BRPI0716657B1 - Produção de milho com alto teor de triptofano por expressão alvejada de cloroplasto da antranilato sintase - Google Patents

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(54) Título: PRODUÇÃO DE MILHO COM ALTO TEOR DE TRIPTOFANO POR EXPRESSÃO ALVEJADA DE CLOROPLASTO DA ANTRANILATO SINTASE (51) Int.CI.: C12N 15/82; C12N 9/88; C07K 14/195; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 11/08/2006 US 60/837,200 (73) Titular(es): MONSANTO TECHNOLOGY LLC (72) Inventor(es): SIVA MANJUNATH; SANTIAGO XAVIER NAVARRO; WILLIAM D. RAPP; XIAOHONG SHI; MARGUERITE J. VARAGONA; JENNIFER L. WINSON; GUANGNING YE

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para VETOR DE EXPRESSÃO E MÉTODO PARA AUMENTAR OS NÍVEIS DE TRIPTOFANO LIVRE NAS SEMENTES DE PLANTAS MONOCOTILEDÔNEAS POR EXPRESSÃO DIRECIONADA DE CLOROPLASTO DA ANTRANILATO SINTASE, MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE RAÇÃO NUTRICIONALMENTE INTENSIFICADO BEM COMO O REFERIDO PRODUTO.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório US 60/837.200, depositado em 11 de agosto de 2006, cuja descrição na íntegra é aqui especificamente incorporada a título de referência.

1. Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se a métodos e composições para expressar e localizar antranilato sintase em células vegetais.

2. Descrição da Técnica Relacionada [003] Em milho, a antranilato sintase existe como uma enzima de duas subunidades, que catalisa a primeira reação que se ramifica a partir da via de aminoácido aromático para a biossíntese do triptofano no cloroplasto. Tem sido demonstrado que ela é uma importante enzima na regulação da produção do triptofano em vegetais. Anderson et al. (Patente US 6.118.047) demonstraram que a superexpressão de uma subunidade a insensível ao triptofano da antranilato sintase proveniente do milho acarretou um nível elevado de triptofano em plantas de milho transgênicas. Recentemente, foi mostrado que formas monoméricas de antranilato sintases provenientes de fontes procarióticas são capazes de aumentar os níveis de triptofano em sojas e milho transgênicos (Pedidos de Patente US 10/138.927, expedido como Patente US 7.217.865, e US 10/430.011, publicado como Publicação de Pedido de Patente US 20030213010).

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2/82 [004] A maioria das proteínas que participam das vias biossintéticas dentro do cloroplasto é codificada nuclearmente e sintetizada no citosol. A obtenção correta dessas proteínas aos plastídios é assim essencial para sua função biossintética. Na maioria dos casos, esse direcionamento é obtido pela presença de uma extensão N-terminal, chamada de peptídeo de trânsito para o cloroplasto (CTP) ou peptídeo de trânsito para o plastídio. Transgenes de fontes bacterianas devem ter uma sequência de codificação de uma sequência de CTP fusionada a uma sequência que codifica um polipeptídeo expressado se o polipeptídeo expressado é para ser compartimentalizado no cloroplasto. Por conseguinte, o transporte de um polipeptídeo exógeno para um cloroplasto é obtido por meio de ligação operável de uma sequência de polipeptídeos que codifica uma sequência de CTP à região 5' de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo exógeno.

[005] Para muitos propósitos da manipulação e transformação de células vegetais com uma antranilato sintase monomérica, será desejável que o gene que é introduzido na célula vegetal resulte em um produto que é translocalizado para o plastídio e funciona no plastídio. Contudo, nem todos os CTPs são capazes de efetuarem essa translocalização com igual eficácia. A identificação de CTPs eficientes e eficazes para o êxito da expressão e localização da antranilato sintase em plantas monocotiledôneas, e em particular plantas de milho, é necessária na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Em um aspecto, a presente invenção proporciona polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que compreendem peptídeos de trânsito para o cloroplasto (CTPs) fundidos a antranilato sintases (AS) monoméricas, em que os peptídeos de trânsito para o cloroplasto são capazes de compartimentalizar a antranilato sintase na fração de plastídio de uma célula vegetal. Quando tais ácidos nucleicos da anPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 9/304

3/82 tranilato sintase são expressos em uma planta transgênica, níveis elevados de triptofano podem ser obtidos dentro das células da planta. Em uma modalidade da presente invenção, vetores e construções de expressão contendo estes polinucleotídeos são proporcionados. As células vegetais recombinantes que contêm tais vetores e construções de expressão são também parte da presente invenção. As células vegetais, sementes e produtos alimentícios transgênicos obtidos pela expressão de proteínas usando as sequências, construções e métodos da presente invenção são também considerados parte da invenção. [007] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos para aumentar o teor de triptofano livre em plantas monocotiledôneas. Em uma modalidade, o método compreende transformar uma planta monocotiledônea com um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende um peptídeo de trânsito para o cloroplasto fundido a uma antranilato sintase monomérica, em que o peptídeo de trânsito para o cloroplasto funciona para localizar ou compartimentalizar a atividade da antranilato sintase no plastídio da célula vegetal. [008] Em ainda um outro aspecto, a invenção proporciona novos polinucleotídeos isolados que codificam antranilato sintases monoméricas de fontes de Agrobacterium e Sinorhizobium. Em uma modalidade da presente invenção, vetores de expressão que compreendem esses novos polinucleotídeos são proporcionados. Em ainda outras modalidades, células hospedeiras, células vegetais transgênicas, plantas transgênicas, sementes das plantas transgênicas e produtos de ração resultantes contendo esses vetores de expressão são também considerados parte da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [009] A figura 1 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON66560 [0010] A figura 2 representa uma análise Western blot de frações

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4/82 de plastídio de células de milho transgênico contendo o vetor de transformação de planta pMON66560 [0011] A figura 3 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON78824 [0012] A figura 4 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON78832 [0013] A figura 5 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON69765 [0014] A figura 6 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON69755 [0015] A figura 7 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON82561 [0016] A figura 8 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON78152 [0017] A figura 9 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON78153 [0018] A figura 10 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON82560 [0019] A figura 11 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON69779 [0020] A figura 12 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON78137 [0021] A figura 13 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON78140 [0022] A figura 14 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON78143 [0023] A figura 15 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON78142 [0024] A figura 16 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON78139

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5/82 [0025] A figura 17 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON69774 [0026] A figura 18 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON69775 [0027] A figura 19 representa um mapa de restrição do plasmídeo pMON69777

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0028] De acordo com a invenção, composições são proporcionadas para expressarem e transportarem uma antranilato sintase monomérica para os plastídios de uma célula vegetal. Em particular, a invenção proporciona novas sequências de polinucleotídeos que serão de utilidade no aumento do teor de triptofano livre nas células de plantas transformadas. Adicionalmente, novos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos da antranilato sintase monomérica de Agrobacterium e Sinorhizobium são proporcionados.

[0029] A invenção proporciona polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que compreendem peptídeos de trânsito para o cloroplasto (CTPs) fusionados às antranilatos sintases (AS) monoméricas, em que os peptídeos de trânsito para o cloroplasto são capazes de compartimentalizarem a antranilato sintase na fração de plastídio de uma célula vegetal. Quando tais ácidos nucleicos da antranilato sintase são expressos em uma planta transgênica, níveis elevados de triptofano são obtidos dentro das células da planta. Em um aspecto da presente invenção, os vetores e as construções de expressão que contêm esses polinucleotídeos são proporcionados. As células vegetais recombinantes que contêm tais vetores e construções de expressão são também parte da presente invenção. As células vegetais, sementes e produtos de ração transgênicos obtidos pela expressão de proteínas usando as sequências, as construções e os métodos da presente invenção são também considerados parte da invenção.

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6/82 [0030] Em ainda outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para aumentar o teor de triptofano livre em plantas monocotiledôneas. Em uma modalidade, o método compreende transformar uma planta monocotiledônea com um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende um peptídeo de trânsito para o cloroplasto fusionado a uma antranilato sintase monomérica, em que o peptídeo de trânsito para o cloroplasto é capaz de compartimentalizar a atividade da antranilato sintase no plastídio da célula vegetal.

[0031] A presente invenção é adicionalmente direcionada a novos polinucleotídeos isolados que codificam antranilato sintases monoméricas de fontes de Agrobacterium e Sinorhizobium. Em um aspecto da presente invenção, vetores de expressão compreendendo esses novos polinucleotídeos são proporcionados. Em ainda outras modalidades, células hospedeiras, células vegetais transgênicas, plantas transgênicas, sementes das plantas transgênicas e produtos de ração resultantes contendo estes vetores de expressão são também considerados parte da presente invenção.

[0032] Uma planta ou semente transgênica, que mostre uma característica desejada, por exemplo, níveis aumentados de triptofano da presente invenção, compreende um DNA exógeno particular inserido no genoma da planta transgênica que confere a característica desejada. A característica que é uma alteração mensurável da característica que ocorre naturalmente em uma planta de controle, por exemplo, uma planta ou semente de substancialmente o mesmo genótipo que carece daquele DNA exógeno particular. A característica desejada intensificada pode ser medida por comparação da característica em uma planta ou semente transgênica com o DNA exógeno particular associado à característica desejada intensificada para a característica em uma planta ou semente de controle. Portanto, alto teor de triptofano refere-se a uma planta de milho (maize) com níveis aumentados de triptoPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 13/304

7/82 fano em qualquer parte da planta, preferivelmente uma semente; a semente pode ser também referida aqui como um caroço ou um grão. [0033] Antranilato sintase (AS; EC 4.1.3.27) catalisa a primeira reação que se ramifica da via de aminoácido aromático para a biossíntese do triptofano em plantas, fungos, e bactérias. Nas plantas, os processos químicos para a biossíntese do triptofano são compartimentalizados no cloroplasto. Já que a antranilato sintase é uma proteína nuclear codificada que é sintetizada no citosol, ela deve ser transportada por algum meio para o cloroplasto para participar da biossíntese do triptofano. Adicionalmente, a antranilato sintase endógena que é nativa para as plantas do tipo selvagem ou não transgênicas é sensível à inibição de retroalimentação pelo acúmulo do triptofano durante o processo biossintético. Desse modo, o teor de triptofano das células vegetais não transgênicas é limitado a um nível relativamente baixo. Por exemplo, em milho não transgênico, os níveis de triptofano são tipicamente menores que 25 partes por milhão (ppm) na semente da planta; usualmente na faixa de 8 a 10 ppm. A presente invenção proporciona novos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos da antranilato sintase monomérica insensíveis à retroalimentação de Agrobacterium e Sinorhizobium que são fusionados a um peptídeo de trânsito para o cloroplasto capaz de direcionar a antranilato sintase aos plastídios. A presente invenção proporciona ainda construções de DNA e sementes que contêm pelo menos um dos cassetes de expressão de planta das construções de DNA das presentes invenções em seu genoma, em que a semente tem um teor de triptofano mais alto que as sementes que não contêm a construção.

[0034] Triptofano aumentado pode ser exibido na célula vegetal por acúmulo de quantidades aumentadas (maiores que 25 ppm) do aminoácido no caroço e pode ser medido por qualquer método adequado, tal como o de espectrofotometria de massa ou cromatografia

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8/82 líquida de alto desempenho, do tecido apropriadamente extraído. Um caroço de milho transgênico da presente invenção com triptofano aumentado é especialmente útil como ração ou produto para ração, uma farinha ou produto de farinha, ou produtos de proteína, ou fonte de outros produtos processados do caroço que contêm um teor de triptofano mais alto que caroços não transgênicos de uma variedade similar. [0035] Quaisquer das plantas ou partes destas da presente invenção podem ser processadas para produzirem uma ração (por exemplo, forragem), farinha, preparação de proteína ou de óleo. Uma parte da planta particularmente preferida para esse propósito é uma semente. Em uma modalidade preferida, a ração, farinha, preparação de proteína ou de óleo é projetada para uso na alimentação de animais de criação (animais de criação). Métodos para produção de ração, farinha, preparações de proteína e óleo são conhecidos da técnica, por exemplo, das Patentes US 4.957.748; 5.100.679; 5.219.596; 5.936.069; 6.005.076; 6.146.669; e 6.156.227, aqui incorporadas a título de referência, na íntegra. Em uma modalidade preferida, a preparação de proteína é uma preparação com alto teor de proteína. A preparação com alto teor de proteína tem preferivelmente um teor de proteína maior que 5% p/v, mas preferivelmente 10% p/v, e ainda mais preferivelmente maior que 15% p/v.

Polinucleotídeos e Polipeptídeos Isolados [0036] A presente invenção proporciona, em uma modalidade, polinucleotídeos isolados que codificam peptídeos de trânsito para o cloroplastos (CTPs; peptídeos de trânsito para o plastídio) fusionados às antranilato sintases monoméricas. O termo plastídio significa uma classe de organelas da célula vegetal compreendendo proplastídios, leucoplastos, amiloplastos, cromoplastos, e cloroplastos. No contexto da presente invenção, a frase peptídeo de trânsito significa um polipeptídeo que direciona o transporte de uma proteína nuclear codificaPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 15/304

9/82 da para um plastídio. Tipicamente, o CTP ou a sequência de peptídeos de trânsito está localizada no N-terminal de um polipeptídeo.

[0037] Polinucleotídeos que codificam antranilato sintase monoméricas, e polinucleotídeos que codificam CTPs ou peptídeo de trânsito para o plastídio são isolados em que eles foram substancialmente separados ou purificados de outras sequências de ácidos nucleicos com as quais o ácido nucleico é normalmente associado na célula do organismo no qual o ácido nucleico ocorre naturalmente, isto é, outro DNA cromossômico ou extracromossômico. O termo engloba ácidos nucleicos que são bioquimicamente purificados de modo a remover substancialmente ácidos nucleicos contaminadores e outros componentes celulares. O termo engloba também ácidos nucleicos recombinantes e ácidos nucleicos quimicamente sintetizados. O termo substancialmente purificado, como usado aqui, refere-se a uma molécula separada de outras moléculas normalmente associadas com ela no seu estado nativo. Mais preferivelmente, uma molécula substancialmente purificada é a espécie predominante presente em uma preparação. Uma molécula substancialmente purificada pode ser mais que 60% isenta, preferivelmente 75% isenta, mais preferivelmente 90% isenta das outras moléculas (exclusive do solvente) presentes na mistura natural. O termo substancialmente purificado não tem o objetivo de englobar moléculas presentes em seu estado nativo. Tais polinucleotídeos isolados podem ser também recombinantes em que eles foram combinados com polinucleotídeos exógenos. Por exemplo, a molécula de DNA recombinante pode ser um polinucleotídeo isolado que é operavelmente ligado a um promotor exógeno, ou a um promotor que é endógeno para a célula hospedeira.

[0038] Como usado aqui, um polinucleotídeo exógeno é uma sequência de DNA que tenha sido introduzida em uma célula hospedeira, que preferivelmente não é idêntica a nenhuma sequência de DNA prePetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 16/304

10/82 sente na célula em seu estado nativo, não transformado. Um polinucleotídeo endógeno ou nativo é uma sequência de DNA que está naturalmente presente em uma célula hospedeira ou organismo. Igualmente, um polipeptídeo exógeno é uma sequência de proteínas que é codificada por um DNA isolado que tenha sido introduzido em uma célula hospedeira, e que preferivelmente não é idêntico a nenhuma sequência de DNA presente na célula em seu estado nativo, não transformado. Um polipeptídeo endógeno ou nativo é uma proteína que está naturalmente presente em uma célula hospedeira ou organismo.

[0039] De particular interesse são polipeptídeos que representam sequências de CTP da presente invenção, que são capazes de compartimentalizarem o polipeptídeo da antranilato sintase no plastídio da célula vegetal transformada. A sequência de CTP pode ser derivada de um gene que codifica uma proteína direcionada ao plastídio do milho ou de outras espécies vegetais incluindo, mas sem limitação, Ruta graveolens, Oryza sativa, e Arabidopsis thaliana. Sequências de peptídeos de trânsito para o cloroplasto são conhecidas da técnica e incluem sequências de direcionamento de subunidade 1 pequena de ribulose-1,5-bifosfato carboxilase (rubisco) de Arabidopsis thaliana (AtCTP1); Silva Filho et al. (1996); Schnell et al. (1991); 5-(enolpiruvil) shikimato-3-fosfato sintase de Arabidopsis thaliana (At-CTP2); Archer et al. (1990); subunidades de Zea mays de antranilato sintase-alfa 1 (Zm-ASA1-CTP) e alfa 2 (Zm-ASA1-CTP); di-hidrodipicolinato sintase de Zea mays (Zm-DHDPS-CTP); ADP glicose pirofosforilase de Oryza sativa (Os-Waxy (Os-Wx)-CTP; e subunidade de antranilato sintase alfa de Ruta graveolens (Rg-ASA curto-CTP e Rg-ASA longo-CTP). Para descrições do uso de peptídeos de trânsito para o cloroplasto vide a Patente US 5.188.642, que está aqui incorporada a título de referência.

