ES2260926T3 - Medios y metodo para potenciar el contenido de compuestos de azufre en plantas. - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar el contenido de compuestos que contienen azufre en plantas transgénicas, células o tejido de plantas transgénicas, que consiste en la introducción de una molécula de un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de serina acetiltransferasa (SAT) en una planta transgénica, célula o tejido de la planta transgénica, donde dicha molécula de un ácido nucleico está unida operablemente a elementos reguladores que permiten la expresión de la molécula del ácido nucleico en las células de la planta, donde dicha planta, dicha célula de la planta o dicho tejido de la planta no expresan una molécula de un ácido nucleico introducida exógenamente que codifica una proteína que tiene actividad de O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL).

Description

Medios y método para potenciar el contenido de compuestos de azufre en plantas.

La presente invención se relaciona con un método para aumentar el contenido de compuestos que contienen azufre en plantas transgénicas, células o tejido de plantas transgénicas que consiste en la introducción de una molécula de un ácido nucleico que codifica una proteína con actividad de serina acetiltransferasa (SAT) en una planta, una célula de una planta o un tejido de una planta, donde dicha molécula de un ácido nucleico está unida operablemente a elementos reguladores que permiten la expresión del ácido nucleico en las células de la planta, donde dicha planta, dicha célula de la planta o dicho tejido de la planta no expresan una molécula de un ácido nucleico exógenamente introducida que codifica una proteína que tiene actividad de O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL). También se describe una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de serina acetiltransferasa (SAT) donde dicha(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) está(n) unida(s) operablemente a elementos reguladores que permiten la expresión de la(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) en las células de las plantas. La presente invención también describe vectores que comprenden dichas moléculas de ADN recombinante así como las células de las plantas, los tejidos de las plantas y las plantas transformados con ellos. La presente invención describe más a fondo el uso de las moléculas y los vectores de ADN recombinante antes mencionados en el cultivo de células y tejidos de plantas, el mejoramiento de plantas y/o la agricultura. Además, la presente invención incluye la producción de alimentos, piensos y sus aditivos que comprendan las células o el tejido de las plantas y las plantas descritos anteriormente.

Las plantas superiores usan el sulfato inorgánico del suelo como la principal fuente de azufre para sintetizar los aminoácidos cisteína y metionina que contienen azufre. Se postuló que la biosíntesis de cisteína en las plantas desempeña un papel esencial en el ciclo del azufre en la naturaleza. El azufre reducido en forma de cisteína es necesario en las plantas para muchas funciones diferentes (Rennenberg, 1990; Schmidt, 1992). Es esencial para el metabolismo de las plantas normales debido a que conecta el metabolismo de la serina y la metionina al transportar el azufre reducido necesario para la biosíntesis de metionina (Giovanelli, 1990; Ravanel, 1997; Brunold y Rennenberg, 1997). Además, la cisteína sirve como sustrato para otras moléculas que contienen azufre como ciertos cofactores, compuestos de membrana, y como un aminoácido esencial para la síntesis proteica (Giovanelli, 1980; Schmidt, 1992). La cisteína también es esencial como un precursor para la producción del glutatión (GSH) y otros metabolitos relacionados con el estrés. La demanda de cisteína varía durante el desarrollo de la planta y también depende de los cambios en el medio ambiente, incluidos la disponibilidad de luz, de sulfato y algunos tipos de estrés, abiótico o biótico (von Arb y Brunold 1986; Nussbaum, 1988; Delhaize, 1989; Rauser, 1991; Ghisi, 1993; Hell, 1994).

Para la biosíntesis de cisteína, primero se debe activar la L-serina mediante transferencia de un grupo acetilo de la acetil coenzima A para formar el producto intermedio O-acetil-L-serina (OAS). Esta importante reacción es catalizada por la serina acetiltransferasa (SAT). La activación de la serina, una reacción clave en la vía biosintética de la cisteína, se investigó a nivel molecular sólo en procariotas (Breton, 1990; Monroe, 1990; Evans, 1991; Lai y Baumann, 1992). La síntesis de cisteína en las plantas se realiza por sulfhidrilación de la O-acetil-L-serina en presencia de sulfuro libre u enlazado, catalizada por O-acetilserina(tiol)liasa (OAS-TL, cisteína sintasa, CSase; EC 4.2.99.8.) (Schmidt y Jäger, 1990). Esta reacción fue exhaustivamente analizada (Saito, 1992, 1993 y 1994; Rolland, 1993 y 1996; Youssefian, 1993; Noji, 1994; Hell, 1994; Kuske, 1994 y 1996; Takahashi y Saito, 1996).

En las bacterias SAT y OAS-TL forman un complejo bifuncional denominado cisteína sintasa. En este complejo sólo una pequeña proporción de la O-acetilserina(tiol)liasa (5%) se asocia con toda la actividad de SAT (Kredich, 1969). Además, estudios sobre la regulación de la biosíntesis de cisteína en las bacterias revelaron que la serina acetiltransferasa es sensible a la retroinhibición por L-cisteína y que la O-acetilserina (o N-acetilserina) participa en la activación de la transcripción de varios de los promotores del operón cys (Ostrowski y Kredich, 1989; Kredich, 1993). Recientemente se clonaron ADNc de plantas que codifican serina acetiltransferasas a partir de diferentes especies (Bogdanova, 1995; Murillo, 1995; Ruffet, 1995; Saito, 1995; Roberts y Wray, 1996). En las plantas, SAT también existe en un complejo con OAS-TL, lo que sugiere una canalización metabólica eficiente de serina a cisteína mediante la prevención de la difusión del producto intermedio O-acetil-L-serina (Nakamura, 1988; Nakamura y Tamura, 1990; Ruffet, 1994; Bogdanova y Hell, 1997; Hesse, 1997). Se informó que tanto SAT como OAS-TL fueron localizadas en plástidos, mitocondria y citosol de varias plantas, lo que sugiere que la capacidad para sintetizar cisteína parece ser necesaria en todos los compartimientos celulares con capacidad biosintética de una proteína endógena (Smith y Thompson, 1969; Smith, 1972; Brunold y Suter, 1982; Lunn, 1990; Rolland, 1992; Ruffet, 1994). En Pisum sativum, por ejemplo, existen tres isoformas diferentes de SAT y cada isoforma parece ser específica para un compartimiento intracelular determinado (Ruffet, 1995). Además de estas ubicaciones celulares necesarias, el hecho de que la biosíntesis de cisteína esté en interacción compleja con la captación y reducción de sulfato, el cual es a su vez regulado por fotosíntesis y asimilación de nitrato (Anderson, 1990; Brunold, 1993), permite sugerir un papel importante de la biosíntesis de cisteína en el metabolismo del azufre en las plantas superiores.

Una característica muy importante de las secuencias de reacción de formación de cisteína es el hecho de que la actividad de SAT es mucho menor en comparación con la actividad de OAS-TL. En las semillas y almácigos, la OAS-TL es 10 a 20 veces más activa que SAT (Smith, 1971; Ngo y Shargool, 1974). En las hojas enteras la relación de actividad de ambas enzimas es de 100 a 300 veces (Nakamura, 1987), mientras que en los cloroplastos solos la relación es hasta de 345 veces (Ruffet, 1994). Como se demostró en Allium y espinaca, SAT es en comparación con OAS-TL una enzima poco abundante (Nakamura y Tamura, 1990; Ruffet, 1994). Además, también se discutió que la disponibilidad de OAS era limitante de la tasa de síntesis de cisteína (Neuenschwander, 1991; Ghisi, 1990; Rennenberg 1983; Brunold, 1993; Saito, 1994). La actividad de SAT se regula significativamente por retroinhibición de la cisteína en sandía (Saito, 1995). La regulación de SAT también tiene lugar a nivel de la expresión génica. En Arabidopsis thaliana en respuesta al estrés relacionado con la luz y el azufre se acumula el ARNm de SAT en aproximadamente dos veces (Bogdanova, 1995). Sin embargo, en tanto que la función y el papel de SAT, OAS y OAS-TL en la cascada de reacciones de la biosíntesis de cisteína han sido sometidos a numerosas investigaciones, los intentos previos de alterar la tasa de síntesis de cisteína han fracasado (Saito, 1994). En consecuencia, la regulación precisa de la vía biosintética de la cisteína todavía no se comprende plenamente y es parte de una discusión controvertida. Por lo tanto, hasta ahora no se ha dispuesto de los medios para el control del contenido de azufre en las plantas, que puede tener aplicaciones en varios aspectos de la agricultura.

De este modo, el problema técnico subyacente en la presente invención fue satisfacer la necesidad de contar con métodos para modular el contenido de compuestos de azufre en las plantas.

La solución a este problema técnico se logra proporcionando las materializaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La invención también divulga una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de serina acetiltransferasa (SAT) donde dicha molécula de ácido nucleico está unida operablemente a elementos reguladores que permiten la expresión de la(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) en las células de las plantas.

La expresión "proteína que tiene actividad de serina acetiltransferasa (SAT)", como se usa aquí, significa que dicha proteína puede transferir un grupo acetilo de la acetil coenzima A a la L-serina para formar el producto intermedio de la vía biosintética de la cisteína, la O-acetil-L-serina.

