ES2269110T3 - Metodo para mejorar el valor agronomico y nutricional de las plantas. - Google Patents

Metodo para mejorar el valor agronomico y nutricional de las plantas. Download PDF

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Abstract

Un método de producción de células vegetales que acumulan carotenoides, células que están normalmente exentas de carotenoides, comprendiendo dicho méto- do transformar material vegetal con una molécula de DNA aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende: (a) una casete de expresión capaz de dirigir la producción en dichas células de una fitoeno-sintasa derivada de una planta; y (b) una casete de expresión capaz de dirigir la producción en dichas células de una fitoeno-desaturasa derivada de una bacteria.

Description

Método para mejorar el valor agronómico y nutricional de las plantas.
La presente invención se refiere al campo de la transformación de células vegetales, semillas, tejidos y plantas enteras. Más específicamente, la presente invención se refiere a la inserción de secuencias de nucleótidos recombinantes que codifican una o más de las enzimas específicas del camino biosintético de los carotenoides en material vegetal a fin de mejorar su valor agronómico y nutricional.
Antecedentes de la invención
La deficiencia en provitamina A (\beta-caroteno) representa un problema sanitario muy grave que conduce a síntomas clínicos severos en la parte de la población mundial que se nutre de cereales tales como el arroz como el alimento principal o de primera necesidad casi exclusivo. En el sudeste de Asia solamente, se estima que cinco millones de niños desarrollan la enfermedad oftálmica xeroftalmía cada año, de los cuales 0,25 millones quedan finalmente ciegos (Sommer, 1988; Grant, 1991). Adicionalmente, aunque la deficiencia en vitamina A no es un determinante proximal de la muerte, la misma se encuentra en correlación con una susceptibilidad incrementada de aflicciones posiblemente fatales tales como diarrea, enfermedades respiratorias, y enfermedades de la infancia, tales como el sarampión (Grant, 1991). De acuerdo con estadísticas recopiladas por la UNICEF, la nutrición mejorada en provitamina podría prevenir 1-2 millones de muertes anualmente entre los niños de edad comprendida entre 1 y 4 años, y 0,25-0,5 millones de muertes adicionales durante la infancia posterior (Humphrey et al., 1992). Por estas razones, es muy deseable elevar los niveles de carotenoides en los alimentos de primera necesidad. Además, se sabe que los carotenoides contribuyen a la prevención de varias clases de cáncer y está establecido el papel de luteína y zeaxantina en la prevención de la degeneración macular de la retina (véase, v.g., Brown et al., 1998; Schalch, 1992).
Adicionalmente, los carotenoides tienen una extensa gama de aplicaciones como colorantes en la alimentación humana y los piensos animales así como en productos farmacéuticos. Además, existe un interés creciente en los carotenoides como productos nutrientes en la "alimentación funcional". Esto es debido a que algunos carotenoides, v.g. \beta-caroteno, exhiben carácter de provitamina-A en los mamíferos.
Los carotenoides son isoprenoides de 40 carbonos (C_{40}) formados por condensación de 8 unidades isopreno derivadas del precursor biosintético isopentenil-difosfato (véase Fig. 1). Por su nomenclatura, los carotenoides están comprendidos en dos clases, a saber carotenos, que comprenden hidrocarburos, mientras que se hace referencia a los derivados oxigenados como xantofilas. Su función esencial en las plantas es la protección contra el deterioro foto-oxidante en el aparato fotosintético de los plástidos. Adicionalmente, aquéllos participan en la captación de la luz durante la fotosíntesis y representan componentes integrales de los centros de reacción fotosintéticos. Los carotenoides son los precursores directos de la fitohormona ácido abscísico.
La biosíntesis de los carotenoides se representa esquemáticamente en Fig. 1 y ha sido investigada, y su camino esclarecido en bacterias, hongos y plantas (véase, por ejemplo, Britton, 1988). En las plantas, los carotenoides se forman en los plástidos.
El compuesto intermedio precoz en el camino biosintético de los carotenoides es el geranilgeranil-difosfat
(GGPP), formado por la enzima geranilgeranil-difosfato-sintasa a partir de isopentenil-difosfato (IPP) y dimetilalil-difosfato (DMAPP, véase Fig. 1). El paso enzimático subsiguiente, que representa también la primera reacción específica de los carotenoides, es catalizado por la enzima fitoeno-sintasa. La reacción comprende una reacción de dos pasos que da como resultado una condensación de cabeza con cola de dos moléculas de GGPP para formar el primer producto de caroteno, fitoeno, todavía desprovisto de color, (Dogbo et al., 1988, Chamovitz et al., 1991; Linden et al., 1991; Pecker et al., 1992). La fitoeno-sintasa existe en dos formas soluble/inactiva y fijada a la membrana/activa, y requiere funciones hidroxi vecinales para su actividad tal como está presente en la superficie de las membranas de plástidos que contienen galactolípidos (Schledz et al., 1996).
Si bien la formación de fitoeno es similar en bacterias y plantas, la metabolización del fitoeno difiere acusadamente. En las plantas, dos productos génicos operan de manera secuencial para generar el caroteno coloreado licopeno (Beyer et al., 1989). Los mismos están representados por las enzimas fitoeno-desaturasa (PDS, véase v.g. Hugueney et al., 1992) y \zeta-caroteno-desaturasa (ZDS, véase, v.g. Albrecht et al., 1996). Cada uno introduce dos enlaces dobles que producen \zeta-caroteno por la vía de fitoflueno y licopeno por la vía de neurosporeno, respectivamente. Se cree que PDS está enlazada mecanísticamente a una cadena rédox fijada a la membrana (Nievelstein et al., 1995) que emplea plastoquinona (Mayer et al., 1990; Schulz et al., 1993; Norris et al., 1995), mientras que ZDS actúa mecanísticamente de manera diferente (Albrecht et al., 1996). En las plantas, el camino global parece implicar compuestos intermedios de configuración cis (Bartley et al., 1999). En contraste, en muchas bacterias, por ejemplo en el género Erwinia, la secuencia de desaturación entera que forma los cuatro enlaces dobles es producida por un único producto génico (CrtI), que convierte el fitoeno directamente en licopeno (véase, v.g., Miawa et al., 1990; Armstrong et al., 1990; Hundle, et al., 1994). Se sabe que este tipo de desaturasa bacteriana no es sensible a ciertos herbicidas blanqueantes que inhiben eficientemente la fitoeno-desaturasa de tipo vegetal.
En las plantas, dos productos génicos catalizan la ciclación de licopeno, a saber \alpha(\varepsilon)- y \beta-licopeno-ciclasas, formando grupos terminales \alpha(\varepsilon) y \beta-ionona, respectivamente (véase v.g. Cunningham et al., 1993; Scolnik y Bartley, 1995, Cunningham et al., 1996). En las plantas, se forman normalmente \beta-caroteno que lleva dos grupos terminales \beta-ionona y \alpha-caroteno, que lleva un grupo terminal \alpha(\varepsilon) y un grupo terminal \beta-ionona.
La formación de las xantofilas de plantas está mediada primeramente por dos productos génicos, \alpha- y \beta-hidroxilasas (Masamoto et al., 1998) que actúan en la posición C3 y C3' de la cadena principal de caroteno de \alpha- y \beta-caroteno, respectivamente. Las xantofilas resultantes reciben los nombres de luteína y zeaxantina.
Otras reacciones de oxigenación son catalizadas por la epoxidasa zeaxantina que cataliza la introducción de funciones epoxi en la posición C5,C6 y C5',C6' de la cadena principal de la zeaxantina (Marin et al., 1996). Esto conduce a la formación de anteraxantina y violaxantina. La reacción se hace reversible por la acción de un producto génico diferente, la violaxantin-des-epoxidasa (Bugos y Yamamoto, 1996).
El producto génico que conduce a la formación de neoxantina no se ha identificado hasta ahora.
Genes y cDNAs que codifican genes de la biosíntesis de los carotenoides han sido clonados a partir de una diversidad de organismos, que comprenden desde bacterias a plantas (genes bacterianos y cianobacterianos incluyen Erwinia herbicola (Solicitud WO91/13078, Armstrong et al., 1190), Erwinia uredovora (Misawa et al., 1990), R. capsulatus (Armstrong et al., 1989), Thermus thermophilus (Hoshino et al., 1993), la cianobacteria Synechococcus sp. (número de acceso a Genbank X63873), Flavobacterium sp. cepa R1534 (Pasamontes et al., 1997). Genes y cDNAs que codifican enzimas en el camino biosintético de los carotenoides en las plantas superiores han sido clonados a partir de diversas fuentes, que incluyen Arabidopsis thaliana, Sinapis alba, Capsicum annuum, Narcissus pseudonarcissus, Lycopersicon esculentum, etc., como puede deducirse de las bases de datos públicas.
En la actualidad se sabe relativamente poco acerca del uso de los genes clonados en transformaciones de plantas superiores y los efectos resultantes. La expresión de fitoeno-sintasa del tomate puede afectar a los niveles de carotenoides en el fruto (Bird et al., 1991; Bramley et al., 1992; Fray y Grierson, 1993). Se ha consignado también que la expresión constitutiva de una fitoeno-sintasa en plantas de tomate transformadas da como resultado enanismo, debido al redireccionamiento del metabolito GGPP del camino de biosíntesis de la gibberelina (Fray et al., 1995). Ninguno de tales problemas se observó después de la expresión constitutiva de la fitoeno-sintasa de Narcissus pseudonarcissus en el endospermo del arroz (Burkhardt et al., 1997). Se sabe que la CrtI de Erwinia uredovora, como desaturasa bacteriana, funciona en las plantas y confiere resistencia a los herbicidas blanqueantes (Misawa et al., 1993).