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11/82 [0040] Exemplos de polinucleotídeos isolados que codificam peptídeos de trânsito pata o cloroplasto (CTPs) da invenção incluem DNAs que compreendem as seguintes SEQ ID NOs de nucleotídeos:

SEQ ID NO:1: Sequência de ácidos nucleicos que codifica At-CTP2(C/M) (5-(enolpiruvil) shikimato-3-fosfatase da Arabidopsis thaliana) com sítio de clivagem modificado (C/M);

SEQ ID NO:2: Sequência de ácidos nucleicos que codifica At-CTP2(E/K) com sítio de clivagem nativo (E/K);

SEQ ID NO:3: Sequência de ácidos nucleicos que codifica At-CTP2(E/K) + 10 aminoácidos da EPSPS sintase da Arabdopsis;

SEQ ID NO:4: Sequência de ácidos nucleicos que codificam At-CTP2(E/K) + 5 aminoácidos da EPSPS sintase da Arabidopsis madura;

SEQ ID NO:5: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-ASA1-CTP (subunidade da antranilato sintase a1 da Zea mays);

SEQ ID NO:6: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-ASA1-CTP + 20 aminoácidos da subunidade a1 da antranilato sintase da Zea mays madura;

SEQ ID NO:7: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-ASA2-CTP (subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays);

SEQ ID NO:8: Zm-ASA2-CTP + 5 aminoácidos da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays madura;

SEQ ID NO:9: Sequência de ácidos nucleicos que codificam Zm-ASA2-CTP + 18 aminoácidos da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays madura;

SEQ ID NO:10: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Os-Wx-CTP (ADP glicose pirofosforilase da Oryza sativa);

SEQ ID NO:11: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Os-Wx-CTP + 5 aminoácidos da ADP glicose da Oryza sativa madura;

SEQ ID NO:12: Sequência de ácidos nucleicos que codifica

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Os-Wx-CTP + 20 aminoácidos da ADP glicose da Oryza sativa madura;

SEQ ID NO:13: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Rg-AS curto-CTP (subunidade a da antranilato sintase da Ruta graveolens; Met1 a Ser72;

SEQ ID NO:14: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Rg-As longo-CTP (subunidade a da antranilato sintase da Ruta graveolens; Met1 a Ser92;

SEQ ID NO:15: Sequência de ácidos nucleicos que codifica m-DHDPS-CTP (di-hidrodipicolinato da Zea mays);

SEQ ID NO:16: Zm-DHDPS-CTP + 9 aminoácidos da dihidrodipicolinato sintase da Zea mays madura;

SEQ ID NO:17: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-DHDPS-CTP + 20 aminoácidos da di-hidrodipicolinato sintase da Zea mays madura;

SEQ ID NO:18: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-DHDPS-CTP + 3 aminoácidos da di-hidrodipicolinato sintase da Zea mays madura; e

SEQ ID NO:19: Sequência de ácidos nucleicos que codifica peptídeo de trânsito pata o cloroplasto do gene da subunidade pequena da Arabidopsis thaliana rubisco, CTP1.

[0041] A presente invenção contempla também qualquer ácido nucleico isolado que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto (CTP) que compreende, por exemplo, qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:

SEQ ID NO:20: At-CTP2 (5-enolpiruvil) shikimato-3-fosfato sintase da Arabidopsis thaliana) com sítio de clivagem modificado (C/M);

SEQ ID NO:21: At-CTP2(E/K) com sítio de clivagem nativo (E/K);

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SEQ ID NO:22: At-CTP2(E/K) + 10 aminoácidos da EPSPS sintase da Arabidopisis madura;

SEQ ID NO:23: At-CTP2(E/K) + 5 aminoácidos da EPSPS sintase da Arabidopsis madura;

SEQ ID NO:24: Zm-ASA1-CTP (subunidade a1 da antranilato sintase da Zea mays);

SEQ ID NO:25: Zm-ASA1-CTP + 20 aminoácidos da subunidade a1 da antranilato sintase da Zea mays madura;

SEQ ID NO:26: Zm-ASA2-CTP (subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays);

SEQ ID NO:27: Zm-ASA2-CTP + 5 aminoácidos da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays madura;

SEQ ID NO:28: Zm-ASA2-CTP + 18 aminoácidos da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays madura;

SEQ ID NO:29: Os-Wx-CTP (ADP glicose pirofosforilase da Oryza sativa);

SEQ ID NO:30: Os-Wx-CTP + 5 aminoácidos da ADP glicose pirofosforilase da Oryza sativa madura;

SEQ ID NO:31: Os-Wx-CTP + 20 aminoácidos da ADP glicose pirofosforilase da Oryza sativa madura;

SEQ ID NO:32: Rg-AS curto-CTP (subunidade a da antranilato sintase da Ruta graveolens; Met1 a Ser72;

SEQ ID NO:33: Rg-AS longo-CTP (subunidade a da antranilato sintase da Ruta graveolens; Met1 a Ser92;

SEQ ID NO:34: Zm-DHDPS-CTP (di-hidrodipicolinato sintase da Zea mays);

SEQ ID NO:35: Zm-DHDPS-CTP + 9 aminoácidos da dihidrodipicolinato sintase da Zea mays madura;

SEQ ID NO:36: Zm-DHDPS-CTP + 20 aminoácidos da dihidrodipicolinato sintase da Zea mays madura;

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SEQ ID NO:37: Zm-DHDPS-CTP + 3 aminoácidos da dihidrodipicolinato sintase da Zea mays madura; e

SEQ ID NO:38: gene da subunidade pequena da Arabidopsis thaliana rubisco, CTP1.

[0042] Polipeptídeos isolados que codificam peptídeos de trânsito para cloroplasto (CTPs) da invenção fundidos à proteína fluorescente verde (GFP), às antranilato sintases, ou à antranilato sintase fusionada à GFP incluem DNAs compreendendo as seguintes SEQ ID Nos de nucleotídeos:

SEQ ID NO:39: Sequência de ácidos nucleicos que codifica At-CTP2 fusionada à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:40: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-ASA2-CTP fusionada à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:41: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Os-Wx-CTP fusionada à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:42: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Rg-AS curto-CTP fusionada à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:43: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-DHDPS-CTP fundida à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:44: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-DHDPS-CTP + 5 aminoácidos da di-hidrodipicolinato sintase da Zea mays madura fusionada à GFP;

SEQ ID NO:45: Sequência de ácidos nucleicos que codifica At-CTP2 com sítio de clivagem E/K fusionada à antranilato sintase da Rhizobium meliloti

SEQ ID NO:46: Sequência de ácidos nucleicos que codifica At-CTP2 + 10 aminoácidos fusionada à antranilato sintase da Rhizobium meliloti madura;

SEQ ID NO:47: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-ASA2-CTP fusionada à antranilato sintase da Rhizobium meliloti;

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SEQ ID NO:48: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-ASA2-CTP + 18 aminoácidos da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays madura fusionada à antranilato sintase da Rhizobium meliloti; e

SEQ ID NO:49: Sequência de ácidos nucleicos que codifica Zm-ASA2-CTP + 18 aminoácidos da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays madura (os primeiros 65 aminoácidos codificados pelo gene Zm-ASA-2) fusionada à antranilato sintase monomérica da Agrobacterium tumefaciens fundida à proteína fluorescente verde. [0043] Sequências representativas dos peptídeos de trânsito para o cloroplasto (CTPs) da invenção fusionada à proteína fluorescente verde (GFP) ou antranilato sintases incluem aminoácidos que compreendem as seguintes SEQ ID NOs de polipeptídeos:

SEQ ID NO:50 At-CTP2 fusionada à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:51 Zm-ASA2-CTP fusionada à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:52 Os-Wx-CTP fusionada à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:53 Rg-As-curto-CTP fundida à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:54 Zm-DHDPS-CTP fusionada à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:50 Zm-DHDPS-CTP + 5 aminoácidos da dihidrodipicolinato sintase da Zea mays madura fusionada à proteína fluorescente verde (GFP);

SEQ ID NO:56 At-CTP2 com sítio de clivagem nativa E/K fusionada à antranilato sintase da Rhizobium meliloti;

SEQ ID NO:57 At-CTP2 + 10 aminoácidos da EPSPS sintase da Arabidopsis madura fusionada à antranilato sintase da RhizoPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 22/304

16/82 bium meliloti;

SEQ ID NO:58 Zm-ASA2-CTP da antranilato sintase da Rhizobium meliloti;

SEQ ID NO:59 Zm-ASA-2-CTP + 18 aminoácidos da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays fusionada à antranilato sintase da Rhizobium meliloti;

e

SEQ ID NO:60 Zm-ASA2-CTP + 18 aminoácidos da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays (os primeiros 65 aminoácidos codificados pelo gene Zm-ASA2) fusionada à antranilato sintase monomérica da Agrobacterium tumefaciens fusionada à proteína fluorescente verde.

[0044] Certos oligonucleotídeos são úteis para a prática da presente invenção, por exemplo, oligonucleotídeos que compreendem as SEQ ID NOs: 61-198 são úteis na construção de vetores de transfecção para ensaios de protoplastos de transição; e oligonucleotídeos compreendendo SE ID NOs: 226-331 são úteis como iniciadores de PCR.

[0045] Um outro aspecto da presente invenção refere-se às antranilato sintases monoméricas (AS) e fragmentos das mesmas; e seu uso em métodos para obter plantas que produzem elevados níveis do L-triptofano livre. A superprodução de L-triptofano livre em plantas transgênicas contendo tais polipeptídeos resulta da introdução e expressão de um ácido nucleico que codifica antranilato sintase, ou um domínio do mesmo. Tais ácidos nucleicos da antranilato sintase incluem a-domínios do tipo selvagem ou mutante, ou formas monoméricas da antranilato sintase. Uma forma monomérica da antranilato sintase compreende pelo menos dois domínios de antranilato sintase em uma cadeia de polipeptídeo simples, por exemplo, um a-domínio ligado a um β-domínio.

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17/82 [0046] Antranilato sintases de plantas nativas são geralmente bastante sensíveis à inibição de realimentação por L-triptofano e análogos dos mêssmos. Tal inibição constitui um mecanismo chave para regular a via sintética do triptofano. Portanto, uma antranilato sintase ou um domínio desta que seja altamente ativo, mais eficaz ou que seja inibido em uma menor extensão pelo triptofano ou um análogo deste produzirá provavelmente níveis elevados de triptofano. De acordo com a invenção, as antranilato sintases das Agrobacterium tumefaciens e Sinorhizobium melilloti são particularmente úteis para produzir altos níveis de triptofano. Antranilato sintases monoméricas isoladas da presente invenção incluem adicionalmente formas desreguladas e fragmentos das mesmas. Tais formas desreguladas incluem o alelo S51C da Sinorhizobium conforme descrição aqui; os alelos F298W, V48F, V48Y, S51F e S51C da antranilato sintase da Agrobacterium, conforme descrita no Pedido de Patente US 2003097677; e a forma otimizada de códon do alelo S51C da antranilato sintase da Agrobacterium conforme descrita no Pedido de Patente US 11/503.532, intitulada High Tryptophan Maize, cada um dos quais é aqui incorporado a título de referência, na íntegra. Esses alelos são desregulados por inibição de realimentação de triptofano.

[0047] Para gerar altos níveis de triptofano em uma planta ou em uma célula hospedeira selecionada, o ácido nucleico da antranilato sintase selecionada é isolado e pode ser manipulado in vitro para incluir sinais reguladores para expressão gênica em células vegetais ou em outros tipos de célula. Devido ao fato de a via biossintética do triptofano nos vegetais ser reportada como estando presente dentro dos plastídios, os ácidos nucleicos da antranilato sintase exógena são ou introduzidos nos plastídios ou são modificados por adição de um segmento de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito de plastídio amino-terminal. Tal peptídeo de trânsito de plastídio pode direcioPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 24/304

18/82 nar o produto gênico da antranilato sintase nos plastídios.

[0048] De modo a alterar a biossíntese do triptofano, o ácido nucleico que codifica uma atividade de antranilato sintase deve ser introduzido nas células vegetais ou em outras células hospedeiras e estas células transformadas identificadas, diretamente ou indiretamente. Uma antranilato sintase inteira ou uma porção útil ou domínio desta pode ser usada. A antranilato sintase é estavelmente incorporada ao genoma da célula vegetal. Os sinais transcricionais que controlam a expressão da antranilato sintase devem ser reconhecidos por, e serem funcionais, dentro das células vegetais ou de outras células hospedeiras. Ou seja, a antranilato sintase deve ser transcrita no RNA mensageiro (mRNA), e o mRNA deve ser estável no núcleo da célula vegetal e ser transportado intacto para o citoplasma para tradução. O mRNA da antranilato sintase deve ter sinais traducionais apropriados para serem reconhecidos e apropriadamente traduzidos por ribossomos vegetais. O produto gênico do polipeptídeo deve escapar substancialmente do ataque proteolítico no citoplasma, ser transportado para o compartimento celular correto (por exemplo, um plastídio) e ser capaz de assumir uma conformação tridimensional que conferirá atividade enzimática. A antranilato sintase deve ser ainda estável para funcionar na biossíntese do triptofano e seus derivados; ou seja, deve estar localizada próxima às enzimas vegetais nativas catalisando as etapas de flanqueamento na biossíntese (presumivelmente em um plastídio) de modo a obter os substratos requeridos e passar para o produto apropriado.

[0049] Mesmo que tais condições sejam satisfeitas, a superprodução bem sucedida do triptofano não é um evento previsível. A expressão de alguns transgenes pode ser negativamente afetada por elementos cromossômicos próximos. Se o alto nível de triptofano é obtido por mutação para reduzir a inibição de realimentação, podem existir

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19/82 outros mecanismos de controle para compensar a regulação reduzida na etapa de antranilato sintase. Podem existir mecanismos que aumentam a taxa de rompimento dos aminoácidos acumulados. O triptofano e os aminoácidos relacionados devem ser também superproduzidos em níveis que não sejam tóxicos para a planta. Finalmente, a característica introduzida deve ser estável e hereditária de modo a permitir o desenvolvimento e uso, comerciais.

[0050] Isolamento e identificação dos polinucleotídeos que codificam as antranilato sintases são descritos no Pedido de Patente US 10/138.927, publicado como Publicação de Pedido de Patente US 20030097677 e concedido como Patente US 7.217.865; e US 10/430.11, publicado como Publicação de Pedido de Patente US 20030213010, os quais são aqui incorporados a título de referência na íntegra.

[0051] Exemplos de DNAs isolados que codificam antranilato sintases da presente invenção incluem DNAs que compreendem as seguintes SEQ ID NOs de nucleotídeos:

SEQ ID NO: 199 antranilato sintase do tipo selvagem da Agrobacterium tumefaciens;

SEQ ID NO: 201 Agrobacterium tumefaciens alelo mutante F298W da Agrobacterium tumefaciens;

SEQ ID NO: 203 alelo mutante S51F da Agrobacterium tumefaciens;

SEQ ID NO: 205 alelo mutante S51C da Agrobacterium tumefaciens;

SEQ ID NO: 207 alelo mutante S51C otimizado por códon da Agrobacterium tumefaciens;

SEQ ID NO: 209 tipo selvagem da antranilato sintase da Sinorhizobium meliloti; e

SEQ ID NO: 211 alelo mutante S51C da antranilato sintase

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20/82 da Sinorhizobium meliloti.

[0052] A presente invenção contempla também qualquer ácido nucleico isolado que codifique uma antranilato sintase compreendendo, por exemplo, qualquer uma das seguintes sequências de aminoácidos:

SEQ ID NO: 200 antranilato sintase do tipo selvagem da Agrobacterium tumefaciens;

SEQ ID NO: 202 mutante F298W da Agrobacterium tumefaciens;

SEQ ID NO: 204 mutante S51F da Agrobacterium tumefaciens;

SEQ ID NO: 206 mutante S51C da Agrobacterium tumefaciens;

SEQ ID NO: 208 mutante S51C otimizado com códon da Agrobacterium tumefaciens;

SEQ ID NO: 210 antranilato sintase do tipo selvagem da Sinorhizobium meliloti;

SEQ ID NO: 212 mutante S51C da Sinorhizobium meliloti. [0053] Como usado aqui com respeito à antranilato sintase, o termo monomérico significa que dois ou mais domínios da antranilato sintase são incorporados de um modo funcional em uma única cadeia de polipeptídeo. A antranilato sintase monomérica pode ser montada in vivo em uma forma dimérica. Polinucleotídeos e polipeptídeos da antranilato sintase monomérica podem ser isolados de vários organismos tais como Agrobacterium tumefaciens, Anabaena M22983, Azospirillum brasilense, Brucella melitensis, Euglena gracilis, Mesorhizobium loti, Nostoc sp. PCC7120 ou Rhizobium meliloti (Sinorhizobium meliloti). Alternativamente, ácidos nucleicos e polipeptídeos da antranilato sintase monomérica podem ser construídos de uma combinação de domínios selecionados de qualquer gene da antranilato sintase monomérica ou multimérica conveniente. Tais organismos incluem, por

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21/82 exemplo, Agrobacterium tumefaciens, Anabaena M22983, Arabidopsis thaliana, Azospirillum brasilense, Brucella melitensis, Mesorhizobium loti, Nostoc sp. PCC7120, Rhizobium meliloti (Sinorhizobium meliloti), Rhodopseudomonas palustris, Ruta graveolens, Sulfolobus solfataricus, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, soja, arroz, algodão, milho, ou qualquer gene que codifique uma subunidade ou domínio da antranilato sintase. Ácidos nucleicos que codificam os domínios selecionados podem ser ligados de forma recombinante. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica a terminação C de um a-domínio pode ser ligado a um ácido nucleico que codifique a terminação N do βdomínio, ou vice-versa, por formação de uma ligação de fosfodiéster. Como alternativa tais polipeptídeos de domínio simples podem ser ligados quimicamente. Por exemplo, o a-domínio pode ser ligado via terminação C à terminação N do β-domínio, ou vice-versa, por formação de uma ligação peptídica.