La expresión "proteína que tiene actividad de cisteína-\gamma-sintasa (C\gammaS)" se refiere a una proteína capaz de catalizar la formación de L-cistationina o L-homocisteína dependiendo del sustrato que contiene azufre, L-cisteína o sulfuro. Esta proteína también se conoce como cistationina-\gamma-sintasa. Los términos "cisteína-\gamma-sintasa" y "cistationina-\gamma-sintasa" se usan aquí indistintamente. En las plantas, C\gammaS cataliza generalmente la primera reacción específica de la biosíntesis de metionina, concretamente el reemplazo gama del sustituyente fosforilo de la O-fosfohomoserina por cisteína. Por lo tanto, la cisteína es un precursor principal de la biosíntesis de metionina en las plantas.

De conformidad con la presente invención, la secuencia de codificación del gen cysE de Escherichia coli (Denk y Böck, 1987), que codifica una enzima de la vía biosintética de la cisteína, a saber serina acetiltransferasa (SAT, EC 2.3.1.30), se introdujo en el genoma de plantas de papa bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Para dirigir la proteína al interior del cloroplasto se fusionó traduccionalmente cysE a la secuencia señal 5' de la subunidad pequeña de rubisco; vea el Ejemplo 1. Las plantas transformadas con éxito presentaron una elevada acumulación de ARNm de cysE. Además, los extractos de hojas crudos de estas plantas tuvieron una actividad de SAT significativamente alta, hasta 20 veces mayor en comparación con la de las plantas silvestres. Las plantas de papa transgénica que sobreexpresan el gen de E. coli presentaron niveles elevados de cisteína y glutatión (GSH), que fueron de dos a tres veces mayores que en las plantas de control; vea el Ejemplo 2. Sin embargo, sorprendentemente el aumento de la actividad de la enzima SAT y del sustrato para la biosíntesis de cisteína O-acetil-L-serina (OAS) no tuvo ningún efecto sobre la expresión y la actividad de O-acetilserina(tiol)liasa (OAS-TL), la enzima que convierte la OAS, el producto de SAT, en cisteína; vea los Ejemplos 3 y 4. Tanto la expresión de este gen a nivel del ARN como la actividad de la enzima permanecieron inalteradas en comparación con las de las plantas silvestres.

De estos experimentos, se extrajeron las siguientes conclusiones; por una parte la SAT bacteriana de E coli expresada en las plantas de papa transgénica se acumuló en los cloroplastos como una proteína catalíticamente funcional. Por otra parte los contenidos celulares de cisteína y glutatión aumentaron significativamente en las hojas de las plantas transgénicas. Los niveles de cisteína en un transformante (SAT-48) fueron casi tres veces mayores y en otro transformante (SAT-26) dos veces mayores que las cantidades encontradas en las plantas de control sin transformar, lo que indica que la expresión de cysE es responsable de la estimulación de la síntesis de cisteína. Los experimentos realizados de conformidad con la presente invención también revelaron que ambos transformantes tenían niveles de glutatión significativamente elevados, que fueron hasta dos veces mayores que en las plantas silvestres. Estos resultados inesperados demostraron que en condiciones normales sin ningún estrés por azufre, el nivel endógeno de SAT es un paso limitante en la vía biosintética de cisteína, al menos en el cloroplasto, adonde se dirige la SAT de E. coli. Esto significa que en condiciones habituales el nivel de OAS-TL es suficiente para convertir toda la OAS producida en la célula y por lo tanto no es limitante de un flujo normal de biosíntesis de cisteína. De hecho, que una sobreexpresión de la SAT en las plantas de papa transgénica pueda aumentar más el contenido de cisteína y glutatión implica que los pasos en la vía de asimilación del sulfato antes de la incorporación de sulfuro en la cisteína, es decir la captación de sulfato, la activación de sulfato y la reducción de 5'-fosfosulfato de adenosina (APS), están en condiciones normales y que tampoco son limitantes de la biosíntesis de cisteína. Las plantas parecen poseer bastante capacidad y actividades de captación de sulfato como para convertir el sulfato en sulfuro a fin de asegurar cantidades suficientes de azufre reducido, necesario para la producción de cisteína. Finalmente vale la pena mencionar, que los resultados presentados de conformidad con la presente invención muestran directamente la conexión entre la cisteína libre y el glutatión. Los mayores niveles de cisteína en las plantas de papa transgénica estimulan la biosíntesis del glutatión, conduciendo a niveles del tripéptido, que son hasta dos veces mayores en comparación con los de las plantas silvestres. Esto sugiere, que la biosíntesis de glutatión en las hojas de papa está limitada por la disponibilidad de cisteína. Experimentos recientemente realizados con álamo confirman estos resultados (Strohm, 1995; Noctor, 1996).

Según se ha divulgado en los experimentos realizados de conformidad con la presente invención, las plantas poseen bastante capacidad y actividades de captación de sulfato como para convertir el sulfato en sulfuro a fin de asegurar cantidades suficientes de azufre reducido, necesario para la biosíntesis de compuestos que contienen azufre. Por lo tanto, basándose en los hallazgos de la presente invención, se puede esperar que introduciendo cisteína-\gamma-sintasa, la primera enzima específica de la vía biosintética de la metionina en las plantas transgénicas, se pueda aumentar significativamente el contenido de metionina en las plantas en comparación con el de las plantas silvestres. En este sentido, se observa que un aumento de al menos 10% del contenido de compuestos que contienen azufre en las plantas ya le confiere efectos ventajosos, por ejemplo mayor tolerancia al estrés abiótico. Preferentemente el contenido de estos compuestos aumenta en al menos aproximadamente 50%, muy preferentemente en 100% y se prefiere particularmente que el aumento del contenido de compuestos que contienen azufre sea de más de 1 vez, preferentemente de 2 veces. Locke, Keystone Meeting 6.-11.4.1997, Abstract 306 (1997) informó del aumento de metionina en 3 a 5 veces cuando se expresa C\gammaS en las plantas. Dado que la introducción de SAT da como resultado un aumento del sustrato de C\gammaS se espera que al introducir la C\gammaS en las plantas de la invención que expresan SAT o viceversa el aumento del contenido de compuestos que contienen azufre aumente adicionalmente en aproximadamente 1 a 10 veces más, preferentemente en 5 a 10 veces más.

En una materialización preferida de la invención, dicha proteína que tiene actividad de SAT es una serina acetiltransferasa derivada de procariotas o arquebacterias. Los organismos procariotas pueden incluir bacterias gramnegativas así como grampositivas, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens, Bacillus subtilis y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también se pueden emplear otros. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas que tienen actividad de SAT se pueden obtener a partir de la tecnología anterior (p. ej., Bogdanova, FEBS Lett. 358 (1995), 43-47; Denk, J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 515-525; Evans, J. Bacteriol. 173 (1991), 5.457-5.469).

Por otra parte, en el método de acuerdo con la invención las moléculas de ácidos nucleicos se pueden usar hibridándolas a las moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente y que codifican una proteína que tiene actividad de SAT. Dichas moléculas de ácidos nucleicos se pueden aislar p. ej. de bibliotecas, como bibliotecas de ADNc o genotecas mediante técnicas bien conocidas por los técnicos en la materia. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico hibridantes se pueden identificar y aislar utilizando las moléculas de ácidos nucleicos descritas antes conocidas en el ambiente o fragmentos o complementos de éstas como sondas para cribar genotecas mediante la hibridación con dichas moléculas según técnicas corrientes. También es posible el aislamiento de dichas moléculas de ácidos nucleicos aplicando la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) usando como cebadores oligonucleótidos derivados de las moléculas de ácidos nucleicos descritas antes. Las moléculas de ácidos nucleicos que se hibridan con cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos mencionadas precedentemente también incluyen fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácidos nucleicos descritas antes que codifican una proteína que tiene actividad de SAT o los fragmentos biológicamente activos de éstas. Se entiende que los fragmentos son partes de moléculas de ácidos nucleicos suficientemente largos como para codificar la proteína descrita o un fragmento de ésta que tenga actividad biológica según se definió antes.

