ES2614649T3 - Mejoras en o relacionadas con compuestos orgánicos - Google Patents

Abstract

Un método para producir al menos un polipéptido heterólogo o exógeno en una planta o célula vegetal que comprende: 1) introducir en dicha célula vegetal un promotor nuclear vegetal que dirige la expresión en un núcleo de planta de un intrón introducido del grupo II que tiene una primera secuencia aislada de ácido nucleico insertada en el dominio IV de la misma, en donde el intrón introducido del grupo II está unido operativamente a y bajo control regulador del promotor nuclear de la planta y comprende una primera secuencia aislada de ácido nucleico, en donde dicha primera secuencia aislada de ácido nucleico comprende un promotor del plástido vegetal que dirige la expresión en un plástido vegetal y está operativamente unido a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido heterólogo o exógeno; 2) cultivar dicha célula vegetal de (1) en condiciones en las que dicho promotor nuclear de planta dirige la expresión de dicho intrón; 3) seleccionar una célula vegetal de (2) en la que dicha primera secuencia aislada de ácido nucleico está integrada en el genoma del plástido; 4) cultivar la célula vegetal de (3) o una planta regenerada a partir de ella en condiciones en las que dicho promotor del plástido vegetal expresa dicha proteína heteróloga o exógena de dicha segunda secuencia de ácido nucleico de la misma.

Description

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DESCRIPCION

Mejoras en o relacionadas con compuestos organicos

La presente invencion se refiere a un metodo para producir protemas heterologas o exogenas en material de celulas vegetales tal como celulas vegetales transformadas en cultivo o en tejido vegetal derivado de celulas vegetales transformadas. En particular, el metodo se refiere a un metodo para producir protemas en plastidos comprendidos en material de celulas vegetales, el material genetico requerido para ello, tal como ADN y ARN, vectores, celulas huesped, metodos de introduccion de material genetico en celulas vegetales y sus usos.

Una solicitud de patente estadounidense de Biesgen C (numero de publicacion 2006/0253916) se refiere a metodos para la generacion de plantas transgenicas que poseen plastidos geneticamente modificados. La ensenanza tecnica detras de los metodos descritos en la misma no se basa en el uso de un vehmulo de ARN derivado de intron que hace uso de procesos celulares endogenos para la transferencia de ARN desde el citoplasma de la celula hacia el plastido.

Una desventaja de los metodos de transformacion de plastidos del estado de la tecnica es que la eficiencia de transformacion en terminos del numero de plastidos transformados por celula tiende a ser baja y, por tanto, la cantidad de protema exogena producida por celula tiende a ser tambien baja. Otra desventaja de los metodos del estado de la tecnica es que la entrega de informacion genetica en el plastido es desigual. Los metodos del estado de la tecnica no se basan en procesos celulares endogenos para la transferencia de ARN en el genoma del plastido, y como tal, los procedimientos del estado de la tecnica para modificar geneticamente plastidos son generalmente ineficientes. Estas y otras desventajas de la tecnologfa de transformacion de plastidos del estado de la tecnica resultaran evidentes a partir de la descripcion anterior.

Los presentes inventores han encontrado que mediante el uso o adaptacion de procesos celulares endogenos para la transferencia de polinucleotidos, tales como ARN, desde el citoplasma a los plastidos en la celula vegetal, las secuencias de polinucleotidos derivadas de la transformacion nuclear del nucleo de una celula vegetal pueden ser eficientemente transferidas al genoma del plastido, dentro de una celula vegetal que es por lo tanto transformada, y expresada en el plastido de interes como se describe en la presente memoria. Para los propositos de la presente invencion, los terminos "plastido" y "plastidos" y "poblacion de plastidos" se usan indistintamente, a menos que el contexto lo requiera de otra manera. Tambien, para los propositos de la presente invencion, los terminos "celula vegetal" y "celulas vegetales" se usan indistintamente, a menos que el contexto lo requiera de otra manera. Al emplear o adaptar procesos celulares endogenos para la transferencia de ARN al genoma del plastido como se describe en la presente memoria, se considera que el metodo de la invencion es unico en comparacion con los metodos del estado de la tecnica para la generacion de plantas que poseen plastidos geneticamente modificados: la poblacion de plastidos de la celula o de celulas que comprenden tejido vegetal transformado de acuerdo con la presente invencion es bombardeada constantemente por ARN que se deriva del nucleo de la celula, que se transporta desde la membrana del plastido y dentro del genoma del plastido donde se transcribe de forma inversa, se integra y luego se expresa, dando como resultado la generacion de protemas de interes.

Existe la necesidad de un metodo alternativo de transformacion de plastidos para la transformacion de celulas vegetales sobre los del estado de la tecnica.

La base de la presente invencion, que no parece haberse realizado en la tecnica anterior, es insertar al menos una secuencia de polinucleotidos de interes en un sitio adecuado de un dominio de un intron, o en sitios adecuados dentro de los dominios de varios intrones, ya sea de origen bacteriano o de plastido, o tanto de origen bacteriano como de plastido, tal como un intron del grupo II, y modificar la insercion del intron modificado en el nucleo de una celula huesped vegetal donde se expresa como ARN. La secuencia de nucleotidos de los intrones de interes en la invencion puede modificarse adicionalmente para eliminar los sitios de empalme ocultos, mejorando asf la expresion en la celula vegetal. El ARN expresado se transfiere entonces al citoplasma en donde se une con una protema multifuncional que lo lleva a la membrana del plastido, donde la secuencia de ARN es transcrita en forma inversa en ADN que luego se inserta en el genoma del plastido donde se expresa entonces la secuencia de polinucleotidos de interes bajo el control de un promotor especifico del plastido, dando lugar a un polipeptido o polipeptidos de interes, dependiendo del diseno.

La presente invencion tambien se refiere a la produccion de celulas vegetales transgenicas y plantas transgenicas que comprenden plastidos que se modifican geneticamente con secuencias de polinucleotidos derivadas de intrones que transportan secuencias de polinucleotidos de interes bajo control operativo de un promotor de plasto de la planta.

De acuerdo con la presente invencion se proporciona un metodo para producir al menos un polipeptido heterologo o exogeno en una planta o una celula vegetal que comprende:

1) introducir en dicha celula vegetal un promotor nuclear vegetal que dirige la expresion en un nucleo de una planta de un intron introducido del grupo II que tiene una primera secuencia aislada de acido nucleico insertada en el dominio IV del mismo, en donde el intron introducido del grupo II esta unido operativamente a y bajo control regulador del promotor

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nuclear de la planta y comprende una primera secuencia aislada de acido nucleico, en donde dicha primera secuencia aislada de acido nucleico comprende un promotor del plastido vegetal que dirige la expresion en un plastido vegetal y esta operativamente unido a una segunda secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido heterologo o exogeno;

2) cultivar dicha celula vegetal de (1) en condiciones en las que dicho promotor nuclear de la planta dirige la expresion de dicho intron;

3) seleccionar una celula vegetal de (2) en donde dicha primera secuencia aislada de acido nucleico esta integrada en el genoma del plastido;

4) cultivar la celula vegetal de (3) o una planta regenerada a partir de ella en condiciones en las que dicho promotor del plastido vegetal expresa dicha protema heterologa o exogena de dicha segunda secuencia de acido nucleico de la misma.

El intron de 1) se deriva de una bacteria, un hongo o un plastido de una planta y se selecciona o se deriva de intrones del grupo II o de versiones modificadas de los mismos en los que se han eliminado sitios ocultos de empalme. El intron del grupo II puede ser el intron Ll.ltrB de Lactococcus lactis o una version modificada de el en la que se han eliminado los sitios de empalme ocultos como se describe aqrn. Los intrones del grupo II estan ampliamente representados en los organelos de las plantas (por ejemplo, 25 intrones en el genoma del plasmido del tabaco) y en hongos, y en bacterias. Los intrones del grupo II utiles en el metodo de la invencion son retroelementos moviles altamente estructurales que codifican protema multifuncional (protema codificada por intron o IEP) que posee actividad de transcriptasa inversa (RT). La IEP facilita el empalme del ARN de intron mediante la estabilizacion de la estructura de ARN catalfticamente activa, realiza la transcripcion inversa y la insercion del intron en sitios objetivo de ADN espedficos del genoma bacteriano a alta frecuencia (Moran y colaboradores (1995) Mol Cell Biol 15: 2828-2838; Cousineau y colaboradores (1998) Cell 94: 451-462).

Los intrones del grupo II de origen bacteriano, tales como los derivados de Lactococcus que comprenden un gen LtrA modificado, se utilizan preferiblemente en el metodo de la invencion. La secuencia de polinucleotidos de LtrA de una bacteria Lactococcus, tal como Lactococcus lactis, puede modificarse para una expresion optima en plantas insertando en ella al menos una secuencia de polinucleotidos que comprende uno o mas intrones de al menos una secuencia de acido nucleico vegetal, tal como de uno o mas genes vegetales y mediante sustitucion de ciertos codones seleccionados con una baja frecuencia de uso en plantas nativas con codones que se producen con mayor frecuencia en dichas plantas. Tfpicamente, se analiza la secuencia bacteriana de interes de LtrA con referencia al uso de codones vegetales usando comparaciones in silico tales como las encontradas en la pagina web
www.kazusa.or.jp/codon para codones bacterianos que se presentan con baja frecuencia en las plantas. Dichos codones pueden ser entonces sustituidos con codones que tienen una alta frecuencia de ocurrencia en plantas, y se genera una secuencia de polinucleotidos modificada derivada in silico. A partir de esta secuencia optimizada de LtrA, se elabora una secuencia sintetica de polinucleotidos de LtrA correspondiente a la secuencia generada in silico usando procedimientos estandar de smtesis de polinucleotidos conocidos en la tecnica y luego se pueden usar en la preparacion de constructos de uso en la presente invencion tal como se describe aqrn. Se cree que mediante el uso de una secuencia modificada que comprende sustituciones de codones vegetales como se ha explicado en terminos generales anteriormente, se generan mas secuencias estables de ARN de polinucleotidos en el ambiente de la celula vegetal.

Otros intrones que pueden usarse en el metodo de la invencion son los que ocurren naturalmente en los plastidos de plantas superiores, especialmente intrones del grupo II, tal como en los genes trnK del genoma del plastido. Los intrones de trnK adecuados se encuentran en los plastidos de Arabidopsis, mafz y tabaco.

Otros tipos de intrones que pueden usarse en el metodo de la invencion incluyen, por ejemplo, el intron rll del grupo II de Scenedesmus obliquus (GenBank Ac. No.: X17375.2 nucleotidos 28831 a 29438, Hollander V y Kuck U (1999) Nucl Acids Res 27: 2339-234; Herdenberger F y colaboradores (1994) Nucl Acids Res 22: 2869-2875, Kuck U y colaboradores (1990) Nucl Acids Res 18: 2691-2697), el intron Ll.ltrB (GenBank Acc. No.: U50902 nucleotidos 2854 a 5345), el intron trnK de Arabidopsis (GenBank Acc. No.: AP000423, nucleotidos complementarios 1752 a 4310) [0222], el intron trnK de mafz (GenBank Acc. No.: X86563, nucleotidos complementarios 1421 a 3909), y el intron trnK del tabaco (GenBank Acc. No.: Z00044, nucleotidos complementarios 1752 a 4310).

Al margen de los intrones heterologos descritos en la presente invencion, se pueden usar intrones endogenos que se encuentran naturalmente en los plastidos de las celulas vegetales de la planta de interes en el metodo de la invencion. Sin embargo, se cree que se prefieren intrones heterologos, tales como intrones trnK, ya que pueden usarse para evitar inestabilidades potenciales provocadas por la duplicacion de secuencias. Los intrones que se presentan naturalmente en los plastos de la planta de interes pueden modificarse de manera que tengan una homologfa de secuencia de aproximadamente 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, o de cualquier porcentaje de homologfa de secuencia entre ellos, con la secuencia del intron de partida, mientras se retiene la funcionalidad, tambien se puede emplear en el metodo de la invencion.

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Un promotor nuclear vegetal (por ejemplo, un promotor especifico de nucleo exogeno) es aquel que denota un promotor que se introduce frente a una secuencia de acido nucleico de interes y se le asocia operativamente con ella. Por lo tanto, un promotor nuclear vegetal es uno que se ha colocado delante de un componente del polinucleotido seleccionado, es decir, el intron introducido del grupo II. De este modo, un promotor puede ser nativo de una celula vegetal de interes, pero puede no estar operativamente asociado con el intron del grupo II de la invencion en una celula vegetal de tipo silvestre. Tfpicamente, un promotor nuclear vegetal, tal como un promotor espedfico de un nucleo exogeno, es uno que se transfiere a una celula huesped o planta huesped desde una fuente distinta a la celula huesped o planta huesped.

Los ADNc que codifican un polinucleotido de la invencion contienen al menos un tipo de promotor que es operable en una celula vegetal, por ejemplo, un promotor inducible o constitutivo unido operativamente a una primera y/o segunda secuencia de acido nucleico o componente de una secuencia de acido nucleico tal como se define aqm y como lo proporciona la presente invencion. Como se ha discutido, esto permite el control de la expresion del polinucleotido de la invencion. La invencion tambien proporciona plantas transformadas con secuencias de polinucleotidos o constructos y metodos que incluyen la introduccion de dichas secuencias o constructos de acidos nucleicos de polinucleotidos en una celula vegetal y/o la induccion de expresion de dicha primera o segunda secuencia o constructo de acido nucleico dentro de una celula vegetal, por ejemplo mediante aplicacion de un estfmulo adecuado, tal como un inductor exogeno eficaz.

El termino "inducible" tal como se aplica a un promotor es bien comprendido por los expertos en la tecnica. En esencia, la expresion bajo el control de un promotor inducible se "enciende" o aumenta en respuesta a un estfmulo aplicado (que puede generarse dentro de una celula o proporcionarse exogenamente). La naturaleza del estfmulo vana entre los promotores. Algunos promotores inducibles causan niveles de expresion bajos o indetectables (o ninguna expresion) en ausencia del estfmulo apropiado. Otros promotores inducibles causan una expresion constitutiva detectable en ausencia del estfmulo. Sea cual sea el nivel de expresion en ausencia del estfmulo, la expresion de cualquier promotor inducible se incrementa en presencia del estfmulo correcto. La situacion preferible es cuando el nivel de expresion aumenta tras la aplicacion del estfmulo pertinente mediante una cantidad eficaz para alterar una caractenstica fenotfpica. Por lo tanto, se puede usar un promotor inducible (o "conmutable") que provoca un nivel basico de expresion en ausencia del estfmulo, cuyo nivel es demasiado bajo para producir un fenotipo deseado (y de hecho puede ser cero). Tras la aplicacion del estfmulo, la expresion se incrementa (o se enciende) hasta un nivel, que produce el fenotipo deseado. Un ejemplo de un promotor inducible es el interruptor genico inducible por etanol revelado en Caddick y colaboradores (1998) Nature Biotechnology 16: 177-180. Se conocen en la tecnica una cantidad promotores inducibles.

Los promotores regulados qmmicamente pueden usarse para modular la expresion de un gen o una secuencia de polinucleotidos de la invencion en una planta mediante la aplicacion de un regulador qrnmico exogeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor qmmicamente inducible, donde la aplicacion del producto qrnmico induce la expresion genica, o un promotor qmmicamente reprimible, donde la aplicacion del producto qrnmico reprime la expresion genica. Los promotores qmmicamente inducibles son conocidos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, el promotor In2-2 del mafz, que es activado por los protectores de herbicidas de bencenosulfonamida, el promotor GST del mafz, que es activado por compuestos electrofflicos hidrofobos que se usan como herbicidas previos a la germinacion, y el promotor pR-1a del tabaco, que es activado por el acido salidlico. Otros promotores regulados qmmicamente de interes incluyen promotores sensibles a esteroides (vease, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en Schena y colaboradores (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 88: 10421-10425 y McNellis y colaboradores (1998) Plant J. 14 (2): 247-257) y promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (vease, por ejemplo, Gatz y colaboradores (1991) Mol. Gen. 227: 229-237 y las patentes estadounidenses Nos. 5.814.618 y 5.789.156), incorporados aqm como referencia.

Cuando se desea mayor expresion en tejidos particulares, se pueden utilizar promotores espedficos del tejido. Los promotores espedficos del tejido incluyen los descritos por Yamamoto y colaboradores (1997) Plant J. 12 (2) 255-265; Kawamata y colaboradores (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7): 792-803; Hansen y colaboradores (1997) Mol. Gen Genet. 254 (3): 337-343; Russell y colaboradores (1997) Transgenic Res. 6 (2): 157-168; Rinehart y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112 (3): 1331-1341; Van Camp y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112 (2): 525-535; Canevascini y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112 (2): 513-524; Yamamoto y colaboradores (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5): 773778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco y colaboradores (1993) Plant Mol Biol. 23 (6): 11291138; Matsuoka y colaboradores (1993) Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90 (20): 9586-9590; y Guevara-Garcia y colaboradores (1993) Plant J. 4 (3): 495-505.

Tambien se pueden usar los denominados promotores constitutivos en los metodos de la presente invencion. Los promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor 35M del CaMV (Odell y colaboradores (1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy y colaboradores (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen y colaboradores (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 y Christensen y colaboradores (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last y colaboradores (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten y colaboradores, (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); promotor ALS (solicitud de patente estadounidense con el numero de serie 08/409.297), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen los de las patentes estadounidenses Nos. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; y 5.608.142.

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La expresion en plastidos se efectua empleando un promotor de plastido vegetal tal como promotores espedficos de plastidos y/o elementos de regulacion de la transcripcion. Los ejemplos incluyen el promotor de ARN polimerasa (WO 97/06250) y otros promotores descritos en la tecnica, por ejemplo en el documento WO 00/07431, patente estadounidense No. 5.877.402, WO 97/06250, WO 98/55595, WO 99/46394, WO 01/42441 y WO 01/07590; el elemento promotor rpoB, el elemento promotor atpB, el elemento promotor clpP (vease tambien WO 99/46394) y el elemento promotor ADNr 16S. El promotor espedfico del plastido puede tener tambien un "operon" policistronico asignado a el (EP-A 1 076 095; WO 00/20611).

Otros promotores que pueden usarse en el metodo de la invencion incluyen tambien el promotor PrbcL, el promotor Prps16 y el promotor Prrn16 descritos en la solicitud de patente estadounidense No. 2006/0253916, los promotores espedficos de plastido Prrn-62, Pycf2-1577, PatpB-289, Prps2-152, Prps16-107, Pycf1-41, PatpI-207, PclpP-511, PclpP-173 y PaccD-129 (WO 97/06250, Hajdukiewicz PTJ y colaboradores (1997) EMbO J 16: 4041-4048), el promotor PaccD-129 del gen accD del tabaco (WO 97/06250), el promotor PclpP-53 del gen clpP como promotor NEP altamente activo en cloroplastos (WO 97/06250), el promotor Prrn-62 del gen rrn, el promotor Prps16-107 del gen rps16, el promotor PatpB/E-290 del gen atpB/E de tabaco (Kapoor S y colaboradores (1997) Plant J 11: 327-337) y el promotor PrpoB-345 del gen rpoB (Liere K y Maliga P (1999) EMBO J 18: 249-257). Ademas, aquellos promotores que pertenecen a la clase III (Hajdukiewicz PTJ y colaboradores (1997) EMBO J 16: 4041-4048) y todos los fragmentos de los promotores de clase II que controlan el inicio de la transcripcion por NEP pueden utilizarse en el metodo de la invencion. Tales promotores o fracciones de promotores no se conocen generalmente por estar altamente conservados. ATAGAATAAA se proporciona como consenso cerca del sitio de inicio de la transcripcion de los promotores NEP (Hajdukiewicz P T J y colaboradores (1997) EMBO J 16: 4041-4048).