Se han realizado muchos intentos a lo largo de los años para alterar o mejorar los caminos biosintéticos de los carotenoides en diversos tejidos vegetales tales como tejidos vegetativos o semillas, o en bacterias. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 96/13149, WO 98/06862, WO 98/24300, WO 96/28014 y la Patente U.S. número 5.168.988. Además de esto, el documento WO 99/07867 describe métodos para producir plantas y semillas que tienen composiciones de carotenoides alteradas por transformación de plantas hospedadoras con construcciones que tienen una región de iniciación de la transcripción procedente de un gen expresado en una semilla de planta, un péptido de tránsito plastídico, una secuencia de DNA derivada de al menos una región codificante de genes de la biosíntesis de los carotenoides, y una región de terminación de la transcripción. Los métodos expuestos en el documento WO 9907867 encuentran utilidad particular en el aumento del contenido de carotenoides en plantas de semillas oleaginosas. Todos estos documentos están restringidos a la manipulación de reacciones biosintéticas de carotenoides pre-existentes en las células. Otras aplicaciones encaminadas a la alteración de la biosíntesis de los carotenoides en semillas ricas en aceite son diferentes, dado que proporcionan un disipador para acomodar un exceso de carotenoides formados debido al aumento provocado por la transformación.
Es evidente que es necesario un método de transformación de material vegetal a fin de producir transformantes capaces de expresar todas las enzimas del camino de la biosíntesis de los carotenoides necesarias para producir carotenos y xantofilas de interés.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona medios y métodos de transformación de células vegetales, semillas, tejidos o plantas enteras a fin de producir transformantes capaces de expresar todas las enzimas del camino de la biosíntesis de los carotenoides que son esenciales para que la planta hospedadora direccionada acumule carotenos y/o xantofilas de interés. La presente invención proporciona también moléculas de DNA diseñadas que son adecuadas para la realización del método de la invención, y plásmidos o sistemas vectores que comprenden dichas moléculas. Adicionalmente, la presente invención proporciona células de plantas transgénicas, semillas, tejidos y plantas enteras que exhiben una calidad nutricional mejorada y contienen tales moléculas de DNA y/o que han sido generadas por el uso de los métodos de la presente invención.
Así, la presente invención proporciona tanto la introducción y expresión de novo de la biosíntesis de carotenoides, que es particularmente importante con relación al material vegetal que se sabe está esencialmente exento de carotenos, tales como el endospermo del arroz y las semillas de muchos otros cereales, y a la modificación de la biosíntesis de carotenoides pre-existentes a fin de regular en el sentido creciente o decreciente la acumulación de ciertos compuestos intermedios o productos de interés.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un camino general de la biosíntesis de carotenoides vegetales. Los nombres de las enzimas se dan en negrita. Se indica también la reacción catalizada por una caroteno-desaturasa bacteriana de tipo CrtI.
La Figura 2 indica que el compuesto intermedio geranilgeranil-difosfato (GGPP) no está implicado solamente en la biosíntesis de los carotenoides, sino que sirve como bloque de construcción en caminos que conducen a compuestos diferentes por reacciones de prenilación (v.g. tocoferoles, quinonas, clorofilas) o por una reacción diferente que no emplea moléculas aceptoras no prenílicas (v.g. gibberelinas, sustancias saborizantes y aromatizantes).
La Figura 3 da análisis HPLC de semillas de arroz pulimentadas (el endospermo) de plantas de arroz no transformadas (Fig. 3A) y transformadas (con plásmido A, Fig. 3B), con plásmido A más B, Fig. 3C). La aparición de los carotenoides, carotenos cíclicos y xantofilas, es evidente en las trazas que representan semillas transformadas.
La Figura 4 ilustra esquemáticamente las casetes de expresión utilizadas en "plásmido A" y "plásmido B". LB, borde izquierdo; RB, borde derecho; psy, fitoeno-sintasa, cDNA de Narcissus pseudonarcissus; crtI, gen de caroteno-desaturasa de Erwinia uredovora; cyc, licopeno-ciclasa, cDNA de Narcissus pseudonarcissus; aph IV, higromicin-fosfotransferasa; Gt1, promotor de glutelina 1 del arroz; 35S, promotor 35S de CaMV; nos, terminador nopalina-sintasa; NptII, gen de resistencia a la kanamicina.
Figura 5: A, transferencia Northern que utiliza RNA de flores de narciso atrompetado sin tratar (pista 1) y tratadas con CPTA (pista 2). El RNA inmovilizado se sometió repetidamente a eliminación de materias volátiles para permitir la hibridación utilizando sondas marcadas para B, fitoeno-sintasa; B, fitoeno-desaturasa; C, \zeta-caroteno-desaturasa; E, licopeno-ciclasa. B, transferencia Western utilizando extractos proteínicos de flores de narciso atrompetado sin tratar (pista 1) y tratadas (pista 2). Las transferencias se sondaron con anticuerpos dirigidos contra A, fitoeno-sintasa; B, fitoeno-desaturasa; C, \zeta-caroteno-desaturasa; D, licopeno-ciclasa.
Abreviaturas utilizadas a lo largo de la memoria descriptiva
Los nombres sistemáticos de los carotenoides relevantes mencionados en esta memoria son:
Fitoeno: 7,8,11,12,7',8',11',12'-octahidro-\Psi,\Psi-caroteno
Fitoflueno: 7,8,11,12,7',8'-hexahidro-\Psi,\Psi-caroteno
\zeta-caroteno: 7,8,7',8'-tetrahidro-\Psi,\Psi-caroteno
Neurosporeno: 7,8-dihidro-\Psi,\Psi-caroteno
Licopeno: -\Psi,\Psi-caroteno
\beta-caroteno: \beta,\beta-caroteno
\alpha-caroteno: \beta,\varepsilon-caroteno
Zeaxantina: \beta,\beta-caroteno-3,3'-diol
Luteína: \beta,\varepsilon-caroteno-3,3'-diol
Anteraxantina: 5,6-epoxi-5,6-dihidro-\beta,\beta-caroteno-3,3'-diol
Violaxantina: 5,6,5',6'-diepoxi-5,6,5',6'-tetrahidro-\beta,\beta-caroteno-3,3'-diol
Neoxantina: 5,6'-epoxi-6,7-dideshidro-5,6,5',6'-tetrahidro-\beta,\beta-caroteno-3,5,3'-triol
\vskip1.000000\baselineskip
Enzimas
PSY: fitoeno-sintasa
PDS: fitoeno-desaturasa
CrtI: caroteno-desaturasa bacteriana
ZDS: \zeta (zeta)-caroteno-desaturasa
CYC: licopeno-\beta-ciclasa
Compuestos intermedios no carotenos
IPP: isopentenil-difosfato
DMAPP: dimetilaril-difosfato
GGPP: geranilgeranil-difosfato
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "planta" incluye generalmente algas eucariotas, embriofitas que incluyen Bryophyta, Pteridophyta y espermatofitas tales como Gymnospermae y Angiospermae, incluyendo las últimas Magnoliopsida, Rosopsida (eu-"dicots"), y Liliopsida ("monocots"). Ejemplos representativos y preferidos incluyen semillas de cereales, v.g. arroz, trigo, cebada, avena, amaranto, lino, trigo híbrido, centeno, maíz, y otras hierbas; semillas oleaginosas, tales como semillas oleaginosas de Brassica, semillas de algodón, soja, cártamo, girasol, coco, palma y análogas; otras semillas comestibles o semillas con partes comestibles que incluyen calabaza común, calabaza de cuello curvo, sésamo, amapola, uva, habas mung, cacahuete, guisantes, habichuelas, rábano, alfalfa, cacao, café, cáñamo, frutos de árbol de tipo nuez tales como nueces de nogal, almendras, pacanas, garbanzos, etc. Adicionalmente, patatas, zanahorias, batatas, tomate, pimienta, mandioca, sauces, robles, olmo, arces, manzanos, bananeros; flores ornamentales tales como lirios, orquídeas, juncos, rosas, ranúnculos, petunias, flox, violetas, girasoles, y análogas. Generalmente, la presente invención es aplicable en especies ornamentales así como especies cultivadas para alimento, fibra, productos de madera, materiales curtientes, colorantes, pigmentos, gomas, resinas, productos de látex, grasas, aceites, fármacos, bebidas, y análogas. Preferiblemente, la planta diana seleccionada para transformación se cultiva para alimento, tal como, por ejemplo, cereales, raíces, legumbres, nueces, hortalizas, tubérculos, frutos, especias y análogas.
Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 1
De acuerdo con la presente invención, se proporcionan medios y métodos de transformación de células vegetales, semillas, tejidos o plantas enteras para producir transformantes capaces de expresar todas las enzimas del camino de la biosíntesis de los carotenoides que son esenciales para que la planta hospedadora direccionada acumule carotenos y/o xantofilas de interés. De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, dichos métodos pueden utilizarse también para modificar la biosíntesis de carotenoides pre-existentes a fin de regular en sentido creciente o decreciente la acumulación de ciertos compuestos intermedios o productos de interés. Adicionalmente, se proporcionan moléculas de DNA específicas que comprenden secuencias nucleotídicas que llevan una o más casetes de expresión capaces de dirigir la producción de una o más enzimas características del camino de biosíntesis de los carotenoides seleccionado del grupo constituido por:
- fitoeno-sintasa derivada de plantas, hongos o bacterias,
- fitoeno-desaturasa derivada de plantas, hongos o bacterias,
- \zeta-caroteno-desaturasa derivada de plantas o cianobacterias, y
- licopeno-ciclasa derivada de plantas, hongos o bacterias.
Como se describe también, la casete de expresión anterior comprende uno o más genes o cDNAs que codifican fitoeno-sintasa de plantas, hongos o bacterias, fitoeno-desaturasa de plantas, hongos o bacterias, \zeta-caroteno-desaturasa de plantas, o licopeno-ciclasa de plantas, hongos o bacterias, enlazadas cada una operativamente a un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido adecuado que permite su expresión en células vegetales, semillas, tejidos o plantas enteras. Genes o cDNAs particularmente preferidos codifican fitoeno-sintasa de plantas, fitoeno-desaturasa bacteriana o licopeno-ciclasa de plantas. Un gran número, todavía creciente de genes que codifican fitoeno-sintasa (de plantas y bacterias), caroteno-desaturasa de tipo CrtI (bacteriana) y licopeno-ciclasa (de plantas y bacterias) han sido aislados y son accesibles a partir de las bases de datos. Los mismos proceden de diversas fuentes y están disponibles todos ellos para uso en los métodos descritos.
Se prefiere que las moléculas de DNA comprendan adicionalmente al menos un gen marcador o cDNA seleccionable enlazado operativamente a un promotor constitutivo, inducible o específico de tejidos adecuado, con higromicina-fosfotransferasa como el marcador seleccionable bajo el control de un promotor constitutivo que es el más preferido. Aunque las personas expertas pueden seleccionar cualquier promotor disponible funcionalmente activo en material vegetal, se prefiere el diseño de las casetes de expresión apropiadas de acuerdo con la invención para enlazar operativamente la secuencia nucleotídica respectiva que codifica fitoeno-desaturasa, \zeta-caroteno-desaturasa, o licopeno-ciclasa a promotores específicos de tejidos o constitutivos, en tanto que se expresa preferiblemente la secuencia nucleotídica que codifica la fitoeno-sintasa bajo el control de un promotor específico de tejidos para evitar la interferencia con la formación de gibberelinas.
Debe entenderse que la secuencia nucleotídica como elemento funcional de la molécula de DNA de acuerdo con la descripción puede comprender cualquier combinación de uno o más de los genes o cDNAs arriba mencionados. En una realización particularmente preferida de la presente invención, dicha secuencia de nucleótidos comprende casetes de expresión funcionales tanto para fitoeno-sintasa como para fitoeno-desaturasa bacteriana o fúngica, y puede, después de incorporación en un plásmido o sistema vector apropiado (plásmido A) introducirse en el material vegetal diana, sea sola o junto con un segundo vector (plásmido B) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica licopeno-ciclasa.
La invención proporciona adicionalmente plásmidos o sistemas vectores que comprenden una o más de las moléculas de DNA o secuencias nucleotídicas anteriores, que se derivan preferiblemente de Agrobacterium tumefaciens.
La presente invención proporciona adicionalmente células vegetales, semillas, tejidos y plantas transgénicas enteras que exhiben una calidad nutritiva mejorada y contienen una o más de las moléculas de DNA, plásmidos o vectores anteriores, y/o que han sido generadas por el uso de los métodos de acuerdo con la presente invención.
La presente invención está basada en el hecho de que el compuesto intermedio precoz geranilgeranil-difosfato (GGPP) no sirve solamente para la carotenogénesis, sino que representa un punto de ramificación que atiende a diferentes caminos biosintéticos (Fig. 2). Se llega por tanto a la conclusión de que este precursor existe en los plástidos de todos los tejidos vegetales, contengan o no carotenoides, tales como el endospermo del arroz. La fuente de GGPP puede utilizarse por tanto para conseguir los objetos de la presente invención, es decir la introducción del camino biosintético de los carotenoides en parte o como un todo, y/o la mejora o aceleración de un camino de biosíntesis de carotenoides pre-existente.
El término "exento de carotenoides" utilizado a la largo de la memoria descriptiva para diferenciar entre ciertas células o tejidos vegetales diana significará que el material vegetal respectivo no transformado de acuerdo con la invención se sabe que por lo general está esencialmente exento de carotenoides, como sucede en el caso de, p.ej. órganos de almacenamiento tales como, por ejemplo, el endospermo del arroz y análogos. Exento de carotenoides no significa que se excluyan células o tejidos que acumulan carotenoides en cantidades prácticamente indetectables. Preferiblemente, dicho término definirá un material vegetal que tiene un contenido de carotenoides de 0,001% p/p o inferior.
Con relación a la selección de fuentes apropiadas de las cuales pueden derivarse enzimas del camino de los carotenoides, debe entenderse que secuencias codificantes de Cyanobacteria que son homólogas a secuencias respectivas de plantas pueden utilizarse también de acuerdo con la presente invención.
En una realización preferida de la presente invención, una fitoeno-sintasa de plantas superiores se enlaza operativamente a un promotor que confiere expresión específica de tejidos. Ésta está unificada en el mismo plásmido (plásmido A) con una fitoeno-desaturasa bacteriana (tipo Crt-I), fusionada la última a una secuencia de DNA que codifica un péptido de tránsito y está enlazada operativamente a un promotor que permite la expresión constitutiva. La transformación de plantas con esta construcción en un vector adecuado dirigirá la formación de licopeno en el tejido seleccionado por la fitoeno-sintasa controladora del promotor, por ejemplo, en las semillas de cereales exentos de carotenoides. Sorprendentemente, esta transformación por sí sola puede iniciar la síntesis de los carotenoides más allá de la formación de licopeno hacia xantofilas situadas aguas abajo, tales como luteína, zeaxantina, anteraxantina, violaxantina, y neoxantina, incluso en un tejido exento de carotenoides tal como el endospermo del arroz. Adicionalmente, se observa la formación de \alpha-caroteno. Así, se forma un complemento de carotenoides similar al presente en las hojas verdes. Este fenómeno inesperado (designado también aquí como mecanismo de rebasamiento ("overshoot")) puede ser debido a la expresión constitutiva de los genes tardíos respectivos (licopeno-ciclasas, \beta-caroteno-hidroxilasas, epoxidasas), que llegan a activarse por el suministro de sustrato mediado por la transformación o, alternativamente, por la inducción de la expresión de genes biosintéticos de carotenoides provocada por la transformación. En el caso en que el mecanismo de "overshoot" no funciona, la co-transformación (plásmido B) con un gen o cDNA que codifica licopeno-ciclasa puede resolver este problema y permitir al menos formación de \alpha- o \beta-caroteno (provitamina A). En los casos en que funciona el mecanismo de "overshoot", esta co-transformación puede aumentar los efectos provocados por la fitoeno-sintasa y la caroteno-desaturasa de tipo CrtI. La presente invención incluye por tanto la introducción del camino de biosíntesis de los carotenoides más allá del punto dado genéticamente por la transformación con plásmido A o A+B.
El plásmido A es también capaz de mejorar la producción de carotenoides en tejidos que contienen carotenoides. Estas transformaciones conducen a la mejora del valor nutritivo de la alimentación humana y los piensos animales. Una ventaja adicional de la utilización de la fitoeno-desaturasa bacteriana del tipo crtI en la transformación es que dicha enzima se expresará también en los cloroplastos de las hojas, confiriendo de este modo resistencia a los herbicidas blanqueantes que están direccionados a la fitoeno-desaturasa de las plantas. La presente invención incluye también por tanto aprovechar la resistencia a los herbicidas blanqueantes en asociación con plantas transgénicas que llevan al menos plásmido A.
El segundo plásmido B puede llevar el gen de una licopeno-ciclasa vegetal; alternativamente, puede utilizarse una licopeno-ciclasa bacteriana, equipada con una secuencia de tránsito. Ésta está enlazada operativamente a un promotor, que confiere preferiblemente la misma especificidad de expresión tisular que en el caso de la fitoeno-sintasa en el plásmido A. La co-transformación de los plásmidos A y B da como resultado la complementación del tejido diana tal como una raíz, fruto, tubérculo o semilla con la información plena para la realización del camino de biosíntesis de los carotenoides a partir de geranilgeranil-difosfato para formar \beta-caroteno. En el caso de reacciones posteriores del camino pre-existentes o inducidas, esta co-transformación (véase anteriormente) hace posible un contenido incrementado de carotenoides y la formación incrementada de xantofilas derivadas de \beta-caroteno.
Todos los genes utilizados están equipados operativamente con una secuencia de DNA que codifica una secuencia de tránsito que permite importación de plástidos. Esto se hace sea por tecnología de DNA recombinante o bien la secuencia de tránsito está presente en el cDNA vegetal que se utiliza. La transformación permite luego la formación de carotenoides utilizando una agrupación del precursor geranilgeranil-difosfato localizado en los plástidos. Este compuesto central no es un carotenoide ni representa un precursor que esté destinado exclusivamente a la biosíntesis de carotenoides (véase Fig. 2).