El término "derivado" significa en este contexto que la secuencia de nucleótidos de estas moléculas de ácidos nucleicos difiere de las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos descritas antes en una o más posiciones de los nucleótidos y que tienen una gran homología con dichas moléculas de ácidos nucleicos. Se entiende que homología hace referencia a una identidad de secuencia de al menos 40%, particularmente una identidad de al menos 60%, preferentemente más del 80% y aún más preferentemente más del 90%. Las desviaciones con respecto a las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos descritas antes pueden, por ejemplo, ser el resultado de una o más sustituciones, supresiones, agregados, inserciones y/o recombinaciones de nucleótidos ya sea solas o en combinación, que pueden ocurrir naturalmente o producirse a través de las técnicas de ADN recombinante bien conocidas por los técnicos en la materia; consulte por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Homología significa además que las moléculas de ácidos nucleicos o proteínas codificadas respectivas son funcional y/o estructuralmente equivalentes. Las moléculas de ácidos nucleicos que son homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos descritas antes y que son derivadas de dichas moléculas de ácidos nucleicos son, por ejemplo, variaciones de dichas moléculas de ácidos nucleicos que representan modificaciones que tienen la misma función biológica, en particular que codifican las proteínas con la misma o sustancialmente la misma actividad biológica según se definió aquí. Puede haber variaciones de origen natural, como secuencias que codifican la proteína SAT de otros procariotas y plantas o mutaciones. Estas mutaciones pueden ocurrir naturalmente o pueden obtenerse mediante técnicas de mutagénesis, consulte más arriba. Las variaciones alélicas pueden ser variantes alélicas de origen natural así como variantes producidas sintéticamente o modificadas genéticamente; consulte más arriba. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las SAT de plantas comparten semejanzas significativas con las serina acetiltransferasas bacterianas (Vuorio, 1994; Bogdanova y Hell, 1997). La región más conservada dentro de todas las SAT, tanto las de plantas como las de bacterias, se ubica en el C terminal y se ha sugerido que le confiere actividad de transferasa (Vaara, 1992; Vuorio, 1994). En esta región conservada está presente un motivo hexapéptido que se ha propuesto como un dominio catalítico en las acetiltransferasas bacterianas y que recientemente se ha demostrado que también está presente en la región de contacto de OAS-TL/SAT en el complejo de la cisteína sintasa de Arabidopsis thaliana (Bogdanova y Hell, 1997). Además, las moléculas de ácidos nucleicos se pueden emplear de conformidad con la presente invención que codifica homólogos o análogos de las proteínas descritas anteriormente que tienen actividad de SAT pero donde por lo demás no están relacionadas con esas proteínas. Por ejemplo, malY de E. coli codifica una enzima que participa en la captación y metabolismo de la maltosa y las maltodextrinas del sistema de maltosa de la E. coli pero tiene además actividad enzimática de cistationina-\beta-liasa; consulte Zdych, J. Bacteriol. 177 (1995), 5.035-5.039. Sin embargo, dichas proteínas no son homólogas entre sí sobre la base del análisis de homología de la secuencia de aminoácidos. Dichas proteínas que no presenta homologías significativas con las proteínas SAT comunes pueden ser identificadas por un técnico con experiencia en la materia usando las técnicas bien conocidas en el ambiente, por ejemplo, mediante complementación de los genes mutantes que participan en la vía biosintética de la cisteína o la metionina, por ejemplo, en las cepas de E. coli mutantes correspondientes; consulte también Zdych, más arriba.

Las proteínas codificadas por los diversos derivados, variantes, homólogos o análogos de las moléculas de ácidos nucleicos descritas antes pueden compartir características específicas comunes, como el peso molecular, la reactividad inmunológica, la conformación, etc., así como propiedades físicas, como la movilidad electroforética, el comportamiento cromatográfico, los coeficientes de sedimentación, el pH óptimo, la temperatura óptima, la estabilidad, la solubilidad, las propiedades espectroscópicas, etc. Todas estas moléculas de ácidos nucleicos y derivados se pueden emplear de conformidad con la presente invención en tanto la actividad enzimática de la proteína codificada permanezca sustancialmente inalterada en la clase, concretamente que la proteína tenga actividad de SAT según se definió antes.

En una materialización preferida del método de la invención, la molécula de ácido nucleico está unida operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito capaz de dirigir la(s) proteína(s) a un compartimiento celular deseado. La molécula de ácido nucleico se puede modificar de modo que la proteína codificada se ubique en cualquier compartimiento deseado de la célula de la planta. Estos incluyen el retículo endoplasmático (KDEL, Schouten, Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-793), la vacuola (Neuhaus, PNAS 88 (1991), 10.362-10.366), la mitocondria (Chaumont, Plant Mol. Biol. 24 (1994), 631-641), los plástidos (Fuhr, EMBO J. 5 (1986), 2.063-2.071), el apoplasto (von Schaewen, EMBO J. 9 (1990), 3.033-3.044), el citoplasma, etc. Los métodos para llevar a cabo estas modificaciones y las secuencias señal que aseguran la ubicación en un compartimiento deseado son bien conocidos por los técnicos con experiencia en la materia. Preferentemente, dicho compartimiento celular es un plástido. Según se describe en los ejemplos adjuntos, la proteína que tiene actividad de SAT se dirigió al interior del cloroplasto mediante la fusión traduccional a la secuencia señal 5' de la subunidad pequeña de rubisco.

La molécula de ácido nucleico utilizada en el método de la invención está unida operablemente a las secuencias reguladoras que permiten la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos en las células de las plantas. Preferentemente, dichos elementos reguladores comprenden un promotor activo en las células de las plantas. La expresión comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en las células de las plantas son bien conocidos por los técnicos con experiencia en la materia.

Estos elementos reguladores pueden ser heterólogos u homólogos con respecto a la molécula de ácido nucleico que se va a expresar así como con respecto a la especie de la planta que se va a transformar. En general, tales elementos reguladores comprenden un promotor activo en las células de las plantas. Para obtener expresión en todos los tejidos de una planta transgénica, se usan preferentemente promotores constitutivos, como el promotor 35S de CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810-812) o promotores de los genes de poliubiquitina del maíz (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675-689). Para lograr expresión en tejidos específicos de una planta transgénica es posible usar promotores específicos de los tejidos (consulte, p. ej., Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2.245-2.251). Se conocen también promotores que son específicamente activos en los tubérculos de las papas o en las semillas de diferentes especies de plantas, como maíz, Vicia, trigo, cebada etc. Se pueden usar promotores inducibles para poder controlar exactamente la expresión. Un ejemplo de promotores inducibles son los promotores de los genes que codifican proteínas de choque térmico. También se han descrito elementos reguladores específicos de microsporas y sus usos (WO96/16182). Además, se puede emplear el sistema de prueba químicamente inducible (Gatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991); 229-237). Los técnicos con experiencia en la materia conocen otros promotores adecuados que se describen, por ejemplo, en Ward (Plant Mol. Biol. 22 (1993), 361-366). Los elementos reguladores pueden comprender además potenciadores de la transcripción y/o la traducción funcionales en las células de las plantas. Potenciadores traduccionales de planta que se usan a menudo son, por ejemplo, las secuencias omega de CaMV y/o la inclusión de un intrón (Intrón-1 del gen de Shrunken del maíz, por ejemplo) que se ha demostrado que aumenta los niveles de expresión hasta en 100 veces. (Maiti, Transgenic Research 6 (1997), 143-156; Ni, Plant Journal 7 (1995), 661-676). Además, los elementos reguladores pueden incluir señales de terminación de la transcripción, como una señal de poliadenilación, que lleva al agregado de una cola poli-A al transcrito que puede mejorar su estabilidad. Las señales de terminación que se emplean generalmente provienen del gen de la nopalina sintasa o del ARN del promotor 35S de CaMV.

En una materialización preferida del método de la invención, dicho promotor es inducible o es expresado constitutivamente y/o es un promotor específico de una célula, un tejido o un órgano. Preferentemente, dicho promotor es específico del tubérculo, específico de la semilla, específico del endosperma, específico del embrión o específico del floema. Los ejemplos de dichos promotores incluyen pero no exclusivamente al promotor B33 de patatin (específico del tubérculo, Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23), el promotor de la faseolina (específico de la semilla, Karchi, Plant J, 3 (1993), 721-727), el promotor de la glutenina HMW (específico del endosperma, Helford, Theor. Appl. Genet 75 (1987), 117-126), el promotor de la \alpha,\beta-conglicina (específico del embrión, Fujiwara, Plant Cell Reports 9 (1991), 602-606), el promotor de rolC (específico del floema, Lerchl, Plant Cell 7 (1995), 259-270).

La presente invención también describe vectores, particularmente plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores que se utilizan convencionalmente en manipulación genética que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de SAT. Se pueden usar métodos que son bien conocidos por los técnicos con experiencia en la materia para construir diversos plásmidos y vectores; consulte por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternativamente, las moléculas y vectores de ADN recombinante de la invención pueden reconstituirse en los liposomas para ser entregados a las células deseadas.

De manera ventajosa los vectores descritos anteriormente comprenden un marcador seleccionable y/o evaluable. Los marcadores genéticos seleccionables útiles para la selección de las células de las plantas, el callo, el tejido de las plantas y las plantas transformadas son bien conocidos por los técnicos con experiencia en la materia y comprenden, por ejemplo, resistencia al antimetabolito como base para la selección de dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, que confiere resistencia a los aminoglicósidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se han descrito otros genes seleccionables, concretamente trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptofano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8.047); la isomerasa de manosa-6-fosfato que permite que las células utilicen manosa (WO 94/20627) y ODC (ornitina-descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina-descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus terreus que confiere resistencia a Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2.336-2.338). Los marcadores evaluables útiles también son conocidos por los técnicos con experiencia en la materia y se encuentran a la venta. De manera ventajosa, dicho marcador es un gen que codifica luciferasa (Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o \beta-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3.901-3.907). Esta materialización es particularmente útil para el cribado simple y rápido de las células, los tejidos y los organismos que contienen un vector de la invención.