[0054] Como usado aqui, uma antranilato sintase que é desregulada para inibição de realimentação por triptofano é uma antranilato sintase que retém mais que cerca de 10% mais atividade que um tipo selvagem correspondente ou antranilato sintase suscetível nativa, quando as antranilato sintases desreguladas e do tipo selvagem são expostas a quantidades equivalentes de triptofano ou um análogo de aminoácido do triptofano. Preferivelmente, a antranilato sintase desregulada retém mais que cerca de 20% mais atividade que uma correspondente antranilato sintase do tipo selvagem ou nativa, suscetível. [0055] Fragmentos ou variantes dos polipeptídeos são também considerados como fazendo parte da presente invenção. Um fragmento é uma polipeptídeo variante que tem uma sequência de aminoácidos que é inteiramente a mesmo que parte, mas não toda a sequência de aminoácidos dos polipeptídeos descritos previamente. Os fragmentos podem ser de posição livre, ou compreendidos dentro de um poPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 28/304

22/82 lipeptídeo maior deste que o fragmento forma uma parte ou região, mais preferivelmente como uma região simples contínua. Fragmentos preferidos são biologicamente fragmentos ativos que são aqueles fragmentos que medeiam atividades dos polipeptídeos da invenção, incluindo aqueles com atividade similar ou atividade aperfeiçoada ou com uma atividade diminuída. Também incluídos estão aqueles fragmentos que são antigênicos ou imunogênicos ou em um animal, para o propósito de gerar anticorpos úteis em um método de detecção, por exemplo, ensaio de imunossorvente ligado a enzima.

[0056] Variantes dos polipeptídeos incluem também polipeptídeos que variam das sequências estabelecidas na Listagem de Sequências por substituições de aminoácidos conservativos, substituição de um resíduo por um outro com características iguais. Em geral, tais substituições estão entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser e Thr; entre Asp e Glu; entre Asn e Gln; entre Lys e Arg; ou entre Phe e Tyr. Particularmente preferidas são variantes nas quais 5 a 10; 1 a 5; 1 a 3 ou um aminoácido, são substituídos, deletados, ou adicionados, em qualquer combinação.

[0057] Sequências de DNA, funcionais, da antranialto sintase e polipeptídeos funcionais da antranilato sintase que exibem 80%, mais preferivelmente 85%, ainda mais preferivelmente 90% a 95% e, mais preferivelmente 96% a 99%, a identidade de sequência para as sequências de DNA e para as sequências de aminoácidos explicitamente descritas aqui estão também dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, 85% de identidade de aminoácidos significam que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as 2 sequências estão alinhadas para correspondência máxima. Lacunas (em qualquer uma das 2 sequências apresentam correspondência) são deixadas para maximizar a correspondência; comprimentos de lacunas de 5 ou menos são preferidos, com 2 ou menos sendo mais preferidos.

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23/82 [0058] Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados, por exemplo, na construção dos vetores de expressão recombinante úteis para a transformação das células hospedeiras vegetais, conforme posterior discussão aqui.

Vetores de Transformação de Planta [0059] De interesse na presente invenção é o uso das sequências de polinucleotídeos, ou polinucleotídeos, em vetores de expressão recombinantes para direcionar a transcrição e tradução das sequências de polinucleotídeos que codificação a AS monomérica fusionada a um CTP em uma célula hospedeira vegetal.

[0060] Como usado aqui, recombinante inclui referência a uma célula ou vetor, que foi modificado por introdução de uma sequência de ácidos nucleicos heterólogos ou que a célula seja derivada de uma célula assim modificada. Logo, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados de forma idêntica dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outro modo anormalmente expressos, subexpressos ou não expressos de modo nenhum como resultado da deliberada intervenção humana.

[0061] O termo operavelmente ligado refere-se a uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que o promotor inicia e medeia a transcrição de sequências de DNA correspondentes à segunda sequência. Como usado aqui, operavelmente ligado refere-se também a uma ligação funcional entre 2 ou mais sequências de nucleotídeos distintas de modo que as sequências de ácidos nucleicos que estão ligadas são contíguas, e, se necessário para ligar duas regiões de codificação de proteína contíguas e no mesmo quadro de leitura. Por exemplo, ligar operavelmente as sequências de codificação de CTP com a sequência de nucleotídeos que codifica uma antranilato sintase monomérica pode requerer a manipulação de

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24/82 uma ou mais das sequências de DNA, tal como um sítio de restrição conveniente ou uma sequência de ligante que possa permitir melhor reconhecimento da sequência de trânsito amino-terminal.

[0062] Tais polinucleotídeos podem ser amplificados usando-se cDNA, mRNA ou DNA genômico como um modelo e iniciadores de oligonucleotídeos apropriados de acordo com as técnicas padrão de amplificação por PCR. Alternativamente, eles podem ser sintetizados usando-se técnicas sintéticas padrão, tal como um sintetizador de DNA automatizado.

[0063] Um vetor de expressão compreende, minimamente, uma sequência de polinucleotídeos, que codifica um polipeptídeo que é expresso em uma célula hospedeira. Tipicamente, um vetor de expressão é colocado sob o controle de certos elementos reguladores que incluem promotores, elementos reguladores específicos de tecido, e intensificadores. Diz-se que tal vetor de expressão está operavelmente ligado aos elementos reguladores.

[0064] Os vetores de expressão da presente invenção compreendem em geral uma promotor, funcional em uma célula vegetal, operavelmente ligado a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma antranilato sintase, fusionado a um peptídeo de trânsito para o cloroplasto (CTP) da presente invenção e uma região de terminação transcricional funcional em uma célula hospedeira vegetal.

[0065] Exemplos de vetores de expressão da presente invenção incluem DNAs tendo as seguintes SEQ ID NOs:

SEQ ID NO: 213, sequência de ácidos nucleicos que codifica pMON68065, o vetor de expressão para Zm-ASA2-CTP +18::alelo mutante não otimizado AgroAS(S51C);

SEQ ID NO: 214, sequência de ácidos nucleicos que codifica pMON68066, o vetor de expressão para Zm-ASA2-CTP +18::alelo mutante otimizado não-nativo (mno) AgroAS(S51C);

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SEQ ID NO: 215, o vetor de expressão para pMON69757, a sequência de ácidos nucleicos que codifica a construção contendo o alelo mutante AgroAS(F298W);

SEQ ID NO: 216, sequência de ácidos nucleicos que codifica pMON69770, o vetor de expressão para a construção contendo o alelo mutante não otimizado AgroAS(S51C) com 3' UTR alternada;

SEQ ID NO: 217, sequência de ácidos nucleicos que codifica pMON69768, o vetor de expressão para a construção contendo o alelo mutante AgroAS(S51F);

SEQ ID NO: 218, sequência de ácidos nucleicos que codifica pMON78850, o vetor de expressão para a construção contendo o alelo tipo selvagem da antranilato sintase da Rhizobium meliloti;

SEQ ID NO: 219, sequência de ácidos nucleicos que codifica pMON78851, o vetor de expressão para a construção contendo o alelo S51C antranilato sintase da Rhizobium meliloti.

[0066] Célula hospedeira significa que uma célula contém um vetor e suporta a replicação, e/ou transcrição ou transcrição e tradução (expressão) da construção de expressão. Células hospedeiras para uso na presente invenção podem ser células de vegetais de monocotiledôneas ou células bacterianas. Um exemplo de uma célula hospedeira bacteriana da presente invenção é Agrobacterium. Em uma modalidade preferida, células hospedeiras são células de milho.

[0067] Como usado aqui, uma planta transgênica é uma planta que tem um polinucleotídeo exógeno estavelmente introduzido em seu genoma, por exemplo, os polinucleotídeos nucleares ou de plastídio de um outro organismo.

[0068] Os termos sementes e caroços devem ser entendidos como sendo de significados equivalentes. O termo caroço é frequentemente usado para descrever a semente de uma planta de milho ou de arroz. Em todas as plantas, a semente é o óvulo maduro que conPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 32/304

26/82 siste em um revestimento de semente, embrião, aleurona, e um endosperma.

[0069] De interesse particular é o uso dos polinucleotídeos da presente invenção para a preparação de vetores de expressão recombinante para codificar uma AS monomérica fusionada com um CTP em uma célula vegetal hospedeira, em que o CTP direciona a localização da AS para a fração de plastídio da célula hospedeira vegetal. Construções de expressão, vegetais, compreendem geralmente um promotor funcional em uma célula hospedeira vegetal ligada a uma sequência da presente invenção e uma região de terminação transcricional funcional em uma célula hospedeira vegetal.

[0070] Como usado aqui promotor significa uma região de sequência de DNA que é essencial para a iniciação de transcrição de RNA de DNA. Promotores são localizados a montante do DNA a ser transcrito e têm regiões que agem como sítios de ligação para RNA polimerase e têm regiões que trabalham com outros fatores para promoverem a transcrição de RNA. Mais especificamente, promotores basais em plantas compreendem regiões canônicas associadas com a iniciação de transcrição, tais como as caixas CAAT e TATA. Na presente invenção, as moléculas de promotor preferidas e moléculas de 5' UTR permitem a transcrição em células de sementes ou tecidos em uma taxa ou em um nível maior que em outras células e tecidos da planta. Aqueles versados na técnica reconhecerão que existem numerosos promotores constitutivos e específicos de tecido que são funcionais em células vegetais, e foram descritas na literatura. Por exemplo, os promotores são descritos na Patente US 6.437.217 (promotor de RS81 de milho); Patente US 5.641.876 (promotor de actina de arroz); Patente US 6.426.446 (promotor RS324 de arroz); Patente US 6.429.362 (promotor de PR-1 de milho); Patente US 6.232.526 (promotor A3 de milho); Patente US 6.177.611 (promotores de milho constituPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 33/304

27/82 tivos); Patentes US 5.322.938. 5.352.605. 5.359.142 e 5.530.196 (promotor de 35S); Patente US 6.433.252 (promotor de oleosina L3 de milho, P-Zm.L3); Patente US 6.429.357 (promotor 2 de actina de arroz bem como intron 2 de actina de arroz); Patente US 5.837.848 (promotor específico de raiz); Patente US 6.294.714 (promotores induzíveis por luz); Patente US 6.140.078 (promotores induzíveis por sal); Patente US 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno); Patente US 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo); Patente US 6.635.806 (promotor de gama-coixina, P-Cl.Gcx); Pedido de Patente US 10/732.721 (promotor específico de embrião de milho, ZmEM; emb5); Patente US 7.151.204 (promotor de cloroplasto aldolase de milho); SEQ ID NO: 220 (promotor Per1 de cevada); SEQ ID NO: 221 (promotor B32); SEQ ID NO: 222 (promotor Z27 de milho); SEQ ID NO: 223 (promotor 1 de Globulina de milho; Belanger e Kriz. 1991); e SEQ ID NO: 224 (promotor L-3 de coixina), todos os quais são aqui incorporados a título de referência.

[0071] Promotores constitutivos tal como o promotor CaMV35A derivado do vírus do mosaico da couve-flor (Patente US 5.858.741 e Patente US 5.322.938) ou o promotor FMV35S derivado do vírus do mosaico da escrofulária (Patente US 5.378.619) rendem altos níveis de expressão na maioria dos órgãos das plantas. Versões intensificadas ou duplicadas dos promotores AcMV35S e FMV35S são úteis na prática desta invenção, por exemplo, o CaMV35S (e35S) intensificado (Odell, et al., 1985); Patente US 5.378.629). Além disso, pode ser também preferido produzir expressão da proteína de interesse em tecidos específicos da planta, tais como folha, caule, raiz, tubérculo, endosperma da semente, embriões da semente, fruta, etc., e o promotor escolhido deve ter o tecido desejado e especificidade desenvolvimental.

[0072] Regiões de terminação de transcrito reguladoras podem

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28/82 também ser proporcionadas nos vetores de expressão de planta da presente invenção. As regiões de terminação de transcritos podem ser fornecidas pela sequência de genes da antranilato sintase endógena ou uma região de terminação de transcrição conveniente derivada de uma fonte de gene diferente. Essas regiões de terminação de transcrição são comumente referidas como regiões 3' não traduzidas ou 3' UTRs. Exemplos de regiões 3' URT incluem a região 3' da nopalina sintase (nos 3'; Fraley et al., 1983), proteína de choque térmico do milho, hsp 17 (T-Ta.Hsp17), a região 3' do gene de glutelina da Oryza sativa (Os-gt1; SEQ ID NO: 225), uma 3' UTR do gene de zeína, tal como Z27 3' UTR (Lopes et al., 1995), globulina 1 do milho (TZm.Glb1), e T-Ps.RbcS2:E9 (subunidade pequena da Rubisco de ervilha), aquelas descritas em WO0011200A2 e outras 3' UTRs conhecidas da técnica, que podem ser testadas e usadas em combinação com uma região de codificação da antranilato sintase fundida a um peptídeo de trânsito para o cloroplasto. O técnico versado na técnica reconhecerá que qualquer região de terminação de transcrito conveniente que seja capaz de terminar a transcrição em uma célula vegetal monocotiledônea pode ser empregada nas construções da presente invenção.

[0073] Além disso, intensificadores de transcrição ou duplicações de intensificadores podem ser usados para aumentar a expressão de um promotor particular. Exemplos de tais intensificadores incluem, mas sem limitação, um intron hsp70 de milho (também referido como Zm.DnaK) (Patente US 5.424.412 Brown, et al.), o intron 1 Adh (Callis et al., 1987), um intron da actina de arroz (McElroy et al., 1991; Patente US 5.641.876), intron da sacarose sintase (Vasil et al., 1989), um elemento ômega TMV (Gallie et al., 1999), e o intensificador de CaMV 35S ou um intensificador da octopina sintase (Patente US 5.290.924). Como a sequência de DNA entre o sítio de iniciação de transcrição e o

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29/82 início da sequência de codificação, isto é, a sequência líder não traduzida, pode influenciar a expressão gênica, pode ser também desejado empregar um sequência de líder particular. Qualquer sequência de líder disponível para aquele versado na técnica pode ser empregada. Sequências líder preferidas direcionam níveis ótimos de expressão do gene ligado, por exemplo, por aumento ou manutenção da estabilidade de mRNA e/ou por prevenção da iniciação inapropriada de tradução (Joshi, 1987). A escolha de tais sequências fica a critério daqueles versados na técnica. Sequências que são derivadas de genes que são altamente expressos em monocotiledôneas, e em particular milho e arroz, são contempladas.

[0074] Ensaios para determinar a eficácia, pela qual as sequências de CTP isoladas direcionam uma proteína de interesse a um plastídio, são bem conhecidos da técnica. A título de exemplo, um gene repórter tais como β-glucuronidase (GUS), cloranfenicol acetil transferase (CAT), ou proteína fluorescente verde (GFP) pode ser operavelmente ligado à sequência de CTP. Essa fusão gênica ocorre depois do controle de um promotor adequado, ligado a um vetor de transformação, e transformado em uma célula vegetal. Depois de um período de tempo adequado para expressão e localização no plastídio, a fração de plastídio é extraída e a atividade repórter ensaiada. A capacidade das sequências de CTP isoladas de direcionar e distribuir a proteína repórter para o plastídio é assim avaliada e comparada com outras sequências de CTP conhecidas; vide Silva-Filho et al. (1996).

Transformação de Célula Vegetal [0075] Uma célula vegetal, tecido, órgão, ou planta onde o vetor de expressão recombinante da presente invenção foi introduzido é considerado transformado, transfectado, ou transgênico. Uma célula vegetal ou planta transgênica ou transformada também inclui a progênie da célula vegetal ou da planta e a progênie produzida de um proPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 36/304

30/82 grama de cruzamento tal como uma planta transgênica como um parente em um cruzamento e exibindo um fenótipo alterado resultante da presença de uma sequência de ácidos nucleicos introduzida.

[0076] O termo introduzido no contexto de inserir uma sequência de ácidos nucleicos em uma célula significa transfecção, ou transformação ou transdução e inclui referência à incorporação de uma sequência de ácidos nucleicos em uma célula eucariótica ou procariótica onde a sequência de ácidos nucleicos pode ser incorporada no genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídio, ou DNA mitocondrial), convertida em um replicon autônomo, ou transientemente expresso (por exemplo, mRNA transfectado).

[0077] Como usado aqui, o termo planta inclui referência às plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, e células vegetais e sua progênie. A célula vegetal, como usada aqui, inclui, sem limitação, culturas em suspensão de semente, embriões, regiões meristemáticas, tecido do calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, e micrósporos. A classe de plantas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção inclui geralmente plantas monocotiledôneas. Uma planta preferida da presente invenção é milho.

[0078] Como usado aqui, o termo planta transgênica inclui referência a uma planta que compreende dentro de seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo está estavelmente integrado dentro do genoma de modo que o polinucleotídeo é passado para gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado ao genoma sozinho ou como parte de um vetor de expressão recombinante. O termo transgênico é usado aqui para incluir qualquer célula, linhagem de célula, calo, tecido, parte da planta ou a planta, cujo genótipo foi alterado pela presença de ácido nucleico heterólogo incluindo aqueles transgênicos inicialmente assim

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31/82 alterados, bem como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexuada do transgênico inicial.