Las plantas deberían expresar el o los genes introducidos, y son preferiblemente homocigóticas para expresión de los mismos. Generalmente, el gen estará enlazado operativamente a un promotor funcionalmente activo en las células hospedadoras direccionadas de la planta particular. La expresión debería ser a un nivel tal que se obtenga la característica deseada del gen. Por ejemplo, la expresión del gen marcador seleccionable debería proporcionar una selección apropiada de transformantes producidos de acuerdo con los métodos de la presente invención. Análogamente, la expresión de uno o más genes del camino biosintético de los carotenoides y las xantofilas para una calidad nutritiva mejorada debería dar como resultado una planta que tenga un contenido relativamente mayor de uno o más de los compuestos intermedios o productos del camino en comparación con el de la misma especie que no se somete al método de transformación de acuerdo con la presente invención. Por otra parte, se deseará por regla general limitar la expresión excesiva del gen o genes de interés a fin de evitar afectar de modo significativamente adverso la fisiología normal de la planta, es decir, en tal grado que se haga difícil el cultivo de la misma.
La presente invención proporciona también una molécula de DNA aislada de acuerdo con la reivindicación 15.
El o los genes que codifican la enzima o enzimas de interés pueden utilizarse en casetes de expresión para la expresión en los tejidos de la planta transformada. Para alcanzar los objetos de la presente invención, es decir, introducir o complementar el camino de biosíntesis de los carotenoides en una planta diana de interés, la planta se transforma con al menos una casete de expresión que comprende una región de iniciación de la transcripción enlazada a un gen de interés.
La iniciación de la transcripción puede ser nativa o análoga al hospedador o extraña o heteróloga al hospedador. Por extraña se entiende que la región de iniciación de la transcripción no se encuentra en el hospedador de tipo salvaje en el que se introduce la región de iniciación de la transcripción.
Son particularmente interesantes aquellas regiones de iniciación de la transcripción asociadas con proteínas de almacenamiento, tales como glutelina, patatina, napina, cruciferina, \beta-conglicinina, faseolina o análogas.
La casete de transcripción incluirá, en la dirección de transcripción 5'-3', una región de iniciación de la transcripción y la traducción, una secuencia de DNA de interés, y una región de terminación de la transcripción y la traducción funcional en las plantas. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de DNA de interés o puede derivarse de otras fuentes. Regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens tales como las regiones de terminación de la octopina-sintasa y nopalina-sintasa (véase también, Guerineau et al., 1991; Proudfoot, 1991; Sanfacon et al., 1991; Mogen et al., 1990; Munroe et al., 1990; Ballas et al., 1989; Joshi et al., 1987).
En su mayor parte, el gen o genes de interés de la presente invención estarán direccionados a plástidos, tales como los cloroplastos, para su expresión. De esta manera, en los casos en que el gen de interés no se inserta directamente en el plástido, la casete de expresión contendrá adicionalmente una secuencia que codifica un péptido de tránsito para dirigir el gen de interés al plástido. Tales péptidos de tránsito se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Von Heijne et al., 1991; Clark et al., 1989; Della-Cioppa et al., 1987; Romer et al., 1993; y Shah et al., 1996). Cualesquiera genes del camino de los carotenoides útiles en la invención pueden utilizar péptidos de tránsito nativos o heterólogos.
La construcción puede incluir también cualesquiera otros reguladores necesarios tales como secuencias de consenso de traducción de plantas (Joshi, 1987), intrones (Luehrsen y Walbot, 1991) y análogos, enlazados operativamente a la secuencia nucleotídica de interés. Secuencias de intrones dentro del gen deseado a introducir pueden aumentar su nivel de expresión estabilizando el material transcrito y haciendo posible su translocación efectiva fuera del núcleo. Entre las secuencias conocidas de tales intrones se encuentran los intrones del gen de ubiquitina vegetal (Cornejo, 1993). Adicionalmente, se ha observado que la misma construcción insertada en locis diferentes del genoma puede variar en el nivel de expresión en las plantas. Se cree que este efecto es debido al menos en parte a la posición del gen en el cromosoma, es decir, que materiales aislados individuales tendrán niveles de expresión diferentes (véase, por ejemplo, Hoever et al., 1994). Secuencias de DNA reguladoras adicionales que pueden utilizarse para la construcción de casetes de expresión incluyen, por ejemplo, secuencias que son capaces de regular la transcripción de una secuencia de DNA asociada en tejidos vegetales en el sentido de inducción o represión.
Existen, por ejemplo, ciertos genes vegetales que se sabe son introducidos por diversos factores internos y externos, tales como hormonas vegetales, choque térmico, productos químicos, patógenos, deficiencia de oxígeno, luz, fatiga, etc.
Un grupo adicional de secuencias de DNA que pueden regularse comprende secuencias impulsadas por productos químicos que están presentes, por ejemplo, en los genes de la proteína PR (relacionada con la patogénesis) del tabaco y son inducibles por medio de reguladores químicos tales como los descritos en el documento EP-A-0 332 104.
Otra consideración adicional en la expresión de genes extraños en las plantas es el nivel de estabilidad del genoma transgénico, es decir, la tendencia de un gen extraño a segregarse de la población. Si un marcador seleccionable está enlazado al gen o la casete de expresión de interés, entonces puede aplicarse selección para mantener la planta transgénica.
Puede ser beneficioso incluir secuencias conductoras 5' en la construcción de la casete de expresión. Tales secuencias conductoras pueden actuar para mejorar la traducción. Los conductores de traducción son conocidos en la técnica e incluyen: conductores de picornavirus, por ejemplo, el conductor EMCV (región no codificante 5' de la encefalomiocarditis; Elroy-Stein et al., 1989); conductores de potivirus, por ejemplo, el conductor TEV (Virus del Moteado del Tabaco; Allisson et al., 1986); y la proteína de fijación de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP, Macejak y Sarnow, 1991); el conductor no traducido del mRNA de la proteína de recubrimiento del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA4; Jobling y Gehrke, 1987); el conductor del virus del mosaico del tabaco (TMV; Gallie et al., 1989); y el conductor del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV; Lommel et al., 1991; véase también, Della-Cioppa et al., 1987).
Dependiendo de dónde debe expresarse la secuencia de DNA de interés, puede ser deseable sintetizar la secuencia con codones vegetales preferidos, o alternativamente con codones preferidos de cloroplastos. Los codones vegetales preferidos pueden estar determinados por los codones de frecuencia máxima en las proteínas expresadas en la mayor cantidad en la especie vegetal particular de interés (véanse los documentos EP-A-0 359 472; EP-A-0 386 962; WO 91/16432; Perlak et al., 1991; y Murray et al., 1989). De este modo, las secuencias de nucleótidos pueden optimizarse para expresión en cualquier planta. Se reconoce que la totalidad o cualquier parte de la secuencia génica puede ser optimizada o sintética. Es decir, pueden utilizarse también secuencias sintéticas o parcialmente optimizadas. Para la construcción de genes preferidos de cloroplastos, véase el documento USPN 5.545.817.
En la preparación de la casete de transcripción, los diversos fragmentos de DNA pueden manipularse, a fin de proporcionar las secuencias de DNA en la orientación adecuada y, en caso apropiado, en el marco de lectura adecuado. Para este fin, pueden emplearse adaptadores o enlazadores con objeto de unir los fragmentos de DNA, o pueden implicarse otras manipulaciones a fin de proporcionar sitios de restricción convenientes, la eliminación de DNA superfluo, eliminación de sitios de restricción, o análogos. Para este propósito, pueden emplearse mutagénesis in vitro, reparación de iniciadores, restricción, reasociación, resección, ligación, o análogos, donde pueden estar involucradas inserciones, deleciones o sustituciones, v.g. transiciones y transversiones.
La casete de expresión que lleva el gen de interés se pone en un vector de expresión por métodos estándar. La selección de un vector de expresión apropiado dependerá del método de introducción del vector de expresión en las células hospedadoras. Un vector de expresión típico contiene: elementos de DNA procariotas que codifican un origen de replicación bacteriana y un gen de resistencia a los antibióticos para proporcionar el crecimiento y la selección del vector de expresión en el hospedador bacteriano; un sitio de clonación para inserción de una secuencia de DNA exógena, que, en este contexto, codificaría una o más enzimas específicas del camino de biosíntesis de los carotenoides; elementos de DNA eucariotas que controlan la iniciación de la transcripción del gen exógeno, tales como un promotor; y elementos de DNA que controlan el procesamiento de materiales transcritos, tales como una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación. Aquél puede contener también secuencias tales como sean necesarias para la integración eventual del vector en el cromosoma.
