DE10064454A1 - Veränderung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen durch genetische Veränderung des Shikimatweges - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere Vitamin E, Vitamin K und/oder Ubichinon durch Kultivierung von Organismen, insbesondere Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp einen genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen, sowie die transgenen Organismen selbst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere Vitamin E, Vitamin K und/oder Ubichinon durch Kultivierung von Organismen, insbesondere Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp einen genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen, sowie die transgenen Organismen selbst.

Organismen, insbesondere Pflanzen, weisen eine Reihe von Stoff­ wechselprodukten auf, die als Feinchemikalien einen hohen wirt­ schaftlichen Wert haben. Als Feinchemikalien sind beispielsweise aromatische Aminosäuren, Salicylsäurederivate, Phenylpropanoide, Flavonoide, Stilbene, Xanthone und Chinone, insbesondere die gemischten Prenyllipid-Verbindungen mit Vitamin E oder Vitamin K Aktivität zu nennen.

In biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von Fein­ chemikalien werden Organismen, die in der Lage sind diese Feinchemikalien herzustellen, kultiviert und die gewünschten Feinchemikalien aus den Organismen isoliert.

Für wirtschaftliche Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Feinchemikalien, aber auch für die Verwendung der Organismen als prozessierte oder nicht prozessierte Lebens- oder Futter­ mittel, ist es wünschenswert, den Gehalt an Feinchemikalien in den Organismen gezielt zu verändern, wie beispielsweise den Gehalt der gewünschten Feinchemikalie zu erhöhen und/oder den Metabolitfluß zu nicht gewünschten Feinchemikalien zu hemmen.

Wirtschaftlich bedeutende Feinchemikalien sind beispielsweise Plastochinone, Ubichinone sowie Verbindungen mit Vitamin E- oder Vitamin K-Aktivität, die eine Isoprenoid-Seitenkette aufweisen, die mit einem aromatischen Kern verbunden ist.

Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E- Aktivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell­ schaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die Gruppe der Toco­ pherole (1a-d) weist eine gesättigte Seitenkette auf, die Gruppe der Tocotrienole (2a-d) eine ungesättigte Seitenkette:

1a, α-Tocopherol: R¹ = R² = R³ = CH₃
1b, β-Tocopherol: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
1c, γ-Tocopherol: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
1d, δ-Tocopherol: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

2a, α-Tocotrienol: R¹ = R² = R³ = CH₃
2b, β-Tocotrienol: R¹ = R² = CH₃, R² = H
2c, γ-Tocotrienol: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
2d, δ-Tocotrienol: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin E alle vor­ stehend erwähnten Tocopherole und Tocotrienole mit Vitamin-E- Aktivität verstanden.

Diese Verbindungen mit Vitamin-E-Aktivität sind wichtige natür­ liche fett-lösliche Antioxidantien. Ein Mangel an Vitamin E führt bei Menschen und Tieren zu pathophysiologischen Situationen. Vitamin E-Verbindungen haben daher einen hohen wirtschaftlichen Wert als Zusatzstoffe im Food- und Feed-Bereich, in pharma­ zeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.

Die in der Natur vorkommenden Verbindungen mit Vitamin K-Aktivität sind Derivate des 1,4-Naphthochinons (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 5., 488-506, Vitamin K). Phyllochinon (frühere Bezeichnung: Vitamin K₁) weist eine größten­ teils gesättigte Seitenkette auf, während die Gruppe der Mena­ chinone-n (frühere Bezeichnung: Vitamin K₂) eine ungesättigte Seitenkette mit 4 bis 13 Isoprenylresten aufweist.

In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin K alle Ver­ bindungen mit Vitamin K-Aktivität verstanden, insbesondere die vorstehend erwähnten Verbindungen.

Ausgangspunkt der Biosynthese der Isoprenoidseitenkette ist Iso­ pentenylpyrophosphat (IPP). IPP steht im Gleichgewicht mit seinem Isomer Dimethylallyl Pyrophosphat (DMAPP). Eine Kondensation von IPP mit DMAPP in Kopf-Schwanz Anlagerung ergibt das Monoterpen (C10) Geranyl-Pyrophosphat (GPP). Die Addition von weiteren IPP Einheiten führt zum Sesquiterpen (C15) Farnesy-Pyrophosphat (FPP) und zum Diterpen (C20) Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat (GGPP).

Phyllochinon enthält eine C20 Phytyl-Kette, in der nur die erste Isopren-Einheit eine Doppelbindung enthält. GGPP wird durch die Geranylgeranyl-Pyrophosphat-Oxidoreduktase (GGPPOR) zum Phytyl- Pyrophosphat (PPP) umgeformt, dem Ausgangsstoff für die weitere Bildung von Tocopherolen.

Bei den Ringstrukturen der gemischten Prenyllipide, die zur Bildung der Vitamine E und K führen, handelt es sich um Chinone, deren Ausgangsmetabolite aus dem Shikimat-Weg stammen.

Chorismat wird ausgehend von Erythrose-4-Phosphat und Phos­ phoenolpyruvat (PEP) durch deren Kondensation zu 3-deoxy-D- Arabino-heptulosonat-7-Phosphat (DAHP) über die Zwischenstufen 3'-Dehydroquinat, 3'-Dehydroshikimat, Shikimat, Shikimat-3- Phosphat und 5'-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat gebildet. Dabei wird das Erythrose-4-Phosphat vom Calvinzyklus gebildet und das PEP von der Glykolyse bereitgestellt.

In höheren Pflanzen wird Tyrosin ausgehend von Chorismat über Prephenat und Arogenat gebildet. Die aromatische Aminosäure Tyrosin wird in Hydroxyphenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homogentisinsäure überführt wird.

Die Homogentisinsäure wird anschließend an Phytylpyrophosphat (PPP) bzw. Geranylgeranylpyrophosphat gebunden, um die Vorläufer von α-Tocopherol und α-Tocotrienol, das 2-Methyl-6-phytylhydro­ chinon bzw. das 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon zu bilden. Durch Methylierungsschritte mit S-Adenosylmethionin als Methyl- Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Dimethyl-6-phytylquinol, dann durch Zyklisierung γ-Tocopherol und durch nochmalige Methylierung α-Tocopherol.

Es ist bekannt, durch Überexpression bzw. Herunterregulation von Biosynthesegenen des Tocopherolbiosyntheseweges, unter dem in der vorliegenden Erfindung der Biosyntheseweg von Hydroxyphenylpyruvat bis Tocopherol verstanden wird, den Gehalt an Vitamin E in Pflanzen zu modifizieren.

WO 97/27285 beschreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD).

WO 99/04622 bzw. D. DellaPenna et al., Science 1998, 282, 2098-2100 beschreiben Gensequenzen codierend für eine γ-Toco­ pherolmethyltransferase aus Synechocystis PCC6803 und Arabidopsis thaliana und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.

Ferner ist bekannt, durch Überexpression bzw. Herunterregulation von Biosynthesegenen des Biosyntheseweges der Isoprenoid-Seiten­ kette, den Gehalt an Vitamin E in Pflanzen zu modifizieren.

WO 99/23231 zeigt, daß die Expression einer Geranylgeranyl- Reductase in transgenen Pflanzen eine gesteigerte Tocopherol­ biosynthese zur Folge hat.

WO 00/08169 beschreibt Gensequenzen codierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und eine Geranyl-Geranyl- Pyrophosphat Oxidoreduktase un deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.

Alle diese Methoden liefern zwar Organismen, insbesondere Pflanzen, die einen modifizierten Gehalt an der Feinchemikalie Vitamin E aufweisen, dennoch ist oft die Höhe des Gehalts an Vitamin E für Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch Isolierung aus diesen transgenen Organismen noch nicht zufrieden­ stellend.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde ein weiteres Ver­ fahren zur Herstellung von Feinchemikalien durch Kultivieren von Organismen, bzw. transgene Organismen die Feinchemikalien her­ stellen können, mit optimierten Eigenschaften zur Verfügung zu stellen, die die geschilderten Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.

Demgemäß wurde ein Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien gefunden, indem man Organismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp einen genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen.

Unter Shikimatweg wird in der vorliegenden Erfindung, ins­ besondere für höhere Pflanzen der vorstehend beschriebene Bio­ syntheseweg ausgehend von D-Erythrose-4-Phosphat über Shikimat, Chorismat, Prephenat, Arogenat, Tyrosin bis einschließlich zu 4-Hydroxyphenylpyruvat verstanden (G. Michal, Biochemical Pathways, Biochemie-Atlas, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, 1999, Seite 59 bis 60,Abb. 4.7-1 und Kapitel 4.7.1)

Vorzugsweise wird in der vorliegenden Erfindung unter Shikimat­ weg der Stoffwechselweg von Shikimat bis 4-Hydroxyphenylpyruvat, besonders bevorzugt der Stoffwechselweg von Chorismat bis 4-Hydroxyphenylpyruvat verstanden, wobei für Pflanzen der Stoffwechselweg ab Chorismat über Prephenat, Arogenat und Tyrosin verläuft.

Unter Feinchemikalien werden Stoffwechselprodukte des Organismus verstanden, die aus dem Shikimatweg resultieren. Der Shikimatweg beginnt dabei bei D-Erythrose-4-Phosphat und endet bei 4-Hydroxy­ phenylpyruvat, wie vorstehend beschrieben. Für diese Stoff­ wechselprodukte stellen die Ausgangsverbindung D-Erythrose-4- Phosphat, die Endverbindung 4-Hydroxyphenylpyruvat sowie alle, vorstehend erwähnten, Zwischenstufen des Shikimatweges, die Ausgangsverbindungen, nachstehend auch Zwischenverbindungen bezeichnet, dar, die biosynthetisch vom Organismus in die Stoff­ wechselprodukte umgewandelt werden.