Naturalmente, el experto en la tecnica apreciara que las secuencias de ADN terminadoras estaran presentes en los constructos utilizados en la invencion. Se contempla un terminador como una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que indica la terminacion de la transcripcion. Estos elementos son secuencias 3' no traducidas que contienen senales de poliadenilacion, que actuan para provocar la adicion de secuencias de poliadenilato al extremo 3' de los transcritos primarios. Para la expresion en celulas vegetales, la secuencia terminadora transcripcional de nopalina sintasa (A. Depicker y colaboradores, 1982, J. of Mol. & Applied Gen. 1: 561-573) sirve como una senal de terminacion transcripcional.

Los expertos en la tecnica son capaces de construir vectores y disenar protocolos para secuencias de acido nucleico recombinantes o para expresion genica. Se pueden escoger o construir vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilacion, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias segun sea apropiado. Para mas detalles vease, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: segunda edicion, Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas tecnicas y protocolos conocidos para la manipulacion de acido nucleico, por ejemplo en la preparacion de constructos de acido nucleico, mutagenesis, secuenciacion, introduccion de ADN en celulas y expresion genica, y analisis de protemas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, segunda edicion, Ausubel y colaboradores eds., John Wiley & Sons, 1992. Las descripciones de Sambrook y colaboradores y Ausubel y colaboradores se incorporan aqu como referencia. Procedimientos espedficos y vectores previamente utilizados con gran exito en las plantas son descritos por Bevan (Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721 (1984)) y Guerineau y Mullineaux (1993) (Vectores de transformacion y expresion de la planta, en: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed.) Oxford, BIOS Scientific Publishers, paginas 121-148).

Naturalmente, el destinatario experto apreciara que cada intron introducido del grupo II estara bajo control regulador de su propio promotor exogeno y terminador. Cuando dos o mas protemas objetivo estan destinadas a ser producidas a partir de un unico ARN portador, es preferible que puedan separarse facilmente, por ejemplo, uniendose a diferentes anticuerpos espedficos de la protema (monoclonales o policlonales) en la fase de recoleccion del sistema de cultivo de celulas vegetales.

Los marcadores geneticos seleccionables pueden facilitar la seleccion de plantas transgenicas y estas pueden consistir en genes quimericos que confieren fenotipos seleccionables tales como resistencia a antibioticos tales como espectinomicina, estreptomicina, kanamicina, neomicina, higromicina, puromicina, fosfinotricina, clorosulfurona, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas y glifosato.

Cuando se introducen secuencias seleccionadas de acidos nucleicos de acuerdo con la presente invencion en una celula, se deben tener en cuenta ciertas consideraciones, bien conocidas por los expertos en la tecnica. El acido nucleico a insertar debe ensamblarse dentro de un constructo, que contiene elementos reguladores efectivos, que impulsaran la transcripcion. Debe existir un metodo para transportar el constructo dentro de la celula. Una vez que el constructo esta dentro de la membrana celular, se producira o no la integracion en el material cromosomico endogeno. Finalmente, en lo que respecta a las plantas, el tipo de celula objetivo debe ser tal que las celulas puedan ser regeneradas en plantas enteras.

Las plantas transformadas con segmentos de ADN que contienen secuencias de interes tal como se proporcionan en la presente invencion se pueden producir mediante tecnicas convencionales, que ya son conocidas para la manipulacion

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genetica de plantas. El ADN se puede transformar en celulas vegetales utilizando cualquier tecnologfa adecuada, tal como un vector plasmido Ti desarmado portado por Agrobacterium que explote su capacidad natural de transferencia genica (EP-A-270355, EP-A-0116718, nAr 12 (22) 8711 -87215 1984), bombardeo con partfculas o micro proyectiles (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616), microinyeccion (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green y colaboradores (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press), electroporacion (EP 290395, WO 8706614), otras formas de incorporacion directa de ADN (DE 4005152, WO 9012096, US 4684611), incorporacion de ADN mediada por liposomas (por ejemplo, Freeman y colaboradores, Plant Cell Physiol., 29: 1353 (1984)), o el metodo de agitacion tipo vortice (por ejemplo, Kindle, PNAS EE.UU. 87: 1228 (1990d). Los metodos ffsicos para la transformacion de celulas vegetales se revisan en Oard, 1991, Biotech, Adv. 9: 1-11.

Por lo tanto, una vez que se ha identificado una secuencia de acido nucleico o un gen, puede reintroducirse en celulas vegetales utilizando tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica para producir plantas transgenicas del fenotipo apropiado.

La transformacion de Agrobacterium es ampliamente utilizada por los expertos en la tecnica para transformar especies dicotiledoneas. La produccion de plantas transgenicas estables y fertiles en casi todas las plantas monocotiledoneas economicamente relevantes tambien es ahora rutinaria (Toriyama, y colaboradores (1988) Bio/Technology 6, 10721074; Zhang y colaboradores (1988) Plant Cell Rep. 7 , 379-384; Zhang y colaboradores (1988) Theor Appl. Genet 76, 835-840; Shimamoto y colaboradores (1989) Nature 338, 274-276; Datta y colaboradores (1990) Bio/Technology 8, 736740; Christou y colaboradores (1991) Bio/Technology 9, 957-962; Peng y colaboradores (1991) International Rice Research Institute, Manila, Filipinas 563-574; Cao y colaboradores (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591; Li y colaboradores (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore y colaboradores (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm y colaboradores (1990) Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm y colaboradores (1990) Plant Cell 2, 603618; D'Halluin y colaboradores (1992) Plant Cell 4, 1495-1505; Walters, y colaboradores (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel y colaboradores (1993) Biotechnology 11, 194-200; Vasil, IK (1994) Plant Molecular Biology 25, 925937; Weeks, y colaboradores (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084; Somers, y colaboradores (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594; WO92/14828). En particular, la transformacion mediada por Agrobacterium es ahora un metodo de transformacion alternativo altamente eficiente en monocotiledoneas (Hiei y colaboradores, (1994) The Plant Journal 6, 271-282).

La generacion de plantas transgenicas fertiles se ha logrado en los cereales arroz, mafz, trigo, avena y cebada (revisado en Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162.; Vasil y colaboradores (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain y colaboradores, 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 pagina 702). Wan y Lemaux (1994) Plant Physiol. 104: 37-48 describen tecnicas para la generacion de gran numero de plantas de cebada fertiles transformadas independientemente.

El bombardeo con microproyectiles, la electroporacion y la incorporacion directa de ADN son preferidos cuando Agrobacterium es ineficiente o ineficaz. Alternativamente, se puede emplear una combinacion de diferentes tecnicas para aumentar la eficiencia del proceso de transformacion, por ejemplo, bombardeo con micropartfculas recubiertas con Agrobacterium (EP-A-486234) o bombardeo con microproyectiles para inducir lesiones seguido por el cultivo conjunto con Agrobacterium (EP-A-486233).

Tras la transformacion, se puede regenerar una planta, por ejemplo a partir de celulas individuales, tejido de callos o discos foliares, como es estandar en la tecnica. Casi cualquier planta puede ser regenerada completamente a partir de celulas, tejidos y organos de la planta. Las tecnicas disponibles se revisan en Vasil y colaboradores, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, vol. I, II y III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, y Weiss Bach y Weiss Bach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989.

La eleccion particular de una tecnologfa de transformacion se determinara por su eficacia para transformar ciertas especies vegetales asf como la experiencia y preferencia de la persona que practica la invencion con una metodologfa particular de eleccion. Sera evidente para el experto en la tecnica que la eleccion particular de un sistema de transformacion para introducir acido nucleico en celulas vegetales no es esencial o limitante de la invencion, ni tampoco la eleccion de la tecnica para la regeneracion de plantas.

La invencion comprende ademas una celula huesped transformada con vectores o constructos como se ha expuesto anteriormente, especialmente una celula vegetal o microbiana. De este modo, se proporciona una celula huesped, tal como una celula vegetal, que incluye secuencias de nucleotidos de la invencion como se indica aqrn. Dentro de la celula, la secuencia de nucleotidos puede incorporarse dentro del cromosoma.

Tambien de acuerdo con la invencion se proporciona una celula vegetal que incorpora en su genoma al menos una secuencia de nucleotidos, particularmente secuencias heterologas de nucleotidos, segun se proporciona por la presente invencion bajo control operativo de secuencias reguladoras para el control de expresion como se describe en la presente memoria. La secuencia codificadora puede estar operativamente unida a una o mas secuencias reguladoras que pueden ser heterologas o foraneas a las secuencias de acido nucleico empleadas en la invencion, tales como

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aquellas que no estan asociadas naturalmente con la secuencia o secuencias de acido nucleico para su expresion. La secuencia de nucleotidos de acuerdo con la invencion puede colocarse bajo el control de un promotor inducible externamente para colocar la expresion bajo el control del usuario. Un aspecto adicional de la presente invencion proporciona un metodo para elaborar dicha celula vegetal que implica la introduccion de una o varias secuencias de acido nucleico contempladas para su uso en la invencion o un vector adecuado que incluye la secuencia o secuencias contempladas para su uso en la invencion en una planta y provocar o permitir la recombinacion entre el vector y el genoma de la celula vegetal para introducir dichas secuencias en el genoma. La invencion se extiende a celulas vegetales que contienen una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la invencion como resultado de la introduccion de la secuencia de nucleotidos en una celula ancestral.

El termino "heterologo" puede usarse para indicar que el gen/secuencia de nucleotidos en cuestion ha sido introducido en dichas celulas de la planta o un antecesor de la misma, usando ingeniena genetica, es decir, mediante intervencion humana. Se puede proporcionar una celula vegetal transgenica, es decir, transgenica para la secuencia de nucleotidos en cuestion. El transgen puede estar en un vector extra genomico o incorporarse, preferiblemente de forma estable, al genoma. Un gen heterologo puede sustituir a un gen endogeno equivalente, es decir, que normalmente realiza la misma funcion o una funcion similar, o la secuencia insertada puede ser adicional al gen endogeno u otra secuencia. Una ventaja de la introduccion de un gen heterologo es la capacidad de colocar la expresion de una secuencia bajo el control de un promotor de eleccion, con el fin de poder influir en la expresion de acuerdo con la preferencia. Ademas, se pueden utilizar mutantes, variantes y derivados del gen de tipo silvestre, por ejemplo, con mayor actividad que el tipo silvestre, en lugar del gen endogeno. Las secuencias de nucleotidos heterologas, o exogenas o foraneas, a una celula vegetal pueden ser de origen no natural en celulas de ese tipo, variedad o especie. De este modo, una secuencia de nucleotidos puede incluir una secuencia codificante o derivada de un tipo particular de celula vegetal o especie o variedad de planta, colocada dentro del contexto de una celula vegetal de un tipo o especie o variedad de planta diferente. Una posibilidad adicional es colocar una secuencia de nucleotidos dentro de una celula en la cual se encuentre naturalmente un homologo, pero en donde la secuencia de nucleotidos esta unida y/o adyacente al acido nucleico que no se presenta naturalmente dentro de la celula o celulas de ese tipo o especie o variedad de planta, tal como unida operativamente a una o mas secuencias reguladoras, tales como una secuencia promotora, para el control de la expresion. Una secuencia dentro de una planta u otra celula huesped puede ser identificablemente heterologa, exogena o foranea.

Tambien se proporcionan plantas que incluyen una celula vegetal de acuerdo con la invencion, junto con cualquier parte o propagulo de la misma, semilla, progenie autofecundada o hibridada y descendientes. Particularmente se proporcionan plantas de cultivo transgenicas, que han sido modificadas para portar genes identificados como se ha indicado anteriormente. Ejemplos de plantas adecuadas incluyen tabaco (Nicotiana tabacum) y otras especies de Nicotiana, zanahoria, vegetales y oleaginosas de Brassica, melones, pimientos, uvas, lechuga, fresa, remolacha azucarera, trigo, cebada, mafz, arroz, soja, guisantes, sorgo, girasol, tomate, algodon y patata. Las plantas transgenicas especialmente preferidas de la invencion incluyen algodon, arroz, especies de Brassica de semilla oleaginosa tales como canola, mafz y soja.

Ademas de una planta, la presente invencion proporciona cualquier clon de dicha planta, semilla, progenie autofecundada o tnbrida y descendientes, y cualquier parte de cualquiera de estas, tales como esquejes y semillas. La invencion proporciona cualquier propagulo vegetal, es decir cualquier parte que se puede usar en reproduccion o propagacion, sexual o asexual, incluyendo esquejes, semillas etc. Tambien esta comprendida en la invencion una planta que es una progenie propagada sexual o asexualmente, clon o descendiente de dicha planta, o cualquier parte o propagulo de dicha planta, progenie, clon o descendiente.

La presente invencion tambien abarca el producto de expresion del polipeptido de una molecula de acido nucleico de acuerdo con la invencion como se describe en la presente memoria o que puede ser obtenido de acuerdo con la informacion y las sugerencias de la presente invencion. Tambien se proporcionan metodos para elaborar dicho producto de expresion mediante la expresion de una secuencia de nucleotidos que codifica por lo tanto bajo condiciones adecuadas en celulas huesped adecuadas, por ejemplo, E coli. Los expertos en la tecnica son capaces de construir vectores y protocolos de diseno y sistemas para la expresion y recuperacion de productos de la expresion genica recombinante.

Se contempla que la protema objetivo heterologa o exogena es cualquier protema de interes que se puede producir por el metodo de la invencion. Los tipos de protemas objetivo que se contemplan para la produccion en un metodo de la presente invencion incluyen protemas vegetales y protemas farmaceuticas para uso en mairnferos, incluyendo el hombre, tales como insulina, preproinsulina, proinsulina, glucagon, interferones tales como interferon a, interferon p, interferon y, factores de coagulacion sangumea seleccionados del Factor VII, VIII, IX, X, XI y XII, hormonas de fertilidad incluyendo hormona luteinizante, factores de crecimiento hormonal estimulantes de los folmulos incluyendo el factor de crecimiento epidermico, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor estimulante de colonias de granulocitos y similares, prolactina, oxitocina, hormona estimulante de la tiroides, hormona adrenocorticotropica, calcitonina, hormona paratiroidea, somatostatina, eritropoyetina (EPO), enzimas tales como p-glucocerebrosidasa, hemoglobina, albumina de suero, colageno, protema toxica de insectos de Bacillus thuringiensis; protema de resistencia a herbicidas (glifosato); protemas de tolerancia a la sal; protemas de mejora nutricional implicadas en la biosmtesis de compuestos

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fenolicos, almidones, azucares, alcaloides, vitaminas y vacunas comestibles, y similares. Ademas, el metodo de la invencion puede utilizarse para la produccion de anticuerpos monoclonales espedficos o fragmentos activos de los mismos y de enzimas industriales.

Todas las protemas mencionadas anteriormente son de tipo vegetal y humano. Otras protemas que se contemplan para la produccion en la presente invencion incluyen protemas para uso en el cuidado veterinario y pueden corresponder a homologos animales de protemas humanas, tales como las protemas humanas mencionadas anteriormente en este documento.

Un polipeptido de acuerdo con la presente invencion puede ser un alelo, variante, fragmento, derivado, mutante u homologo de los polipeptidos como se menciona en el presente documento. El alelo, variante, fragmento, derivado, mutante u homologo pueden tener sustancialmente la misma funcion de los polipeptidos aludidos anteriormente y como se muestra en la presente memoria o pueden ser un mutante funcional de los mismos.

La "homologfa" en relacion con una secuencia de aminoacidos o una secuencia de polipeptidos producida por el metodo de la invencion se puede usar para referirse a identidad o similitud, preferiblemente identidad. Como se ha indicado anteriormente, un alto nivel de identidad de aminoacidos puede estar limitado a dominios o regiones funcionalmente significativos.

En ciertas realizaciones, un alelo, variante, derivado, derivado mutante, mutante u homologo de la secuencia espedfica pueden mostrar poca homologfa total, por ejemplo aproximadamente 20%, o aproximadamente 25%, o aproximadamente 30%, o aproximadamente 35%, o aproximadamente 40% o aproximadamente 45%, con la secuencia espedfica. Sin embargo, en dominios o regiones funcionalmente significativos, la homologfa de aminoacidos puede ser mucho mayor. Se pueden identificar dominios o regiones putativos funcionalmente significativos usando procesos de bioinformatica, incluyendo la comparacion de las secuencias de homologos.

Los dominios o regiones funcionalmente significativos de diferentes polipeptidos se pueden combinar para la expresion de acido nucleico codificante como una protema de fusion. Por ejemplo, las propiedades particularmente ventajosas o deseables de diferentes homologos pueden combinarse en una protema hfbrida, de manera que el producto de expresion resultante, puede incluir fragmentos de diversas protemas progenitoras, si es apropiado.

La similitud de secuencias de aminoacidos puede ser tal como se ha definido y determinado por el programa TBLASTN, de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, que es de uso comun en la tecnica. En particular, se puede utilizar TBLASTN 2.0 con Matrix BLOSUM62 y las penalizaciones GAP: existencia: 11, extension: 1. Otro programa estandar que se puede utilizar es BestFit, que forma parte del Paquete Wisconsin, Version 8, Septiembre 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU., Wisconsin 53711). BestFit hace una alineacion optima del mejor segmento de similitud entre dos secuencias. Las alineaciones optimas se encuentran insertando espacios para maximizar el numero de coincidencias usando el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. (1981) 2: 482-489). Otros algoritmos incluyen GAP, que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias completas que maximizan el numero de coincidencias y minimizan el numero de espacios. Como con cualquier algoritmo, generalmente se usan los parametros por defecto, que para GAP son una penalizacion por creacion de espacios = 12 y penalizacion por extension de espacios = 4. Alternativamente, se puede usar una penalizacion de creacion de espacios de 3 y una penalizacion por extension de espacios de 0,1. El algoritmo FASTA (que utiliza el metodo de Pearson y Lipman (1988) PNAS EE.UU. 85: 2444-2448) es una alternativa adicional.

El uso de cualquiera de los terminos "homologfa" y "homologo" en la presente memoria no implica ninguna relacion evolutiva necesaria entre las secuencias comparadas, manteniendo por ejemplo el uso estandar de terminos tales como "recombinacion homologa" que simplemente requiere que dos secuencias de nucleotidos sean suficientemente similares para recombinarse en las condiciones apropiadas. Una discusion adicional de los polipeptidos de acuerdo con la presente invencion, que pueden ser codificados por acido nucleico de acuerdo con la presente invencion, se encuentra a continuacion.

La ensenanza de todas las referencias citadas aqrn se incorpora en su totalidad a la presente descripcion.