En una realización preferida, el vector de expresión contiene también un gen que codifica un marcador de selección tal como v.g. la higromicin-fosfotransferasa (van den Elzen et al., 1985), que está enlazado funcionalmente a un promotor. Ejemplos adicionales de genes que confieren resistencia a los antibióticos y son por tanto adecuados como marcadores seleccionables incluyen aquéllos que codifican la resistencia a neomicin-fosfotransferasa-kanamicina (Velten et al., 1984); el gen de resistencia a la kanamicina (NPT II) derivado de Tn5 (Bevan et al., 1983); el gen PAT descrito en Thompson et al., (1987); y la cloranfenicol-acetiltransferasa. Para una descripción general de vectores de expresión en plantas y genes marcadores seleccionables adecuados de acuerdo con la presente invención, véase Gruber et al., (1993). Como se ha reseñado anteriormente, es posible también omitir un marcador de selección adicional de una casete de expresión que comprende crtI bacteriano, cuyo producto génico se ha demostrado que confiere resistencia a los herbicidas blanqueantes. En esta realización específica, se prefiere que crtI se encuentre bajo el control de un promotor constitutivo o específico de tejidos. En una realización muy preferida, crtI está controlado por un promotor específico para y funcionalmente activo en tejidos o células verdes, fotosintéticamente activos.
Un elemento promotor empleado para controlar la expresión del gen de interés y el gen marcador, respectivamente, puede ser cualquier promotor compatible con plantas. Los mismos pueden ser promotores de genes de plantas, tales como el promotor de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bis-fosfato-carboxilasa (RUBISCO), o promotores de plásmidos inductores de tumores de Agrobacterium tumefaciens, como los promotores de nopalina-sintasa y octopina-sintasa, o promotores virales tales como los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) o el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia. Véase la Solicitud Internacional WO 91/19806, por ejemplo, para una revisión de promotores de plantas conocidos que son adecuados para uso en la presente invención.
Los promotores "específicos de tejidos" facilitan que la acumulación de uno o más de dichos productos génicos sea particularmente alta en el tejido en el cual deben expresarse los productos del camino biosintético de los carotenoides o xantofilas; alguna expresión puede existir en otras partes de la planta. Ejemplos de promotores específicos de tejidos conocidos incluyen el promotor de glutelina 1 (Kim et al., 1993; Okita et al., 1989; Zheng et al., 1993), el promotor de patatina de clase I dirigido a los tubérculos (Bevan et al., 1986); los promotores asociados con los genes ADPGPP del tubérculo de la patata (Muller et al., 1990); el promotor de \beta-conglicinina del haba de soja, conocido también como la proteína 7S, que impulsa la transcripción dirigida a las semillas (Bray, 1987); y promotores dirigidos a las semillas de los genes de zeína del endospermo del maíz (Pedersen et al., 1982). Un tipo adicional de promotor que puede utilizarse de acuerdo con la invención es un promotor de ubiquitina vegetal. Los promotores de ubiquitina vegetal son bien conocidos en la técnica, como ha sido puesto de manifiesto por Kay et al., (1987), y en el documento EP-A-0 342 926. Igualmente adecuados para la presente invención son promotores de actina, promotores de histona y promotores de tubulina. Ejemplos de promotores quiméricamente inducibles preferidos, tales como el promotor PR-1a del tabaco, se detallan en el documento EP-A-0 332 104. Otra categoría de promotores preferida es aquélla que es inducible por lesiones. Promotores preferidos de esta clase incluyen los descritos por Stanford et al., (1989), Xu et al., (1993), Logemann et al., (1989), Rohrmeier & Lehle, (1993), Firek et al., (1993), y Warner et al.,
(1993).
Las células vegetales, semillas, tejidos y plantas enteras contempladas en el contexto de la presente invención pueden obtenerse por cualquiera de varios métodos. Los expertos en la técnica apreciarán que la elección del método dependería del tipo de planta, es decir monocotiledónea o dicotiledónea, direccionada para la transformación. Tales métodos incluyen generalmente transferencia génica directa, transferencia génica inducida por productos químicos, electroporación, microinyección (Crossway et al., 1986; Neuhaus et al., 1987), transferencia génica mediada por Agrobacterium, aceleración balística de partículas utilizando, por ejemplo, dispositivos disponibles de Agracetus, Inc. Madison, Wisconsin, y Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (véase, por ejemplo, Sanford et al., Patente U.S. 4.945.050; y Mc Cabe et al., 1982), y análogos.
Un método para obtención de las presentes plantas transformadas o partes de las mismas es la transferencia génica directa en la cual células vegetales se cultivan o se desarrollan de cualquier otro modo en condiciones adecuadas en presencia de oligonucleótidos de DNA que comprenden la secuencia nucleotídica que se desea introducir en la planta o parte de la misma. La fuente de DNA donante es típicamente un plásmido u otro vector adecuado que contiene el gen o genes deseados. Por conveniencia, se hace referencia en esta memoria a plásmidos, entendiéndose que se contemplan también otros vectores adecuados que contengan el gen o genes deseados.
Cualquier tejido vegetal adecuado que contenga el plásmido puede tratarse por transferencia génica directa. Un tejido vegetal de este tipo incluye, por ejemplo, estructuras reproductivas en una etapa precoz de desarrollo, particularmente antes de la meiosis, y especialmente 1-2 semanas antes de la meiosis. Generalmente, los órganos reproductivos pre-meióticos están bañados en solución de plásmido, tales como, por ejemplo, por inyección de la solución de plásmido directamente en la planta en o cerca de los órganos reproductores. Las plantas se auto-polinizan luego, o se someten a polinización cruzada con polen de otra planta tratada de la misma manera. La solución de plásmido contiene por lo general aproximadamente 10-50 \mug de DNA en aproximadamente 0,1-10 ml por estructura floral, pero puede utilizarse una cantidad mayor o menor que ésta dependiendo del tamaño de la estructura floral particular. El disolvente es típicamente agua estéril, solución salina, o solución salina tamponada, o un medio vegetal convencional. Si se desea, la solución de plásmido puede contener también agentes que inducen o mejoran químicamente la absorción de plásmidos, tales como, por ejemplo, PEG, Ca^{2+} o análogos.
Después de la exposición de los órganos reproductores al plásmido, la estructura floral se desarrolla hasta la madurez y se recogen las semillas. Dependiendo del marcador plasmídico, la selección de las plantas transformadas con el gen marcador se hace por germinación o desarrollo de las plantas en un medio sensible al marcador, o preferiblemente un medio resistente al marcador. Por ejemplo, las semillas obtenidas de plantas tratadas con plásmidos que tienen el gen de resistencia a la kanamicina se mantendrán verdes, mientras que aquéllas que carezcan de este marcador serán semillas de tipo albino. La presencia de la transcripción del gen deseado de mRNA a partir de las mismas y la expresión del péptido pueden demostrarse ulteriormente por técnicas convencionales de transferencia Southern, Northern y Western.
En otro método adecuado para llevar a cabo la presente invención, se tratan protoplastos vegetales para inducir la absorción del plásmido. la preparación de protoplastos es bien conocida en la técnica e implica típicamente digestión de las células vegetales con celulasa y otras enzimas durante un periodo de tiempo suficiente para eliminar la pared celular. Típicamente, los protoplastos se separan de la mezcla de digestión por tamizado y lavado. Los protoplastos se suspenden luego en un medio apropiado, tal como, por ejemplo, medio F, medio CC, etc., típicamente a razón de 10^{4}-10^{7} células/ml. Se añade luego a esta suspensión la solución de plásmido arriba descrita y un inductor tal como polietilen-glicol, Ca^{2+}, virus Sendai o análogos. Alternativamente, los plásmidos pueden encapsularse en liposomas. La solución de plásmidos y protoplastos se incuba luego durante un periodo de tiempo adecuado, por lo general aproximadamente 1 hora a aproximadamente 25ºC. En algunos casos, puede ser deseable someter a choque térmico la mezcla por calentamiento breve a aproximadamente 45ºC, v.g. durante 2-5 minutos, y enfriar rápidamente hasta la temperatura de incubación. Los protoplastos tratados se someten luego a clonación y se seleccionan en cuanto a la expresión del gen o genes deseados, v.g. por expresión del gen marcador y técnicas de transferencia convencionales. Las plantas enteras se regeneran luego a partir de los clones de manera convencional.
La técnica de electroporación es similar, excepto que se aplica típicamente corriente eléctrica a la mezcla de plásmidos desnudos y protoplastos, en una cámara de electroporación en ausencia o presencia de polietilen-glicol, Ca^{2+} o análogos. La electroporación típica incluye 1-10 pulsos de 40-10.000 voltios de corriente continua durante un periodo de 1-2000 \mus con intervalos típicos de 0,2 segundos entre pulsos. Pueden utilizarse también pulsos de corriente alterna de severidad similar. De modo más general, un condensador cargado se descarga a través de la cámara de electroporación que contiene la suspensión de protoplastos del plásmido. Este tratamiento da como resultado un aumento reversible de la permeabilidad de las membranas biológicas y permite por tanto la inserción del DNA de acuerdo con la invención. Los protoplastos de la membrana sometida a electroporación renuevan su pared celular, se dividen y forman tejido de callo (véase, por ejemplo, Riggs et al., 1986).
