EP1576164A2 - VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON TRANSGENEN PFLANZEN MIT ERHöHT EM VITAMIN E-GEHALT DURCH VER äNDERUNG DES SERIN-ACETYLTRANSF ERASE-GEHALTS - Google Patents

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON TRANSGENEN PFLANZEN MIT ERHöHT EM VITAMIN E-GEHALT DURCH VER äNDERUNG DES SERIN-ACETYLTRANSF ERASE-GEHALTS

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EP1576164A2
EP1576164A2 EP03780153A EP03780153A EP1576164A2 EP 1576164 A2 EP1576164 A2 EP 1576164A2 EP 03780153 A EP03780153 A EP 03780153A EP 03780153 A EP03780153 A EP 03780153A EP 1576164 A2 EP1576164 A2 EP 1576164A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
sat
content
plants
plant
sats
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03780153A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Geiger
Susanne Tropf
Klaus-Dieter Salchert
Ulrich Keetman
Karin Herbers
Rainer Lemke
Rüdiger HELL
Markus Wirtz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
SunGene GmbH
Original Assignee
Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
SunGene GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, SunGene GmbH filed Critical Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Publication of EP1576164A2 publication Critical patent/EP1576164A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of transgenic plants and / or plant cells with an increased vitamin E content, the transgenic plants or plant cells having a serine acetyltransferase (SAT) content and / or activity that is different from that of the wild type and / or have an altered content of thiol compounds.
  • the present invention also relates to the use of nucleic acids which code for a SAT for the production of transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content.
  • the present invention also relates to a process for the production of vitamin E by culturing transgenic plants or plant cells which have a content of SAT which is different from that of the wild type.
  • Vitamin E usually refers to the eight naturally occurring compounds with vitamin E activity, which are derivatives of 6-chromanol (UUmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4 ., 478-488, vitamin E).
  • the group of tocopherols (1) has a saturated side chain
  • the group of tocotrienols (2) has an unsaturated side chain:
  • vitamin E means all of the above-mentioned tocopherols and tocotrienols with vitamin E activity.
  • Vitamin E compounds are important natural fat-soluble antioxidants. A lack of vitamin E leads to pathophysiological situations in humans and animals. Vitamin E compounds therefore have a high economic value as additives in the food and feed sector, in pharmaceutical formulations and in cosmetic applications.
  • the .alpha.-tocopherol is biologically most important.
  • the tocopherols and tocotrienols are found in many vegetable oils; the seed oils of soy, wheat, corn, rice, cotton, rapeseed, alfalfa and nuts are particularly rich in tocopherols and tocotrienols.
  • fruits and vegetables such as raspberries, beans, peas, fennel, peppers etc. contain the above-mentioned vitamin E compounds.
  • tocopherols and tocotrienols are synthesized exclusively in plants or photosynthetically active organisms. Some of the most important synthetic routes of tocopherols and tocotrienols are shown in Figures la and lb.
  • tocopherols Due to their redox potential, tocopherols help to prevent the oxidation of unsaturated fatty acids by atmospheric oxygen; ⁇ -tocopherol is the most important fat-soluble antioxidant in humans. It is believed that tocopherols act as antioxidants to stabilize biological membranes by protecting unsaturated fatty acids
  • tocopherol the membrane fluidity is maintained. According to recent findings, the formation of arteriosclerosis can also be counteracted by the regular intake of relatively high doses of tocopherol. Further beneficial properties of tocopherols have been described as delaying late-stage diabetes-related damage, reducing the risk of cataract formation, reducing oxidative stress in smokers, anticarcinogenic effects, and protective effects against skin damage such as erythema and aging. Tocopherol compounds such as tocopherol acetate and succinate are the usual forms of application for the use of vitamin E in blood circulation and lipid-lowering agents and veterinary as a feed additive.
  • tocopherols and tocotrienols are not only used in terms of food technology, but also in paints based on natural oils, in deodorants and other cosmetics such as sunscreens, skin care products, lipsticks etc.
  • tyrosine is formed from chorismate, prephenate and arogenate.
  • the aromatic amino acid tyrosine is converted into hydroxyphenyl pyruvate by the enzyme tyrosine aminotransferase, which is converted into homogentisic acid by dioxygenation.
  • the homogentisic acid is then bound to phytyl pyrophosphate (PPP) or geranylgeranyl pyrophosphate to form the precursors of ⁇ -tocopherol and ⁇ -tocotrienol, the 2-methyl-6-phytylhydroquinol or the 2-methyl-6-geranylgeranylhydroquinol.
  • PPP phytyl pyrophosphate
  • geranylgeranyl pyrophosphate to form the precursors of ⁇ -tocopherol and ⁇ -tocotrienol, the 2-methyl-6-phytylhydroquinol or the 2-methyl-6-geranylgeranylhydroquinol.
  • WO 97/27285 describes a modification of the tocopherol content by increased expression or by down-regulation of the enzyme p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD).
  • HPPD p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase
  • WO 99/04622 and DellaPenna et al, (1998) Science 282, 2098-2100 describe gene sequences coding for a ⁇ -tocopherol methyltransferase from Synechocystis PCC6803 and Arabidopsis thaliana and their incorporation into transgenic plants which have a modified vitamin E content.
  • WO 99/23231 shows that the expression of a geranylgeranyl reductase in transgenic plants results in an increased tocopherol biosynthesis.
  • WO 00/08169 describes gene sequences encoding an l-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase and a geranyl-geranyl-pyrophosphate oxidoreductase and their incorporation into transgenic plants which have a modified vitamin E content.
  • WO 00/68393 and WO 00/63391 describe gene sequences encoding a phytyl / prenyl transferase and their incorporation into transgenic plants which have a modified vitamin E content.
  • WO 00/61771 postulates that the combination of a gene from the sterol metabolism in combination with a gene from the tocopherol metabolism can lead to an increase in the tocopherol content in transgenic plants.
  • the invention is therefore based on the object of providing a method which enables the production of transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content.
  • Serine acetyltransferase (SAT, EC2.3.1.30) is involved in the two-step process by which cysteine biosynthesis is accomplished in vivo in microorganisms and plants.
  • SAT ensures the formation of the activated thioester O-acetylserine (OAS) from serine and acetyl-coenzymeA. Free sulfide is introduced into O-acetylserine to obtain cysteine and acetate by enzymatic catalysis by O-acetylserine (thiol) lyase.
  • the reaction catalyzed by SAT represents the rate-limiting step, the activity of this enzyme being found exclusively in conjunction with O-acetylserine (thiol) lyase (OAS-TL) in the so-called cysteine synthase complex.
  • OAS-TL depends on the activity SAT-free homodimers are present in large excess (Kredich et al., (1969) J. Biol. Chem., 244, 2428-2439; Saito (2000) Curr. Opin. Biol. 3, 188-195).
  • SATs Microbial, vegetable and animal SATs can be divided into different groups according to their allosteric controllability. A number of SATs are inhibited by the end product of the biosynthetic pathway they catalyze, cysteine. Such SATs are commonly referred to as feedback-regulated SATs (Wirtz et al., (2002), Amino acids, in press; Hell et al., (2002) Amino Acids 22, 245-257; Noji et al, (1998) J Biol. Chem. 273, 32739-45; Inoue et al., (1999) Eur. J. Biochem. 266, 220-27; Saito (2000) Curr. Op. Plant Biol. 3, 188-95).
  • the prototypes for feedback-regulated SATs are the microbial SATs CysE from E. coli (Accession Code E12533; Denk and Bock (1987) J. Gen. Microbiol. 133, 515-25) and S. typhimurium (Accession Code A00198; Kredich and Tomkins (1966) J. Biol. Chem. 241, 4955-65), and the vegetable SATs SAT-c from A. thaliana (Accession Code U30298; Noji et al., Vide supra), SAT2 from Citrullus vulgaris (Accession Code D49535 ; Saito et al, (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321-26) and SAT56 from Spinacia oleracea (Accession Code D88529; Noji et al., (2001) Plant Cell Physiol. 42, 627-34).
  • SATs that can be inhibited to a much lesser extent by cysteine or not at all by cysteine.
  • These SATs are also called feedback-independent SATs.
  • Typical representatives of such feedback-independent SATs are so far only known from plants. These include e.g. Arabidopsis thaliana SAT A (EMBL Accession code X82888;
  • the change in the content or the activity of functional or non-functional SATs in plants can be used to produce transgenic plants or plant cells which have increased vitamin E contents .
  • the change in the content and / or the activity of SATs in transgenic plants or plant cells can be e.g. can be attributed to plant cells or plants due to the transmission and overexpression of nucleic acids which code for functional or non-functional SATs.
  • the change in the content and / or the activity of SAT in transgenic plants or plant cells with increased vitamin E content can also be due to the up or down regulation of the activity and / or the amount of endogenous SATs synthesized.
  • the change in the content of thiol compounds can be used to produce transgenic plants or plant cells which have increased vitamin E contents.
  • the change in the content of thiol compounds can be attributed, for example, to the change in the content and / or the activity of SATs in transgenic plants or plant cells and thus, for example, to the transmission and overexpression of nucleic acids which are necessary for functional or non-functional SATs code, can be reached on plant cells or plants.
  • the change in the content of thiol compounds can also affect the Changes in the content and / or the activity of other enzymes involved in the metabolic pathways of thiol compounds can be attributed to plant and thus, for example, by the transfer and overexpression of nucleic acids which code for such enzymes or homologs, mutants or fragments thereof. cells or plants can be reached.
  • the present invention therefore relates to a process for the production of transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content and a changed content and / or activity of SAT compared to the wild type.
  • the invention also relates to a method for producing transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content, in which the expression of SAT by transferring nucleic acid sequences which code for functional or nonfunctional SATs or functional equivalents thereof to plants or Plant cells is effected.
  • the present invention further relates to processes for the production of transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content, in which the activity or amount of endogenous SAT is up or down regulated.
  • Another object of the invention is a method for producing transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content, in which antibodies which are specific for SATs and which possibly inhibit their function are expressed in the cell.
  • the invention further relates to processes for the production of transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content, in which the post-translational modification status of overexpressed or endogenous functional and / or non-functional SATs is changed.
  • the present invention also relates to processes for the production of transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content, in which the expression of some of the endogenous SAT genes by processes such as, for example, antisense processes, post-transcriptional gene silencing (PTGS ), virus-induced gene silencing (VIGS), RNA interference (RNAi) or homologous recombination was silenced.
  • the invention also relates to transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content, which have a content and / or activity of SAT which is different compared to the wild type.
  • the present invention also relates to a process for the production of transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content, the plants having a modified content of thiol compounds compared to the wild type.
  • the present invention also relates to transgenic plants or plant cells which have been produced by one of the processes according to the invention and which have increased vitamin E contents compared to the wild type.
  • Another object of the present invention is the use of nucleic acids, which code for functional or non-functional SATs from different organisms, for the production of transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content.
  • serine acetyltransferase activity means the enzyme activity of a serine acetyltransferase.
  • a serine acetyl transferase is understood to be a protein which has the enzymatic activity of linking serine and acetyl coenzyme A to the activated thioester O-acetylserine (OAS).
  • serine acetyltransferase activity is understood to mean the amount of serine converted or amount of O-acetylserine formed in a certain time by the protein serine acetyltransferase.
  • SAT activity is different from that of the wild type, a different amount of serine is converted or a different amount of O-acetylserine is formed by the protein SAT compared to the wild type in a certain time.
  • the amount of serine converted or the amount of O-acetylserine formed is increased in a certain time by the protein SAT compared to the wild type.
  • the amount of serine converted or the amount of O-acetylserine formed is reduced by the protein SAT in a certain time compared to the wild type.
  • the content of SAT in the plant or plant cell is lower than that of the wild type, less SAT is produced in comparison to the wild type. If the content of thiol compounds is different from that of the wild type, a different amount of the thiol compounds is thus produced in the plant or plant cell compared to the wild type. The same applies to increased or decreased thiol contents.
  • the increase in the content and / or the activity of SAT in a transgenic plant cell or plant brought about by a method according to the invention is preferably at least 5%, preferably at least 20%, likewise preferably at least 50%, particularly preferably at least 100%), likewise particularly preferably at least the factor 5, particularly preferably at least the factor 10, likewise particularly preferably at least the factor 50, more preferably at least the factor 100 and most preferably at least the factor 1000.
  • the reduction in the content and / or the activity of SAT in a transgenic plant cell or plant brought about by a method according to the invention is preferably at least 5%, preferably at least 10%, particularly preferably at least 20%, likewise particularly preferably at least 40%, also particularly particularly preferably at least 60%, particularly preferably at least 80%, also particularly preferably at least 90% and most preferably at least 98%).
  • a wild type is understood to mean the corresponding non-genetically modified starting organism.
  • SAT is used in the context of the present invention, this means both feedback-regulated and feedback-independent SATs.
  • the term SAT includes functional and non-functional SATs. Functional SATs fall under the definition as given above for a SAT.
  • non-functional SATs have the same nucleic acid or amino acid sequences as functional SATs or functional equivalent parts thereof, but have point mutations, insertions or deletions of nucleotides or amino acids at some points which have the effect that the nonfunctional SATs do not or are only able to acetylate to a very limited extent to form O-acetylserine.
  • Non-functional SATs also include those SATs that carry point mutations, insertions or deletions at the nucleic acid or amino acid sequence level and are not or are nevertheless able to interact with physiological binding partners of the SAT.
  • physiological binding partners include e.g. the O-acetylserine (thiol) lyase.
  • non-functional SAT does not include those proteins which have no essential sequence homology at the amino acid or nucleic acid level to functional SATs. Proteins which are not able to transfer acetyl groups to serine and which have no essential sequence homology with SATs are therefore by definition not meant by the term “non-functional SATs” according to the invention. Non-functional SATs are also referred to as inactivated or inactive SATs in the context of the invention.
  • non-functional SATs according to the invention which carry the point mutations, insertions and / or deletions mentioned above are characterized by a essential sequence homology to the known functional SATs according to the invention or their functionally equivalent parts.
  • essential sequence homology is generally understood to mean that the nucleic acid or amino acid sequence of a DNA molecule or a protein is at least 40%, preferably at least 50%, more preferably at least 60%, likewise preferably at least 70%, particularly preferably is at least 90%, particularly preferably at least 95% and most preferably at least 98% identical to the nucleic acid or amino acid sequences of a known functional SAT or their functionally equivalent parts.
  • Identity between two proteins is understood to mean the identity of the amino acids over the respective total protein length, in particular the identity which is determined by comparison with the aid of the laser gene software from DNA Star, Inc., Madison,
  • Homologies can also be determined using the laser gene software from DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (USA) using the CLUSTAL method (Higgins et al, (1989), Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151) can be calculated.
  • Nucleic acid or amino acid sequences of feedback-regulated or feedback-independent functional SATs are known to the person skilled in the art. You can e.g. from the well-known databases such as the nucleotide sequence database Genbank or the protein sequence database of the NCBI. In addition, there are numerous examples of the SATs mentioned in the literature (see above).
  • the nucleic acid sequences for feedback-independent functional SATs from plants, microorganisms, fungi and animals are also particularly preferred for the methods according to the invention.
  • the cDNA sequences of the Nicotiana tabacum SAT genes 1, 4 and 7 (EMBO accession numbers AJ414051, AJ414052 and AJ414053) and the Arabidopsis thaliana SAT genes SAT 52, SAT 5 and SAT A (EMBL Accession Codes U30298, Z34888 and X82888).
  • SAT-p accession code L42212; Noji et al, (1998) vide supra
  • SAT-m identical to SAT A; Accession code X82888; Noji et al, ( 1998) vide supra; Bogdanova and Hell (1995) Plant Physiol, 109, 1498; Wirtz et al, (2002) vide supra).
  • Nucleic acids encoding proteins containing the amino acid sequence GKXXGDRHPKIGD (X stands for any amino acid; Wirtz et al, (2001) Eur. J. Biochem. 268, 686-93) or one of these sequences are particularly preferably used for the method according to the invention sequence derived by substitution, insertion or deletion of amino acids, which has an identity of at least 30%>, preferably of at least 50%), preferably of at least 70% o, more preferably at least 90%), most preferably at least 95%) at the amino acid level with the sequence with the accession code X82888 (Bogdanova et al., (1995) FEBS L. 358, 43-47; Bogdanova and Hell (1995) Plant Physiol. 109, 1498; Wirtz et al., 2002, vide supra) and which have the enzymatic property of a SAT.
  • Non-functional feedback-regulated or non-functional feedback-independent SATs can be identified in a simple manner by the person skilled in the art.
  • a number of techniques are available to the person skilled in the art with which it is possible to insert mutations, insertions or deletions into the nucleic acid sequences which code for functional SATs (Sambrook (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the person skilled in the art can determine whether the mutagenized SATs still have enzyme activity by appropriate enzyme activity tests, as shown in the examples or known from the prior art feature.
  • Non-functional SATs have a reduced activity compared to the non-mutagenized SAT.
  • a non-functional SAT has from 1 to 90%, preferably from 1 to 70%, particularly preferably from 1 to 50%, likewise particularly preferably from 1 to 30%, particularly preferably from 1 to 15% and most preferably over 1 to 10%> of the activity of the corresponding functional SAT with wild-type sequence.
  • Non-functional SATs that are no longer (or nevertheless) able to bind to physiological binding partners of the SAT, e.g.
  • the person skilled in the art can also identify OAS-TL in routine experiments using appropriate in vitro binding tests.
  • Preferred non-functional SATs for the methods according to the invention are nucleic acid sequences which are used for a non-functional SAT with reduced encoded enzyme activity, the SAT at least one amino acid exchange within the amino acid motif preserved in SAT enzymes
  • the amino acid X is generally any amino acid; Xi is preferably Q or A; amino acid X is preferably C or S. Amino acids are abbreviated in the one-letter code. The N- or C-terminal amino acids located next to this motif are also highly conserved in SATs.
  • the core motif within the amino acid sequence motif mentioned is DRH. An amino acid exchange within this core motif is particularly preferred.
  • the mutation which leads to the enzymatic inactivation of the SAT is an amino acid exchange of the amino acid histidine within the motif mentioned.
  • An exchange of histidine to alanine is particularly preferred.
  • point mutation is to be understood as the replacement of an amino acid or a nucleotide by another amino acid or another nucleotide.