A continuacion se presentan ejemplos no limitantes y figuras que ilustran la invencion.

Figura 1: Conjunto de constructos para la transformacion del cloroplasto de Arabidopsis.

Figura 2: Conjunto de constructos para la transformacion del cloroplasto del tabaco.

Figura 3: Conjunto de constructos para la transformacion del cloroplasto de tomate.

Figura 4: Conjunto de constructos para la transformacion del cloroplasto de arroz.

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Figura 5: Casete de transformacion optimizado de cloroplasto que incluye intrones en el gen aadA y mGFP para estabilizar el transcrito. TrnI-LFS y trnA RFS- secuencias flanqueantes de trnI y trnA ; Prrn- promotor del cloroplasto del gen rrn16; Inti- int6- intrones del genoma de Arabidopsis introducidos en las secuencias de codificacion de los genes aadA y mGFP4 con el fin de estabilizar el transcrito; PsbA ter terminador del cloroplasto del gen psbA del cloroplasto; PBS- sitio de union del cebador para induccion de la reaccion de transcriptasa inversa.

Figura 6: Casete optimizado del gen LtrASi para expresion en plantas. Ubiq3At- promotor del gen ubiquitina 3 de Arabidopsis; cTP- peptido de transito de cloroplasto; LtrASi- gen LtrA sintetico sintetizado para expresion optima en plantas; ADH2-Int1, ADH2-Int2, intron 3- intron del genoma de Arabidopsis introducido para estabilizar el transcrito de sLtrA en plantas; ags ter- secuencia de poliadenilacion de la planta.

Figura 7: Casete genica Tnti de transcriptasa inversa (RT) -RNasa H (RH) (RT-RH) que facilita la transcripcion inversa del casete del transgen del cloroplasto en los cloroplastos.

Figura 8: constructos del vector utilizado para optimizacion de transformacion del cloroplasto utilizando el vector de transformacion del intron del grupo II. (A) vector ALG241 que porta al casete del transgen del cloroplasto y el gen LtrASi en el vector binario pGreen0029 (Hellens y colaboradores (2000) Plant Mol. Biol 42: 819-832;
www.pgreen.ac.uk). (B) vector ALG231 que porta a Tnti RT-RH en el vector binario pSOUP-0179 (Hellens, citado mas arriba). Ambos plasmidos fueron transformados conjuntamente en la cepa de Agrobacterium AGLIque se uso para la transformacion del tabaco.

Ejemplos

Suministro del transgen a los cloroplastos usando vectores del intron del grupo II.

Concepto

Se han aprovechado las caractensticas funcionales del intron para dirigir e insertar secuencias de polinucleotidos de interes en el plastido, por ejemplo, el genoma del cloroplasto. Los intrones del grupo II tienen una estructura secundaria conservada y comprenden seis dominios funcionales. No se ha demostrado que el dominio IV desempene un papel en la reaccion de empalme, pero puede contener un marco de lectura abierto (ORF) que codifica una protema multifuncional (IEP) que esta implicada en el empalme y la movilidad del intron. Se ha eliminado este ORF del Dominio IV del intron y reemplazado con una secuencia de nucleotidos de interes para la insercion en el genoma del cloroplasto. El ORF nativo del intron se fusiono a un peptido de transito del organelo y se expreso conjuntamente por separado.

Se utilizo el intron LtrB de Lactococcus lactis (amplificado de la cepa MG1363 de Lactococcus lactis, Genoscope, Francia) y el intron trnK del cloroplasto nativo de tabaco (amplificado por PCR a partir del ADN genomico del tabaco de la variedad Petite Gerard), conteniendo ambos un ORF en el Dominio IV. Los intrones atpF y petD de mafz nativo (amplificados a partir del ADN genomico del mafz), que no tienen ningun ORF en el Dominio IV, tambien se utilizaron. En resumen, se inserto el casete de transgen del cloroplasto en el Dominio IV de los intrones antes mencionados y se esperaba que el ORF codificado por el intron expresado conjuntamente en trans o en el caso de los intrones atpF y petD de mafz nativo que no tienen ORF en el Dominio IV, que la protema o protemas nativas expresadas a partir del genoma nuclear estanan implicados en el empalme del intron y direccionamiento en los cloroplastos. El casete del transgen del cloroplasto contiene un promotor Prrn del cloroplasto del tabaco, una secuencia de fusion aadA-GFP4, una secuencia terminadora psbA 3'UTR del genoma del cloroplasto del tabaco y dos regiones flanqueantes homologas a la region del genoma del cloroplasto del tabaco entre los genes rbcL y accD.

Razon de la tecnologfa

El proceso de transformacion del cloroplasto comprende dos etapas.

(1) Direccionamiento del complejo ARN-protema a los cloroplastos.

Despues de suministrar el constructo de intron en la celula vegetal, se consigue una fuerte expresion del ARN del intron que contiene el casete dirigido al cloroplasto a partir del promotor espedfico del nucleo. La protema codificada por el intron (IEP) fusionada a un peptido de transito del cloroplasto, tambien se sobreexpresara en la administracion conjunta a partir del mismo o de un vector diferente y luego se unira al ARN del intron y facilitara el plegado y el empalme de del intron a partir del ARNm. Ya que la IEP se fusiona a un peptido de transito del cloroplasto, preferiblemente transferira entonces el ARN del intron a los cloroplastos. Para los intrones tales como atpF y petD que no tienen ningun ORF para IEP en el Dominio IV, se espera que la protema nativa codificada en el nucleo realice funciones similares a aquellas de la IEP introducida con los intrones LtrB y trnk. Una vez que el casete del intron se presenta en la celula vegetal a traves de transformacion nuclear, el cloroplasto sera entonces bombardeado permanentemente por el complejo de IEP expresada-ARN del intron. Tal bombeo estable y continuo del complejo en el organelo objetivo es un requisito previo para lograr una alta eficiencia de transformacion del organelo. La tecnologfa aprovecha el hallazgo de que la secuencia

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de transito del cloroplasto es suficiente para permitir que todo el complejo IEP-ARN del intron sea luego incorporado por el cloroplasto.

(2) Transcripcion inversa del casete del transgen e insercion en el genoma del cloroplasto.

Una vez dentro del organelo, la sobreexpresion de la transcriptasa inversa (RT-RH) del retrotransposon tntl del tabaco fusionado al peptido de transito del cloroplasto de la subunidad pequena de Rubisco facilita la transcripcion inversa de ARN del casete del transgen. RT-RH reconoce un sitio de union del cebador (PBS) e inicia la transcripcion inversa utilizando ARNt-Met codificado por el cloroplasto como cebador. RT-RH catalizara la transcripcion inversa del casete del transgen, y la insercion del casete transcrito inverso en el genoma del cloroplasto sera inducida debido a la recombinacion homologa entre las secuencias flanqueantes del casete y la region homologa en el genoma del cloroplasto.

Una vez que la poblacion de genomas del organelo ha sido transformada en la lmea vegetal inicial, ya no se requieren los transgenes codificados en el nucleo y luego se pueden eliminar mediante segregacion en generaciones de plantas posteriores, dejando una lmea vegetal transformada del organelo limpia.

Materiales y metodos.

Preparacion del vector con base en el intron del grupo II.

El intron LtrB, que no contiene al gen LtrA codificado en el intron en el dominio IV, se amplifico usando procedimientos estandar conocidos en la tecnica (por ejemplo Molecular Cloning: a Laboratory Manual: segunda edicion, Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) de la cepa MG1364 de Lactococcus lactis utilizando los siguientes cebadores:

para la parte 5' del cebador del intron

IM105

INT5-F (Xhol) TGTCTCGAGTGTGATTGCAACCCACGTCGAT (SEQ ID NO. 1)

IM106

INT5-R (AscI) TGTGGCGCGCCACGCGTCGCCACGTAATAAATA (SEQ ID NO. 2);

para la parte 3' del cebador del intron

IM107

INT3-F (NotI) TGTGCGGCCGCTGGGAAATGGCAATGATAGCGA (SEQ ID NO. 3)

IM108

INT3-R (EcoRI) TGTGAATTCCAGTCAAATTGTTTGCCAGTATAAAG (SEQ ID NO. 4)

Intron 5' de LtrB

CTCGAGTGTGATTGCAACCCACGTCGATCGTGAACACATCCATAACGTGCGCCCAGATAGGGTGTTAAGTCAA GTAGTTTAAGGTACTACTCTGTAAGATAACACAGAAAACAGCCAACCTAACCGAAAAGCGAAAGCTGATACGG GAACAGAGCACGGTTGGAAAGCGATGAGTTACCTAAAGACAATCGGGTACGACTGAGTCGCAATGTTAATCAG ATATAAGGTATAAGTTGTGTTTACTGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTATGTGTCGATAGAGGAAAGTGTCT GAAACCTCTAGTACAAAGAAAGGTAAGTTATGGTTGTGGACTTATCTGTTATCACCACATTTGTACAATCTGT AGGAGAACCTATGGGAACGAAACGAAAGCGATGCCGAGAATCTGAATTTACCAAGACTTAACACTAACTGGGG ATACCCTAAACAAGAATGCCTAATAGAAAGGAGGAAAAAGGCTATAGCACTAGAGCTTGAAAATCTTGCAAGG GTACGGAGTACTCGTAGTAGTCTGAGAAGGGTAACGCCCTTTACATGGCAAAGGGGTACAGTTATTGTGTACT AAAATT AAAAAT TGATTAGGGAGGAAAACCTCAAAAT GAAACCAACAATGGCAATT T TAGAAAGAATCAGTAA AAATTCACAAGAAAATATAGACGAAGTTTTTACAAGACTTTATCGTTATCTTTTACGTCCAGATATTTATTAC GTGGCGACGCGTGGCGCGC (SEQ ID NO. 5)

intron 3' de LtrB

GCGGCCGCTGGGAAATGGCAATGATAGCGAAACAACGTAAAACTCTTGTTGTATGCTTTCATTGTCATCGTCA CGTGATTCATAAACACAAGTGAATTTTTACGAACGAACAATAACAGAGCCGTATACTCCGAGAGGGGTACGTA CGGTTCCCGAAGAGGGTGGTGCAAACCAGTCACAGTAATGTGAACAAGGCGGTACCTCCCTACTTCACCATAT CATTTTTAATTCTACGAATCTTTATACTGGCAAACAATTTGACTGGAATTC (SEQ ID NO.6)

El gen codificado por el intron para la protema LtrA se amplifico por separado del ADN genomico de la cepa MG1363 de 5 L. lactis utilizando el siguiente par de cebadores:

AS384-F (SphI)

GGCATGCATGAAACCAACAATGGCAATTTTA (SEQ ID NO.7)

AS187-R (SpeI)

GACTAGTTCACTTGTGTTTATGAATCACGTG (SEQ ID NO.8)

10 ORF de LtrA

GCATGCATGAAACCAACAATGGCAATTTTAGAAAGAATCAGTAAAAATTCACAAGAAAATATAGACGAAGTTT

TTACAAGACTTTATCGTTATCTTTTACGTCCAGATATTTATTACGTGGCGTATCAAAATTTATATTCCAATAA

AGGAGCTTCCACAAAAGGAATATTAGATGATACAGCGGATGGCTTTAGTGAAGAAAAAATAAAAAAGATTATT

CAATCTTTAAAAGACGGAACTTACTATCCTCAACCTGTACGAAGAATGTATATTGCAAAAAAGAATTCTAAAA

AGAT GAGACC T T TAGGAAT T CCAAC T T T CACAGATAAAT T GAT CCAAGAAGC T GT GAGAATAAT T C T T GAAT C

TATCTATGAACCGGTATTCGAAGATGTGTCTCACGGTTTTAGACCTCAACGAAGCTGTCACACAGCTTTGAAA

ACAATCAAAAGAGAGTTTGGCGGCGCAAGATGGTTTGTGGAGGGAGATATAAAAGGCTGCTTCGATAATATAG

ACCACGTTACACTCATTGGACTCATCAATCTTAAAATCAAAGATATGAAAATGAGCCAATTGATTTATAAATT

TCTAAAAGCAGGTTATCTGGAAAACTGGCAGTATCACAAAACTTACAGCGGAACACCTCAAGGTGGAATTCTA

TCTCCTCTTTTGGCCAACATCTATCTTCATGAATTGGATAAGTTTGTTTTACAACTCAAAATGAAGTTTGACC

GAGAAAGTCCAGAAAGAATAACACCTGAATATCGGGAACTTCACAATGAGATAAAAAGAATTTCTCACCGTCT

CAAGAAGTTGGAGGGTGAAGAAAAAGCTAAAGTTCTTTTAGAATATCAAGAAAAACGTAAAAGATTACCCACA

CTCCCCTGTACCTCACAGACAAATAAAGTATTGAAATACGTCCGGTATGCGGACGACTTCATTATCTCTGTTA

AAGGAAGCAAAGAGGACTGTCAATGGATAAAAGAACAATTAAAACTTTTTATTCATAACAAGCTAAAAATGGA

ATTGAGTGAAGAAAAAACACTCATCACACATAGCAGTCAACCCGCTCGTTTTCTGGGATATGATATACGAGTA

AGGAGAAGTGGAACGATAAAACGATCTGGTAAAGTCAAAAAGAGAACACTCAATGGGAGTGTAGAACTCCTTA

TTCCTCTTCAAGACAAAATTCGTCAATTTATTTTTGACAAGAAAATAGCTATCCAAAAGAAAGATAGCTCATG

GTTTCCAGTTCACAGGAAATATCTTATTCGTTCAACAGACTTAGAAATCATCACAATTTATAATTCTGAATTA

AGAGGGATTTGTAATTACTACGGTCTAGCAAGTAATTTTAACCAGCTCAATTATTTTGCTTATCTTATGGAAT

ACAGCTGTCTAAAAACGATAGCCTCCAAACATAAGGGAACACTTTCAAAAACCATTTCCATGTTTAAAGATGG

AAGTGGTTCGTGGGGCATCCCGTATGAGATAAAGCAAGGTAAGCAGCGCCGTTATTTTGCAAATTTTAGTGAA

TGTAAATCCCCTTATCAATTTACGGATGAGATAAGTCAAGCTCCTGTATTGTATGGCTATGCCCGGAATACTC

TTGAAAACAGGTTAAAAGCTAAATGTTGTGAATTATGTGGAACATCTGATGAAAATACTTCCTATGAAATTCA

CCATGTCAATAAGGTCAAAAATCTTAAAGGCAAAGAAAAATGGGAAATGGCAATGATAGCGAAACAACGTAAA

ACTCTTGTTGTATGCTTTCATTGTCATCGTCACGTGATTCATAAACACAAGTGAACTAGT (SEQ ID

No. 9)

El gen LtrA se fusiono en forma translacional con un peptido de transito de cloroplasto usando metodos comunmente empleados en la tecnica (por ejemplo, Maniatis y colaboradores, citado mas arriba) a partir de la protema de choque termico del cloroplasto de guisantes (Acceso No. L03299). La secuencia para el peptido de transito se amplifico usando 5 los siguientes cebadores:

AS293-F (Xhol)

TCTCGAGTTGATGGCTTCTTCTGCTCAAATA (SEQ ID NO.10)

AS294-R (SphI)

GGCATGCAACTCTCAAAGTGAAACCCTTC (SEQ ID NO.11)

10 cTP

CTCGAGATGGCTTCTTCTGCTCAAATACACGGTCTCGGAACCGCTTCTTTCTCTTCCCTCAAAAAACCCTCTT CCATTTCCGGTAATTCCAAAACCCTTTTCTTCGGTCAGCGACTCAATTCCAACCACTCTCCCTTCACCCGCGC CGCATTCCCTAAGTTAAGTAGCAAAACCTTTAAGAAGGGTTTCACTTTGAGAGTTGCATGC (SEQ ID NO.12)

El intron trnK se amplifico a partir del ADN genomico del tabaco de la variedad Petite Gerard usando cebadores para el extremo 5' del intron:

AS402 (XhoI)

5 GCTCGAGGTTGCTAACTCAACGGTAGAGTAC (SEQ ID NO. 13)

AS521 (ASCI)

GCACGCGTGGCGCGCCATTTCTATTTAAACCATGATCA (SEQ ID NO.14) para el extremo 3' del intron:

AS568 (Notl)

10 CACGCGTGCGGCCGCTTCTTCTAGTTTGTGGGGAGTA (SEQ ID NO.15)

AS405 (BamHI)

GGGATCCGATATGCTAGTGGGTTGCCCGGGA (SEQ ID NO. 16) extremo 5' del intron trnK

GTGCGGCTAGTCTCTTTTACACATATGGATGAAGTGAGGGATTCGTCCATACTCTCGGTAAAGTTTGGAAGAC CACGACTGATCCTGAAAGGGAATGAATGGTAAAAATAGCATGTCGTATCAACGGAAAGTTCTGAGAATATTTC ATTGTTCCTAGATGGGTATAAAACCGTGTTAGAATTCTTGGAACGGAACAAAATAAAGTTGGGTCGAATGAAT AAAT GGATAGGGCT GCGGCT T CAATTAAATTATAGGGAAAGAAAGAAAAAGCAACGAGC T T T TGTTCTTAATT TGAATGATTCCCGATCTAATTAGACGTTAAAAATTTATTAGTGCCTGATGCGGGAAGGGTTTCTTGTCCCATG AGTGGATTCTCCATTTTTTTAATGAATCCTAACTATTACCATTTTCTATTACGGAGATGTGTGTGTAGAAGAA ACAGTATAT T GATAAAGAAAGT T T T TTCCGAAGTCAAAAGAGCGATTAGGTTGAAAAAATAAAGGAT T T C TAA CCATCTTATTATCCTATAACACTATAACATAGACCAATTAAACGAAACGAAAAAAAAAAGAGATGATAGAGAA TCCGTTGAGAAGTTTACCTGTATCCAAGGTATCTATTCTTACTAAAATACTTTGTTTTAACTGTATCGCACTA TGTATCATTTGATAACCCTCAAAATCTTCCGTCTTTGGTTCAAATCGAATTTCAAATGGAAGAAATCCAAAGA TATTTACAGCCAGATAGATCGCAACAACACAACTTCCTATATCCACTTATCTTTCAGGAGTATATTTATGCAC 15 TTGCTCATGATCATGGTTTAAATAGAAATGCGCC(SEQ ID NO.17)

extremo 3' del intron trnK

TTCTTCTAGTTTGTGGGGAGTATATAGAAGTCGGATTTGGTATTTGGATATTTTTTGTATCAATGATCTGGCG AATTATCAATGATTCATTCTTAGATTTTCTAAATGGAAATTTGTTTCTAAATGATGAAGAGATAAAAAAATTT CACTATTCTGAAATGTTGATTGTAATAGTAATTAAGGGGTAAATCAACTGAGTATTCAACTTTTTAAAGTCTT TCTAATTTCTATAAGAAAGGAACTGATGTATACATAGGGAAAGCCGTGTGCAATGAAAAATGCAAGCACGGCT TGGGGAGGGGTCTTTACTTGTTTATTTAATTTAAGATTAACATTTATTTTATTTAACAAGGAACTTATCTACT CCAT(SEQ ID NO. 18)

La protema MatK codificada por el intron tmK se amplifico a partir de ADN genomico de tabaco de la variedad Petite Gerard con cebadores