[0079] Assim uma planta tendo dentro de suas células um polinucleotídeo heterólogo pode estar ou estavelmente integrado ao genoma, ou pode ser extracromossômico. Preferivelmente, os polinucleotídeos da presente invenção estão estavelmente integrados ao genoma de modo que os polinucleotídeos são passados para gerações sucessivas. Os polinucleotídeos estão integrados ao genoma sozinho ou como parte um vetor de expressão recombinante.

[0080] Como usado aqui, o termo heterólogo com referência a um ácido nucleico é um ácido nucleico que se origina de uma espécie estranha, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificado de sua forma nativa em composição e/ou do local genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor ligado operavelmente a um gene estrutural heterólogo é de uma espécie diferente daquela da qual o gene estrutural derivou, ou, se da mesma espécie, um ou ambos são substancialmente modificados de sua forma original. Uma proteína heteróloga pode se originar de uma espécie estranha, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma original por intervenção humana deliberada.

[0081] Os métodos particulares usados para a transformação da célula vegetal hospedeira não são críticos para a presente invenção. A transformação da planta é preferivelmente permanente, isto é, por integração das construções de expressão introduzidas ao genoma da planta hospedeira, de modo que as construções introduzidas são passadas para as gerações de plantas sucessivas. Aquele versado na técnica reconhecerá que uma ampla variedade de técnicas de transformação existe na técnica. Qualquer técnica que seja adequada para a planta hospedeira alvo poderá ser empregada no escopo da presente invenção. Por exemplo, as construções podem ser introduzidas em

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32/82 uma variedade de formas, que inclui, mas sem limitação, uma fita de DNA, em um plasmídeo, ou em um cromossomo artificial. A introdução das construções nas células vegetais alvo pode ser efetuada por uma variedade de técnicas, incluindo, mas sem limitação, coprecipitação de cálcio-fosfato-DNA, eletroporação, microinjeção, infecção por Agrobacterium, lipossomos ou transformação com microprojéteis (isto é, a pistola de gene).

[0082] Com respeito ao bombardeio de microprojéteis (Patentes US 5.550.318; US 5.538.880, e US 5.610.041; cada uma das quais é aqui incorporada a título de referência, na íntegra), partículas são revestidas com polinucleotídeos e distribuídas às células através de força propulsora. Exemplos de partículas incluem aquelas compreendidas de tungstênio, platina, e preferivelmente, ouro. Um método útil para distribuir DNA para células vegetais por aceleração de partículas é o Sistema de Distribuição de Partículas Biolistics® (BioRad, Hercules, Califórnia), que pode ser usado para propelir partículas revestidas com DNA ou células através de uma tela, tal como aço inoxidável ou tela NYTEX, sobre uma superfície de filtro coberta com células vegetais monocotiledôneas em suspensão. Técnicas de bombardeio de microprojéteis são amplamente aplicáveis, e podem ser usadas para transformar virtualmente qualquer espécie de planta. Exemplos de espécies que foram transformadas por bombardeio de microprojéteis incluem espécies monocotiledôneas tais como milho (Publicação de PCT WO95/0618), cevada, trigo (Patente US 5.563.055, aqui incorporada a título de referência na íntegra), arroz, aveia, centeio, cana-de-açúcar, e sorgo; bem como várias dicotiledôneas incluindo tabaco, soja (Patente US 5.322.783, aqui incorporada a título de referência na íntegra), girassol, amendoim, algodão, tomate, e legumes em geral (Patente US 5.563.055, aqui incorporada a título de referência, na íntegra). Aquele versado na técnica pode referir-se à literatura para detalhes e selecioPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 39/304

33/82 nar técnicas adequadas para uso nos métodos da presente invenção. [0083] Normalmente, incluído com o vetor de expressão da presente invenção estará um gene estrutural tendo as regiões reguladoras necesságarias para expressão em um hospedeiro e para proporcionar a seleção das células transformantes. O gene pode proporcionar resistência a um agente citotóxico, por exemplo, antibiótico, metal pesado, toxina, etc., complementação proporcionando prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, imunidade viral e similar. Dependendo do número de espécies hospedeiras diferentes, construção de expressão ou componentes destes que são introduzidos um ou mais marcadores podem ser empregados, em que condições diferentes para seleção são usadas para os diferentes hospedeiros.

[0084] Quando Agrobacterium é usada para transformação da célula vegetal, um vetor pode ser usado o qual pode ser introduzido no hospedeiro Agrobacterium para recombinação homóloga com T-DNA ou o plasmídeo Ti ou Ri presente no hospedeiro Agrobacterium. O plasmídeo Ti ou Ri contendo T-DNA para recombinação pode ser armado (capaz de causar formação de gll) ou desarmado (incapaz de causar formação de gll), sendo o último permissível, desde que os genes vir estejam presentes no hospedeiro Agrobacterium. O plasmídeo armado pode dar uma mistura de células vegetais normais e gall.

[0085] Em alguns casos quando a Agrobacterium é usada como o veículo para transformar células vegetais hospedeiras, a construção de expressão ou de transcrição limitada pela região(ões) da borda de T-DNA será inserida em uma vetor de ampla faixa hospedeira capaz de replicação na E. coli e Agrobacterium, havendo vetores de ampla faixa hospedeira descritos na literatura. Comumente usados são pRK2 ou derivados destes. Vide, por exemplo, Ditta et al., (1980) e EPA 0 120 515, que são aqui incorporados a título de referência. Alternativamente, as sequências podem ser inseridas para serem expressas em

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34/82 células vegetais em um vetor contendo sequências de replicação separadas, uma das quais estabiliza o vetor em E. coli e a outro na Agrobacterium. Vide, por exemplo, McBride e Summerfelt (1990), em que a origem de replicação pRiHRI (Jouanin et al., 1985) é usada e proporciona estabilidade adicionada dos vetores de expressão de planta em células de Agrobacterium hospedeiras.

[0086] Incluídos com a construção de expressão e o T-DNA estarão um ou mais marcadores que permitem a seleção das células transformadas de Agrobacterium e vegetais. Vários marcadores foram desenvolvidos para uso com células vegetais, tal como resistência a cloranfenicol, canamicina, o aminoglicosídeo G418, higromicina, ou similares. O marcador particular empregado não é essencial para esta invenção, sendo um ou outro marcador preferido, dependendo do hospedeiro particular e da maneira da construção.

[0087] Para transformação das células vegetais usando Agrobacterium, explantes podem ser combinados e incubados com a Agrobacterium transformada por tempo suficiente para a transformação, as bactérias mortas, e as células vegetais cultivadas em meio seletivo. Uma vez que o calo se forma, a formação de broto pode ser encorajada empregando-se os hormônios vegetais apropriados de acordo com métodos conhecidos e os brotos transferidos para o meio enraizador para regeneração de plantas. As plantas podem ser então crescidas para formar sementes e as sementes podem ser usadas para estabelecer gerações repetitivas.

[0088] Existem vários meios possíveis para obtenção das células vegetais desta invenção que contêm vetores de expressão múltipla. Quaisquer meios para produzir uma planta compreendendo um vetor ou sequência de polinucleotídeos da presente invenção, e pelo menos um outro vetor tendo uma outra sequência de polinucleotídeos que codifica uma enzima separada são englobados pela presente invenção.

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Por exemplo, o vetor de expressão da presente invenção pode ser usado para transformar uma planta ao mesmo tempo que a segunda construção, por inclusão de ambos os vetores de expressão em um vetor de transformação de planta (plasmídeo) ou pelo uso de vetores de transformação de planta separados, cada um dos quais expressa os genes desejados. O segundo vetor pode ser introduzido em uma planta que já tenha sido transformada com o primeiro vetor de expressão, ou altemativamente, plantas transformadas, uma tendo a primeira construção e uma tendo a segunda construção, podem ser cruzadas, usando-se técnicas de cruzamento padrão, para fazer com que as construções fiquem juntas na mesma planta.

Métodos [0089] A presente invenção proporciona um método para aumentar os níveis de triptofano livre em uma semente de uma planta transgênica. Em uma modalidade, o método para aumentar o triptofano compreende introduzir em uma célula vegetal uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma antranilato sintase monomérica ligada operavelmente a um CTP, que é capaz de direcionar ou localizar a antranilato sintase monomérica ao cloroplasto da célula vegetal. A antranilato sintase monomérica da presente invenção é uma forma desregulada da enzima que é insensível à inibição de realimentação por triptofano.

[0090] Como usados aqui, os termos níveis aumentados ou elevados de triptofano livre em uma célula vegetal, tecido vegetal, parte de planta ou planta são níveis que são cerca de 2 a 200 vezes, preferivelmente cerca de 5 a 150 vezes, e, mais preferivelmente, cerca de 10 a 100 vezes, os níveis encontrados em uma célula vegetal, tecido vegetal, parte da planta ou planta não transformados, isto é, um onde o genoma não tenha sido alterado pela presença de um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto fusionado

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36/82 a uma antranilato sintase monomérica. Por exemplo, os níveis de Ltriptofano livre em uma semente de planta transformada são comparados àqueles de uma semente de planta não transformada (o material de partida).

[0091] Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar um método com processamento relativamente rápido para prognosticar a capacidade de um CTP de compartimentalizar corretamente uma AS monomérica para os plastídios de células vegetais. A presente invenção proporciona um método de visualização utilizando expressão transiente em cloroplastos de milho, ou embriões em desenvolvimento de milho, de uma proteína fluorescente verde (GFP) fusionada a várias AS monoméricas e a vários CTPs. Uma GFP é capaz de produzir uma fluorescência verde, absorver no UV para a faixa azul com um pico em 395 nm e emitir na faixa verde com um pico em 510 nm. Esse método permite a visualização da localização do polipeptídeo AS::GFP. Um resultado se maior que 50% da localização no plastídio seria um prognóstico positivo da capacidade do CTP de compartimentalizar com sucesso a AS monomérica.

[0092] A presente invenção proporciona ainda um método para fabricar um produto de ração de milho nutricionalmente intensificado que compreende processar uma semente de uma planta de milho da presente invenção em uma farinha, proteína ou óleo.

[0093] Adicionalmente, a presente invenção proporciona um método para detectar sequências de DNA únicas pertencentes a quaisquer combinações de sequências de CTP::AS descritas aqui em uma célula vegetal transgênica, ou em um produto de ração ou de farinha derivado de tal célula vegetal transgênica. O genoma de tal célula vegetal transgênica, ou uma ração ou produto de farinha derivado de tal célula vegetal transgênica produz um amplicon diagnóstico para um vetor de expressão contendo qualquer uma das sequências de CTP::AS únicas

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37/82 quando testadas em um método de amplificação de DNA para amplificar uma molécula de DNA do DNA extraído de tal célula vegetal transgênica, ou uma reação ou produto de farinha derivado de tal célula vegetal transgênica. Como usado aqui, um amplicon é uma pedaço de DNA que foi sintetizado usando-se técnicas de amplificação tal como PCT ou LACR. Um amplicon é também entendido em seu uso comum como sendo um produto de PCR.

[0094] A invenção será agora genericamente descrita, ela será mais prontamente entendida por referência aos seguintes exemplos que estão incluídos com fins tão-somente ilustrativos e não têm o objetivo de limitar a presente invenção.

EXEMPLOS [0095] Os seguintes exemplos estão incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionarem bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas como constituindo os modos preferidos para sua prática. Contudo, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente exposição, apreciarem que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obter um resultado parecido ou similar sem se desviar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, ficará aparente que certos agentes, que são tanto química como fisiologicamente relacionados podem ser usados em substituição aos agentes descritos aqui, desde que resultantes semelhantes ou similares sejam obtidos. Todos tais substitutos similares e modificações aparentes para aqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, conforme definida pelas reivindicações apensas.

EXEMPLO 1

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Localização de uma Antranilato Sintase Compreendendo um Peptídeo de Trânsito para o Cloroplasto CTP1 [0096] Este exemplo demonstra que o produto de proteína de um transgene que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto CTP1 fusionado à terminação amino de um alelo de antranilato sintase da Agrobacterium não é eficazmente direcionado nos plastídios embrionários no milho transgênico.

[0097] O vetor de transformação de planta pMON66560 (figura 1) codifica uma proteína de fusão, que compreende a sequência de peptídeos de trânsito para o cloroplasto do gene de subunidade pequena da Arabidopsis rubisco, CTP1 (codificada por SEQ ID NO: 19) fusionada à terminação amino de AgroAS(F298W) (codificada por SEQ ID NO: 201), e acionada por um promotor específico de embrião de milho (ZmEM).

[0098] Para isolar a fração de plastídio dos embriões de caroços imaturos das plantas de milho transgênicas, várias espigas foram colhidas nos dias 25-27 depois da polinização (DAP). As plantas de milho transgênicas F3 homozigóticas continham o vetor de transformação vegetal Pmon66560 (figura 1).

[0099] Aproximadamente 2,5 g de embriões foram colocados sobre gelo na medida em que eram excisados dos caroços. Os embriões foram então enxaguados três vezes em água estéril gelada, seguido por enxágue em tampão PIM gelado (20 mM de Hepes/NaOH, 0,5M de sorbitol, 10mM de KCl, 1mM de MgCl2, 1mM de EDTA, 10mM de DTT, pH 7,4). Os embriões e frações subsequentes foram mantidos gelados durante todas as etapas de isolamento.

[00100] Os embriões foram então transferidos para um placa de Petri contendo 5 mL de PIM, e picados finamente usando lâminas de barbeador de extremidade simples até que a consistência dos embriões picados se assemelhassem à areia. Os embriões picados foram

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39/82 filtrados através de 1 camada de Miracloth® (Calbiochem Corporation, La Jolla, CA) em um tubo cônico de 50 mL e levados a um volume total de 20 mL com PIM. Uma alíquota pequena desse homogeneizado filtrado foi então centrifugada a 750x g por 5 minutos para precipitar os plastídios. O sobrenadante foi vertido, e uma pequena alíquota (designada S1) armazenada a -80^oC. Uma alíquota de 2,5 mL de PIM foi então adicionada aos plastídios precipitados, e os precipitados foram resuspensos usando-se uma pequeno pincel de pintura de cerdas macias. Depois que uma pequena alíquota foi removida e congelada (fração designada P1), 2,5 mL dos precipitados re-suspensos foram colocados em camadas sobre cada um do gradientes Percoll descontínuos. O tubos de gradiente consistiam em 6 mL de 35% de Percoll/PiM em camadas sobre 3 mL de 75% de Percoll/PIM. Os tubos de gradientes foram então centrifugados por 8 minutos a 1.000x g. As bandas de plastídio resultantes a 35% / 75% da interface foram coletadas e transferidas para um outro tubo de 15 mL, e 1 mL de 1X PIM foram adicionados a cada tubo. Depois de centrifugação a 750x g por 5 minutos, o sobrenadante foi removido, e ambos os precipitados foram resuspensos em 0,25 mL de PIM. A fração de precipitado resuspenso contendo os plastídios purificados foi designada P2 e foi armazenada a -80^oC antes da análise.

[00101] A presença da proteína AS nas quatro frações isoladas (H, S1, P1 e P2) foi analisada por análise Western blot, usando métodos bem conhecidos da técnica. Em resumo, as frações de proteína foram separadas por SDS-PAGE em 4-12% de géis Bio-RAD Criterion BisTris (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), carregando 18 mg de proteína/faixa. Depois da eletroforese, as proteínas foram transferidas para nitrocelulose, e blots em duplicata foram submetidos a protocolos padrão para *Western blotting incluindo bloquear, incubação de anticorpos primários (anticorpos primários descritos abaixo), lavagem, incuPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 46/304

40/82 bação de anticorpos secundários (conjugados com a peroxidase de raiz forte), lavagem, e detecção quimioluminescente. Os anticorpos primários usados na análise *blot foram cultivados em cabra contra (a) a subunidade a-2 da antranilato sintase do milho, uma proteína localizada no plastídio conhecida; (b) glutamina sintetase 1 de ervilha (GS1), uma forma citosólica de glutamina sintase (GS) (Tingey et al., 1987); e (c) antranilato sintase da Agrobacterium. Os anticorpos, denominados ASa anti-milho, GS1 antiervilha e AS anti-agro, respectivamente, foram preparados usando-se metodologia padrão conhecida da técnica.

[00102] Os resultados (figura 2) demonstram que o anticorpo ASa anti-milho, na medida em que reconhecida bandas correspondentes à subunidade a-2 da antranilato sintase do milho em todas as quatro frações, foi enriquecido nas frações de plastídios P1 e P2. Em contraste, o anticorpo GS1 antiervilha reconheceu uma banda correspondente a uma proteína do tamanho esperado nas frações H e S1, uma quantidade menor de proteína na fração de plastídio P1 bruta, e quantidades dificilmente detectadas nos plastídios purificados, fração P2. Esse padrão de particionar a glutamina sintetase é consistente com sua localização para o citosol. O anticorpo AS anti-agro reconheceu uma proteína do tamanho esperado que exibe um padrão que se assemelha ao marcador citosólico GS1 em todas as quatro frações, indicando que está também localizada primariamente no citosol, apesar do fato que a sequência de codificação ter incluído a sequência de CTP1. Os resultados indicam que a CTP1 não seria útil em vetores de expressão para compartimentalizar a proteína no plastídio das células embrionárias de milho. Adicionalmente, os resultados sugerem que nem todos os peptídeos de trânsito para o cloroplasto têm a capacidade de localizar com sucesso uma AS monomérica para os plastídios de células de milho.

