DESTA, DE PRODUÇÃO DE UM PEPTÍDEO, DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA

TRANSPLASTÔMICA, PARA A OBTENÇÃO DE UM PEPTÍDEO, PARA A PRODUÇÃO DE UM PEPTÍDEO E USO DE UM PEPTÍDEO SINAL

BACTERIANO"

A presente invenção relaciona-se a novas construções e métodos para a expressão de proteínas recombinantes, no lúmen do tilacóide de células de planta transplastômica. A invenção também refere-se a meios e métodos para expressar proteínas de interesse contendo ligações de dissulfeto na célula de planta transplastômica.

Plantas oferecem uma alternativa adequada para a expressão microbiana ou animal para a produção de proteínas recombinantes industriais ou farmacêuticas. Elas apresentam muitas vantagens em comparação com os sistemas tradicionais, como baixos custos de produção antecipada, rápida facilidade de expansão, a ausência de agentes patogênicos para humanos e capacidade de dobrar e montar proteínas complexas com precisão (Ma et al., 2003, Nature reviews. 4:794-802). Inúmeros modelos de plantas foram transformadas para produzir estruturas complexas com conformação nativa com sucesso, tais como anticorpos ou antígenos complexos (Warzecha e Mason, 2003, Plant J Physiol. 160 (7): 755-64; Arntzen et al., 2005, Vaccine .23:1753-1756). Além disso, algumas espécies de plantas têm potencial para serem adequadas para a imunização oral direta, o conceito de vacinas comestíveis, incluindo de humanos (Mason et al., 2002, Trends in Mol. Med. 8 (7):324-329). No entanto, existem algumas limitações, uma vez que a transformação nuclear de plantas muitas vezes resulta em baixo rendimento de proteína recombinante.

Como uma alternativa para a expressão nuclear, cloroplastos modificados por engenharia genética surgiram como uma ferramenta eficaz para a expressão de proteínas recombinantes em plantas (Daniell et al., 2004, Em Molecular Biology of Plant organelles, Springer, 443-490; Maliga 2004, Annu. Rev. Plant. Biol. 55:289-313; Dubald et al., 2006, Em: In recent Advances in Plant Biotechnology, Kumar, A. (Ed), IK International Publishers. Nova Dehli (in press)). O principal motivo é que este sistema é caracterizado pelo seu nível potencialmente elevado de expressão do transgene, em até 46% de proteínas solúveis (De Cosa et al., 2001, Λ/aí. Biotechnol. 19:71-74). Características adicionais de interesse são: (i) a herança materna de seu genoma na maioria das espécies, reduzindo drasticamente a disseminação do transgene através do pólen, e (ii) a introdução direcionada do DNA específico por recombinação homóloga em uma região definida do genoma do plastídio. A localização dos transgenes é, portanto, previsível, expressão gênica é uniforme entre as linhagens transgênicas selecionadas que são clonadas em essência, e não há segregação das características na progênie.

Os plastídios são organelas de células eucarióticas, que segundo a teoria endossimbiótica derivam de ancestrais das cianobactérias. Elas, portanto, continuam exibindo muitas funcionalidades de procarióticos, incluindo, por exemplo, a organização de genes em óperons, e a maioria dos mecanismos procarióticos de expressão gênica.

Em relação à proteína, foi previsto que cloroplastos, tal como outros sistemas procarióticos, não seriam capazes de acumular proteínas recombinantes contendo ligações de dissulfeto corretamente formadas, que representam uma importante classe de proteínas terapêuticas. Há até agora na literatura apenas alguns exemplos de proteínas recombinantes contendo ligações de dissulfeto que foram manifestadas com sucesso em plastídios (Staub, JM1 etal, 2000; Daniell et al., 2001). No entanto, ele está claro se estas ligações estão corretamente pareadas, e se elas são formadas espontaneamente na planta ou durante a extração.

Cloroplastos são organelas complexas em termos estruturais, que compreende três fases solúveis distintas. O cloroplasto é ligado por uma dupla- membrana do envelope, o qual inclui um espaço intermembrana. A principal fase solúvel é o estroma, que é o local de fixação de carbono, síntese de aminoácidos e muitas outras vias. A membrana dominante é a extensa rede do tilacóide interconectado, onde a luz é captada e o é ATP sintetizado. A membrana tilacóide inclui a terceira fase solúvel, o lúmen do tilacóide, que abriga uma série de proteínas fotossintéticas extrínsecas, bem como muitas outras (C. Robinson et al, 2001, Traffic 2:245-251).

O lúmen do tilacóide do cloroplasto é um compartimento celular de plantas que pode ser otimizado para o acúmulo de certas proteínas recombinantes, devido a esta particularidade, incluindo o seu conteúdo específico em proteases (Z. Adams et al., TRENDS in Plant Science, vol 7 N °10 , Págs 451-456, 2002). Apesar disso, ele raramente tem sido considerado para a translocação de proteína recombinante e o acumulo desta.

Na Patente US 6.512.162, a seqüência de codificação da aprotinina é fundida com o gene petA, a fim de direcionar a proteína fusionada peta::aprotinina para a membrana tilacóide da célula vegetal. O gene petA é um gene do genoma do cloroplasto que codifica a proteína citocromo f (petA), que tem sido relatado como um polipeptídio com um arranjo transmembrana na membrana tilacóide do cloroplasto, com a região N-terminal dentro do espaço tilacóide, e uma seqüência C-terminal de 15 aminoácidos no estroma (SJ Rothstein et al, Proc. Natl.. Acad USA., Vol. 82, págs 7955-7959, 1985). Portanto, a proteína fundida petA::aprotinina, no qual a seqüência que codifica a proteína aprotinina está ligada com o 3'terminal da seqüência que codifica o citocromo f (petA), deve endereçar a aprotinina no estroma.

Por conseguinte, há ainda uma necessidade de métodos e meios que permitam endereçar um peptídeo de interesse para o lúmen do tilacóide do cloroplasto.

Tal estratégia aproveita-se do alto nível de expressão de transgenes integrado ao genoma do cloroplasto, com o intuito de acumular alta quantidade de proteína recombinante em um compartimento celular (o lúmen do tilacóide), com características específicas.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: Mapa do plasmídeo pCLT 516.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção oferece seqüências de ácidos nucléicos recombinantes úteis na translocação de uma proteína recombinante codificada por um transgene integrado no genoma do cloroplasto para o lúmen do tilacóide do cloroplasto, segundo o qual, as seqüências de ácido nucléico mencionada codificam peptídeos sinal bacteriano.

Além disso, uma característica notável e inesperada no uso do método e dos meios da presente invenção é a grande melhoria na expressão e na atividade específica da proteína recombinante.

A presente invenção refere-se adicionalmente aos meios e métodos para a obtenção de uma proteína contendo ligações de dissulfeto de interesse no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal transplastômica, e/ou a produção de proteínas recombinantes tendo um N-terminal não-metionina no cloroplasto vegetal.

O assunto da invenção é um gene quimérico compreendendo, ligadas um ao outro de modo funcional na direção da transcrição:

a) um promotor de um gene vegetal plastômico,

b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma seqüência sinal bacteriana transacionalmente fundida com peptídeo sinal,

c) uma seqüência de ácido nucléico heteróloga que codifica um peptídeo de interesse,

d) opcionalmente um terminador, que é ativo nos plastídios das células vegetais.

De acordo com a invenção, o "peptídeo sinal bacteriano" pode ser qualquer peptídeo sinal de origem bacteriana, ou seja, qualquer peptídeo sinal de proteína bacteriana secretada. Uma proteína bacteriana secretada é uma proteína de origem bacteriana, que é secretada para fora da célula bacteriana. Proteínas bacterianas secretadas naturalmente contêm um peptídeo sinal que permite com que o maquinário da célula bacteriana direcione a dita proteína para fora célula bacteriana. O peptídeo sinal bacteriano da invenção pode ser um peptídeo sinal N-terminal, ou seja, um peptídeo sinal de uma proteína bacteriana localizada na extremidade N-terminal da referida proteína bacteriana.