AS442 (SphI)

5 GGCATGCCAAATGGAAGAAATCCAAAGATA (SEQ ID NO.19)

AS443 (SstI)

GGAGCTCTCATTGATAATTCGCCAGATCA (SEQ ID NO.20)

MatK

GCATGCCAAATGGAAGAAATCCAAAGATATTTACAGCCAGATAGATCGCAACAACACAACTTCCTATATCCAC TTATCTTTCAGGAGTATATTTATGCACTTGCTCATGATCATGGTTTAAATAGAAATAGGTCGATTTTGTTGGA AAATCCAGGTTATAACAATAAATTAAGTTTCCTAATTGTGAAACGTTTAATTACTCGAATGTATCAACAGAAT CATTTTCTTATTTCTACTAATGATTCTAACAAAAATTCATTTTTGGGGTGCAACAAGAGTTTGTATTCTCAAA TGATATCAGAGGGATTTGCGTTTATTGTGGAAATTCCGTTTTCTCTACGATTAATATCTTCTTTATCTTCTTT CGAAGGCAAAAAGATTTTTAAATCTTATAATTTACGATCAATTCATTCAACATTTCCTTTTTTAGAGGACAAT TTTTCACATCTAAATTATGTATTAGATATACTAATACCCTACCCTGTTCATCTGGAAATCTTGGTTCAAACTC TTCGCTATTGGGTAAAAGATGCCTCTTCTTTACATTTATTACGATTCTTTCTCCATGAATTTTGGAATTTGAA TAGTCTTATTACTTCAAAGAAGCCCGGTTACTCCTTTTCAAAAAAAAATCAAAGATTCTTCTTCTTCTTATAT AATTCTTATGTATATGAATGCGAATCCACTTTCGTCTTTCTACGGAACCAATCTTCTCATTTACGATCAACAT CTTTTGGAGCCCTTCTTGAACGAATATATTTCTATGGAAAAATAGAACGTCTTGTAGAAGTCTTTGCTAAGGA TTTTCAGGTTACCCTATGGTTATTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGTTAGGTATCAAGGAAAATCCATTCTG GCTTCAAAAGGGACGTTTCTTTTGATGAATAAATGGAAATTTTACCTTGTCAATTTTTGGCAATGTCATTGTT CTCTGTGCTTTCACACAGGAAGGATCCATATAAACCAATTATCCAATCATTCCCGTGACTTTATGGGCTATCT TTCAAGTGTGCGACTAAATCCTTCAATGGTACGTAGTCAAATGTTAGAAAATTCATTTCTAATCAATAATGCA ATTAAGAAGTTCGATACCCTTGTTCCAATTATTCCTTTGATTGGATCATTAGCTAAAGCAAACTTTTGTACCG TATTAGGGCATCCCATTAGTAAACCGGTTTGGTCCGATTTATCAGATTCTGATATTATTGACCGATTTGGGCG TATATGCAGAAATCTTTTTCATTATTATAGCGGATCTTCCAAAAAAAAGACTTTATATCGAATAAAGTATATA CTTCGACTTTCTTGTGCTAGAACTTTAGCTCGGAAACACAAAAGTACTGTACGCACTTTTTTGAAAAGATCGG GCTCGGAATTATTGGAAGAATTCTTAACGTCGGAAGAACAAGTTCTTTCTTTGACCTTCCCACGAGCTTCTTC TAGTTTGTGGGGAGTATATAGAAGTCGGATTTGGTATTTGGATATTTTTTGTATCAATGATCTGGCGAATTAT n CAATGAGAGCTC (SEQ ID NO. 21)

Mat K se fusiono a la secuencia del peptido de transito del cloroplasto del gen HSP70 del guisante (vease la secuencia

5

10

15

20

anterior).

El intron atpF se amplifico a partir del ADN genomico de maz utilizando cebadores AS409 (Xhol)

para el extremo 5' del intron

GCTCGAGACTGTAGTGGTTGGTGTATTG (SEQ ID NO. 22)

AS410 (AscI)

GGGCGCGCCTTCTTTTTTGTTATGTATTATGGCT (SEQ ID NO. 23) para el extremo 3' del intron AS411 (Notl)

GGCGGCCGCAAAAAGGAGCGGGAGAGCCAAA (SEQ ID NO.24)

AS412 (SpeI)

GACTAGTGAATAGTACTTAAAATCCTCTG (SEQ ID NO.25) extremo 5' del intron atpF

CTCGAGACTGTAGTGGTTGGTGTATTGATTTTTTTTGGAAAGGGAGTGTGTGCGAGTTGTCTATTTCAAGAAT AGATTGGATCTATCCGGCTGCACTTTAGAATATTTTTAGTATTTTTTTTGATAAATAAGAAAAGGTGCACGAT CTCGACGAATTACTTCTGAATAACTTCAGAAATCATATGGAAGAACCATAGCATTTCGCGATTCATTGGTAAA TTTACTTTGATTCTCTATAGACCAATAATGTGAGACCATTAACACGGTTAAAGCTAAACTGCTTGAAGTCCGG GCAAAAAGGGGTACTCTTTCTACAACTACATTAGTATTAGTCTCGAAATGCTTTAAACGGGAAATAGCTAGTG TAGAATTTATCTGATATAGAACACTCATATCGATAAAATAGTTTGAACTATTTACTAGAAGGGCACGCAGCCC T T T T TCCAAT GCCAAATCGACGACC T ATGT AT AAAAAAAAGAGAAAT T T T T T GGAT T T GAAGAAAAAAT AAAA GGAATTCTATCAATTTTTATTTTCCATTTATTTAGTTAGTTTTTCTTAATGAAATTGAAATTATTAACTAACA GAGCAAACACAAATAAAGAAACAACTTTGCTGACCATGATAGATTTTTATCTAGTTGGAAGAGTCCTCTTAAT ATTCATCTAGTCTTATATAAGTTTGGGTATATAGAAATACAAACAGAAAAGAGAGGATAGAGGATAGGCTCAT TACATAAAAAAAAGATATGGAAATAGCCATAATACATAACAAAAAAGAAGGCGCGCC (SEQ ID NO. 2 6)

extremo 3' del intron atpF

GCGGCCGCAAAAAGGAGCGGGAGAGCCAAATGAATCGAAAGATTCATGTTTGGTTCGGGAAGAGATCATAAAA AT TGTAAACT TAATAGCAAGATAAT CTACT T T CAT TAAAAGATT TAT TAGATAATCGAAAACAGAGGAT T T TA AGTACTATTCACTAGT (SEQ ID NO.27)

se amplifico el intron petD a partir de ADN genomico de mafz utilizando cebadores para el extremo 5' del intron:

AS413 (SalI)

GGTCGACGGATACTTCTCTTCAACTTCGAAGT (SEQ ID NO.28)

AS414 (SpeI)

GACTAGTACGCGGGTTCCCCATAATAATTATG (SEQ ID NO.29)

para el extremo 3' del intron:

AS415 (AscI)

GGGCGCGCCATAATGACTCAATGACTCAAGGTA (SEQ ID NO.30)

AS416 (NotI)

5 GGCGGCCGCATACCCCTATTCTATTGTGGATC (SEQ ID NO. 31)

extremo 5' del intron petD

GTCGACGGATAC T T C T C T T C AAC T T C GAAG T AT T T T T AT AC AAAT AG T T GAAG T GAAT T T T AC GAAAGAAAAT

AAGGCGGATTATGGGAGTGTGTGACTTGAATTATTAATTTGGCCATGCAGATAGAGAATTGGATCTGCCACAT

TAGAATTCACGACCAAAGGTGTCTCCGCATCCAATCAACACGTAAGTCCCCTATCTAGGAAGGATAGGCTGGT

TCACTCGAGGAGAATATTTTCTATGATCATACCCCACCAACCATGTCATCCATGAACAGGCTCCGTAAGATCC

TATAGAGTATAAATGGAATAAGTCATGTGATATGATCCAATTCAATTTTTATTACACTTACTTTTTATTATAG

TATGGAAATGCATTCATTTTCTTTGCATCGATTTTGATCCGCAATACTATCGGAGTAAAAGAAGGGATCTAAG

GAAGAACGCAGGCTAAACTTTTTGATTTTTTATTAGTAACAAGTAAATACTTTGTTTGGACATAAGAAACTTG

CGATATCGAGGGGATAAACAACAACTAATCAAGAGACAATCCACAAAGCAATTGATCATGATCAAATTTGTAA

GCCCACTTGGATATTGAGCATTTAAGCATAAGAATAGGATTCTTTTCAATGAGTAGTTATAGGCGCAACTTCG

GAAAAGATAATTTGATAAAGTTTTTCTTACCTTGAGTCATTGAGTCATTATGGCGCGCC (SEQ ID NO.

32)

extremo 3' del intron petD

GCGGCCGCATACCCCTATTCTATTGTGGATCCTCCACGGTCTTATTTCTTTCATTCTTGCTCGAGCCGGATGA

TGAAAAATTCTCATGTCCGGTTCCTTTGGGGGATGGATCCTAAAGAATTCACCTATCCCAATAACAAAGAAAC

CTGACTTAAATGATCCTGTATTAAGAGCAAAATTAGCTAAAGGGATGGGACATAATTATTATGGGGAACCCGC GTACTAGT (SEQ ID NO.33)

El casete de transformacion del cloroplasto contiene:

Promotor Prrn de tabaco

CTCGAGTTTGCTCCCCCGCCGTCGTTCAATGAGAATGGATAAGAGGCTCGTGGGATTGACGTGAGGGGGCAGG GATGGCTATATTTCTGGGAGCGAACTCCGGGCGAATACGAAGCGCTTGGATACAGTTGTAGGGAGGGATTTCC CGGG (SEQ ID NO.34)

Prrn se amplifico a partir de ADN de tabaco con los cebadores 15 AS134-F (XhoI)

TCTCGAGTTTGCTCCCCCGCCGTCGTTC (SEQ ID NO.35)

AS135-R (SmaI)

CCCCGGGCCCTCCCTGGAGTTCGCTCCCAGAAATAT (SEQ ID NO.36)

Promotor Prps16 de trigo

CCGCGGCATTCATATGATAGAATATGGGTTTAAATAAATTGGCTCTTTGCGGAGTCTTTCCCGATAAATACTT AATTTCTTTTATTCATATTTCTCCATAGATAGCAAAGCAAGTTTGAATTAGTATACAAAAAACGAAACTAATG ACTATTCATGATTCCATCCATATTGGATCAATTCCCTATAACACTTTGCAATGAAATTAGAGGAATGTTATCG AT (SEQ ID NO. 37)

Prps16 se amplifico a partir de ADN genomico de trigo cv. Pavon usando cebadores AS425 (Sstll)

GCCGCGGCATTCATATGATAGAATATGGGT (SEQ ID NO.38)

5 AS518 (ClaI)

TATCGATAACATTCCTCTAATTTCATTGCA(SEQ ID NO.39) gen aadA

CCCGGGATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCC

ATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGA

TATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTG

GAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACA

TCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGG

TATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCC

TTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAA

CCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCAT

TTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCG

GCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGC GCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATCAGGATC C (SEQ ID NO.40)

10 se amplifico el gen aadA a partir de E. Coli que porta el plasmido pCN1 (Chinault y colaboradores (1986) Plasmid 15: 119-l3l) usando cebadores:

AS130 (Sma I)

GCCCGGGATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGA (SEQ ID NO.41)

AS131 (Bam HI)

15 GGGATCCTGATTTGCCGACTACCTTGGT (SEQ ID NO.42)

gen mGFP4

GGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTA ATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTAT TTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTT TCAAGATACCCAGATCATATGAAGCGGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA GGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAGGGAGACACCCTCGT CAACAGGATCGAGCTTAAGGGAATCGATTTCAAGGAGGACGGAAACATCCTCGGCCACAAGTTGGAATACAAC TACAAC T C C CACAAC GTATACAT CAT GGCAGACAAACAAAAGAAT GGAATCAAAGT TAACT TCAAAATTAGAC ACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGT CCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCAC ATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAATCTAGA (SEQ ID NO.43)

se sintetizo el gen mGFP4 con base en el banco de datos de NCBI (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Ac. No. U87624 y se amplifico usando cebadores:

AS132 (Bam HI)

5 GGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACT (SEQ ID NO.44)

AS133 (Xba I)

TTCTAGATTATTTGTATAGTTCATCCA (SEQ ID NO.45)

Los aadA y mGFP4 se fusionaron a continuacion en una secuencia para generar la fusion aadA-mGFP4 Secuencia de la fusion aadA-mGFP4

CCCGGGATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCC 10 ATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGA

TATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTG

GAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACA

TCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGG

TATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCC

TTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAA

CCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCAT

TTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCG

GCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGC

GCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATCAGGATC

CATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGG

CACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCA

CTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAG

ATACCCAGATCATATGAAGCGGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCTGAGGGATACGTGCAGGAGAGGACC

ATCTTCTTCAAGGACGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAGGGAGACACCCTCGTCAACA

GGATCGAGCTTAAGGGAAT CGAT T T CAAGGAGGACGGAAACAT CCTCGGCCACAAGT T GGAATACAAC TACAA

CTCCCACAACGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAAC

ATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTT

TACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGT

CCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAATCTAGA (SEQ

ID NO.46)

terminador psbA de tabaco

TCTAGACTGGCCTAGTCTATAGGAGGTTTTGAAAAGAAAGGAGCAATAATCATTTTCTTGTTCTATCAAGAGG GTGCTATTGCTCCTTTCTTTTTTTCTTTTTATTTATTTACTAGTATTTTACTTACATAGACTTTTTTGTTTAC ATTATAGAAAAAGAAGGAGAGGTTATTTTCTTGCATTTATTCATGATTGAGTATTCTATTTTGATTTTGTATT TGTTTAAATTGTGAAATAGAACTTGTTTCTCTTCTTGCTAATGTTACTATATCTTTTTGATTTTTTTTTTCCA AAAAAAAAATCAAATTTTGACTTCTTCTTATCTCTTATCTTTGAATATCTCTTATCTTTGAAATAATAATATC ATTGAAATAAGAAAGAAGAGCTATATTCGACCGCGG (SEQ ID NO.47)

el terminador psbA se amplifico a partir de ADN genomico de tabaco de la variedad Petite Gerard con cebadores:

5 AS136 (Xba l)

GTCTAGAGATCTTGGCCTAGTCTATAGGA (SEQ ID NO.48)

AS137 (Sac II)

GCCGCGGTCGAATATAGCTCTTCTTTCTTA (SEQ ID NO.49) terminador atpA de trigo

ACTAGTCAAATAAATTTTGCATGTCTACTCTTGTTAGTAGAATAGGAATCGTTGAGAAAGATTTTTCATTTGA 10 ATCATGCAAAAAAGTTTTCTTTGTTTTTAGTTTAGTATAGTTATTTAAAGAATAGATAGAAATAAGATTGCGT

CCAATAGGATTTGAACCTATACCAAAGGTTTAGAAGACCTCTGTCCTATCCATTAGACAATGGACGCTTTTCT TTCATATTTTATTCTTTCTTTTATTTTTTTTTCTTCTTCCGAGAAAAAACTGTTAGACCAAAACTCTTTTAGG AAATCAAAAAATCCAGATACAAATGCATGATGTATATATTATATCATGCATATATCATAAAGAAGGAGTATGG AAGCTT (SEQ ID NO.50)

se amplifico a partir de ADN genomico de trigo cv Pavon utilizando cebadores AS427 (SpeI)

GACTAGTCAAATAAATTTTGCATGTCTACTC (SEQ ID NO.51)

5 AS428 (HindIII)

GAAGCTTTCCATACTCCTTCTTTATGATATATG (SEQ ID NO.52)

Secuencia flanqueante atpB de Arabidopsis

AAGCTTTCTCATAATAAAAAAAATATGTTAAATTTTGTTACGAATTTTTTCGAATACAGAAAAAATCTTCGAT AGCAAATTAATCGGTTAATTCAATAAAAAGTGGGAGTAAGCACTCGATTTCGTTGGTCCCACCCAAGCGGATG TGGAATTCAATTTTTTATTCATTCAATGAAGGAATAGTCATTTTCAAGCTCAACTAACTGAAACCTAGTTTTA AAAT AAAAAAT AT AT GAAT AAAAAAAT T T T T TGCGGAAAGT C T T T T AT T T T T T T ATCAT AAT AGGAAT AGGCA AGCCTTTGTTTTATCTAGCGAATTCGAAACGGAACTTTAGTTATGATTCATTATTTCGATCTCATTAGCCTTT TTTTTCGTATTTTCATTTTAGCATATCCGGTTCTCGAG (SE ID NO.53)

se amplifico a partir del ADN genomico de Arabidopsis thaliana (Col-0) con los cebadores:

10 Clf-f (Hind III)

CCCAAGCTTTCTCATAATAAAAAAAATATGTTA (SEQ ID NO.54)

Clf-r (Xho I)

CCGCTCGAGAACCGGATATGCTAAAATGAAAATA (SEQ ID NO.55)

Secuencia flanqueante rbcL de Arabidopsis

CCGCGGATGCGTCCCATTTATTCATCCCTTTAGCAACCCCCCCTTGTTTTTCATTTTCATGGATGAATTCCGC ATATTGTCATATCTAGGATTTACATATACAACAGATATTACTGTCAAGAGTGATTTTATTAATATTTTAATTT T AAT AT T AAAT AT T T GGAT T T AT AAAAAGT C AAAGAT TCAAAACT TGAAAAAGAAGT AT T AGGT T GCGC T AT A CATATGAAAGAATATACAATAATGATGTATTTGGCGAATCAAATATCATGGTCTAATAAAGAATAATTCTGAT TAGTTGATAATTTTGTGAAAGATTCCTGTGAAAAAGGTTAATTAAATCTATTCCTAATTTATGTCGAGTAGAC CTTGTTGTTTTGTTTTATTGCAAGAATTCTAAATTCATGACTTGTAGGGAGGGACTTATGTCTAGA (SEQ 15 ID NO.56)

se amplifico a partir del ADN genomico de Arabidopsis thaliana (Col-0) utilizando cebadores:

Crf-f (Sac II)

TCCCCGCGGATGCGTCCCATTTATTCATCCCT (SEQ ID NO.57)

Crf-r (Xba I)

GCTCTAGACATAAGTCCCTCCCTACAAGT (SEQ ID NO.58)