EXEMPLO 2

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Sequências de Peptídeo de Trânsito Adicional para a Localização da Antranilato Sintase [00103] Este exemplo descreve o desenho de várias seqüências de CTP que foram incorporadas à construção dos vetores de transfecção de protoplasto contendo as fusões de antranilato sintase de milhoproteína fluorescente verde (Zm-AS::GFP) e as fusões controle::GFP detalhadas no Exemplo 3; e que foram avaliadas nos sistemas de ensaio de expressão transiente que estão descritos no Exemplo 4.

Tabela 1. Variantes de CTP

Nome do CTP	SEQ ID NO:	Breve Descrição do CTP
At-CTP2(C/M)	1	At-CTP2 (5-(enolpiruvil) shikimato-3-fosfato sintase da Arabidopsis thaliana 5- com sítio de clivagem modificado (C/M)
At-CTP2(E/K)	2	At-CTP2 com sítio de clivagem nativo (E/K)
At-CTP2(E/K) + 10	3	At-CTP2 + 10 aminoácidos da EPSPS sintase da from Arabidopsis madura
At-CTP2(E/K) + 5	4	At-CTP2 + 5 aminoácidos da EPSPS sintase da Arabidopsis madura
Zm-ASA1-CTP	5	Zm-ASA1 CTP (subunidade a1 da antranilato sintase da Zea mays)
Zm-ASA1-CTP + 20	6	Zm-ASA1 CTP + 20 aminoácidos da subunidade a1 da antranilato sintase da Zea mays madura
Zm-ASA2-CTP	7	Zm-ASA2 CTP (subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays)
Zm-ASA2-CTP + 5	8	Zm-ASA2 CTP + 5 aminoácidos da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays madura
Zm-ASA2-CTP +18	9	Zm-ASA2 CTP + 18 aminoácidos da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays madura
Os-Wx-CTP	10	Os-Wx CTP (ADP glicose pirofosforilase da Oryza sativa)
Os-Wx-CTP + 5	11	Os-Wx CTP + 5 aminoácidos da ADP glicose pirofosforilase da Oryza sativa madura
Os-Wx-CTP + 20	12	Os-Wx CTP + 20 aminoácidos da ADP glicose pirofosforilase da Oryza sativa madura

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Nome do CTP	SEQ ID NO:	Breve Descrição do CTP
Rg-AS short-CTP	13	Rg-AS curta-CTP (subunidade a da antranilase sintase da Ruta; Met1 to Ser72)
Rg-AS long-CTP	14	Rg-AS longa-CTP (subunidade a da antranilase sintase da Ruta; Met1 to Ser92)
Zm-DHDPS-CTP	15	Zm-DHDPS CTP (di-hidrodipicolinato sintase da Zea mays)
Zm-DHDPS-CTP + 9	16	Zm-DHDPS CTP + 9 aminoácidos da dihidrodipicolinato sintase da Zea mays madura
Zm-DHDPS-CTP + 20	17	Zm-DHDPS CTP + 20 aminoácidos da dihidrodipicolinato sintase da Zea mays madura
Zm-DHDPS-CTP + 3	18	Zm-DHDPS CTP + 3 aminoácidos da dihidrodipicolinato sintase da Zea mays

EXEMPLO 3

Construção de Vetores de Transformação [00104] Esse exemplo descreve a construção dos vetores de transfecção de protoplasto contendo as fusões de antranilato sintase do milho::proteína fluorescente verde (Zm-AS::GFP) que foram usadas nos ensaios de protoplasto transiente e ensaio de embriões descritos no exemplo 4. Duas estratégias gerais foram empregadas para construir estes vetores.

[00105] A primeira estratégia envolveu amplificação por PCR da sequência de codificação de CTP-AS com a introdução de um sítio de restrição para facilitar a adição da sequência de codificação de GFP. A primeira estratégia está exemplificada pela construção do pMON78824 (figura 3). O plasmídeo pMON78824 foi construído por amplificação por PCR de um fragmento de DNA contendo a sequência de codificação de ZM-ASA2 CTP usando o plasmídeo pMON66574 como um modelo. Sítios de restrição BamHI foram incorporados aos iniciadores AS25 e AS 3' (SEQ ID NOs: 63 e 61, respectivamente) para permitir a inserção do fragmento no quadro com a sequência de codificação da GFP contida no plasmídeo pMON30098. O produto de PCR foi clonado no vetor

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43/82 pCRIl (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), resultando no plasmídeo pMON82553. A integridade da sequência foi confirmada por sequenciamento de DNA usando metodologias bem conhecidas da técnica. [00106] O fragmento de Zm-ASA2 CTP foi excisado do pMON82553 usando BamHI, e inserido no sítio de BamHI do plasmídio pMON30098 para criar pMON78824. O plasmídeo resultante pMON78824 codificou uma proteína de fusão (SEQ ID NO: 60) compreendendo: a) os primeiros 65 aminoácidos codificados pelo gene de Zm-ASA2; b) antranilato sintase monomérica da Agrobacterium tumefaciens; e c) a região de codificação de GFP, todos sob o controle do promotor e35S.

[00107] Vetores de transformação de protoplasto contendo várias fusões de GPF foram construídos de um modo similar usando PCR padrão e métodos de clonagem, bem conhecidos da técnica. IDs de vetor de transfecção (número pMON), descrição geral da proteína de fusão incluída no vetor de transfecção, iniciadores de PCR usados, e modelo de PCR estão resumidos na tabela 2.

Tabela 2. Sumário da estratégia 1 dos vetores de plasmídeo construídos para ensaios de transfecção de protoplastos

Vetor de T ransfecção ID	Descrição Geral da proteína de fusão	Iniciadores de PCR	SEQ ID NO:	Modelo de PCR
pMON30098	Vetor base proporciona sequência de GPF para vetores de transfecção	n/a		n/a
pMON79960	CTP1::GFP	CTP1 5' CTP1 3'	61 62	pMON66559
pMON79961	CTP1::AgroAS(F298W)::GFP	CTP1 5' AS 3'	61 63	pMON66559
pMON78818	No CTP:: AgroAS(F298W)::GFP	AS 5' AS 3'	64 63	pMON79961
pMON78820	Zm-ASA2(inclui CTP)::GFP	AS25 AS23	65 66	pMON64201

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Vetor de T ransfecção ID	Descrição Geral da proteína de fusão	Iniciadores de PCR	SEQ ID NO:	Modelo de PCR
pMON78822	Nenhuma CTP:Zm-ASA2 ma- dura:GFP	AS2MAT AS23	67 66	pMON64201
pMON78824	Zm-ASA2-CTP + 18::AgroAS(wt)::GFP	AS25 AS 3'	65 63	pMON66574
pMON78140	Os-Wx-CTP::GFP	RW-5 RW-3	68 69	pMON66356
pMON78139	Rg-AS curta-CTP::GFP	Ruta-5 Ruta-3	70 71	pMON66575
pMON78143	Rg-AS curta- CTP::AgroAS(F298W):: GFP	Ruta XbaI AgroBsiWI	72 73	pMON66575
pMON78142	Rg-AS longa- CTP::AgroAS(F298W):: GFP	Ruta XbaI AgroBsiWI	72 73	pMON66571
pMON69763	DHDPS +3 - CTP::AgroAS(F298W):: GFP	DHDPS- 67146-5' DHDPS- 67146-3'	74 75	pMON67146
pMON69774	At-CTP2(EK)::antranilato sin- tase da Rhizobium meliloti:: GFP	5'Xba1- CTP2-N1 3'Xba1- CTP2-N1	76 77	pMON78834
pMON69775	At-CTP2 + 10::Rhizobium meli- loti anthranilate synthase::GFP	3'Xba1- CTP2-N2 3'Xba1- CTP2-N3	78 79	pMON78834
pMON69776	Zm-ASA2-CTP::antranilato sintase da Rhizobium meliloti ::GFP	5'-Xba1- ZmAS2-N1 3'-Xba1- ZmAS2-N1	80 81	pMON69754
pMON69777	Zm-ASA2-CTP+18::antranilato sintase da Rhizobium melilo- ti::GFP	5'-Xba1- ZmAS1-N1 3'-Xba1- ZmAS2-N2	82 83	pMON69754

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 51/304

45/82 [00108] A segunda estratégia usada para construção de vetor de transformação de protoplasto envolveu a montagem de sequências correspondentes a vários CTPs, e fusão destas sequências à sequência N-terminal de AgroAS(F298 W) (SED ID NO: 201). As sequências de codificação de CTP foram geradas usando-se conjuntos de iniciadores de sobreposição em uma reação de montagem com base em PCR com base em um método de Withers-Martinez et al. (1999). Um exemplo dessa segunda estratégia é a geração do plasmídeo pMON78832 (figura 4) contendo um vetor de expressão que codifica uma proteína de fusão At-CTP2::AgroAS (F298W)::GFP.

[00109] A primeira etapa dessa segunda estratégia é sintetizar um vetor do tipo ponte (“shuttle vector”) contendo a sequência de codificação de AgroAS(F298W) que foi modificada para fusões em estrutura para vários CTPs para sua terminação N e GFP para sua terminação C. Para essa finalidade, uma reação de amplificação de PCR foi feita usando pMON79961 como o modelo, e os iniciadores de oligonucleotídeos AS5A (SEQ ID NO: 84) e AS 3' (SEQ ID NO: 63), usando métodos bem conhecidos da técnica. O produto de PCR de 2,2 kb resultante, contendo a sequência de codificação de AgroAS(F298W), foi purificado por gel de agarose, ligado ao vetor pCRII, e transformado em células de E. coli competentes usando o kit de clonagem Invitrogen TA (Invitrogen). O plasmídeo intermediário resultante foi denominado WDRAPP01.0005, e foi sequenciado para confirmar a presença do produto de PCT de 2,2 kb. A inserção de 2,2 kb foi então excisada do plasmídeo WDRAPP01.005 usando BamHI e clonado no sítio de BamHII no plasmídeo pBluescriptII SK+ para gerar o plasmídeo pMON82554.

[00110] A segunda etapa dessa segunda estratégia envolveu a síntese da sequência de codificação N-terminal de AgroAS(F298W). Para essa finalidade, os seguintes 14 iniciadores de oligonucleotídeos, lisPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 52/304

46/82 tados na Tabela 13, foram preparados. Tabela 3. Iniciadores de Oligonucleotídeos

Nome do Oligo	SEQ ID NO:
At-CTP2-Agro N1-1	SEQ ID NO: 85
At-CTP2-Agro N1-2	SEQ ID NO: 86
At-CTP2-Agro N1-3	SEQ ID NO: 87
At-CTP2-Agro N1-4	SEQ ID NO: 88
At-CTP2-Agro N1-5	SEQ ID NO: 89
At-CTP2-Agro N1-6	SEQ ID NO: 90
At-CTP2-Agro N1-7	SEQ ID NO: 91
At-CTP2-Agro N1-8	SEQ ID NO: 92
At-CTP2-Agro N1-9	SEQ ID NO: 93
At-CTP2-Agro N1-10	SEQ ID NO: 94
At-CTP2-Agro N1-11	SEQ ID NO: 95
Nome do Oligo	SEQ ID NO:
At-CTP2-Agro N1-12	SEQ ID NO: 96
At-CTP2-Agro N1-13	SEQ ID NO: 97
At-CTP2-Agro N1-14	SEQ ID NO: 98

[00111] Soluções de estoque (100 mmols/L) foram preparadas para cada um dos 14 oligonucleotídeos descritos na tabela 5, por dissolução das quantidades requeridas em água destilada. Uma mistura de oligonucleotídeos (mistura oligo At-CTP2 N1) foi então preparada por combinação de 5 mL de cada solução de oligonucleotídeo individual. A amplificação por PCR foi efetuada usando as seguintes condições:

PCR primária Mistura 1:

microlitro de mistura oligo CTP2 N1 1 microlito da mistura 4 dNTP (Roche, 10 milimolar cada) microlitros de água

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 53/304

47/82

Mistura 2:

microlitros de MgCl₂ 25mM microlitros de tampão de PCR (sem MgCl₂)

0,75 microlitro de mistura de enzima Expand Hi-Fi (Roche) 13,25 microlitros de água [00112] Mistura 1 e Mistura 2 foram combinados em um tubo para PCR de parede delgada e a reação de PCR foi efetuada como a seguir:

1) 94^oC/2 minutos

2) 94^oC/30 segundos

3) 45^oC/30 segundos

4) 72^oC/30 segundos

5) Ir para a etapa 2 quatros vezes mais

6) 72^oC/2 minutos

7) 4^oC/manter PCR secundária Mistura 3:

microlito de reação de PCR primária

1,5 microlitro de N1-1 oligo (10 picomoles/microlitro)

1,5 microlitro de N1-14 oligo (10 picomoles/microlitro) microlitro da mistura de dNTP microlitros de água Mistura 4:

microlitros de MgCl2 25mM microlitros de tampão de PCR (sem MgCl2)

0,75 microlitro de mistura de enzima Expand Hi-Fi (Roche) 13,25 microlitros de água [00113] A mistura 1 e a mistura 2 foram combinadas em um tubo de parede delgada e a reação de PCR foi efetuada como a seguir:

[00114] A mistura 3 e a mistura 4 foram combinadas em um tubo de

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 54/304

48/82

PCR de parede delgada e a reação de PCR foi efetuada como a seguir:

1) 94^oC/2 minutos

2) 94^oC/30 segundos

3) 55^oC/30 segundos

4) 72^oC/30 segundos

5) Ir para a etapa 2 mais 24 vezes

6) 72^Oc/2 minutos

7) 4^oC/manter [00115] O produto de PCR resultante do tamanho correto (~0,3 kb) foi purificado em gel de agarose e ligado ao vetor pCRII (kit de clonagem Invitrogen TA, Invitrogen) conforme descrição acima. Depois de confirmar a sequência, o plasmídeo foi digerido com NcoI e BsiWI, e clonado em pMON82554, substituir um fragmento que foi previamente removido no sítio NcoI e BsiWI. O plasmídeo intermediário resultante foi então digerido com BamH1 para gerar um fragmento que foi então clonado para pMON30098. O vetor de plasmídeo resultante compreendia os elementos genéticos da 3'UTR de promotor e33S::intron hsp79::At-CTP2:AgroAS(F298W)::GFP::nos (pMON78832; figura 4). [00116] Várias variantes de cada CTP foram construídas no modo descrito acima por adição da sequência de DNA da proteína madura correspondente que codifica de 3 a 20 aminoácidos na extremidade 3' do CTP. Para cada vetor pCRII contendo uma variante de CTP, o fragmento entre os sítios de restrição NcoI e BSiWI do vetor pCRII foi subsequentemente removido do vetor e clonado entre os sítios de NcoI e BsiWI do vetor *shuttle de pMON82554 conforme descrito acima. Cada um desses vetores foi subsequentemente digerido com BamHI para gerar um fragmento que foi então clonado no sítio BamHI de pMON30098 conforme descrição acima para proporcionar os elementos genéticos remanescentes do vetor de plasmídeo final. Os vetoPetição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 55/304

49/82 res de plasmídeos finais contendo essas variantes de CTP fusionadas à GFP e os elementos genéticos remanescentes do vetor são listados na tabela 4 juntamente com os iniciadores que foram usados em sua construção.

