ES2260926T3 - Medios y metodo para potenciar el contenido de compuestos de azufre en plantas. - Google Patents
Medios y metodo para potenciar el contenido de compuestos de azufre en plantas.Info
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Abstract
Un método para aumentar el contenido de compuestos que contienen azufre en plantas transgénicas, células o tejido de plantas transgénicas, que consiste en la introducción de una molécula de un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de serina acetiltransferasa (SAT) en una planta transgénica, célula o tejido de la planta transgénica, donde dicha molécula de un ácido nucleico está unida operablemente a elementos reguladores que permiten la expresión de la molécula del ácido nucleico en las células de la planta, donde dicha planta, dicha célula de la planta o dicho tejido de la planta no expresan una molécula de un ácido nucleico introducida exógenamente que codifica una proteína que tiene actividad de O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL).
Description
Medios y método para potenciar el contenido de
compuestos de azufre en plantas.
La presente invención se relaciona con un método
para aumentar el contenido de compuestos que contienen azufre en
plantas transgénicas, células o tejido de plantas transgénicas que
consiste en la introducción de una molécula de un ácido nucleico que
codifica una proteína con actividad de serina acetiltransferasa
(SAT) en una planta, una célula de una planta o un tejido de una
planta, donde dicha molécula de un ácido nucleico está unida
operablemente a elementos reguladores que permiten la expresión del
ácido nucleico en las células de la planta, donde dicha planta,
dicha célula de la planta o dicho tejido de la planta no expresan
una molécula de un ácido nucleico exógenamente introducida que
codifica una proteína que tiene actividad de
O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL).
También se describe una molécula de ADN recombinante que comprende
una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene
actividad de serina acetiltransferasa (SAT) donde dicha(s)
molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) está(n)
unida(s) operablemente a elementos reguladores que permiten
la expresión de la(s) molécula(s) de ácido(s)
nucleico(s) en las células de las plantas. La presente
invención también describe vectores que comprenden dichas moléculas
de ADN recombinante así como las células de las plantas, los tejidos
de las plantas y las plantas transformados con ellos. La presente
invención describe más a fondo el uso de las moléculas y los
vectores de ADN recombinante antes mencionados en el cultivo de
células y tejidos de plantas, el mejoramiento de plantas y/o la
agricultura. Además, la presente invención incluye la producción de
alimentos, piensos y sus aditivos que comprendan las células o el
tejido de las plantas y las plantas descritos anteriormente.
Las plantas superiores usan el sulfato
inorgánico del suelo como la principal fuente de azufre para
sintetizar los aminoácidos cisteína y metionina que contienen
azufre. Se postuló que la biosíntesis de cisteína en las plantas
desempeña un papel esencial en el ciclo del azufre en la naturaleza.
El azufre reducido en forma de cisteína es necesario en las plantas
para muchas funciones diferentes (Rennenberg, 1990; Schmidt, 1992).
Es esencial para el metabolismo de las plantas normales debido a que
conecta el metabolismo de la serina y la metionina al transportar el
azufre reducido necesario para la biosíntesis de metionina
(Giovanelli, 1990; Ravanel, 1997; Brunold y Rennenberg, 1997).
Además, la cisteína sirve como sustrato para otras moléculas que
contienen azufre como ciertos cofactores, compuestos de membrana, y
como un aminoácido esencial para la síntesis proteica (Giovanelli,
1980; Schmidt, 1992). La cisteína también es esencial como un
precursor para la producción del glutatión (GSH) y otros metabolitos
relacionados con el estrés. La demanda de cisteína varía durante el
desarrollo de la planta y también depende de los cambios en el medio
ambiente, incluidos la disponibilidad de luz, de sulfato y algunos
tipos de estrés, abiótico o biótico (von Arb y Brunold 1986;
Nussbaum, 1988; Delhaize, 1989; Rauser, 1991; Ghisi, 1993; Hell,
1994).
Para la biosíntesis de cisteína, primero se debe
activar la L-serina mediante transferencia de un
grupo acetilo de la acetil coenzima A para formar el producto
intermedio O-acetil-L-serina
(OAS). Esta importante reacción es catalizada por la serina
acetiltransferasa (SAT). La activación de la serina, una reacción
clave en la vía biosintética de la cisteína, se investigó a nivel
molecular sólo en procariotas (Breton, 1990; Monroe, 1990; Evans,
1991; Lai y Baumann, 1992). La síntesis de cisteína en las plantas
se realiza por sulfhidrilación de la
O-acetil-L-serina en
presencia de sulfuro libre u enlazado, catalizada por
O-acetilserina(tiol)liasa
(OAS-TL, cisteína sintasa, CSase; EC 4.2.99.8.)