Em bactérias, secreção protéica depende principalmente em peptídeos sinais N-terminal. Existem pelo menos duas vias secretoras distintas em que ambas dependem dos peptídeos sinais N-terminal: a via Sec e a via Tat. Em bactérias, há também um terceiro tipo de mecanismo secretor chamado secreção do tipo Ill ou "via de secreção geral". Os sinais de secreção do tipo Ill estão localizados na extremidade C-terminal das proteínas.

A via Sec é, em bactérias, a principal via de translocação de proteína. Proteínas secretórias são sintetizadas no citosol como precursores com uma extensão amino-terminal, o peptídeo sinal. Estas proteínas precursoras (pré-proteínas) são direcionadas diretamente ou via chaperonas moleculares para um complexo ligado à membrana denominado "translocase". As pré-proteínas são translocadas através da membrana em um estado não enovelado. Finalmente, na face periplasmática da membrana, a seqüência sinal da pré-proteína é removida por uma peptidase de sinal (AJM Driessen, 2002, Protein Targeting, transport & translocation, Dalbey RE RE & G. von Heijne ed., Chap 4 - "protein export in bactéria", 47-73).

A via Tat foi mais tarde descoberta como presente na maioria das bactérias. A região hidrofóbica do peptídeo sinal Tat tem uma hidrofobicidade típica mais baixa do que a encontrada no peptídeo sinal Sec1 e o peptídeo sinal Tat não é reconhecido pelos componentes do maquinário da Sec. No entanto, e apesar do fato de que não existe aparente relação entre os componentes do maquinário da Sec e Tat, o peptídeo sinal respectivos são relativamente semelhantes em sua concepção geral, e parecem mais como variações sobre um tema do que dois tipos distintos de sinais de translocação ( G. von Heijne, .2002, Protein Targeting, transport & translocation, Dalbey RE RE & G. von Heijne ed., Cap 3 - "Targeting sequences", 35-46).

Assim, a presente invenção está relacionada com um gene quimérico, tal como definido anteriormente, onde a seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano é proveniente de uma proteína bacteriana utilizando a via Sec, ou via Tat, para a sua translocação.

Os peptídeos sinais bacteriano são conhecidos por terem uma extensão que varia geralmente entre 18 e 30 aminoácidos, mas os peptídeos sinais bacteriano de qualquer comprimento são apropriados para a presente invenção. Eles são equipados com as mesmas propriedades físicas e têm geralmente a seguinte estrutura tripartida:

-N-domínio: o domínio amino-terminal contém uma carga positiva líquida. Pré-proteínas que não têm esta carga positiva são ainda reconhecidas pela translocase mas são translocados lentamente. Os N-domínios conhecidos tem de 1 a 5 aminoácidos, mas peptídeos sinais bacteriano com N-domínios maiores poderiam também ser adequados para a presente invenção;

-Η-domínio: o núcleo hidrofóbico da seqüência sinal consiste de um braço de resíduos de aminoácido hidrofóbicos que pode dobrar em uma conformação alfa-helicoidal. Freqüentemente, os resíduos glicina e prolina são encontrados no meio deste domínio. N-domínios conhecidos podem conter de 7 a 15 aminoácidos, mas peptídeos sinais bacteriano com H- domínios maiores poderiam também ser adequados para a presente invenção;

- C-domínio: o C-domínio polar contém o sítio de clivagem para a peptidase de sinal. N-domínios conhecidos podem conter de 3 a 7 aminoácidos, mas peptídeos sinais bacteriano com C- domínios de comprimentos diferentes poderiam também ser adequados para a presente invenção;

Predição e identificação dos peptídeos sinais de uma proteína bacteriana baseada na seqüência de aminoácidos da proteína ou sobre a seqüência de ácidos nucléicos do gene correspondente são bem conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto.

Como um exemplo não-limitante, SignaIP (Nielsen et al., Int. J. Neural Syst. 8:581-599, 1997) e TargetP (Emanuelsson et al, J Mol Biol 300:1005-1016, 2000) são ferramentas adequadas para a predição de peptídeo sinal de uma proteína bacteriana ou uma seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano.

É bem conhecido pelos técnicos hábeis que a tradução normal nos plastídios inicia na metionina. De acordo com a invenção, uma tradução do códon iniciador ATG, que codifica uma metionina, é fundido à estrutura na extremidade 5' da molécula de ácido nucléico que codifica o peptídeo sinal bacteriano ou substitui a porção N-terminal do aminoácido quando este peptídeo sinal bacteriano não é iniciado por uma metionina e/ou quando a dita molécula de ácido nucléico codifica um peptídeo sinal que direciona para o lúmen não é iniciada por um códon ATG.

Moléculas de ácido nucléico que codificam um peptídeo sinal bacteriano podem ser isoladas, por exemplo, a partir de bibliotecas de DNA produzidas de origem bacteriana. Alternativamente, elas podem ser produzidas por meio de técnicas de DNA recombinante (por exemplo, PCR) ou por meio de síntese química. O isolamento e identificação de tais moléculas de ácidos nucléicos podem ser realizados pelo uso de moléculas de acordo com a invenção ou de partes dessas moléculas, ou, se for o caso, podem ser as fitas reversas complementares reversas dessas moléculas, por exemplo, por hibridação de acordo com métodos padrão (vide, por exemplo, Sambrook et ai, .1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Um peptídeo sinal bacteriano, de acordo com a invenção, pode ser obtido a partir de uma proteína bacteriana com técnicas rotineiras pelos técnicos hábeis no assunto, por métodos notáveis, tais como os descritos em Sambrook et al (1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, ED.:Nolan C, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Em um exemplo de realização da presente invenção a seqüência de ácido nucléico que codifica peptídeo sinal bacteriano é escolhida entre o grupo constituído por:

a) molécula de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos conhecida sob SEQ ID No: 2;

b) molécula de ácido nucléico que codifica um peptídeo, a seqüência de aminoácidos do qual tem uma identidade de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou 95% com a seqüência de aminoácidos conhecida sob SEQ ID No: 2;

c) molécula de ácido nucléico, compreendendo a seqüência nucleotídica conhecida sob SEQ ID No: 1;

d) molécula de ácido nucléico, a seqüência de ácido nucléico que tem uma identidade de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, 80%, 90% ou 95% com as seqüências de ácido nucléico descrito em a) ou c);

e) moléculas de ácido nucléico, a seqüência nucleotídica do qual se difere da seqüência da molécula de ácido nucléico identificada em a), b), c) ou d) devido à degeneração do código genético; e

f) moléculas de ácido nucléico, que representam fragmentos, variantes alélicos e/ou derivativas de moléculas de ácido nucléico identificadas em a), b), c), d) ou e).

De acordo com a presente invenção, o termo "identidade" deve ser entendido pelo significado de número de aminoácidos/nucleotídeos correspondentes aos aminoácidos/nucleotídeos de outras proteínas/ácidos nucléicos, expresso como percentagem. A identidade é preferencialmente determinada pela comparação da SEQ. ID No: 1, ou SEQ ID No: 2 com outras proteínas/ácidos nucléicos com a ajuda de programas de computadores. Se as seqüências que serão comparadas com outras tiverem comprimentos diferentes, a identidade deve ser determinada de forma que o número de aminoácidos, de que têm a seqüência menor em comum com a seqüência maior, determina o quociente percentual de identidade. Preferencialmente, a identidade é determinada por meio do programa de computador ClustalW, que é bem conhecida e está disponível publicamente (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). ClustalW está publicamente disponível por Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) e Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Alemanha. ClustalW também pode ser baixado eletronicamente a partir de diferentes sites da Internet, incluindo o site da IGBMC (Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, BP163, 67404 Illkirch Cedex1 França; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) e do EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/), bem como de todos os sites da Internet Λ) P1,

espelhados do EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton1 Cambridge CB10 1DP, UK).