Otro método adecuado para transformación de células diana implica el uso de Agrobacterium. En este método, se utiliza Agrobacterium que contiene el plásmido con la o las casetas del gen o genes deseados para infectar células vegetales e insertar el plásmido en el genoma de las células diana. Las células que expresan el gen deseado se seleccionan luego y se someten a clonación como se ha descrito arriba. Por ejemplo, un método para la introducción de un gen de interés en un tejido diana, v.g., un tubérculo, raíz, cereal o legumbre, por medio de un plásmido, v.g. un plásmido Ri y un Agrobacterium, v.g. A. rhizogenes o A. tumefaciens, consiste en utilizar un pequeño plásmido recombinante adecuado para clonación en Escherichia coli, en el cual se ha sometido a corte y empalme un fragmento de T-DNA. Este plásmido recombinante se abre por escisión en un sitio dentro del T-DNA. Se introduce por corte y empalme en esta abertura una pieza de DNA "pasajero". El DNA pasajero está constituido por el gen o genes de esta invención que deben incorporarse en el DNA de la planta así como un marcador seleccionable, v.g. un gen para resistencia a un antibiótico. Este plásmido se somete luego nuevamente a clonación en un plásmido mayor y se introduce después en una cepa de Agrobacterium que lleva un plásmido Ri sin modificar. Durante el crecimiento de la bacteria, tendrá lugar a veces una doble recombinación rara, dando como resultado bacterias cuyo T-DNA alberga una inserción: el DNA pasajero. Dichas bacterias se identifican y seleccionan por su supervivencia en medios que contienen el antibiótico. Estas bacterias se utilizan para insertar su T-DNA (modificado con DNA pasajero) en un genoma vegetal. Este procedimiento que utiliza A. rhizogenes o A. tumefaciens da lugar a células vegetales transformadas que pueden regenerarse en plantas viables sanas (véase, por ejemplo, Hinchee et al., 1988).
Otro enfoque adecuado consiste en bombardear las células con microproyectiles que están recubiertos con el DNA transformante (Wang et al., 1988), o están acelerados por una solución que contiene DNA en la dirección de las células a transformar por un impacto de presión, dispersándose con ello finamente en una niebla con la solución como resultado del impacto de presión (documento EP-A-0 434 616).
El bombardeo con microproyectiles ha sido propuesto como técnica eficaz de transformación para células, con inclusión de células de plantas. En Sanford et al., (1987), se informó que el bombardeo con microproyectiles era eficaz para suministrar ácido nucleico al citoplasma de células vegetales de Allium cepa (cebolla). Christou et al., (1988) consignaron la transformación estable de callo de soja con un gen de resistencia a la kanamicina por bombardeo con microproyectiles. Los mismos factores consignaron la penetración a aproximadamente 0,1% hasta 5% de células y encontraron niveles observables de actividad de la enzima NPTII y resistencia en los callos transformados de hasta 400 mg/l de kanamicina. McCabe et al., (1988) han consignado la transformación estable de Glycine max (soja) utilizando bombardeo con microproyectiles. McCabe et al. han consignado adicionalmente la recuperación de una planta R_{1} transformada a partir de una planta quimérica R_{0} (véase también Weissinger et al., 1988; Datta et al., 1990 (arroz); Klein et al., 1988a (maíz); Klein et al., 1988b (maíz); Fromm et al., 1990; y Gordon-Kamm et al., 1990 (maíz)).
Alternativamente, un plástido vegetal puede transformarse directamente. La transformación estable de cloroplastos ha sido consignada en plantas superiores, véase, por ejemplo, SVAB et al., (1990); SVAB y Maliga, (1993); Staub y Maliga (1993). El método está basado en el suministro con cañón de partículas de DNA que contiene un marcador seleccionable y el direccionamiento del DNA al genoma del plástido por recombinación homóloga. En tales métodos, la expresión de genes de plástidos puede realizarse por el uso de un promotor de genes de plástidos o por trans-activación de un transgén silencioso transportado por un plástido posicionado para expresión de una secuencia promotora selectiva tal como la reconocida por la RNA-polimerasa T7. El gen del plástido silencioso se activa por expresión de la RNA-polimerasa específica a partir de una construcción de expresión nuclear y direccionamiento de la polimerasa al plástido mediante el uso de un péptido de tránsito. La expresión específica de tejido puede obtenerse en un método de este tipo por el uso de una RNA-polimerasa específica codificada por el núcleo y dirigida al plástido, expresada por un promotor específico de tejidos vegetales adecuado. Un sistema de este tipo ha sido consignado en McBride et al., (1994).
La lista de posibles métodos de transformación dada arriba a modo de ejemplo no se reivindica como lista completa, y no tiene por objeto limitar en modo alguno el alcance de la invención.
La presente invención comprende también por tanto material de plantas transgénicas, seleccionado del grupo constituido por protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, óvulos, cigotos, etc., y especialmente plantas enteras, que ha sido transformado por medio del método de acuerdo con la invención y comprende el DNA recombinante de la invención en forma expresable, así como procesos para la producción de dicho material de plantas transgénicas.
Los transformantes positivos se regeneran en plantas siguiendo procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, McCornick et al., 1986). Estas plantas pueden cultivarse luego, y polinizarse o bien con la misma cepa transformada o cepas diferentes antes que pueda evaluarse la progenie en cuanto a la presencia de las propiedades deseadas y/o la extensión en la que se expresan las propiedades deseadas y que se identifique el híbrido resultante que tenga la característica fenotípica deseada. Una primera evaluación puede incluir, por ejemplo, el nivel de resistencia bacteriana/fúngica de las plantas transformadas. Pueden desarrollarse dos o más generaciones para garantizar que la característica fenotípica en cuestión se mantiene de manera estable y se hereda y se recogen posteriormente las semillas para asegurar que se ha alcanzado el fenotipo u otra propiedad deseada.
Dentro del alcance de la presente invención están comprendidas también plantas transgénicas, en particular plantas transgénicas fértiles transformadas por medio del método de la invención y su progenie asexual y/o sexual, las cuales exhibirán todavía la propiedad o propiedades nuevas y deseables debido a la transformación de la planta madre.
Debe entenderse que el término ‘progenie’ abarca a la vez la progenie de plantas transgénicas generada "asexualmente" y "sexualmente". Debe entenderse también que esta definición incluye todos los mutantes y variantes que pueden obtenerse por medio de procesos conocidos, tales como por ejemplo fusión celular o selección de mutantes y que exhiben todavía las propiedades características de la planta transformada inicial, junto con todos los productos de cruzamiento y fusión del material vegetal transformado.
Partes de plantas, tales como por ejemplo flores, tallos, frutos, hojas, raíces originadas en las plantas transgénicas o su progenie previamente transformadas por medio del método de la invención y constituidas por consiguiente al menos en parte por células transgénicas, son también un objeto de la presente invención.
Los ejemplos siguientes son ilustrativos pero no limitantes de la presente invención.
Depósito del material biológico
Cepas de E. coli portadoras de las casetes de expresión de acuerdo con la presente invención han sido depositadas conforme al Tratado de Budapest con la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) en Braunschweig, Alemania bajo los Números de Acceso siguientes:
Cepa No. de Acceso
PRiceCYC TOP10 (casete del plásmido B) DMS 12714
PbaaI42 TOP10 (casete del plásmido A) DSM 12713
Ejemplos Introducción de provitamina A (\beta-caroteno) y biosíntesis de xantofila en el endospermo del arroz (Oryza sativa) exento de carotenoides Formación de fitoeno (Burkhardt et al., 1997)
Investigaciones bioquímicas previas utilizando isopentenil-difosfato radiomarcado han demostrado que el endospermo del arroz posee la sintasa GGPP enzimáticamente activa, proporcionando con ello un precursor importante para la biosíntesis de los carotenoides. Por esta razón, la variedad modelo de arroz japonés Taipei 309 se transformó por bombardeo con microproyectiles con un cDNA que codificaba la fitoeno-sintasa de narciso atrompetado (Narcissus pseudonarcissus; (ACC. No. X78814, Schledz y Beyer, 1996, Schledz et al., 1996) bajo el control de un promotor constitutivo y bajo el control de un promotor específico de endospermo. En las plantas transgénicas de arroz, se ha demostrado que la enzima de narciso atrompetado es activa por la acumulación in vivo del caroteno no coloreado fitoeno en el endospermo del arroz. Así, se demostró por primera vez que era posible en principio modificar por ingeniería genética el primer paso enzimático específico de los carotenoides en la biosíntesis de carotenoides en un tejido no fotosintético, carente de carotenoides.
Introducción del camino biosíntético de los carotenoides hacia licopeno, \beta-caroteno (Provitamina A) y xantofilas en el endospermo del arroz Construcción del plásmido
(Para técnicas estándar de biología molecular véase Sambrook et al., 1989. Para una representación esquemática de las construcciones, véase la Fig. 4). Los genes estructurales codificantes de las enzimas biosintéticas de carotenoides eran:
Psy: fitoeno-sintasa de Narcissus pseudonarcissus (Acc. No. X78814).
crtI: caroteno-desaturasa de la bacteria Erwinia uredovora fusionada en la secuencia de tránsito del guisante Rubisco (Misawa et al., 1993).
cyc: licopeno-ciclasa de Narcissus pseudonarcissus (Acc. No. X98796).