El método de la invención es útil en particular para la manipulación genética de las células de las plantas, el tejido de las plantas y las plantas para aumentar su contenido de compuestos que contienen azufre y para obtener plantas con fenotipos modificados, preferentemente con fenotipos mejorados o útiles. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas transgénicas, células o tejido de plantas transgénicas que consiste en la introducción de una molécula de un ácido nucleico que codifica una proteína con actividad de SAT que está unida operablemente a elementos reguladores que permiten la expresión en las células de las plantas en el genoma de dichas plantas, dichas células de las plantas o dicho tejido de las plantas.

Los métodos para la introducción de ADN extraño en las plantas también son bien conocidos por los técnicos en la materia. Estos incluyen, por ejemplo, transformación de las células de las plantas, el tejido de las plantas o las plantas con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes, fusión de los protoplastos, transferencia directa de genes (consulte, p. ej., EP-A 164 575), inyección, electroporación, métodos biolísticos como bombardeo de partículas y otros métodos conocidos por los técnicos en la materia. Los vectores usados en el método de la invención pueden contener otros elementos funcionales, por ejemplo secuencias de ADN-T del "borde izquierdo" y del "borde derecho" de Agrobacterium que permiten la integración estable en el genoma de la planta. Además, los técnicos con experiencia en la materia conocen métodos y vectores que permiten la generación de plantas transgénicas exentas de marcador, es decir el gen marcador seleccionable o evaluable se pierde en una cierta etapa del desarrollo de la planta o del mejoramiento de la planta. Esto se puede lograr mediante, por ejemplo, cotransformación (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 151-161; Peng, Plant Mol. Biol. 27 (1995), 91-104) y/o mediante el uso de sistemas que utilizan enzimas capaces de promover la recombinación homóloga en plantas (consulte, p. ej., WO97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353-361); Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 653-657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170-176; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19 (1991), 6373-6378). Métodos para la preparación de vectores apropiados son descritos por, p. ej., en Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2da Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Cepas de Agrobacterium tumefaciens y vectores adecuados así como transformación de Agrobacterias y medios de cultivo y de selección apropiados son bien conocidos por los técnicos con experiencia en la materia y se describen en la tecnología anterior (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383-396; C58C1 (pGV 3850kan), Deblaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic, Acid Res. 12 (1984), 8.711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8.467-8.471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 963-976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies, In: Plant Molecular Biology Manual Vol 2, Gelvin y Schilperoort (Eds.), Dordrecht, Países Bajos: Kluwer Academic Publ. (1994), 1-22; EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V, Fraley, Crit, Rev. Plant. Sci., 4, 1-46; An, EMBO J. 4 (1985), 277-287). Aunque en el método de la invención se prefiere el uso de Agrobacterium tumefaciens, se pueden usar otras cepas de
Agrobacterium, como Agrobacterium rhizogenes, por ejemplo, si se desea un fenotipo conferido por dicha cepa.

Los métodos para la transformación utilizando métodos biolísticos son bien conocidos por los técnicos en la materia; consulte, p. ej., Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993), 1.553-1.558 y Christou (1996) Trends in Plant Science 1, 423-431. La microinyección se puede realizar según se describe en Potrykus y Spangenberg (eds.), Gene Transfer To Plants. Springer Verlag, Berlín, NY (1995).

La transformación de la mayoría de las plantas dicotiledóneas es posible con los métodos descritos anteriormente.

Pero también para la transformación de plantas monocotiledóneas se han desarrollado varias técnicas de transformación exitosas.

Estas incluyen la transformación usando métodos biolísticos como, p. ej, los descritos anteriormente así como transformación del protoplasto, electroporación de células parcialmente permeabilizadas, introducción de ADN usando fibras de vidrio, etc.

En general, las plantas, las células y el tejido de las plantas que pueden modificarse con una molécula o vector de ADN recombinante de acuerdo con la invención y que presentan (sobre)expresión de una proteína que tiene actividad de SAT y opcionalmente de C\gammaS, respectivamente, se pueden derivar de cualquier especie de planta deseada. Pueden ser plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, preferentemente pertenecen a especies de plantas de interés en la agricultura, el cultivo de la madera o la horticultura, como las plantas cultivadas (por ejemplo, maíz, arroz, cebada, trigo, centeno, avenas. etc.), papas, plantas que producen aceite (p. ej., colza oleaginosa, girasol, maní, soja, etc.), algodón, remolacha azucarera, caña de azúcar, plantas leguminosas (p. ej., frijoles, guisantes etc.), plantas que producen madera, preferentemente árboles, etc.

La presente invención también describe células de plantas transgénicas que contienen establemente integrada en el genoma una molécula de un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de SAT unida a elementos reguladores que permiten la expresión de la molécula del ácido nucleico en las células de las plantas y donde la molécula del ácido nucleico es extraña a la célula de la planta transgénica.

Por "extraña" se quiere dar a entender que la molécula del ácido nucleico es o bien heteróloga con respecto a la célula de la planta, esto significa derivada de una célula o un organismo con antecedentes genómicos diferentes, o bien es homóloga con respecto a la célula de la planta pero está ubicada en un entorno genómico diferente del homólogo de origen natural de dicha molécula de ácido nucleico. Esto significa que, si la molécula de ácido nucleico es homóloga con respecto a la célula de la planta, no está ubicada en su ubicación natural en el genoma de dicha célula de la planta, en particular está rodeada por genes diferentes. En este caso la molécula de ácido nucleico puede estar o bien bajo el control de su propio promotor o bien bajo el control de un promotor heterólogo.

La presencia y expresión de la molécula del ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de SAT en las células de la planta transgénica lleva a la síntesis de proteína(s) que tiene(n) una influencia sobre, p. ej., la resistencia al estrés de las células de la planta y lleva a los cambios fisiológicos y fenotípicos correspondientes en las plantas que contienen dichas células. Según se describe en los ejemplos adjuntos, las plantas que expresan constitutivamente SAT de E. coli presentan altos niveles de cisteína. Además, el contenido del tripéptido glutatión (\gamma-glutamil-cisteinil glicina) fue considerablemente mayor que en las plantas silvestres, porque este compuesto es la principal forma de almacenamiento del azufre reducido del reino vegetal y sirve como vertedero principal de la cisteína producida. El glutatión desempeña no sólo un papel esencial en la regulación de la nutrición azufrada, sino que también es un factor importante en la defensa de las plantas contra diversas formas de estrés, incluidas intensidades luminosas elevadas, sequía, frío, calor y deficiencia de minerales (Smith, 1990; Rennenberg y Brunold, 1994). El tripéptido se sintetiza en plantas así como en otros organismos en dos reacciones catalizadas por enzimas a partir de los aminoácidos constituyentes (Meister y Anderson, 1983; Rennenberg, 1995).

Según se trató precedentemente, la cisteína-\gamma-sintasa es capaz de usar cisteína como el sustrato que contiene azufre. Por consiguiente, puesto que se ha demostrado en el curso de la presente invención, que las plantas transgénicas que sobreexpresan una proteína que tiene actividad de SAT tienen un contenido considerablemente mayor de cisteína, se puede concebir que la coexpresión de una molécula de un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de C\gammaS debería asegurar un efecto sinérgico en la producción de metionina, ya que ambos la enzima clave de la vía biosintética de la metionina y su sustrato, son sobreproducidos en las plantas.

La célula de la planta transgénica descrita también puede comprender un marcador seleccionable. Como se describió anteriormente, se pueden emplear diversos marcadores seleccionables de conformidad con la presente invención. De manera ventajosa, se pueden usar marcadores seleccionables que sean adecuados para la selección directa de las plantas transformadas, por ejemplo, el gen de la fosfinotricin-N-acetiltransferasa el producto génico de la cual detoxifica el herbicida L-fosfinotricina (glufosinato o BASTA); consulte, por ejemplo, De Block, EMBO J. 6 (1987), 2.513-2.518 y Dröge, Planta 187 (1992), 142-151.

Además, la presente invención también describe plantas transgénicas y tejido de plantas transgénicas que comprenden las células de plantas transgénicas descritas antes. Estas pueden presentar, por ejemplo, una mejor resistencia al estrés. Preferentemente, el nivel de glutatión, cisteína y/o metionina en la planta transgénica de la invención es más mayor en comparación con el de una planta silvestre. Un aumento del nivel de glutatión, cisteína y/o metionina se entiende que hace referencia a un contenido elevado de cualquiera de los compuestos que contienen azufre mencionados precedentemente, ya sea solo o en combinación, en las células o el tejido de las plantas transgénicas o en las plantas transgénicas de la presente invención en el orden de al menos aproximadamente 10% en comparación con la célula o el tejido de la planta silvestre o la planta silvestre sin transformar, correspondientes, lo cual ya asegura efectos benéficos sobre la vitalidad de la planta como, p. ej., mejor tolerancia al estrés. De manera ventajosa, el contenido de los compuestos descritos anteriormente aumenta en al menos aproximadamente un 50%, preferentemente en más de aproximadamente un 75%, se prefiere particularmente que aumente al menos aproximadamente un 100% o más y se prefiere aún más que aumente más de aproximadamente un 200%. Considerando el contenido de cisteína, metionina y glutatión combinados se puede lograr incluso un aumento en 10 a 20 veces de los compuestos que contienen azufre en comparación con el nivel de cisteína libre en las plantas silvestres aunque se conciben aumentos mayores de compuestos que contienen azufre en las plantas de la presente invención.