Secuencia flanqueante rbcL de tabaco

GGCGCGCCGAGACATAACTTTGGGCTTTGTTGATTTACTGCGTGATGATTTTGTTGAACAAGATCGAAGTCGC

GGTATTTATTTCACTCAAGATTGGGTCTCTTTACCAGGTGTTCTACCCGTGGCTTCAGGAGGTATTCACGTTT

GGCATATGCCTGCTCTGACCGAGATCTTTGGGGATGATTCCGTACTACAGTTCGGTGGAGGAACTTTAGGACA

TCCTTGGGGTAATGCGCCAGGTGCCGTAGCTAATCGAGTAGCTCTAGAAGCATGTGTAAAAGCTCGTAATGAA

GGACGTGATCTTGCTCAGGAAGGTAATGAAATTATTCGCGAGGCTTGCAAATGGAGCCCGGAACTAGCTGCTG

CTTGTGAAGTATGGAAAGAGATCGTATTTAATTTTGCAGCAGTGGACGTTTTGGATAAGTAAAAACAGTAGAC

ATTAGCAGATAAATTAGCAGGAAATAAAGAAGGATAAGGAGAAAGAACTCAAGTAATTATCCTTCGTTCTCTT

AATTGAATTGCAATTAAACTCGGCCCAATCTTTTACTAAAAGGATTGAGCCGAATACAACAAAGATTCTATTG

CATATATTTTGACTAAGTATATACTTACCTAGATATACAAGATTTGAAATACAAAATCTAGCCGCGG (SEQ

ID NO.59)

se amplifico a partir del ADN genomico del tabaco de la variedad Petite Gerard con cebadores:

5 AS395 (AscI)

GGGCGCGCCGAGACATAACTTTGGGCTTTGTTGA (SEQ ID NO.60)

AS397 (SacII)

GGCCGCGG CTAGATTTTGTATTTCAAATCTTGT (SEQ ID NO.61)

Secuencia flanqueante accD de tabaco

CTCGAGAACTAAATCAAAATCTAAGACTCAAATCTTTCTATTGTTGTCTTGGATCCACAATTAATCCTACGGA TCCTTAGGATTGGTATATTCTTTTCTATCCTGTAGTTTGTAGTTTCCCTGAATCAAGCCAAGTATCACACCTC TTTCTACCCATCCTGTATATTGTCCCCTTTGTTCCGTGTTGAAATAGAACCTTAATTTATTACTTATTTTTTT AT TAAAT T T TAGAT T TGT TAGTGAT TAGATAT TAGTAT TAGACGAGAT T T TACGAAACAAT TAT T T T T T TAT T TCTTTATAGGAGAGGACAAATCTCTTTTTTCGATGCGAATTTGACACGACATAGGAGAAGCCGCCCTTTATTA AAAATTATATTATTTTAAATAATATAAAGGGGGTTCCAACATATTAATATATAGTGAAGTGTTCCCCCAGATT CAGAACTTTTTTTCAATACTCACAATCCTTATTAGTTAATAATCCTAGTGATTGGATTTCTATGCTTAGTCTG ATAGGAAATAAGATATTCAAATAAATAATTTTATAGCGAATGACTATTCATCTATTGTATTTTCATGCAAATA GGGGGCAAGAAAACTCTATGGAAAGATGGTGGTTTAATTCGATGTTGTTTAAGAAGGAGTTCGAACGCACTAG 10 T(SEQ ID NO.62)

se amplifico a partir del ADN genomico del tabaco de la variedad Petite Gerard con cebadores:

AS396 (SpeI))

GGACTAGTGCGTTCGAACTCCTTCTTAAACAAC (SEQ ID NO.63)

AS398 (XhoI)

15 GGCTCGAGAACTAAATCAAAATCTAAGACTCA (SEQ ID NO.64)

Secuencia flanqueante atpB de tomate (tmLFS)

GGCGCGCCGTCCGCTAGCACGTCGATCGGTTAATTCAAAAAAATCGGAATTAGCACTCGATTTCGTTGGCACC ATGCAATTGAACCAATCCAATTGTTTACTTATTCAATGAGACTGAGTTAATTTGGAAGCTCACCCAACCTATT TTCATTTAAAAATCTCAAGTGGATGAATCAGAATCTTGAGAAATTCTTTCATTTGTCTATCATTATAGACAAG CCCATCCATATTATCGATTCTATGGAATTCGAACCTGAACTTTATTTTCTATTTCTATTACGATTCATTATTT GTATCTAATGGGCTCCTCTTCTTATTTATTTTTTATTTAAATTTCAGCATATCGATTTATGCCTAGCCTATTC TTTTCTTTGCGTTTTTCTTTCTTTTTTATACCTTTCATAGATTCATAGAGGAATTCCATATATTTTCACATCT AGGATTTACATATACAACATATACCACTGTCAAGGGGGAAGTTCCCGCGG (SEQ ID NO.65)

se amplified a partir del ADN genomico de tomate (Lycopersicon esculentum var. Moneymaker) con cebadores AS417 (AscI)

GGGCGCGCCGTCCGCTAGCACGTCGATCGGT (SEQ ID NO.66)

5 AS418 (SstII)

GCCGCGGGAACTTCCCCCTTGACAGTGGTAT (SEQ ID NO.67)

Secuencia flanqueante rbcL de tomate (tmRFS)

GTCGACAGGGGGAAGTTCTTATTATTTAGGTTAGCTAGGTATTTCCATTTCAAAAAAAAAAAAGGTAAAAAAT CAAAATTGGGTTGCGCTATATATATGAAAGAGTATACAATAATGATGTATTTGGCAAATCAAATACCATGGTC TAATAATCAACCATTCTGATTAATTGATAATATTAGTATTAGTTGGAAATTTTGTGAAAGATTCCTGTGAAAA GTTTCATTAACGCGGAATTCATGTCGAGTAGACCTTGCTGTTGTGAGAATTCTTAATTCATGAGTTGTAGGGA GGGATTTATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTACAAATTG ACTTATTATACTCCTGAGTACCAAACCAAGGATACTGATATATTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTG GAGTTCCACCTGAAGAAGCAGGGGCCGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTATGGAG CATGC (SEQ ID NO.68)

se amplifico a partir del ADN genomico de tomate (Lycopersicon esculentum var. Moneymaker) con cebadores:

10 AS419 (SalI)

GGTCGACAGGGGGAAGTTCTTATTATTTAGGT (SEQ ID NO.69)

AS420 (SphI)

GGCATGCTCCATACAGTTGTCCATGTACCAGT (SEQ ID NO.70)

Secuencia flanqueante atpB de arroz (rLFS)

GGCGCGCCCTTGTTGAATAATGCCAAATCAACACCAAAAAAATATCCAAAAATCCAAAAGTCAAAAGGAAATG AATTAGTTAATTCAATAAGAGAGAAAAGGGGACCAGCACTTGATTTCGTTGCCCAAACGAATCCCATTCAATC GTTTACTCATGGAATGAGCCCGTCGGAAAGTTCAATCAATCTTTTTTTCATATACATTTTGCCTTTTGTAAAC GATTTGTGCCTACTCTACTTTCTTATCTAGGACTTCGATATACAAAATATATACTACTGTGAAGCATAGATTG CTGTCAACAGAGAATTTTCGTAGTATTTAGGTATTTCCACTCAAAATAAGAAAAGGGGGTCTATTAAGAACTT AATAAGGATTAGAAGTTGATTTGGGGTTGCGCTATATCTATTAAAGAGTATACAATAAAGATGGATTTGGTGA 1C; ATCAAATCCATGGTTTAATAACGAAGCATGTTAACTTACCATAACAACAACAAGCTT (SEQ ID NO.71)

se amplified a partir del ADN genomico de arroz (Oryza sativa), var. Nippon bare con cebadores:

AS421 (AscI)

GGGCGCGCCCTTGTTGAATAATGCCAAATCAA (SEQ ID NO.72)

AS422 (HindIII)

5 GAAGCTTGTTGTTGTTATGGTAAGTTAACA (SEQ ID NO.73)

Secuencia rbcL de arroz Right (rRFS)

CCGCGGTCAATTCTTATCGAATTCCTATAGTAGAATTCCTATAGCATAGAATGTACACAGGGTGTACCCATTA

TATATGAATGAAACATATTATATGAATGAAACATATTCATTAACTTAAGCATGCCCCCCATTTTCTTTAATGA

GTTGATATTAATTGAATATCTTTTTTTTAAGATTTTTGCAAAGGTTTCATTTACGCCTAATCCATATCGAGTA

GACCCTGTCGTTGTGAGAATTCTTAATTCATGAGTTGTAGGGAGGGACGTATGTCACCACAAACAGAAACTAA

AGCAAGTGTTGGATTTAAAGCTGGTGTTAAGGATTATAAATTGACTTACTACACCCCGGAGTACGAAACCAAG

GACACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAGCCGGGGGTTCCGCCCGAAGAAGCAGGGGCTGCAG

TAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTTTGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGAGCATGC

(SEQ ID NO.74)

se amplifico a partir del ADN genomico de arroz (Oryza sativa), var. Nippon bare con cebadores AS423 (SstII)

10 GCCGCGGTCAATTCCTATCGAATTCCTATAGTA(SEQ ID NO.75)

AS424 (SphI)

GGCATGCTCAAGACTGGTAAGTCCATCAGTCC (SEQ ID NO.76)

Se sintetizo el promotor 35S con base en el banco de datos de NCBI Ac. NC_001497 (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y se utilizo para la expresion del intron que contenia el casete transgenico del cloroplasto.

15 Promotor 35S

GAATTCCAATCCCACAAAAATCTGAGCTTAACAGCACAGTTGCTCCTCTCAGAGCAGAATCGGGTATTCAACA CCCTCATATCAACTACTACGTTGTGTATAACGGTCCACATGCCGGTATATACGATGACTGGGGTTGTACAAAG GCGGCAACAAACGGCGTTCCCGGAGTTGCACACAAGAAATTTGCCACTATTACAGAGGCAAGAGCAGCAGCTG ACGCGTACACAACAAGTCAGCAAACAGACAGGTTGAACTTCATCCCCAAAGGAGAAGCTCAACTCAAGCCCAA GAGCTTTGCTAAGGCCCTAACAAGCCCACCAAAGCAAAAAGCCCACTGGCTCACGCTAGGAACCAAAAGGCCC AGCAGTGATCCAGCCCCAAAAGAGATCTCCTTTGCCCCGGAGATTACAATGGACGATTTCCTCTATCTTTACG ATCTAGGAAGGAAGTTCGAAGGTGAAGTAGACGACACTATGTTCACCACTGATAATGAGAAGGTTAGCCTCTT CAATTTCAGAAAGAATGCTGACCCACAGATGGTTAGAGAGGCCTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTAC CCGAGTAACAATCTCCAGGAGATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTA AT T GCAT CAAGAACACAGAGAAAGACATAT T T C T CAAGAT CAGAAGTAC TAT T CCAGTAT GGACGAT T CAAGG CTTGCTTCATAAACCAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCTACTGAATCTAAGGCC ATGCATGGAGTCTAAGATTCAAATCGAGGATCTAACAGAACTCGCCGTGAAGACTGGCGAACAGTTCATACAG AGTCTTTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACTCTGGTCTACTCCA AAAATGTCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGATAATTTCGGGAAA CCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTAC AAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATCTCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGAC CCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGA CATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGT TCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTCGAG (SEQ ID NO.77)

El promotor TAF2 de Arabidopsis se uso para dirigir la expresion de protemas codificadas por intron (IEP). Se amplifico a partir del ADN genomico de Arabidopsis thaliana (Col-0) usando los siguientes cebadores:

TAF2-F GGTACCATGATCGCTTCATGTTTTTATC (SEQ ID NO. 153)

5 TAF2-R CTCGAGGTTCCTTTTTTGCCGATATGTT (SEQ ID NO. 154)

Promotor TAF2 de Arabidopsis

GGTACCATGATCGCTTCATGTTTTTATCTAATTTGTTAGCATATTGAATGATTGATTTTCTTTTAATTTGGAT

ATGTTGATTGTCTTGTTGCATCATCAATGTATGTTTTATTTAACACCGGAAGATCTTATGATGGGTTCATTAC

TTCATAATAATCTCCGAGTTCTACAAGACTACAACTTTCACGTGACTTTTACAGCGACAAAAAATGCATCTAG

CGAAAATTAATCCACAACCTATGCATTTTTGTCACTCTTCACACGCGTATGTGCATAAATATATAGTATATAC

TCGACAATCGATGCGTATGTGTACACAATTACCAAAACAATTATTTGAATATTCAGACATGGGTTGACATCAC

CAAGTAATATTCACAGTATCTGAAAACTATGTTTTGACATCCCTAAATAGTTTGACTAACCAGTTTAATATGA

GAGCATTTGTAAGAGGCAAGAGCCATGGTTTTGTTGGCTCGTTTAATATGCTCATTTAACCCCCCCAAAAAAT

ACTATTAGATTTAAACGTAAAAGAATTAACGAACACAAGAACTGCTAAAACAAAAAAAAATCAATGGCCGACA

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TTTCATAGTTCATACATCACTAATACTAAAAGATGCATCATTTCACTAGGGTCTCATGAAATAGGAGTTGACA TTTTTTTTTGTAACGACAGAAGTTGACATGTTAAGCATCAATTTTTTTAAGAGTGGATTATACTAGTTTTTTT TTTTTTTTTTAATGTATGGTATGATACAACAACAAAAACTATAAAATAGAAAAAGTCAGTGAAACCTCAAATT GAAGGAAAAAC T T T T GCACAAAAAGAGAGAGAGAGAGAAAGAAT GTAAAT CCAAATAAAT GGGCC TAAT T GAG AATGCTTTAACTTTTTTTTTTTGGCTAAAAGAGAATGCTTTAACTAAGCCCATAAAATGAACATCAAACTCAA AGGGTAAGAT TAATACAT T TAGAAAACAATAGCCGAATAT T TAATAAGT T TAAGACATAGAGGAGT T T TATGT AATTTAGGAACCGATCCATCGTTGGCTGTATAAAAAGGTTACATCTCCGGCTAACATATCGGCAAAAAAGGAA CCTCGAG (SEQ ID NO.78)

Transformation de plantas Transformation de plantas de Arabidopsis

Se realizo la transformacion de las plantas de Arabidopsis como se describe en Clough & Bent (Clough & Bent (1998) Plant Journal 16: 735-743). Se utilizo la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens (Koncz y Schell (1986) Mol Gen Genet 204: 383-396) para la transformacion. La transformacion de las plantas se llevo a cabo con tres constructos diferentes ALG4-1, ALG4-2 y ALG8-1 (Figura 1) basadas en el vector binario pGreen 0029 (Hellens y colaboradores (2000) Plant Mol. Biol 42: 819-832). En resumen, se inserto un casete de transformacion de cloroplasto que conterna la secuencia flanqueante atpB, el promotor Prrn, la fusion aadA-mGFP4, PSA 3 ’UTR, la secuencia flanqueante rbcL en el dominio IV de los intrones LtrB o trnK usando enzimas AscI-NotI. Los intrones que contetian el casete de transformacion se fusionaron con el promotor 35S y el terminador nos y se introdujeron en el vector binario pGreen0029 (Figura 1). La proterna LtrA codificada por el intron LtrB se fusiono a un peptido de transito de cloroplasto y se inserto en pGreen 0029 junto con el casete de ALG4-1, dando como resultado ALG4-2.

Las Kneas transgenicas se recuperaron en un medio de selection suplementado con 50 mg/l de kanamicina. Transformacion de plantas de tabaco

Las plantas de tabaco fueron transformadas como lo describen Horschet (Horschet y colaboradores (1985) Science 227: 1229-1231) usando la cepa AGG1 de Agrobacterium (vease el protocolo, mas adelante).

Se usaron cinco constructos que comprendian cuatro intrones diferentes, el intron LtrB de Lactococcus lactis, el intron trnK de tabaco y los intrones atpF y petD de maiz para la construction del vector (Figura 2). Se inserto el casete del transgen del cloroplasto que porta la secuencia flanqueante rbcL, el promotor Prrn, la fusion aadA-mGFP4, psbA 3’ UTR, la secuencia flanqueante accD en el dominio IV de cada uno de dichos intrones. El intron que contetia el casete transgenico se coloco bajo control del promotor 35S y del terminador nos, y despues se inserto en el vector binario pGreen0029, dando como resultado los constructos ALG6, ALG8, ALG9, ALG10. El gen codificado por intron LtrB para LtrA se fusiono a un peptido de transito de cloroplasto y se anadio el promotor TAF2 de Arabidopsis al constructo ALG6 dando como resultado el vector ALG7. El gen codificado por el intron trnK para las protemas matK tambien se fusiono con el peptido de transito de cloroplasto y se anadio a ALG8 dando como resultado el vector ALG8-1.

Las plantas de tabaco transgenicas se regeneraron en medio de seleccion suplementado con 300 mg/l de kanamicina.

Transformacion de plantas de tomate

Se generaron plantas de tomate transgenicas como lo describen Fillatti y colaboradores (Fillatti y colaboradores (1987) Bio/Technology 5, 726-730) usando la cepa AGL1 de Agrobacterium (vease el protocolo, mas adelante). Se prepararon dos constructos con base en los vectores ALG7 y ALG8-2, en donde se reemplazaron las secuencias flanqueantes del tabaco por secuencias flanqueantes de atpB y rbcL espedficas de tomate dando como resultado vectores ALG7-1 y ALG8-3 (Figura 3).

Transformacion de plantas de arroz

La transformacion del arroz se llevo a cabo usando bombardeo de particulas como lo describen Christou y colaboradores (Christou y colaboradores (1991) Bio/Technology 9: 957-962). Se utilizo para la transformacion la variedad cultivada de arroz japonica Nipponbare. Se preparo un casete transgenico de cloroplasto que contetia la

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30

region flanqueante atpB de arroz, el promotor 16S de trigo, la fusion aadA-mGFP4, el terminador atpA de trigo y secuencias flanqueantes rbcL de arroz. Este casete transgenico se inserto en el casete del intron LtrB, el casete del intron atpF y el casete del intron petD en el vector pGreen 0179 que contema resistencia codificada a la higromicina, dando como resultado los vectores ALG7-2, ALG9-1 y ALG10-1 (Figura 4). Las plantas transgenicas se recuperaron en medio suplementado con 50 mg/l de higromicina.

Analisis molecular-biologico

El ADN de plantas transgenicas se aislo usando el procedimiento descrito por Puchooa (Puchooa (2004) African J Biotech 3: 253-255) o utilizando el minikit de plantas DNeasy de Invitrogen siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se aislo usando TRI REAGENTMR (Sigma).