Construcción de pB19hpc (designado "plásmido A" en el texto)
Un fragmento de DNA que llevaba el gen de la fitoeno-desaturasa intacto (crtI) de Erwinia uredovora con la secuencia del péptido de tránsito de la subunidad pequeña del guisante Rubisco (tp) aguas abajo del promotor 35S de CaMV y aguas arriba de la señal de poliadenilación nos 3' ha sido construido por Misawa et al. (1993) y se ha ligado a pUC19 digerido con HindIII/EcoRI para obtener el plásmido pUCET4. La casete de expresión crtI se escindió de pUCET4 como un fragmento HindIII/EcoRI y se ligó a pBluescriptKS digerido con HindIII/EcoRI, obteniéndose el plásmido pBaal1. El plásmido pGt1PsyH (Burckhardt et al., (1997) que llevaba una casete de expresión de psy constituida por el cDNA de fitoeno-sintasa de Narcissus pseudonarcissus (Acc. No. X78814) bajo el control del promotor de glutelina 1 del arroz (Gt1; Kim et al., 1993; Okita et al., 1989; Zheng et al., 1993) y la señal de poliadenilación nos 3' se digirió con SacII y se terminó en extremos romos utilizando DNA-polimerasa T4. Para obtener la casete de expresión psy, se llevó a cabo una segunda digestión con KpnI. El fragmento SacII (romo)/KpnI se ligó luego a pBaal1 digerido con XhoI (romo)/KpnI para obtener el plásmido pBaal2 que llevaba casetes de expresión crtI y
psy.
Los sitios polienlazadores de pUC18 se reemplazaron para contener los sitios de restricción siguientes en el orden que se indica a continuación: Hind III, I-SceI, KpnI, NotI, SmaI, IsceI, EcoRI. El plásmido pUC18M resultante se digirió con KpnI y NotI. Un fragmento de DNA que llevaba las casetes de expresión crtI y psy se escindió de pBaal2 utilizando KpnI y NotI y se ligó al pUC18M digerido mencionado anteriormente. El plásmido obtenido pBaal3, contiene las casetes de expresión dobles flanqueadas por dos sitios de restricción de meganucleasa
(I-SceI).
La casete de expresión del gen de higromicina-fosfotransferasa aph IV que contenía aph IV bajo el control del promotor CaMV35S y la señal de poliadenilación de CaMV35S se escindió de pRice (véase la construcción del plásmido B) como un fragmento KpnI y se ligó a pBaal3 digerido con KpnI. Los plásmidos pBaal42 y pBaal41 obtenidos contienen la casete de resistencia a la higromicina en la misma orientación que la casete de expresión psy (pBaal42) o en la orientación opuesta (pBaal41).
El vector pBin19 (Bevan, 1984) se digirió con EcoRI y HindIIIII y una secuencia de oligonucleótido sintético que contenía los sitios de restricción siguientes en el orden que se indica a continuación: Hind III, I-SceI, KpnI, NotI, SmaI, IsceI, EcoRI se introdujo utilizando un protocolo estándar, lo cual proporcionó pBin19M.
Las casetes de expresión de crtI, psy y aph IV se escindieron de pBaal42 utilizando los sitios de meganucleasa I-sceI y se ligaron a pBin19M después de digestión con I-sceI. El plásmido resultante pB19hpc se utilizó luego para transformación.
Construcción de pZCycH (designado "plásmido B" en el texto)
El promotor de glutelina 1 Gt1 se escindió de pKS1 (Okita et al., 1989) utilizando EcoRI/BglII y se ligó a pV34 digerido con BamHI/MunI (Futtere y Potrykus, no publicado) entre dos sitios de meganucleasa I-Sce1 para obtener el plásmido pV34Gt1. La casete de expresión del gen de higromicina-fosfotransferasa aph IV que contenía la señal de poliadenilación 35S de CaMV seguida por aph IV bajo el control del promotor 35S de CaMV y una segunda señal de poliadenilación 35S de CaMV posterior se escindió de pCIB900 (Wünn et al., 1996) utilizando SalI y SacI. Después de ligación de un adaptador XhoI para el sitio SalI al fragmento obtenido, la casete se ligó a pV34Gt1 para obtener el Plásmido (pRice). Se escindió la licopeno-ciclasa cyc de Narcissus pseudonarcissus (Acc. No. X98796) se escindió del plásmido pGEM4CYC (Bonk et al., 1997) utilizando Ecl136II y BamHI. Después de tratamiento con fragmento Klenow, se ligó la cyc a pRice digerido con Ecl36II para obtener pRiceCYC.
El vector pPZP100 (Hajdukiewicz et al., 1994) se digirió con EcoRI y HindIIIII y se introdujo una secuencia oligonucleotídica sintética que contenía los sitios de restricción siguientes en el orden que se indica a continuación: HindIIIII, I-SceI, KpnI, NotI, SmaI, IsceI, y EcoRI utilizando un protocolo estándar, lo que proporcionó
pPZP100M.
La casete doble cyc aph IV se escindió de pRiceCYC utilizando la meganucleasa IsceI y se ligó a pPZP100M digerido con IsceI para obtener el plásmido de transformación pZCycH.
Inducción de Callo y Transformación
Inducción de callo: Semillas inmaduras de la variedad cultivada de arroz japonica TP 309 en la etapa de leche se recogieron de plantas cultivadas en invernadero, se esterilizaron en la superficie en etanol al 70% (v/v) durante 1 min, se incubaron en hipocloruro de calcio al 6% durante 1 hora en un agitador de sacudidas y se lavaron 3-5 veces con agua destilada estéril. Los embriones inmaduros se aislaron luego de las semillas esterilizadas bajo un microscopio binocular en un banco limpio con corriente de aire y se cultivaron en medio NB (sales N6 y vitaminas B5, complementado con 30 g/l de maltosa, 500 mg/l de prolina, 300 mg/l de hidrolizado de caseína, 500 mg/l de glutamina, y 2 mg/l de 2,4-D, pH 5,8). Después de 4-5 días, se retiraron los coleóptilos, y los escudetes hinchados se subcultivaron en medio NB reciente durante 3-5 días hasta la inoculación de Agrobacterium.
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Transformación mediada por Agrobacterium : Embriones inmaduros precultivados durante una semana se sumergieron en suspensión de células LBA 4404 de Agrobacterium tumefaciens como se ha descrito (Uze et al., 1997). Para co-transformación de los dos vectores separados, pZPsC y pZCycH, se utilizó para inoculación LBA4404/pZPsC (DO_{600} = 2,0) mezclado con un volumen igual de LBA4404/pZCycH (DPO_{600} = 1,0) después de inducción con acetonsiringona. Los embriones precultivados inoculados se co-cultivaron en medio NB complementado con acetonsiringona 200 mM durante 3 días, se subcultivaron en medio de recuperación (NB con 250 mg/l de cefotaximo) durante 1 semana y se transfirieron luego a medio de selección NB en presencia de 30 mg/l de higromicina y 250 mg/l de cefotaximo durante 4-6 semanas. Las plantas se regeneraron a partir de callos resistentes recuperados en medio NB complementado con 0,5 mg/l de NAA y 3 mg/l de BAP en 4 semanas, se enraizaron y se transfirieron a un invernadero.
Transferencia Southern
Para demostrar la presencia de los transgenes, se llevaron a cabo transferencias Southern de acuerdo con métodos estándar (Sambrook et al., (1989) utilizando las sondas marcadas homólogas derivadas de fitoeno-sintasa, CrtI y ciclasa.
Análisis de los Pigmentos Carotenoides
Semillas (1 g) de plantas R0 se descascarillaron y se trataron durante 8 h con papel de esmeril en una máquina de sacudidas, para eliminar la cubierta de la semilla. Por inspección visual, las líneas transformadas mostraron un color amarillento claramente detectable debido a la presencia de carotenoides. Además, era detectable un patrón de segregación que en algunos casos se encontraba muy próximo a la relación esperada de 3 (amarillo) a 1
(blanco).
La suma de semillas de líneas individuales (50, de cada una) se trituraron a un polvo fino utilizando un micro-desmembrador (Braun, Melsungen). Se extrajo éste repetidas veces con acetona para completar la descoloración. Los extractos reunidos se secaron en corriente de nitrógeno. El residuo se disolvió en cloroformo y se aplicó cuantitativamente a análisis HPLC utilizando un sistema Waters HPLC equipado con un detector de red de fotodiodos y una columna de fase inversa C_{30} (YMC Europe GmbH). La separación se llevó a cabo utilizando sistema disolvente A:MeOH:terc-butilmetil-éter (1:1, v/v); B: MeOH:terc-butilmetil-éter:H_{2}O (6:1,2:1,2, v/v/v) con empleo de un gradiente 100% B a 43% B en el transcurso de 25 min, y luego hasta 0% B en el transcurso de 75 min adicionales. Se mantuvieron estas condiciones finales durante 10 min adicionales antes de la re-equilibración. Ejemplos de los resultados obtenidos se dan en Fig. 3A para un control sin transformar, en Fig. 3B para una línea que llevaba solamente el plásmido A y en Fig. 3C para una línea que llevaba el plásmido A and. Evidentemente, los carotenoides se acumulan en los transformantes. Los controles exhibían algunas cantidades traza de carotenoides que pueden atribuirse en su mayor parte a la cubierta de las semillas que es difícil de separar por completo. Entre los carotenoides detectados en las semillas transformadas, el \beta-caroteno (provitamina A) representa el producto principal (hasta 60%). Adicionalmente, el camino formador de xantofila era activo, conduciendo la formación de luteína y zeaxantina, así como de ciertas cantidades de carotenoides epoxidados. Se llega a la conclusión de que esta última parte del camino es inducida o bien por la transformación o por productos derivados de la transformación. Alternativamente, el camino formador de xantofila se expresa constitutivamente en el endospermo del arroz, dando como resultado la formación de las xantofilas zeaxantina y luteína más algunos componente adicionales menores que representan xantofilas
epoxidadas.