Preferencialmente, a versão 1.8 do programa CIustaIW é usado para determinar a identidade entre as proteínas de acordo com a presente invenção e outras proteínas. Ao fazê-lo, os seguintes parâmetros devem ser definidos: KTUPLE = 1, TOPDIAG = 5, WINDOW = 5, PAIRGAP = 3, GAPOPEN = 10, GAPEXTEND = 0.05, GAPDIST = 8, MAXDIV = 40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS (OFF), NOPGAP, NOHGAP.

Preferencialmente, a versão 1.8 do programa CIustaIW é usado para determinar a identidade entre as seqüências de moléculas de ácido nucléicos de acordo com a invenção, por exemplo, e outras seqüências de moléculas de ácido nucléicos. Ao fazê-lo, os seguintes parâmetros devem ser definidos:

KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: unweighted.

Os parentes mais próximos para os antecessores dos cloroplastos são conhecidos como cianobactérias, que são capazes de realizar fotossíntese oxigênica. Tal como cloroplastos, as cianobactérias guardam um sistema de membrana tilacóide interna que abriga o complexo de proteínas de cadeia de transporte eletrônico fotossintético. De acordo com a invenção, o peptídeo sinal bacteriano pode ser ou não de origem de uma cianobactéria, e/ou a partir ou não de uma proteína localizada no interior do lúmen do tilacóide de uma bactéria.

De acordo com a presente invenção, o termo "ligados uns aos outros de modo funcional" ou "operavelmente ligados" significa que elementos específicos do componente gene quimérico são ligados uns aos outros de tal maneira que funcionam como uma unidade para permitir expressão da seqüência codificadora. De modo exemplificativo, um promotor é dito ligado a uma seqüência codificadora de modo funcional se ele é capaz de promover a expressão de tal seqüência codificadora.

De acordo com a presente invenção, o termo "ligados uns aos outros de modo funcional" abrange o caso de uma combinação policistrônica em que o promotor não é diretamente ligado à seqüência codificadora.

Um gene quimérico de acordo com a invenção pode ser montado a partir de vários componentes utilizando técnicas rotineiras para os técnicos hábeis no assunto, métodos notáveis como os descritos em Sambrook et al (1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Nolan C, ed., Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Os elementos regulatórios que precisam ser incluídos precisamente no gene quimérico dependem do tipo de planta e do tipo de plastídio que será utilizado: os técnicos hábeis no assunto são capazes de selecionar quais elementos reguladores podem ser utilizados para o trabalho e podem melhorar a produção de proteína em uma determinada planta. Como exemplo, a seqüência consenso de Shine-Dalgarno (SD) GGAGG pode ser colocada a montante do gene. Alternativamente ou em complemento, uma região 5'não traduzida (UTR) pode ser inserida entre o promotor e o gene (Staub JM e Maliga P., 1993, EMBO J. 12, 601-606).

Os técnicos hábeis no assunto são conscientes de que o uso de uma região 5' não traduzida (5' UTR) e região 3' não traduzida (3' UTR) como sinais regulatórios são geralmente necessários para níveis mais elevados de expressão do transgene em plastídios (B. De Cosa, Moar W., Lee SB, Miller e M. Daniell H., 2001, Nat. Biotechnol. 19, 71-74). Possíveis 5'UTR e 3'UTR são bem conhecidas por aqueles hábeis no assunto. Como exemplo, o promotor do gene psbA, nucleotídeo 1596 ao 1819 do GenBank Z00044, incluindo a 5'UTR endógena. O promotor do óperon ribossômico 16S Prrn pode ser associado com o sítio de ligação ribossômica da região do gene rbcL (5'UTR rbcL).

No contexto da invenção, um promotor de um gene plastômico vegetal significa um promotor que é naturalmente presente no plastoma de uma planta.

Entre os promotores de um gene plastômico vegetal, a título de exemplo, pode ser feita a menção especial do gene psbA que codifica o polipeptídeo D1 do PSII (Staub et al. 1993 EMBO Journal 12 (2) :601-606), e o promotor constitutivo Prrn, que regulamenta o óperon do RNA ribossômico (Staub et al. 1992 Plant Cell 4:39-45). Como regra geral, técnicos hábeis no assunto saberão qual dos promotores disponíveis selecionar a fim de se obter o modo de expressão desejado (constitutiva ou induzida).

Um promotor bem adequado para a presente invenção é o promotor Prrn do tabaco que está associado com parte da seqüência 5' não traduzida do gene rbcL proporcionando um sítio de ligação ribossômico (Svab et ai, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. 90:913-917).

Outro promotor bastante adequado é o promotor dependente de luz do gene psbA que codifica o polipeptídeo D1 do PSII (Staub JM e Maliga P., .1993, EMBO J. 12, 601-606).

Entre os terminadores que são ativos nos plastídios da célula vegetal, a título de exemplo, poderia ser feita menção especial dos terminadores do gene psbA, do gene rbcL (que codifica a subunidade grande da RuBisCO), e do gene rps16 (que codifica uma proteína ribossômica do tabaco) (Shinozaki et al., 1986, EMBO J. 5:2043-2049; Staub JM e Maliga P., .1993, EMBO J. 12, 601-606).

De acordo com a presente invenção, o termo "fundido transacionalmente com" deverá ser entendido como uma fusão das seqüências de ácido nucléico de tal modo que elas representem uma única fase de leitura aberta, que após a transcrição leva à produção de um único RNA mensageiro que codifica um único polipeptídeo, quando traduzidos.

De acordo com a presente invenção, a seqüência de ácido nucléico codificando um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente com uma seqüência de ácido nucléico heteróloga, o que significa que esta segunda seqüência de ácido nucléico não está naturalmente fundida com a primeira seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano. Em outro exemplo de realização, o ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano e/ou o ácido nucléico que codifica uma seqüência do peptídeo de interesse são concebidos de forma a otimizar a expressão no cloroplasto, baseado, por exemplo, no "codon usage" do cloroplasto da Nicotiana tabacum. O "codon usage" do cloroplasto da Nicotiana tabacum está disponível em www.Kazusa.or.jp/codon, bem como a distribuição dos códons é aleatoriamente atribuída a cada resíduo de aminoácido ao longo de toda a seqüência codificadora em função da freqüência no uso do "codon usage" do cloroplasto apresentado (Nakamura et ai., 2000, Nucl. Acids Res. 28, 292).

De acordo com a presente invenção, a seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano é fundido transacionalmente com uma seqüência de ácido nucléico heteróloga, o que significa que a seqüência de ácido nucléico que codifica o peptídeo de interesse pode ser isolado, por exemplo, a partir do DNA genômico ou do DNA produzido a partir de bibliotecas eucariotas ou de outra origem.

Alternativamente, podem ser produzidos por meio de técnicas de DNA recombinante (por exemplo, PCR) ou por meio de síntese química. O isolamento e identificação de tais moléculas de ácidos nucléicos pode ser efetuado através do uso de moléculas de acordo com a invenção ou de partes dessas moléculas, ou, se for o caso, das fitas complementares reversas dessas moléculas, por exemplo, por hibridação de acordo com métodos padrões (vide, por exemplo, Sambrook et ai, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Ainda em outro exemplo de realização, a seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo de interesse codifica um peptídeo com um N-terminal não-metionina.

Entre os peptídeos de interesse, um N-terminal não-metionina, a título de exemplo, podemos citar a proteína aprotinina. Aprotinina é um inibidor de protease, que pode ser extraída de órgãos ou tecidos de origem bovina, tal como o pâncreas, pulmão ou fígado. Aprotinina é conhecida por inibir várias serina proteases, incluindo a tripsina, quimotripsina, plasmina e calicreína, e é utilizada terapeuticamente no tratamento do infarto do miocárdio, síndrome de choque, hiperfibrinolítica e pancreatite aguda, e no intuito de reduzir a perda sangüínea em relação à cirurgia cardíaca (Bidstrup et al, 1989, Cardiovasc Surg. 44:640-645). Os ácidos nucléicos e aminoácidos de aprotinina podem ser encontrados na base de dados Swiss-Prot/TrEMBL (colaboração entre o Swiss Institute of Bioinformatics e o EMBL outstation - the European Bioinformatics Instituteml http://us.exDasv.org/sprot) Número de acesso P00974.