De manera ventajosa, el nivel de cisteína libre en las plantas descritas es aproximadamente superior a 20 nmol por gramo de peso fresco (gpf) de tejido de hoja, preferentemente superior a 30 nmol/gpf y más preferentemente superior a 40 nmol/gpf, vea también el Ejemplo 2. Además, el contenido de glutatión en las plantas descritas puede ser preferentemente superior a 350 nmol/gpf, más preferentemente superior a 500 nmol/gpf. El contenido de metionina se puede aumentar en al menos aproximadamente 5 veces, preferentemente en más de 10 veces.

La invención también describe partes cosechables y material de propagación de las plantas transgénicas descritas los cuales contienen células de las plantas transgénicas descritas precedentemente y/o derivan de las plantas descritas precedentemente y presentan mayores niveles de compuestos que contienen azufre según se describió antes. Las partes cosechables pueden ser en principio cualquier parte útil de una planta, por ejemplo, hojas, tallos, fruto, semillas, raíces, etc. El material de propagación incluye, por ejemplo, semillas, frutos, gajos, almácigos, tubérculos, portainjertos, etc.

Además, la presente invención divulga el uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de SAT para la producción de plantas transgénicas que presenten un mayor nivel de glutatión, cisteína y/o metionina. Preferentemente, dicho mayor nivel de metionina o cisteína da lugar a procesos de maduración acelerados, flores alteradas y/o resistencia a patógenos.

La expresión constitutiva del gen cysE de SAT de E. coli en plantas de papa transgénica demuestra directamente in vivo, que la reacción catalizada por SAT es en verdad limitante de la tasa en la vía biosintética de la cisteína en plantas, como se ve por los altos niveles de cisteína en los transformantes; vea los ejemplos adjuntos. Además, según se trató antes, se espera que los correspondientes niveles altos de glutatión en las plantas transgénicas puedan conferir resistencia contra diversas formas de estrés. En las plantas el glutatión juega un papel importante en la defensa contra las especies de oxígeno activo, xenobióticos, metales pesados y otras formas de estrés incluidos sequía, calor y deficiencia de minerales (Alscher, 1989; Smith, 1990; Schmidt y Jäger, 1992; Rennenberg y Brunold, 1994; Rennenberg, 1995). El conocimiento acerca de esto también tiene importancia práctica. La mayor resistencia de las plantas contra las especies de oxígeno activo puede desempeñar un papel muy importante en el futuro, pensando en las concentraciones elevadas de ozono en la atmósfera. Además, es razonable una mayor tolerancia contra los xenobióticos, por ejemplo los herbicidas, como resultado de mayores niveles de glutatión en las plantas de la invención. Por otra parte, una posible estrategia es construir plantas transgénicas que sean capaces de crecer en concentraciones mayores de iones de metales pesados y que por consiguiente podrían usarse para biorremediación. Por otra parte, las moléculas y vectores de ADN recombinante descritos pueden ser útiles para alterar o modificar la interacción planta/patógeno. El término "patógeno" incluye, por ejemplo, bacterias, virus y hongos así como protozoarios.

Según se trató antes, las células o el tejido de plantas transgénicas y las plantas transgénicas descritas se pueden usar para mejorar los efectos tóxicos de los contaminantes del suelo incluida la economía de agua. Los contaminantes pueden ser de origen natural o ser causados por la minería, las actividades industriales y urbanas. Dichos contaminantes comprenden compuestos que pueden inactivar proteínas que contienen azufre, en particular las enzimas, o actuar como antagonistas o inhibidores de la vía biosintética de la cisteína y/o la metionina. Son ejemplos de dichos antagonistas o inhibidores los herbicidas, fungicidas, pesticidas o particularmente los iones metálicos, por ejemplo, Hg^{2+}. Por ejemplo, debido a los niveles elevados de GSH conferidos por la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína que tiene actividad de SAT en las plantas descritas anteriormente, es posible emplear suelo para agricultura que de otro modo no sería adecuado debido a la presencia de, por ejemplo, compuestos tóxicos que interfieren con enzimas que contienen azufre y por lo tanto con el crecimiento de las plantas. Esto es en particular cierto para el suelo que contiene grandes cantidades de metales pesados. Es más, las células de la planta, el tejido de la planta y las plantas de la presente invención se pueden usar para la remediación del suelo contaminado. Un efecto secundario ventajoso es que mediante, por ejemplo, la mayor tolerancia a los metales debida a la presencia de la molécula o vector de ADN recombinante de la invención, las células de la planta, el tejido de la planta y la planta de la presente invención se pueden usar para "bioprospección minera" (Cunningham, TIBTECH 13 (1995), 393-397). Esto significa que las plantas, el tejido de las plantas y las células de las plantas de la presente invención se pueden usar para la fitoextracción de metales como mercurio, níquel y cobre. Por otra parte, como se mencionó anteriormente un mayor contenido de GSH en las células o el tejido de las plantas y las plantas descritos pueden asegurar una mayor resistencia. Además, el alto nivel de GSH presente en las células o tejidos de las plantas y en las plantas descritos antes se espera que dé como resultado un crecimiento de los almácigos y una producción de biomasa mejores. En resumen, el aumento del contenido de GSH tiene múltiples efectos sobre la vitalidad de las plantas y es de particular interés para el fitogenetista.

Por lo tanto, la presente invención también describe el uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de SAT, una célula de una planta, una planta o un tejido de una planta de la invención o, partes cosechables o material de propagación de ésta, para la producción de alimentos y piensos, para el mejoramiento de la resistencia a los patógenos, para conferir tolerancia a los metales pesados o los herbicidas, para mejorar la producción de biomasa, para potenciar el crecimiento de los almácigos, para conferir tolerancia contra el estrés biótico o abiótico, o para mejorar el sabor y/o gusto de los alimentos o piensos. El uso de la molécula o vector de ADN recombinante descritos para conferir tolerancia a los herbicidas incluye, por ejemplo, su uso como marcadores seleccionables en plantas de acuerdo con otros sistemas que emplean (sobre)expresión de enzimas capaces de conferir tolerancia (es decir resistencia) a los efectos de eliminación (muerte) de las células de la planta de los herbicidas. Un ejemplo de dicho sistema es la sobreexpresión de la enzima 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato (EPSP) sintasa que confiere tolerancia al herbicida glifosato. De manera similar, las moléculas y vectores de ADN recombinante descritos se pueden usar para conferir tolerancia contra compuestos que actúan sobre las enzimas que contienen azufre mediante, p. ej., el secuestro del compuesto que es responsable de la inhibición de dichas enzimas mediante el alto contenido de cisteína, GSH y/o metionina mediante péptidos y proteínas que están presentes en mayores niveles debido al elevado contenido de los aminoácidos que contienen azufre.

Como se describió antes, el valor nutricional de las plantas, del tejido de las plantas y de las células de las plantas de la invención así como de las partes cosechables y del material de propagación de dichas plantas mejora considerablemente debido al mayor contenido de compuestos que contienen azufre. Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con alimentos, piensos o sus aditivos que comprendan las células de la planta, el tejido de la planta, la planta, las partes cosechables o el material de propagación descritos antes. Estos piensos, alimentos y aditivos tienen preferentemente mayores contenidos de cisteína, metionina y/o glutatión como se describió precedentemente.

Estas y otras materializaciones se divulgan y se engloban mediante la descripción y los ejemplos de la presente invención. Bibliografía adicional referente a cualquiera de los métodos, usos y compuestos que se van a emplear de conformidad con la presente invención se pueden encontrar en bibliotecas públicas, usando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo se puede utilizar la base de datos pública "Medline" que está disponible en internet, por ejemplo
en http://www.ncbi.nim.nih.gov/PubMed/medline.html. Otras bases de datos y direcciones como http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, son conocidas por los técnicos con experiencia en la materia y también se pueden obtener utilizando, por ejemplo,
http://www.lycos.com. Una visión general de la información sobre patentes en biotecnología y un informe acerca de fuentes pertinentes de información sobre patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y de temas de actualidad se proporciona en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Las figuras muestran

Figura 1

(a) Análisis de transferencia Northern del ARN total extraído de hojas de cinco plantas transgénicas independientes (SAT-65, 26, 48, 3 y 71) y de dos plantas silvestres (Control a y b). La hibridación se realizó con una sonda de ADN de cysE de E. coli marcado con ^{32}P. Los carriles contenían 15 \mug de ARN total cada uno.

(b) Actividad catalítica máxima de SAT en las hojas de cinco plantas transgénicas independientes (SAT-65, 26, 48, 3 y 71) y dos plantas silvestres (Control a y b). La actividad específica de los extractos crudos se informa en pmol de CoA producida por min y \mug de proteína total. Las barras de error representan una desviación estándar (< 10%). N = 4 medidas independientes.