Bevorzugte Feinchemikalien sind die aromatischen Aminosäuren, wie beispielsweise Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, Salicyl­ säurederivate, Folsäurederivate, Phenylpropanoide, wie beispiels­ weise Lignin, Lignane oder Coumarine, insbesondere Scopoletin oder Scopolin, Flavonoide, wie beispielsweise Chalcone, Flava­ none, Flavanole, Anthocyanidine oder Isoflavonoide, Stilbene, Xanthone, oder Chinonderivate, wie beispielsweise Vitamin E, Vitamin K, Ubichinone, Plastochinone oder Shikonin.

Besonders bevorzugte Feinchemikalien sind Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon, insbesondere Vitamin E.

Je nachdem ob die genetische Veränderung des Shikimatweges zu einer Erhöhung oder Erniedrigung des Metabolitflusses zu einer bestimmten Zwischenverbindung - die Teil des Shikimatweges ist - führt, erhöht sich bzw. erniedrigt sich der Gehalt der Fein­ chemikalie die biosynthetisch im Organismus aus dieser Zwischen­ verbindung hergestellt wird. Unter genetischer Veränderung des Shikimatweges wird somit vorzugsweise die Erhöhung oder Erniedrigung des Metabolitflußes zu einer Zwischenverbindung des Shikimatweges verstanden.

Genetische Veränderung des Shikimatweges die zu einer Erhöhung des Metabolitflusses zu einer Zwischenverbindung und damit der entsprechenden Feinchemikalie führen, sind beispielsweise die folgenden Maßnahmen A, B oder C:

• 1. A: Erhöhung der Aktivität mindestens eines Enzyms des Shikimat­ weges des Wildtyps, beispielsweise durch Überexpression von Genen des Shikimat­ weges, die Proteine mit dieser enzymatischen Aktivität codieren, durch das Ausschalten von negativen Regulations­ mechanismen von zur Zwischenverbindung führenden Stoff­ wechselwegen, wie beispielsweise das Ausschalten der Feed­ back-Inhibierung oder das Einbringen von orthologen Genen die im gewünschten Organismus keiner Regulation unterliegen.
• 2. B: Einbringen mindestens eines Gens in den Organismus zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist und das den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrückt. Dieses Gen kann beispielsweise durch die neue Genfunktion eine Erhöhung des Stoffflusses zu der Zwischenverbindung bewirken, bei der die Überbrückung endet.
• 3. C: Inaktivierung von Genen die Enzyme kodieren, die mit den Enzymen des Stoffwechselwegs, der zum gewünschten Produkt führt, konkurrieren.
  Genetische Veränderung des Shikimatweges die zu einer Erniedrigung des Metabolitflusses zu einer Zwischenverbindung und damit der entsprechenden Feinchemikalie führen, sind beispielsweise die folgenden Maßnahmen D, E oder F.
• 4. D: Überexpression eines Stoffwechselgens und damit die Erhöhung der entsprechenden Enzymaktivität, die von dieser Zwischen­ verbindung wegführt;
• 5. E: Inaktivierung von Genen die Enzyme kodieren, die zu dieser Zwischenverbindung führen, beispielsweise durch Antisenese- Technik oder Kosuppression;
• 6. F: Expression eines Gens zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist. Dieses Gen kann beispielsweise den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrücken und durch die neue Genfunktion eine Erniedrigung des Stofflusses zu den über­ brückten Zwischenverbindungen bewirken.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens führt die genetische Veränderung des Shikimatweges im Organismus zu einer Erhöhung des Metabolitflusses zu einer gewünschten Zwischenverbindung und damit der entsprechenden gewünschten Feinchemikalie.

Bevorzugt erfolgt die Erhöhung des Metabolitflusses zu einer gewünschten Zwischenverbindung des Shikimatweges und damit zur gewünschten Feinchemikalie durch mindestens eine Maßnahme aus­ gewählt aus der Gruppe der Maßnahme A und B, also durch die Maß­ nahme A und/oder B, wobei die Maßnahmen A und B die vorstehend beschriebene Bedeutung haben.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher dadurch gekennzeichnet, daß man zur genetischen Ver­ änderung des Shikimatweges mindestens eine Maßnahme ausgewählt aus der Gruppe der Maßnahmen A und B durchführt, wobei A und B folgende Bedeutung haben:

• 1. A: Erhöhung der Aktivität mindestens eines Enzyms des Shikimat­ weges des Wildtyps;
• 2. B: Einbringen mindestens eines Gens in den Organismus zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist und das den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrückt.

Die Erhöhung der Aktivität mindestens eines Enzyms des Shikimat­ weges des Wildtyps nach Maßnahme A kann beispielsweise durch Überexpression von Nukleinsäuren, also Genen des Shikimatweges, die Proteine mit dieser enzymatischen Aktivität codieren, durch das Ausschalten von negativen Regulationsmechanismen von zur Zwischenverbindung führenden Stoffwechselwegen, wie beispiels­ weise das Ausschalten der Feed-back-Inhibierung oder das Ein­ bringen von orthologen Genen erfolgen, die im gewünschten Organismus keiner Regulation unterliegen.

Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung der Aktivität mindestens eines Enzyms des Shikimatweges des Wildtyps gemäß Maßnahme A durch Überexpression von Nukleinsäuren des Shikimatweges, die Proteine 1 mit dieser enzymatischen Aktivität codieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Durchführung der Maßnahme A dadurch, daß man eine Nukleinsäure, codierend eine Chorismatmutase, in den Organismus einbringt.

Unter einer Chorismatmutase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Chorismat in Prephenat umzuwandeln.

Prinzipiell sind alle Chorismatmutasen im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar, wie beispielsweise die Chorismatmutase aus Petroselinum Crispum (Accessionsnummer: T14902, T14901), Chorismatmutase aus Streptomyces coelicolor (T36865), Chorismat­ mutase aus Bacillus subtilis (A33894), Chorismatmutase aus Asper­ gillus nidulans (AAD30065) oder die nachstehend beschriebenen Chorismatmutasen aus Arabidopsis thaliana oder die nachstehend beschriebene Chorismatmutase Aktivität der Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenase (tyrA) aus E. coli.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Chorismatmutasegene verwendet, die eine Chorismatmutase kodieren, deren Aktivität einer reduzierten posttranslationalen Regulation im Organismus unterliegt. Unter einer reduzierten Regulation wird eine Regulation der Aktivität von höchstens 99%, vorzugsweise höchstens 70%, besonders bevorzugt 50%, insbesondere bevor­ zugt 0%, also keine Regulation der Aktivität, verglichen mit der Wildtypregulation verstanden.

Chorismatmutasegene, die eine Chorismatmutase kodieren, deren Aktivität im Organismus einer reduzierten, insbesondere keiner Regulation unterliegt, sind beispielsweise Chorismatmutasegene aus gattungsverschiedenen Organismen oder Chorismatmutasegene aus dem gleichen Organismus oder gattungsverwandten Organismen die an der Lokalisation der Expression einer reduzierten, insbesondere keiner posttranslationalen Regulation unterliegen.

Unter Organismen werden erfindungsgemäß prokaryontische Organismen oder eukaryontische Organismen, wie beispielsweise Bakterien, Hefen, Algen, Moose, Pilze oder Pflanzen, verstanden, die in der Lage sind, als Wildtyp oder durch genetische Ver­ änderung die vorstehend erwähnten Feinchemikalien herzustellen. Bevorzugte Organismen sind photosynthetisch aktive Organismen, wie beispielsweise Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, die bereits als Wildtyp in der Lage sind, die vorstehend erwähnten Feinchemikalien herzustellen.

Besonders bevorzugte Organismen sind Pflanzen.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Maßnahme A des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Chorismatmutasegene, die eine Chorismatmutase kodieren, deren Aktivität in Pflanzen einer reduzierten posttranslationalen Regulation unterliegt, in Pflanzen eingebracht.

Beispielsweise sind dies einige bakterielle oder davon abge­ leitete Chorismatmutasegene, also Nukleinsäuren, die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz einer bakteriellen Chorismatmutase deren Aktivität in Pflanzen einer reduzierten posttranslationalen Aktivität unterliegt, beispielsweise die nachstehend beschriebene Nukleinsäure kodierend für die Chorismatmutase Aktivität der Chorismatmutase-Prephenatdehydro­ genase (tyrA) aus E. coli. oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, besonders bevor­ zugt mindestens 90% auf Aminosäureebene mit der Sequenz der bakteriellen Chorismatmutase und die enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase aufweist.

Unter dem Begriff "Substitution" ist in der Beschreibung der Aus­ tausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, bei­ spielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gln durch Asn, Val durch Ile, Leu durch Ile, Ser durch Thr.

Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.

Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptid­ kette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.

Unter Homologie zwischen zwei Proteinen wird vorzugsweise die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, vorzugsweise die Identität die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (UWGCG, University of Wisconsin, Genetic Computer Group) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12
Length Weight: 4
Average Match: 2,912
Average Mismatch: -2,003

Unter einem Protein, das eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz der vorstehend beschriebenen Chorismatmutase aus E. coli aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz der vorstehend beschriebenen Chorismatmutase, vor­ zugsweise nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parameter­ satz eine Homologie von mindestens 30% aufweist.

Die bakteriellen oder davon abgeleiteten Chorismatmutasegene können auch Proteine kodieren die die Eigenschaft einer Chorismatmutase und die Eigenschaft eines weiteren Enzyms aufweisen, wie beispielsweise das nachstehend beschriebene Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase-Gen (tyrA) aus E. coli K12. Diese Ausführungsform ist, wie nachstehend beschrieben, besonders bevorzugt, wenn die Maßnahmen A und B in Kombination durchgeführt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Maßnahme A des erfindungsgemäßen Verfahren, insbesondere bei der Durch­ führung der Maßnahme A alleine, werden die Chorismatmutasegene in spezifische Orte in den Organismus gebracht, an denen die entsprechenden Chorismatmutasen einer reduzierten posttrans­ lationalen Regulation unterliegen.