A invenção também relaciona-se a um vetor projetado para a transformação do plastídio da planta, caracterizado em que ele contém, pelo menos, duas seqüências que são homólogas às seqüências no plastoma da planta a ser transformada, de modo que, as ditas seqüências homólogas flaqueiam pelo menos um gene quimérico, de acordo com a invenção.

Estas seqüências - uma à montante (LHRR) e a outra à jusante (RHRR) do(s) gene(s) quimérico(s) componente(s) permitirá a recombinação homóloga dupla dentro de uma região intergênica do plastoma, compreendendo a região contígua LHRR e RHRR.

As duas seqüências de recombinação homóloga, de acordo com a invenção, podem ser contíguas de forma que o gene quimérico é inserido em uma seqüência não codificante (intergênica) do plastoma. Em outro exemplo de realização específico, esta seqüência é parte do óperon do RNA ribossômico do plastídio. Em outra exemplo de realização particular, a seqüência não- codificante inclui a extremidade 3' do gene rbcl (que codifica a subunidade da grande ruBisCO), com a outra seqüência homóloga da extremidade 5' do gene accD (que codifica uma das as sub-unidades da acetil-CoA carboxilase). E mais especialmente ainda, o fragmento LHRR corresponde aos nucleotídeos de 57764 a 59291 do plastoma do tabaco (Shinozaki et al., 1986 - GenBank Z00044). O fragmento RHRR corresponde aos nucleotídeos de 59299 a 60536 do plastoma do tabaco.

Para obter a transformação do plastídio, o DNA modificado necessita atravessar a parede celular, a membrana plasmática e dupla membrana da organela antes de atingir o estroma. Neste aspeto, a técnica mais comumente utilizada para a transformação do genoma do plastídio é a de bombardeamento de partículas (Svab e Maliga, 1993, Proc. Natl.. Acad. Sci. USA., 1 de Fevereiro, 90 (3) :913-917).

A transfecção de plastídios usando microprojéteis de alta velocidade foi primeiramente realizada na alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii (Boynton et al., 1988). Atualmente, nas plantas superiores, a transformação estável de plastídios é comumente realizada no tabaco, Nicotiana tabacum (Svab e Maliga, 1990, Proc. Natl.. Acad. Sei. USA. 87, 8526- 8530; Svab e Maliga, 1993, Proc. Natl.. Acad. Sei. USA., 1 de Fevereiro, 90 (3) :913-917). Transformação de plastídios de arroz (Khan e Maliga MS, 1999, A/aí. Biotechnol. 17, 910-915), de Arabidopsis thaliana (Sikdar et al., 1998, Plant Cell Reports 18:20-24), de batata (Sidorov et al, 1999, Plant J. 19 (2) :209-216), de Brassica napus (Chaudhuri et al., 1999, documento WO 00/39313) e de tomate (Ruf et al., 2001, Nat Biotechnol. 19, 870-875) têm sido relatadas. Plantas transplastômicas férteis foram obtidas para o tabaco, tomate, batata e soja (documento WO 04/053133). Recentemente, a transformação dos plastídios da lentilha-d'água foi relatada (documento WO 05/005643).

Um marcador seletivo pode ser usado para selecionar plastídios e células transformadas, ou seja, aquelas que têm incorporado o(s) gene(s) quimérico(s) em seu plastoma (ou seja, células transplastômicas), e o marcador também torna possível a obtenção de plantas transplastômicas férteis. O termo "homoplasmico" significa que todas as células contem o mesmo tipo de plastoma e que somente aquele plastoma. Plantas transplastômicas são homoplasmicas quando todas as suas células contêm apenas cópias do plastoma transformado.

Entre os genes que podem ser utilizados como marcadores seletivos, a título de exemplo, uma menção especial pode ser feito a dois genes quiméricos, isto é, o gene aadA que codifica para um aminoglicosídeo3"-adeniltransferase que confere resistência a espectinomicina e streptomicina (Savb et al., 1993, Proc. Natl.. Acad. Sci 90:913-917), e gene neo que codifica uma neomicina fosfotransferase (Carrer et al., 1993, Mol. Gen. Genet. 241:49-56) que confere resistência a canamicina. Outros candidatos a marcador seletivo adequados incluem genes que conferem resistência a betaína aldeído, como o gene que codifica a betaína aldeído desidrogenase (Daniell et ai, 2001, Curr. Genet. 39:109-116), e também genes que confere tolerância a herbicidas, como o gene bar (White et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18 (4): 1062) que confere resistência a bialaphos, e o gene EPSPS (Patente US 5.188.642) que confere resistência ao glifosato. Alternativamente, genes repórter podem ser utilizados, isto é, genes que codificam para identificar enzimas facilmente como GUS (β-glucuronidase) (Staub JM e Maliga P., 1993, EMBO J. 12, 601-606) ou a proteína verde fluorescente (GFP, Sidorov et al., 1999, Plant J. 19 (2) :209-216), genes que codificam pigmentos, ou para as enzimas que regulam a produção de pigmentos. Esses genes estão descritos nos pedidos de patentes WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, WO 97/04130 e WO 01/64023.

O gene que codifica o marcador seletivo pode ser o gene aadA que codifica para um aminoglicosídeo 3"-adeniltransferase que confere resistência a espectinomicina e streptomicina (Svab et ai, 1993, Proc. Natl..

Acad. Sei. 90:913-917).

A presente invenção refere-se, portanto, a células vegetais transplastômicas, ou plantas transplastômicas e/ou progênies destas, tendo integrado em seu plastoma uma molécula do ácido nucléico contendo uma ligação a outra, de modo funcional na direção da transcrição de uma seqüência promotora que está ativa em plastídios, seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente com uma seqüência heteróloga de ácido nucléico que codifica um peptídeo, e, opcionalmente, um terminador, que está ativo nos plastídios das células vegetais.

Em um exemplo de realização da presente invenção, a seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo que é fundido com a seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano, é derivada de um organismo eucarioto.

A presente invenção também está relacionada a uma planta transplastômica e/ou progênies, que é uma Lemnaceae, uma planta do gênero Nicotiana, uma planta de batata, uma planta tomate, uma planta de soja, uma planta de canola ou de colza, uma planta de algodão, uma planta de arroz ou uma alga.

Em um exemplo de realização, a planta transplastômica da invenção é uma planta de tabaco.

Em outro exemplo de realização, a presente invenção relaciona- se a partes cultiváveis de plantas, de acordo com a invenção, tais como folhas, em que estas partes contêm células vegetais cultiváveis, de acordo com a invenção.

A presente invenção também relaciona-se a um método para a produção de plantas transplastômicas de acordo com a invenção, onde: a) uma célula vegetal é transformada com pelo menos um gene quimérico que inclui, uma ligação a outra, de modo funcional na direção da transcrição, uma seqüência promotora de gene de planta plastômica, uma seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente com uma seqüência de ácido nucléico heteróloga que codifica um peptídeo e, opcionalmente, um terminador, que está ativo nos plastídios das células vegetais.

b) é uma planta regenerada a partir de uma célula vegetal obtida na etapa a); e

c) se necessário, as plantas são produzidas a partir das plantas obtidas na etapa b).

A célula vegetal obtida na etapa a), pode ser regenerada para a planta inteira, de acordo com métodos conhecidos pelos hábeis na técnica como, por exemplo, utilizando os métodos descritos em "Plant Cell Culture Protocols", 1999, editado por RD Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2.

A produção de plantas adicionais de acordo com a etapa (c), do método de acordo com a invenção pode ser realizada, por exemplo, na propagação vegetativa (por exemplo, utilizando estaquia, tubérculos ou por meio da cultura de calos e regeneração da planta inteira) ou pela propagação sexuada. Aqui, a propagação sexuada ocorre preferencialmente sob condições controladas, ou seja, selecionado plantas com características particulares são cruzadas e propagadas com outra.