Las reacciones de PCR se realizaron usando ADN Polimerasa GoTaq Flexi (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los siguientes cebadores:

Arabidopsis

MS7 CCCTCTGTCGCACTCATAGCTACAG (SEQ ID NO.79)

MS18 GGAGATGTTGTGCGAGTATCGACAGG(SEQ ID NO.80)

IM68 CAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCC(SEQ ID NO.81)

IM69 GCTGGGATTACACATGGCATGGATGAAC(SEQ ID NO.82)

IM70 ATAGGTGAAAGTAGTGACAAGTGTTGGC(SEQ ID NO.83)

IM71 CGTATGTTGCATCACCTTCACCCTCTC(SEQ ID NO.84)

Tabaco

AS457 AGAGAATTGGGCGTTCCGATCGTAA (SEQ ID NO.85)

AS458 GGATTCACCGCAAATACTAGCTTG (SEQ ID NO.86)

AS459 GAAATTCCGAATGTCTTTAACGCCGA(SEQ ID NO.87)

AS460 TGGAATAACTGTCTCCATTCCTATCACT(SEQ ID NO.88)

IM68 CAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCC(SEQ ID NO.81)

IM69 GCTGGGATTACACATGGCATGGATGAAC(SEQ ID NO.82)

IM70 ATAGGTGAAAGTAGTGACAAGTGTTGGC(SEQ ID NO.83)

IM71 CGTATGTTGCATCACCTTCACCCTCTC(SEQ ID NO.84)

Tomate

TM1 AAAGGCTACATCTAGTACCGGAC (SEQ ID NO.89)

TM2 CCAGAAGTAGTAGGATTGATTCTCA(SEQ ID NO.90)

TM3 CGATCAAGACTGGTAAGTCCAT(SEQ ID NO.91)

TM4 ACAATGGAAGTAAGCATATTGGTAA(SEQ ID NO.92)

Arroz

RC1 GGGTCCAATAATTTGATCGATA(SEQ ID NO.93)

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RC3 GTCTAATGGATAAGCTACATAAGCGA(SEQ ID NO.95)

RC4 CCCACAATGGAAGTAAACATGT(SEQ ID NO.96)

Los fragmentos amplificados se clonaron en el vector pGEM t-easy y se secuenciaron para confirmar el sitio de insercion correcto. Los analisis no radiactivos de Southern y Northern se realizaron utilizando el kit de marcacion y deteccion de ADN DIG High Prime y el kit DIG Northern (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Resultados y discusion

La transformacion de Arabidopsis, tabaco, tomate y arroz se realizo con vectores intron basados en el grupo II que conteman casetes transgenicos para transformacion de cloroplastos. Se usaron vectores con protemas codificadas por intron (IEP) tales como LtrA y matK o sin IEP introducida. En todos los casos, fue posible detectar la insercion del casete transgenico en el genoma del cloroplasto utilizando amplificacion por PCR de las regiones de union. Se analizaron cinco lmeas transgenicas independientes para todos los constructos y se pudo amplificar el fragmento de ADN de tamano correcto para las uniones de insercion en todas las lmeas. Los fragmentos amplificados se secuenciaron y se confirmaron los sitios de insercion correctos. Los mismos datos se generaron con amplificacion por PCR de los flancos de insercion en el tabaco para lmeas con vectores basados en el intron trnK de tabaco (ALG8) y vectores basados en atpF y petD de mafz.

El analisis de Northern tambien se realizo para confirmar la presencia de transcritos de cloroplasto sentido. Todos los vectores de transformacion teman el casete transgenico insertado en la orientacion antisentido y como resultado, el transcrito generado a partir del nucleo tambien estara en la orientacion antisentido. Solo el casete del transgen que se inserta en el genoma del cloroplasto puede generar un transcrito sentido del transgen. Se prepararon sondas antisentido marcadas con DIG usando aRn polimerasa T3 y se usaron en hibridacion de Northern. De hecho, se podfan detectar transcritos sentido sobre el ARN total en todas las lmeas transformadas con vectores ALG6, ALG7 y ALG8. No se detecto senal en la muestra de ARNm lo que indica que el transcrito era de origen en el cloroplasto (los transcritos de cloroplasto no estan mayormente poliadenilados) o en el control negativo donde se uso ARN total de tabaco de tipo silvestre.

Hemos aprendido que la sobreexpresion de la IEP mejora la eficiencia de la transformacion, sin embargo, las protemas endogenas expresadas desde el nucleo pueden tambien realizar las mismas funciones debido a la estructura conservada del intron. Las protemas putativas relacionadas con la transcriptasa inversa/maturasas del grupo II se identificaron utilizando alineaciones de secuencias en genomas de Arabidopsis y de arroz (Mohr y Lambowitz (2003) Nucleic Acids Research 31: 647-652). Tambien se ha demostrado que una serie de protemas expresadas desde el nucleo (CRS1, CRS2, CAF1, HCF-152) estan participando en el empalme de intrones de organelo (Jenkins y colaboradores (1997) Plant Cell 9: 283-296; Vogel y colaboradores (1999) Nucleic Acids Research 27: 3866-3874; Fisk y colaboradores (1999) EMBO J 18: 2621-2630; Meierhoff y colaboradores (2003) Plant Cell 15: 1480-1495; Ostheimer y colaboradores (2003) EMBO J 22: 3919-3929). Estas protemas se unen al ARN del intron y se piensa que sirven como recipiente para dirigir el ARN de vectores basados en intron en los organelos. El genoma del cloroplasto de las plantas contiene solo un matK de ORF que es similar al gen LtrA de L. lactis y esta codificado por el intron trnK. Se ha demostrado que esta protema tiene actividad de union al ARN del intron y puede ser responsable de la transcripcion inversa en los cloroplastos (Liere & Link (1995) Nucleic Acids Research 23: 917-921). La presencia de esta protema en los cloroplastos es el requisito previo mas importante para la insercion de vectores basados en intrones, ya que podnan ser transcritos de forma inversa por matK despues de dirigirlos a los cloroplastos mediante protemas codificadas en el nucleo implicadas en el empalme.

2. Optimizacion de la transformacion del cloroplasto

Se introdujeron las siguientes mejoras para optimizar la eficacia de la transformacion del cloroplasto:

1. El intron Ll.ltrB de Lactococcus lactis se optimizo in silico eliminando sitios de empalme ocultos y optimizando su expresion en plantas utilizando el programa basado en la web que se encuentra en
http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPGene/.

2. Se modifico el casete del transgen del cloroplasto mediante la insercion de intrones de los genes de Arabidopsis At2g29890 (intrones 1, 2, 3, 5, 6) y At1g67090 (intron 4) (
http://www.arabidopsis.org/servlets/Search?type=general&ac- tion=new_search) que estabiliza el transcrito en celulas vegetales y mediante la adicion de un sitio de union del cebador (PBS) al extremo 3' del casete para facilitar mejor la transcripcion inversa del casete;

3. Se sintetizo un gen LtrA sintetico mediante el uso optimo de codones vegetales para la expresion en plantas, y se introdujeron intrones seleccionados del gen At5g43940 de Arabidopsis para mejorar la estabilidad del transcrito de ARN;

4. Se genero sobreexpresion de la transcriptasa inversa (RT-RH) del retrotransposon tntl de tabaco (Acceso No. x13777) fusionado al peptido de transito del cloroplasto de subunidad pequena de Rubisco (Acceso No. x02353, posicion 1048-1218) a partir de tabaco, para facilitar la transcripcion inversa del ARN del casete del transgen. RT-RH reconoce el sitio de union del cebador (PBS) y asf inicia la transcripcion inversa usando el ARNt-Met de cloroplasto 5 como cebador.

Intron L1.LtrB optimizado

ACACATCCATAACGTGCGCCCAGATAGGGTGTTAAGTCAAGTAGTTTAAGGTACTACTCAGTAAGATAACACT GAAAACAGCCAACCTAACCGAAAAGCGAAAGCTGATACGGGAACAGAGCACGGTTGGAAAGCGATGAGTTAGC TAAAGACAATCGGCTACGACTGAGTCGCAATGTTAATCAGATATAAGCTATAAGTTGTGTTTACTGAACGCAA GTTTCTAATTTCGGTTATGTGTCGATAGAGGAAAGTGTCTGAAACCTCTAGTACAAAGAAAGCTAAGTTATGG TTGTGGACTTAGCTGTTATCACCACATTTGTACAATCTGTTGGAGAACCAATGGGAACGAAACGAAAGCGATG GCGAGAATCTGAATTTACCAAGACTTAACACTAACTGGGGATAGCCTAAACAAGAATGCCTAATAGAAAGGAG GAAAAAGGCTATAGCACTAGAGCTTGAAAATCTTGCAAGGCTACGGAGTAGTCGTAGTAGTCTGAGAAGGCTA ACGGCCTTTACATGGCAAAGGGCTACAGTTATTGTGTACTAAAATTAAAAATTGATTAGGGAGGAAAACCTCA AAATGAAACCAACAATGGCAATTTTAGAAAGAATCAGTAAAAATTCACAAGAAAATATAGACGAAGTTTTTAC AAGACTTTATCGTTATCTTTTACGTCCTGATATTTATTACGTGGCGGGCGCGCCACGCGTGCGGCCGCTGGGA AATGGCAATGATAGCGAAAGAACCTAAAACTCTGGTTCTATGCTTTCATTGTCATCGTCACGTGATTCATAAA CACAAGTGAATTTTTACGAACGAACAATAACAGAGCCGTATACTCCGAGAGGGGTACGTACGGTTCCCGAAGA GGGTGGTGCAAACCAGTCACAGTAATGTGAACAAGGCGGTACCTCCCTACTTCAC (SEQ ID NO. 97)

Gen LtrA sintetico optimizado para la transformacion de plantas (LtrASi)

ATGAAGCCAACAATGGCAATCCTCGAACGAATCTCTAAGAACTCACAGGAGAACATCGACGAGGTCTTCACAA GACTTTACCGTTACCTTCTCCGTCCTGACATCTACTACGTGGCATATCAGAACCTCTACTCTAACAAGGGAGC T T C TACAAAGGGAAT CC T CGAT GATACAGC T GAT GGAT T C T C T GAGGAGAAGAT CAAGAAGAT CAT CCAAT C T TTGAAGGACGGAACTTACTACCCTCAGCCTGTCCGAAGAATGTACATCGCAAAGAAGAACTCTAAGAAGATGA GACCTCTTGGAATCCCAACTTTCACAGACAAGTTGATCCAGGAGGCTGTGAGAATCATCCTTGAATCTATCTA TGAGCCTGTCTTCGAGGATGTGTCTCACGGTTTCCGACCTCAGCGAAGCTGTCACACAGCTTTGAAGACAATC AAGAGAGAGTTCGGAGGTGCAAGATGGTTCGTGGAGGGAGATATCAAGGGATGCTTCGATAACATCGACCACG TCACACTCATCGGACTCATCAACCTTAAGATCAAGGATATGAAGATGAGCCAGTTGATCTACAAGTTCCTCAA GGCAGGTACCTTTATCCTCGATCCTCGCACTCTCACTATCTGTAGACATGTTATTGAAAAACCCTATCTCCGA TTATTAGTTTTCTGATTTTCATTTCATTTTGACGCCGATTCACATAGGTTACCTCGAAAACTGGCAGTACCAC AAGACTTACAGCGGAACACCTCAGGGCGGAATCCTCTCTCCTCTCCTCGCTAACATCTATCTTCATGAATTGG ACAAGTTCGTTCTCCAACTCAAGATGAAGTTCGACCGAGAGAGTCCAGAGAGAATCACACCTGAATACCGGGA GCTTCACAACGAGATCAAAAGAATCTCTCACCGTCTCAAGAAGTTGGAGGGCGAGGAGAAGGCTAAGGTTCTC TTGGAATACCAGGAGAAGAGGAAGAGGTTGCCTACACTCCCTTGTACATCACAAACAAACAAGGTTCGTTCTC TCCATTTTCATTCGTTTGAGTCTGATTTAGTGTTTTGTGGTTGATCTGAATCGATTTATTGTTGATTAGTGAA TCAATTTGAGGCTGTGTCCTAATGTTTTGACTTTTGATTACAGGTCTTGAAGTACGTCCGATACGCTGACGAC TTCATCATCTCTGTTAAGGGAAGCAAGGAGGACTGTCAATGGATCAAGGAGCAATTGAAGCTCTTCATCCATA ACAAGCTCAAGATGGAATTGAGTGAGGAGAAGACACTCATCACACATAGCAGTCAGCCTGCTCGTTTCCTCGG ATACGACATCCGAGTCAGGAGAAGTGGAACTATCAAGCGATCTGGAAAGGTCAAGAAGAGAACACTCAACGGG AGTGTGGAGCTTCTCATCCCTCTCCAAGACAAGATCCGTCAATTCATCTTCGACAAGAAGATCGCTATCCAGA AGAAGGATAGCTCATGGTTCCCAGTTCACAGGAAGTACCTTATCCGTTCAACAGACTTGGAGATCATCACAAT CTACAACTCTGAATTGAGAGGTAAGCTGCTACCTCAAACTTTCTAGTGCTTCCATATTTCCTTTCTTCTGCAA GGCAGAGAACCATTGTGGTTAAGTGTTTTAAATTGTGAATGTATAGGTATCTGCAACTACTACGGTCTCGCAA GTAACTTCAACCAGCTCAACTACTTCGCTTACCTTATGGAATACTCTTGCTTGAAGACTATCGCATCTAAGCA TAAGGGAACACTCTCAAAGACCATCTCTATGTTCAAGGATGGAAGTGGTTCTTGGGGAATCCCTTACGAGATC AAGCAGGGGAAGCAGAGGAGATACTTCGCCAACTTCAGTGAATGCAAATCTCCTTACCAATTCACTGATGAGA TCAGTCAAGCTCCTGTGCTTTACGGATACGCTCGGAACACTCTTGAGAACAGACTTAAGGCTAAGTGTTGTGA GCTTTGTGGAACATCTGATGAGAACACATCTTACGAGATCCACCACGTCAACAAGGTCAAGAACCTTAAGGGA AAGGAGAAGTGGGAGATGGCAATGATCGCTAAGCAGCGGAAGACTCTTGTTGTTTGCTTCCATTGTCATCGTC ACGTGATCCATAAGCACAAGTGA (SEQ ID NO. 98)

La secuencia de LtrASi (LtrASi: LtrA Sintetico + Intrones) se diseno in silico y luego se sintetizo qmmicamente usando intrones que se introdujeron en la secuencia sintetica usando cebadores superpuestos.

5 Los intrones se amplificaron a partir del ADN genomico de Arabidopsis utilizando los siguientes cebadores:

IM333 ATCTACAAGTTCCTCAAGGCAGGTACCTTTATCCTCGATCCTCG (SEQ ID NO. 99)

IM334 TACTGCCAGTTTTCGAGGTAACCTATGTGAATCGGCGTCAAAAT (SEQ ID NO. 100) para el intron 1;

IM337 TTGTACATCACAAACAAACAAGGTTCGTTCTCTCCATTTTCATT (SEQ ID NO. 101)

IM341 ATCTACAACTCTGAATTGAGAGGTAAGCTGCTACCTCAAACTTT (SEQ ID NO. 103)

IM342 AGACCGTAGTAGTTGCAGATACCTATACATTCACAATTTAAAAC (SEQ ID NO. 104) para el intron 3.

La region de codificacion LtrAS se amplifico usando procedimientos estandar empleados en la tecnica (por ejemplo, 5 Maniatis y colaboradores, citado mas arriba) usando los siguientes cebadores:

LTRA-F21 GCATGCATGAAGCCAACAATGG (SEQ ID NO.105)

IM332 CGAGGATCGAGGATAAAGGTACCTGCCTTGAGGAACTTGTAGAT (SEQ ID NO.106) para el fragmento 1; IM335 ATTTTGACGCCGATTCACATAGGTTACCTCGAAAACTGGCAGTA (SEQ ID NO. 107)

IM336 AATGAAAATGGAGAGAACGAACCTTGTTTGTTTGTGATGTACAA (SEQ ID NO. 108) para el fragmento 2;

10 IM339 ATGTTTTGACTTTTGATTACAGGTCTTGAAGTACGTCCGATACG (SEQ ID NO. 109)

IM340 AAAGTTTGAGGTAGCAGCTTACCTCTCAATTCAGAGTTGTAGAT (SEQ ID NO.110) para el fragmento 3;

IM343 GTTTTAAATTGTGAATGTATAGGTATCTGCAACTACTACGGTCT (SEQ ID NO.111)

LTRA-R21 TTACTAGTTCACTTGTGCTTATGG (SEQ ID NO. 112) para el fragmento 4

El intron y los fragmentos de la secuencia codificante se combinaron y se realizo la amplificacion por PCR utilizando 15 metodos comunmente empleados en la tecnica (Maniatis y colaboradores, citado mas arriba) de toda la secuencia de LtrASi con cebadores LTRA-F21 y LTRA-R21.

Fusion aadA-mGFP optimizada para transformacion

ATGGCAGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAAGTAACTTTTAGCTCTCAGCTGCTG TTTACTAAGTTCATGCCATACATTGATTCTGGTTTATTAAGGGTTATGTTCAGTATTACTAGTAACAAAATCT ATTTCTTCGTTTCCGTCTGCAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACAT TTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAA GGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGA GATTCTCCGCGCTGTAGAGGTAATTTTCATCTTTGTTTGGCCTTCCAAGTGCTTTTTTTGCTGTTTACGGGTG GAACTTCAGTAAAAATGGGATCAAAACATCATATGGCATAAATAAATTTTAAGAATGGCGAACTCGGGGTTAC CGAATATGGCTTCCTTTTTCAGTGTTTCTTAGTCCATTGTACTTATGAGATTGCAGGTCACCATTGTTGTGCA CGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATT C T T GCAGG TAT C T T C GAGCCAGCCACGATCGACAT TGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATA GCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCT AAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCAGGTAAGAAATCTTTTCCCATCTTGAAGTCA CCTCAAACCGAACGTTAGGAAATTCCAAAATGTTTTGATAGTAGTCTACTTAGTTTCAAGTTTTGGGTTTGTG TATACTTTCACTAATAATATGCGTGGAAACATTGCAGGTGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCA TTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCC GGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCG CGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATCAGGAT CCATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAA TGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTAATTAAACAAAATTTAAACATCTATATAAACTAGCT AGATCTTAGGAAAATTTGGTTTAATATATTAGGATCTTGATTTATATAAACATGTTCAAAATGTTATCTGAGT GGTTTGTAACATGTGGTTTGTATAGGTGATGCTACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTG GAAAACTACCTGTTCCTTGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCC GGATCAGATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCT TTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTAAGTAAATATTGGTAATATAAC ATTTTTACATGACTTTGGTGTCTTAATTTGTCGTTTCGCATGTGTTTCATTTAGTTTCTGCCAGAGCATCTGA GAGGCCATTCTTAATATATGATATGATGTTGCTTTGCTCTAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTGAA AGGAAT CGAC T T C AAGGAAGAT GGAAACAT C C TCGGACACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCACACAACGTG TACAT CAC C GCAGACAAACAGAAGAAT GGAAT CAAAGC TAAC T T CAAAAT T C GCCACAACAT T GAAGAT GGT T CCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATAGGTACGCAGGCTATATAGGCTTTGACATTTTT TTGTTTTCATATTTTTCTTTGTTCCACTATGAACTTCATTCTGTTTTTTGACTTCATTGCAGGTGATGGCCCT GTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGAGACC ACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAA (SEQ ID NO. 113)

Los intrones se insertaron en la secuencia de fusion aadA-mGFP4 por PCR con cebadores superpuestos. Los intrones se amplificaron mediante PCR a partir de ADN genomico de Arabidopsis utilizando los siguientes cebadores:

5 aadAF2 actatcagaggtaagtaacttttagctctca (SEQ ID No. 114)

aadAR2 cgccaactacctgcagacggaaacgaagaa (SEQ ID No. 115) para el intron 1;

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aadAR4 caatggtgacctgcaatctcataagtacaatg (SEQ ID NO. 117) para el intron 2;

aadAF6 gactgggcaggtaagaaatcttttcccatcttga (SEQ ID NO. 118)

aadAR6 cgctcatcacctgcaatgtttccacgcatat (SEQ ID NO. 119) para el intron 3;

mGFP2F gagggtgaaggtaatttattcttctttgttttc (SEQ ID NO. 120)

mGFP2R gtagcatcacctgtttaagaagaaaatcaaaat (SEQ ID NO. 121) para el intron 4;

mGFP4F aagtttgaaggtaagtaaatattggtaatataac (SEQ ID NO. 122)

mGFP4R agggtatcacctagagcaaagcaacatcatatc (SEQ ID NO. 123) para el intron 5;

mGFP6F tactccaataggtacgcaggctatataggctttg (SEQ ID NO. 124)

mGFP6R agggccatcacctgcaatgaagtcaaaaaacag (SEQ ID No. 125) para el intron 6 (Fig. 5).