Las líneas transformadas con plásmido A solo, exhibían en principio el mismo patrón de carotenoides; sin embargo, el contenido de carotenoides era generalmente inferior, de tal modo que las conclusiones anteriores se extienden a la licopeno-ciclasa en el endospermo del arroz.
Especialmente, la presencia de luteína y zeaxantina se consideran como un valor añadido inesperado debido a sus efectos positivos, v.g. sobre la vista (véase, v.g. Brown et al., 1998; Schalch, 1992).
Evidentemente, son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención a la vista de las enseñanzas que anteceden. Por consiguiente, debe entenderse que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede practicarse de modo distinto que el descrito específicamente.
El precursor geranilgeranil-difosfato se encuentra ubicuamente en el material vegetal
Para ensayar en cuanto a la presencia de GGPP en otros tejidos distintos del arroz, se realizaron experimentos de incubación análogamente a lo descrito para el endospermo del arroz con endospermo aislado de dos variedades de trigo de laboratorio, dos variedades de cebada, y fruto de bananero Cavendish. Los granos inmaduros de trigo y cebada se descascarillaron, se exprimió el endospermo y se separó el embrión. Se llevaron a cabo experimentos de incubación en tampón Tris/HCl 100 mM de pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM, MnCl_{2} 1 mM, ATP 3 mM en presencia de 0,5 \muCi de
[I-^{14}C] isopentenil-difosfato durante 6 h a 25ºC. Los ensayos individuales se complementaron con fosfatasa alcalina para permitir la desfosforilación de los prenil-difosfatos formados. Después de 3-6 h, los materiales solubles en lípidos con inclusión de los prenil-alcoholes correspondientes se aislaron por extracción con cloroformo/metanol (2/1, v/v). Esto fue seguido por análisis HPLC, como se ha indicado arriba.
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En el endospermo de las variedades de trigo examinadas (las dos cuales están esencialmente exentas de carotenoides), se observó una señal muy pronunciada que, utilizando GGPP auténtico desfosforilado (producido con ayuda de GGPP-sintasa recombinante de Sinapis alba) se comprobó que representaba geranilgeraniol. Así pues, la instalación por transformación de la biosíntesis de provitamina A en el trigo parece tan factible como en el arroz. Se observaron cantidades menores pero detectables de GGPP en la forma del alcohol correspondiente en la cebada como expresión del hecho de que el endospermo de la cebada exhibe algún pequeño indicio de formación de carotenoides. Análogamente, el bananero Cavendish produce carotenoides y por consiguiente la presencia de actividades formadoras de GGPP que se observaron especialmente en estado maduro no era sorprendente.
Inducción por CPTA de genes de la biosíntesis de carotenoides
El inhibidor de la licopeno-ciclasa CPTA, conocido desde hace largo tiempo (hidrocloruro de 2-(4-clorofeniltio)trietilamina) y compuestos afines (véase, v.g. El-Sayed Osman et al., 1984; Fosket y Radin, 1982) mimetiza, con respecto a la acumulación de licopeno, la transformación con el plásmido A. Tratando de mostrar una regulación creciente de los genes biosintéticos de carotenoides, los autores de la invención sintetizaron CPTA de acuerdo con el método dado por Scheutz y Baldwin (1957) aplicando este compuesto en una solución acuosa 1 mM a flores de narciso atrompetado. Este tejido fotosintéticamente inactivo respondió por acumulación de licopeno, como era de esperar. Sin embargo, lo que resulta inexplicable por la acción primaria de CPTA (¡un inhibidor!) el contenido de carotenoides estaba casí duplicado. Por esta razón, se llevaron a cabo análisis de Transferencias Northern y Western para demostrar una posible inducción de la abundancia en transcritos que codifican enzimas biosintéticas de carotenoides o en la abundancia de enzimas.
La Fig. 5A da los resultados de las transferencias Northern Se aisló RNA total de flores sin tratar (pista 1) y tratadas con CPTA. El RNA inmovilizado se separó repetidas veces para permitir la hibridación subsiguiente con sondas para fitoeno-sintasa (B), fitoeno-desaturasa (C), \zeta-caroteno-desaturasa y licopeno-ciclasa. Es evidente que, con la exención de la \zeta-caroteno-desaturasa, todos los RNAs carotenogénicos específicos, con inclusión de la licopeno-ciclasa han aumentado en abundancia.
Para el análisis por transferencia Western (véase Fig. 5B), se aisló la proteína total de flores sin tratar y tratadas con CPTA y, después de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (30 \mug de proteína por pista), se transfirió a membranas de nitrocelulosa. Las transferencias eran las desarrolladas con anticuerpos dirigidos contra fitoeno-sintasa (A), fitoeno-desaturasa (B), \zeta-caroteno-desaturasa (C) y licopeno-ciclasa. Es evidente que, al nivel de proteínas, tiene lugar un aumento en abundancia de enzimas por tratamiento con CPTA.
Con los datos para arroz proporcionados anteriormente, se llega a la conclusión de que los carotenoides (o productos derivados de los mismos) pueden inducir genéticamente la formación de carotenoides en una clase de mecanismo de realimentación.
La presente invención proporciona, así pues, medios para introducir por ingeniería genética el camino biosintético de los carotenoides en tejidos exentos de carotenoides o para incrementar la productividad de caminos pre-existentes de biosíntesis de carotenoides. El método puede utilizarse para aumentar el valor nutritivo, la farmacología o el aspecto visual de semillas, frutos, tubérculos, flores u hojas.
La invención es fundamentalmente útil en el aumento de las demandas nutritivas, en los casos en que no es particularmente relevante producir grandes cantidades de carotenoides. El arroz, por ejemplo, en su forma molida está constituido por el endospermo, que no contiene carotenoides coloreados detectables. Éstos están presentes en la cubierta de la semilla que se separa durante el procesamiento. Este procesamiento se requiere para permitir el almacenamiento de los granos de arroz a largo plazo.
La invención representa el primer ejemplo de una modificación de novo por ingeniería genética de un camino de biosíntesis de carotenoides, y es aplicable a otros tejidos de cosechas agronómicamente importantes exentas de carotenoides, por ejemplo otras semillas de cereales, o a tejidos de raíces que están exentos de carotenoides coloreados o no coloreados. Esto no excluye el potencial del método para aumentar o modificar carotenoides pre-existentes.
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Claims (22)

1. Un método de producción de células vegetales que acumulan carotenoides, células que están normalmente exentas de carotenoides, comprendiendo dicho método transformar material vegetal con una molécula de DNA aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende:
(a) una casete de expresión capaz de dirigir la producción en dichas células de una fitoeno-sintasa derivada de una planta; y
(b) una casete de expresión capaz de dirigir la producción en dichas células de una fitoeno-desaturasa derivada de una bacteria.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha fitoeno-desaturasa es el gen CrtI de Erwinia uredovora.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el cual dicha fitoeno-desaturasa está fusionada con un péptido de tránsito plastídico adecuado.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicha fitoeno-desaturasa se expresa bajo el control de un promotor específico o constitutivo de tejidos.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual dicha fitoeno-desaturasa se expresa bajo el control de un promotor constitutivo.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dicha fitoeno-sintasa se expresa bajo el control de un promotor específico de tejidos.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual dicha fitoeno-sintasa se deriva de Narcissus pseudonarcissus.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el cual dicho DNA comprende adicionalmente un polinucleótido que proporciona un marcador seleccionable.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual dicho material vegetal se transforma por medio de un Agrobacterium que comprende dicho DNA.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual dicha célula vegetal es una célula vegetal de arroz.
11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el cual dicha célula es una célula de endospermo.
12. Una célula vegetal transformada que puede obtenerse por un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Una célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 12, que es una célula del endospermo del arroz.
14. Una molécula de DNA aislada que comprende una secuencia nucleotídica que comprende:
(a) una casete de expresión capaz de dirigir la producción en una célula vegetal, célula que está normalmente exenta de carotenoides, de una fitoeno-sintasa derivada de una planta; y
(b) una casete de expresión capaz de dirigir la producción en dicha célula de una fitoeno-desaturasa derivada de una bacteria.
15. Un DNA de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual dicha fitoeno-desaturasa es el gen CrtI de Erwinia uredovora.
16. Un DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en el cual dicha fitoeno-desaturasa está fusionada con un péptido de tránsito plastídico adecuado.
17. Un DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el cual dicha fitoeno-desaturasa se expresa bajo el control de un promotor específico o constitutivo de tejidos.
18. Un DNA de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual dicha fitoeno-desaturasa se expresa bajo el control de un promotor constitutivo.
19. Un DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el cual dicha fitoeno-sintasa se expresa bajo el control de un promotor específico de tejidos.
20. Un DNA de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual dicha fitoeno-sintasa se deriva de Narcissus pseudonarcissus.
21. Un DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en el cual dicho DNA comprende adicionalmente un polinucleótido que proporciona un marcador seleccionable.
22. Un DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, en el cual la secuencia nucleotídica está optimizada para la expresión en una planta.
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