A presente invenção relaciona-se adicionalmente a um método de produção de um peptídeo de interesse no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal transplastômica compreendendo as seguintes etapas:

a) introduzindo um gene quimérico na célula vegetal que inclui: - um promotor de um gene de planta plastômica, operavelmente ligado a uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente a uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica o dito peptídeo de interesse, e

-opcionalmente um terminador, que está ativo nos plastídios de células vegetais, resultando em uma célula vegetal transplastômica;

b) colocando a célula vegetal transplastômica sob as condições que permitam a expressão do gene quimérico, e a subseqüente clivagem do peptídeo sinal.

A presente invenção diz respeito também a um método de produção de uma planta transplastômica que expressa um peptídeo de interesse no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal transplastômica compreendendo das seguintes etapas:

a)introduzindo em uma célula vegetal uma construção que contém:

-um promotor de um gene plastômico vegetal, operavelmente ligado a

-uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente a uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica o dito peptídeo de interesse; e

-opcionalmente um terminador, que está ativo nos plastídios de células vegetais, resultando em uma célula vegetal transplastômica;

b)colocando a célula vegetal transplastômica sob as condições que permitam a transcrição do gene quimérico, e a subseqüente clivagem do peptídeo sinal; e

c)selecionado a célula vegetal transplastômica.

Em um exemplo de realização, o método descrito acima engloba a etapa adicional de regeneração de uma planta a partir da célula vegetal transplastômica.

Em um exemplo de realização da presente invenção, a seqüência de ácido nucléico que codifica o peptídeo sinal bacteriano nos métodos descritos acima, é fundido transacionalmente com uma seqüência de ácido nucléico heteróloga que codifica o dito peptídeo de interesse, o que significa que esta segunda seqüência de ácido nucléico não está fundida naturalmente ao ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano.

Em um exemplo de realização da presente invenção, o peptídeo de interesse produzido no lúmen do tilacóide da célula vegetal transplastômica utilizando os métodos descritos acima, é um peptídeo N-terminal não- metionina.

A presente invenção refere-se ainda ao método acima descrito para produção de um peptídeo N-terminal não-metionina em um plastídio vegetal, no qual a proteína N-terminal não-metionina é a aprotinina, ou um hormônio do crescimento humano.

A invenção relaciona-se ainda a um método para a obtenção de um peptídeo ou proteína de interesse contendo uma ligação de dissulfeto no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal transplastômica, compreendendo as

seguintes etapas:

a) introduzindo um gene quimérico na célula vegetal que inclui:

- um promotor de um gene de planta plastômica, operavelmente

ligado a

- uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente a uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica o dito peptídeo de interesse, e

- opcionalmente um terminador, que está ativo nos plastídios de células vegetais, resultando em uma célula vegetal transplastômica;

b) colocando a célula vegetal transplastômica sob as condições que permitam a expressão do gene quimérico, e a subseqüente clivagem do peptídeo sinal. Em um exemplo de realização da presente invenção, a seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano é fundido transacionalmente com uma seqüência de ácido nucléico heteróloga que

codifica o dito peptídeo de interesse.

O hormônio do crescimento humano, a toxina B da cólera, albumina humana, anticorpos de cadeia única, interferon alfa humano ou fosfatase alcalina, são exemplos de peptídeos contendo ligações de dissulfeto, que podem ser obtidos através dos meios e métodos da presente invenção.

A presente invenção refere-se ainda a um método para produção de um peptídeo de interesse que inclui a etapa de extração do peptídeo de interesse de uma célula vegetal transplastômica, de acordo com a invenção, ou a partir de uma planta transplastômica e/ou progênies desta, de acordo com a presente invenção, ou a partir de partes cultiváveis de uma planta transplastômica de acordo com a presente invenção.

A presente invenção refere-se ainda um método para produzir um peptídeo de interesse compreendendo as seguintes etapas:

a) produzindo o dito peptídeo de interesse no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal transplastômica utilizando o método definido acima, e

b) extraindo o peptídeo de interesse a partir da dita célula vegetal

transplastômica.

A presente invenção refere-se ainda a um método para produzir um peptídeo de interesse compreendendo as seguintes etapas:

a) produzindo uma planta transplastômica que expressa o dito peptídeo de interesse no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal

transplastômica utilizando o método definido acima, e

b) extraindo o peptídeo de interesse a partir da dita célula vegetal

transplastômica. Preferencialmente, este método também inclui a etapa de colheita das plantas cultivadas e/ou partes de plantas, tais como as folhas, antes de extrair o peptídeo de interesse. Mais preferencialmente, inclui ainda a etapa de cultivo das plantas da presente invenção antes da colheita.

Em um exemplo de realização da presente invenção, a seqüência de ácido nucléico que codifica o peptídeo sinal bacteriano utilizado nos métodos descritos acima compreende a seqüência determinada como SEQ ID No 1 ou tem uma identidade de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70 %, 80%, 90% ou 95% com a seqüência de ácido nucléico determinada como SEQ ID No 1.

Em um exemplo de realização da presente invenção, a seqüência de ácido nucléico que codifica o peptídeo sinal bacteriano utilizado nos métodos descritos acima compreende a seqüência de ácidos nucléicos que codifica a seqüência de aminoácidos determinada como SEQ ID No 2 ou codifica uma seqüência de aminoácido do peptídeo que tem uma identidade de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou 95% com a seqüência de aminoácidos determina como SEQ ID No: 2;

Como revelado pelos seguintes exemplos, que não são de forma alguma limitantes, foi obtida a inesperada e notável expressão e atividade específica da proteína de interesse utilizando os métodos e meios da presente invenção.

Exemplo 1

construção de Vetores de Transformação Contendo o Gene da Fosfatase

Alcalina com ou Sem um Peptídeo Sinal Bacteriano

A seqüência phoA incluindo o peptídeo sinal bacteriano direcionador de proteína para o periplasma (PhoA-L) foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico da E.coli DH5a com os primers da EP-PhoA C (5'- ttatttcagccccagagcgg-3') e EP-PhoATP N (S^tgaaacaaagcactattgcactggc-S'). O fragmento amplificado foi clonado em pCR4Blunt-Topo (Invitrogen) para se obter o plasmídeo (pEPA53) e, em seguida, clonado no plasmídeo pAPR04 para formar um vetor de expressão cloroplástica do tabaco pCLT 516. O plasmídeo pAPR04 é um vetor de transformação do plastídio que carrega um cassete de expressão heteróloga com um gene (aadA) que confere resistência a espectinomicina como um gene marcador de seleção, o promotor psbA (PpsbA) e o terminador do tabaco rbcL. Este vetor permite a integração direcionada do transgene entre os genes do plastídio rbcL e accD do tabaco. As regiões de recombinação homóloga da esquerda e da direita (LHRR e RHRR) correspondem ao fragmento do plastoma do tabaco de 57769 a 59296, e de 59304 a 60540, respectivamente (GenBank Z00044; Shinozaki et ai, 1986, EMBO J. 5:2043-2049).

O gene phoA sem o peptídeo sinal bacteriano (PhoA-S) também foi amplificado por PCR do DNA genômico da E.coli DH5a com os primers EP- PhoA C e PE-PhoA N (S^gggtcatgaggacaccagaaatgcctgt-S'). O fragmento amplificado foi clonado em um pCR4Blunt-Topo e posteriormente clonado no vetor pCLT516 deletando o peptídeo sinal em frente do gene phoA, para construir o vetor de expressão cloroplástico do tabaco pCLT 515.