  • conservative exchanges are preferably carried out, in which the replaced amino acid has similar physico-chemical properties to the original amino acid, for example an exchange of glutamate by aspartate or valine by isoleucine.
  • Deletion is the replacement of an amino acid or nucleotide with a direct link.
  • Insertions are insertions of amino acids or nucleotides into the polypeptide chain or into the nucleic acid molecule, a direct bond being formally replaced by one or more amino acids or nucleotides.
  • SAT1 stands for Arabidopsis thaliana SAT isoform A (SAT-1, database axcession no. U 22964)
  • SAT5 stands for Arabidopsis thaliana SAT isoform B (SAT-5, database axcession no. Z 34888)
  • SAT52 stands for the Arabidopsis thaliana SAT isoform C (SAT-52, database axcession no. U 30298)
  • CysE stands for the SAT enzyme from S. typhimurium (CysE, database accession no. A 00198); TDT stands for tetrahydrodipicolinate-N-succinyl transferase from E.
  • LpxA stands for UDP-N-acetylglucosamine acyltransferase from E. coli (LpxA; database accession no. P 10440).
  • LpxA stands for UDP-N-acetylglucosamine acyltransferase from E. coli (LpxA; database accession no. P 10440).
  • Further sequence information can be found in Murillo et al., (1995) Cell. Mol. Biol. Res. 41, 425-433; Howarth et al., (1997) Biochim. Biophys. Acta 1350, 123-127; Saito et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321-16326, Genbank Accession no. D 88530 (K. Saito).
  • the enclosed alignment shows the position of the motif suitable for the inactivation of the SAT enzyme. Accordingly, the position of the conserved amino acid motif in further, the
  • the core motif D R H is in the Arabidopsis thaliana SAT isoform A at amino acid 307-309, whereby the numbering always refers to the first methionine of the longest open reading frame.
  • the position of the motif in the other SAT isoforms can easily be found in the amino acid alignment shown in Fig. 2.
  • DNA sequences with high homology i.e. a high similarity or identity are bona fide candidates for DNA sequences which correspond to the DNA sequences according to the invention, i.e. Correspond to SATs.
  • These gene sequences can be determined by standard methods, e.g. PCR and hybridization are isolated, and their function can be determined by appropriate enzyme activity tests and other experiments by the person skilled in the art.
  • Homology comparisons with DNA sequences can also be used according to the invention to design PCR primers by first identifying the regions which are most conserved between the DNA sequences of different organisms. Such PCR primers can then be used to isolate in a first step DNA fragments which are components of DNA sequences which are homologous to the DNA sequences of the invention.
  • search engines that can be used for such homology comparisons or searches. These search engines include e.g. the CLUSTAL program group of the BLAST program, which is made available by the NCBI.
  • the present invention also relates to a process for the production of transgenic plants or plant cells with an increased vitamin E content, the plants having a modified content of thiol compounds compared to the wild type.
  • these trapped plants show increased levels of thiol compounds compared to the wild type.
  • the increase in thiol compounds can be at least a factor of 2, preferably at least a factor of 5, particularly preferably at least a factor of 10, particularly preferably at least a factor of 20 and most preferably at least a factor of 100.
  • the increase in the vitamin E content usually corresponds to the values mentioned below.
  • thiol compounds are understood to mean compounds with thiol groups that occur naturally in plants.
  • the thiol compounds include glutathione, S-adenosylmethionine, methionine and cysteine.
  • transgenic plants with an altered content of thiol compounds e.g. by changing the content and / or activity of SAT, as discussed in detail below.
  • transgenic plants can also be produced by changing the content and / or the activity of other enzymes which are involved in the production of thiol compounds.
  • the SAT activity and the SAT content can be increased in various ways, for example by switching off inhibitory regulatory mechanisms at the level of transcription, translation and protein or by Increasing the gene expression of a nucleic acid coding for a SAT compared to the wild type, for example by inducing the SAT gene or by introducing nucleic acids coding for a SAT.
  • the SAT activity or the SAT content is increased compared to the wild type by increasing the gene expression of a nucleic acid encoding a SAT.
  • the gene expression of a nucleic acid encoding a SAT is increased by introducing nucleic acids encoding a SAT into the organism, preferably into a plant.
  • any SAT gene from a wide variety of organisms ie any nucleic acid encoding a SAT
  • genomic SAT nucleic acid sequences from eukaryotic sources which contain introns in the event that the host organism is unable or unable to splice the corresponding SATs, nucleic acid sequences which have already been processed, such as the corresponding cDNAs, are preferred use. All of the nucleic acids mentioned in the description can e.g. be an RNA, DNA or cDNA sequence.
  • a nucleic acid sequence which codes for one of the functional or non-functional, feedback-regulated or feedback-independent SATs defined above is generated transfer a plant or plant cell.
  • This transmission leads to an increase in the expression of the functional or non-functional SAT and accordingly to an increase in the vitamin E content in the transgenic plants or plant cells.
  • such a method typically comprises the following steps:
  • a promoter sequence which is functional in plants is operatively linked to it, a DNA sequence which codes for a SAT or functionally equivalent parts thereof - a termination sequence which is functional in plants
  • step b) transfer of the vector from step a) to a plant cell and possibly integration into the plant genome.
  • Such a method can be used to increase the expression of DNA sequences which code for functional or non-functional, feedback-regulated or feedback-independent SATs or their functionally equivalent parts, and thus the vitamin E content in plants or Plant cells also increase.
  • vectors which comprise regulatory sequences, such as promoters and termination sequences, is known to the person skilled in the art.
  • the person skilled in the art knows how a vector from step a) can be transferred to plant cells and which features a vector must have in order to be integrated into the plant genome.
  • the method described can also increase the vitamin E content by at least 20%, preferably by at least 50%, also preferably by at least 75%, particularly preferably by at least 100%, particularly preferably by at least a factor of 5 particularly preferably by at least a factor of 10 and most preferably by at least a factor of 100 compared to the wild type.
  • the SAT content in transgenic plants or plant cells is increased by transferring a nucleic acid that is suitable for a SAT from another organism, e.g. E. coli encoded, then it is advisable to use the nucleic acid sequence e.g. to convert the amino acid sequence encoded from E. coli into a nucleic acid sequence by back-translating the polypeptide sequence according to the genetic code, which comprises above all those codons which are used more frequently owing to the organism-specific codon usage.
  • the codon usage can easily be determined on the basis of computer evaluations of other known genes of the organisms in question.
  • Increasing the gene expression or the activity of a nucleic acid encoding a SAT also means, according to the invention, the manipulation of the expression of the organism-specific, in particular plant-specific, endogenous SATs. This can be achieved, for example, by changing the promoter DNA sequence for genes coding for SAT. Such a change that changed, preferably increased expression rate of at least one endogenous SAT gene can result from the deletion or insertion of DNA sequences.
  • a change in the promoter sequence of endogenous SAT genes generally leads to a change in the expressed amount of the SAT gene and thus also to a change in the SAT activity detectable in the cell or in the plants.
  • an altered or increased expression of at least one endogenous SAT gene can be achieved in that a regulator protein which does not occur in the non-transformed organism interacts with the promoter of these genes.
  • a regulator protein which does not occur in the non-transformed organism interacts with the promoter of these genes.
  • Such a regulator can represent a chimeric protein which consists of a DNA binding domain and a transcription activator domain, as described for example in WO 96/06166.
  • Another way to increase the activity and content of endogenous SATs is to include transcription factors involved in the transcription of the endogenous SAT genes, e.g. upregulate by overexpression.
  • transcription factors involved in the transcription of the endogenous SAT genes e.g. upregulate by overexpression.
  • the measures for overexpression of transcription factors are known to the person skilled in the art and are likewise disclosed for SATs in the context of the present invention.
  • a change in the activity of endogenous SATs can be achieved by targeted mutagenesis of the endogenous gene copies.
  • a change in the endogenous SATs can also be achieved by influencing the post-translational modifications of SATs. This can be done, for example, by regulating the activity of enzymes such as kinases or phosphatases, which are involved in the post-translational modification of SATs, by appropriate measures such as overexpression or "gene silencing".
  • the expression of endogenous SATs can also be regulated via the expression of aptamers which specifically bind to the promoter sequences of SAT. Depending on whether the aptamers bind to stimulating or repressing promoter regions, the amount and in this case the activity on endogenous SAT is increased or decreased.
  • Aptamers can also be designed to specifically bind to the SAT proteins and e.g. Binding to the catalytic center of the SATs reduce the activity of the SATs.
  • the expression of aptamers is usually carried out by vector-based overexpression and is well known to the person skilled in the art, as is the design and selection of aptamers (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243, 123-36).
  • endogenous SATs can be reduced by various experimental measures which are well known to the person skilled in the art. These measures are usually summarized under the term "gene silencing". For example, by transmitting a vector mentioned above, which has a DNA sequence coding for SAT coding or parts thereof in antisense orientation, the expression of an endogenous SAT gene can be silenced. This is due to the fact that the transcription of such a vector in the cell leads to an RNA which can hybridize with the mRNA transcribed by the endogenous SAT gene and thus prevents its translation.
  • the antisense strategy can be coupled with a ribozyme process.
  • Ribozymes are catalytically active RNA sequences which, coupled to the antisense sequences, cleave the target sequences catalytically (Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75). This can increase the efficiency of an antisense strategy.
  • Other methods for reducing SAT expression, particularly in plants as organisms, include overexpression of homologous SAT nucleic acid sequences (Jorgensen et al, (1996) Plant Mol. Biol.
  • RNA / DNA oligonucleotides into the plant
  • knockout Mutants with the help of e.g. T-DNA mutagenesis (Koncz et al, (1992) Plant Mol Biol. 20 (5) 963-976) or homologous recombination (Hohn et al, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 8321- 8,323th).
  • DNA-binding factors e.g. Factors of the type of zinc finger transcription factors possible.
  • factors can be introduced into a cell that inhibit the target protein itself.
  • the protein binding factors can e.g. Be aptamers (Famulok et al, (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243, 123-36).
  • SAT-specific antibodies can be considered as further protein-binding factors, the expression of which in plants causes a reduction in the content and / or activity of SAT.
  • the production of monoclonal, polyclonal or recombinant SAT-specific antibodies follows standard protocols (Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol 182, pp. 663-679 (1990), MP Deutscher, ed.).
  • the expression of antibodies is also known from the literature (Fiedler et al, (1997) Immunotechnology 3, 205-216; Maynard and Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76).
  • the techniques mentioned are well known to those skilled in the art. He also knows which sizes are used for e.g. The antisense method or the RNAi method must have the nucleic acid constructs used, and the complementarity, homology or identity of the respective nucleic acid sequences.
  • sequence homology or homology is generally understood to mean that the nucleic acid or amino acid sequence of a DNA molecule or a protein is at least 40%, preferably at least 50%, more preferably at least 60%, likewise preferably at least 70%>, particularly preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%) and most preferably at least 98% are identical to the nucleic acid or amino acid sequences of a known DNA or RNA molecule or protein.
  • the degree of homology or identity relates to the entire length of the coding sequence.
  • complementarity describes the ability of a nucleic acid molecule to hybridize with another nucleic acid molecule due to hydrogen bonds between complementary bases. The person skilled in the art knows that two nucleic acid molecules do not have to have 100 percent complementarity in order to be able to hybridize with one another. One is preferred
  • Nucleic acid sequence which is to hybridize with another nucleic acid sequence at least 40% of this, at least 50%>, at least 60%, preferably at least 70%), particularly preferably at least 80%>, likewise particularly preferably at least 90% , particularly preferably at least 95%> and most preferably at least 98 or 100% »complementary.
  • Nucleic acid molecules are identical if they have the same nucleotides in the same 5'-3 'order.
  • Hybridization of an antisense sequence with an endogenous mRNA sequence typically takes place in vivo under cellular conditions or in vitro. According to the invention, hybridization is carried out in vivo or in vitro under conditions which are stringent enough to ensure a specific hybridization.
  • stringent conditions thus refers to conditions under which a nucleic acid sequence binds preferentially to a target sequence, but does not bind or at least significantly reduces it to other sequences. Stringent conditions depend on the circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures. In general, stringent conditions are chosen so that the hybridization temperature is approximately 5 ° C below the melting point (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and a defined pH. Tm is the temperature (at a defined pH value, a defined ionic strength and a defined nucleic acid concentration) at which 50% of the molecules which are complementary to a target sequence hybridize with this target sequence.
  • Tm melting point
  • stringent conditions include salt concentrations between 0.01 and 1.0 M sodium ions (or other salt) and a pH between 7.0 and 8.3. The temperature is at least 30 ° C for short molecules (for example, those that contain between 10 to 50 nucleotides).
  • stringent conditions can include the addition of destabilizing agents such as formamide.
  • Typical hybridization and wash buffers have the following composition.
  • Hybridization solution prehybridization solution lxlO 6 cpm / ml probe (5-10 min 95 ° C)
  • Prehybridization at least 2 h at 50-55 ° C
  • nucleic acid molecules which are used for other “gene silencing” processes must be.
  • nucleic acid molecules have to be introduced into the cell, which are either double-stranded RNA, one strand of which is homologous or identical to an endogenous RNA sequence, or DNA molecules , the transcription of which results in corresponding double-stranded RNA molecules in the cell, the RNA-interference-inducing double-stranded RNA molecules usually comprising 20-25 nucleotides (see also Tuschl et al, vide supra). A detailed description of this method is also disclosed in WO 99/32619.
  • Another object of the invention is a method for increasing the vitamin E content in transgenic plants, in which, in addition to the change in the content and / or the activity of SAT, such enzymes, the increased formation of homogenate or phytyl pyrophosphate, a reduced degradation of Homogenizat or phytyl pyrophosphate or an increased implementation within the last steps of tocopherol biosynthesis cause (eg tocopherol methyl transferase, tocopherol cyclase, ⁇ -tocopherol methyl transferase), are changed in terms of their content or their activity in the transgenic plants.
  • tocopherol methyl transferase tocopherol cyclase
  • ⁇ -tocopherol methyl transferase are changed in terms of their content or their activity in the transgenic plants.
  • Vitamin E synthesis involved in vivo the upregulation of the content or the activity of the aforementioned enzymes in connection with the change in the content and / or the activity of SATs brings further advantages in the production of plants with an increased vitamin E content.
  • the up or down regulation of Activity or the content of the enzymes mentioned can take place by one and / or a combination of the aforementioned methods.
  • vectors can generally be constructed which, after transfer to plant cells, overexpress the coding sequence enable in transgenic plants or plant cells or effect the suppression of endogenous nucleic acid sequences.
  • Vectors which can be used according to the invention for overexpression and for repression of DNA sequences which code for the various SATs or functionally equivalent parts thereof can comprise regulatory sequences in addition to the nucleic acid sequences to be transmitted. Which specific regulatory elements or sequences are contained in these vectors depends on the purpose of the application.
  • Vectors which can be used to overexpress coding sequences in plants are known to the person skilled in the art. Methods for transferring the sequences and for producing transgenic plants or plant cells with an increased or reduced expression of proteins are also known to the person skilled in the art.
  • the regulatory elements contained in vectors ensure transcription and, if desired, translation of the nucleic acid sequence that is transferred to the plants.
  • nucleic acid constructs in which the coding nucleic acid sequences are operatively linked to one or more regulatory signals which ensure transcription and translation in organisms, in particular in plants, are called vectors or expression cassettes. Accordingly, the invention further relates to nucleic acid constructs, in particular nucleic acid constructs functioning as an expression cassette, containing a nucleic acid encoding a SAT or functionally equivalent parts thereof, which is functionally linked to one or more regulation signals which ensure transcription and translation in organisms, in particular in plants.
  • the regulation signals preferably contain one or more promoters which ensure transcription and translation in organisms, in particular in plants.
  • the expression cassettes contain regulatory signals, that is to say regulatory nucleic acid sequences which control the expression of the coding sequence in the host cell.
  • an expression cassette comprises upstream, i.e. at the 5 'end of the coding sequence, a promoter and downstream, i.e. at the 3 'end, a polyadenylation signal and optionally further regulatory elements which are operatively linked to the intervening coding sequence for at least one of the genes described above.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and possibly further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequence as intended.
  • the nucleic acid constructs and expression cassettes according to the invention additionally contain a nucleic acid which codes for a peptide which regulates the location of the expressed SAT in the cell.
  • nucleic acids preferably encode plastidic transit peptides that encode the Ensure localization in plastids, particularly preferably in chloroplasts, or for signal peptides which cause localization in the cytoplasm, mitochondria or in the endoplasmic reticulum.
  • sequences preferred but not limited to the operative linkage are targeting sequences to ensure the subcellular
  • any promoter which can control the expression of foreign genes in plants is suitable as promoters of the expression cassette.
  • a plant promoter or a plant virus-derived promoter is preferably used.
  • the CaMV 35S promoter from the cauliflower mosaic virus (Franck et al. (1980) Cell 21, 285-294) is particularly preferred.
  • this promoter contains different recognition sequences for transcriptional effectors, which in their entirety lead to permanent and constitutive expression of the introduced gene (Benfey et al, (1989) EMBO J. 8 2195-2202).
  • Another possible promoter is the nitrilase promoter.
  • the expression cassette can also contain a chemically inducible promoter, by means of which the expression of the target gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • promoters such as the PRP1 promoter (Ward et al, (1993) Plant. Mol Biol 22, 361-366), a promoter induced by salicylic acid (WO 95/19443), one which can be induced by benzenesulfonamide (EP 388 186), one that can be induced by tetracycline (Gatz et al, (1992) Plant J. 2, 397-404), one that can be induced by abscisic acid (EP 335 528) or one that can be induced by ethanol or cyclohexanone (WO 93/21334 ) Promoter can be used.
  • promoters are particularly preferred which ensure expression in tissues or parts of plants in which, for example, the biosynthesis of vitamin E or its precursors takes place. Promoters that ensure leaf-specific expression should be mentioned in particular.
  • the promoter of the cytosolic FBPase from potato or the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al, (1989) EMBO J. 8 2445-245) should be mentioned.
  • a foreign protein could be stably expressed up to a proportion of 0.67% of the total soluble seed protein in the seeds of transgenic tobacco plants (Fiedler et al, (1995) Bio / Technology 10 1090-1094).
  • Expression of the SATs in the seeds of plants using seed-specific promoters such as e.g. the Phaseolin (US 5504200), the USP (Baumlein et al, (1991) Mol Gen. Genet. 225 (3), 459-467), the LEB4, the Vicilin and the Legumin B4 promoter.