Figura 2

(a) Niveles endógenos de cisteína en hojas de plantas transgénicas de 6 semanas (SAT-48 y SAT-26) y plantas silvestres (Control a y b). Las cantidades de cisteína se informan en nmol por gpf. Las barras de error representan una desviación estándar (< 20). N = 18; 6 plantas independientes por línea transgénica, 3 medidas independientes por planta.

(b) Niveles endógenos de glutatión en hojas de plantas transgénicas de 6 semanas (SAT-48 y SAT-26) y plantas silvestres (Control a y b). Las cantidades de glutatión se dan en nmol por gpf. Las barras de error representan una desviación estándar (< 10), N = 18; 6 plantas independientes por línea transgénica, 3 medidas independientes por planta.

Figura 3

Análisis de transferencia Northern del ARN total extraído de hojas de cinco plantas transgénicas independientes (SAT-65, 26, 48, 3 y 71) y de dos plantas silvestres (Control a y b). La hibridación se realizó con una sonda de ADNc de OAS-TL plastídica de papa marcada con ^{32}P (p) y también con una isoforma citosólica (c). Los carriles contenían 15 \mug de ARN total cada uno.

Figura 4

Actividad in vitro de OAS-TL en hojas de plantas transgénicas (SAT-48 y 26) y de plantas silvestres (Control a y b). La actividad específica de los extractos crudos se informa en pmol de cisteína producida por min y \mug de proteína total. Las barras de error representan una desviación estándar (< 10%). N = 4 medidas independientes.

Los ejemplos ilustran la invención:

Ejemplo 1

Cribado de plantas de papa transgénica que contienen ARNm de SAT de E. coli

Para dirigir la SAT de E. coli a los cloroplastos de las plantas se construyó una fusión de genes con un péptido de tránsito de Rubisco de Arabidopsis. Se amplificó ADN genómico de SAT de E. coli por RCP usando dos oligonucleótidos sintéticos (EcSAT-N; 5'-GAG AGA CCA TGG CGT GTG AAG AAC TGG AAA, EcSAT-C: 5'-GAG AGA TCT AGA TTA GAT CCC ATC CCC ATA). Se digirió ADN bicatenario con Nco I y Xba I y se clonó detrás del péptido de tránsito. El producto génico fusionado se insertó como fragmento Asp 718/Xho I en un vector binario predigerido con Asp 718/Sal I (Höfgen y Willmitzer, 1990) bajo el control del promotor 35S de CaMV. El plásmido se introdujo en papa a través de Agrobacterium Tumefaciens (Solanum tuberosum cv Désirée) según describen Rocha-Sosa et al. (1989). La Solanum tuberosum cv Désirée se obtuvo de Vereinigte Saatzuchten eG (Ebstorf, Alemania). Las plantas transgénicas y silvestres se mantuvieron en cultivo tisular durante un período de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad en medio Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962) complementado con 2% (p/v) de sacarosa a 22ºC. En el invernadero, las plantas se hicieron crecer a 22ºC durante el período de luz (16 horas) y a 15ºC durante el período de oscuridad (8 horas). Las plantas se cultivaron en macetas separadas y se regaron continuamente.

Las plantas de papa transgénica mantenidas en cultivo tisular fueron visualmente indistinguibles de las plantas de control sin transformar. Para cribar plantas que expresaran el ARNm de SAT de E. coli, se seleccionaron al azar cincuenta plantas para tomar muestras de hojas. Estas muestras se sometieron a análisis de ARN por transferencia en gel usando como sonda ADNc de SAT de E. coli marcado radiactivamente. Para el aislamiento del ARN, el material de hojas de la planta se congeló en nitrógeno líquido inmediatamente después de la cosecha. El ARN total se extrajo del material congelado según Logemann et al. (1987). Después de la desnaturalización a 65ºC el ARN total se separó en condiciones de desnaturalización mediante electroforesis en gel (Lehrach, 1977) y después se transfirió a membranas de nylon. La hibridación de Northern se realizó a una temperatura apropiada según describe Amasino (1986). Las transferencias de Northern se lavaron tres veces durante 30 min a 55ºC en 0,5 x SSC; SDS al 0,2%. Se realizó el marcado de los fragmentos con ^{32}P con el juego de reactivos "Multiprime DNA-labelling" (Amersham Buchler, Braunschweig, Alemania). Se seleccionaron cinco transformantes independientes que acumulaban altas cantidades de ARNm de SAT para el análisis posterior y se transfirieron al invernadero. La repetición del análisis de Northern reveló, que también en condiciones de invernadero los transformantes acumulaban altas cantidades del ARNm extraño (figura 1a). La longitud de la transcripción detectada en las plantas de papa transgénica (\approx 1.050 pares de bases) estuvo de acuerdo con la longitud informada para el gen cysE, concretamente 819 bp (Denk y Böck, 1987) y la secuencia señal usada de rubisco (\approx 240 bp). Para medir la actividad enzimática de SAT se utilizó un análisis que sigue un método de Kredich y Tomkins (1966). Este método se basa en un intercambio de disulfuro entre CoA, liberada de un residuo acetilo durante la reacción catalizada por SAT, y el ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoico). La formación de CoA fue analizada en Tris-HCl 50 mM (pH 7,6) que contenía ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) 1 mM , EDTA 1 mM, L-serina 20 mM y acetil-CoA 100 \muM. La reacción se inició mediante el agregado de 10 \mul de extracto de hoja crudo (1,5 \mug/\mul de proteína total), la temperatura de incubación fue de 25ºC. La producción de ácido tionitrobenzoico se controló a 412 nm en un espectrofotómetro (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) contra un blanco de control que contenía todos los materiales excepto L-serina. La curva de calibración se estableció con soluciones de control que contenían todos los materiales y diferentes concentraciones de CoA (0-200 nmol/ml). El análisis de actividad se repitió independientemente con diferentes volúmenes de extracto de hojas crudo, es decir 20, 40 y 60 \mul. El análisis de la actividad de SAT en los extractos de hojas crudos reveló que las plantas de papa que expresan el gen de E. coli convierten serina en OAS mucho más eficientemente que las plantas de control sin transformar (figura 1b), lo que sugiere que las plantas transformadas poseen mayor actividad de SAT, que es probablemente debido a la serina acetiltransferasa extraña de E. coli. A pesar del fuerte aumento de la actividad de SAT en las hojas de las plantas transgénicas, ningún cambio drástico en el fenotipo de estas plantas fue visible con una sola excepción: el transformante 48 mostró una dominancia apical reducida que dio como resultado un fenotipo tupido. Interesantemente el transformante 48 tuvo la actividad de SAT más alta de todas las plantas transgénicas.

Ejemplo 2

La expresión del gen cysE lleva a un aumento en los niveles endógenos de cisteína y glutatión

La biosíntesis de cisteína en las plantas tiene lugar mediante una reacción en dos pasos. La formación de cisteína a partir de sulfuro y O-acetil-L-serina es catalizada por O-acetilserina(tiol)liasa. La O-acetil-L-serina es sintetizada por serina acetiltransferasa a partir de acetil-coenzima A y serina (Brunold y Rennenberg, 1997). Para investigar si la expresión del gen cysE en las plantas de papa influye en los niveles endógenos de cisteína, se determinó la concentración de este aminoácido que contiene azufre en plantas transformadas y sin transformar. Se prepararon los tioles según describen Rüegsegger y Brunold (1992). La separación y cuantificación fueron realizadas por HPLC en fase reversa después de la derivatización con monobromobimano según Newton et al. (1981). Como una modificación, la reducción de los disulfuros se hizo con bis-2-mercaptoetilsulfona y la reacción de marcado con monobromobimano se detuvo con HCl al 15%.

El material de hojas congelado se homogeneizó a un polvo fino y después se extrajo durante 20 min en HCl 0,1 N (2 ml/0,2 gpf) a 4ºC. Después de la centrifugación de la mezcla a 4ºC (20 min, 14.000 g), se agregaron 120 \mul del sobrenadante a 200 \mul de ácido 2-(ciclohexilamino)etansulfónico 0,2 M (pH 9,3). La reducción de los disulfuros totales se realizó agregando 10 \mul de bis-2-mercaptoetilsulfona en Tris-HCl 9 mM, EDTA 5 mM (pH 8). Después del tiempo de reacción de 40 min a temperatura ambiente, los grupos tiol libres se marcaron con monobromobimano. Con este fin, se agregaron a la mezcla 20 \mul de monobromobimano 15 mM en acetonitrilo y la mezcla se mantuvo durante 15 min en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo agregando 250 \mul de HCl 15%. Después de mantener la mezcla de reacción en hielo durante dos horas en la oscuridad, se la centrifugó nuevamente a 4ºC (10 min, 14.000 g). Para el análisis de cisteína y glutatión, el sobrenadante se diluyó adecuadamente con HCl 0,1 N. Las muestras se analizaron según el método de Schupp y Rennenberg (1988) en una columna de HPLC de fase reversa (C_{18}, 250 x 4 mm, 5 \mum de tamaño de partícula, Macherey-Nagel, Oensingen, Suiza). Se usó un sistema solvente consistente en metanol al 10%; ácido acético al 0,25%, pH 3,9 (NaOH) y metanol al 90%; ácido acético al 0,25% con una velocidad de flujo de 1,5 ml/min. La cromatografía se siguió mediante un detector de fluorescencia (excitación: 380 nm, emisión: 480 nm, detector de fluorescencia SFM 25, Kontron, Zürich, Suiza). Los cromatogramas se cuantificaron por integración de las áreas de los picos. Para el análisis de cisteína se usaron los dos transformantes con la actividad de SAT más alta, es decir SAT-48 y SAT-26 (vea Figura 2b). Con este fin, se cosecharon y se extrajeron hojas jóvenes y verdes de plantas de 5 semanas y se les determinó el contenido de cisteína por HPLC. Las plantas de papa transgénica que expresan el gen cysE de E. coli presentaron niveles de cisteína significativamente aumentados (Figura 3a). Los niveles del transformante SAT-48 fueron casi tres veces mayores (45 \pm 10 nmol por gramo de peso fresco de tejido de hoja) y los del transformante SAT-26 dos veces mayores (33 \pm 6 nmol/gpf) que las cantidades encontradas en plantas de control sin transformar (17 \pm 3 nmol/gpf), lo que indica que la expresión de cysE lleva a un aumento de los niveles endógenos del aminoácido cisteína.