(Schmidt y Jäger, 1990). Esta reacción fue exhaustivamente analizada
(Saito, 1992, 1993 y 1994; Rolland, 1993 y 1996; Youssefian, 1993;
Noji, 1994; Hell, 1994; Kuske, 1994 y 1996; Takahashi y Saito,
1996).
En las bacterias SAT y OAS-TL
forman un complejo bifuncional denominado cisteína sintasa. En este
complejo sólo una pequeña proporción de la
O-acetilserina(tiol)liasa (5%) se asocia con
toda la actividad de SAT (Kredich, 1969). Además, estudios sobre la
regulación de la biosíntesis de cisteína en las bacterias revelaron
que la serina acetiltransferasa es sensible a la retroinhibición por
L-cisteína y que la O-acetilserina (o
N-acetilserina) participa en la activación de la
transcripción de varios de los promotores del operón cys (Ostrowski
y Kredich, 1989; Kredich, 1993). Recientemente se clonaron ADNc de
plantas que codifican serina acetiltransferasas a partir de
diferentes especies (Bogdanova, 1995; Murillo, 1995; Ruffet, 1995;
Saito, 1995; Roberts y Wray, 1996). En las plantas, SAT también
existe en un complejo con OAS-TL, lo que sugiere una
canalización metabólica eficiente de serina a cisteína mediante la
prevención de la difusión del producto intermedio
O-acetil-L-serina (Nakamura,
1988; Nakamura y Tamura, 1990; Ruffet, 1994; Bogdanova y Hell, 1997;
Hesse, 1997). Se informó que tanto SAT como OAS-TL
fueron localizadas en plástidos, mitocondria y citosol de varias
plantas, lo que sugiere que la capacidad para sintetizar cisteína
parece ser necesaria en todos los compartimientos celulares con
capacidad biosintética de una proteína endógena (Smith y Thompson,
1969; Smith, 1972; Brunold y Suter, 1982; Lunn, 1990; Rolland, 1992;
Ruffet, 1994). En Pisum sativum, por ejemplo, existen tres
isoformas diferentes de SAT y cada isoforma parece ser específica
para un compartimiento intracelular determinado (Ruffet, 1995).
Además de estas ubicaciones celulares necesarias, el hecho de que la
biosíntesis de cisteína esté en interacción compleja con la
captación y reducción de sulfato, el cual es a su vez regulado por
fotosíntesis y asimilación de nitrato (Anderson, 1990; Brunold,
1993), permite sugerir un papel importante de la biosíntesis de
cisteína en el metabolismo del azufre en las plantas superiores.
Una característica muy importante de las
secuencias de reacción de formación de cisteína es el hecho de que
la actividad de SAT es mucho menor en comparación con la actividad
de OAS-TL. En las semillas y almácigos, la
OAS-TL es 10 a 20 veces más activa que SAT (Smith,
1971; Ngo y Shargool, 1974). En las hojas enteras la relación de
actividad de ambas enzimas es de 100 a 300 veces (Nakamura, 1987),
mientras que en los cloroplastos solos la relación es hasta de 345
veces (Ruffet, 1994). Como se demostró en Allium y espinaca,
SAT es en comparación con OAS-TL una enzima poco
abundante (Nakamura y Tamura, 1990; Ruffet, 1994). Además, también
se discutió que la disponibilidad de OAS era limitante de la tasa de
síntesis de cisteína (Neuenschwander, 1991; Ghisi, 1990; Rennenberg
1983; Brunold, 1993; Saito, 1994). La actividad de SAT se regula
significativamente por retroinhibición de la cisteína en sandía
(Saito, 1995). La regulación de SAT también tiene lugar a nivel de
la expresión génica. En Arabidopsis thaliana en respuesta al
estrés relacionado con la luz y el azufre se acumula el ARNm de SAT
en aproximadamente dos veces (Bogdanova, 1995). Sin embargo, en
tanto que la función y el papel de SAT, OAS y OAS-TL
en la cascada de reacciones de la biosíntesis de cisteína han sido
sometidos a numerosas investigaciones, los intentos previos de
alterar la tasa de síntesis de cisteína han fracasado (Saito,
1994). En consecuencia, la regulación precisa de la vía biosintética
de la cisteína todavía no se comprende plenamente y es parte de una
discusión controvertida. Por lo tanto, hasta ahora no se ha
dispuesto de los medios para el control del contenido de azufre en
las plantas, que puede tener aplicaciones en varios aspectos de la
agricultura.