  • the biosynthesis site of vitamin E in plants is, inter alia, the leaf tissue, so that leaf-specific expression of the nucleic acids according to the invention encoding a SAT is useful.
  • this is not restrictive, since the expression can also be tissue-specific in all other parts of the plant - especially in fatty seeds.
  • a further preferred embodiment therefore relates to a seed-specific expression of the nucleic acids described above.
  • constitutive expression of the SAT is advantageous.
  • inducible expression may also appear desirable.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed SAT can be determined, for example, in vitro by sprout meristem propagation.
  • a change in the type and level of expression of the SAT and its effect on the vitamin E biosynthesis performance on test plants can be tested in greenhouse experiments.
  • the promoter can be native or homologous as well as foreign or heterologous to the host plant.
  • the expression cassette preferably contains the promoter, a coding nucleic acid sequence and possibly a region for homologous or heterologous the transcriptional termination in the 5 '-3' transcription direction. Different termination areas are interchangeable.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al, (1984) EMBO J. 3, 835 ff.) Or functional equivalents thereof.
  • An expression cassette is preferably produced by fusing a suitable promoter with a nucleic acid described above, such as a sequence coding for SAT and preferably a target nucleic acid inserted between promoter and nucleic acid sequence, which codes, for example, for a chloroplast-specific transit peptide, and a polyadenylation signal, according to common recombination and cloning techniques, such as those found in Sambrook et al, (vide supra) and in TJ Silhavy, ML Berman and LW Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).
  • a suitable promoter with a nucleic acid described above, such as a sequence coding for SAT and preferably a target nucleic acid inserted between promoter and nucleic acid sequence, which codes, for example, for a chloro
  • inserted target nucleic acids which ensure targeting in the plastids.
  • Expression cassettes can also be used, the nucleic acid sequence of which codes for a fusion protein, part of the fusion protein being a transit peptide which controls the translocation of the polypeptide.
  • Preferred transit peptides are preferred for the chloroplasts, which are cleaved enzymatically from the target protein part after translocation of the target protein into the chloroplasts.
  • Sequences which code for a fusion protein with a cytoplasmic peptide are likewise preferably contained in expression cassettes.
  • the localization in the cytoplasm can possibly can also be ensured by omitting the sequence for the plastid transit peptide.
  • the transit peptide derived from the Nicotiana tabacum transketolase plastid or another transit peptide e.g. the Rubisco small subunit transit peptide (rbcs) or the ferredoxin NADP oxidoreductase as well as the isopentenyl pyrophosphate isomerase-2
  • another transit peptide e.g. the Rubisco small subunit transit peptide (rbcs) or the ferredoxin NADP oxidoreductase as well as the isopentenyl pyrophosphate isomerase-2
  • nucleic acids according to the invention can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural nucleic acid constituents, and can consist of different heterologous gene segments from different organisms.
  • Codons can be determined from codons with the highest protein frequency, which are expressed in most interesting plant species.
  • various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the promoter and terminator regions can expediently be in
  • linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp within the regulatory ranges.
  • the invention thus relates to vectors containing the nucleic acids, nucleic acid constructs or expression cassettes described above.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of an organism, especially a plant, is called transformation.
  • Suitable methods for the transformation of plants are the protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun - the so-called particle bombardment method, the electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, the microinjection and the Agrobacterium mediated gene transfer.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al, (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, published by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 128-143 and in Potrykus et al, (1991) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Molec. Biol. 42, 205-225).
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements per se for the plasmids used. The same applies to direct gene transfer. Simple plasmids such as pUC derivatives can be used. Typically, vectors can be used which have sequences necessary for propagation and selection in E. coli. This also includes vectors from the pBR322, M13mp series and pACYC184. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is necessary. The usual selection markers are known to the person skilled in the art and it is no problem for him to select a suitable marker.
  • Common marker markers are those that give the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, methotrexate, Mediate glyphosate, streptomycin, sulfonyl urea, gentamycin or phosphinotricin and the like.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the T-DNA contained in the Ti and Ri plasmid, must be connected as a flank region to the genes to be introduced ,
  • the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria by means of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation).
  • Binary vectors can replicate in both E. coli and agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or poly linker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria (Holsters et al, (1978) Molecular and General Genetics 163, 181-187).
  • the agrobacterium serving as the host cell should contain a plasmid carrying a vir region. The vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. T-DNA may also be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • the use of T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and has been sufficiently described in EP 120 515.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • the transformation of plants by agrobacteria is known, among other things, from F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants are regenerated using conventional regeneration methods using known nutrient media.
  • the plants or plant cells obtained in this way can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • the expression cassettes can also be cloned into suitable vectors that allow their proliferation, for example in E. coli.
  • suitable cloning vectors include pBR332, pUC series, M13mp series and pACYC184.
  • Binary vectors which can replicate both in E. coli and in agrobacteria are particularly suitable.
  • the plant expression cassette can be installed in a derivative of the transformation vector pSUN2 with a vicilin promoter (WO 02/00900). While the transformation of dicotyledonous plants or their cells via Ti plasmid vector systems with the help of Agrobacterium tumefaciens is well established, recent work indicates that monocotyledonous plants or their cells are also very accessible to transformation by means of vectors based on Agrobacteria (see Chan et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22, 491-506, among others).
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al, (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84).
  • the resulting plants can be grown normally and crossed with plants that have the same transformed genetic makeup or other genetic makeup.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties.
  • Two or more generations should be attracted to ensure that the phenotypic trait is stably maintained and inherited. Seeds should also be harvested to ensure that the appropriate phenotype or other characteristics have been preserved.
  • transgenic lines which are homozygous for the new nucleic acid molecules and their phenotypic behavior by customary methods examined for an increased vitamin E content and compared with that of hemizygotic lines.
  • plant cells which contain the nucleic acid molecules according to the invention can also be further cultivated as plant cells (including protoplasts, calli, suspension cultures and the like).
  • the expression cassette can also be used to transform bacteria, in particular cyanobacteria, mosses, yeasts, filamentous fungi and algae.
  • the invention therefore also relates to the use of the nucleic acids and the nucleic acid constructs described above, in particular the expression cassettes for the production of genetically modified organisms, in particular for the production of genetically modified plants or for the transformation of plant cells, tissues or parts of plants.
  • transgenic plants preferably have an increased vitamin E content compared to the wild type.
  • the invention therefore also relates to the use of SATs or the nucleic acid constructs according to the invention for increasing the content of vitamin E in organisms which, as a wild type, are able to produce vitamin E.
  • Plants with a high vitamin E content are known to increase
  • Abiotic stress means, for example, cold, frost, dryness, heat and salt.
  • the invention therefore further relates to the use of the nucleic acids according to the invention for the production of transgenic plants which are more resistant to abiotic stress than the wild type.
  • proteins and nucleic acids described above can be used for the production of fine chemicals in transgenic organisms, preferably for the production of vitamin E in transgenic plants.
  • the aim of the use is preferably to increase the content of vitamin E in the plant or parts of plants.
  • the expression can take place specifically in the leaves, in the seeds, petals or other parts of the plant.
  • the invention further relates to a method for producing genetically modified organisms by introducing a nucleic acid described above or a nucleic acid construct described above or a combination of nucleic acid constructs described above into the genome of the starting organism.
  • the invention further relates to the genetically modified organisms themselves described above.
  • the genetically modified organisms in particular plants, have an increased vitamin E content.
  • photosynthetically active organisms such as cyanobacteria are used to produce organisms with a higher vitamin E content than the wild type.
  • Mosses, algae or plants, particularly preferably plants, are used as starting organisms.
  • the plants used for the method according to the invention can be any plant. It is preferably a monocot or dicot crop, food or feed plant.
  • monocotyledonous plants are plants belonging to the genera Avena (oat), Triticum (wheat), Seeale (rye), Hordeum (barley), Oryza (rice), Panicum, Pennisetum, Setaria, sorghum (millet), Zea (corn ) and the like.
  • Dicotyledonous crops include cotton, legumes such as legumes and in particular alfalfa, soybean, rapeseed, tomato, sugar beet, potatoes, ornamental plants and trees.
  • Other useful plants can include fruit (in particular apples, pears, cherries, grapes, citrus, pineapples and bananas), oil palms, tea, cocoa and coffee bushes, tobacco, sisal and, in the case of medicinal plants, rauwolfia and digitalis.
  • the cereals wheat, rye, oats, barley, rice, corn and millet, sugar beet, rapeseed, soybeans, tomato, potatoes and tobacco are particularly preferred. Further useful plants can be found in US Pat. No. 6,137,030.
  • Preferred plants are tagetes, sunflower, arabidopsis, tobacco, red pepper, soy, tomato, eggplant, bell pepper, carrot, carrot, potato, corn, salads and cabbages, cereals, alfalfa, oats, barley, rye, wheat, triticale, millet, Rice, alfalfa, flax, cotton, hemp, Brassicacaeen such as rape or canola, sugar beet, sugar cane, nut and wine species or woody plants such as aspen or yew.
  • Arabidopsis thaliana Tagetes ereeta, Brassica napus, Nicotiana tabacum, sunflower, canola, potato or soy are particularly preferred.
  • Such transgenic plants, their food, and their plant cells, tissue or parts are a further subject of the present invention.
  • the invention thus also relates to crop products and nutritional material of transgenic plants which have been produced by a process according to the invention and have an increased vitamin E content.
  • the harvested products and the propagation material are in particular fruits, seeds, flowers, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings, etc. Parts of these plants, such as plant cells, protoplasts and calli, can also be involved.
  • the genetically modified organisms in particular plants, can be used to produce vitamin E as described above.
  • Genetically modified plants according to the invention with increased vitamin E content that can be consumed by humans and animals can also be used, for example, directly or after processing known per se as food or feed or as feed and food supplement.
  • the genetically modified plants according to the invention can also be used for the production of extracts containing vitamin E.
  • Increasing the content of vitamin E in the context of the present invention preferably means the artificially acquired ability of an increased biosynthetic capacity of these compounds in the plant compared to the non-genetically modified plant, preferably for the duration of at least one plant generation.
  • An increased vitamin E content is generally understood to mean an increased total tocopherol content. Taking an increased vitamin E content but also understood in particular a changed content of the 8 compounds with tocopherol activity described above.
  • the vitamin E content is determined by methods customary in the prior art. These are disclosed in particular in detail in WO 02/072848, the content of which is expressly stated here as a disclosure for methods of detecting the vitamin E content in plants.
  • the vitamin E content can e.g. in leaves and seeds of plants transgenic for SATs. In particular, dry seeds or frozen leaf material are used.
  • the leaf material of the plants is frozen in liquid nitrogen immediately after sampling.
  • the subsequent digestion of the cells is carried out by means of a stirring apparatus by incubation three times in an Eppendorf shaker at 30 ° C., 1000 rpm (revolutions per minute) in 100%> methanol for 15 minutes, the supernatants obtained in each case being combined. Further incubation and extraction steps usually do not result in any further release of tocopherols or tocotrienols.
  • the extracts obtained are analyzed immediately after extraction using an HPLC system (Waters Allience 2690). Tocopherols and tocotrienols are separated on a conventional “reverse phase” column (ProntoSil 200-3-C30 TM, from Bischoff) with a mobile phase of 100% methanol and identified using standards (from Merck).
  • the present invention is illustrated in the following examples, which serve only to illustrate the invention and are in no way to be understood as a limitation.
  • Cloning methods e.g. Restriction cleavage, DNA isolation, agarose, gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. co / z cells, cultivation of bacteria, sequence analysis of recombinant DNA were carried out according to Sambrook et al, vide supra.
  • the transformation of Agrobacterium tumefaciens was carried out according to the method of Höfgen et al, ((1988) Nucl. Acids Res. 16, 9877).
  • the agrobacteria were grown in YEB medium (Vervliet et al, (1975) J. Gen. Virol 26, 33).
  • E. coli (XL 1 Blue) bacteria were obtained from Stratagene, La Jolla, USA.
  • the agrobacterial strain used for plant transformation (GV3101; Bade und Damm in Gene Transfer to Plants; Protrykus, I. and Spangenberg, G., eds., Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30 - 38) was transformed with the vector pSUN2.
  • the vector pSUN2 was used for cloning. Production of transgenic oilseed rape plants (Brassica napus)
  • Transgenic oilseed rape plants were produced according to a standard protocol (Bade und Damm in Gene Transfer to Plants; Protrykus, I. and Spangenberg, G., eds., Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38). The cited reference also discloses the composition of the media and buffers used.
  • the seeds of Brassica napus var. Westar were surface sterilized with 70% ethanol (v / v), washed in water at 55 ° C for 10 min and in a 1% hypochlorite solution (25%) (v / v) Teepol, 0.1% (v / v) Tween20) incubated for 20 min. Thereafter, each seed was washed six times with sterile water for 20 minutes. The seeds were dried on filter paper for three days. 10 to 15 seeds were then germinated in a glass jar containing 15 ml of germination medium. The roots and apices were removed from various seedlings (approx. 10 cm in size) and the remaining stems (hypocotyls) were cut into pieces of approx.
  • the callus induction medium was removed from the oilseed rape explants using sterile pipettes and 50 ml of the bacterial suspension was added to the explants. The reaction mixture was then mixed gently and incubated for 20 min. The bacterial suspension was then removed and the oilseed rape explants were then washed with 50 ml of the callus induction medium for 1 min. 100 ml of the callus induction medium were then added. The co-cultivation was carried out with shaking at 100 rpm for 24 h and stopped by removing the callus induction medium. The explants were then washed twice with 25 ml of washing medium for 1 min and twice with 100 ml of washing medium for 60 min with shaking at 100 rpm. The washing medium was then transferred with the explants into 15 cm petri dishes and the medium was removed using sterile pipettes.
  • the SAT-A from Arabidopsis thaliana described in the prior art with regard to its amino acid sequence and the underlying DNA sequence was inactivated by directed mutagenesis of the amino acid histidine 309 to alanine (the numbering refers to the first methionine of the open reading frame).
  • the directed mutagenesis of the associated cDNA in the plasmid pBlueScript was carried out by base pair exchange using a commercially available method from Promega (Heidelberg, Germany).
  • the site-directed mutagenesis of the SAT-A cDNA was carried out with pBS / ⁇ SATl-6 (Bogdanova et al, (1995) FEBS Lett. 358, 43-47).
  • the Promega GeneEditor in vitro Site Directed Mutagenesis System achieved an average of 80% positive clones.
  • the point mutations were verified by DNA sequencing and the resulting amino acid changes were numbered in relation to the start codon of the longest possible open reading frame of a mitochondrial SAT-A cDNA (cDNA SAT-1 (Roberts et al. (1996) Plant Mol. Biol 30, 1041 -1049)).
  • the inactivation of the E. coli cysE gene to generate a SAT-free E. coli mutant was carried out according to the method described by Hamilton et al. described method carried out (Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol. 171, 4617-4622). This should provide a bacterial strain that is more stable in terms of its SAT deficiency than that currently available in the prior art.
  • the wild-type c sE gene was cloned by means of PCR and obtained by inserting a gentamycin resistance cassette into a Clal restriction site at position 522 on the start codon of the cysE gene, inactivated.
  • the inactivated cysE gene was integrated into the genome of E. coli C600 via homologous recombination to give the strain MW1 (tbr, leu, thi, lac , ⁇ -P ⁇ + F ', cysE, Gm r ).
  • Complementation tests using the E. co / f strains EC1801 (E. coli Genetics Stock Center, Yale University, New Haven, CT, USA) or MW1 were carried out on M9 minimal medium agar plates with or without cysteine with the addition of induction agents and selective antibiotics carried out.
  • the constructs for the expression of Arabidopsis thaliana mitochondrial SAT-A included pBS / ⁇ SATl-6 (X82888; Bogdanova et al, (1985) vide supra), pET / ⁇ SATl-6 and mutated forms of SAT-A.
  • the coding region of the SAT-A was amplified by PCR from base pair 28-939 without a mitochondrial transit peptide using specific primers, flanked by EcoRI and Xhol cleavage sites.
  • thaliana was similarly obtained by cloning a PCR product that contained the mature protein without the mitochondrial transit peptide from base pair 172-1162 (AJ271727 (Hesse et al, (1999) Amino Acids 16, 113-131) in the NcoI-BamHI cleavage sites of pET3d, which gave pET / OAS-C.
  • SAT enzyme activity with and without OAS-TL was determined in a standard assay based on the method of Kredich and Becker (1971, In Methods in Enzymology (Tabor and Tabor, eds), pages 459-469, Academic Press, New York , USA). Crude or purified recombinant SAT protein was incubated in a volume of 250 ⁇ l (50 mM Tris / HCl, pH 7.5, 0.2 mM acetyl-CoA, 2 mM Dithiothreitol, 5 mM serine) at 25 ° C. and A 2 3 2 was recorded for up to 3 minutes.
  • EST 181H17T7 (GenBank Accession Number AJ2711727) was used as a template to generate OAS-TL C without a mitochondrial transit peptide from base pair 172-1162.
  • the pPC vectors with mitochondrial SAT-A without a mitochondrial transit peptide were constructed by amplifying base pairs 28-939 (X82888 (Bogdanova et al, ( 1995) vide supra).
  • SAT and SATH309A were cloned into a binary transformation vector (pSUN2, WO 02/00900).
  • SAT and SATH309A were amplified in the same way by PCR and fused to the reading frame of the rbcs transit peptide. Both SATs were localized in the cytosol with pSUN2, leaving out the section for the import peptide. Either the nitrilase promoter for constitutive expression or the vicilin promoter for seed-specific expression were used as promoters.
  • the cloning was carried out in the given Xhol or Smal restriction sites of the vector pSUN2 mentioned.
  • the cDNA of the active SAT and the SAT mutant SATH309A were each amplified by standard PCR with the oligonucleotide primers SAT269 and SAT270, which had 5 ′ additional Xhol and EcoRI restriction sites. After digestion with EcoRI, the SAT fragments were ligated with the also fused with EcoRI digested transit peptide rbcs. The transit peptide was also amplified by standard PCR using the oligonucleotide primers Tra201 and Tra202, which had 5 'additional EcoRI and Smal restriction sites. The fused fragments were then ligated into the Xhol and Smal restriction sites of the vector.