La PCR para los fragmentos de aadA se realizo con los siguientes cebadores:

AS756 atacaagtgagttgtagggagggaatcatggcagaagcggtgatcgccga (SEQ ID NO. 126)

aadAR1 aagttacttacctctgatagttgagtcgata (SEQ ID NO. 127) para el fragmento 1;

aadAF3 ccgtctgcaggtagttggcgtcatcgagcgcca (SEQ ID NO. 128)

aadAR3 gatgaaaattacctctacagcgcggagaatct (SEQ ID NO. 129) para el fragmento 2;

aadAF5 gagattgcaggtcaccattgttgtgcacgac (SEQ ID NO. 130)

aadAR5 agatttcttacctgcccagtcgggcggcga (SEQ ID NO. 131) para el fragmento 3;

aadAF7 aaacattgcaggtgatgagcgaaatgtagtgct (SEQ ID NO. 132)

AS131 tcctgatttgccgactaccttggt (SEQ ID NO. 133) para el fragmento 4.

Los fragmentos amplificados con cebadores para los intrones 1, 2 y 3 se mezclaron con los fragmentos 1, 2, 3 y 4 amplificados del gen aadA y se realizo la PCR con cebadores AS756 y AS131 para generar la secuencia aadA con intrones.

Los fragmentos del gen mGFP se amplificaron con los siguientes cebadores:

AS132 gggatccatgagtaaaggagaagaact (SEQ ID NO. 134)

mGFPR1 aaaatttagaacagatattgaccttcaccctctccactgacagaa (SEQ ID NO. 135) para el fragmento 1; mGFPF3 ttcttaaacaggtgatgctacatacggaaaac (SEQ ID NO. 136) mGFPR3 atttacttaccttcaaacttgacttcagcac (SEQ IS NO. 137) para el fragmento 2; mGFPF5 ctttgctctaggtgatacccttgttaatcgta (SEQ ID NO. 138)

mGFPR5 agcctgcgtacctattggagtattttgttgataat (SEQ ID NO. 139) para el fragmento 3; mGFPF7 ttcattgcaggtgatggccctgtccttttacca (SEQ ID NO. 140)

AS133 ttctagattatttgtatagttcatcca (SEQ ID NO. 141) para el fragmento 4.

Los fragmentos de intron 4, 5 y 6 se mezclaron con fragmentos 1, 2, 3 y 4 de mGFP, y se realizo la PCR con los

cebadores AS132 y AS133 para generar la secuencia de mGFP con intrones.

Las secuencias de aadA y mGFP generadas con intrones se fusionaron por digestion del fragmento aadA con enzimas Xmal-BamHI, el fragmento mGFP con enzimas BamHI-Xbal y ligacion en BlueScript SK digerido con enzimas XmaI- Xbal. El fragmento de fusion resultante se inserto posteriormente en un casete de cloroplasto (Figura 5).

5 Secuencia de Tntl-RT-RH (RT-RH)

ATGTCAGAAAAGGTGAAGAATGGTATAATTCCTAACTTTGTTACTATTCCTTCTACTTCTAACAATCCCACAA GTGCAGAAAGTACGACCGACGAGGTTTCCGAGCAGGGGGAGCAACCTGGTGAGGTTATTGAGCAGGGGGAGCA ACTTGATGAAGGTGTCGAGGAAGTGGAGCACCCCACTCAGGGAGAAGAACAACATCAACCTCTGAGGAGATCA GAGAGGCCAAGGGTAGAGTCACGCAGGTACCCTTCCACAGAGTATGTCCTCATCAGTGATGAGGGGGAGCCAG AAAGTCTTAAGGAGGTGTTGTCCCATCCAGAAAAGAACCAGTGGATGAAAGCTATGCAAGAAGAGATGGAATC TCTCCAGAAAAATGGCACATACAAGCTGGTTGAACTTCCAAAGGGTAAAAGACCACTCAAATGCAAATGGGTC TTTAAACTCAAGAAAGATGGAGATGGCAAGCTGGTCAGATACAAAGCTCGATTGGTGGTTAAAGGCTTCGAAC AGAAGAAAGGTATTGATTTTGACGAAATTTTCTCCCCCGTTGTTAAAATGACTTCTATTCGAACAATTTTGAG CTTAGCAGCTAGCCTAGATCTTGAAGTGGAGCAGTTGGATGTGAAAACTGCATTTCTTCATGGAGATTTGGAA GAGGAGATTTATATGGAGCAACCAGAAGGATTTGAAGTAGCTGGAAAGAAACACATGGTGTGCAAATTGAATA AGAGTCTTTATGGATTGAAGCAGGCACCAAGGCAGTGGTACATGAAGTTTGATTCATTCATGAAAAGTCAAAC ATACCTAAAGACCTATTCTGATCCATGTGTATACTTCAAAAGATTTTCTGAGAATAACTTTATTATATTGTTG TTGTATGTGGATGACATGCTAATTGTAGGAAAAGACAAGGGGTTGATAGCAAAGTTGAAAGGAGATCTGTCCA AGTCATTTGATATGAAGGACTTGGGCCCAGCACAACAAATTCTAGGGATGAAGATAGTTCGAGAGAGAACAAG TAGAAAGTTGTGGCTATCTCAGGAGAAGTACATTGAACGTGTACTAGAACGCTTCAACATGAAGAATGCTAAG CCAGTCAGCACACCTCTTGCTGGTCATCTAAAGTTGAGTAAAAAGATGTGTCCTACAACAGTGGAAGAGAAAG GGAACATGGCTAAAGTTCCTTATTCTTCAGCAGTCGGAAGCTTGATGTATGCAATGGTATGTACTAGACCTGA TATTGCTCACGCAGTTGGTGTTGTCAGCAGGTTTCTTGAAAATCCTGGAAAGGAACATTGGGAAGCAGTCAAG TGGATACTCAGGTACCTGAGAGGTACCACGGGAGATTGTTTGTGCTTTGGAGGATCTGATCCAATCTTGAAGG GCTATACAGATGCTGATATGGCAGGTGACATTGACAACAGAAAATCCAGTACTGGATATTTGTTTACATTTTC AGGGGGAGCTATATCATGGCAGTCTAAGTTGCAAAAGTGCGTTGCACTTTCAACAACTGAAGCAGAGTACATT GCTGCTACAGAAACTGGCAAGGAGATGATATGGCTCAAGCGATTCCTTCAAGAGCTTGGATTGCATCAGAAGG AGTATGTCGTCTATTGTGACAGTCAAAGTGCAATAGACCTTAGCAAGAACTCTATGTACCATGCAAGGACCAA ACACAT T GAT GT GAGATAT CAT T GGAT T CGAGAAAT GGTAGAT GAT GAAT C T C TAAAAGT C T T GAAGAT T T C T ACAAATGAGAATCCCGCAGATATGCTGACCAAGGTGGTACCAAGGAACAAGTTCGAGCTATGCAAAGAACTTG TCGGAATGCATTCAAACTAG (SEQ ID NO. 142)

El fragmento de RT-RH se amplifico a partir de ADN genomico de tabaco siguiendo procedimientos estandar utilizando los siguientes cebadores:

10 AS774 ggcatgcatgtcagaaaaggtga (SEQ ID NO. 143)

AS775 gactagtctagtttgaatgcattccgacaagttct (SEQ ID NO. 144)

Secuencia del peptido de transito de la subunidad pequena de Rubisco

ATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCTGCAGCAGTTGCCACCCGCAGCAATGTTGCTCAAGCTAACATGGTTGCAC CTTTCACTGGCCTTAAGTCAGCTGCCTCATTCCCTGTTTCAAGGAAGCAAAACCTTGACATCACTTCCATTGC CAGCAATGGTGGAAGAGTGCAATGTATGCAGGTA (SEQ ID NO. 145)

La secuencia del peptido de transito de la subunidad pequena de Rubisco se amplifico a partir del ADN genomico del tabaco usando los siguientes cebadores:

AS794 gctcgagacaatggcttcctcagttctttcctct (SEQ ID NO. 146)

5 AS639 cgcatgctacctgcatacattgcactcttccaccat (SEQ ID NO. 147)

El peptido de transito se fusiono a continuacion a RT-RH (figura 7)

Secuencia del sitio de union del cebador (PBS)

TTGGTACCTACT (SEQ ID NO. 148)

Se introdujo el sitio de union del cebador a trnA RFS mediante el cebador:

10 RFS-PBS-R gccgcagtaggtaccaattgcccttctccgaccctgac (SEQ ID NO. 149).

Promotor de la ubiquitina de Arabidopsis (Ubiq3At)

CGGTACCTACCGGATTTGGAGCCAAGTCTCATAAACGCCATTGTGGAAGAAAGTCTTGAGTTGGTGGTAATGT

AACAGAGTAGTAAGAACAGAGAAGAGAGAGAGTGTGAGATACATGAATTGTCGGGCAACAAAAATCCTGAACA

TCTTATTTTAGCAAAGAGAAAGAGTTCCGAGTCTGTAGCAGAAGAGTGAGGAGAAATTTAAGCTCTTGGACTT

GTGAATTGTTCCGCCTCTTGAATACTTCTTCAATCCTCATATATTCTTCTTCTATGTTACCTGAAAACCGGCA

TTTAATCTCGCGGGTTTATTCCGGTTCAACATTTTTTTTGTTTTGAGTTATTATCTGGGCTTAATAACGCAGG

CCTGAAATAAATTCAAGGCCCAACTGTTTTTTTTTTTAAGAAGTTGCTGTTAAAAAAAAAAAAAGGGAATTAA

CAACAACAACAAAAAAAGATAAAGAAAATAATAACAAT TAC T T TAATT GTAGACTAAAAAAACATAGAT T T TA

T CAT GAAAAAAAGAGAAAAGAAATAAAAAC T T GGAT CAAAAAAAAAACATACAGAT CTTCTAATTATTAACT T

TTCTTAAAAATTAGGTCCTTTTTCCCAACAATTAGGTTTAGAGTTTTGGAATTAAACCAAAAAGATTGTTCTA

AAAAATACTCAAATTTGGTAGATAAGTTTCCTTATTTTAATTAGTCAATGGTAGATACTTTTTTTTCTTTTCT

TTATTAGAGTAGATTAGAATCTTTTATGCCAAGTATTGATAAATTAAATCAAGAAGATAAACTATCATAATCA

ACATGAAATTAAAAGAAAAATCTCATATATAGTATTAGTATTCTCTATATATATTATGATTGCTTATTCTTAA

TGGGTTGGGTTAACCAAGACATAGTCTTAATGGAAAGAATCTTTTTTGAACTTTTTCCTTATTGATTAAATTC

T T C T AT AGAAAAGAAAGAAAT T AT T T GAGGAAAAG T AT AT AC AAAAAGAAAAAT AGAAAAAT G T C AGT GAAGC

AGATGTAATGGATGACCTAATCCAACCACCACCATAGGATGTTTCTACTTGAGTCGGTCTTTTAAAAACGCAC

GGTGGAAAATATGACACGTATCATATGATTCCTTCCTTTAGTTTCGTGATAATAATCCTCAACTGATATCTTC

CTTTTTTTGTTTTGGCTAAAGATATTTTATTCTCATTAATAGAAAAGACGGTTTTGGGCTTTTGGTTTGCGAT

ATAAAGAAGACCTTCGTGTGGAAGATAATAATTCATCCTTTCGTCTTTTTCTGACTCTTCAATCTCTCCCAAA

GCCTAAAGCGATCTCTGCAAATCTCTCGCGACTCTCTCTTTCAAGGTATATTTTCTGATTCTTTTTGTTTTTG

ATTCGTATCTGATCTCCAATTTTTGTTATGTGGATTATTGAATCTTTTGTATAAATTGCTTTTGACAATATTG

TTCGTTTCGTCAATCCAGCTTCTAAATTTTGTCCTGATTACTAAGATATCGATTCGTAGTGTTTACATCTGTG

TAATTTCTTGCTTGATTGTGAAATTAGGATTTTCAAGGACGATCTATTCAATTTTTGTGTTTTCTTTGTTCGA

TTCTCTCTGTTTTAGGTTTCTTATGTTTAGATCCGTTTCTCTTTGGTGTTGTTTTGATTTCTCTTACGGCTTT

TGATTTGGTATATGTTCGCTGATTGGTTTCTACTTGTTCTATTGTTTTATTTCAGGTCACCAAACACTCGAG

(SEQ ID. NO. 150)

El promotor se amplifico a partir del ADN genomico de Arabidopsis (Col-0) usando los siguientes cebadores:

15 AS724 CGGTACCTACCGGATTTGGAGCCAAGTC (SEQ ID NO. 151)

AS726 GCTCGAGTGTTTGGTGACCTGAAATAAAACAATAGAACAAGT (SEQ ID NO. 152)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

En conclusion, se presenta un sistema eficiente para la transformacion del cloroplasto utilizando vectores basados en intrones del grupo II. Tanto los intrones bacterianos como nativos podnan ser utilizados para el suministro e insercion del transgen de interes en los cloroplastos.

Transformacion de explantes foliares de tabaco con la cepa AGL1 de Agrobacterium Todos los artfculos se esterilizan en autoclave antes de su uso.

El filtro esteriliza los antibioticos para prevenir el crecimiento de hongos y mantener los antibioticos para el cultivo de tejido vegetal en una caja separada.

Esterilizar el material vegetal: Tomar plantas de unos 9 cm de alto; no deben haber empezado a florecer. Cortar las hojas con cutfcula (4-6 hojas por constructo, lo suficiente para cortar 100 explantes), sumergir en etanol al 70% y sumergir inmediatamente en hipoclorito de sodio al 1% (cat. No. 01032500); utilizar una botella de blanqueador que no exceda de 3 meses de preparado porque el gas de cloro se evapora), mantener las hojas con pinzas y agitar durante 20 min. Evitar danar la cutfcula, de lo contrario el blanqueador entrara en el sistema vascular. Enjuagar brevemente en agua esteril 5-6 veces y dejar en agua hasta que este listo para ser cortado.

Cocultivo de Agrobacterium con explantes de tabaco: Cultivar AGL1 en caldo LB o L con antibioticos apropiados durante la noche a 28-30°C y al dfa siguiente vuelve a suspender Agrobacterium en solucion de cocultivo de manera que la concentracion final tenga aproximadamente una OD600nm 0,4 -0,6. Colocar las hojas de tabaco en caldo de cocultivo y cortar cuadrados de 1-1,5 cm x 1-1,5 cm con un bistun esteril redondeado usando una accion de balanceo. Sumergir los explantes foliares en la solucion de Agrobacterium con forceps esteriles (almacenados en etanol al 100%, flameados y dejar enfriar antes de tocar el tejido foliar), transfiera a papel Whatman esteril y transfiera sobre placas TSM no selectivas (6 explantes por placa), preparando aproximadamente 15 placas por constructo. Repetir este procedimiento para cada constructo, asegurandose de que el bistun y las pinzas se sumerjan en etanol y se flameen entre cada constructo para evitar contaminacion cruzada. Dejar durante 2 dfas solo para AGL1 (3-4 dfas para las otras cepas Agrobacterium).

Transferencia a placas TSM selectivas: Usar pinzas flameadas esteriles para recoger y lavar los explantes en 100 ml de caldo de cocultivo suplementado con 320 mg/l de Timentina (una maceta por constructo), agitar bien, transferir a papel Whatman esteril y colocar los explantes lavados en placas TSM selectivas suplementadas con antibioticos selectivos apropiados y 320 mg/l de Timentina para matar Agrobacterium.

Regeneracion de brotes: Toma alrededor de 1 mes para ver aparecer los brotes, los explantes deben ser transferidos a placas frescas cada 10-14 dfas. Observar el crecimiento recurrente de AGL1; si la Timentina no es suficiente para matar Agrobacterium, agregar 250 mg/l de cefotaxima.

Regeneracion de la rafz: Toma alrededor de 1 semana. Se cortan brotes de los explantes; se colocan en cajas de cultivo que contienen TRM suplementado con los antibioticos selectivos apropiados y 320 mg/l de Timentina + 250 mg/l de cefotaxima para prevenir el crecimiento recurrente de Agrobacterium.

Mantener las plantas en cajas de TRM: Revisarlas cada dos semanas hasta que esten listas para ser transferidas a un invernadero

Adaptacion a las condiciones del invernadero: Remojar los granulos de turba en agua esteril hasta que se hinchen hasta un tamano normal y colocar cuidadosamente una planta por granulo, incubar las plantas bajo condiciones de 100% de humedad en un propagador, abriendo gradualmente las pequenas ventanas hasta que las plantas se adapten a la atmosfera normal durante varios dfas.

Recetas:

Cocultivo: MS con vitaminas y MES + 0,1 mg/l de NAA + 1 mg/l de BA + 3% de sacarosa, pH 5,7

TSM: MS con vitaminas y MES + 0,1 mg/1 de NAA + 1 mg/l de BA + 3% de sacarosa, pH 5,7, 0,2% de gelrite

TRM: sales de medio MS con vitaminas y MES + 0,5% de sacarosa, pH 5,7, 0,2% de gelrite. Autoclave.

Concentracion de antibioticos

Para los cultivos LB o L de Agrobacterium:

5

10

15

20

25

30

35

Para cultivar AGL1 que porta pGreen/pSOUP: Carbenicilina 100 mg/l, tetraciclina 5 mg/ml, rifampicina 50 mg/ml, kanamicina 50 mg/ml

AGL1 que porta pSOUP: Carbenicilina 100 mg/l, tetraciclina 5 mg/ml, rifampicina 50 mg/ml.

AGL1 vado: Carbenicilina 100 mg/l, rifampicina 50 mg/ml.

Para el cultivo de plantas:

Kanamicina: 300 mg/l (100 mg/l si se usa benthamiana)

Higromicina: 30 mg/l (10 mg/l si se usa benthamiana)

PPT: 20mg/l (2 mg/l si se usa benthamiana)

Timentina: 320 mg/l. Se utiliza para matar Agrobacterium, pero es bastante inestable. Elaborar una pequena cantidad de patron y almacenar en el congelador por hasta 1 mes; despues de ese tiempo, el antibiotico ya no es eficiente.

Cefotaxima: 250 mg/l. Tambien se utiliza para matar Agrobacterium, anadir a TS

Protocolo de transformacion de tomate

Germinacion de la semilla

Esterilizacion superficial

Suministrar a las semillas de tomate un tratamiento de EtOH al 70% durante 2 minutos para aflojar la capa gelatinosa de la semilla.

Eliminar el EtOH y enjuagar una vez con agua esteril.

(En esta etapa se puede incluir un tratamiento de fosfato trisodico durante 20 minutos para eliminar la transmision a las semillas de TMV). Enjuagar.