Exemplo 2

Transformação. Seleção ε Regeneração de Plantas Transplastômicas de Tabaco

A Transformação de plastídio e seleção de plantas foram realizadas conforme descrito por Svab e Maliga (1993, Proc. Natl.. Acad. Sei. USA, 90: 913-917). Resumidamente, plantas tabacos estéreis foram cultivadas em meio sólido MS com 30g/l de sacarose. A transformação foi realizada bombardeando folhas desta planta com 4,5 semanas de idade com partículas de ouro revestidas com plasmídeos pCLT515 e pCLT516 usando uma arma "geradora de fluxo de partícula" (Finer et al., 1992, Rep Plant Cell, 11: 323- 328). Após a incubação a 24°C no meio MS por dois dias, as folhas bombardeadas foram cortadas em pequenos pedaços (~ 1 cm χ 1cm) e, em seguida, submetidos a ciclos de seleção em meio MS contendo 500Mg/ml de espectinomicina. Os brotos resistentes a espectinomicina obtidos após cerca de seis semanas foram transplantados em uma estufa.

Os eventos selecionados correspondentes aos vetores pCLT515 e pCLT516 foram fenotipicamente indistinguíveis do tabaco do tipo selvagem e totalmente férteis.

Exemplo 3 Analise de PCR ε Southern Blot A extração do DNA total das plantas na gerações TO1 T1 e T2, foi realizada utilizando o kit DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf1 França). Plantas supostamente transgênicas foram testadas por PCR com diferentes conjuntos de primers: (1) aadA + (õ^tatggatcccgaagcggtgatc-S') / (2) aadA-(5'- gatcgctagattatttgccgcta-3'), (5) orbcL52 (5'- atgtcaccacaaacacagactaaagc-3'), e (6) aadAIOR (5'-gttgatacttcggcgatcaccgttto3'), ambos os conjuntos concebidos para determinar se a integração dos genes externos tinham ocorrido no genoma do cloroplasto no sítio direcionado pela recombinação homóloga, e (3) EP-PhoA-1337F (5'-gcatgccgccaatgttgttg-3') / (4) AccD-V (5'- actgcccattgattatttagccc3') para demonstrar a presença do gene phoA nas linhagens transgênicas, como descrito na Figura 1. As reações de PCR foram realizadas em um termociclador MJ Research usando a mistura de reação

READYMIX Taq PCR Reaction Mix (Sigma).

Para a análise por Southern blot 5pg de DNA total foram digeridos com Hindlll, separados em gel agarose 0,8% e transferido para uma membrana de nylon. As sondas utilizadas para a análise de Southern blot, representado na figura 1, foram amplificadas utilizando os pares primer. (i) 5'- gtagagagccgtttatgaatgtcttcg-3' e 5'-aaggatgtcctaaagttcctccacc-3' para rbcL, (ii)5'-gaagcggtgatcgccgaag-3' e Sl-WatttgccgactaccttggtgatctcgcoS' para aadA, (iii) .5'-ttatttcagccccagagcgg-3' e 5-gggtcatgaggacaccagaaatgcctgt -3' para a phoA e phoATP. Os fragmentos da PCR foram purificados utilizando o kit de purificação de PCR "PCR purification Kif (Qiagen), e foram radiomarcados com 32P por priming aleatório com o kit "MEGAPRIME Kit' (Qiagen). As membranas foram lavadas com as soluções 6XSSC, 2XSSC 0,1% SDS e O1IXSSC 1% SDS1 a 65°C. Autoradiogramas foram obtidos após 2h de exposição, a uma temperatura de cerca de -80 °C, com a tela de intensificação.

Um fragmento único de DNA com cerca de 7 kb é detectado como o esperado para os eventos de transformação, o que confirma a integração do transgene no Iocus predito entre os genes accD e rbcL no plastoma. Não foi detectado com essa sonda sinal com um peso molecular maior que, cerca de 11500 pb, como esperado para o plastoma do tipo selvagem, o que confirma a fase homoplasmica do material analisado. A sonda PhoA revela uma grande banda de cerca de 8 kb, como esperado para as amostras transgênicas, o que mostra que o gene da fosfatase alcalina está presente no genoma do plastídio dessa linhagem. Finalmente, nenhuma diferença foi observada entre as amostras nas gerações TO, T1 e T2, mostrando que os transgenes introduzidos são herdados de forma estável.

A expressão de PhoA e de todo o comprimento de SP-PhoA poderiam ser facilmente detectadas em géis-2D pela coloração total de proteínas com prata. A expressão da SP-PhoA é drasticamente superior a da PhoA estromal e, no mesmo nível que a grande subunidade Rubisco, a mais abundante proteína das folhas.

Exemplo 4

Analise por Western Blot ε Eletroforese Bidimensional em gel

Folhas transformadas e não transformadas foram congeladas em nitrogênio líquido e trituradas em um pó fino. O tampão de extração de proteína (Tris-HCI 50mM, EDTA mM, DTT 1mM e inibidor de protease - Mini Protease inhibitor cocktail tablets, Roche) foi adicionado ao pó, e incubado no gelo durante 20 minutos. A mistura foi centrifugada a 4 0C a 13000g durante 5 min. O sobrenadante, contendo proteínas totais solúveis, foi retirado e concentração protéica de cada amostra foi determinada utilizando o kit reagente 'iBradford Protein Assay Reagent kit' (Bio-Rad). Uma alíquota da amostra foi retirada, combinada com o tampão de teste contendo tampão mercaptoetanol, foi fervida e, em seguida, correu em gel SDS-PAGE 12%. As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, utilizando um aparelho de electroblotting líquido (Mini-Protean 3 Cell, Bio-Rad). Após duas horas de saturação à temperatura ambiente com tampão TTBS (10X TBS da Bio-Rad, tween 0,1%, Bio-Rad, pH 7,5) contendo o reagente de bloqueio do western (Roche), as membranas foram lavadas três vezes com tampão TTBS e incubadas overnight a 4 0C com tampão TTBS contendo anticorpo monoclonal suscitados em camundongos contra a fosfatase alcalina (mouse anti-fosfatase alcalina de Escherichia coli, mAb1012, Chemicon internacional). Após três lavagens em tampão TTBS, as membranas foram incubadas por duas horas em temperatura ambiente com tampão TTBS contendo anticorpos secundários suscitados em caprinos contra IgGs de camundongo, (anti- IgG de camundongo conjugado com fosfatase alcalina, Sigma). As membranas foram reveladas após três lavagens em tampão TTBS e uma lavagem em tampão TBS, com conjunto de substratos Immun Star™ -AP (Bio-Rad) sobre um

Hyperfilm™ ECL (Amersham).

PAGE nativa (sem SDS) foi realizada na mesma condição, com proteínas totais de folhas extraídas em tampão Tris-HCI 50mM suplementado com inibidor de protease (Mini Protease inhibitor cocktail tablets, sem EDTA, Roche). As proteínas não foram fervidas e o mercaptoetanol não foi adicionado a amostra antes do carregamento.

As proteínas foram analisadas por eletroforese em gel bidimensional utilizando técnicas descritas anteriormente (Rajjou et ai, 2004, PIantPhysioI., 134: 1598-1613; Job et al, 2005, Plant physiol. 38 (2): 790-802). As proteínas totais solúveis (150Mg) extraídas de plastídios transformados de folhas de tabaco TO foram separadas usando fitas de gel formando um gradiente de pH imobilizado de pH não-linear de 3 a 10 (Immobiline Dry Strip pH 3-10 NL1 18 cm; Amersham Biosciences). A eletroforese bidimensional foi realizada em gel de SDS-poliacrilamida 10%. As proteínas foram reveladas pela coloração do gel com azul de Coomassie (Pierce) ou transferido para uma membrana de immunoblotting procedida como descrito anteriormente para a análise de Western blot.

Exemplo 5

Ensaio de Atividade In Vitro ε In Vivo

A atividade da fosfatase alcalina foi detectada usando o substrato NBT/BCIP (pastilhas de NBT / BCIP prontas para o uso, Roche). 5-bromo-4- cloro-3-indolil fosfato (BCIP), em combinação com Azul de p-nitro tetrazólio (NBT) produz um precipitado intenso, insolúvel em preto-roxo na presença da fosfatase alcalina. A reação NBT / BCIP prossegue a uma velocidade constante, permitindo o controle preciso da sensibilidade relativa e controle do desenvolvimento da reação.