  • Example of standard PCR reaction volume 50 ⁇ l with 20 pmol of each primer, 1-10 ng plasmid, buffer from the manufacturer, 1 U Taq polymerase (Promega). Sequence: 5 minutes at 94 ° C, then 30 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 60 seconds at 55 ° C, 30 seconds at 72 °, followed by 10 minutes at 72 ° C.
  • the SATs were extracted from the transgenic plant material and their activity was determined. For this, the protocol of Nakamura et al, ((1987) Plant Cell Physiol, 28, 885-891) was used. The leaves (nitrilase promoter) or the seeds (vicilin promoter) of three independent transgenic lines were examined in each case. It was shown that transgenic plants that express the SATH309A have an unchanged SAT activity compared to non-transgenic plants, while transgenic plants that overexpress the active SAT have a significantly increased total S AT activity. Determination of the vitamin E content of the transgenic plants
  • Tocopherols and tocotrienols were separated on a conventional “reverse phase” column (ProntoSil 200-3-C30 TM, from Bischoff) with a mobile phase of 100% methanol and identified using standards (from Merck).
  • the used as the detection system Fluorescence of the substances (excitation 295 nm, emission 320 nm), which was detected using a Jasco FP 920 fluorescence detector.
  • transgenic plant material with active SAT or inactive SATH304A regardless of whether constitutive or seed-specific expression was carried out, an increase in the vitamin E content compared to the wild type was found.
  • Figure 1 shows typical vitamin E biosynthetic pathways.
  • Figure 2 shows an amino acid alignment of various sermacetyl transferases.
  • Figure 3 shows a vector map of pSUN2 with the rbcs-SATH309A construct.

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Abstract

Die vorliegende Erfndung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt, wobei die transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt und/oder Aktivität an Serin-Acetyltransferase (SAT) und/oder einen veränderten Gehalt an Thiol-Verbindungen aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für eine SAT kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch Kultivierung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt an SAT aufweisen.

Description

Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt durch Veränderung des Serin-Acetyltransferase-Gehalts
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt, wobei die transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt und/oder Aktivität an Serin-Acetyltransferase (SAT) und/oder einen veränderten Gehalt an Thiol- Verbindungen aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für eine SAT kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch Kultivierung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt an SAT aufweisen.
Als Vitamin E werden üblicherweise die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E- Aktivität bezeichnet, bei denen es sich um Derivate des 6-Chromanols handelt (UUmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die Gruppe der Tocopherole (1) weist eine gesättigte Seitenkette auf, die Gruppe der Tocotrienole (2) eine ungesättigte Seitenkette:
α-Tocopherol: R1 = R2= R3 = CH3 ß-Tocopherol: R1 = R3 = CH3, R2 = H γ-Tocopherol: R1 = H, R2 = R3 = CH3 δ-Tocopherol: R1 = R2 = H, R3 = CH3
α -Tocotrienol: R l1 _ = D R2 _ = R-D3J _ = , CH3 p -Tocotrienol: R1 = R3 = CH3, R2 = H γ -Tocotrienol: R1 = H, R2 = R3 = CH3 δ -Tocotrienol: R 11 _ = R = H, RJ = CH3
In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin E alle vorstehend erwähnten Tocopherole und Tocotrienole mit Vitamin E- Aktivität verstanden.
Diese Verbindungen mit Vitamin E- Aktivität sind wichtige natürliche fett-lösliche Antioxidantien. Ein Mangel an Vitamin E führt bei Menschen und Tieren zu pathophysiologischen Situationen. Vitamin E-Verbindungen haben daher einen hohen wirtschaftlichen Wert als Zusatzstoffe im Food- und Feed-Bereich, in pharmazeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.
Von den genannten Verbindungen mit Vitamin E- Aktivität ist das α-Tocopherol biologisch am bedeutensten. Die Tocopherole und Tocotrienole kommen in vielen Pflanzenölen vor, besonders reich an Tocopherolen und Tocotrienolen sind die Samenöle von Soja, Weizen, Mais, Reis, Baumwolle, Raps, Luzerne und Nüssen. Auch Früchte und Gemüse, wie z.B. Himbeeren, Bohnen, Erbsen, Fenchel, Paprika etc. enthalten die oben genannten Vitamin E-Verbindungen. Soweit bisher bekannt, werden Tocopherole und Tocotrienole ausschließlich in Pflanzen bzw. photosynthetisch aktiven Organismen synthetisiert. Einige der wichtigsten Synthesewege der Tocopherole und Tocotrienole sind in Abbildung la und lb dargestellt.
Tocopherole tragen aufgrund ihres Redoxpotentials dazu bei, die Oxidation ungesättigter Fettsäuren durch Luftsauerstoff zu vermeiden; in Menschen ist α-Toco- pherol das wichtigste fettlösliche Antioxidans. Es wird angenommen, dass die Tocopherole durch die Funktion als Antioxidantien zur Stabilisierung biologischer Membranen beitragen, da durch den Schutz der ungesättigten Fettsäuren der
Membranen die Membranfluidität aufrechterhalten wird. Jüngeren Erkenntnissen zu Folge kann darüber hinaus mit der regelmäßigen Zufuhr relativ hoher Tocopherol- Dosen der Ausbildung der Arteriosclerose entgegengewirkt werden. Als weitere günstige Eigenschaften der Tocopherole wurden die Verzögerung Diabetes-bedingter Spätschäden, die Verminderung des Risikos der Kataraktbildung, die Verminderung des oxidativen Stresses bei Rauchern, antikarzinogene Effekte, protektive Wirkung gegen Hautschäden wie Erytheme und Hautalterung beschrieben. Dabei sind Tocopherol-Verbindungen wie Tocopherolacetat und -succinat die üblichen Applikationsformen für die Anwendung von Vitamin E in durchblutungsfördernden und Lipid-senkenden Mitteln und veterinärmedizinisch als Futtermittelzusatz.
Wegen ihrer oxidationshemmenden Eigenschaften werden die Tocopherole und Tocotrienole nicht nur lebensmitteltechnologisch genutzt, sondern auch in auf natürlichen Ölen basierenden Anstrichfarben, in Desodorantien und anderen Kosmetika, beispielsweise Sonnenschutzmitteln, Hautpflegemitteln, Lippenstiften etc. eingesetzt.
Wirtschaftliche Verfahren zur Herstellung von Vitamin E-Verbindungen bzw. von Nahrungs- und Futtermitteln mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt sind daher von großer Bedeutung. Besonders vorteilhaft sind dabei biotechnologische Verfahren oder durch genetische Veränderung optimierte Vitamin E-produzierende Organismen wie transgene Pflanzen und Pflanzenzellen.
Bei der Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt bedient man sich dabei im Stand der Technik üblicherweise Enzymen, die in die Biosynthese der Tocopherole und Tocotrienole in höheren Pflanzen involviert sind (siehe auch Abbildungen la und lb).
In höheren Pflanzen wird Tyrosin ausgehend von Chorismat über Prephenat und Arogenat gebildet. Die aromatische Aminosäure Tyrosin wird durch das Enzym Tyrosinaminotransferase in Hydroxyphenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homogentisinsäure überführt wird.
Die Homogentisinsäure wird anschließend an Phytylpyrophosphat (PPP) bzw. Geranylgeranylpyrophosphat gebunden, um die Vorläufer von α-Tocopherol und α-Tocotrienol, das 2-Methyl-6-phytylhydrochinol bzw. das 2-Methyl-6-geranyl- geranylhydrochinol zu bilden. Durch Methylierungsschritte mit S-Adenosyl- methionin als Methyl-Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Dimethyl-6- phytylquinol, dann durch Zyklisierung γ-Tocopherol und durch nochmalige Methylierung α-Tocopherol.
Es sind Versuche bekannt, in transgenen Organismen durch Überexpression einzelner Biosynthesegene eine Erhöhung des Metabolitflusses zur Steigerung des Tocopherol- bzw. Tocotrienolgehaltes zu erreichen.
WO 97/27285 beschreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hydroxy- phenylpyruvatdioxygenase (HPPD). WO 99/04622 bzw. DellaPenna et al, (1998) Science 282, 2098-2100 beschreiben Gensequenzen codierend für eine γ -Tocopherolmethyltransferase aus Synechocystis PCC6803 und Arabidopsis thaliana und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.
WO 99/23231 zeigt, dass die Expression einer Geranylgeranyl-Reductase in transgenen Pflanzen eine gesteigerte Tocopherolbiosynthese zur Folge hat.
WO 00/08169 beschreibt Gensequenzen codierend eine l-Deoxy-D-Xylose-5- Phosphat-Synthase und eine Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat Oxidoreduktase und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.
WO 00/68393 und WO 00/63391 beschreiben Gensequenzen codierend eine Phytyl/Prenyl-Transferase und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.
In WO 00/61771 wird postuliert, dass die Kombination eines Gens aus dem Sterol- Stoffwechsel in Kombination mit einem Gen aus dem Tocopherolstoffwechsel zu einer Erhöhung des Tocopherolgehalts in transgenen Pflanzen führen kann.
Alle diese Methoden liefern zwar genetisch veränderte Organismen, insbesondere Pflanzen, die in der Regel einen modifizierten Gehalt an Vitamin E aufweisen, weisen jedoch den Nachteil auf, dass die Höhe des Gehalts an Vitamin E in den im Stand der Technik bekannten genetisch veränderten Organismen noch nicht zufriedenstellend ist.
Es besteht daher weiterhin ein großer Bedarf an transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit deutlich erhöhten Vitamin E-Gehalten, die zur Gewinnung der Vitamin E- Verbindungen genützt werden können. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt ermöglicht.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung, wie sie sich aus der Beschreibung ergeben, werden durch den Gegenstand des unabhängigen Anspruchs gelöst.
Bevorzugte Ausfuhrungsformen der Erfindung werden durch die abhängigen Unteransprüche definiert.
Es ist jetzt überraschend gefunden worden, dass die Veränderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SAT in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eine Steigerung des Gehalts an Vitamin E-Verbindungen wie den genannten Toco- pherolen und Tocotrienolen ermöglicht. Dies war insbesondere deswegen überraschend, weil bisher davon ausgegangen wurde, dass Enzyme mit einer SAT- Aktivität eine Funktion lediglich in Biosynthesewegen zur Herstellung von Schwefel-haltigen Verbindungen wie Cystein, Methionin und z.B. Glutathion haben.
Serin- Acetyltransferase (SAT, EC2.3.1.30) ist an dem zweistufigen Prozess beteiligt, durch den in vivo in Mikroorganismen und Pflanzen die Cystein-Biosynthese bewerkstelligt wird.
SAT sorgt für die Bildung des aktivierten Thioesters O-Acetylserin (OAS) aus Serin und Acetyl-CoenzymA. Freies Sulfid wird in O-Acetylserin eingeführt, um Cystein und Acetat mittels enzymatischer Katalyse durch O-Acetylserin (Thiol)-Lyase zu erhalten. Die durch SAT katalysierte Reaktion stellt hierbei den geschwindigkeits- limitierenden Schritt dar, wobei die Aktivität dieses Enzyms ausschließlich in Verbindung mit O-Acetylserin (Thiol)-Lyase (OAS-TL) in dem so genannten Cysteinsynthase-Komplex gefunden wird. OAS-TL ist bedingt durch die Aktivität SAT-freier Homodimere in großem Überschuss vorhanden (Kredich et al., (1969) J. Biol. Chem., 244, 2428-2439; Saito (2000) Curr. Opin. Biol. 3, 188-195).
Mikrobielle, pflanzliche und tierische SATs können nach ihrer allosterischen Regulierbarkeit in verschiedene Gruppen unterteilt werden. Eine Reihe von SATs wird durch das Endprodukt des durch sie katalysierten Biosynthesewegs, Cystein, inhibiert. Solche SATs werden üblicherweise als Feedback-regulierte SATs bezeichnet (Wirtz et al., (2002), Amino acids, in press; Hell et al., (2002) Amino Acids 22, 245-257; Noji et al, (1998) J. Biol. Chem. 273, 32739-45; Inoue et al., (1999) Eur. J. Biochem. 266, 220-27; Saito (2000) Curr. Op. Plant Biol. 3, 188-95).
Als Prototypen für Feedback-regulierte SATs gelten die mikrobiellen SATs CysE aus E. coli (Accession Code E12533; Denk und Bock (1987) J. Gen. Microbiol. 133, 515-25) und S. typhimurium (Accession Code A00198; Kredich and Tomkins (1966) J. Biol. Chem. 241, 4955-65), sowie die pflanzlichen SATs SAT-c aus A. thaliana (Accession Code U30298; Noji et al., vide supra), SAT2 aus Citrullus vulgaris (Accession Code D49535; Saito et al, (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321-26) und SAT56 aus Spinacia oleracea (Accession Code D88529; Noji et al., (2001) Plant Cell Physiol. 42, 627-34).
Daneben gibt es eine Gruppe von SATs, die in wesentlich geringerem Ausmaß durch Cystein bzw. überhaupt nicht durch Cystein inhibiert werden können. Man bezeichnet diese SATs auch als Feedback-unabhängige SATs. Typische Vertreter solcher Feedback-unabhängigen SATs sind bislang nur aus Pflanzen bekannt. Dazu gehören z.B. SAT A aus Arabidopsis thaliana (EMBL Accession code X82888;
Bogdanova und Hell (1995) Plant Physiol. 109, 1498; Wirtz et al, 2002, vide supra), SAT 4 aus Nicotiana tabacum (Accession Code AJ414052; Wirtz et al, 2002, vide supra) und ASAT5 aus Allium tuberosum (Urano et al., (2000) Gene 257, 269-277). Aufgrund ihrer Rolle im Biosyntheseweg für Cystein wurde die Verwendung von SAT-kodierenden Nukleinsäuresequenzen zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen nur im Zusammenhang mit Verfahren zur Herstellung von transgenen Organismen mit erhöhten Cystein- bzw. Glutathion-Gehalten diskutiert (Wirtz et al, vide supra). Aus dem Stand der Technik ist keine funktionelle Verbindung zwischen SAT und Biosynthesewegen, die zur Produktion von Vitamin E-Verbindungen wie Tocopherolen und Tocotrienolen fuhren, bekannt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist jetzt überraschend gefunden worden, dass die Änderung des Gehalts oder der Aktivität von funktionellen oder nicht-funktio- nellen SATs in Pflanzen verwendet werden kann, um transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen herzustellen, die über erhöhte Vitamin E-Gehalte verfugen. Die Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SATs in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen kann dabei z.B. auf die Übertragung und Überexpression von Nukleinsäuren, die für funktioneile oder nicht-funktionelle SATs kodieren, auf Pflanzenzellen bzw. Pflanzen zurückzuführen sein. Die Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SAT in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt kann auch auf die Hoch- bzw. Herunterregulierung der Aktivität und/oder der synthetisierten Menge von endogenen SATs zurückzuführen sein.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist jetzt darüber hinaus gefunden worden, dass die Veränderung des Gehalts an Thiol- Verbindungen verwendet werden kann, um transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen herzustellen, die über erhöhte Vitamin E- Gehalte verfügen. Die Änderung des Gehalts an Thiol- Verbindungen kann dabei z.B. auf die Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SATs in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen zurückzuführen sein und damit z.B. durch die Übertragung und Überexpression von Nukleinsäuren, die für funktionelle oder nicht- funktionelle SATs kodieren, auf Pflanzenzellen bzw. Pflanzen erreicht werden. Die Änderung des Gehalts an Thiol- Verbindungen kann dabei aber auch auf die Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von anderen in die Stoff wechselwege von Thiol- Verbindungen involvierten Enzymen zurückzuführen sein und damit z.B. durch die Übertragung und Überexpression von Nukleinsäuren, die für solche Enzyme oder Homologe, Mutanten bzw. Fragmente davon kodieren, auf Pflanzen- zellen bzw. Pflanzen erreicht werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt und einem veränderten Gehalt und/oder Aktivität von SAT im Vergleich zum Wildtyp.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, bei denen die Expression von SAT durch Übertragung von Nukleinsäuresequenzen, die für funktionelle oder nicht-funktionelle SATs oder funktionelle Äquivalente davon kodieren, auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen bewirkt wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, bei denen die Aktivität oder Menge an endogener SAT hoch- oder herunterreguliert wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, bei denen Antikörper, die für SATs spezifisch sind und möglicherweise deren Funktion hemmen, in der Zelle exprimiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, bei denen der post-translationale Modifikationsstatus von überexprimierten oder endogenen funktionellen und/oder nicht-funktionellen SATs verändert wird. Ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, bei denen die Expression von einem Teil der endogenen SAT-Gene durch Verfahren wie z.B. Antisense-Verfahren, post-transcriptional gene silencing (PTGS), virus-induced gene silencing (VIGS), RNA interference (RNAi) oder homologe Rekombination gesilenct wurde.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, die über einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt und/oder Aktivität an SAT verfügen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt, wobei die Pflanzen einen veränderten Gehalt an Thiol- Verbindungen im Vergleich zum Wildtyp aufweisen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden und über im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Vitamin E-Gehalte verfugen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Nukleinsäuren, die für funktionelle oder nicht-funktionelle SATs aus verschiedenen Organismen kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt.
Unter Serin- Acetyltransferase- Aktivität wird erfindungsgemäß die Enzymaktivität einer Serin- Acetyltransferase verstanden. Unter einer Serin- Acetyltransferase wird ein Protein verstanden, das die enzy- matische Aktivität aufweist, Serin und Acetyl-Coenzym A zum aktivierten Thioester O-Acetylserin (OAS) zu verknüpfen.
Dementsprechend wird unter Serin- Acetyltransferase- Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Serin-Acetyltransferase umgesetzte Menge Serin bzw. gebildete Menge O-Acetylserin verstanden.
Bei einer gegenüber dem Wildtyp veränderten SAT-Aktivität wird erfindungsgemäß somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein SAT eine andere Menge Serin umgesetzt bzw. eine andere Menge O-Acetylserin gebildet.
Bei einer gegenüber dem Wildtyp erhöhten SAT- Aktivität wird somit erfindungsgemäß im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein SAT die umgesetzte Menge Serin bzw. die gebildete Menge O-Acetylserin erhöht.
Bei einer gegenüber dem Wildtyp erniedrigten SAT-Aktivität wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein SAT die umgesetzte Menge Serin bzw. die gebildete Menge O-Acetylserin erniedrigt.