Vorzugsweise werden dabei Nukleinsäuren, kodierend eine Chorismatmutase aus dem gleichen oder aus gattungsverwandten Organismen verwendet, die an Ort der Expression einer reduzierten posttranslationalen Regulation unterliegen.

Die Isoformen von Chorismatmutasen die aus unterschiedlichen Kompartimenten eines Organismus isoliert werden, weisen eine unterschiedliche Regulation auf.

Die entsprechenden Corismatmutasegene aus einem spezifischen Kompartiment des Organismus oder aus gattungsverwandten Organismen können in andere Kompartimente des Organismus ein­ gebracht werden, in denen die kodierten Chorismatmutasen keiner posttranslationalen Regulation unterliegen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens in Pflanzen wird zur Durchführung der Maßnahme A eine Nukleinsäure, codierend eine cytosolische Chorimatmutase aus Pflanzen in Plastiden von Pflanzen eingebracht.

Prinzipiell eignen sich dafür alle Nukleinsäuren, die eine cytosolische Chorismatmutase aus Pflanzen kodieren, vorzugsweise die Nukleinsäure kodierend eine cytosolische Chorismatmutase aus Arabidopsis thaliana (Seq ID NO. 3) und davon abgeleitete natür­ liche oder nicht natürliche Nukleinsäuren.

Die Existenz verschiedener Isoformen der Chorismatmutase konnte für verschiedene Organismen nachgewiesen werden. So konnten aus Arabidopsis thaliana drei verschiedene Chorismatmutasen isoliert werden (Eberhard et al. 1993. FEBS 334, 233-236; Eberhard et al. 1996. Plant J. 10, 815-821; Mobley et al. 1999. Gene 15; 240 (1): 115-123).

Diese Isoformen unterschieden sich in ihrer Lokalisation als auch in ihren enzymatischen Eigenschaften. So ist die Chorismat­ mutase-1 plastidär lokalisiert und wird durch die aromatischen Aminosäuren allosterisch kontrolliert.

Das cytosolische Isoenzym Chorismatmutase-2 unterliegt keiner bekannten Regulation (Benesova, M. Bode, R, Phytochemistry 1992, 31, 2983-2987).

Unter Nukleinsäuren, kodierend eine cytosolische Chorismatmutase aus Arabidopsis thaliana und davon abgeleitete natürliche oder nicht natürliche Nukleinsäuren werden Nukleinsäuren verstanden, die ein Protein kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz der cytosolischen Chorismatmutase (SEQ ID NO. 4) oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Amino­ säuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 90% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 4 und die enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase aufweisen.

Unter einem Protein, das eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 4 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO. 4, vorzugs­ weise nach vorstehendem Programmalgorithmus mit vorstehenden Parametersatz eine Homologie von mindestens 30% aufweist.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Nukleinsäure, codierend die cytosolische Chorismatmutase aus Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO. 4) in Plastiden von Pflanzen eingebracht.

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise durch Rück­ übersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der pflanzenspezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Pflanze leicht ermitteln.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Nukleinsäure der Sequenz SEQ ID NO. 3 in Plastiden von Pflanzen eingebracht. Die Sequenz SEQ ID NO. 3 stellt das Gen der cytosolischen Chorismatmutase aus Arabidopsis thaliana (Chorismatmutase-2) dar.

Das Einbringen der Nukleinsäuren, codierend eine Chorismatmutase in Plastiden von Pflanzen kann beispielsweise, wie nachstehend für die Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase näher beschrieben, durch Einbringen von Expressionskassetten in Pflanzen erreicht werden, deren Nukleinsäure-Sequenz für ein Chorismatmutase- Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloroplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation der cytosolischen Chorismatmutase in die Chloroplasten vom Chorismatmutase-Teil enzymatisch abgespalten werden.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bringt man daher ein Nukleinsäure­ konstrukt in die Pflanze ein, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend ein plastidäres Transitpeptid und eine Nukleinsäure die ein Protein kodiert, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 4 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase aufweist.

Nukleinsäuren, codierend plastidäre Transitpeptide sind bei­ spielsweise DNA-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Trans­ itpeptids der plastidären Transketolase aus Tabak in drei Lese­ rastern als KpnI/BamHI Fragmente mit einem ATG-Codon in der NcoI Schnittstelle:

pTP09

pTP10

pTP11

oder die Nukleinsäure, codierend das plastidäre Transitpeptid der plastidären Chorismatmutase-1 aus Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO. 7):

Vorzugsweise wird zur plastidären Lokalisation einer cyto­ solischen Chorismatmutase die Nukleinsäure, codierend das plastidäre Transitpeptid der plastidären Chorismatmutase-1 aus Arabidopsis thaliana verwendet.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bringt man daher ein Nukleinsäure­ konstrukt in die Pflanze ein, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend ein plastidäres Transitpeptid der plastidären Chorismatmutase-1 aus Arabidopsis thaliana und eine Nuk­ leinsäure die ein Protein kodiert, enthaltend die Aminosäure­ sequenz SEQ ID NO. 4 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abge­ leitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 4 und die enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase aufweist.

Besonders bevorzugt wird für Maßnahme A des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Nukleinsäurekonstrukt enthaltend die Sequenz (SEQ ID NO. 5) in Pflanzen eingebracht.

SEQ ID NO. 5 stellt ein Nukleinsäurekonstrukt aus der Nuklein­ säure, codierend das plastidäre Transitpeptid der plastidären Chorismatmutase-1 aus Arabidopsis thaliana und der Nukleinsäure, codierend die cytosolische Chorismatmutase-2 aus Arabidopsis thaliana dar.

Die vorliegende Anmeldung betrifft insbesondere diese Nuklein­ säurekonstrukte als auch deren Verwendung in der Maßnahme A des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Fig. 1 zeigt beispielsweise das Biosyntheseschema ausgehend von Erythrose-4-Phosphat zu Vitamin E. Durch die zusätzliche Expression eines Chorismatmutasegens wird der Shikimatweg des Wildtyps genetisch verändert und der Metabolitfluß zu Hydroxy­ phenylpyruvat erhöht. Das nun vermehrt zur Verfügung stehende Hydroxyphenylpyruvat wird weiter in Richtung Tocopherole umge­ setzt. Ein erhöhter Gehalt an Hydroxyphenylpyruvat führt zu einer erhöhten Umsetzung Richtung Vitamin E und/oder Vitamin K. Vor­ zugsweise führt ein erhöhter Gehalt an Hydroxyphenylpyruvat zu einer Erhöhung des Vitamin E-Gehalts.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt, wie nach­ stehend ausführlich beschrieben, durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Chorismatmutase-Nukleinsäure- Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und Chorismat­ mutase-Nukleinsäure-Sequenz inserierten Nukleinsäure, die für ein plastidäres Transitpeptid kodiert, also vorzugsweise durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einem geeigneten, vorstehend be­ schriebenen Nukleinsäurekonstrukt, sowie einem Polyadenylierungs­ signal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sam­ brook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.

Die Maßnahme B zur Veränderung des Shikimatweges des Wildtyps erfolgt, wie vorstehend ausgeführt durch Einbringen mindestens eines Gens in den Organismus zu dem der Wildtyp kein ortho­ loges Gen aufweist und das den Stoffwechselweg des Shikimat­ weges des Wildtyps überbrückt. Dieses Gen codiert ein Enzym, daß durch die neue enzymatische Aktivität eine Erhöhung des Stoff­ flusses zu der Zwischenverbindung bewirkt, bei der die Über­ brückung endet. Diese neue enzymatische Aktivität unterliegt vorzugsweise keiner Regulation durch den Organismus, schließt also den Stoffwechselweg kurz, um beispielsweise limitierende Regulationsstellen im Stoffwechsel zu umgehen. Dadurch ist es möglich, den Metabolitfluß zu limitierenden Substanzen von vor­ handenen Regulationen zu entkoppeln.

Unter einem zum Wildtyp orthologen Gen wird ein Gen verstanden, daß aus einem anderen Organismus stammt, wobei die Enzymaktivität die das Gen kodiert bereits im Wildtyp vorhanden ist.

Dementsprechend wird unter der Formulierung "Gen, zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist" ein Gen aus einem anderen Organismus verstanden, wobei die Enzymaktivität die das Gen kodiert vor der Transformation im Wildtyp nicht vorhanden oder nicht aktiviert war.

Vorzugsweise wir unter einem zum Wildtyp orthologen Gen ein funktionelles Äquivalent aus einem anderen Organismus verstanden, wobei unter funktionellem Äquivalent die Gesamtheit der Eigen­ schaften des Genproduktes (Protein) verstanden wird.

Dementsprechend wird vorzugsweise unter der Formulierung "Gen, zu dem der Wildtyp kein orthologe Gen aufweist" ein Gen verstanden, zudem der Wildtyp kein funktionelles Äquivalent gemäß der vor­ stehend gegebenen Definition besitzt und somit eine Stoffwechsel­ leistung etabliert wird, die einen alternativen Stoffwechselweg erzeugt, um ein bereits in der Pflanze vorhandenes Produkt (enthaltenen Metaboliten) zu produzieren.

Unter Organismen werden erfindungsgemäß, wie vorstehend für Maßnahme A beschrieben, prokaryontische Organismen oder eukaryontische Organismen, wie beispielsweise Bakterien, Hefen, Algen, Moose, Pilze oder Pflanzen, verstanden, die in der Lage sind, als Wildtyp oder durch genetische Veränderung die vor­ stehend erwähnten Feinchemikalien herzustellen. Bevorzugte Organismen sind photosynthetisch aktive Organismen, wie bei­ spielsweise Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, die bereits als Wildtyp in der Lage sind, die vorstehend erwähnten Feinchemikalien herzustellen.