Um comprimido de NBT/BCIP em 10 ml de água estéril foi utilizado diretamente sobre membranas PVDF e o sinal de PhoA foi revelado após 20 minutos de incubação no escuro em temperatura ambiente.

As cepas bacterianas expressando tanto a PhoA quanto a SP- phoA foram cultivadas overnight a 37°C em meio sólido LB suplementado com antibiótico (500ug/ml de espectinomicina) e com NBT-BCIP (uma pastilha para 500ml em meio LB). Para o ensaio nas plantas transformadas com phoA ou SPphoA, fragmentos de folhas de tabaco foram incubadas overnight a 37°C em 10 ml de água estéril suplementada com NBT-BCIP (200μΙ a 20mg/ml). Os resultados demonstram que uma forte atividade da fosfatase alcalina foi detectada na linhagem de tabaco transgênica expressando todo a proteína SP- PhoA de comprimento total. A atividade da PhoA é claramente detectada, mas em um nível inferior a da PhoA-SP. Exemplo 6

Estimativa da Proteína Ativa Total O ensaio da hidrólise do pNPP da fosfatase alcalina - O ensaio foi realizado pela mistura em cada poço, de uma placa de 96 poços, de 260μΙ de Glicina IOOmM1 1mM MgCI2, 1mM de ZnCI2 e diferentes concentrações de proteínas totais extraídas na condição nativa de bactérias e plantas transformadas, tanto com pCLT515 quanto com pCLT516. O volume final foi ajustado para 280μΙ com tampão p- nitrofenil fosfato (pNPP, 1 pastilha diluída em 5 ml de água esterilizada, Sigma), que inicia a reação. O ensaio foi lido contra o branco a 405 nm em um espectrofotômetro Beckman Coulter AD340. O resultado foi obtido através da equação:

Unidades de atividade de PhoA/mL = (M4tWmin do teste - M4CWTiin do branco) χ (volume total da reação em mL)18,5 x (volume da enzima utilizada em mL)18,5: coeficiente de extinção Milimolar do pNPP a 405 nm. Unidades de phoA/mg de proteína total = (Unidades/ml) / (mg de

proteína/ml de enzima).

Quantificação da phoA expressa nas bactérias e plantas - As proteínas extraídas foram carregados em SDS-PAGE 12%, a revelação do sinal da phoA foi realizada diretamente sobre membranas PVDF com substratos Immun Star™ -AP por quimiluminescência. A concentração protéica para cada amostra (mg de phoA / mg de proteína total) foi determinada nas membranas reveladas usando o software uQuantity one software" disponível pela Bio-Rad.

Atividade específica - Para o cálculo da atividade específica de phoA usamos tanto a atividade de pNPP e quanto a quantificação da atividade phoA. Com a relação entre os dois resultados nós obtivemos a quantidade de atividade de phoA para uma determinada quantidade de phoA expressa nas linhagens transformadas. Estes resultados mostram que a SP-PhoA não só é mais alta do que PhoA expressa em cloroplastos, mas que também é expressa de forma mais ativa, que tem um número significativamente maior de atividade específica, semelhante à encontrada para SP-PhoA no periplasma bacteriano.

Exemplo 7

Localização da Proteína

Fracionamento do cloroplasto - As folhas de tabaco foram misturadas por duas vezes durante 2-3 s em 330 mM de sorbitol 50mM Hepes- KOH (pH 7,8), KCl 10 mM, EDTA 1 mM, 0,15% (p/v) de albumina de soro bovino, ascorbato de sódio 4 mM, e cisteína 7 mM. A mistura resultante foi filtrada através de três camadas de malha náilon (20 urn), o filtrado foi centrifugado por 20 min a 3000rpm a 4 °C. Os pellets foram ressuspendidos em 25 ml de sorbitol 330 mM, Hepes-KOH 50 mM (pH 7,8), KCl 10 mM, centrifugados por 20 minutos a 3000rpm a 4 ° C, e ressuspendidos em 25 ml do mesmo tampão. A suspensão obtida foi superimposta sobre duas fases de um gradiente de Percoll (8ml de 40%, 4ml de 80%). Os gradientes foram centrifugados a 3700 rpm durante 10 minutos a uma temperatura de 4 °C. A menor banda verde contendo plastídios foi coletada intacta e diluída em tampão pirofosfato de sódio 10 mM (pH 7,8). As tilacóides foram coletadas, em seguida, por centrifugação em um gradiente de sacarose (15 ml de sacarose 0,6 M) a 15000 rpm durante 10 minutos a 4°C. O sobrenadante contendo o extrato estromal foi separado do sedimento contendo cloroplastos intactos. O último foi lavado duas vezes com cada um dos seguintes tampões: (i) pirofosfato de sódio 10 mM (pH 7,8) para remover as proteínas estromais residuais; (ii) Tricina 2 mM (pH 7,8), sacarose 300 mM para remover proteínas da membrana tilacóide extrínsecas não identificadas, e (iii) fosfato de sódio 30 mM (pH 7,8), NaCI 50 mM, MgCI2 5 mM e sacarose 100 mM (tampão de fragmentação). As tilacóides intactas foram ainda fracionadas por sonicação sobre gelo, três vezes por 10 s cada. As O tilacóides sonicadas foram então centrifugadas por 5 minutos em uma centrífuga da marca Eppendorf a 4 0C para remover as tilacóides intactas, e membranas tilacóides foram separadas do extrato do lúmen por ultracentrifugação do sobrenadante.

Localização da fosfatase alcalina - Todas as frações obtidas foram submetidas à análise de Western blot usando anticorpos tanto contra proteína Iuminal solúvel do plastídio TL 29 (anticorpo utilizado em uma diluição de até 1/10000), quanto contra a proteína estromal solúvel KARI (usado na diluição de 1/10000) e fosfatase alcalina (usado como descrito anteriormente).

Nossos resultados mostram que PhoA e SP-PhoA não têm a mesma distribuição dentro dos cloroplastos. PhoA é essencialmente detectada no compartimento estromal, como esperado. Uma proporção substancial da SP-PhoA é detectada na fração do lúmen do tilacóide, o que mostra que o peptídeo sinal bacteriano é capaz de realizar a translocação da fosfatase alcalina em toda a membrana tilacóide. A maior atividade específica da SP PhoA é, portanto, atribuída a localização da enzima presente no lúmen do tilacóide, que é mais apropriado do que no estroma para o alto nível de acúmulo de enzima ativas e com o dobramento globular correto.

Exemplo 8

Direcionamento da Porteína Heteróloga GUS para o Lúmen do Tilacóide

Foi realizada uma fusão gênica entre o peptídeo sinal da fosfatase alcalina e da enzima "repórter" GUS (beta-glucuronidase da E. coli). Um gene sintético (SEQ ID No 3), foi organizado para o qual contém a partir da extremidade 5' para 3' a seqüência do peptídeo sinal da fosfatase alcalina, iniciando no segundo códon (códon que codifica a metionina N-terminal do peptídeo sinal será restabelecido pela clonagem dentro do vetor de transformação final) fundido com a seqüência 5' do gene GUS, a partir do segundo códon (GTC para Valina) para o sítio de restrição do Mscl. Esta seqüência foi inserida no vetor de clonagem pCR-TOPO-Blunt (Invitrogen), formando um vetor pCLT-PhoA-GUS Nter. O fragmento clonado de 337 pb obtido após a restrição com Dral e Mscl, foi em seguida clonado no vetor de transformação do plastídio do tabaco pCLT194 digerido com Ncol (completo) e Mscl. O vetor de transformação do tabaco pCLT-PhoA-GUS contém a fusão translacional entre o peptídeo sinal da fosfatase alcalina (PhoA) e região codificante do GUS. No pCLT194, esta fase de leitura aberta é colocada sob o controle do promotor psbA do plastídio do tabaco e direciona o GUS recombinante para o lúmen tilacóide, enquanto que a GUS expressa a partir do pCLT194 nos plastídios de tabaco transformados se acumula no estroma. Phoeni xTemp7588.tmp.txt I,ISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Bayer CropScience SA <120> PLANTAS TRANSPLASTÔMICAS QUE EXPRESSAM PROTEÍNA LÚMEN-ESPECÍFICA <130> BCS 06-4009 <160> 18 <170> Patentln version 3.3