Bei einem gegenüber dem Wildtyp veränderten Gehalt an SAT wird somit im Vergleich zum Wildtyp in der Pflanze bzw. Pflanzenzelle eine andere Menge des Proteins SAT hergestellt.
Bei einem gegenüber dem Wildtyp erhöhten Gehalt an SAT wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer Pflanze bzw. Pflanzenzelle mehr SAT hergestellt.
Entsprechend wird bei einem gegenüber dem Wildtyp erniedrigten Gehalt an SAT in der Pflanze bzw. Pflanzenzelle im Vergleich zum Wildtyp weniger SAT hergestellt. Bei einem gegenüber dem Wildtyp veränderten Gehalt an Thiol-Verbindungen wird somit im Vergleich zum Wildtyp in der Pflanze bzw. Pflanzenzelle eine andere Menge der Thiol-Verbindungen hergestellt. Entsprechendes gilt bei erhöhten bzw. erniedrigten Thiol-Gehalten.
Vorzugsweise beträgt die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren bewirkte Erhöhung des Gehalts und/oder der Aktivität an SAT in einer transgenen Pflanzenzelle bzw. Pflanze mindestens 5%, bevorzugt mindestens 20%, ebenfalls bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 100%), ebenfalls besonders bevorzugt mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 10, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 50, noch bevorzugter mindestens den Faktor 100 und am meisten bevorzugt mindestens den Faktor 1000.
Vorzugsweise beträgt die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren bewirkte Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität an SAT in einer transgenen Pflanzenzelle bzw. Pflanze mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, besonders bevorzugt mindestens 20%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens 40%>, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens 60% , insbesondere bevorzugt mindestens 80%», ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 98%).
Unter einem Wildtyp wird erfindungsgemäß der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus verstanden.
Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung von SAT gesprochen wird, dann sind erfindungsgemäß damit sowohl Feedback-regulierte als auch Feedback-unabhängige SATs gemeint. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff SAT funktionelle sowie nicht-funktionelle SATs. Funktionelle SATs fallen dabei unter die Definition wie sie oben für eine SAT gegeben worden ist.
Wenn im Rahmen der Erfindung von funktionell äquivalenten Teilen von SATs gesprochen wird, dann sind damit Fragmente der Nukleinsäuresequenzen von kompletten SATs gemeint, deren Expression noch zu Proteinen mit der enzy- matischen Aktivität eines SAT führt. Diese Proteinfragmente fallen ebenfalls unter den Begriff „funktioneil äquivalente Teile von SATs".
Nicht-funktionelle SATs verfügen erfindungsgemäß über die gleichen Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen wie funktionelle SATs bzw. funktionelle äquivalente Teile davon, weisen jedoch an einigen Stellen Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen von Nukleotiden oder Aminosäuren auf, die bewirken, dass die nicht- funktionellen SATs nicht oder nur sehr begrenzt in der Lage sind, Serin unter Bildung von O-Acetylserin zu acetylieren. Nicht-funktionelle SATs umfassen auch solche SATs, die Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen auf Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzebene tragen und nicht oder trotzdem in der Lage sind, mit physiologischen Bindungspartnern der SAT zu interagieren. Zu solchen physiologischen Bindungspartnern gehört z.B. die O-Acetylserin (Thiol)-Lyase.
Erfindungsgemäß umfasst der Begriff "nicht-funktionelle SAT" nicht solche Proteine, die keine wesentliche Sequenzhomologie auf Aminosäure- bzw. Nuklein- säureebene zu funktioneilen SATs aufweisen. Proteine, die nicht in der Lage sind, Acetylgruppen auf Serin zu übertragen, und keine wesentliche Sequenzhomologie mit SATs aufweisen, sind daher definitionsgemäß mit dem erfindungsgemäßen Begriff "nicht-funktionelle SATs" nicht gemeint. Nicht-funktionelle SATs werden im Rahmen der Erfindung auch als inaktivierte oder inaktive SATs bezeichnet.
Somit zeichnen sich erfindungsgemäße nicht-funktionelle SATs, die die oben genannten Punktmutationen, Insertionen und/oder Deletionen tragen, durch eine wesentliche Sequenzhomologie zu den bekannten funktionellen erfindungsgemäßen SATs oder deren funktionell äquivalenten Teilen aus.
Unter wesentlicher Sequenzhomologie wird erfindungsgemäß allgemein verstanden, dass die Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz eines DNA-Moleküls bzw. eines Proteins zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%, weiter bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95%» und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% zu den Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen einer bekannten funktionellen SAT oder deren funktionell äquivalenten Teilen identisch ist.
Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA Star, Inc., Madison,
Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUSTAL-Methode (Higgins et al, (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151) berechnet wird.
Homologien können ebenfalls mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUSTAL-Methode (Higgins et al, (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151) berechnet werden.
Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen von Feedback-regulierten bzw. Feedbackunabhängigen funktionellen SATs sind dem Fachmann bekannt. Sie können z.B. den allgemein bekannten Datenbanken wie der Nukleotidsequenzdatenbank Genbank oder der Proteinsequenzdatenbank des NCBI entnommen werden. Darüber hinaus finden sich zahlreiche Beispiele für die genannten SATs in der Literatur (siehe oben).
Besonders bevorzugt für die erfindungsgemäßen Verfahren sind die Nuklein- säuresequenzen für Feedback-regulierte funktionelle SATs aus A. thaliana (SAT-c; U30298; Noji et al., (1998) vide supra), aus Citrullus vulgaris (SAT2; Accession Code D49535; Saito et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321-26) und aus Spinacia oleracea (SAT56; D88529; Noji et al., (2001) Plant Cell Physiol. 42, 627-34) sowie aus Mikroorganismen wie S. typhimurium (CysE; Accession Code A00198; Kredich and Tomkins (1966) J. Biol. Chem. 241, 4955-65).
Ebenfalls besonders bevorzugt sind für die erfindungsgemäßen Verfahren die Nukleinsäure-Sequenzen für Feedback-unabhängige funktionelle SATs aus Pflanzen, Mikroorganismen, Pilzen und Tieren. Besonders bevorzugt sind dabei die cDNA- Sequenzen der Nicotiana tabacum SAT-Gene 1, 4 und 7 (EMBO Accession numbers AJ414051, AJ414052 und AJ414053) sowie die Arabidopsis thaliana SAT-Gene SAT 52, SAT 5 und SAT A (EMBL Accession Codes U30298, Z34888 und X82888).
Weitere bevorzugte Nuklemsäuresequenzen für die genannten SATs umfassen die A. thaliana Gene SAT-p (Accession Code L42212; Noji et al, (1998) vide supra) und SAT-m (identisch zu SAT A; Accession code X82888; Noji et al, (1998) vide supra; Bogdanova und Hell (1995) Plant Physiol, 109, 1498; Wirtz et al, (2002) vide supra).
SATs mit Sequenzen, die zu den Sequenzen der oben genannten Accession numbers im Wesentlichen homolog sind, sind ebenfalls Gegenstand bevorzugter Ausfuhrungs- formen der Erfindung.
Besonders bevorzugt verwendet man für das erfindungsgemäße Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz GKXXGDRHPKIGD (X steht für eine beliebige Aminosäure; Wirtz et al, (2001) Eur. J. Biochem. 268, 686-93) oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30%>, vorzugsweise von mindestens 50%), bevorzugt von mindestens 70%o, noch bevorzugter von mindestens 90%), am meisten bevorzugt von mindestens 95%) auf Aminosäureebene mit der Sequenz mit dem Accession code X82888 (Bogdanova et al., (1995) FEBS L. 358, 43-47; Bogdanova und Hell (1995) Plant Physiol. 109, 1498; Wirtz et al., 2002, vide supra) haben und die die enzymatische Eigenschaft einer SAT aufweisen.
Erfindungsgemäße nicht-funktionelle Feedback-regulierte oder nicht-funktionelle Feedback-unabhängige SATs können vom Fachmann in einfacher Weise identifiziert werden. Dem Fachmann stehen eine Reihe von Techniken zur Verfügung, mit denen es möglich ist, Mutationen, Insertionen oder Deletionen in die Nukleinsäuresequenzen, die für funktionelle SATs kodieren, einzufügen (Sambrook (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Nach Einführung der Punktmutation, Insertion und/oder Deletion, die auch allgemein als Mutation bezeichnet werden, kann der Fachmann durch entsprechende Enzymaktivitätstests, wie sie in den Beispielen dargestellt oder aus dem Stand der Technik bekannt sind, feststellen, ob die mutagenisierten SATs noch über Enzymaktivität verfugen. Nicht-funktionelle SATs verfugen über eine im Vergleich zur nicht-mutagenisierten SAT erniedrigten Aktivität. Erfindungsgemäß verfugt eine nicht-funktionelle SAT über 1 bis 90%>, bevorzugt über 1 bis 70%>, besonders bevorzugt über 1 bis 50%, ebenfalls besonders bevorzugt über 1 bis 30%>, insbesondere bevorzugt über 1 bis 15% und am meisten bevorzugt über 1 bis 10%> der Aktivität der entsprechenden funktionellen SAT mit Wildtyp-Sequenz.
Nicht-funktionelle SATs, die nicht mehr (oder trotzdem) in der Lage sind, an physiologische Bindungspartner der SAT wie z.B. OAS-TL zu binden, kann der Fachmann durch entsprechende in vitro Bindungstests ebenfalls in Routineexperimenten identifizieren.
Bevorzugt werden als nicht-funktionelle SATs für die erfindungsgemäßen Verfahren Nukleinsäuresequenzen verwendet, die für eine nicht-funktionelle SAT mit redu- zierter Enzymaktivität kodieren, wobei die SAT mindestens einen Aminosäureaustausch innerhalb des in SAT-Enzymen konservierten Aminosäuremotivs
GKXiÄGDRHPKIGD
verfügt. Bei der Aminosäure X handelt es sich generell um eine beliebige Aminosäure, bei Xi handelt es sich bevorzugt um Q oder A; bei der Aminosäure X handelt es sich bevorzugt um C oder S. Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code abgekürzt. Auch die N- bzw. C-terminal neben diesem genannten Motiv liegenden Aminosäuren sind in SATs stark konserviert. Das Kernmotiv innerhalb des genannten Aminosäuresequenzmotivs ist DRH. Ein Aminosäureaustausch innerhalb dieses Kernmotivs ist besonders bevorzugt.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich bei der Mutation, die zu der enzymatischen Inaktivierung der SAT führt, um einen Aminosäureaustausch der Aminosäure Histidin innerhalb des genannten Motivs. Dabei ist ein Austausch von Histidin zu Alanin besonders bevorzugt.
Unter dem Begriff "Punktmutation" ist in der Beschreibung der Austausch einer Aminosäure oder eines Nukleotids durch eine andere Aminosäure oder ein anderes Nukleotid zu verstehen. Bezüglich Aminosäuren werden so genannte konservative Austausche bevorzugt durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure ähnliche physiko-chemische Eigenschaften aufweist wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise ein Austausch von Glutamat durch Aspartat oder Valin durch Isoleucin. Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure oder eines Nukleotids durch eine direkte Bindung. Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren oder Nukleo- tiden in die Polypeptidkette oder in das Nukleinsäuremolekül, wobei formal eine direkte Bindung durch eine oder mehrere Aminosäuren oder Nukleotide ersetzt wird. In der beigefügten Abbildung 2 werden verschiedene SAT- Aminosäuresequenzen im Vergleich dargestellt. Dabei steht SAT1 für die Arabidopsis thaliana SAT-Isoform A (SAT-1, database axcession no. U 22964), SAT5 steht für die Arabidopsis thaliana SAT-Isoform B (SAT-5, database axcession no. Z 34888), SAT52 steht für die Arabidopsis thaliana SAT-Isoform C (SAT-52, database axcession no. U 30298), CysE steht für das SAT-Enzym aus S. typhimurium (CysE, database accession no. A 00198); TDT steht für Tetrahydrodipicolinat-N-Succinyltransferase aus E. coli (TDT; database accession no. P 56220); LpxA steht für UDP-N-Acetylglucosamin- acyltransferase aus E. coli (LpxA; database accession no. P 10440). Weitere Sequenzangaben sind zu finden in Murillo et al., (1995) Cell. Mol. Biol. Res. 41, 425 - 433; Howarth et al., (1997) Biochim. Biophys. Acta 1350, 123 - 127; Saito et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321 - 16326, Genbank Accession no. D 88530 (K. Saito). Dem beiliegenden Alignment kann die Position des für die Inaktivierung des SAT-Enzyms geeigneten Motivs entnommen werden . Entsprechend kann durch Alignments die Position des konservierten Aminosäuremotivs in weiteren, dem
Stand der Technik zu entnehmenden SAT-Enzymen bestimmt werden. Z.B. befindet sich das Kernmotiv D R H in der Arabidopsis thaliana SAT-Isoform A bei Aminosäure 307-309, wobei sich die Nummerierung immer auf das erste Methionin des längsten offenen Leserahmens bezieht. Die Position des Motivs in den-anderen SAT- Isoformen kann problemlos dem als Abb. 2 beigefügten Aminosäure-Alignment entnommen werden.
Neben den oben genannten SAT-Genen stehen dem Fachmann weitere im Stand der Technik beschriebene und in den Gendatenbanken erhältliche SAT-Sequenzen zur Verfügung, die sich für die Umsetzung der Erfindung eignen. Darüber hinaus ist der Fachmann mittels Routineverfahren wie PCR oder Screening von Bibliotheken mit geeigneten SAT-Gensonden problemlos in der Lage, weitere SAT-Gensequenzen aus einem beliebigen Organismus zu isolieren. Es ist bereits oben eine Vielzahl von DNA-Sequenzen, die sowohl für funktionelle als auch für nicht-funktionelle, Feedback-regulierte bzw. Feedback-unabhängige SATs aus verschiedenen Organismen kodieren, angegeben worden. Dem Fachmann ist bekannt, wie er entsprechende korrespondierende DNA-Sequenzen von anderen Organismen isolieren kann. Typischerweise wird der Fachmann zunächst durch Homologie- Vergleiche in den etablierten Datenbanken wie z.B. der Genebank- Datenbank am NCBI versuchen, entsprechende homologe Sequenzen zu identifizieren. Solche Datenbanken können auf der NCBI-Homepage beim NIH unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov gefunden werden.
DNA-Sequenzen mit einer hohen Homologie, d.h. einer hohen Ähnlichkeit oder Identität sind bona fide Kandidaten für DNA-Sequenzen, die den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, d.h. SATs entsprechen. Diese Gensequenzen können durch Standardmethoden, wie z.B. PCR und Hybridisierung isoliert werden, und ihre Funktion durch entsprechende Enzymaktivitätstests und andere Experimente durch den Fachmann bestimmt werden. Homologievergleiche mit DNA-Sequenzen können erfindungsgemäß auch verwendet werden, um PCR-Primer zu designen, indem zunächst die Regionen identifiziert werden, die zwischen den DNA-Sequenzen von verschiedenen Organismen am meisten konserviert sind. Solche PCR-Primer können dann benutzt werden, um in einem ersten Schritt DNA-Fragmente zu isolieren, die Bestandteile von DNA-Sequenzen sind, die zu den DNA-Sequenzen der Erfindung homolog sind.
Es gibt eine Reihe von Suchmaschinen, die für solche Homologievergleiche bzw. -suchen verwendet werden können. Diese Suchmaschinen umfassen z.B. die CLUSTAL-Programmgruppe des BLAST-Programms, das durch das NCBI zur Verfügung gestellt wird.
Darüber hinaus sind dem Fachmann eine Reihe von experimentellen Methoden bekannt, mit denen DNA-Sequenzen aus verschiedensten Organismen isoliert werden können, die zu den erfindungsgemäßen SATs homolog sind. Dazu gehört z.B. das Anfertigen und Screenen von cDNA-Bibliotheken mit entsprechend degenerierten Sonden (siehe auch Sambrook et al., vide supra).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt, wobei die Pflanzen einen veränderten Gehalt an Thiol-Verbindungen im Vergleich zum Wildtyp aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zeigen diese trangenen Pflanzen erhöhte Gehalte an Thiol-Verbindungen im Vergleich zum Wildtyp. Die Erhöhung an Thiol-Verbindungen kann dabei mindestens den Faktor 2, bevorzugt mindestens den Faktor 5, besonders bevorzugt mindestens den Faktor 10, insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 20 und am meisten bevorzugt mindestens den Faktor 100 betragen. Die Erhöhung des Gehalts an Vitamin E entspricht in der Regel den weiter unten genannten Werten.
Unter Thiol-Verbindungen werden dabei erfindungsgemäß natürlicherweise in Pflanzen vorkommende Verbindungen mit Thiol-Gruppen verstanden. Insbesondere zählen zu den Thiol-Verbindungen Glutathion, S-Adenosylmethionin, Methionin und Cystein.
Erfindungsgemäß können transgene Pflanzen mit verändertem Gehalt an Thiol- Verbindungen z.B. durch Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität an SAT hergestellt werden, wie sie im Folgenden im Detail diskutiert wird. Solche transgenen Pflanzen können aber auch durch Veränderung des Gehalts und/oder der Aktivität von anderen Enzymen, die in die Herstellung von Thiol-Verbindungen involviert sind, hergestellt werden.
Die Erhöhung der SAT- Aktivität und des SAT-Gehalts kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulations- mechanismen auf Transkriptions-, Translations- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend für eine SAT gegenüber dem Wildtyp, beispielsweise durch Induzierung des SAT-Gens oder durch Einbringen von Nukleinsäuren kodierend für eine SAT.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der SAT- Aktivität bzw. des SAT-Gehalts gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine SAT. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine SAT durch Einbringen von Nukleinsäuren kodierend eine SAT in den Orga- nismus, bevorzugt in eine Pflanze.
Dazu kann prinzipiell jedes SAT-Gen verschiedenster Organismen, also jede Nukleinsäure, die eine SAT kodiert, verwendet werden. Bei genomischen SAT- Nukleinsäuresequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall, dass der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden SATs zu spleißen, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden. Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können z.B. eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz sein.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt wird eine Nuklein- säuresequenz, die für eine der oben definierten funktionellen oder nicht-funktio- nellen, Feedback-regulierten oder Feedback-unabhängigen SATs kodiert, auf eine Pflanze bzw. Pflanzenzelle übertragen. Diese Übertragung fuhrt zu einer Erhöhung der Expression der funktionellen bzw. nicht-funktionellen SAT und entsprechend zu einer Erhöhung des Vitamin E-Gehalts in den transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen. Ein solches Verfahren umfasst erfindungsgemäß typischerweise die folgenden Schritte:
a) Herstellung eines Vektors umfassend die folgenden Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt DNA-Sequenzen, in 5'-3'-Orientierung:
eine in Pflanzen funktionelle Promotorsequenz operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die für eine SAT oder funktionell äquivalente Teile davon kodiert - eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz
b) Übertragung des Vektors aus Schritt a) auf eine Pflanzenzelle und ggf. Integration in das pflanzliche Genom.