Tabela 4. Sumário dos vetores da estratégia 2 construídos para ensaios de transfecção de protoplastos

pMON	Variantes de CTP::GFP	Nome do Iniciador	SEQ ID NO:
pMON78832	At-CTP2(C/M)::AgroAS(F298W)::GFP	CTP2- N1-1	85
		CTP2- N1-2	86
		CTP2- N1-3	87
		CTP2- N1-4	88
		CTP2- N1-5	89
		CTP2- N1-6	90
		CTP2- N1-7	91
		CTP2- N1-8	92
		CTP2- N1-9	93
		CTP2- N1-10	94
		CTP2- N1-11	95
		CTP2- N1-12	96
		CTP2- N1-13	97
		CTP2- N1-14	98
pMON78833	At-CTP2(E/K)::AgroAS(F298W)::GFP	CTP2- N1-1	85
		CTP2- N1-2	86
		CTP2- N1-3	87
		CTP2- N1-4	88
		CTP2- N1-5	89
		CTP2- N2-6	99
		CTP2- N1-7	91
		CTP2- N1-8	92
		CTP2- N2-9	100
		CTP2- N1-10	94

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 56/304

50/82

pMON	Variantes de CTP::GFP	Nome do Iniciador	SEQ ID NO:
		CTP2- N1-11	95
		CTP2- N1-12	96
		CTP2- N1-13	97
		CTP2- N1-14	98
pMON78834	At-CTP2 + 10::AgroAS(F298W)::GFP	CTP2- N1-1	85
		CTP2- N1-2	86
		CTP2- N1-3	87
		CTP2- N1-4	88
		CTP2- N1-5	89
		CTP2- N3-6A	101
		CTP2- N3-6B	102
		CTP2- N1-7	91
		CTP2- N1-8	92
		CTP2- N3-9A	103
		CTP2- N3-9B	104
		CTP2- N1-10	94
		CTP2- N1-11	95
		CTP2- N1-12	96
		CTP2- N1-13	97
		CTP2- N1-14	98
pMON78835	At-CTP2 + 5::AgroAS(F298W)::GFP	CTP2- N1-1	85
		CTP2- N1-2	86
		CTP2- N1-3	87
		CTP2- N1-4	88
		CTP2- N1-5	89
		CTP2- N4-6	105
		CTP2- N1-7	91
		CTP2- N1-8	92
		CTP2- N4-9	106

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 57/304

51/82

pMON	Variantes de CTP::GFP	Nome do Iniciador	SEQ ID NO:
		CTP2- N1-10	94
		CTP2- N1-11	95
		CTP2- N1-12	96
		CTP2- N1-13	97
		CTP2- N1-14	98
pMON78138	Zm-ASA1-CTP::AgroAS(F298W)::GFP	ASA1-1-1T	107
		ASA1-1-2T	108
		ASA1-1-3T	109
		CTP2- N1-7	91
		ASA1-1-5B	110
		ASA1-1-4B	111
		ASA1-1-3B	112
		ASA1-1-2B	113
		CTP2- N1-8	92
pMON78141	Zm-ASAI-CTP +20::AgroAS(F298W)::GFP	ASA1-1-1T	107
		ASA1-1-2T	108
		ASA1-20-3T	114
		ASA1-20-4T	115
		CTP2- N1-7	91
		ASA1-1-5B	110
		ASA1-1-4B	111
		ASA1-1-3B	112
		ASA1-20-3B	116
		ASA1-20-2B	117
		CTP2- N1-8	92
pMON69760	Zm-ASA2-CTP::AgroAS(F298W)::GFP	AS2-5'-1	118

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 58/304

52/82

pMON	Variantes de CTP::GFP	Nome do Iniciador	SEQ ID NO:
		AS2-5'-41	119
		AS2-5'-81	120
		AS2-5'-121	121
		AS2-5'-161	122
		AS2-3'-208	123
		AS2-3'-168	124
		AS2-3'-128	125
		AS2-3'-88	126
		AS2-3'-48	127
pMON69761	Zm-ASA2-CTP + 5aa::AgroAS(F298W)::GFP	AS2-5'-161-5aa	128
		AS2-3'-183-5aa	129
		AS2-3'-153-5aa	130
pMON69762	Zm-ASA2-CTP + 10aa::AgroAS(F298W)::GFP	AS2-5'-161-10aa	131
		AS2-5'-196-10aa	132
		AS2-3'-198-10aa	133
		AS2-3'-163-10aa	134
pMON69771	Zm-ASA2-CTP::GFP	AS2GFP-5'	135
		AS2GFP-3'	136
pMON78135	Os-Wx-CTP::AgroAS(F298W)::GFP	RW-CM-1T	137
		RW-CM-2T	138
		RW-CM-3T	139
		RW-CM-4T	140
		RW-CM-5T	141
		RW-CM-6T	142
		RW-CM-7T	143
		RW-CM-8B	144

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 59/304

53/82

pMON	Variantes de CTP::GFP	Nome do Iniciador	SEQ ID NO:
		RW-CM-7B	145
		RW-CM-6B	146
		RW-CM-5B	147
		RW-CM-4B	148
		RW-CM-3B	149
		RW-CM-2B	150
		RW-CM-1B	151
pMON78136	Os-Wx-CTP + 5::AgroAS(F298W)::GFP	RW-CM-1T	137
		RW-CM-2T	138
		RW-CM-3T	139
		RW-CM-4T	140
		RW-CM-5T	141
		RW-CM-6T	142
		RW-5-7T	152
		RW-5-8T	153
		RW-CM-8B	144
		RW-CM-7B	145
		RW-CM-6B	146
		RW-CM-5B	147
		RW-CM-4B	148
		RW-CM-3B	149
		RW-5-2B	154
		RW-5-1B	155
pMON78137	Os-Wx-CTP + 20::AgroAS(F298W)::GFP	RW-CM-1T	137
		RW-CM-2T	138
		RW-CM-3T	139
		RW-CM-4T	140
		RW-CM-5T	141
		RW-CM-6T	142

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 60/304

54/82

pMON	Variantes de CTP::GFP	Nome do Iniciador	SEQ ID NO:
		RW-20-7T	156
		RW-20-8T	157
		RW-20-9T	158
		RW-CM-8B	144
		RW-CM-7B	145
		RW-CM-6B	146
		RW-CM-5B	147
		RW-CM-4B	148
		RW-CM-3B	149
		RW-5-2B	154
		RW-20-2B	159
		RW-20-1B	160
pMON69758	Zm-DHDPS- CTP::AgroAS(F298W)::GFP	DHDPS-5'-1	161
		DHDPS-5'-41	162
		DHDPS-5'-81	163
		DHDPS-5'-121	164
		DHDPS-5'-161	165
		DHDPS-3'- AgroAS	166
		DHDPS-3'-184	167
		DHDPS-3'-140	168
		DHDPS-3'-99	169
		DHDPS-3'-59	170
pMON69759	Zm-DHDPS-CTP + 9aa::AgroAS(F298W)::GFP	DHDPS-5'-161- 9aa	171
		DHDPS-5'-201- 9aa	172
		DHDPS-3'-216- 9aa	173

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 61/304

55/82

pMON	Variantes de CTP::GFP	Nome do Iniciador	SEQ ID NO:
		DHDPS-3'-176- 9aa	174
pMON69765	Zm-DHDPS-CTP + 20aa::AgroAS(F298W)::GFP	DHDPS-5'-201- 20aa	175
		DHDPS-5'-241- 20aa	176
		DHDPS-3'-249- 20aa	177
		DHDPS-3'-209- 20aa	178
		DHDPS-3'-169- 20aa	179
pMON69764	Zm-DHDPS-CTP + 5aa::AgroAS(F298W)::GFP	DHDPS-5'-161- 5aa	180
		DHDPS-5'-201- 5aa	181
		DHDPS-3'-244- 5aa	182
		DHDPS-3'-204- 5aa	183
		DHDPS-3'-164- 5aa	184
pMON69772	Zm-DHDPS-CTP::GFP	DHDPSGFP-5'	185
		DHDPSGFP-3'	186
pMON69766	Zm-DHDPS-CTP + 5::GFP	DHDPS-N1	187
		DHDPS-N2	188
		DHDPS-N3	189
		DHDPS-N4	190
		DHDPS-N9	191
		DHDPS-N10	192

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pMON	Variantes de CTP::GFP	Nome do Iniciador	SEQ ID NO:
		DHDPS-N11	193
		DHDPS-N12	194
		DHDPS-N13	195
		DHDPS-N14	196
		DHDPS-N15	197
		DHDPS-N18	198
EXEMPLO 4

Localização de AgroAS e Variantes para Plastídios [00117] Este exemplo descreve dois sistemas de ensaio de expressão transiente usados para predizer as habilidades de diferentes peptídeos de trânsito para o cloroplasto (CTPs) em plastídios para direcionar proteínas de fusão AS::GFP. Esses ensaios utilizam os vetores de transfecção de protoplastos contendo as fusões de antranilato sintaseproteína fluorescente verde (AS::GFP) e as fusões que foram descritas no exemplo 3.

[00118] Dois métodos de ensaio de expressão transiente foram desenvolvidos para prognosticar a localização das proteínas de fusão AS::GFP em células de milho. Um sistema de protoplasto de milho de rendimento médio foi usar para selecionar muitos CTPs diferentes com respeito a sua capacidade de direcionarem as proteínas de fusão AS::GFP aos plastídios de células de folha de milho etiolado. Um sistema de rendimento inferior para expressar proteínas no desenvolvimento de embriões de milho foi usado para confirmar o padrão de localização de plastídio visto no sistema de protoplasto. Dados desses dois ensaios foram então usados para prognosticar as habilidades de vários CTPs para direcionar a localização das proteínas AS de Agrobacterium e da Sinorhizobium em embriões de milho transgênico. [00119] Todas as construções testadas nos sistemas de ensaio transiente foram construídas com os mesmos elementos genéticos em

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57/82 uma cadeia principal de vetor comum que expressaram cada gene usando o promotor e35S, intron hps70(DnaK) e nos 3'UTR.

[00120] Para assegurar que os sistemas transientes estavam funcionando corretamente, plasmídeos de controle foram construídos. Os controles para localização citosólica foram os vetores contendo a fusão de GFP sem CTP (pMON30098; Tabelas 2 e 5), fusão de AgroAS à GFP (sem CTP adicionado) (pMON78818; Tabelas 2 e 5), e fusão de Zm-ASA-2-CTP::GFP truncada carecendo da Zm-ASA2-CTP (pMON78822; Tabelas 2 e 5). Os controles usados para localização de plastídio foram ASA2 fusionados à GFP (pMON78820; Tabelas 2 e 5) e At-CTP2 funcionada à GFP (pMON53173; Tabela 5). Dois controles adicionais foram usados para confirmar os dados das plantas transgênicas; CTP1::GFP (pMON79960; Tabelas 2 e 5) e CTP1::AgroAS(F298W)::GFP (pMON79961; Tabelas 2 e 5). Padrões de localização de GFP ou proteínas de fusão de GFP de cada um destes vetores são reportados na Tabela 5. Os dados também confirmaram os resultados do fracionamento das células conforme descrição no Exemplo 1, indicando a localização citosólica da proteína de fusão de CTP1::AgroASm (F298W)::GFP e a incapacidade de CTP1 de direcionar a AgroAS(F298W) ao plastídio.

[00121] Na maioria dos experimentos, um controle adicional foi construído para cada CTP testado. Esses controles consistiam no CTP testado fusionado diretamente à GFP. Por exemplo, Zm-ASA2-CTP fusionada à GFP (pMONO69771) para testar as fusões de ZmASA2::AgroAS::GFP. Os métodos para a construção de todos os vetores testados estão detalhados no Exemplo 3.

[00122] Muitas variações foram preparadas para cada um dos CTPs testados. Essas variações foram distinguidas por variação do número de aminoácidos N-terminal adicionados ao CTP da proteína hospedeira nativa (tabela 1). Por exemplo, na série Zm-ASA2-CTP, o

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58/82

CTP determinado experimentalmente fusionado diretamente à GFP foi usado, bem como duas versões adicionais que incluíram 5 e 18 aminoácidos da terminação N da Zm-ASA2, isolado da região da terminação amino da subunidade a2 da antranilato sintase da Zea mays madura adjacente ao CTP. As construções são designadas como ZmASA2-CTP + 5 (SEQ ID NO: 8) e Zm-ASA2-CTP + 18 (SEQ ID NO: 9) na tabela 1.

[00123] Como um teste primário, as construções de CTP descritas na tabela I foram avaliadas em um sistema de protoplasto etiolado. Protoplastos mesofílicos de folha foram preparados de mudas de milho etiolado usando métodos bem conhecidos da técnica (vide, por exemplo, Sheen, 1993).

[00124] Os diferentes vetores foram eletroporados nos protoplastos usando métodos bem conhecidos da técnica. Aproximadamente 18 a 24 horas depois, as células de protoplastos foram contadas quanto à fluorescência da GFP usando microscopia confocal. Em resumo, a microscopia foi realizada usando um Microscópio de Varredura a Laser Zeiss LSM10 META (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thorwood, NY) equipado com um Laser de Íon Argônio, lasers verdes e vermelhos de Hélio-Neon, e um laser bombeado por diodo Chameleon (Coherent Laser Division, Santa Clara, CA). Aquisição de imagens e análise foram realizadas usando Examinador de Imagem LSM 5, versão 3.2.0.70 (Carl Zeis MicroImaging, Inc., Thornwood, NY). O processamento de imagem foi realizado usando Adobe Photoshop CS, versão 8.0 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA). Pelo menos 50 células, para cada construção, foram classificadas com respeito a conter fluorescência: a) somente nos plastídios, b) somente no citosol e c) tanto no plastídio como no citosol.

[00125] Como um teste secundário, um sistema de ensaio transiente específico foi desenvolvido para avaliar as construções desenhadas

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59/82 para serem expressas no tecido de germe de milho em desenvolvimento. As construções avaliadas por esse teste foram escolhidas com base em ter uma classificação no sistema de protoplasto de 50% ou mais de células transformadas contendo somente a localização do plastídio. As construções de controle, adicionais, conforme detalhadas acima, foram também testadas.

[00126] Embriões foram isolados de espigas do milho esterilizadas na superfície, por exemplo, HiII ou um parente endógamo, em aproximadamente 14 dias depois da polinização (DAP). Cerca de 20-30 embriões foram colocados em placas de Petri contendo o meio N6 suplementado com sorbitol 0,1M + manitol 0,2M (Chu, 1978). Depois de quatro horas de incubação à temperatura ambiente, os embriões foram bombardeados com partículas de ouro de 0,6 mm revestidas com DNA usando o Sistema de Distribuição de Partículas Biolistic® PDS-1000/He (Bio-Rad Corporation). As placas foram bombardeadas duas vezes a 9 cm da tela de parada para a prateleira alvo, com uma pressão de ruptura de 7.584 kPa (1.100 psi) e um intervalo de distância de 1 cm. Seguinte ao bombardeio, os embriões foram incubados a 28^oC, no escuro, durante a noite antes de serem analisados por microscopia confocal de multifóton, conforme descrição acima. Pelo menos 50 células foram contadas e classificadas conforme descrito acima para o sistema de protoplastos.

[00127] Os resultados dos ensaios de localização estão mostrados na Tabela 5. Os resultados indicam que com base na visualização, os seguintes seis CTPs direcionaram eficazmente a AgroAs aos plastídios das células de germe de milho: Zm-ASA2-CTP + 18 (SEQ ID NO: 9; o componente CTP do pMON78824), Rg-AS longo-CTP (SEQ ID NO: 14; o componente do CTP do pMON78142), Rg-AS curto-CTP (SEQ ID NO: 13; o componente CTP do pMON78143 e pMON78139), At-CTP2 (E/K) (SEQ ID NO: 2; o componente CTP do pMON78833),

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At-CTP2 (E/K) + 10 (SEQ ID NO: 3; o componente CTP do pMON78834), e Zm-DHDPS-CTP + 20 (SEQ ID NO: 17; componente CTP do pMON69765). Os resultados indicam também que nenhum de todos os vários CTPs ensaiados deu positivo quanto à capacidade de localizar AS::GFP tanto no protoplasto como nos ensaios de expressão transiente do embrião. Esses resultados corroboram os resultados descritos no Exemplo 1, e indicam a necessidade de identificar CTPs úteis para localização bem sucedida das proteínas AS monoméricas nos cloroplastos de plantas monocotiledôneas e, portanto, produzindo elevados níveis de triptofano.

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pMON ID	Variantes de CTP::AgroAS::GFP	% de Localização de Plastídio no Proto- plasto	% de Localização de Plastídio no Embrião
78832	At-CTP2(C/M): :AgroAS(F298W): :GFP	68,6	Não testado
78833	At-CTP2(E/K)::AgroAS(F298W): :GFP	64	79
78834	At-CTP2 + 10::AgroAS(F298W)::GFP	72	35
78835	At-CTP2 + 5::AgroAS(F298W)::GFP	60,6	Não testado
53173	Controle: At-CTP2::GFP	>80	80
78138	Zm-ASA1-CTP::AgroAS(F298W)::GFP	0	Não testado
78141	Zm-ASA1-CTP + 20::AgroAS(F298W)::GFP	0	Não testado
69760	Zm-ASA2-CTP::AgroAS(F298W)::GFP	0	Não testado
69761	Zm-ASA2-CTP + 5::AgroAS(F298W)::GFP	0	Não testado
78824	Zm-ASA2-CTP + 18:: AgroAS(wt)::GFP	100	81
69771	Controle: Zm-ASA2-CTP::GFP	15	Não testado
78135	Os-Wx-CTP::AgroAS(F298W)::GFP	0	Não testado
78136	Os-Wx CTP + 5::AgroAS(F298W)::GFP	0	Não testado
78137	Os-Wx-CTP + 20::AgroAS(F298W)::GFP	72	Não testado
78140	Controle: Os-Wx-CTP::GFP	77	Não testado
78143	Rg-AS curto-CTP::AgroAS(F298W)::GFP	87,3	54

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pMON ID	Variantes de CTP::AgroAS::GFP	% de Localização de Plastídio no Proto- plasto	% de Localização de Plastídio no Embrião
78142	Rg-AS longo-CTP::AgroAS(F298W)::GFP	88,6	55
78139	Controle: Rg-AS curto-CTP::GFP	77,3	67
69758	Zm-DHDPS-CTP::AgroAS(F298W)::GFP	0	Não testado
69759	Zm-DHDPS-CTP + 9::AgroAS(F298W)::GFP	3	Não testado
69765	Zm-DHDPS-CTP + 20::AgroAS(F298W)::GFP	71	91% no plastídio e no citosol; 9% somente no citosol
69763	Zm-DHDPS-CTP + 3::AgroAS(F298W)::GFP	0	33
69772	Controle: Zm-DHDPS-CTP::GFP	0	10
69766	Controle: Zm-DHDPS-CTP + 5::GFP	30	Não testado

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Continuação

pMON ID	Variantes de CTP::AgroAS::GFP	% de Localização de Plastídio no Protoplasto	% de Localização de Plastídio no Embrião
69774	At-CTP2(E/K):: antranilato sintase da Rhizobium meliloti::GFP	64	Não testado
69775	At-CTP2 + 10:: antranilato sintase da Rhizobium meliloti::GFP	72,7	Não testado
69776	Zm-ASA2-CTP:: antranilato sintase da Rhizobium meliloti::GFP	0	Não testado
69777	Zm-ASA2-CTP + 18:: antranilato sintase da Rhizobium melilo- ti::GFP	70.7	Não testado
78818	Controle: No CTP::AgroAS(F298W)::GFP	0	0
78820	Controle: Zm-ASA2(inclui CTP)::GFP	70.3	85
78822	Controle: No CTP::Zm-ASA2 madura::GFP	*	Não testado
79961	Controle: CTP1::AgroAS(F298W)::GFP	*	0
30098	Controle: GFP	*	0
79960	Controle: CTP1::GFP	**	44

* Para esses controles, nenhuma localização de plastídio foi observada no ensaio transiente de protoplasto; os dados não foram quantificados.