Besonders bevorzugte Organismen sind Pflanzen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens verwendet man deshalb Pflanzen als zu transformierende Organismen. In diesem Fall eignen sich für die Durchführung der Maßnahme B vorzugsweise bakterielle Gene als Gene zu denen die Pflanze kein orthologes Gen aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Maßnahme B des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Stoffwechselweg des Shikimatweges der Pflanze durch das mindestens eine einge­ brachte Gen überbrückt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Maßnahme B des erfindungsgemäßen Verfahrens bringt man eine Nukleinsäure, codierend eine Prephenatdehydrogenase in eine Pflanze ein. Für die bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich alle Gene die eine Prephenatdehydrogenase kodieren.

Unter einer Prephenatdehydrogenase wird ein Enzym verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Prephenat in 4-Hydroxy­ phenylpyruvat umzuwandeln.

Beispiele für Nukleinsäuren, die eine Prephenatdehydrogenase codieren und im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können sind die bekannten und beispielsweise in Datenbanken im Internet zugänglichen Prephenatdehydrogenasegene aus Lactococcus lactis (Accession X78413), Synechocystis spec PCC 6803 (slr2081), Deinococcus radiodurans (AAF10695) oder Bacillus subtilis (P20692). Weitere Beispiele können durch Vergleich der Homologien der Sequenzen mit diesen bekannten Prephenatdehydrogenasegenen gefunden werden, wie beispielsweise die potentiellen Prephenat­ dehydrogenase aus Termotoga maitima (AAD35430) oder Heliobacter pylori 26695 (Accession AAD08422).

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver­ fahren unter Verwendung eines Prephenatdehydrogenasegens bringt man man eine Nukleinsäure ein, die ein Protein kodiert, ent­ haltend die Aminosäuresequenz der Prephenatdehydrogenase aus Synechocystis spec PCC 6803 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 90% auf Aminosäureebene mit der Sequenz der Pre­ phenatdehydrogenase aus Synechocystis spec PCC 6803 und die enzymatische Eigenschaft Prephenatdehydrogenase aufweist.

Unter einem Protein, das eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz der Prephenatdehydrogenase aus Synechocystis spec PCC 6803 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz der Prephenatdehydrogenase aus Synechocystis spec PCC 6803, vorzugsweise nach vorstehendem Programmalgorithmus mit vorstehenden Parametersatz eine Homologie von mindestens 30% aufweist.

Fig. 1 zeigt beispielsweise das Biosyntheseschema ausgehend von Erythrose-4-Phosphat zu den Tocopherolen. Durch die zusätzliche Expression eines Prephenatdehydrogenase-Gens wird der Shikimat­ weg des Wildtyps genetisch verändert und der Metabolitfluß zu Hydroxyphenylpyruvat erhöht. Das nun vermehrt zur Verfügung stehende Hydroxyphenylpyruvat wird weiter in Richtung Tocopherole umgesetzt. Ein erhöhter Gehalt an Hydroxyphenylpyruvat führt zu einer erhöhten Umsetzung Richtung Vitamin E und/oder Vitamin K. Vorzugsweise führt ein erhöhter Gehalt an Hydroxyphenylpyruvat zu einer Erhöhung des Vitamin E-Gehalts.

Es ist jedoch vorteilhaft, gegebenenfalls in Kombination mit der erfindungsgemäßen Überbrückung des Stoffwechselweges weitere Enzyme des Shikimatweges überzuexprimieren, um einen erhöhten Metabolitfluß zu den gewünschten Feinchemikalien zu erreichen.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens werden daher die Maßnahmen A und B in Kombination durchgeführt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser erfindungs­ gemäßen Verfahrensvariante bringt man eine Nukleinsäure codierend eine Prephenatdehydrogenase in Kombination mit einer Nukleinsäure codierend eine Chorismatmutase in eine Pflanze ein.

Diese Kombination kann beispielsweise durch Einbringen von zwei Nukleinsäuren erfolgen, die jeweils ein Enzym mit der Aktivität einer Chorismatmutase und ein Enzym mit der Aktivität einer Prephenatdehydrogenase codieren. Für diese Ausführungsform ist es notwendig, zwei verschiedene Nukleinsäuren, die jeweils eines dieser Enzyme kodieren, in die Pflanze einzubringen.

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens erfolgt diese Kombination in einer Nuklein­ säure, in dem man eine Nukleinsäure, codierend eine Chorismat­ mutase-Prephenatdehydrogenase in eine Pflanze einbringt.

Das Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase-Gen, codiert ein Protein, daß sowohl die enzymatischen Eigenschaften einer Chorismatmutase als auch einer Prephenatdehydrogenase auf­ weist. Dadurch wird durch Einbringen einer Nukleinsäure eine enzymatische Aktivität überexprimiert, bzw. eine enzymatische Aktivität eingebracht, die einer reduzierten posttranslationalen Regulation unterliegt (Chorismatmutase) und eine enzymatische Eigenschaft (Prephenatdehydrogenase) neu eingeführt.

Unter einer Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase wird ein Enzym verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Chorismat in 4-Hydroxyphenylpyruvat umzuwandeln.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform dieser erfindungsgemäßen Verfahrensvariante bringt man man eine Nuklein­ säure ein, die ein Protein kodiert, enthaltend die Aminosäure­ sequenz SEQ ID NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substi­ tution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 90% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase-Prephenat­ dehydrogenase aufweist.

Das Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 stellt die Chorismatmutase-Prephenatedehydrogenase (tyrA) aus E. coli K12 dar.

Unter einem Protein, das eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Ver­ gleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO. 2, vorzugsweise nach vorstehendem Programmalgorithmus mit vorstehenden Parameter­ satz eine Homologie von mindestens 30% aufweist.

Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können bei­ spielsweise eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz sein.

Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind, wie vorstehend beschrieben, durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Organismus spezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Soll das Protein beispielsweise in einer Pflanze exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Pflanze bei der Rückübersetzung zu verwenden.

Weitere bevorzugte Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenasen bzw. deren kodierende Nukleinsäuren sind insbesondere Nukleinsäuren bakterieller Herkunft, wie beispielsweise, die Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenasegene aus Erwinia herbicola (Accession X60420; Dieses Protein kann durch Deletion eins 109 Bp Bereiches am 5'Ende auch in eine monofunktionelle Prephenatdehydrogenase umgewandelt werden und dann beispielsweise wie vorstehend be­ schrieben als Prephenatdehydrogenase verwendet werden) oder Bordetella bronchiseptica (Accession AAF01289) oder lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäure­ sequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nuklein­ säuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID NO. 2 oder den anderen vorstehend beschriebenen Sequenzen leicht auffinden, wie beispielsweise die potentielle Chorismatmutase-Prephenat­ dehydrogenasegene aus Methanococcus janaschii (Accession Q58029).

Besonders bevorzugt verwendete Nukleinsäuren kodieren eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus Bakterien.

Eine besonders bevorzugt verwendete Nukleinsäure hat die Sequenz SEQ ID NO. 1. Diese Nukleinsäure stellt eine prokaryontische genomische DNA aus E. Coli K12 dar, die die Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenase der Sequenz SEQ ID NO. 2, auch tyrA-Gen genannt, kodiert.

Fig. 1 zeigt beispielsweise das Biosyntheseschema ausgehend von Erythrose-4-Phosphat zu den Tocopherolen. Durch die zusätz­ liche Expression eines Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase- Gens wird der Shikimatweg des Wildtyps genetisch verändert und der Metabolitfluß zu Hydroxyphenylpyruvat erhöht. Das nun ver­ mehrt zur Verfügung stehende Hydroxyphenylpyruvat wird weiter in Richtung Tocopherole umgesetzt. Ein erhöhter Gehalt an Hydroxy­ phenylpyruvat führt zu einer erhöhten Umsetzung Richtung Vitamin E und/oder Vitamin K. Vorzugsweise führt ein erhöhter Gehalt an Hydroxyphenylpyruvat im erfindungsgemäßen Verfahren zu einer Erhöhung des Vitamin E-Gehalts.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Fein­ chemikalien wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der transgenen Organismen ein Ernten der Organismen und ein Isolieren der Feinchemikalien aus den Organismen angeschlossen.

Das Ernten der Organismen erfolgt in an sich bekannter Weise dem jeweiligen Organismus entsprechend. Mikroorganismen, wie Bakterien, Moose, Hefen und Pilze oder Pflanzenzellen, die durch Fermentation in flüssigen Nährmedien kultiviert werden, können beispielsweise durch Zentrifugieren, Dekantieren oder Filtrieren abgetrennt werden. Pflanzen werden in an sich bekannter Weise auf Nährböden gezogen und entsprechend geerntet.

Die Isolierung der Feinchemikalien aus der geernteten Biomasse erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Extraktion und gegebenenfalls weiterer chemische oder physika­ lischer Reinigungsprozesse, wie beispielsweise Fällungsmethoden, Kristallographie, thermische Trennverfahren, wie Rektifizier­ verfahren oder physikalische Trennverfahren, wie beispielsweise Chromatographie.

Die Isolierung von Vitamin E aus Ölhaltigen Pflanzen erfolgt beispielsweise bevorzugt durch chemische Umwandlung und Destillation aus Pflanzenölen oder aus den bei der Desodorierung pflanzlicher Öle anfallenden Wasserdampfdestillate (Dämpfer­ kondensate).

Weitere Isolierverfahren von Vitamin E aus Dämpferkondensaten sind beispielsweise in DE 31 26 110 A1, EP 171 009 A2, GB 2 145 079, EP 333 472 A2 und WO 94/05650 beschrieben.