Ein solches Verfahren kann verwendet werden, um die Expression von DNA- Sequenzen, die für funktionelle oder mcht-funktionelle, Feedback-regulierte oder Feedback-unabhängige SATs oder deren funktionell äquivalente Teile kodieren, zu erhöhen und damit den Vitamin E-Gehalt in Pflanzen bzw. Pflanzenzellen ebenfalls zu erhöhen. Die Verwendung solcher Vektoren, die regulatorische Sequenzen, wie es Promotor und Terminationssequenzen sind, umfassen, ist dem Fachmann bekannt. Darüber hinaus weiß der Fachmann, wie ein Vektor aus Schritt a) auf Pflanzenzellen übertragen werden kann und welche Merkmale ein Vektor besitzen muss, um ins pflanzliche Genom integriert werden zu können.
Durch Überexpression aktiver SAT kann die Gesamtaktivität von SAT auf diese Weise in Blättern von transgenem Tabak bis um den Faktor 100 erhöht werden (Wirtz et al. (2002) vide supra). Die messbare SAT-Gesamtaktivität erhöht sich nach Überexpression nicht-funktioneller SAT entsprechend nicht, wohl aber die Menge an nicht-funktioneller SAT. Dennoch muss sich in diesen transgenen Linien die Bildungsrate von O-Acetylserin und Cystein erhöht haben, da die Gehalte dieser Verbindungen stark ansteigen (WO 02/060939). Ohne an eine wissenschaftliche Hypothese gebunden sein zu wollen, wird vermutet, dass diese Erhöhung sehr wahrscheinlich durch Kompensation der jeweils nicht betroffenen Zellkomparti- mente, die über eigene Cysteinsynthese-Enzyme verfugen, erreicht wird, um die durch die inaktivierte SAT verursachte Deregulierung in Piastiden bzw. dem Cytosol auszugleichen (WO 02/060939). Gleichzeitig wird in den Pflanzen eine signifikante Erhöhung des Vitamin E-Gehalts erreicht.
Generell kann durch das dargestellte Verfahren eine Erhöhung des Vitamin E- Gehalts um mindestens 20%>, bevorzugt um mindestens 50%>, ebenfalls bevorzugt um mindestens 75 %>, besonders bevorzugt um mindestens 100%, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 5, ebenfalls insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und am meisten bevorzugt um mindestens den Faktor 100 im Vergleich zum Wildtyp erreicht werden.
Wenn der SAT-Gehalt in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Übertragen einer Nukleinsäure erhöht wird, die für eine SAT aus einem anderen Organismus wie z.B. E. coli kodiert, dann ist es empfehlenswert, die durch die Nukleinsäuresequenz z.B. aus E. coli kodierte Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung der Poly- peptidsequenz gemäß dem genetischen Code in eine Nukleinsäuresequenz zu überführen, die vor allem solche Codons umfasst, die aufgrund der Organismusspezifischen Codon-Usage häufiger verwendet werden. Die Codon-Usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.
Unter Erhöhung der Genexpression bzw. der Aktivität einer Nukleinsäure kodierend eine SAT wird erfindungsgemäß auch die Manipulation der Expression der Organismus-, insbesondere pflanzeneigenen endogenen SATs verstanden. Dies kann beispielsweise durch Veränderung der Promotor-DNA-Sequenz für SAT kodierende Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine veränderte, vorzugsweise erhöhte Expressionsrate mindestens eines endogenen SAT-Gens zur Folge hat, kann durch Deletion oder Insertion von DNA-Sequenzen erfolgen.
Eine Veränderung der Promotor-Sequenz von endogenen SAT-Genen führt in der Regel zu einer Veränderung der exprimierten Menge des SAT-Gens und damit auch zu einer Änderung der in der Zelle bzw. der Pflanzen nachweisbaren SAT- Aktivität.
Des Weiteren kann eine veränderte bzw. erhöhte Expression mindestens eines endogenen SAT-Gens dadurch erzielt werden, dass ein im nicht transformierten Organismus nicht vorkommendes Regulatorprotein mit dem Promotor dieser Gene in Wechselwirkung tritt. Solch ein Regulator kann ein chimäres Protein darstellen, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator-Domäne besteht, wie beispielsweise in WO 96/06166 beschrieben.
Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der Aktivität und des Gehalts von endogenen SATs besteht darin, Transkriptionsfaktoren, die in die Transkription der endogenen SAT-Gene involviert sind, z.B. durch Überexpression hochzuregulieren. Die Maßnahmen zur Überexpression von Transkriptionsfaktoren sind dem Fachmann bekannt und werden ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung für SATs offenbart.
Darüber hinaus kann eine Veränderung der Aktivität von endogenen SATs durch gezielte Mutagenese der endogenen Genkopien erreicht werden.
Eine Veränderung der endogenen SATs kann ebenfalls durch Beeinflussung der post-translationalen Modifikationen von SATs erreicht werden. Dies kann z.B. dadurch geschehen, dass die Aktivität von Enzymen wie Kinasen oder Phosphatasen, die in die post-translationale Modifikation von SATs involviert sind, durch entsprechende Maßnahmen wie Überexpression oder "gene silencing" reguliert wird. Die Expression von endogenen SATs kann auch über die Expression von Aptameren, die spezifisch an die Promotorsequenzen von SAT binden, reguliert werden. Je nachdem, ob die Aptamere an stimulierende oder reprimierende Promotorbereiche binden, wird die Menge und in diesem Fall damit die Aktivität an endogener SAT erhöht oder erniedrigt.
Aptamere können auch so entworfen werden, dass sie spezifisch an die SAT-Proteine binden und durch z.B. Bindung an das katalytische Zentrum der SATs die Aktivität der SATs reduzieren. Die Expression von Aptameren erfolgt üblicherweise durch Vektor-basierte Überexpression und ist dem Fachmann ebenso wie der Entwurf und die Selektion von Aptameren wohl bekannt (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243,123-36).
Darüber hinaus kann eine Venninderung der Menge und Aktivität von endogenen SATs durch verschiedene, dem Fachmann wohl bekannte experimentelle Maßnahmen erreicht werden. Diese Maßnahmen werden üblicherweise unter dem Begriff des "gene silencing" zusammengefasst. Zum Beispiel kann durch Übertragen eines oben genannten Vektors, der eine für SAT-kodierende DNA-Sequenz oder Teile davon in Antisense-Orientierung aufweist, aufpflanzen die Expression eines endogenen SAT-Gens gesilenct werden. Dies beruht darauf, dass die Transkription eines solchen Vektors in der Zelle zu einer RNA führt, die mit der vom endogenen SAT-Gen transkribierten mRNA hybridisieren kann und somit deren Translation verhindert.
Prinzipiell kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym- Verfahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die, gekoppelt an die antisense-Sequenzen, die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75). Dies kann die Effizienz einer antisense- Strategie erhöhen. Weitere Methoden zur Reduzierung der SAT-Expression insbesondere in Pflanzen als Organismen umfassen die zur Kosuppression führende Überexpression homologer SAT-Nukleinsäuresequenzen (Jorgensen et al, (1996) Plant Mol. Biol. 31 (5), 957-973) oder die Induktion des spezifischen RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon) (Angell et al, (1999) Plant J. 20 (3), 357-362). Diese Methoden werden auch als "post-transcriptional gene silencing" (PTGS) bezeichnet.
Weitere Methoden sind die Einführung von Nonsense-Mutationen in das endogene Gen mittels Einführung von RNA/DNA-Oligonukleotiden in die Pflanze (Zhu et al, (2000) Nat. Biotechnol 18 (5), 555-558) oder die Generierung von Knockout- Mutanten mit Hilfe von z.B. T-DNA-Mutagenese (Koncz et al, (1992) Plant Mol Biol. 20 (5) 963-976) oder homologer Rekombination (Hohn et al, (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96, 8321-8323.).
Ferner ist eine Genrepression (aber auch die Genüberexpression) auch mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren z.B. Faktoren vom Typus der Zink- fingertranskriptionsfaktoren möglich. Ferner können Faktoren in eine Zelle eingebracht werden, die das Zielprotein selber inhibieren. Die proteinbindenden Faktoren können z.B. Aptamere sein (Famulok et al, (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243, 123-36).
Als weitere proteinbindende Faktoren, deren Expression in Pflanzen eine Reduktion des Gehalts und/oder der Aktivität an SAT bewirkt, kommen SAT-spezifische Antikörper in Frage. Die Herstellung von monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten SAT-spezifischen Antikörpern folgt Standard-Protokollen (Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol 182, pp. 663-679 (1990), M. P. Deutscher, ed.). Die Expression von Antikörpern ist ebenfalls aus der Literatur bekannt (Fiedler et al, (1997) Immunotechnology 3, 205-216; Maynard and Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76). Weitere Techniken, die verwendet werden können, um die Expression von endogenen SAT-Genen zu unterdrücken, zu minimieren oder zu verhindern, umfassen VIGS, RNAi oder "gene knockouts" z.B. durch homologe Rekombination. Die entsprechenden Verfahren sind dem Fachmann bekannt oder können in einfacher Weise in der Literatur recherchiert werden. Eine weitere übliche Methode zum "gene silencing" ist die Co-Suppression (siehe z.B. Waterhouse et al, (2001), Nature 411, 834-842; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol 20, 446-448 und weitere Publikationen in dieser Ausgabe, Paddison et al, (2002), Genes Dev. 16, in press, Brummelkamp et al, (2002), Science 296, 550-553).
Die genannten Techniken sind dem Fachmann wohl bekannt. Er weiß daher auch, über welche Größen die für z.B. Antisense-Verfahren oder das RNAi-Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte verfugen müssen, und über welche Komple- mentarität, Homologie bzw. Identität die jeweiligen Nukleinsäuresequenzen verfugen müssen.
Die Begriffe Komplementarität, Homologie und Identität sind dem Fachmann bekannt.
Unter Sequenzhomologie bzw. Homologie wird im Rahmen dieser Erfindung allgemein verstanden, dass die Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz eines DNA- Moleküls bzw. eines Proteins zu mindestens 40%>, bevorzugt zu mindestens 50%, weiter bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70%>, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95%) und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% zu den Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen eines bekannten DNA- oder RNA-Moleküls bzw. Proteins identisch sind. Dabei bezieht sich der Homologie- bzw. Identitätsgrad auf die gesamte Länge der kodierenden Sequenz. Mit dem Begriff Komplementarität wird die Fähigkeit eines Nukleinsäuremoleküls beschrieben, mit einem anderen Nukleinsäuremolekül aufgrund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen zu hybridisieren. Der Fachmann weiß, dass zwei Nukleinsäuremoleküle nicht über eine 100-prozentige Komplementarität verfugen müssen, um miteinander hybridisieren zu können. Bevorzugt ist eine
Nukleinsäuresequenz, die mit einer anderen Nukleinsäuresequenz hybridisieren soll, zu dieser zu mindestens 40%, zu mindestens 50%>, zu mindestens 60%, bevorzugt zu mindestens 70%), besonders bevorzugt zu mindestens 80%>, ebenfalls besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95%> und am meisten bevorzugt zu mindestens 98 bzw. 100%» komplementär.
Nukleinsäuremoleküle sind identisch, wenn sie gleiche Nukleotide in gleicher 5'-3'- Reihenfolge aufweisen.
Die Hybridisierung einer antisense-Sequenz mit einer endogenen mRNA-Sequenz findet typischerweise in vivo unter zellulären Bedingungen oder in vitro statt. Erfindungsgemäß wird eine Hybridisierung in vivo oder in vitro unter Bedingungen ausgeführt, die stringent genug sind, um eine spezifische Hybridisierung zu gewährleisten.
Stringente in vitro Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden (siehe z.B. Sambrook et al, vide supra). Der Begriff "spezifische Hybridisierung" bezieht sich auf den Umstand, dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferentiell an eine bestimmte Nuklein- säuresequenz bindet, wenn diese Nukleinsäuresequenz Teil einer komplexen Mischung von z.B. DNA- oder RNA-Molekülen ist.
Der Begriff "stringente Bedingungen" bezieht sich damit auf Bedingungen, unter denen eine Nukleinsäuresequenz präferentiell an eine Zielsequenz bindet, aber nicht oder zumindest wesentlich reduziert an andere Sequenzen. Stringente Bedingungen sind von den Umständen abhängig. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Generell werden stringente Bedingungen so gewählt, dass die Hybridisierungstemperatur circa 5°C unter dem Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten ionischen Stärke und einem definierten pH- Wert liegt. Tm ist die Temperatur (bei einem definierten pH-Wert, einer definierten ionischen Stärke und einer definierten Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der Moleküle, die zu einer Zielsequenz komplementär sind, mit dieser Zielsequenz hybridisieren. Typischerweise umfassen stringente Bedingungen Salzkonzentrationen zwischen 0,01 und 1 ,0 M Natriumionen (oder eines anderen Salzes) und einen pH zwischen 7,0 und 8,3. Die Temperatur ist mindestens 30°C für kurze Moleküle (z.B. für solche, die zwischen 10 bis 50 Nukleotiden umfassen). Zusätzlich können stringente Bedingungen die Zugabe von destabilisierenden Agenzien wie z.B. Formamid umfassen. Typische Hybridisierungs- und Waschpuffer haben folgende Zusammensetzung.
Prähybridisierungslösung:
0,5 % SDS 5x SSC
50 mMNaPO4, pH 6,8 0,1 % Na-Pyrophosphat 5x Denhardt's Reagenz 100 μg/ml Lachssperm
Hybridisierungslösung: Prähybridisierungslsg. lxlO6 cpm/ml Sonde (5-10 min 95°C)
20x SSC: 3 M NaCl
0,3 M Natriumeitrat ad pH 7 mit HCl
50x Denhardt's Reagenz: 5 g Ficoll
5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g Bovine Serum Albumine ad 500 ml A. dest.
Eine typische Verfahrensweise für die Hybridisierung sieht folgendermaßen aus:
Optional: Blot 30 min in lx SSC/ 0,1% SDS bei 65°C waschen
Prähybridisierung: mindestens 2 h bei 50-55°C
Hybridisierung: über Nac] tιt bei 55-60°C
Waschen: 05 min 2x SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp
30 min 2x SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp
30 min lx SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp
45 min 0,2x SSC/ 0,1% SDS 65°C
5 min 0,lx SSC Raumtemperatur
Die Begriffe "Sense" und "Antisense" sowie "Antisense-Orientierung" sind dem Fachmann bekannt. Der Fachmann weiß darüber hinaus, wie lang Nukleinsäure- moleküle, die für antisense-Verfahren verwendet werden sollen, sein müssen und welche Homologie oder Komplementarität sie hinsichtlich ihrer Zielsequenzen haben müssen.
Entsprechend weiß der Fachmann auch, wie lang Nukleinsäuremoleküle, die für andere "gene silencing"-Verfahren verwendet werden, sein müssen. Zum Beispiel weiß der Fachmann, dass bei einem RNAi-Verfahren Nukleinsäuremoleküle in die Zelle eingebracht werden müssen, bei denen es sich entweder um doppelsträngige RNA, von denen ein Strang homolog bzw. identisch zu einer endogenen RNA- Sequenz ist, handelt, oder um DNA-Moleküle, deren Transkription in der Zelle entsprechende doppelsträngige RNA-Moleküle ergeben, wobei die die RNA- interference induzierenden doppelsträngigen RNA-Moleküle üblicherweise 20-25 Nukleotide umfassen (siehe auch Tuschl et al, vide supra). Eine ausführliche Beschreibung dieser Methode ist ebenfalls in WO 99/32619 offenbart.
Auch eine kombinierte Anwendung der vorstehend beschriebenen Methoden ist denkbar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung des Vitamin E-Gehalts in transgenen Pflanzen, bei dem zusätzlich zu der Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SAT solche Enzyme, die eine erhöhte Bildung von Homogentisat oder Phytylpyrophosphat, einen verminderten Abbau von Homo- gentisat oder Phytylpyrophosphat oder eine verstärkte Umsetzung innerhalb der letzten Schritte der Tocopherolbiosynthese bewirken (z.B. Tocopherolmethyltransferase, Tocopherolcyclase, γ-Tocopherolmethyltransferase), hinsichtlich ihres Gehalts oder ihrer Aktivität in den transgenen Pflanzen verändert sind.
Beispiele für solche Enzyme finden sich in der WO 02/072848, die hier diesbezüglich ausdrücklich als Offenbarung eingeführt wird.
Da es sich bei diesen Enzymen um Enzyme handelt, die in die Regulation der
Vitamin E-Synthese in vivo involviert sind, bringt die Hochregulierung des Gehalts bzw. der Aktivität der vorgenannten Enzyme im Zusammenhang mit der Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SATs weitere Vorteile bei der Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt. Die Hoch- oder Runterregulation der Aktivität bzw. des Gehalts der genannten Enzyme kann dabei durch eine und/oder eine Kombination der vorgenannten Methoden erfolgen.
Wenn erfindungsgemäß DNA-Sequenzen verwendet werden, die in 5'-3'-Orien- tierung operativ mit einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist, verknüpft sind, können allgemein Vektoren konstruiert werden, die nach der Übertragung auf Pflanzenzellen die Überexpression der kodierenden Sequenz in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen ermöglichen bzw. die Suppression von endogenen Nukleinsäuresequenzen bewirken.
Vektoren, die erfindungsgemäß zur Überexpression und zur Repression von DNA- Sequenzen, die für die verschiedenen SATs oder funktionell äquivalente Teile davon kodieren, verwendet werden können, können zusätzlich zu den zu übertragenden Nukleinsäuresequenzen regulatorische Sequenzen umfassen. Welche spezifischen regulatorischen Elemente bzw. Sequenzen in diesen Vektoren enthalten sind, hängt dabei von dem Ziel der Anwendung ab. Vektoren, die zur Überexpression von kodierenden Sequenzen in Pflanzen verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt. Dem Fachmann sind ebenso Methoden zur Übertragung der Sequenzen sowie zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten bzw. reduzierten Expression von Proteinen bekannt.