De este modo, el problema técnico subyacente en
la presente invención fue satisfacer la necesidad de contar con
métodos para modular el contenido de compuestos de azufre en las
plantas.
La solución a este problema técnico se logra
proporcionando las materializaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
La invención también divulga una molécula de ADN
recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que
codifica una proteína que tiene actividad de serina
acetiltransferasa (SAT) donde dicha molécula de ácido nucleico está
unida operablemente a elementos reguladores que permiten la
expresión de la(s) molécula(s) de ácido(s)
nucleico(s) en las células de las plantas.
La expresión "proteína que tiene actividad de
serina acetiltransferasa (SAT)", como se usa aquí, significa que
dicha proteína puede transferir un grupo acetilo de la acetil
coenzima A a la L-serina para formar el producto
intermedio de la vía biosintética de la cisteína, la
O-acetil-L-serina.
La expresión "proteína que tiene actividad de
cisteína-\gamma-sintasa
(C\gammaS)" se refiere a una proteína capaz de catalizar la
formación de L-cistationina o
L-homocisteína dependiendo del sustrato que contiene
azufre, L-cisteína o sulfuro. Esta proteína también
se conoce como
cistationina-\gamma-sintasa. Los
términos
"cisteína-\gamma-sintasa" y
"cistationina-\gamma-sintasa"
se usan aquí indistintamente. En las plantas, C\gammaS cataliza
generalmente la primera reacción específica de la biosíntesis de
metionina, concretamente el reemplazo gama del sustituyente
fosforilo de la O-fosfohomoserina por cisteína. Por
lo tanto, la cisteína es un precursor principal de la biosíntesis de
metionina en las plantas.
De conformidad con la presente invención, la
secuencia de codificación del gen cysE de Escherichia
coli (Denk y Böck, 1987), que codifica una enzima de la vía
biosintética de la cisteína, a saber serina acetiltransferasa (SAT,
EC 2.3.1.30), se introdujo en el genoma de plantas de papa bajo el
control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV). Para dirigir la proteína al interior del cloroplasto se
fusionó traduccionalmente cysE a la secuencia señal 5' de la
subunidad pequeña de rubisco; vea el Ejemplo 1. Las plantas
transformadas con éxito presentaron una elevada acumulación de ARNm
de cysE. Además, los extractos de hojas crudos de estas plantas
tuvieron una actividad de SAT significativamente alta, hasta 20
veces mayor en comparación con la de las plantas silvestres. Las
plantas de papa transgénica que sobreexpresan el gen de E.
coli presentaron niveles elevados de cisteína y glutatión (GSH),
que fueron de dos a tres veces mayores que en las plantas de
control; vea el Ejemplo 2. Sin embargo, sorprendentemente el aumento
de la actividad de la enzima SAT y del sustrato para la biosíntesis
de cisteína O-acetil-L-serina
(OAS) no tuvo ningún efecto sobre la expresión y la actividad de
O-acetilserina(tiol)liasa
(OAS-TL), la enzima que convierte la OAS, el
producto de SAT, en cisteína; vea los Ejemplos 3 y 4. Tanto la
expresión de este gen a nivel del ARN como la actividad de la enzima
permanecieron inalteradas en comparación con las de las plantas
silvestres.