Die Herstellung der transgenen Organismen, insbesondere Pflanzen erfolgt vorzugsweise durch Transformation der Ausgangsorganismen, insbesondere Pflanzen, mit einem Nukleinsäurekonstrukt, daß die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, insbesondere die Nuklein­ säuren codierend eine Chorismatmutase, eine Prephenatdehydro­ genase oder eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase oder die vorstehen beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere das Nukleinsäurekonstrukt, kodierend für ein plastidäres Transit­ peptid und eine cytosolische Chorismatmutase enthält, wobei diese Nukleinsäuren

Diese Nukleinsäurekonstrukte, in denen die kodierende Nuklein­ säureseguenz oder das kodierende Nukleinsäurekonstrukt mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Pflanzen gewährleisten, werden im folgenden auch Expressions­ kassetten genannt.

Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner als Expressions­ kassette fungierende Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine, vorstehend beschriebene Nukleinsäure, insbesondere die Nuklein­ säure codierend eine Chorismatmutase, eine Prephenatdehydrogenase oder eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase oder die vor­ stehen beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere das Nukleinsäurekonstrukt, kodierend für ein plastidäres Transit­ peptid und eine cytosolische Chorismatmutase, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation im Wirtsorganismus, insbesondere in Pflanzen gewährleisten.

Vorzugsweise enthält die Expressionskassette eine Nukleinsäure kodierend ein plastidäres Transitpeptid, das die Lokalisation in Plastiden gewährleistet.

Die Expressionskassetten beinhalten Regulationssignale, also regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevor­ zugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette strom­ aufwärts, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für mindestens eines der vorstehend beschriebenen Gene operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Im folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäure­ konstrukte, Expressionskassetten für Pflanzen und Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen beschrieben.

Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf be­ schränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzen­ virus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202).

Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen tyrA- Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z. B. der PRP1-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesulfonamid-induzierbarer (EP-A 388186), ein durch Tetra­ zyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können u. a. verwendet werden.

Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese der entsprechenden Fein­ chemikalien, insbesondere Vitamin E bzw. dessen Vorstufen statt­ findet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blatt­ spezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245).

Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremd­ protein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094). Die Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin- Promotor (US 5504200), den USP- (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467), LEB4-Promotor (Fiedler und Conrad, 1995), Sucrose-Bindeprotein-Promotor (Zitat), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt vorzugsweise durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten, vorstehend beschriebenen Nukleinsäure-Sequenz, insbesondere der Nukleinsäure-Sequenz codierend eine Chorismatmutase, eine Pre­ phenatdehydrogenase oder eine Chorismatmutase-Prephenatdehydro­ genase und vorzugsweise einer zwischen Promotor und Nukleinsäure- Sequenz inserierten Nukleinsäure, die für ein chloroplasten­ spezifisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadeny­ lierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungs­ techniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.

Insbesondere bevorzugt sind insertierte Sequenzen, die, wie vorstehend für die Chorismatmutase beschrieben, ein Targeting in den Plastiden gewährleisten.

Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren Nukleinsäure-Sequenz für ein Fusionsprotein, insbesondere ein Chorismatmutase-, Prephenatdehydrogenase- oder Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenase-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloroplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation der Proteine, insbesondere der Chorismatmutase, Prephenatdehydro­ genase oder Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase in die Chloro­ plasten vom Proteinteil, insbesondere vom Chorismatmutase-, Pre­ phenatdehydrogenase- bzw. Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase- Teil enzymatisch abgespalten werden. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären Nicotiana tabacum Transketolase oder einem anderen Transitpeptid (z. B. dem Transit­ peptid der kleinen Untereinheit der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase als auch der Isopentenylpyrophosphat Iso­ merase-2) oder dessen funktionellem Äquivalent abgeleitet ist.

Für die Verwendung der cytosolischen Chorismatmutase bzw. der Nukleinsäure, codierend eine cytosolische Chorismatmutase ist, wie vorstehend beschrieben, insbesondere die Verwendung des Transitpeptids der plastidären Chorismatmutase, bzw. deren kodierende Nukleinsäure bevorzugt.

Besonders bevorzugt bei der erfindungsgemäßen Verwendung der anderen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind DNA-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Transitpeptids der plastidären Transketolase aus Tabak in drei Leserastern als KpnI/BanHI Fragmente mit einem ATG-Codon in der NcoI Schnittstelle:

pTP09

pTP10

pTP11

Ein weiteres Beispiel für ein plastidäres Transitpeptid ist das Transitpeptid der plastidären Isopentenyl-pyrophosphat Iso­ merase-2 (IPP-2) aus Arabisopsis thaliana.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere die Nuklein­ säuren codierend eine Chorismatmutase, eine Prephenatdehydro­ genase oder eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen Nukleinsäure-Bestand­ teilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Gen­ abschnitten verschiedener Organismen bestehen.

Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Poly­ linker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet vor­ zugsweise in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine kodierende Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäurekonstrukt und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktions­ schnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden.

Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing- back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Poly­ adenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.

Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, insbesondere der Nukleinsäuren kodierend eine Chorismatmutase, eine Prephenatdehydrogenase oder eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase oder der vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte oder Proteine, insbesondere der Chorismatmutasen, der Prephenatdehydrogenasen oder der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenasen zur Herstellung von transgenen Pflanzen.

Vorzugsweise weisen diese transgenen Pflanze gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Feinchemikalien, insbesondere an Ubichinon, Vitamin E und/oder Vitamin K, vorzugsweise an Vitamin E auf.

Es ist bekannt, daß Pflanzen mit einem hohen Vitamin-E-Gehalt eine erhöhte Resistenz gegenüber abiotischem Streß aufweisen. Unter abiotischem Streß wird beispielsweise Kälte, Frost, Trockenheit, Hitze und Salz verstanden.

Daher betrifft die Erfindung weiterhin die Verwendung der vorstehend erwähnten Nukleinsäuren zur Herstellung transgener Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Resistenz gegenüber abiotischem Streß aufweisen.

Die vorstehend beschriebenen Proteine und Nukleinsäuren können zur Herstellung von Feinchemikalien in transgenen Organismen, vorzugsweise zur Herstellung von Vitamin E, Vitamin K und/oder Ubichinon, insbesondere Vitamin E in transgenen Pflanzen ver­ wendet werden.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom eines Organismus, insbesondere einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Dazu können insbesondere bei Pflanzen an sich bekannte Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzen­ geweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Trans­ formation genutzt werden.

Geeignete Methoden zur Transformation von Pflanzen sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikro­ injektion und der, vorstehend beschriebene, durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispiels­ weise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, heraus­ gegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben.

Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans­ formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).

Dementsprechend betrifft die Erfindung weiterhin Vektoren ent­ haltend die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, Nukleinsäure­ konstrukte oder Expressionskassetten.

Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die Expressionskassette kann über die Pflanzen hinaus auch zur Transformation von Bakterien, insbesondere Cyanobakterien, Moosen, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen eingesetzt werden.

Zur bevorzugten Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, im folgenden auch transgene Pflanzen bezeichnet, wird die fusionierte Expressionskassette, die ein erfindungegemäßes Protein, insbesondere eine Chorismatmutase, Prephenatdehydro­ genase oder eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase kodiert, vorzugsweise in einen Vektor, beispielsweise pBin19, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren.

Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen verwendet werden, indem beispielsweise ver­ wundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Expression eines erfindungsgemäßen Gens, insbesondere einer Nukleinsäure kodierend eine eine Chorismatmutase, eine Prephenatdehydrogenase oder eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase enthalten.

Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine Chorismatmutase, Prephenatdehydrogenase oder Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenase kodierenden Nukleinsäure wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben.

Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in ein Derivat des Transformationsvektors pBin-19 mit 35s Promotor (Bevan, M., Nucleic Acids Research 12: 8711-8721 (1984)) ein­ gebaut werden. Fig. 2 zeigt ein Derivat des Transformations­ vektors pBin-19 mit samenspezifischem Legumin B4-Promotor.

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agro­ bakterien replizieren können.

Die Erfindung betrifft daher die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, insbesondere die Nukleinsäuren koodierend eine Chorismatmutase, Prephenatdehydrogenase oder eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase, der vorstehend be­ schriebenen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere der Expressions­ kassetten zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen oder zur Transformation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzen­ teilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes der Pflanze oder Pflanzenteile an Feinchemikalien, insbesondere des Gehalts an Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon, vorzugsweise an Vitamin E.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen, Blütenblättern oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen.

Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen indem man eine vorstehend beschriebene Nukleinsäure oder ein vorstehend beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt in das Genom des Ausgangs­ organismus einführt.

Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekennzeichnet, daß man Expressionskassetten enthaltend Nukleinsäuresequenzen, kodierend eine kodierend eine Chorismatmutase, Prephenatdehydro­ genase oder eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase in eine Pflanzenzelle oder Protoplasten von Pflanzen einbringt und diese zu ganzen Pflanzen regeneriert.

Die Erfindung betrifft auch die genetisch veränderte Organismen, wobei die genetische Veränderung den Metabolitfluß des Shikimat­ weges gegenüber dem Wildtyp verändert und der Organismus gegen­ über dem Wildtyp einen veränderten Gehalt an Feinchemikalien auf­ weist.

Wie vorstehend erwähnt, weisen bevorzugte genetisch veränderte Organismen einen erhöhten Gehalt an Feinchemikalien, insbesondere einen erhöhten Gehalt an Vitamin E, Vitamin K und Ubichinon, vorzugsweise einen erhöhten Gehalt an Vitamin E gegenüber dem Wildtyp auf.

Unter einem genetisch veränderter Organismus wird erfindungsgemäß insbesondere ein Organismus verstanden, bei dem die genetische Veränderung die Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Chorismatmutase, Prephenatdehydrogenase oder Choroismatmutase- Prephenatdehydrogenase gegenüber einem Wildtyp
für den Fall, daß der Ausgangsorganismus die entsprechende Nukleinsäure enthält, erhöht oder
für den Fall, daß der Ausgangsorganismus die entsprechende Nukleinsäure nicht enthält, verursacht.