** Para esse controle, a localização de plastídio e citosólica foi observada, mas não quantificada.

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EXEMPLO 5

Vetores de Transformação e Transformação de Milho [00128] Este exemplo descreve a construção dos vetores de transformação contendo sequências de ácidos nucleicos que codificam o tipo selvagem (wt) e alelos mutantes da antranilato sintase (AS) de ambas as Agrobacterium tumefaciens e Rhizobium meliloti em combinação com várias proteínas de transporte de cloroplasto. Esse exemplo também proporciona um protocolo para a transformação de milho com os vetores de transformação descritos aqui.

[00129] Para a construção dos vetores de transformação contendo AS da Agrobacterium tumefaciens do tipo selvagem, a sequência de codificação de AS foi cortada do plasmídeo pMON66580 por digestão com XhoI, blunting as extremidades usando feijão-mungo nuclease, e então cortando com Bg1II para isolar um primeiro segmento. Para isolar um segundo fragmento contendo o promotor de oleosina do milho, intron hsp70, e Tr7-3'-UTR, o plasmídeo pMON69753 foi cortado com Bg1II e SmaI. Esses dois fragmentos foram ligados para gerar pMON69754. Para construir o vetor de transformação final que contém a Zm-ASA2-CTP, pMON69754 foi digerido com XhoI, e o fragmento purificado contendo o promotor de oleosina do milho, intron hsp70, Zm-ASA2-CTP fusionado a -wt, e Tr7-3'UTR foi isolado. Esse fragmento foi então ligado no vetor pMON78808, que havia sido também digerido com XhoI para geral o vetor de transformação final pMON69755 (Figura 6).

[00130] Para a construção de vetores de transformação contendo o alelo mutante, pMON66868 foi digerido com StuI e RsrII para isolar um fragmento contendo parte da região de codificação da AgroAS(F298W). Similarmente, pMON697654 foi também digerido com StuI e RsrII para isolar um fragmento que contém o promotor de oleosina de milho, intron hsp70, parte da região de codificação e Tr7

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3'-UTR. Os fragmentos resultantes foram ligados para gerar pMON69756. Para construir o vetor de transformação final, pMON68756, foi digerido com XhoI, e purificado o fragmento contendo o promotor de oleosina do milho, intron hsp70, Zm-ASA2-CTP fusionada à AgroAS(F298W), e Tr7-3'UTR. Esse fragmento foi então ligado ao sítio de XhoI do pMON78808, para gerar pMON69757; SEQ ID NO: 215).

[00131] Vetores de transformação contendo a região de codificação (SEQ ID NO:203 da AgroAS(S51F) foram construídos de forma similar. Por exemplo, o plasmídeo pMON69754, descrito acima, foi digerido com BamHI e NcoI para remover a região de codificação da AgroAS. O plasmídeo pMON58121 foi também digerido com BamHi e NcoI para isolar o alelo mutante da AgroAS(S51F). Os fragmentos resultantes foram então ligados para gerar o plasmídeo intermediário pMON69767. O vetor de transformação final, pMON69768, foi construído conforme descrito acima por digestão do pMON69767 com XhoI, e ligação dos fragmentos no sítio de XhoI do pMON78808.

[00132] Um exemplo da construção dos vetores de transformação contendo o alelo de AgroAS(S51C) é pMON68065. pMON68063 foi digerido com a enzima de restrição XhoI, separado em gel da agarose a 1,0%, e o fragmento de DNA de 4.569 bp que corresponde ao promotor de oleosina da Zea mays fusionado ao íntron (Zm.DNAK), o alelo de AgroAS(S51C) e a Os-gt1-3'UTR foram isolados do gel.

[00133] O DNA do pMON78808 foi também cortado com enzima de restrição XhoI, desforilado usando enzima de fosfatase alcalina (New England BioLabs Inc.), e o DNA foi purificado usando o kit de purificação de PCR QIAGEN (QIAGEN Inc.). O DNA digerido com XhoI do pMON7808 e o fragmento de DNA digerido com XhoI de 4.569 bp do pMON68063 foram ligados juntos para gerar pMON68065.

[00134] Um exemplo da construção dos vetores de transformação

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 72/304 contendo o alelo (AgroAS(S51C)-nno) otimizado com códon de AgroAS(S51C) é pMON68066. A otimização do códon do alelo mutante de AgroAS(S51C) foi efetuada conforme descrição no Pedido de Patente US 11/503.532, que é aqui incorporado a título de referência). DNA de Agros(S51C)-nno otimizado com códon foi sintetizado pelo grupo BLUE HERON BIOTECHNOLOGY (Bothell, WA, E.U.A.). O DNA sintético foi então digerido com enzimas de restrição de NcoI e BamHI, separado em um gel de agarose a 1,0%, e o fragmento de DNA de 2.193 bp correspondente ao AgroAS(S51C)-nno foi cortado do gel e purificado conforme descrito acima. O DNA do pMON68063 foi também cortado com enzimas de restrição NcoI e BamHI e separado em um gel de agarose a 1,0%. O fragmento de DNA digerido com NcoI/BamHI de 5.244 bp contém todos os elementos genéticos descritos em pMON68063 exceto que o alelo mutante de AgroAS(S51C). As reações de ligação foram efetuadas misturando-se o DNA do DNA (fragmento de 2.193 bp) de AgroAS(S51C) nno digerido com NcoI/BamHI e pMON68603 (fragmento de DNA de 5.244 bp), para gerar pMON68064. pMON68064 foi então cortado com a enzima de restrição XhoI, separado sobre gel de agarose a 1,0%, e o fragmento de DNA de 4,532 bp que contém o promotor de oleosina da Zea mays fusionado ao itron hsp70 (Zm.DNAK), o AgroAS(S51C)-nno e Os-gt13'UTR foi purificado conforme descrição acima. O DNA do pMON7808 foi também cortado com a enzima de restrição XhoI, desforilado usando a enzima fosfatase alcalina (New England BioLabs, Inc., Beverly, MA), e purificado usando kit de purificação de PCR QIAGEN (QIAGEN Inc., Valencia, CA). A reações de ligação foram realizadas misturandose o DNA de pMON78808 cortado com XhoI desfosforilado e o fragmento de DNA de 4.532 bp do pMON68064, para gerar o pMON68066.

[00135] O plasmídeo pMON69769 foi usado como um vetor de base

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 73/304 para gerar vários outros vetores de transformação incluindo pMON82561 (Figura 7), pMON78152 (Figura 8), pMON78153 (Figura 9), pMON82560 (Figura 10), pMON69779 (Figura 11), pMON78846, pMON78850, pMON78851, pMON68065, pMON69781, pMON94548, pMON94549, pMON97701, pMON97703 e pMON97705 usando estratégias de clonagem similares.

Transformação de Milho [00136] Os vetores de transformação descritos acima foram transformados em milho essencialmente como descrito na Publicação de Pedido de Patente US 20050005327, que é aqui incorporado a título de referência na íntegra. Em resumo, espigas contendo embriões imaturos são colhidas aproximadamente 10 dias depois da polinização e mantidas refrigeradas a 4^oC (até 5 dias pós-colheita). O tamanho preferido do embrião para esse método de transformação é de ~1,5-2,0 mm. Esse tamanho é usualmente atingido 10 dias depois da polinização dentro da estufa com as condições de crescimento de uma temperatura média de 30,55^oC (87^oF), duração do dia de 14 horas com iluminação fornecida por Lâmpadas de Sódio de Alta Pressão de 1000W da GE.

[00137] Embriões imaturos são isolados das espigas esterilizadas na superfície e diretamente colocados na suspensão preparada de células de Agrobacterium em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. O isolamento dura continuamente por aproximadamente 5 a 60 minutos. Alternativamente, os embriões são excisados diretamente no meio de inoculação (sem Agrobacterium ou acetossiringona) por 5 a 60 minutos e subsequentemente inoculados por 5 a 30 minutos com suspensão de células de Agrobacterium. Depois da suspensão de células de Agrobacterium ser removida usando uma pipeta de transferência estéril com ponta fina, os embriões imaturos são transferidos para um meio de cocultura de crn398 (Tabela 6). Os embriões são então localizados

Petição 870170023305, de 07/04/2017, pág. 74/304 no meio com o escutelo virado para cima. Os embriões são cultivados em uma incubadora escura (23^oC) por aproximadamente 14-48^oC. [00138] Os embriões são então transferidos para um meio de indução de calo (crn336, Tabela 6), que contém glifosato 0,1mM e 500 mg/L de carbenicilina para inibir Agrobacterium em placas de Petri (100 mm x 25 mm). As culturas são incubadas em uma sala de cultura escura/incubadora a 30^oC por 2 semanas seguido por uma semana adicional em uma sala de cultura escura/incubadora a 27^oC. Todos os pedaços de calo são então transferidos individualmente sobre o primeiro meio de regeneração (crn335, Tabela 6), que contém glifosato 0,1mM e 250 mg/L de carbenicilina. As culturas são crescidas nesse meio em uma sala de cultura a 27^oC com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuro por cerca de 7 a 10 dias. Eles são então transferidos para o segundo meio de regeneração (crn333, Tabela 6) em placas de Petri (100 mm x 25 mm) a 27^oC com 16 horas de luz por aproximadamente 2 a 3 semanas. Todos os pedaços de calo com brotos regenerados e tecido vivo são então transferidos para placas com crn333 fresco ou crn334 PHYTATRAYs (Tabela 6) ou diretamente transferidos para taças de sundae contendo o meio enraizador (crn366, Tabela 6) para crescer mais antes de serem transferidos para o solo (aproximadamente de 1 a 3 semanas). Os meios de regeneração (crn335, crn333 e crn334) contêm, todos, 250 mg~L de carbenicilina e glifosato 0,1mM.

[00139] As mudas são transferidas para o solo, aclimatizadas (hardened off) em uma câmara de crescimento a 27^oC, 80% de umidade, e baixa de intensidade de luz, por aproximadamente 1 a 2 semanas, e então transferidas para uma estufa e crescidas sob condições de estufa padrão. Os caroços resultantes são colhidos e analisados conforme descrição abaixo.

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Tabela 6. Composição de meios usados na transformação do milho (por litro)

Componente	Meios de Co- cultura (crn398)	Meios de In- du- ção de Calo (crn336)	Meios para Primeira Regeneração (crn335)	Meios para Segunda Regeneração (crn333 (pla- cas)/ crn334(PHYTATRAYs))	Meios de Enraizamen- to (crn366)
Sais MS	2,17 g	4,33 g	4,33 g	4,33 g	2,17 g
Sacarose	20 g	30 g	30 g		20 g
Maltose				20 g
Glicose	10 g			10 g
l-Prolina	115 mg	1,38 g	1,38 g
Casaminoácidos		0,5 g	0,05 g
IBA (1 mg/mL de estoque)					0,75 mL
l-Asparagina				0,15 g
Mio-inositol				0,1 g
NAA (1 mg/mL de estoque)					0,5 mL
Tiamina-HCl (0,5mg/mL de estoque)	1,0 mL	1,0 mL
2,4-D (1 mg/mL de estoque)	3,0 mL	0,5 mL

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Componente	Meios de Co- cultura (crn398)	Meios de In- du- ção de Calo (crn336)	Meios para Primeira Regeneração (crn335)	Meios para Segunda Regeneração (crn333 (pla- cas)/ crn334(PHYTATRAYs))	Meios de Enraizamen- to (crn366)
Nitrato de Prata (2 mg/mL de estoque)	1,7 mL	1,7 mL
Vitaminas MS 100X	10 mL	10 mL			5,0 mL
MS Fromm 1000X			1,0 mL	1,0 mL
Carbenicilina (250 mg/mL)		2,0 mL	1,0 mL	1,0 mL
Glifosato (0,5M de estoque)		0,2 mL	0,2 mL	0,2 mL	0,2 mL
Componente	Meios de Cocul- tura (crn398)	Meios de Indução de Calo (crn336)	Meios para Primeira Regeneração (crn335)	Meios para Segunda Regeneração (crn333 (pla- cas)/ crn334(PHYTATRAYs))	Meios de Enraizamento (crn366)
Fitagel		3,0 g	3,0 g	3,0 g	3,0 g
BAP (0,5 mg/mL stock)		0,02 mL	7,0 mL
Acetossiringona (1,0M)	0,2 mL
Agarose, Low EEO	5,5 g

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EXEMPLO 6

Métodos para a imunolocalização da AS e Quantificação do Triptofano em Caroços de Milho [00140] Este exemplo descreve os procedimentos analíticos usados nos estudos de imunolocalização e quantificação dos níveis de triptofano livre em caroços de eventos de milho transformados com as construções de CTP descritas no exemplo 5.

[00141] Os caroços das plantas transgênicas no estádio F1 contendo diferentes construções foram colhidas separadas em 26 DAP. Essas construções incluíram pMON69755 (figura 6), pMON69779 (figura 11), pMON82650 (figura 10), pMON82561 (figura 7), pMON78153 (Figura 9) e pMON79152 (figura 8). De oito a dez embriões foram isolados de cada linhagem transgênica dessas construções, fixados em solução de 3,7% de formaldeído, e armazenados a 4^oC, antes de serem analisados para a localização das proteínas expressas pelo estudo de imunomarcação descrito abaixo.

[00142] DNA genômico foi também extraído do endosperma destes caroços transgênicos usando kit de planta DNeasy^® (Cat. N^o 69104, Qiagen, Waltham, MA). Amplificações com PCR foram realizadas para identificar caroços positivos e negativos usando os iniciadores de oligonucleotídeos AS2-5' e AS-31 designados SEQ ID NO: 226 e SEQ ID NO: 227 respectivamente na Listagem de Sequência.

[00143] Os embriões de milho descritos acima foram incubados em 500 mL de Triton X-100 a 0,05% por 30 minutos. Seções de tecido de escutelo foram fatiadas em seções de 20 mm de espessura usando um micrótomo de lâmina vibratória Leica VT 1000S (Leica Microsystems GmbH, Nussloch, Alemanha) equipado com uma faca de safira, e então lavadas 3 vezes em tampão de PBS (NaCl 137mM, KCl 3mM, Na₂PO₄ 8mM, e KH₂PO₄ 1,5mM) contendo glicina 10mM, por 10 minutos por lavagem.

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72/82 [00144] As seções de tecido foram então incubadas em mistura enzimática (4% de pectinase, 2% de celulose) por 40 minutos a 28^oC. Os tecidos foram então bloqueados com soro não diluído por 15 minutos, usando soro de cabra (Sigma Cat. N^o G-9023; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) para detecção de AgroAS e soro de coelho (Sigma R-9133) para AS de milho. As secções de tecido foram então incubadas durante a noite a 4^oC, com agitação suave, ou em AgroAS antihis de coelho a 1 % ou AS anti-coelho de cabra em tampão PBS. [00145] Depois da incubação durante a noite, os tecidos foram lavados em tampão de PBS contendo glicina 10mM por 20 minutos e incubados de novo no respectivos soros não diluídos por 15 minutos à temperatura ambiente. Os tecidos foram então incubados no escuro com anticorpo secundário conjugado com Alexa, por 2 horas, à temperatura ambiente. Os fatores de diluição foram de 1:1000 de proteína anti-cabra de coelho AlexaFluor® 532 (Molecular Probes, Inc.) para a proteína ZmAS. Seguinte à incubação, os tecidos foram lavados 3 vezes em PBS contendo glicina 10mM por 10 minutos por lavagem. Os tecidos foram então contracoloridos com branco de calcofluor para as paredes celulares (Sigma) solução (2,5 mg/mL em estoque, diluídos com 1:50 com água destilada) e corante de Hoechst para os núcleos (Molecular Probes) por 15 minutos no escuro com agitação. Os tecidos coloridos foram então lavados por 10 minutos em água destilada antes da montagem.

[00146] Os resultados indicam que quando as amostras foram sondadas tanto com AgroAS (fluorescência vermelha em 543 nm) e anticorpo de ZmAS de controle (fluorescência verde em 488 nm) com os canais fundidos, o aparecimento da cor amarela sugeriu colocalização das proteínas em plastídios (dados não mostrados).

[00147] Para extrair a fração de aminoácido, 30 mg de caroços moídos foram colocados em um frasco de centrífuga. Um mililitro de ácido

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73/82 tricloroacético a 5% foi adicionado a cada amostra. As amostras foram misturadas por turbilhonamento, e colocadas a 4^oC, durante a noite. As amostras foram então misturadas e giradas em uma microcentrífuga por 15 minutos a 14.000 rpm. Um pouco do sobrenadante foi então removido, colocado em um frasco de HPLC e vedado. As amostras foram mantidas a 4^oC antes da análise.