De estos experimentos, se extrajeron las
siguientes conclusiones; por una parte la SAT bacteriana de E
coli expresada en las plantas de papa transgénica se acumuló en
los cloroplastos como una proteína catalíticamente funcional. Por
otra parte los contenidos celulares de cisteína y glutatión
aumentaron significativamente en las hojas de las plantas
transgénicas. Los niveles de cisteína en un transformante
(SAT-48) fueron casi tres veces mayores y en otro
transformante (SAT-26) dos veces mayores que las
cantidades encontradas en las plantas de control sin transformar, lo
que indica que la expresión de cysE es responsable de la
estimulación de la síntesis de cisteína. Los experimentos
realizados de conformidad con la presente invención también
revelaron que ambos transformantes tenían niveles de glutatión
significativamente elevados, que fueron hasta dos veces mayores que
en las plantas silvestres. Estos resultados inesperados demostraron
que en condiciones normales sin ningún estrés por azufre, el nivel
endógeno de SAT es un paso limitante en la vía biosintética de
cisteína, al menos en el cloroplasto, adonde se dirige la SAT de
E. coli. Esto significa que en condiciones habituales el
nivel de OAS-TL es suficiente para convertir toda la
OAS producida en la célula y por lo tanto no es limitante de un
flujo normal de biosíntesis de cisteína. De hecho, que una
sobreexpresión de la SAT en las plantas de papa transgénica pueda
aumentar más el contenido de cisteína y glutatión implica que los
pasos en la vía de asimilación del sulfato antes de la incorporación
de sulfuro en la cisteína, es decir la captación de sulfato, la
activación de sulfato y la reducción de
5'-fosfosulfato de adenosina (APS), están en
condiciones normales y que tampoco son limitantes de la biosíntesis
de cisteína. Las plantas parecen poseer bastante capacidad y
actividades de captación de sulfato como para convertir el sulfato
en sulfuro a fin de asegurar cantidades suficientes de azufre
reducido, necesario para la producción de cisteína. Finalmente vale
la pena mencionar, que los resultados presentados de conformidad con
la presente invención muestran directamente la conexión entre la
cisteína libre y el glutatión. Los mayores niveles de cisteína en
las plantas de papa transgénica estimulan la biosíntesis del
glutatión, conduciendo a niveles del tripéptido, que son hasta dos
veces mayores en comparación con los de las plantas silvestres. Esto
sugiere, que la biosíntesis de glutatión en las hojas de papa está
limitada por la disponibilidad de cisteína. Experimentos
recientemente realizados con álamo confirman estos resultados
(Strohm, 1995; Noctor, 1996).
Según se ha divulgado en los experimentos
realizados de conformidad con la presente invención, las plantas
poseen bastante capacidad y actividades de captación de sulfato como
para convertir el sulfato en sulfuro a fin de asegurar cantidades
suficientes de azufre reducido, necesario para la biosíntesis de
compuestos que contienen azufre. Por lo tanto, basándose en los
hallazgos de la presente invención, se puede esperar que
introduciendo
cisteína-\gamma-sintasa, la
primera enzima específica de la vía biosintética de la metionina en
las plantas transgénicas, se pueda aumentar significativamente el
contenido de metionina en las plantas en comparación con el de las
plantas silvestres. En este sentido, se observa que un aumento de al
menos 10% del contenido de compuestos que contienen azufre en las
plantas ya le confiere efectos ventajosos, por ejemplo mayor
tolerancia al estrés abiótico. Preferentemente el contenido de estos
compuestos aumenta en al menos aproximadamente 50%, muy
preferentemente en 100% y se prefiere particularmente que el aumento
del contenido de compuestos que contienen azufre sea de más de 1
vez, preferentemente de 2 veces. Locke, Keystone Meeting
6.-11.4.1997, Abstract 306 (1997) informó del aumento de metionina
en 3 a 5 veces cuando se expresa C\gammaS en las plantas. Dado que
la introducción de SAT da como resultado un aumento del sustrato de
C\gammaS se espera que al introducir la C\gammaS en las plantas
de la invención que expresan SAT o viceversa el aumento del
contenido de compuestos que contienen azufre aumente adicionalmente
en aproximadamente 1 a 10 veces más, preferentemente en 5 a 10
veces más.
En una materialización preferida de la
invención, dicha proteína que tiene actividad de SAT es una serina
acetiltransferasa derivada de procariotas o arquebacterias. Los
organismos procariotas pueden incluir bacterias gramnegativas así
como grampositivas, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium,
Serratia marcescens, Bacillus subtilis y diversas especies
dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus,
aunque también se pueden emplear otros. Por ejemplo, las moléculas
de ácido nucleico que codifican las proteínas que tienen actividad
de SAT se pueden obtener a partir de la tecnología anterior (p. ej.,
Bogdanova, FEBS Lett. 358 (1995), 43-47; Denk, J.
Gen. Microbiol. 133 (1987), 515-525; Evans, J.
Bacteriol. 173 (1991), 5.457-5.469).