Als Organismen und zur Herstellung von Organismen mit einem erhöhten Gehalt an Feinchemikalien im Vergleich zum Wildtyp werden in einer bevorzugten Ausführungsform, wie vorstehend erwähnt, photosynthetisch aktive Organismen wie beispielsweise Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, besonders bevorzugt Pflanzen als Ausgangsorganismen und dementsprechend auch als genetisch veränderte Organismen verwendet.

Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Pflanzen im Sinne der Erfindung sind insbesondere mono- und dikotyle Pflanzen.

Bevorzugte Pflanzen sind Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter Pfeffer, Soja, Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Karotte, Kartoffel, Mais, Salate und Kohlarten, Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf, Brassicacaen wie beispielsweise Raps oder Canola, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Nuß- und Weinspezies oder Holzgewächse wie beispielsweise Espe oder Eibe.

Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Tagetes erecta, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Canola, Kartoffeln sowie weitere Ölsaaten, wie beispielsweise Soja.

Die genteisch veränderten Organismen, insbesondere Pflanzen können, wie vorstehend beschrieben zur Herstellung von Fein­ chemikalien, insbesondere zur Herstellung von Vitamin E, Vitamin K und Ubichinon verwendet werden.

Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Feinchemikalien, insbesondere mit einem erhöhten Gehalt an Vitamin-E, Ubichinon und/oder Vitamin K, vorzugsweise Vitamin E können auch beispiels­ weise direkt oder nach an sich bekannter Prozessierung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.

Erhöhung des Gehaltes an Feinchemikalien bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung dieser Verbindungen in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.

Unter einem erhöhten Gehalt an Vitamin E wird in der Regel ein erhöhter Gehalt an Gesamt-Tocopherol verstanden. Unter einem erhöhten Gehalt an Vitamin E wird aber auch insbesondere ein ver­ änderter Gehalt der vorstehend beschriebenen 8 Verbindungen mit Tocopherolaktivität verstanden.

Beispielsweise führt das Einbringen eines Chorismatmutase-Pre­ phenatdehydrogenase-Gens in Pflanzen überraschenderweise zu einem besonders erhöhten Anstieg des Gehalts an Tocotrienolen.

Im Falle der Erhöhung des Gehalts an Vitamin E kann sowohl der Gehalt an Tocopherolen oder Tocotrienolen gesteigert werden. Vor­ zugsweise wird der Gehalt an Tocopherolen gesteigert. Aber es ist auch möglich unter bestimmten Bedingungen vorzugsweise den Gehalt an Tocotrienolen zu steigern.

Der Biosyntheseort von Vitamin E beispielsweise ist in Pflanzen unter anderem das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere der Nukleinsäuren codierend eine Chorismatmutase, eine Prephenat­ dehydrogenase oder eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase sinnvoll ist. Dies ist jedoch nicht einschränkend, da die Expression auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - besonders in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft deshalb eine samenspezifische Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere der Nukleinsäuren codierend eine Chorismatmutase, eine Prephenatdehydrogenase oder eine Chorismatmutase-Prephenat­ dehydrogenases.

Darüber hinaus ist eine konstitutive Expression von exogenen Chorismatmutase-, Prephenatdehydrogenase- oder Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenase-Genen von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.

Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten Chorismatmutase-, Prephenatdehydrogenase- oder Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenase-Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des Chorismatmutase-, Prephenat­ dehydrogenase- oder Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase-Gens und deren Auswirkung auf die Vitamin E-Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

Allgemeine Experimentelle Bedingungen Sequenzanalyse rekombinanter DNA

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 1 Klonierung des tyrA-Gens kodierend für die Chorismat­ mutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12

Die DNA kodierend für das tyrA-Gen wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus E. coli K12 unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (tyrA5' SEQ ID NO. 10) und eines antisense spezifischen Primers (tyrA3' SEQ ID NO. 9) amplifiziert.

Die PCR Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR erfolgte in einem 50 µl Reaktionsansatz in dem enthalten war:

• - 2 µl einer E. coli K12 Zellsuspension
• - 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP
• - 1,5 mM Mg(OAc)₂
• - 5 µg Rinderserum-Albumin
• - 40 pmol tyrA5'
• - 40 pmol tyrA3'
• - 15 µl 3,3 × rTth DNA Polymerase XLPuffer (PE Applied Biosystems)
• - 5 U rTth DNA Polymerase XL (PE Applied Biosystems)

Die PCR wurde unter folgenden Zyklus Bedingungen durchgeführt:
Schritt 1: 5 Minuten 94°C (Denaturierung)
Schritt 2: 3 Sekunden 94°C
Schritt 3: 1 Minute 55°C (Annealing)
Schritt 4: 2 Minuten 72°C (Elongation)
30 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4
Schritt 5: 10 Minuten 72°C (Post-Elongation)
Schritt 6: 4°C (Warteschleife)

Das Amplikon wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR Klonierungsvektor pGEM-T (Promega) kloniert. Die Identität des erzeugten Amplikons wurde durch Sequenzierung unter Ver­ wendung des M13F (-40) Primers bestätigt.

Beispiel 2 Herstellung von Expressionskassetten enthaltend das tyrA-Gen, kodierend für die Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12

Transgene Nicotiana tabacum und Arabidopsis thaliana Pflanzen wurden erzeugt, die die Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 unter Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., Cell 21: 285-294, 1980) exprimieren. Die Grundlage des zur konstitutiven Expression der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 erzeug­ ten Plasmides war der pBinAR-TkTp-10 (Ralf Badur, Dissertation Universität Göttingen, 1998). Dieser Vektor ist ein Derivat des pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sci. 66: 221-230, 1990) und enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., 1980) das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens (Gielen et al., EMBO J. 3: 835-846, 1984) sowie die für das Transitpeptid der Nicotiana tabacum plastidären Transketolase kodierenden DNA Sequenz. Die unter Berücksichtigung des korrekten Leserasters erfolgte Klonierung der Chorismatmutase-Prephenat­ dehydrogenase aus E. coli K12 in diesen Vektor, erzeugt eine Translationsfusion der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase mit dem plastidären Transitpeptid. Dadurch erfolgt ein Transport des Transgens in die Plastiden.

Zur Erstellung dieses Plasmides wurde das tyrA-Gen unter Ver­ wendung der flankierenden SmaI bzw. SalI Restriktionsschnitt­ stellen aus dem Plasmid pGEM-T/tyrA isoliert. Dieses Fragment wurde unter Anwendung von Standardmethoden in einen SmaI/SalI geschnittenen pBinAR-TkTp-10 ligiert (siehe Fig. 2). Dieses Plasmid (pBinAR-TkTp-10/tyrA) wurde zur Erzeugung transgener Nicotiana tabacum und A. thaliana Pflanzen verwendet.

Fragment A (529 bp) in Fig. 2 beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus), Fragment B (245 bp) kodiert für das Transitpeptid der Nicotiana tabacum Transketolase, Fragment C (1232 Bp) kodiert für das tyrA-Gen aus E. coli K12, Fragment D (219 Bp) kodiert für das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.

Beispiel 3 Erzeugung von Nukleinsäurekonstrukten zur Expression der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors

Zur Herstellung von chimären DNA Konstrukten zur Erzeugung trans­ gener Arabidopsos thaliana, Nicotiana tabacum bzw. Brassica napus Pflanzen, die die Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors exprimieren, wurde der Vektor pPTVkanLeP-IPP-TP-9 verwendet.

Dieser Vektor ist ein Derivat des pGPTVkan (D. Becker, E. Kemper, J. Schell, R. Masterson. Plant Molecular Biology 20: 1195-1197, 1992) dem das uidA Gen deletiert wurde. Stattdessen enthält der Vektor pPTVkanLeP-IPP-TP-9 den samenspezifischen Promotor des Legumin B4 Gens (Kafatos et al., Nuc. Acid. Res., 14 (6): 2707-2720, 1986), die Sequenz kodierend für das Transitpeptid der A. thaliana plastiden-spezifischen Isopentenyl-pyrophosphat Isomerase-2 (IPP-2) (Badur, unveröffentlicht) und das Terminationssignal der Nopalinsynthase aus A. tumefaciens (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 561-73, 1982).

Das Nukleinsäure-Fragment kodierend für die tyrA aus E. coli K12 wurde als SmaI/SalI Fragment mit durch die T4-Polymerase auf­ gefüllten stumpfen Enden in den Vektor pPTVkanLeP-IPP-TP-9 (Fig. 3) kloniert, wodurch eine Translationsfusion mit dem Transitpeptid der IPP-2 erzeugt wurde. Somit konnte ein Import der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase in die Plastiden gewährleistet werden. Dieses Plasmid (pPTVkanLeP-IPP-TP-9/TyrA) wurde zur Erzeugung transgener Nicotiana tabacum, A. thaliana bzw. Brassica napus Pflanzen verwendet.

Fragment A (2700 bp) in Fig. 3 beinhaltet den Promotor des Legumin B4 Gens aus Vicia faba, Fragment B (206 bp) Fragment kodierend für das Transitpeptid der A. thaliana Isopentenyl-pyro­ phosphat-Isomerase-2. Fragment C (1234 Bp) kodiert für das tyrA- Gen aus E. coli K12. Fragment D (272 Bp) für das Terminationssignal des Nopalin-Synthase Gens.

Beispiel 4 Herstellung transgener Arabidopis thaliana Pflanzen, die das tyrA-Gen exprimieren

Wildtyp Arabidopsis thaliana Pflanzen (Columbia) wurden mit dem Agrabacterium tumefaciens Stamm (GV3101 [pMP90]) auf Grundlage einer modifizierten Vakuuminfiltrationsmethode transformiert (Steve Clough und Andrew Bent. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of A. thaliana. Plant J 16 (6): 735-43, 1998; der Bechtold, N. Ellis, J. und Pelltier, G., in: Planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CRAcad Sci Paris, 1993, 1144 (2): 204-212). Die verwendeten Agrobacterium tumefaciens Zellen waren im Vorfeld mit den Plasmiden pBinAR-TkTp-10/tyrA bzw. pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA (Fig. 2 bzw. 3) transformiert worden.