Anadir Domests/Vortex al 10% durante 3 horas, agitando.

Lavar 4 veces con agua. Dejar en el cambio final de agua y agitar a 25°C durante la noche.

(El tratamiento prolongado de blanqueo y la imbibicion durante la noche son para alentar una germinacion mas uniforme). Las semillas se pueden dejar hasta 3 meses a 4°C. De hecho, despues de 3 semanas en un refrigerador, casi todas las semillas germinaran al mismo tiempo.

Se colocan 20-30 semillas en tinas que contienen medio de germinacion y se dejan a 25°C en una sala de cultivo (fotopenodo de 16 horas, suplementado con Gro-Lux o luz incandescente, que es especialmente importante para la regeneracion).

Las semillas se cultivan durante 7-10 dfas. Para la transformacion idealmente los cotiledones son jovenes y todavfa se estan expandiendo, no hay formacion visible verdadera de hojas.

Procedimiento de transformacion

Dfa 1

Manana; preparar cultivo de Agrobacterium tumefaciens

Inocular 10 ml de medio A mmimo que contiene los antibioticos apropiados con la cepa LBA4404. Cultivar agitando a 28°C.

Tarde; preparar capas alimentadoras

5

10

15

20

25

30

35

40

Se coloca 1 ml de cultivo en suspension de tabaco fino sobre placas que contienen el medio de suspension celular solidificado con 0,6% de agarosa o medio MS con 0,5 mg/L de 2,4-D, 0,6% de agarosa. Extender alrededor para producir una capa uniforme. Colocar las placas sin sellar y apiladas en la sala de cultivo con poca luz.

Dfa 2

Manana;

Incubacion de Explantes.

Colocar un papel de filtro Whatman no.1 en la parte superior de las placas de alimentacion. Tener cuidado de excluir cualquier burbuja de aire y asegurese de que el papel este completamente mojado.

Cortar el material vegetal.

Se usan cotiledones, los hipocotiledones dan lugar a un elevado numero de tetraploides. Corte siempre bajo el agua y con una accion de balanceo de una cuchilla redonda del bistun para reducir al mmimo el dano al tejido. En una placa Petri cortar la punta del cotiledon y luego hacer dos cortes transversales mas para obtener dos explantes de unos 0,5 cm de largo. Transferir los explantes a una nueva placa de Petri de agua para evitar cualquier dano durante el corte adicional. Siempre manejar las piezas con mucho cuidado. El uso de bistunes redondeados para recoger los cotiledones cortados ayuda a prevenir el pinchazo con puntas afiladas.

Una vez que se recoge un numero de explantes en el pozo, se transfieren a papel de filtro esteril y se colocan alrededor de 30-40 en una placa de alimentacion, superficie abaxial hacia arriba (invertidos). Colocar las placas de Petri sin sellar y apilarlas a 25°C con poca intensidad de luz.

Dejar en preincubacion durante 8 horas.

Tarde; cocultivo

Hacer girar el cultivo de Agrobacterium y resuspender el sedimento en medio MS con 3% de sacarosa hasta una OD600 de 0,4-0,5.

Colocar la suspension bacteriana en una placa Petri y sumergir los explantes de una placa alimentadora. Removerlos y transferirlos a papel de filtro esteril antes de volver a la placa de alimentacion original, teniendo cuidado de no danar el tejido. No se requiere un penodo de tiempo espedfico en las bacterias, pero asegurese de que las piezas han sido completamente sumergidas. Se devuelven las placas a las mismas condiciones que se usan en la fase de preincubacion.

Cocultivar durante 40 horas.

Dfa 4

Manana; aplicar seleccion

Tomar las piezas de las capas de alimentacion y colocarlas en placas de regeneracion de tomate que contienen Augmentin o carbenicilina a razon de 500 pg/ml y el antibiotico apropiado para seleccionar el marcador de transformacion de ADN-T, por ejemplo kanamicina a razon de 100 pg/ml o preferiblemente Augmentin, ya que puede tener un ligero efecto estimulante en la regeneracion. Colocar los cotiledones hacia arriba para que se encorven en el medio, asegurando un buen contacto entre los bordes cortados de la hoja con los nutrientes y los antibioticos.

El uso de gel de agar como agente de fraguado produce un medio blando en el que las piezas se pueden empujar suavemente. Colocar 12 piezas por placa de Petri. Las placas se dejan sin sellar y se devuelven a la sala de cultivo.

Semana 2 o 3

Los explantes se transfieren a medio fresco cada 2-3 semanas. Cuando el material de regeneracion es demasiado grande para las placas de Petri, se coloca en frascos de vidrio mas grandes con tapon de rosca, una tapa de placa Petri que reemplaza la tapa de plastico para permitir una mejor penetracion de la luz y un mejor intercambio de gases.

Se cortan brotes de los explantes y se colocan en medio de enraizamiento con concentraciones reducidas de antibioticos, Augmentin a razon de 200 pg/ml y kanamicina a razon de 50 pg/ml. Si no se enrafzan al principio, volver a cortar y colocar en un medio fresco. Si todavfa no ocurre la produccion de rafces, probablemente son plantas muertas.

5

10

15

20

25

30

35

Si se utiliza el gen de resistencia a la kanamicina como marcador seleccionable, se puede llevar a cabo un ensayo simple con nptll para confirmar la identidad de los transformantes verdaderos.

Para transferir al suelo, eliminar la mayor cantidad de medio posible lavando las rafces suavemente bajo agua corriente. Plantar con cuidado en las macetas Jiffy hidratadas y esterilizadas en autoclave (macetas con turba) y mantenerlas cerradas para mantener la humedad alta mientras se encuentran en la sala de cultivo. Disminuir gradualmente la humedad. Una vez que se pueden observar las rafces creciendo a traves de las macetas Jiffy, las plantas estan listas para ir al invernadero.

N.B. 1 Este protocolo se utiliza con la variedad Moneymaker de tomate. Las eficiencias de transformacion con otras variedades pueden ser menores utilizando estas condiciones y pueden necesitarse alteraciones en el penodo de preincubacion, la densidad de la suspension de Agrobacterium y la duracion del penodo de cocultivo para optimizar el protocolo para cualquier variedad particular.

N.B. 2 Una dificultad que puede surgir, especialmente si se requieren plantas transgenicas para la produccion de semillas, es la de la tetraploidfa. Parece que una proporcion significativa de regenerantes puede tener un numero duplicado de cromosomas. Esto puede ser evaluado, ya sea por el numero de cloroplastos en las celdas de guarda o por los recuentos cromosomicos.

Regeneracion

Sales de MS Mio-inositol Vitaminas de Nitsch Sacarosa Gel de agar pH 6,0 (KOH)

/Litro

1x

100 mg

1 ml del patron de 1000X 20 g 4 g

Autoclave

Ribosido de zeatina(isomero trans) 2 mg

(Esterilizar por filtro y anadir despues de autoclavado) Vitaminas de Nitsch

mg/ml

Tiamina

0,5

Glicina

2,0

(continuacion) Vitaminas de Nitsch

Concentracion final patron 1000x (mg/100 ml) 50 200

Concentracion final

Acido nicotmico

mg/ml patron 1000x (mg/100 ml) 5,0 500

Clorhidrato de piridoxina 0,5 50

5

10

15

20

25

30

Acido folico

0,5 50

Biotina

0,05 5

A una concentracion de 1000x no todas las vitaminas entran en solucion. Mantener a 4°C y agitar antes de usar.

Enraizamiento g/Litro

Medio MS 0,5X

Sacarosa 5 g

Gelrite 2,25 g

pH 6,0 (KOH)

Medios

Germinacion de semillas

Medio MS Glucosa Agarosa pH 5,8

Verter en recipientes redondos de "margarina" Sigma Medio A mmimo K2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 Citrato de Na.2H2O Autoclave en 990 ml Antes de usar anadir:

/Litro 1x 10 g 6 g

/Litro

10.5 g

4.5 g

1.0 g 0,5 g 990 ml

1.0 ml de MgSO4.H2O 1 M 10 ml de glucosa al 20%

Para placas;

Hacer lo anterior en 500 ml y autoclavar.

Autoclavar en forma separada 15 g de Agar Bacto en 490 ml de H2O Anadir MgSO4 y glucosa y combinar.

Transformacion de embriones inmaduros de arroz.

Excision de embriones inmaduros Dfa 1:

5

10

15

20

25

30

35

Remover las semillas inmaduras de la etapa lechosa/post-lechosa de las pamculas (se desean embriones inmaduros de 1-2 mm de tamano).

Esterilizar semillas inmaduras: hipoclorito de sodio al 50% (12%) + 1 gota de Tween 20. Agitar durante 10 min.

Enjuagar 3-5x en agua esteril desionizada. Drenar el exceso de agua. Tomar partes alfcuotas de semillas (alrededor de 40) en placas de Petri esteriles.

Preparar una placa de Petri de 60 x 15 mm que contenga una solucion de hipoclorito de sodio al 50% y junto a ella un vaso de precipitados esteril con un papel de filtro esteril a su lado. Utilizar una pinza esteril para eliminar asepticamente las glumas de la primera semilla. Sumergir esta semilla en el hipoclorito de sodio al 50%. Retirar las glumas de una segunda semilla y sumergir la segunda semilla en la solucion de hipoclorito de sodio mientras se retira la primera semilla y se almacena esta semilla descascarada/esterilizada en el papel de filtro en el vaso de precipitados. Continuar.

Despues de remover todas las glumas:

Esterilizar las semillas descascaradas: hipoclorito de sodio al 50%: 5 min con agitacion.

Enjuagar: 5-7 x en agua esteril desionizada, escurrir.

Colocar todas las semillas en una placa de Petri esteril grande. Tomar partes alfcuotas para la excision del embrion (para evitar que las semillas se sequen, trabajar con solo 50-100 en la placa a la vez dejando el resto en la placa maestra).

Remover el embrion de cada semilla y colocar el embrion, escutelo hacia arriba, en una placa de Petri de 90 x 15 mm que contenga medio de proliferacion (40-50 embriones/placa). Cultivar a 28°C en la oscuridad durante 2 dfas antes del bombardeo.

Dfa 3:

Revisar cada embrion por contaminacion antes de la destruccion

Remover los embriones del medio de proliferacion. Distribuir 35-40 escutelos de embriones hacia arriba en un area de 1 cm2 en el centro de una placa objetivo de 60 x 15 mm que contenga 10 ml de medio de proliferacion + medio osmotico (0,6 M). Revisar cada placa objetivo de modo que el escutelo este recto. Permitir suficiente espacio para que los escutelos no se hagan sombra uno al otro.

Bombardeo:

Pistola 14 kV

Vacfo: 25 pulgadas de Hg

1er bombardeo 4 horas despues del tratamiento osmotico

2do bombardeo 4 horas despues del 1er bombardeo

Dfa 4:

4-16 horas despues de la 2da destruccion transferir los embriones inmaduros al medio de proliferacion sin medio osmotico. Cultivar en la oscuridad a 28°C durante 2 dfas.

Seleccion:

Dfa 5:

Cortar asepticamente con tijeras el brote de germinacion. Transferir 16 a 20 embriones inmaduros a un medio fresco de proliferacion que contenga 30-50 mg/l de higromicina (dependiendo del genotipo); cultivar en la oscuridad a 28°C; registrar el numero total de embriones.

Despues de 10 dfas, retirar cuidadosamente el callo del escutelo rompiendolo en 2-10 trozos pequenos; subcultivar en el medio de proliferacion fresco + higromicina. No subcultivar el tejido marron ni el embrion inmaduro restante que podna inhibir crecimiento adicional del callo sano.

Subcultivar cada 10 dfas seleccionando tejido sano: (embriogenico si esta presente) y transferirlo a medio de 5 proliferacion fresco + higromicina. Remover el callo marron, ya que podna inhibir al callo embriogenico.

30 a 40 dfas despues del bombardeo, cambiar el procedimiento de seleccion. En lugar de eliminar tejidos de mala apariencia, solo se debe mantener tejido embriogenico (eliminar tejido no embriogenico sano)

Regeneracion:

Despues de 40 a 60 dfas, transferir callo embriogenico establecido que mostraban crecimiento diferencial sobre el 10 medio de proliferacion + higromicina al medio de regeneracion + higromicina. Cultivar a 28°C bajo poca luz durante 10 dfas y luego bajo luz alta durante 10 dfas adicionales. Comprobar las placas periodicamente a la luz para revisar el desarrollo de embriones y brotes verdes. A medida que los brotes se desarrollan, a veces es beneficioso mover con suavidad el brote en desarrollo lejos del callo de donde se origino y remover cualquier tejido muerto del propio brote para prevenir la inhibicion del crecimiento.

15 Germinacion:

Transferir embriones compactos blancos y brotes verdes iniciando rafces en el medio de germinacion bajo luz alta a 28°C durante 1 a 2 semanas. Revisar las placas periodicamente. Retirar el tejido necrotico y dividir los embriones en germinacion si es necesario.

Claims (11)

1. Reivindicaciones

   1. Un metodo para producir al menos un polipeptido heterologo o exogeno en una planta o celula vegetal que comprende:

   1) introducir en dicha celula vegetal un promotor nuclear vegetal que dirige la expresion en un nucleo de planta de un 5 intron introducido del grupo II que tiene una primera secuencia aislada de acido nucleico insertada en el dominio IV de la

   misma, en donde el intron introducido del grupo II esta unido operativamente a y bajo control regulador del promotor nuclear de la planta y comprende una primera secuencia aislada de acido nucleico, en donde dicha primera secuencia aislada de acido nucleico comprende un promotor del plastido vegetal que dirige la expresion en un plastido vegetal y esta operativamente unido a una segunda secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido heterologo 10 o exogeno;

   2) cultivar dicha celula vegetal de (1) en condiciones en las que dicho promotor nuclear de planta dirige la expresion de dicho intron;

   3) seleccionar una celula vegetal de (2) en la que dicha primera secuencia aislada de acido nucleico esta integrada en el genoma del plastido;

   15 4) cultivar la celula vegetal de (3) o una planta regenerada a partir de ella en condiciones en las que dicho promotor del

   plastido vegetal expresa dicha protema heterologa o exogena de dicha segunda secuencia de acido nucleico de la misma.
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la celula vegetal de (1) comprende ademas una tercera secuencia de acido nucleico que comprende un promotor nuclear vegetal que dirige la expresion en un nucleo de planta

   20 unido operablemente a una cuarta secuencia de acido nucleico que codifica una protema multifuncional, en donde la protema multifuncional es una protema codificada por intron que posee actividad transcriptasa inversa y es capaz de facilitar el empalme del ARN del intron mediante estabilizacion de la estructura de ARN cataltticamente activa, siendo la protema codificada por el intron de origen bacteriano o plastido y estando fusionada a una secuencia peptfdica de transito del plastido.

   25 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la protema codificada por intron es la protema LtrA de

   Lactococcus lactis.
3. 4. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 2 o la reivindicacion 3, en el que dicha secuencia de acido nucleico que codifica la protema multifuncional es una secuencia de acido nucleico bacteriano LtrA que comprende codones introducidos optimizados para expresion en plantas.

   30 5. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho intron del grupo II se selecciona entre el intron LtrB de

   Lactococcus lactis, el intron trnK del tabaco, el intron atpF del mafz y el intron petD del mafz.
4. 6. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el plastido se selecciona de cloroplastos, proplastidos, etioplastos, cromoplastos, amiloplastos, leucoplastos y elaioplastos, particularmente preferiblemente es un cloroplasto.

   35 7. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polipeptido heterologo o

   exogeno es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en insulina, preproinsulina, proinsulina, glucagon, interferones tales como interferon a, interferon p, interferon y, factores de coagulacion de la sangre seleccionados del Factor VII, VIII, IX, X, XI y XII, hormonas de fertilidad incluyendo hormona luteinizante, factores de crecimiento hormonal estimulantes de los folmulos incluyendo el factor de crecimiento epidermico, el factor de crecimiento derivado de 40 plaquetas, el factor estimulante de colonias de granulocitos y similares, prolactina, oxitocina, hormona estimulante de la tiroides, hormona adrenocorticotropica, calcitonina, hormona paratiroidea, somatostatina, eritropoyetina (EPO), enzimas, p-glucocerebrosidasa, hemoglobina, albumina de suero, colageno, protema toxica de insectos de Bacillus thuringiensis; protema de resistencia a herbicidas (glifosato); protemas de tolerancia a la sal; protemas de mejora nutricional implicadas en la biosmtesis de compuestos fenolicos, almidones, azucares, alcaloides y vitaminas.

   45 8. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el promotor del plastido

   vegetal se selecciona del grupo que consiste en el promotor de aRn polimerasa, el elemento promotor rpoB, el elemento promotor atpB, el elemento promotor clpP, el elemento promotor 16S de ADNr, PrbcL, Prps16, el Prrn16, Prrn- 62, Pycf2-1577, PatpB-289, Prps2-152, Prps16-107, Pycf1-41, PatpI-207, PclpP-511, PclpP-173, PaccD-129, el promotor PaccD-129 del gen accD del tabaco, el promotor PclpP-53 del gen clpP, el promotor Prrn-62 del gen rrn, el 50 promotor Prps16-107 del gen rps16, el promotor PatpB/E-290 del gen atpB/E del tabaco, y el promotor PrpoB-345 del gen rpoB.

   5

   10

   15

   20

   25
5. 9. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la primera secuencia aislada de acido nucleico comprende un promotor del plastido vegetal que dirige la expresion en un plastido vegetal unido operablemente a una segunda secuencia de acido nucleico que comprende ademas un sitio de union del cebador que es homologo al extremo 3' de un ARNt espedfico del cloroplasto.
6. 10. Uso de una secuencia aislada de polinucleotidos que codifica un intron funcional del grupo II en un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, estando el intron del grupo II unido operativamente a un promotor nuclear vegetal exogeno que dirige la expresion en una celula vegetal y que comprende una primera secuencia aislada de acido nucleico, en donde dicha primera secuencia aislada de acido nucleico comprende un promotor del plastido vegetal unido operativamente a una segunda secuencia de acido nucleico que se inserta en el dominio IV del intron del grupo II y que codifica dicho polipeptido heterologo o exogeno en una orientacion antisentido.
7. 11. Uso de una secuencia aislada de polinucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que el intron es un intron del grupo II seleccionado de entre el de una bacteria o un plastido vegetal, en un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
8. 12. Uso de una secuencia aislada de polinucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que el intron del grupo II se selecciona del grupo que consiste en el intron LtrB de Lactococcus lactis, el intron trnK del tabaco, el intron atpF del mafz y el intron petD del mafz.
9. 13. Uso de una secuencia aislada de polinucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 11 o la reivindicacion 12 que codifica la protema multifuncional LtrA de Lactococcus lactis.
10. 14. Una celula huesped que contiene una secuencia heterologa de polinucleotidos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, estando comprendida la celula huesped en una planta, una parte de una planta o un propagulo vegetal o en un cultivo de celulas vegetales.
11. 15. Una planta que comprende una celula vegetal, siendo la celula vegetal una celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 14 y siendo seleccionada la planta del grupo que consiste en algodon, arroz, semillas oleaginosas de especies de Brassica, mafz y soja.