<210> 1 <211> 63 <212> DNA

<213> Escheria Coli

<221> Sig-PePtideo <222> (1) · · (12)

gtgaaacaaa gcactattgc actggcactc ttaccgttac tgtttacccc tgtgacaaaa 60 gcc 63

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> Escheria Coli

<220> sinal <221> <222> (1)..(21)

<400> 2

Met Lys Gln Ser Thr He Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr .1 5 10 15

Pro Val Thr Lys Ala 20

<210> 3

<211> 685

<212> DNA

<213> Artificial

kAI0Z Seqüência sintética que compreende uma seqüência truncada que codifica o peptídeo sinal phoA do E. Coli fundido ao gene beta-glucuronidase truncado do

E. Coli

<400> 3 tttaaacaaa gcactattgc actggcactc ttaccgttac tgtttacccc tgtgacaaaa 60 gccgtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 120 ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 180 gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 240 cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 300 .4 ·

ggccagcgta tcgtgctgcg PhoenixTemp7588 tttcgatgcg gtcactcatt .tmp.txt acggcaaagt gtgggtcaat360 aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 420 tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 480 cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 540 ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 600 aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 660 tctgttgact ggcaggtggt ggcca 685

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 4 20

ttatttcagc cccagagcgg

<210> 5

<211> 2 5 <212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 5 25

tgaaacaaag cactattgca ctggc

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 6 28

gggtcatgag gacaccagaa atgcctgt

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22 Β> primer

<400> 7 22

tatggatccc gaagcggtga tc

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220> Phoem' xTemp7588. tmp. txt

<223> primer

<400> 8 gatcgctaga ttatttgccg cta

<210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> primer

<400> 9 atgtcaccac aaacacagac taaagc

<210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> primer

<400> 10 gttgatactt cggcgatcac cgtttc

<210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> primer

<400> 11 gcatgccgcc aatgttgttg

<210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> primer

<400> 12 actgcccatt gattatttag ccc

<210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> primer

<400> 13 gtagagagcc gtttatgaat gtcttcg

<210> 14 <211> 25 <212> DNA PhoenixTemp7588.tmp.txt

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 14

aaggatgtcc taaagttcct ccacc

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 15

gaagcggtga tcgccgaag

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 16

ttatttgccg actaccttgg tgatctcgcc

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 17

ttatttcagc cccagagcgg

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 18

gggtcatgag gacaccagaa atgcctgt

Claims (17)

1. GENE QUIMÉRICO, ligado a outro de modo funcional na direção da transcrição, compreendendo: a) um promotor de um gene plastômico vegetal, b) um ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente com, c) uma seqüência de ácido nucléico heteróloga que codifica um peptídeo de interesse, e d) opcionalmente, um terminador, que está ativo nos plastídios das células vegetais.

2. VETOR, designado para a transformação de plastídios vegetais, o qual contém, pelo menos, duas seqüências, no qual as ditas seqüências homólogas flaqueiam pelo menos um gene quimérico, de acordo com a reivindicação 1.

3. CÉLULA VEGETAL TRANSPLASTÔMICA, a qual contém pelo menos um gene quimérico, de acordo com a reivindicação 1.

4. PLANTA TRANSPLASTÔMICA E/OU PROGÊNIE DESTA, em que a planta transplastômica compreende uma célula vegetal de acordo com a reivindicação 3.

5. PLANTA TRANSPLASTÔMICA E/OU PROGÊNIE DESTA, de acordo com a reivindicação 4, a qual é uma alga, uma Lemnaceae, uma planta do gênero Nicotiana, uma planta de batata, tomate, colza, canola, arroz, algodão ou soja.

6. PARTES CULTIVÁVEIS DE UMA PLANTA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, compreendendo células vegetais transplastômica de acordo com a reivindicação 3.

7. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSPLASTÔMICA E/OU PROGÊNIE DESTA, de acordo com a compreendendo: a) uma célula vegetal é transformada com pelo menos um gene quimérico que inclui, ligação a outro de modo funcional na direção da transcrição, uma seqüência promotora que está ativa no plastídio, uma seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente com uma seqüência de ácido nucléico heteróloga que codifica um peptídeo e, opcionalmente, um terminador, que está ativo nos plastídios das células vegetais. b) uma planta é regenerada a partir de uma célula vegetal obtida na etapa a); e c) opcionalmente, plantas adicionais são produzidas a partir das plantas obtidas na etapa b).

8. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM PEPTÍDEO, de interesse no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal transplastômica, compreendendo as seguintes etapas: a) introduzindo um gene quimérico na célula vegetal que compreende: - um promotor que é funcional em um plastídio vegetal, operavelmente ligado a - uma seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente a uma seqüência de ácido nucléico que codifica o dito peptídeo de interesse, e - opcionalmente um terminador, que é ativo nos plastídios de células vegetais, resultando em uma célula vegetal transplastômica; b) colocando a célula vegetal transplastômica sob as condições que permitam a expressão do gene quimérico, e a subseqüente clivagem do peptídeo sinal.

9. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSPLASTÔMICA, que expressa um peptídeo de interesse no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal transplastômica, compreendendo as seguintes etapas: a) introduzindo em uma célula vegetal uma construção que contém: - um promotor que é funcional em um plastídio vegetal, operavelmente ligado a; - uma seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente a uma seqüência de ácido nucléico que codifica o dito peptídeo de interesse; e - opcionalmente um terminador, que está ativo nos plastídios de células vegetais, resultando em uma célula vegetal transplastômica; b) colocando a célula vegetal transplastômica sob as condições que permitam a transcrição do gene quimérico, e a subseqüente clivagem do peptídeo sinal; e c) selecionado a célula vegetal transplastômica.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, compreendendo uma etapa adicional de regeneração de uma planta a partir da célula vegetal transplastômica.

11. MÉTODO, de acordo com as reivindicações de 8 a 10, caracterizado pelo fato do dito peptídeo de interesse é um peptídeo N-terminal não-metionina.

12. MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM PEPTÍDEO, de interesse contendo uma ligação de dissulfeto no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal transplastômica, compreendendo as seguintes etapas: a) introduzindo um gene quimérico na célula vegetal que inclui: - um promotor de que é funcional em um plastídio vegetal, operavelmente ligado a - uma seqüência de ácido nucléico que codifica um peptídeo sinal bacteriano fundido transacionalmente a uma seqüência de ácido nucléico que codifica o dito peptídeo de interesse, e - opcionalmente um terminador, que está ativo nos plastídios de células vegetais, resultando em uma célula vegetal transplastômica; b) colocando a célula vegetal transplastômica sob condições que permitam a expressão do gene quimérico, e a subseqüente clivagem do peptídeo sinal.

13. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PEPTÍDEO, de interesse, compreendendo as seguintes etapas: a) produzindo o dito peptídeo de interesse no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal transplastômica utilizando o método definido na reivindicação 8, e b) extraindo o peptídeo de interesse a partir da dita célula vegetal transplastômica.

14. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM PEPTÍDEO, de interesse, compreendendo as seguintes etapas: a) produzindo uma planta transplastômica que expressa o dito peptídeo de interesse no lúmen do tilacóide de uma célula vegetal transplastômica utilizando o método definido na reivindicação 9, e b) extraindo o peptídeo de interesse a partir da dita célula vegetal transplastômica.

15. USO DE UM PEPTÍDEO SINAL BACTERIANO, para expressar a proteína de interesse no lúmen do tilacóide das plantas transplastômicas.

16. USO, de acordo com a reivindicação 16,em que a proteína de interesse é uma proteína contendo cisteínas formando ligações de dissulfeto.

17. USO, de acordo com uma das reivindicações 15 ou 16, em que é utilizado um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1.