Samen der Primärtransformanden wurden auf Grundlage der Antibiotikaresistenz selektioniert. Antibiotika resistente Keimlinge wurden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.

Beispiel 5 Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen, die das tyrA-Gen exprimieren

Die Herstellung transgener Raps Pflanzen orientierte sich an einem Protokoll von Bade, J. B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.

Die Transformationen erfolgten mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 [pMP90]. Zur Transformation wurde das Plasmid pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA verwendet (Fig. 3). Samen von Brassica napus var. Westar wurden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55°C in Wasser gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Filter­ papier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate wurden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einem 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.

Vom Agrobacterium Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4 bis 0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zell­ pellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basal­ medium auf eine OD₆₀₀ von 0,3 eingestellt.

Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobakterium-Lösung hinzu­ gefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agro­ bacterien-Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durch­ geführt. Die Co-Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus- Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Wasch­ medium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wurde in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.

Zur Regeneration wurden jeweils 20 bis 30 Explante in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kanamycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wurden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-Induktionsmedium umgesetzt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen wurden wie von Bade, J. B und Damm, B. (in: Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt.

Beispiel 6 Herstellung transgener Nicotiana tabacum Pflanzen, die das tyrA-Gen exprimieren

Zehn ml YEB-Medium mit Antibiotikum (5 g/l Rinder-Extrakt, 1 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l Pepton, 5 g/l Saccharose und 2 mM MgSO₄.) wurden mit einer Kolonie von Agrobacterium tumefaciens beimpft und über Nacht bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden 20 min bei 4°C, 3500 U/min in einer Tischzentrifuge pelletiert und danach in frischem YEB-Medium ohne Antibiotika unter sterilen Bedingungen resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für die Transformation eingesetzt.

Die Wildtyp-Pflanzen aus Sterilkultur wurden durch vegetative Replikation erhalten. Dazu wurde nur die Spitze der Pflanze abgeschnitten und auf frisches 2MS-Medium in ein steriles Ein­ weckglas überführt. Vom Rest der Pflanze wurden die Haare auf der Blattoberseite und die Mittelrippen der Blätter entfernt. Die Blätter wurden mit einer Rasierklinge in etwa 1 cm² große Stücke geschnitten. Die Agrobakterienkultur wurde in eine kleine Petrischale überführt (Durchmesser 2 cm). Die Blattstücke wurden kurz durch diese Lösung gezogen und mit der Blattunterseite auf 2MS-Medium in Petrischalen (Durchmesser 9 cm) gelegt, so daß sie das Medium berührten. Nach zwei Tagen im Dunkeln bei 25°C wurden die Explantate auf Platten mit Kallusinduktionsmedium überführt und in der Klimakammer auf 28°C temperiert. Das Medium mußte alle 7 bis 10 Tage gewechselt werden. Sobald sich Kalli bildeten, wurden die Explantate in sterile Einweckgläser auf Sproß­ induktionsmedium mit Claforan (0,6% BiTec-Agar (g/v), 2,0 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Gibberelin­ säure, 0,25 g/ml Claforan, 1,6% Glukose (g/v) und 50 mg/l Kanamycin) überführt. Nach etwa einem Monat trat Organogenese ein und die gebildeten Sprosse konnten abgeschnitten werden. Die Kultivierung der Sprosse wurde auf 2MS-Medium mit Claforan und Selektionsmarker durchgeführt. Sobald sich ein kräftiger Wurzel­ ballen gebildet hatte, konnten die Pflanzen in Pikiererde getopft werden.

Beispiel 7 Charakterisierung der transgenen Pflanzen aus Beispiel 4, 5 und 6

Es wurden die Tocopherol- und Tocotrienol-Gehalte in Blätter und Samen der mit den beschriebenen Konstrukten transformierten Pflanzen (Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum) analysiert. Dazu wurden die transgenen Pflanzen im Gewächshaus kultiviert und Pflanzen die das Gen kodierend für die Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 exprimieren auf Northern- und Western Ebene analysiert. In Blättern und Samen dieser Pflanzen wurde der Tocopherolgehalt und der Tocotrienol­ gehalt mittels HPLC ermittelt. In allen Fällen war der Toco­ pherol- und/oder Tocotrienol-Gehalt in transgenen Pflanzen, die zusätzlich ein tyrA-Gen exprimieren, im Vergleich zu nicht trans­ formierten Pflanzen erhöht.

Tabelle 1A (junge Blätter) und 1B (seneszierende Blätter) zeigen die Gehalte [µg/gFG] an α-Tocopherol, γ-Tocopherol, α-Tocotrienol und Gesamt-Vitamin E in Blättern unterschiedlichen Alters in Nicotiana tabacum, cv. SNN-Wildtyp (angegebene Werte MW +/-SD, n = 9) und Pflanzen, die das Tyr A Gen aus E. coli über­ exprimieren.

Tabelle A

junge Blätter

Tabelle B

seneszierende Blätter

Beispiel 8 Klonierung eines Subfragmentes des Gens kodierend für die plastidär exprimierte Chorismat Mutase-1 aus Arabidopsis thaliana

Die DNA Sequenz kodierend für das Transitpeptid des Chorismat- Mutase-1-Gen wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (CM-1TP 5' SEQ ID Nr. 11) und eines antisense spezifi­ schen Primers (CM-1TP 3' SEQ ID NO. 12) amplifiziert.

Die PCR Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR erfolgte in einem 50 µl Reaktionsansatz in dem enthalten war:

• - 2 µl einer Arabidopsis thaliana cDNA
• - 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP
• - 1,5 mM Mg(OAc)₂
• - 5 µg Rinderserum-Albumin
• - 40 pmol CM-1TP 5'Primer
• - 40 pmol CM-1TP 3'Primer
• - 15 µl 3,3 µ rTth DNA Polymerase XLPuffer (PE Applied Biosystems)
• - 5 U rTth DNA Polymerase XL (PE Applied Biosystems)

Die PCR wurde unter folgenden Zyklus Bedingungen durchgeführt:
Schritt 1: 5 Minuten 94°C (Denaturierung)
Schritt 2: 3 Sekunden 94°C
Schritt 3: 1 Minute 55°C (Annealing)
Schritt 4: 2 Minuten 72°C (Elongation)
30 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4
Schritt 5: 10 Minuten 72°C (Post-Elongation)
Schritt 6: 4°C (Warteschleife)

Das Amplikon wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR Klonierungsvektor pCR-Script (Stratagene) kloniert. Die Identität des erzeugten Amplikons wurde durch Sequenzierung unter Verwendung eines Vektor-spezifischen Primers bestätigt.

Beispiel 9 Klonierung des Gens kodierend für die cytosolisch exprimierte Chorismat Mutase-2 aus Arabidopsis thaliana

Die DNA kodierend für das Chorismat-Mutase-2-Gen wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (CM-2 5' SEQ ID NO. 13) und eines antisense spezifischen Primers (CM-2 3' SEQ ID NO. 14) amplifiziert.

Die PCR Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR erfolgte in einem 50 µl Reaktionsansatz in dem enthalten war:

• - 2 µl einer Arabidopsis thaliana cDNA
• - 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP
• - 1,5 mM Mg(OAc)₂
• - 5 µg Rinderserum-Albumin
• - 40 pmol CM-2 5'Primer
• - 40 pmol CM-2 3'Primer
• - 15 µl 3,3 µ rTth DNA Polymerase XLPuffer (PE Applied Biosystems)
• - 5 U rTth DNA Polymerase XL (PE Applied Biosystems)

Die PCR wurde unter folgenden Zyklus Bedingungen durchgeführt:
Schritt 1: 5 Minuten 94°C (Denaturierung)
Schritt 2: 3 Sekunden 94°C
Schritt 3: 1 Minute 55°C (Annealing)
Schritt 4: 2 Minuten 72°C (Elongation)
30 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4
Schritt 5: 10 Minuten 72°C (Post-Elongation)
Schritt 6: 4°C (Warteschleife)

Das Amplikon wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR Klonierungsvektor pGEM-T (Promega) kloniert. Die Identität des erzeugten Amplikons wurde durch Sequenzierung unter Ver­ wendung des M13F (-40) Primers bestätigt.

Beispiel 10 Erzeugung des chimären Genkonstruktes CM-1-TP-CM-2 bestehend aus der DNA Sequenz kodierend für das Transitpeptid (TP) der Chorismatmutase-1 (CM-1) und der DNA Sequenz kodierend für die Chorismatmutase-2 (CM-2)

Zur Erzeugung des chimären Gens CM-1-TP-CM-2, wurde das Plasmid pCR-Script/CM-1-TP mit den Restriktionsenzyme NcoI/SalI verdaut.

In dieses Plasmid wurde das aus dem Plasmid pGEM-Teasy/CM-2 mittels der Restriktionsenzyme NcoI/SalI isolierte DNA-Fragment der CM-2 ligiert. Die Translation dieses chimären DNA-Konstruktes (SEQ ID No. 5) (pCR-Script/AtCM-1TP-AtCM-2, Fig. 4 hat die Bildung eines Fusionsproteins zur Folge, indem das Transitpeptid der CM-1 mit der CM-2 kombiniert ist (SEQ ID NO. 6).

Beispiel 11 Herstellung pflanzlicher Expressionskassetten enthaltend das chimäre Gen CM-1-TP-CM-2

Transgene Pflanzen wurden erzeugt, die das chimäre Gen CM-1-TP-CM2 aus A. thaliana zum einen unter Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., Cell 21: 285-294, 1980) und zum anderen unter Kontrolle des samenspezifischen Promotors des Legumin Gens aus Vicia faba (Kafatos et al., Nuc. Acid. Res., 14(6): 2707-2720, 1986) exprimieren.