Uno de los vertederos principales de la cisteína producida mediante la cascada de asimilación/reducción de sulfato es la formación de glutatión, un tripéptido que consiste en los aminoácidos, glutamato, cisteína y glicina. Debido a que las plantas de papa transgénica que expresan SAT de E. coli contenían más cisteína, es posible que esto haya podido tener efecto sobre la biosíntesis del glutatión, teniendo en mente que la cisteína es un sustrato para la producción de glutatión. Para investigar si éste es el caso, se analizaron los niveles de glutatión en hojas de plantas de las líneas transgénicas SAT-48 y SAT-26 y en plantas silvestre. Estas medidas revelaron que ambos transformantes tuvieron niveles de glutatión significativamente elevados, siendo hasta dos veces mayores (500-600 nmol/gpf) que en las plantas silvestres (300-350 nmol/gpf; Figura 3b). Esto sugiere que mayores niveles de cisteína estimulan la biosíntesis de glutatión.

Teniendo en cuenta que una molécula de glutatión contiene una molécula de cisteína y que las cantidades molares totales de glutatión en hojas de papa son más de 10 veces mayores que las cantidades molares del aminoácido cisteína libre, se puede concluir que la capacidad de síntesis de cisteína en las plantas de papa transgénica aumenta mucho más que sólo dos o tres veces como se podría pensar prestando atención sólo a los niveles de cisteína libre. Un aumento absoluto de 200-300 nmol de glutatión/gpf en las plantas transgénicas es por consiguiente equivalente a una capacidad biosintética de cisteína aumentada en aproximadamente 10 a 18 veces, cuando se tienen aproximadamente 15-20 nmol de cisteína/gpf en hojas de plantas silvestres. Si se agrega a esto los mayores niveles de cisteína libre en las plantas transgénicas en aproximadamente dos o tres veces, la biosíntesis de cisteína en los transformantes es favorecida hasta 20 veces en comparación con las plantas de control.

Ejemplo 3

Mayores niveles endógenos de cisteína y glutatión no influyen en el patrón de expresión de las isoformas de OAS-TL

Se ha informado de una regulación metabólicamente significativa de la actividad de SAT mediante inhibición alostérica de cisteína para la enzima de la sandía (Saito, 1995). Las SAT bacterianas son retroinhibidas a nivel de la transcripción por concentraciones micromolares de cisteína. En contraposición en una situación de limitación de la cisteína, se estimula la expresión de las SAT bacterianas (Kredich, 1987). Además, la O-acetilserina(tiol)liasa, que es la enzima que sigue directamente después de SAT en la cascada de reacciones de biosíntesis de la cisteína, también es regulada por cisteína a nivel de la transcripción. Se observó que se estimulaba la expresión de diferentes ADNc que codifican para isoformas de O-acetilserina(tiol)liasa de Arabidopsis específicas del compartimiento en plantas que crecen con suministro de sulfato limitado, (Hell 1994; Barroso, 1995; Hesse, 1997). También en espinaca la expresión de isoformas de O-acetilserina(tiol)liasa es ligeramente favorecida en condiciones de privación de azufre (Takahashi y Saito, 1996). Para investigar si los mayores niveles de cisteína en las plantas de papa transgénica que expresan el gen cysE de E. coli influye en el patrón de expresión de la OAS-TL endógena de papa, se tomaron muestras de hojas de plantas transgénicas y sin transformar y se sometieron a análisis de transferencia de ARN; vea el Ejemplo 1. Para el marcado radiactivo de los ADNc de OAS-TL de papa (Hesse y Höfgen, 1998), el ADN se cortó con las enzimas de restricción apropiadas y se separó en un gel de agarosa al 1%. Los fragmentos de ADN se aislaron del gel utilizando el juego de reactivos "NucleoSpin Extract" de Macherey-Nagel (Duren, Alemania). Este análisis reveló que aunque las plantas transgénicas contenían significativamente más cisteína en sus hojas, los genes de OAS-TL de papa (tanto la isoforma citosólica como cloroplastídica, Hesse y Höfgen, 1998) no se alteraron en su tasa de transcripción en comparación con la expresión en plantas silvestres (Figura 3). Esto sugiere que los mayores niveles de cisteína en las plantas de papa transgénica no tienen influencia detectable en el patrón de expresión de la OAS-TL de papa a nivel de la transcripción.

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Ejemplo 4

Mayores niveles endógenos de cisteína no influyen en la actividad de la O-acetilserina(tiol)liasa

La OAS-TL se regula a nivel de la actividad mediante el estado del azufre dentro de la célula. La actividad de una O-acetilserina(tiol)liasa citosólica de Arabidopsis thaliana por ejemplo, es activada por la limitación de azufre (Barroso, 1995; Hesse, 1997). También se ha observado aumento de la actividad específica por agotamiento del azufre en las células de tabaco cultivado y C. reinhardtii y en hojas de maíz (Bergmann, 1980; Passera y Ghisi, 1982; Leon, 1988). En contraposición las concentraciones altas de azufre parecen reducir la actividad de OAS-TL. La enzima de Datura innoxia por ejemplo es inhibida por mayores concentraciones de sulfuro (Kuske, 1994). En células de C. reinhardtii la actividad de OAS-TL no es inhibida sólo por el sulfuro, sino también por la OAS y la cisteína (León y Vega, 1991). Para averiguar, si la mayor actividad de SAT y los niveles alterados de cisteína y glutatión en las plantas de papa transgénica tienen efecto sobre la actividad de OAS-TL, se realizó para esta enzima un ensayo de actividad con extractos de hojas crudos. La actividad de O-acetilserina(tiol)-liasa se analizó midiendo la producción de L-cisteína. Cada análisis se inició agregando 5 \mul de extracto de hojas crudo (1 \mug/\mul de proteína total). Las reacciones se llevaron a cabo en K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50 mM (pH 7,5) en presencia de DTT 5 mM, O-acetilserina 10 mM y Na_{2}S 2 mM (volumen total 100 \mul) y se les permitió proceder durante 20 min a 25ºC. Se las detuvo mediante el agregado de 50 \mul de ácido tricloroacético al 20% y después se analizaron para determinar la producción de L-cisteína usando reactivo de Gaitonde (Gaitonde, 1967). El contenido de cisteína se controló a 560 nm en un espectrofotómetro (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) contra un blanco de control que contenía todos los materiales excepto O-acetilserina. Los experimentos se repitieron tres veces. Sin embargo, estas medidas no revelaron ninguna diferencia en las actividades de OAS-TL entre los extractos de hojas de plantas transgénicas y silvestres (Figura 4). Así que se puede especular, que los mayores niveles de cisteína y glutatión en las plantas transgénicas no sólo no tienen un efecto detectable sobre el nivel de expresión génica sino que tampoco tienen efecto sobre la actividad de OAS-TL.

Ejemplo ilustrativo 5

Expresión por plantas de papa transgénica que contienen SAT de E. coli y ARNm de C\gammaS de la planta

Se seleccionaron dos líneas transgénicas que expresan SAT de E. coli (p. ej., SAT-48 y SAT-26) para la sobreinfección con un constructo de plásmido binario que contenía un ADNc de C\gammaS p. ej. papa bajo el control del promotor 35S- y B33, respectivamente. El vector binario es un derivado de pBIN19 que permite p. ej., la resistencia la higromicina para la selección de plantas. Los plásmidos se introdujeron en las líneas transgénicas SAT-48 y SAT-26, respectivamente a través de Agrobacterium tumefaciens según describen Rocha-Sosa, (1989). Las condiciones de selección se eligieron según se describe en el Ejemplo 1. Las líneas transgénicas sobreinfectadas que expresaban SAT de E. coli y C\gammaS se sometieron a cribado a nivel del ARN (transferencia Northern), a nivel proteico (transferencia Western) y de la actividad enzimática. Los experimentos de transferencia Northern se realizaron según se describe en el Ejemplo 1. Se seleccionaron las líneas con elevada expresión de C\gammaS para determinar el contenido proteico y la actividad enzimática. Diez \mug de proteína de cada extracto de hoja se analizaron por transferencia Western para determinar si tenían mayor contenido proteico con respecto a la línea silvestre y la línea transgénica original utilizada. Las líneas con mayor contenido proteico se analizaron además con relación a la actividad enzimática. Se incubaron 10 \mug, 25 \mug, 50 \mug y 100 \mug de extracto de hojas junto con 10 \muCi de ^{35}S-cisteína y succinilhomoserina 10 mM durante 30 min a 30ºC en un volumen total de 200 \mul de Tris/HCl 50 mM, pH 7,8 y DTT 10 mM. Las reacciones se detuvieron agregando 50 \mul de TCA al 20%. Después de la neutralización y la centrifugación se analizaron 5 \mul de cada sobrenadante por cromatografía en capa fina. Se usó como solvente de corrida una mezcla de metanol/acetato de etilo/H_{2}O = 60:30:10). Las plantas transgénicas con actividad alta se analizaron después con respecto al contenido de GSH, C\gammaS y Met.