Typischerweise gewährleisten die regulatorischen Elemente, die in Vektoren enthalten sind, die Transkription und, wenn erwünscht, die Translation der Nukleinsäuresequenz, die auf die Pflanzen übertragen wird.
Diese Nukleinsäurekonstrukte, in denen die kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit einem oder mehreren Regulationssignalen operativ verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Pflanzen gewährleisten, werden Vektoren oder auch Expressionskassetten genannt. Dementsprechend betrifft die Erfindung femer Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere als Expressionskassette fungierende Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend eine SAT oder funktionell äquivalente Teile davon, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft ist, die die Trans- kription und Translation in Organismen, insbesondere in Pflanzen gewährleisten.
Vorzugsweise enthalten die Regulationssignale einen oder mehrere Promotoren, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Pflanzen gewährleisten.
Die Expressionskassetten beinhalten Regulationssignale, also regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst eine Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5 '-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3 '-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für mindestens eines der vorstehend beschriebenen Gene operativ verknüpft sind.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiteren regulativen Elementen derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform enthalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte und Expressionskassetten zusätzlich eine Nukleinsäure, die für ein Peptid kodiert, das die Lokalisation der exprimierten SAT in der Zelle reguliert. Bevorzugt kodieren solche Nukleinsäuren für plastidäre Transitpeptide, die die Lokalisation in Piastiden, insbesondere bevorzugt in Chloroplasten gewährleisten, oder für Signalpeptide, die die Lokalisation im Cytoplasma, Mitochondrien oder im Endoplasmatischen Reticulum bewirken.
Im Folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäurekonstrukte,
Expressionskassetten und Vektoren für Pflanzen und Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, sowie die transgenen Pflanzen selbst beschrieben.
Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären
Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Piastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker wie die 5 '-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al, (1987) Nucl Acids Res. 15, 8693 -8711).
Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik- Virus (Franck et al, (1980) Cell 21, 285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche Erkennungssequenzen für trans- kriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konsti- tutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al, (1989) EMBO J. 8 2195-2202). Ein weiterer möglicher Promotor ist der Nitrilase-Promotor.
Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des Ziel-Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z.B. der PRP1 -Promotor (Ward et al, (1993) Plant. Mol Biol 22, 361-366), ein durch Salicylsäure indu- zierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesulfonamid induzierbarer (EP 388 186), ein durch Tetrazyklin induzierbarer (Gatz et al, (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer (EP 335 528) bzw. ein durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können verwendet werden.
Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Vitamin E bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al, (1989) EMBO J. 8 2445-245).
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremdprotein stabil bis zu einem Anteil von 0,67 % des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler et al, (1995) Bio/Technology 10 1090-1094). Besonders bevorzugt ist daher die Expression der SATs im Samen von Pflanzen unter Verwendung Samen-spezifischer Promotoren wie z.B. des Phaseolin- (US 5504200), des USP- (Baumlein et al, (1991) Mol Gen. Genet. 225 (3), 459-467), des LEB4-, des Vicilin- und des Legumin B4-Promotors.
Der Biosyntheseort von Vitamin E ist in Pflanzen unter anderem das Blattgewebe, so dass eine blattspezifische Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierend eine SAT sinnvoll ist. Dies ist jedoch nicht einschränkend, da die Expression auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - besonders in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft deshalb eine samenspezifische Expression der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren. Darüber hinaus ist eine konstitutive Expression der SAT von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten SAT kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression der SAT und deren Auswirkung auf die Vitamin E- Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet vorzugsweise in der 5 ' -3 ' - Transkriptionsrichtung den Promotor, eine kodierende Nukleinsäuresequenz und eventuell eine Region für homologe oder heterologe die transkriptionale Termi- nation. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im Wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignalen aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al, (1984) EMBO J. 3, 835 ff.) oder funktionelle Äquivalente davon.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt vorzugsweise durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer vorstehend beschriebenen Nukleinsäure wie einer für SAT kodierenden Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und Nuklein- säuresequenz inserierten Target-Nukleinsäure, die z.B. für ein chloroplasten- spezifisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal, nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Sambrook et al, (vide supra) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Insbesondere bevorzugt sind inserierte Target-Nukleinsäuren, die ein Targeting in die Piastiden gewährleisten.
Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren Nukleinsäuresequenz für ein Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloro- plasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation des Ziel-Proteins in die Chloroplasten vom Ziel-Protein-Teil enzymatisch abgespalten werden.
Ebenfalls bevorzugt sind in Expressionskassetten Sequenzen enthalten, die für ein Fusionsprotein mit einem Cytoplasma-Peptid kodieren. Die Lokalisation im Cytoplasma kann dabei u.U. auch durch Weglassen der Sequenz für das plastidäre Transitpeptid sichergestellt werden.
Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären Nicotiana tabacum Transketolase oder einem anderen Transitpeptid (z.B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco (rbcs) oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase als auch der Isopentenylpyrophosphat Isomerase-2) oder dessen funktionellem Äquivalent abgeleitet ist.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen Nukleinsäure- Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleotidsequenzen mit Kodons, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden.
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotidsequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in
Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im Allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vztro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden.
Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Die Erfindung betrifft somit Vektoren enthaltend die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Expressionskassetten. Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom eines Organismus, insbesondere einer Pflanze, wird als Transformation bezeichnet.
Dazu können insbesondere bei Pflanzen an sich bekannte Methoden zur Trans- formation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt werden.
Geeignete Methoden zur Transformation von Pflanzen sind die Protoplastentrans- formation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA- Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al, (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 128-143 sowie in Potrykus et al, (1991) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Molec. Biol. 42, 205-225) beschrieben.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide wie beispielsweise pUC- Derivate verwendet werden. Typischerweise können Vektoren verwendet werden, die über zur Propagation und Selektion in E.coli nötige Sequenzen verfugen. Dazu gehören auch Vektoren der pBR322-, M13mp-Serien und pACYC184. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen. Gebräuchliche Seklektionsmarker sind solche, die den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonyl-Harnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin und dergleichen vermitteln.
Je nach Einfuhrungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden beispielsweise für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- und Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformationen Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri- Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation).
Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Poly linker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al, (1978) Molecular and General Genetics 163, 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium sollte ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzlich kann T-DNA vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzelle ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 515 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (beispielsweise Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. '
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klomerungstechniken können die Expressionskassetten ebenfalls in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungs- vektoren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in ein Derivat des Transformationsvektors pSUN2 mit Vicilin-Promotor (WO 02/00900) eingebaut werden. Während die Transformation dikotyler Pflanzen bzw. deren Zellen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten daraufhin, dass auch monokotyle Pflanzen bzw. deren Zellen der Transformation mittels auf Agrobakterien basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (siehe u.a. Chan et al, (1993), Plant Mol. Biol. 22, 491-506).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren Zellen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan et al, (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al, (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al, (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al, (1990) Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern (vgl. L. Willmitzer (1993) Transgenic Plants in: Biotechnology, A Multi- Volume Comprehensive Treatise (Herausgeber: HJ. Rehm et al, Band 2, 627-659, VCH Weinheim, Deutschland) .
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al, (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen besitzen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehr Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, dass das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich eines erhöhten Vitamin E-Gehalts untersucht und mit dem von hemi- zygoten Linien verglichen werden.
Selbstverständlich können Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nuklein- säuremoleküle enthalten, auch als Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten, Kalli, Suspensionskulturen und dergleichen) weiterkultiviert werden.
Die Expressionskassette kann über die Pflanzen hinaus auch zur Transformation von Bakterien, insbesondere Cyanobakterien, Moosen, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft daher femer die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren und der vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere der Expressionskassetten zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen, insbesondere zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen oder zur Transformation von Pflanzenzellen, -geweben oder Pflanzenteilen.
Vorzugsweise weisen diese transgenen Pflanze gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Vitamin E auf.
Daher betrifft die Erfindung femer die Verwendung von SATs oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte zur Erhöhung des Gehalts an Vitamin E in Organismen, die als Wildtyp in der Lage sind, Vitamin E zu produzieren.
Es ist bekannt, dass Pflanzen mit einem hohen Vitamin E-Gehalt eine erhöhte
Resistenz gegenüber abiotischem Stress aufweisen. Unter abiotischem Stress wird beispielsweise Kälte, Frost, Trockenheit, Hitze und Salz verstanden. Daher betrifft die Erfindung weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Herstellung transgener Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Resistenz gegenüber abiotischem Stress aufweisen.
Die vorstehend beschriebenen Proteine und Nukleinsäuren können zur Herstellung von Feinchemikalien in transgenen Organismen, vorzugsweise zur Herstellung von Vitamin E in transgenen Pflanzen verwendet werden.
Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes der Pflanze oder Pflanzenteile an Vitamin E.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen, Blütenblättern oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen, indem man eine vorstehend beschriebene Nukleinsäure oder ein vorstehend beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt oder eine vorstehend beschriebene Kombination von Nukleinsäurekonstrukten in das Genom des Ausgangsorganismus einfuhrt.
Die Erfindung betrifft ferner die vorstehend beschriebenen genetisch veränderten Organismen selbst.
Wie vorstehend erwähnt, weisen die genetisch veränderten Organismen, insbe- sondere Pflanzen, einen erhöhten Gehalt an Vitamin E auf.
Zur Herstellung von Organismen mit einem im Vergleich zum Wildtyp erhöhten Gehalt an Vitamin E werden in einer bevorzugten Ausführungsform, wie vorstehend erwähnt, photosynthetisch aktive Organismen wie beispielsweise Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, besonders bevorzugt Pflanzen, als Ausgangsorganismen verwendet.
Bei den für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Pflanzen kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutz-, Nahrungs- oder Futterpflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Seeale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören.
Dikotyle Nutzpflanzen umfassen unter anderem Baumwolle, Leguminosen wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen sowie Bäume. Weitere Nutzpflanzen können Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Olpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitalis umfassen. Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Zuckerrübe, Raps, Soja, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weitere Nutzpflanzen können dem US-Patent US 6,137,030 entnommen werden.
Bevorzugte Pflanzen sind Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter Pfeffer, Soja, Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Karotte, Kartoffel, Mais, Salate und Kohlarten, Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf, Brassicacaeen wie beispielsweise Raps oder Canola, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Nuss- und Weinspezies oder Holzgewächse wie beispielsweise Espe oder Eibe.
Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Tagetes ereeta, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Sonnenblume, Canola, Kartoffel oder Soja. Solche transgenen Pflanzen, deren Vennehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung betrifft somit ebenfalls Ernteprodukte und Vennehrungsmaterial transgener Pflanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden und einen erhöhten Vitamin E-Gehalt aufweisen. Bei den Ernteprodukten und dem Vermehrungsmaterial handelt es sich insbesondere um Früchte, Samen, Blüten, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc. Es kann sich auch um Teile dieser Pflanzen wie Pflanzenzellen, Protoplasten und Kalli handeln.
Die genetisch veränderten Organismen, insbesondere Pflanzen, können wie vorstehend beschrieben zur Herstellung von Vitamin E verwendet werden.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitamin E können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Prozessierung als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Futter- und Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Pflanzen können femer zur Her- Stellung von Vitamin E-haltigen Extrakten verwendet werden.
Erhöhung des Gehaltes an Vitamin E bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung dieser Verbindungen in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze, vorzugsweise für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Unter einem erhöhten Gehalt an Vitamin E wird in der Regel ein erhöhter Gehalt an Gesamt-Tocopherol verstanden. Unter einem erhöhten Gehalt an Vitamin E wird aber auch insbesondere ein veränderter Gehalt der vorstehend beschriebenen 8 Verbindungen mit Tocopherolaktivität verstanden.
Die Bestimmung des Vitamin E-Gehalts erfolgt nach im Stand der Technik üblichen Methoden. Diese sind insbesondere ausführlich in WO 02/072848 offenbart, dessen Inhalt hier ausdrücklich als Offenbarung für Nachweisverfahren des Vitamin E- Gehalts in Pflanzen angeführt wird.
Der Vitamin E-Gehalt kann z.B. in Blättern und Samen von für SATs transgenen Pflanzen bestimmt werden. Dazu werden insbesondere trockene Samen oder gefrorenes Blattmaterial verwendet.
Das Blattmaterial der Pflanzen wird direkt nach der Probennahme in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Der sich daran anschließende Aufschluss der Zellen (Blätter oder Samen) erfolgt mittels einer Rührapparatur durch dreimalige Inkubation im Eppendorfschüttler bei 30°C, 1000 rpm (Umdrehungen pro Minute) in 100%> Methanol für 15 Minuten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt werden. Weitere Inkubations- und Extraktionsschritte ergeben in der Regel keine weitere Freisetzung von Tocopherolen oder Tocotrienolen.
Um Oxidation zu vermeiden, werden die erhaltenen Extrakte direkt nach der Extraktion mit Hilfe einer HPLC-Anlage (Waters Allience 2690) analysiert. Tocopherole und Tocotrienole werden über eine übliche „Reverse Phase"-Säule (ProntoSil 200-3-C30 TM , Fa. Bischoff) mit einer mobilen Phase von 100% Methanol getrennt und anhand von Standards (Fa. Merck) identifiziert. Als Detektionssystem dient die Fluoreszenz der Substanzen (Anregung 295 nm, Emission 320 nm), die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszenzdetektors FP 920 nachgewiesen werden kann. Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert.
Beispiele
Allgemeine Klonierungsverfahren:
Klonierungsverfahren, wie z.B. Restriktionsspaltung, DNA-Isolierung, Agarose, Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose und Nylon-Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. co/z-Zellen, Anzucht von Bakterien, Sequenz-Analyse von rekombinanter DNA, wurden nach Sambrook et al, vide supra, durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen et al, ((1988) Nucl. Acids Res. 16, 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobakterien erfolgte in YEB-Medium (Vervliet et al, (1975) J. Gen. Virol 26, 33).
Bakterienstämme und Plasmide
E. coli (XL 1 Blue) Bakterien wurden von der Firma Stratagene, La Jolla, USA bezogen. Der zur Pflanzentransformation eingesetzte Agrobakterienstamm (GV3101; Bade und Damm in Gene Transfer to Plants; Protrykus, I. and Spangenberg, G., eds., Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30 - 38) war mit dem Vektor pSUN2 transformiert. Zur Klonierung wurde der Vektor pSUN2 verwendet. Herstellung von transgenen Raps-Pflanzen (Brassica napus)
Transgene Ölsamen-Rapspflanzen wurden gemäß einem Standardprotokoll hergestellt (Bade und Damm in Gene Transfer to Plants; Protrykus, I. and Spangenberg, G., eds., Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30 - 38). Die genannte Referenz offenbart ebenfalls die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer.
Die Samen von Brassica napus var. Westar wurden mit 70%> Ethanol (v/v) oberflächen-sterilisiert, in Wasser bei 55°C für 10 min gewaschen und in einer l%>igen Hypochlorite-Lösung (25%) (v/v) Teepol, 0,1% (v/v) Tween20) für 20 min inkubiert. Danach wurde jeder Samen sechsmal mit sterilem Wasser für 20 min gewaschen. Die Samen wurden für drei Tage auf Filterpapier getrocknet. 10 bis 15 Samen wurden dann in einem Glasbehälter, der 15 ml Keimungs-Medium enthielt, ausgekeimt. Die Wurzeln und Apices wurden von verschiedenen Setzlingen (Größe ca. 10 cm) entfernt und die verbleibenden Stämmchen (engl: hypocotyls) in Stückchen von ca. 6 mm Länge geschnitten. Die auf diese Weise erhaltenen ca. 600 Explantate wurden in 50 ml „BasaP'-Medium für 30 min gewaschen und dann in einen 300 ml Behälter überführt. Nach der Zugabe von 100 ml Kallusinduktions- Medium wurden die Kulturen unter Schütteln bei 100 rpm (engl. : revolutions per minute) für 24 h inkubiert.
Zur Transformation wurde eine Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens in „Luria BrotiY'-Medium, das mit Kanamycin (20 mg/1) versetzt war, bei 29°C angezogen und 2 ml dieser Kultur in 50 ml Antibiotika-freiem „Luria Broth"- Medium bei 29°C für 4 Stunden inkubiert, bis eine OD6oo von 0,4 bis 0,5 erreicht war. Die Kultur wurde dann bei 2000 rpm für 25 min zentrifugiert und das Zellpellet in 25 ml „Basal"-Medium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde auf eine OD6oo von 0,3 durch entsprechende Zugabe von Medium eingestellt. Das Kallusinduktions-Medium wurde von den Ölsamen-Rapsexplantaten mit Hilfe von sterilen Pipetten entfernt und 50 ml der Bakteriensuspension zu den Explantaten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde dann entfernt und die Ölsamen-Raps- explantate anschließend mit 50 ml des Kallusinduktions-Mediums für 1 min gewaschen. Anschließend wurden 100 ml des Kallusinduktions-Mediums zugegeben. Die Co-Kultivierung wurde unter Schütteln bei 100 rpm für 24 h durchgeführt und durch Entfernen des Kallusinduktions-Mediums gestoppt. Die Explantate wurden dann jeweils zweimal mit 25 ml Wasch-Medium für 1 min und zweimal mit 100 ml Wasch-Medium für 60 min unter Schütteln bei 100 rpm gewaschen. Das Wasch- Medium wurde dann mit den Explantaten in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit Hilfe von sterilen Pipetten entfernt.
Zur Regeneration wurden jeweils 20 bis 30 Explantate in 90 mm Petrischalen, die 25 ml "Shoot induction"-Medium mit Kanamycin enthielten, überführt. Die Petrischalen wurden mit zwei Schichten Leukopor® abgedichtet und bei 25 °C und 2000 Lux einem Photozyklus von 16 h Licht und 16 h Dunkelheit unterworfen. Jeweils nach 12 Tagen wurden die sich entwickelnden Kalli in frische Petrischalen, die ebenfalls "Shoot induction" -Medium enthielten, überfuhrt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration vollständiger Pflanzen wurden wie in der oben genannten Referenz (Bade und Damm, vide supra) angegeben durchgeführt.
Herstellung einer enzymatisch inaktiven Serin-Acetyltransferase (SAT), die noch zur Interaktion mit OAS-TL befähigt ist.