Die Grundlage des zur konstitutiven Expression des chimären Gens CM-1TP-CM-2 war der Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sci. 66: 221-230, 1990). Dieser Vektor enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., 1980) und das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens (Gielen et al., EMBO J. 3: 835-846, 1984). Zur Erstellung dieses Plasmides wurde das chimäre Gen CM-1-TP-CM2 unter Verwendung der flankierenden Restriktionsschnittstellen KpnI/SalI aus dem Plasmid pCR-Script/­ AtCM-1TP-AtCM-2 (Abb. 4) isoliert. Dieses Fragment wurde unter Anwendung von Standardmethoden in einen KpnI/SalI geschnittenen pBinAR ligiert. Das resultierende Plasmid (pBinAR/CM-1TP/CM-2, Abb. 5) wurde zur Erzeugung transgener Arabidopsis thaliana und Nicotiana tabacum verwendet.

Zur Erzeugung eines Plasmides, welches die samenspezifische Expression des chimären Gens CM-1TP/CM-2 in Pflanzen ermöglicht, wurde der samenspezifiche Promotor des Legumin B4 Gens (Kafatos et al., Nuc. Acid. Res., 14(6): 2707-2720, 1986) verwendet. Aus dem Plasmid pGEMTeasy/lePNOS wurde das 2,7 Kb Fragment des Legumin B4 Gen Promotors unter Verwendung der den Promotor 5' flankierenden EcoR1 und der 3' flankierenden KpnI Schnittstellen isoliert. Das Plasmid pBinAR/CM-1TP/CM-2 wurde ebenfalls mit den Restriktions­ enzymen EcoR1 und Kpn1 behandelt. Dies hatte zur Folge, daß der 35S-Promotor des CaMV aus diesem Plasmid herausgetrennt wurde, siehe Fig. 5). Der Promotor des Legumin Gens wurde anschließend als EcoR1/Kpn1 Fragment in diesen Vektor kloniert, wodurch ein Plasmid erzeugt wurde, welches die Expression des chimären Gens CM-1TP-CM-2 unter die Kontrolle dieses samenspezifischen Promotors stellte, siehe Fig. 6). Dieses Plasmid (pBinLeP/­ CM-1TP/CM-2) wurde zur Erzeugung transgener Arabidopsis thaliana, und Nicotiana tabacum Pflanzen verwendet.

Beispiel 12 Herstellung transgener Arabidopis thaliana Pflanzen, die das chimären Gen CM-1-TP-CM-2 exprimieren

Die Herstellung der Pflanzen erfolgte analog zu Beispiel 4 unter Verwendung der Plasmide (pBinAR/AtCM-1TP/CM-2) und (pBinLeP/­ CM-1TP/CM-2).

Beispiel 13 Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen, die das tyrA-Gen exprimieren

Die Herstellung der Pflanzen erfolgte analog zu Beispiel 5 unter Verwendung der Plasmide (pBinAR/AtCM-1TP/CM-2) und (pBinL 02387 00070 552 001000280000000200012000285910227600040 0002010064454 00004 02268eP/­ CM-1TP/CM-2).

Beispiel 14 Herstellung transgener Nicotiana tabacum Pflanzen, die das tyrA-Gen exprimieren

Die Herstellung der Pflanzen erfolgte analog zu Beispiel 6 unter Verwendung der Plasmide (pBinAR/AtCM-1TP/CM-2) und (pBinARleP/­ CM-1TP/CM-2).

Beispiel 15 Charakterisierung der transgenen Pflanzen aus Beispiel 12, 13 und 14

Es wurden die Tocopherol- und Tocotrienol-Gehalte in Blätter und Samen der mit den beschriebenen Konstrukten transformierten Pflanzen (Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum) analysiert. Dazu wurden die transgenen Pflanzen im Gewächshaus kultiviert und Pflanzen die das Gen kodierend für die cytosolische Chorismatmutase exprimieren auf Northern- und Western Ebene analysiert. In Blättern und Samen dieser Pflanzen wurde der Tocopherolgehalt und der Tocotrienolgehalt mittels HPLC ermittelt. In allen Fällen war der Tocopherol- und/oder Toco­ trienol-Gehalt in transgenen Pflanzen, die zusätzlich Chorismat­ mutase-Gene exprimieren, im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen erhöht.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (37)

1. Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien durch Kulti­ vierung von Organismen die gegenüber dem Wildtyp einen genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur genetischen Veränderung des Shikimatweges mindestens eine Maßnahme ausgewählt aus der Gruppe der Maßnahmen A und B durchführt, wobei A und B folgende Bedeutung haben:

• 1. A: Erhöhung der Aktivität mindestens eines Enzyms des Shikimatweges des Wildtyps;
• 2. B: Einbringen mindestens eines Gens in den Organismus zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist und das den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrückt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Maßnahme A die Aktivität mindestens eines Enzyms des Shikimatweges durch Überexpression von Nukleinsäuren erhöht, die Proteine mit dieser enzymatischen Aktivität codieren.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure, codierend eine Chorismatmutase in den Organismus einbringt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure codierend eine Chorismatmutase in den Organismus einbringt, deren Aktivität einer reduzierten posttranslationalen Regulation im Organismus unterliegt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure codierend eine Chorismatmutase in den Organismus einbringt die an der Lokalisation der Expression im Organismus einer reduzierten posttranslationalen Regulation unterliegt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Organismus eine Pflanze verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine cytosolische Chorismatmutase in Plastiden einer Pflanze einbringt.

9. verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nukleinsäurekonstrukt in die Pflanze einbringt, ent­ haltend eine Nukleinsäure kodierend ein plastidäres Transit­ peptid und eine Nukleinsäure die ein Protein kodiert, ent­ haltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 4 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 4 und die enzymatische Eigenschaft einer Choris­ matmutase aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nukleinsäure, kodierend ein plastidäres Transitpeptid eine Nukleinsäure verwendet, die das plastidäre Transitpeptid einer plastidären Chorismatmutase kodiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nukleinsäurekonstrukt der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 5 in Pflanzen einbringt.

12. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend ein plastidäres Transitpeptid und eine Nuklein­ säure die ein Protein kodiert, enthaltend die Aminosäure­ sequenz SEQ ID NO. 4 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 4 und die enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase aufweist.

13. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Nukleinsäure, kodierend ein plastidäres Transitpeptid eine Nukleinsäure verwendet, die das plastidäre Transitpeptid einer plastidären Chorismatmutase kodiert.

14. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 5 aufweist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus eine Pflanze verwendet und daß man bei Maßnahme B als Gen zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist eine Nukleinsäure codierend eine Prephenatdehydrogenase in eine Pflanze ein­ bringt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure codierend eine Prephenatdehydrogenase in Kombination mit einer Nukleinsäure codierend eine Chorismatmuate in eine Pflanze einbringt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure codierend eine Chorismatmutase-Prephenat­ dehydrogenase in eine Pflanze einbringt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure einbringt, die ein Protein kodiert, ent­ haltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aufweist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure bakterieller Herkunft verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure verwendet, die die in SEQ ID NO. 1 dargestellten Sequenz enthält.

21. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, 8 und 15 bis 17, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewähr­ leisten.

22. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 21, enthaltend zusätzlich eine Nukleinsäure kodierend ein plastidäres Transitpeptid.

23. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 22, enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 12.

24. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 22, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend ein plastidäres Transitpeptid und eine Nukleinsäure die ein Protein kodiert, enthaltend die Amino­ säuresequenz SEQ ID NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abge­ leitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase-Prephenat­ dehydrogenase aufweist.

25. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, 8 und 15 bis 17 und der Nukleinsäurekonstrukte gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 und 21 bis 24 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.

26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Pflanze gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Feinchemikalien aufweist.

27. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Pflanze gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Resistenz gegenüber abiotischem Streß aufweist.

28. Genetisch veränderter Organismus, wobei die genetische Ver­ änderung den Metabolitfluß des Shikimatweges gegenüber dem Wildtyp verändert und der Organismus gegenüber dem Wildtyp einen veränderten Gehalt an Feinchemikalien aufweist.

29. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 28, wobei die genetische Veränderung die Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine Chorismatmutase, Prephenatdehydrogenase oder Choroismatmutase-Prephenatdehydrogenase gegenüber einem Wild­ typ
für den Fall, daß der Ausgangsorganismus die entsprechende Nukleinsäure enthält, erhöht oder
für den Fall, daß der Ausgangsorganismus die entsprechende Nukleinsäure nicht enthält, verursacht.

30. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 29, trans­ formiert mit einem Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24.

31. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 29, enthaltend einem Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24.

32. Genetisch veränderter Organismus nach einem der Ansprüche 28 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus eine Pflanze verwendet.

33. Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen gemäß einem der Ansprüche 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, 8 und 15 bis 17 oder mindestens ein Nukleinsäurekonstrukte gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 und 21 bis 24 in das Genom des Ausgangsorganismus ein­ führt.

34. Verwendung der genetisch veränderten Organismen nach einem der Ansprüche 28 bis 32 zur Herstellung von Feinchemikalien.

35. Verwendung der genetisch veränderten Organismen nach einem der Ansprüche 28 bis 32 als Futter- und Nahrungsmittel oder zur Herstellung von prozessierten Lebensmittel.

36. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, 8 und 15 bis 17 und der Nukleinsäurekonstrukte gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 und 21 bis 24 zur Erhöhung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen.

37. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, 8 und 15 bis 17 und der Nukleinsäurekonstrukte gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 und 21 bis 24 zur Herstellung von Feinchemikalien in Organismen.