Referencia

Alscher, Physiol Plant 77 (1989), 457-464

Amasino, Anal Biochem 152 (1986), 304-307

Anderson, Sulfur metabolism in plants. In BJ Miflin, PJ Lea, eds, The Biochemistry of Plants. Academic Press, New York(1990), 327-381

Barroso, FEBS Lett 363 (1995), 1-5

Bergmann, Z Naturforsch 35c (1980), 952-957

Bogdanova, FEBS Lett 358 (1995), 43-47

Bogdanova, PlantJ 11 (1997), 251-262

Breton, J Biol Chem 265 (1990), 18248-18255

Brunold, Planta 155 (1982), 321-327

Brunold, Academic Publishers, The Hague, The Netherlands (1993), 61-76

Brunold, Prog Bot 58 (1997), 164-186

Cook, Arch Biochem Biophys 178 (1977), 293-302

Delhaize, Plant Physiol 89 (1989), 700-706

Denk, J Gen Microbiol 133 (1987), 515-525

Droux, Arch Biochem Biophys 295 (1992), 379-390

Evans, J Bacteriol 173 (1991), 5457-5469

Gaitonde, Biochem J 104 (1967), 627-633

Ghisi, Plant Physiol 92 (1990), 846-849

Ghisi, Photosynthetica 29 (1993), 543-549

Giovanelli, The biochemistry of plants: A comprehensive treatise, amino acids and derivatives. Academic Press, New York 5 (1980), 453-505

Giovanelli, Academic Publishers, The Hague, The Netherlands (1990), 33-48

Hell, FEBS Lett 351 (1994), 257-262

Hesse, WJ Cram et al., eds, Sulphur Metaboiism in Higher Plants. Backhuys Publishers, Leiden, The Netherlands (1997), 227-230

Hesse, Plant Phys 116 (1998), 1604

Kredich, J Biol Chem 241 (1966), 4955-4965

Kredich, J Biol Chem 244 (1969), 2428-2439

Kredich, Cellular and Molecular Biology. American Society of Microbiology, Washington DC (1987), 419-428

Kredich, Academic Publishers, The Hague, The Netherlands (1993), 37-47

Kuske, J Biol Chem 269 (1994), 6223-6232

Kuske, Plant Physiol 112 (1996), 659-667

Lai, Gene 119 (1992), 113-118

Lehrach, Biochem 16 (1977), 4743-4751

León, J Plant Physiol 132 (1988), 618-622

León, Plant Physiol Biochem 29 (1991), 595-599

Logemann, Anal Biochem 163 (1987), 21-26

Lunn, Plant Physiol 94 (1990), 1345-1352

Meister, Annu Rev Biochem 52 (1983), 711-760

Monroe, J Bacteriol 172 (1990), 6919-6929

Murashige, Physiol Plant 15 (1962), 473-479

Murillo, Cell Mol Biol 41 (1995), 425-433

Nakamura, Plant Cell Physiol 28 (1987), 885-891

Nakamura, Plant Cell Physiol 29 (1988), 689-693

Nakamura, Agric Biol Chem 54 (1990), 649-656

Neuenschwander, Plant Physiol 97 (1991), 253-258

Newton, Anal Biochem 114 (1981), 383-387

Ngo, Can J Biochem 52 (1974), 435-440

Noctor, Plant Physiol 112 (1996), 1071-1078

Noji, Mol. Gen. Genet. 244 (1994), 57-66

Nussbaum, Plant Physiol 88 (1988), 1407-1410

Ostrowski, J Bacteriol 171 (1989),130-140

Passera, J Exp Bot 33 (1982), 432-438

Rauser, Plant Physiol 97 (1991), 128-138

Ravanel, C R Acad Sci Paris 320 (1997), 497-504

Rennenberg, Plant Physiol 73 (1983), 560-565

Rennenberg, SPB Academic Publishers, The Hague (1990), 276

Rennenberg, Prog Bot 55 (1994), 142-156

Rennenberg, Cambridge University Press, Cambridge, UK (1995), 155-171

Roberts, Plant Mol Biol 30 (1996),1041-1049

Rocha-Sosa, EMBO J 8 (1989), 23-29

Rolland, Plant Physiol 98 (1992), 927-935

Rolland, Arch Biochem Biophys 300 (1993), 213-222

Rolland, Eur J Biochem 236 (1996), 272-282

Rüegsegger, Plant Physiol 99 (1992), 428-433

Ruffet, Plant Physiol 104 (1994), 597-604

Ruffet, Eur J Biochem 227 (1995), 500-509

Saito, Proc Natl Acad Sci USA 89 (1992), 8078-8082

Saito, FEBS Lett 324 (1993), 247-252

Saito, J Biol Chem 269 (1994), 28187-28192

Saito, Plant Physiol 106 (1994), 887-895

Saito, J Biol Chem 270 (1995), 16321-16326

Schmidt, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 43 (1992), 325-349

Schupp, Plant Sci 57 (1988), 113-117

Smith, Biochem Biophys Res Commun 35 (1969), 939-945

Smith, Biochim Biophys Acta 277 (1971), 288-295

Smith, Plant Physiol 50 (1972), 477-479

Smith, Alscher RG, Cumming JR (eds) Wiley-Liss, New York (1990), 201-215

Takahashi, Plant Physiol 112 (1996), 273-280

Vaara, FEMS Microbiol Lett 97 (1992), 249-254

Von Arb, Physiol Plant 67 (1986), 81-86

Vuorio, FEBS Lett 292 (1994), 90-94

Youssefian, Plant J 4 (1993), 759-769

Claims (13)

1. Un método para aumentar el contenido de compuestos que contienen azufre en plantas transgénicas, células o tejido de plantas transgénicas, que consiste en la introducción de una molécula de un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de serina acetiltransferasa (SAT) en una planta transgénica, célula o tejido de la planta transgénica, donde dicha molécula de un ácido nucleico está unida operablemente a elementos reguladores que permiten la expresión de la molécula del ácido nucleico en las células de la planta, donde dicha planta, dicha célula de la planta o dicho tejido de la planta no expresan una molécula de un ácido nucleico introducida exógenamente que codifica una proteína que tiene actividad de O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL).

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína que tiene actividad de SAT es una serina acetiltransferasa de procariotas o arquebacterias.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde la molécula del ácido nucleico está unida operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito capaz de dirigir la proteína al interior de un compartimiento celular deseado.

4. El método de la reivindicación 3, donde dicho compartimiento celular es un plástido.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dichos elementos reguladores comprenden un promotor activo en las células de las plantas.

6. El método de la reivindicación 5, donde dicho promotor es inducible, expresado constitutivamente y/o es un promotor específico de una célula, un tejido o un órgano.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicho promotor es específico del tubérculo, específico de la semilla, específico del endosperma, específico del embrión o específico del floema.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la molécula del ácido nucleico está ubicada en un vector que comprende además un marcador seleccionable.

9. Alimentos, piensos o sus aditivos, que comprendan células de la planta transgénica en el genoma de las cuales está establemente integrada una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de serina acetiltransferasa (SAT) la que está unida operablemente a elementos reguladores que permiten la expresión de la molécula de ácido nucleico en las células de la planta, o que comprende una planta o tejido de una planta que comprende dichas células de la planta transgénica, partes cosechables de dicha planta o material de propagación de dicha planta, comprendiendo dichas partes cosechables y material de propagación dichas células de la planta, donde dichas células de la planta no expresan una molécula de un ácido nucleico introducida exógenamente que codifica una proteína que tiene actividad de O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL).

10. Los alimentos, piensos o sus aditivos de la reivindicación 9, donde dichas células de la planta transgénica comprenden un marcador seleccionable.

11. Los alimentos, piensos o sus aditivos de la reivindicación 9 ó 10, donde en dicha planta transgénica el nivel de glutatión, cisteína y/o metionina es mayor en comparación con el de la planta silvestre.

12. Los alimentos, piensos o sus aditivos de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde dicha planta transgénica es maíz.

13. Los alimentos, piensos o sus aditivos de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde dicho material de propagación es la semilla.