[00148] A análise de aminoácidos foi realizada conforme descrita na Agilent Technical Publication, Amino Acid Ananlysis Using EclipseAAA Columns and the Agilent 1100 HPLC, 17 de março de 2000. A análise pré-derivatiza os aminoácidos com o-ftaldialdeído (OPA) então separa os conjugados de OPA por cromatografia de fase reversa. A separação foi efetuada usando um sistema de HPLC série Agilent 1100 (Agilent, Palo Alto, CA) com uma coluna Eclipse XDB-C18 4 mm,

4,6 x 150 mm, e uma vazão de 1,2 mL/minuto. As concentrações de aminoácidos foram medidas usando fluorescência: excitação em 340 nm, emissão em 450 nm. Eluição foi com um gradiente de Tampões A e B para HPCL de acordo com a Tabela 7, onde o Tampão A de HPLC era Na₂HPO₄ 40mM pH 7,8, e o Tampão B era Metanol:Acetonitrila:Água a 9:9:2.

Tabela 7: Eluição do Aminoácido

Tempo	0	20	21	26	27
% Tampão A	95	35	0	0	0
% Tampão B	5	65	100	100	100

[00149] Padrões de aminoácidos foram preparados ou comprados em concentrações variando de 0 a 100 mg/mL. A análise de prolina requereu uma etapa de derivatização adicional usando cloroformato de 9-fluorenilmetila (FMOC). Os resultados, conforme mostrados na Tabela 8, estão reportados em ppm.

EXEMPLO 7

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Análise dos Níveis de Triptofano Livre em Milho [00150] Este exemplo apresenta a análise dos níveis de triptofano livre em plantas de milho transformadas com os vetores de expressão descritos no exemplo 5.

[00151] Os caroços F1 foram analisados para triptofano livre conforme descrição no exemplo 6. Os resultados de algumas das plantas transformadas, mostradas na tabela 8 abaixo, indicam que os CTPs que demonstraram habilidade para direcionar com sucesso a GFP nos ensaios de expressão transiente (dados mostrados na tabela 5) tinham valores mais alto de triptofano livre nas plantas transformadas. Adicionalmente, os CTPs que não demonstraram a capacidade para localizar a GFP no plastídio tinham níveis menores de triptofano livre. Esses resultados indicam que nem todos os CTPs podem direcionar a localização de AS monomérica para o plastídio e logo aumentar os níveis de triptofano livre.

Tabela 8. Níveis médios de triptofano livre em plantas de milho transgênicas homozigóticas F3.

Construção	Descrição do Vetor	Evento ID	Média de Triptofano ppm	StdDev do Triptofa- no ppm
PMON3016 7	Vetor, somente	RAG120	11	1
Linhagem parente		Não transgênico	11	2
PMON69755	Zm-ASA2-CTP +18:_wt AS	ZM_S100593	118	8
		ZM_S101241	99	45
		ZM_S103021	58	18
		ZM_S103022	63	6
		ZM_S98891	122	26
PMON69757	Zm-ASA2-CTP +18:_F298W	ZM_S100715	352	42

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Construção	Descrição do Vetor	Evento ID	Média de Triptofano ppm	StdDev do Triptofa- no ppm
		ZM_S101226	310	16
		ZM_S99658	286	37
		ZM_S99679	242	16
		ZM_S99787	319	22
PMON69768	Zm-ASA2-CTP +18:_S51F	ZM_S104037	227	18
		ZM_S104038	129	11
		ZM_S104052	174	18
		ZM_S105091	258	30
		ZM_S105105	254	53
PMON69770	Zm-ASA2-CTP +18:_S51C	ZM_S102618	677	174
		ZM_S102637	649	84
		ZM_S103233	585	190
		ZM_S103234	612	197
		ZM_S103245	632	160
		ZM_S103257	667	106
		ZM_S103261	430	106
		ZM_S103277	684	251
PMON69779	ZM-DHDPS-CTP +20:_F298W	ZM_S115297	150	16
		ZM_S115309	129	32
		ZM_S115313	123	30
		ZM_S115314	148	15
		ZM_S116346	145	12
PMON67146	Zm-DHDPS-CTP+3 :_F298W	ZM_S67192	49	47
		ZM_S67201	41	49
		ZM_S67209	51	48
PMON78152	Rg long-CTP:_F298W	ZM_S111632	68	12
		ZM_S112752	53	13
		ZM_S112777	69	22
		ZM_S113086	89	36

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Construção	Descrição do Vetor	Evento ID	Média de Triptofano ppm	StdDev do Triptofa- no ppm
		ZM_S113096	280	43
PMON78153	Rg short-CTP:_F298W	ZM_S113911	326	14
		ZM_S113927	258	99
		ZM_S113946	280	54
		ZM_S113953	241	47
		ZM_S114105	271	79
PMON82560	At-CTP2(E/K)+1:_F298W	ZM_S115009	353	93
		ZM_S115027	340	24
		ZM_S115029	393	25
		ZM_S115066	358	113
		ZM_S115070	361	91
PMON82561	At-CTP2(E/K) +10:_F298W	ZM_S113026	156	37
		ZM_S113029	192	27
		ZM_S113033	147	50
		ZM_S113194	145	40
		ZM_S113833	169	24
PMON66559	CTP1:_F298W	ZM_S44537	10	2
		ZM_S44538	8	1
		ZM_S44540	11	3
		ZM_S44542	8	0
		ZM_S46820	9	2
		ZM_S46828	9	2
		ZM_S46833	10	2
		ZM_S46841	9	1
		ZM_S46842	10	2
		ZM_S46848	11	3
		ZM_S46855	10	2
		ZM_S46859	10	2
		ZM_S46861	9	1
		ZM_S46865	9	1

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Construção	Descrição do Vetor	Evento ID	Média de Trip- tofano ppm	StdDev do Triptofa- no ppm
		ZM_S46873	8	1
		ZM_S46877	9	3
		ZM_S46878	10	1
PMON68065	Zm-ASA2-CTP +18:_S51C	ZM_S138234	435	42
		ZM_S142738	512	95
		ZM_S137274	514	78
		ZM_S139817	529	108
		ZM_S134462	587	71
		ZM_S142742	594	135
		ZM_S142745	594	90
		ZM_S142725	613	87
		ZM_S142747	651	93
		ZM_S142728	814	395
PMON68066	Zm-ASA2-CTP +18: S51C nno	ZM_S134079	436	132
		ZM_S133073	656	127
		ZM_S133076	774	57
		ZM_S134078	904	119
		ZM_S134080	917	268
		ZM_S133092	928	255
		ZM_S133080	943	154
		ZM_S133098	960	321
		ZM_S133099	1002	556
		ZM_S133082	1023	129
		ZM_S133433	1100	138
		ZM_S133093	1110	136
		ZM_S133089	1289	139
		ZM_S133434	1352	101
PMON78850	At-CTP2(E/K) +1:Rhizobium wt	ZM_S127477	45	4

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Construção	Descrição do Vetor	Evento ID	Média de Trip- tofano ppm	StdDev do Triptofa- no ppm
		ZM_S129898	32	6
		ZM_S129905	35	3
		ZM_S129913	45	5
		ZM_S129917	40	7
PMON78851	At-CTP2(E/K) +1:Rhizobium S51C	ZM_S128450	595	103
		ZM_S128451	547	96
		ZM_S128458	983	31
		ZM_S128461	477	85
		ZM_S128463	548	72
		ZM_S128464	547	100
		ZM_S128466	503	39
		ZM_S128467	603	126
		ZM_S128469	532	69

EXEMPLO 8

Produção de Farinha e Produtos de Ração [00152] Este exemplo mostra métodos para produção de farinha e produção de ração contendo os vetores de expressão, que foram descritos no Exemplo 5.

[00153] Quaisquer das plantas ou partes destas da presente invenção podem ser processadas para produzir ração, farinha, proteína, ou preparação de óleo, incluindo preparações de ração, farinha, proteína e óleo com alto teor total de triptofano. Uma parte das plantas particularmente preferida para esta finalidade é a semente. Em uma modalidade preferida, a preparação de ração, farinha, proteína ou óleo é projetada para animais de criação ou humanos, ou ambos. Os métodos para produção de preparações de ração, farinha, proteína e óleo são conhecidos da técnica. Vide, por exemplo, as Patentes US 4.957.748;

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5.100.679; 5.219.596; 5.936.069; 6.005.076; 6.146.669; e 6.156.227. Em uma modalidade preferida, a preparação de ração, farinha, proteína ou óleo é uma preparação com alto teor de triptofano. Tal preparação com alto teor de triptofano tem preferivelmente um teor de triptofano maior que cerca de 200 a 400 ppm, mais preferivelmente 400 a 600 ppm, e ainda mais preferivelmente 600 a 800 ppm.

EXEMPLO 9

Métodos para Detectar um transgene de CTP::AS [00154] Este mostra métodos que podem ser usados para detecção da presença em células vegetais transgênicas, ou ração ou produtos de farinha de tais células vegetais transgênicas pertencentes a uma construção que contém qualquer uma das combinações de sequência de CTP::AS descritas aqui.

[00155] Amplificação por PCR do DNA de CTP::AS [00156] O DNA genômico de células vegetais transgênicas, ou de ração ou produtos de farinha derivados de tais células vegetais transgênicas, pode ser extraído usando o minikit para planta QIAGEN DNeasy® (Cat # 69104; QIAGEN Inc.) de acordo com o protocolo do fabricante. A mistura reacional de PCR pode incluir geralmente cerca de 100 mg do DNA genômico extraído, tampão de reação de PCR (1X) (Expand High Fidelity PCR System, Cat # 1732641; Roche Inc., Nutley, NJ), dNTP 0,2mM, 5 picomoles de cada iniciador, 3,5 unidades de enzima Taq polimerase High Fidelity, e água para um volume final de 50 mL. Por exemplo, os pares de iniciadores de SEQ ID NO: 228 e SEQ ID NO: 229; ou SEQ ID NO: 230 e SEQ ID NO: 231 podem ser usados para amplificar o DNA extraído para produzir um amplicon que é diagnóstico para DNA da construção Zm-ASA2 + 18-CTP::AgroAS de uma célula vegetal que tenha sido transformada com pMON68066. A mistura reacional é submetida a vários ciclos de temperatura que podem incluir: desnaturar a 95^oC, recozimento a 60^oC, e extensão a

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72^oC, por 35 ciclos. Depois de 35 ciclos de PCR, cerca de 10 mL da mistura reacional são separadados em gel de agarose a 1,0%. A presença de fragmento com 2.649 pares de base (com par de iniciadores SEQ ID NO: 228 e SEQ ID NO: 229) ou um fragmento com 2.735 pares de base (com par de iniciadores SEQ ID NO: 230 e SEQ ID NO: 231) indica que a células vegetais, ração ou produto de farinha compreende Zm-ASA2 + 18-CTP fusionado ao alelo AS. Está bem dentro dos procedimentos conhecidos por aquele com conhecimento ordinário da técnica reconhecer e desenhar pares de iniciadores por PCR que seriam úteis na detecção de sequências únicas pertencentes a uma construção que contém qualquer uma das outras combinações de sequências de CTP::AS, descritas aqui.

[00157] Todos os materiais e métodos descritos aqui e reivindicados podem ser realizados e usados sem experimentação indevida conforme orientação dada pela exposição acima. Embora os materiais e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas e exemplos ilustrativos, ficará claro para aqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas aos materiais e métodos descritos aqui sem se desviar do conceito, espírito e escopo da invenção. Todos de tais substitutos e modificações aparentes para aqueles versados na técnica serão considerados como dentro do escopo da invenção conforme definida pelas reivindicações apensas. REFERÊNCIAS

As seguintes referências, até onde elas proporcionem procedimentos exemplares ou outros detalhes suplementares àqueles mostrados aqui, são especificamente aqui incorporadas a título de referência.

As Patentes, pedidos e publicações de pedidos norteamericanos: Pedido US 09/757.089; Pedido US 10/138.927;Pedido US 10/430.011; Pedido US 10/732.721; Pedido US 11/503.532; Patente

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Patente

Patente

Patente

Patente

Patente

Patente

Patente

US 4.957.748 US 5.100.679 US 5.219.596 US 5.322.938 US 5.359.142 US 5.424.412 US 5.550.318 US 5.641.876 US 5.858.741 US 6.005.076 US 6.140.078 US 6.156.227 US 6.177.611 US 6.294.714 US 6.429.362 US 6.635.806

Patente US 4.957.748 Patente US 5.188.642 Patente US 5.290.924 Patente US 5.322.938 Patente US 5.378.619 Patente US 5.530.196 Patente US 5.563.055

Patente US 5.100.679 Patente US 5.219.596 Patente US 5.322.783 Patente US 5.352.605 Patente US 5.378.619 Patente US 5.538.880 Patente US 5.610.042

Patente US 5.728.925; Patente US 5.837.848;Patente

Patente US 5.936.069 Patente US 6.005.076 Patente US 6.146.669 Patente US 6.156.227 Patente US 6.232.526 Patente US 6.426.446 Patente US 6.433.252

Patente US 5.936.069 Patente US 6.118.047 Patente US 6.146.669 Patente US 6.175.060 Patente US 6.252.138 Patente US 6.429.357 Patente US 6.437.217 Patente US 7.151.204

Patente

Patente

Patente

Patente

Patente

Patente

Patente

Patente

Patente US 5.641.876 US 7.217.865; Publicação US 20030097677; Publicação US 20030213010; Publicação US 20050005327

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1999.

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Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Vetor de expressão que, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de polinucleotídeo que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto fusionado a uma antranilato sintase monomérica heteróloga, em que a molécula de polinucleotídeo que codifica o peptídeo de trânsito para o cloroplasto compreende SEQ ID NO: 9 ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma sequência de aminoácido;

   em que o referido peptídeo de trânsito para o cloroplasto proporciona direcionamento intensificado da referida antranilato sintase monomérica a um cloroplasto de uma célula vegetal quando em comparação com o direcionamento da referida antranilato sintase por CTP1 da SEQ ID NO: 19; e em que a referida molécula de polinucleotídeo proporciona níveis intensificados de pelo menos triptofano em uma célula vegetal transgênica que compreende a referida molécula de polinucleotídeo quando em comparação com uma célula vegetal do mesmo genótipo, mas carecendo da referida molécula de polinucleotídeo, em que a referida antranilato sintase monomérica é insensível à realimentação para triptofano.
2. 2. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida antranilato sintase monomérica compreende uma sequência de polipeptídeos selecionada do grupo que compreende SEQ ID NOs: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, e sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma sequência de aminoácido.
3. 3. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreende a sequência de ácidos nucléicos de SEQ ID NO: 213 ou SEQ ID NO: 214.
4. 4. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caPetição 870170094041, de 04/12/2017, pág. 5/11

   2/4 racterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um promotor funcional em plantas operavelmente ligados ao referido polinucleotídeo que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto fusionado a uma antranilato sintase monomérica.
5. 5. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor constitutivo, induzível, específico de semente, ou preferido para tecido.
6. 6. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo que codifica o peptídeo de trânsito para o cloroplasto compreende SEQ ID NO: 9, e o referido polinucleotídeo que codifica uma antranilato sintase monomérica compreende SEQ ID NO: 207.
7. 7. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que está inserido no genoma de uma célula, planta ou semente transgênica.
8. 8. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida célula transgênica é uma célula vegetal.
9. 9. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida célula transgênica é uma célula de monocotiledônea.
10. 10. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida célula transgênica é uma célula de dicotiledônea.
11. 11. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida antranilato sintase monomérica compreende uma sequência de polipeptídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, e sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma sequência de aminoácido.

    Petição 870170094041, de 04/12/2017, pág. 6/11

    3/4
12. 12. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um promotor operavelmente ligado à referida molécula de polinucleotídeo que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto fusionado a uma antranilato sintase monomérica.
13. 13. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é selecionado do grupo que consiste em um promotor constitutivo, induzível, específico de semente, ou preferido para tecido.
14. 14. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida célula vegetal transgênica é uma célula de milho.
15. 15. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo, que codifica uma peptídeo de trânsito para o cloroplasto, compreende SEQ ID NO: 9 e o referido polinucleotídeo que codifica uma antranilato sintase monomérica compreende SEQ ID NO: 207.
16. 16. Método para aumentar os níveis de triptofano livre nas sementes de plantas monocotiledôneas, caracterizado pelo fato de que compreende expressar em uma célula vegetal o vetor de expressão como definido na reivindicação 1, em que o referido peptídeo de trânsito para o cloroplasto é capaz de compartimentalizar a antranilato sintase monomérica para um plastídio na referida célula vegetal.
17. 17. Método para produzir um produto de ração nutricionalmente intensificado, caracterizado pelo fato de que compreende processar uma semente conforme definida na reivindicação 7 em uma farinha, proteína ou óleo.
18. 18. Produto de ração, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método conforme definido na reivindicação 17, em que o referido produto compreende o vetor de expressão como definido na

    Petição 870170094041, de 04/12/2017, pág. 7/11

    4/4 reivindicação 1.
19. 19. Produto de ração, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de compreende um ácido nucléico que produz um amplicon diagnóstico para o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 1, quando testado em um método de amplificação de DNA.

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