Die im Stand der Technik hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz sowie der zugrunde liegenden DNA-Sequenz beschriebene SAT-A aus Arabidopsis thaliana (EMBL Accession code X82888; Bogdanova und Hell (1995) Plant Physiol 109, 1498; Wirtz et al, 2002, vide supra) wurde durch gerichtete Mutagenese der Aminosäure Histidin 309 zu Alanin inaktiviert (die Nummerierung bezieht sich auf das erste Methionin des offenen Leserahmens). Die gerichtete Mutagenese der zugehörigen cDNA im Plasmid pBlueScript (Stratagene) erfolgte durch Basenpaaraustausch nach einem kommerziell verfügbaren Verfahren der Firma Promega (Heidelberg, Deutschland).
Die ortsgerichtete Mutagenese der SAT-A cDNA wurde mit pBS/ΔSATl-6 durchgeführt (Bogdanova et al, (1995) FEBS Lett. 358, 43-47). Das eingesetzte Promega GeneEditor in vitro Site Directed Mutagenesis System erzielte im Durchschnitt 80% positive Klone. Die Punktmutationen wurden durch DNA- Sequenzierung verifiziert und die resultierenden Aminosäureaustausche wurden in Bezug auf das Startkodon des längsten möglichen offenen Leserahmens einer mitochondrialen SAT-A cDNA nummeriert (cDNA SAT-1 (Roberts et al, (1996) Plant Mol. Biol 30, 1041-1049)).
Die Inaktivierung der SAT-Mutante durch den Aminosäureaustausch in Position 309 (Histidin - Alanin) wurde durch fehlende heterologe Komplementation einer SAT- freien E. co b'-Mutante und durch Enzymbestimmung in vitro (maximal 1%> Rest- aktivität) belegt. Die Interaktionsfähigkeit mit O-Acetylserin (Thiol) Lyase (OAL- TL) wurde durch heterologe Expression in dem Hefe "two-hybrid"-System und Coexpression in E. coli mit nachfolgender biochemischer Reinigung bewiesen.
Die Inaktivierung des cysE-Gens von E. coli zwecks Erzeugung einer SAT-freien E. coli Mutante wurde nach der von Hamilton et al. beschriebenen Methode durchgeführt (Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol. 171, 4617 - 4622). Hierdurch sollte ein Bakterienstamm bereitgestellt werden, der bezüglich seiner SAT-Defizienz stabiler ist als die im Stand der Technik gegenwärtig erhältlichen. Hierzu wurde das Wildtyp c sE-Gen mittels PCR kloniert und durch Insertion einer Gentamycin- Resistenz-Kassette in eine Clal-Restriktionsschnittstelle bei Position 522, bezogen auf das Startcodon des cysE-Gens, inaktiviert. Nach Klonierung dieser Kassette in das Plasmid pMAK705, welches einen Temperatur-sensitiven Replikationsursprung trägt, wurde das inaktivierte cysE-Gen in das Genom von E. coli C600 via homologe Rekombination integriert, um den Stamm MW1 zu ergeben (tbr, leu, thi, lac, λ-P\ + F', cysE, Gmr). Komplementationstests unter Einsatz der E. co/f-Stämme EC1801 (E. coli Genetik Stock Center, Yale University, New Haven, CT, USA) oder MW1 wurden auf M9-Minimalmedium-Agarplatten mit oder ohne Cystein unter Zugabe von Induktionsmittel und selektiven Antibiotika durchgeführt.
Die Konstrukte für die Expression der mitochondrialen SAT-A aus Arabidopsis thaliana umfassten pBS/ΔSATl-6 (X82888; Bogdanova et al, (1985) vide supra), pET/ΔSATl-6 sowie mutierte Formen der SAT-A. Um das zuletzt genannte Plasmid zu erhalten, wurde die kodierende Region der SAT-A mittels PCR von Basenpaar 28 - 939 ohne mitochondriales Transitpeptid unter Einsatz spezifischer Primer, flankiert von EcoRI- und Xhol-Schnittstellen, amplifiziert. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pCAP (Röche, Mannheim, Deutschland) kloniert, die Sequenz mittels Sequenzierung beider Stränge verifiziert und in die entsprechenden Schnittstellen von pET29a (Novagen, Madison, USA) eingefügt, was in einem Fusionsprotein mit den 35 Aminosäuren des S-Tag an seinem N-Terminus für Affinitätsreinigung an S-Agarose resultierte. Mitochondriale OAS-TL aus A. thaliana wurde in ähnlicher Weise durch Klonierung eines PCR-Produkts, welches das reife Protein ohne das mitochondriale Transitpeptid von Basenpaar 172 - 1162 (AJ271727 (Hesse et al, (1999) Amino Acids 16, 113-131) umfasste, in die NcoI-BamHI-Schnittstellen von pET3d, was pET/OAS-C ergab, exprimiert.
Die Expression, Kultivierung und Affinitätsreinigung von SAT und OAS-TL unter Einsatz des S-tag-Systems (Novagen) wurden im Wesentlichen wie von Droux et al, (1998, Eur. J. Biochem. 255,235-245) beschrieben durchgeführt, mit den folgenden Modifikationen. Nach dem letzten Waschschritt wurde der S-tag nicht durch proteo- lytische Spaltung an der Affinitätssäule entfernt, da diese Behandlung in Fraktionen mit labiler SAT-Aktivität resultierte. Statt dessen wurde SAT mit 3 M MgCl2 eluiert, welches anschließend durch Gelfiltration an PDIO-Säulen (Amersham, Freiburg, Deutschland) entfernt wurde. In vitro Interaktion von SAT und OAS-TL an der Säule wurde nach einem Standardwasch- und ElutionsprotokoU mit oder ohne 1 mM OAS (O-Acetylserin) bestimmt, wie beschrieben von Droux et al, (1998, vide supra).
Die Bestimmung der Proteinkonzentration und die Auftrennung von Proteinen wurden nach Standardprotokollen (z.B. Sambrook et al, vide supra) durchgeführt.
Die SAT-Enzymaktivität mit und ohne OAS-TL wurde in einem Standard-Assay auf der Grundlage der Methode von Kredich und Becker (1971, In Methods in Enzymology (Tabor and Tabor, eds), Seiten 459-469, Academic Press, New York, USA) bestimmt. Roh- oder gereinigtes rekombinantes SAT-Protein wurde in einem Volumen von 250 μl (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,2 mM Acetyl-CoA, 2mM Dithiothreitol, 5mM Serin) bei 25 °C inkubiert und A232 wurde für bis zu 3 Min. aufgenommen.
Die OAS-TL- Aktivität wurde unter gesättigten Bedingungen wie zuvor beschrieben untersucht (Nakamura et al, (1987) Plant Cell Physiol.28, 885-891). Kinetische Analysen wurden mit der SigmaPlot-Software durchgeführt, welche hyperbolische Anpassungen auf der Grundlage der Michaelis-Menten-Gleichung erlaubte: v = Vmax x ([S]/(Km + [S]).
Für die Interaktionsanalysen unter Einsatz des Hefe "two-hybrid"-Systems wurden die Transformation der Hefestämme HF7c und PCY2, die Selektion auf Minimalmedium und ß-Galaktosidase-Assays durchgeführt wie bereits beschrieben (Bogdanova and Hell (1997) Plant J. 11, 251-262). PCR mit spezifischen Primerpaaren, flankiert von Sall- bzw. Spel-Schnittstellen, wurde für sämtliche Konstrukte eingesetzt, um die kodierenden Regionen in die entsprechenden Restriktions- Schnittstellen von pPC86 (GAL4-Aktivierungsdomäne) und pPC97 (GAL4-DNA- Bindungsdomäne) einzufügen (Chevray and Nathans (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 5789-5793). EST 181H17T7 (GenBank Accession Number AJ2711727) wurde als Template eingesetzt, um OAS-TL C ohne mitochondriales Transitpeptid von Basenpaar 172 - 1162 zu erzeugen. Im Unterschied zu dem bisher eingesetzten füll length-Konstrukt (Bogdanova et al, (1997) vide supra) wurden die pPC- Vektoren mit mitochondrialer SAT-A ohne mitochondriales Transitpeptid durch Amplifizierung von Basenpaar 28 - 939 konstruiert (X82888 (Bogdanova et al, (1995) vide supra).
Expression der aktiven SAT-A und der nicht-funktionellen S AT-A-Mutante (H309A) in Pflanzen
Die cDNAs der aktiven SAT-A (SAT) und der inaktivierten Mutante SAT-A H309A (SATH309A) wurden in einen binären Transformationsvektor (pSUN2, WO 02/00900) kloniert. SAT und SATH309A wurden in gleicher Weise durch PCR amplifiziert und mit dem Leserahmen des rbcs Transitpeptides fusioniert. Die Lokalisierung beider SATs im Cytosol erfolgte mit pSUN2 unter Weglassung des Abschnitts für das Importpeptid. Als Promotoren wurden entweder der Nitrilase- Promotor für eine konstitutive Expression oder der Vicilin-Promotor für eine samenspezifische Expression verwendet.
Die Klonierungen erfolgten jeweils in die vorgegebenen Xhol- bzw. Smal- Restriktionsschnittstellen des genannten Vektors pSUN2.
Die cDNA der aktiven SAT und der SAT-Mutante SATH309A wurde jeweils mit den Oligonukleotid-Primern SAT269 und SAT270, die über 5 '-gelegene zusätzliche Xhol- und EcoRI-Restriktionsschnittstellen verfügten, durch Standard PCR ampli- fiziert. Nach Verdau mit EcoRI wurden die SAT-Fragmente durch Ligation mit dem ebenfalls mit EcoRI verdauten Transitpeptid rbcs fusioniert. Das Transitpeptid wurde mittels der Oligonukleotid-Primer Tra201 und Tra202, die über 5 '-gelegene zusätzliche EcoRI- und Smal-Restriktionsschnittstellen verfugten, ebenfalls durch Standard-PCR amplifiziert. Anschließend erfolgte die Ligation der fusionierten Fragmente in die Xhol- und Smal- Restriktionsschnittstellen des Vektors.
Beispiel für Standard PCR: Reaktionsvolumen 50 μl mit 20 pmol jedes Primers, 1-10 ng Plasmid, Puffer des Herstellers, 1 U Taq-Polymerase (Promega). Abfolge: 5 Min. bei 94°C, dann 30 Zyklen zu 30 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 55°C, 30 Sek. bei 72°, gefolgt von 10 Min. bei 72°C.
Tra201: 5'-CTC GAG AAT GGC TTC CTC AAT G-3' Tra202: 5'-GAA TTC CCA CAC CTG CAT GCA TTG TAG TC-3' SAT269: 5'-GAA TTC CAT GAA CTA CTT CCG TTA TC-3' SAT270: 5'-CCC GGG TCA AAT TAC ATA ATC CGA C-3'
Extraktion und Aktivitätsbestimmung der SATs aus transgenen Rapspflanzen
Die SATs wurden aus dem transgenen Pflanzenmaterial extrahiert und ihre Aktivität bestimmt. Dazu wurde das Protokoll von Nakamura et al, ((1987) Plant Cell Physiol, 28, 885-891) verwendet. Es wurden jeweils die Blätter (Nitrilase-Promotor) oder die Samen (Vicilin-Promotor) von drei unabhängigen transgenen Linien untersucht. Es zeigte sich, dass transgene Pflanzen, die die SATH309A exprimieren, über eine unveränderte SAT- Aktivität im Vergleich zu nicht-transgenen Pflanzen verfügen, während transgene Pflanzen, die die aktive SAT überexprimieren, über eine deutlich erhöhte Gesamt-S AT Aktivität verfügen. Bestimmung des Vitamin E-Gehalts der transgenen Pflanzen
Die Extraktion von Vitamin E und dessen Nachweis erfolgte wie oben beschrieben. Für die Analyse wurde gefrorenes Blattmaterial (Nitrilase-Promotor) oder trockene Samen (Vicilin-Promotor) eingesetzt. Das Blattmaterial der Pflanzen wurde entsprechend direkt nach der Probennahme in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Der sich daran anschließende Aufschluss der Zellen (Blätter oder Samen) erfolgte mittels einer Rührapparatur durch dreimalige Inkubation im Eppendorfschüttler bei 30°C, 1000 rpm (Umdrehungen pro Minute) in 100%) Methanol für 15 Minuten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt wurden. Weitere Inkubations- und
Extraktionsschritte ergaben in der Regel keine weitere Freisetzung von Tocopherolen oder Tocotrienolen.
Um Oxidation zu vermeiden, wurden die erhaltenen Extrakte direkt nach der Extraktion mit Hilfe einer HPLC- Anlage (Waters Allience 2690) analysiert.
Tocopherole und Tocotrienole wurden über eine übliche „Reverse Phase"-Säule (ProntoSil 200-3-C30 TM , Fa. Bischoff) mit einer mobilen Phase von 100% Methanol getrennt und anhand von Standards (Fa. Merck) identifiziert. Als Detektionssystem diente die Fluoreszenz der Substanzen (Anregung 295 nm, Emission 320 nm), die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszenzdetektors FP 920 nachgewiesen wurde.
Sowohl in transgenem Pflanzenmaterial mit aktiver SAT oder inaktiver SATH304A konnte unabhängig davon, ob eine konstitutive oder samenspezifische Expression durchgeführt wurde, eine Erhöhung des Vitamin E Gehalts im Vergleich zum Wildtyp festgestellt werden.
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigten eindeutig, dass die Arabidopsis thaliana SAT-Mutante mit einem Aminosäureaustausch in Position 309 keine enzymatische SAT-Aktivität mehr aufweist, dennoch aber zur Komplexbildung, also zur Inter- aktion mit OAS-TL in der Lage ist. Die Expression dieser Mutante führte ebenso wie die Expression einer aktiven SAT zu einer überraschenden Erhöhung des Gehalts an Vitamin E.
Abbildungen
Abbildung 1 zeigt typische Vitamin E Biosynthesewege.
Abbildung 2 zeigt ein Aminosäure-Alignment verschiedener Sermacetyltransferasen.
Abbildung 3 zeigt eine Vektorkarte des pSUN2 mit dem rbcs-SATH309A-Konstrukt.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder
Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität von Serin- Acetyl- Transferase (SAT) in den Pflanzen gegenüber dem Wildtyp verändert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der SAT-Gehalt durch Übertragung einer Nukleinsäure, die für eine SAT oder einen funktionell äquivalenten Teil davon kodiert, auf die Pflanze bzw. Pflanzenzelle erhöht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine feedback-regulierte und/oder feedback-unabhängige SAT handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine SAT aus Mikroorganismen, bevorzugt aus E. coli, Corynebacterium glutamicum, aus Pilzen, bevorzugt aus Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Asper gillus nidulans, Neurospora crassa, oder aus Pflanzen, bevorzugt aus Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Allium tuberosum, Brassica oleracea oder Hybriden wie Glycine max, Zea mays, Triticum aestivum handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die SATs mit den Genbank Accession Numbers (in Klammem: Genannotationen der Arabidopsis Genomsequenzierung) L422l2(Atlg55920), AF112303(At2gl7640), X82888(At3gl3110), U30298(At5g56760), At4g35640, AJ414051, AJ414052, AJ414053 oder um SATs mit Sequenzen, die zu den Sequenzen der genannten Accession numbers im Wesentlichen homolog sind, handelt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um nicht-funktionelle SATs handelt, die Punktmutation(en), Deletionen und/oder Insertionen aufweisen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine nicht-funktionelle SAT handelt, die Punktmutationen, Deletionen und/oder Insertionen aufweist, die die Bindung an physiologische Bindungspartner, bevorzugt an Acetyl-Coenzym A und/oder OAS- TL verhindern.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine nicht-funktionelle SAT handelt, die aufgrund einer Mutation innerhalb des Aminosäuresequenzmotivs G K X X G D R H P K I G D (X steht für eine beliebige Aminosäure) enzymatisch inaktiv ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation das Kernmotiv D R H betrifft.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation das Histidin innerhalb des Motivs betrifft.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors umfassend die folgenden Nukleinsäuresequenzen in 5'-3'- Orientierung: - eine in Pflanzen funktionelle Promotorsequenz
- operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die für eine SAT oder funktionell äquivalente Teile davon kodiert
- eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz b) Übertragung des Vektors aus Schritt a) auf eine Pflanzenzelle und gegebenenfalls Integration in das pflanzliche Genom.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor zusätzlich über Nukleinsäuresequenzen verfügt, die eine kompartimentspezifische Expression der SAT in der transgenen Pflanze und/oder Pflanzenzelle, bevorzugt in Mitochondrien, Piastiden, Chloro- plasten und/oder im Cytosol bewirken.
13. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität der endogenen SATs im Vergleich zum Wildtyp geändert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13 , dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität der endogenen SATs durch Beeinflussung der Transkription und/oder Translation erhöht wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13 , dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität der endogenen SATs durch Regulation der posttranslationalen Modifikationen erhöht wird.
16. Verfahren nach Anspruch 13 , dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität der endogenen SATs durch gene silencing erniedrigt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das gene silencing durch ein antisense-Verfahren, durch PTGS, durch VIGS, durch RNAi oder durch homologe Rekombination erfolgt.
18. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität der SAT durch Expression von Antikörpern, die für SAT spezifisch sind, in der Pflanzenzelle verringert wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus nach dem Kultivieren geerntet wird und Vitamin E anschließend aus dem Organismus isoliert wird.
20. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Thiol-Verbindungen in den Pflanzen gegenüber dem Wildtyp verändert wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Glutathion, S-Adenosylmethionin, Methionin und Cystein in den Pflanzen gegenüber dem Wildtyp verändert wird.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 durchgeführt wird.
23. Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die für SAT oder funktionell äquivalente Teile davon kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit einem erhöhten Gehalt an Vitamin E.
24. Verwendung von Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren für eine funktionelle oder nicht funktionelle, feedback-regulierte oder feedback-unabhängige SAT oder funktionell äquivalente Teile davon kodieren.
25. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche
23 oder 24 in einem der Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 19.
26. Transgene Pflanze und/oder Pflanzenzelle mit erhöhtem Vitamin E Gehalt, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 erhältlich ist.
27. Transgene Pflanze und/oder Pflanzenzelle nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine monokotyledone oder dikotyledone Pflanze handelt.
28. Transgene Pflanze und/oder Pflanzenzelle nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Pflanze um Baumwolle, Leguminosen, Soja, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Tabak, Sisal und Getreide, bevorzugt um Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse handelt.
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