Por otra parte, en el método de acuerdo con la
invención las moléculas de ácidos nucleicos se pueden usar
hibridándolas a las moléculas de ácidos nucleicos descritas
anteriormente y que codifican una proteína que tiene actividad de
SAT. Dichas moléculas de ácidos nucleicos se pueden aislar p. ej. de
bibliotecas, como bibliotecas de ADNc o genotecas mediante técnicas
bien conocidas por los técnicos en la materia. Por ejemplo, las
moléculas de ácido nucleico hibridantes se pueden identificar y
aislar utilizando las moléculas de ácidos nucleicos descritas antes
conocidas en el ambiente o fragmentos o complementos de éstas como
sondas para cribar genotecas mediante la hibridación con dichas
moléculas según técnicas corrientes. También es posible el
aislamiento de dichas moléculas de ácidos nucleicos aplicando la
reacción en cadena de la polimerasa (RCP) usando como cebadores
oligonucleótidos derivados de las moléculas de ácidos nucleicos
descritas antes. Las moléculas de ácidos nucleicos que se hibridan
con cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos mencionadas
precedentemente también incluyen fragmentos, derivados y variantes
alélicas de las moléculas de ácidos nucleicos descritas antes que
codifican una proteína que tiene actividad de SAT o los fragmentos
biológicamente activos de éstas. Se entiende que los fragmentos son
partes de moléculas de ácidos nucleicos suficientemente largos como
para codificar la proteína descrita o un fragmento de ésta que tenga
actividad biológica según se definió antes.
El término "derivado" significa en este
contexto que la secuencia de nucleótidos de estas moléculas de
ácidos nucleicos difiere de las secuencias de las moléculas de
ácidos nucleicos descritas antes en una o más posiciones de los
nucleótidos y que tienen una gran homología con dichas moléculas de
ácidos nucleicos. Se entiende que homología hace referencia a una
identidad de secuencia de al menos 40%, particularmente una
identidad de al menos 60%, preferentemente más del 80% y aún más
preferentemente más del 90%. Las desviaciones con respecto a las
secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos descritas antes
pueden, por ejemplo, ser el resultado de una o más sustituciones,
supresiones, agregados, inserciones y/o recombinaciones de
nucleótidos ya sea solas o en combinación, que pueden ocurrir
naturalmente o producirse a través de las técnicas de ADN
recombinante bien conocidas por los técnicos en la materia; consulte
por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y
Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing
Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Homología significa
además que las moléculas de ácidos nucleicos o proteínas codificadas
respectivas son funcional y/o estructuralmente equivalentes. Las
moléculas de ácidos nucleicos que son homólogas a las moléculas de
ácidos nucleicos descritas antes y que son derivadas de dichas
moléculas de ácidos nucleicos son, por ejemplo, variaciones de
dichas moléculas de ácidos nucleicos que representan modificaciones
que tienen la misma función biológica, en particular que codifican
las proteínas con la misma o sustancialmente la misma actividad
biológica según se definió aquí. Puede haber variaciones de origen
natural, como secuencias que codifican la proteína SAT de otros
procariotas y plantas o mutaciones. Estas mutaciones pueden ocurrir
naturalmente o pueden obtenerse mediante técnicas de mutagénesis,
consulte más arriba. Las variaciones alélicas pueden ser variantes
alélicas de origen natural así como variantes producidas
sintéticamente o modificadas genéticamente; consulte más arriba. Por
ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las SAT de plantas
comparten semejanzas significativas con las serina
acetiltransferasas bacterianas (Vuorio, 1994; Bogdanova y Hell,
1997). La región más conservada dentro de todas las SAT, tanto las
de plantas como las de bacterias, se ubica en el C terminal y se ha
sugerido que le confiere actividad de transferasa (Vaara, 1992;
Vuorio, 1994). En esta región conservada está presente un motivo
hexapéptido que se ha propuesto como un dominio catalítico en las
acetiltransferasas bacterianas y que recientemente se ha demostrado
que también está presente en la región de contacto de
OAS-TL/SAT en el complejo de la cisteína sintasa de
Arabidopsis thaliana (Bogdanova y Hell, 1997). Además, las
moléculas de ácidos nucleicos se pueden emplear de conformidad con
la presente invención que codifica homólogos o análogos de las
proteínas descritas anteriormente que tienen actividad de SAT pero
donde por lo demás no están relacionadas con esas proteínas. Por
ejemplo, malY de E. coli codifica una enzima que participa en
la captación y metabolismo de la maltosa y las maltodextrinas del
sistema de maltosa de la E. coli pero tiene además actividad
enzimática de
cistationina-\beta-liasa; consulte
Zdych, J. Bacteriol. 177 (1995), 5.035-5.039. Sin
embargo, dichas proteínas no son homólogas entre sí sobre la base
del análisis de homología de la secuencia de aminoácidos. Dichas
proteínas que no presenta homologías significativas con las
proteínas SAT comunes pueden ser identificadas por un técnico con
experiencia en la materia usando las técnicas bien conocidas en el
ambiente, por ejemplo, mediante complementación de los genes
mutantes que participan en la vía biosintética de la cisteína o la
metionina, por ejemplo, en las cepas de E. coli mutantes
correspondientes; consulte también Zdych, más arriba.
Las proteínas codificadas por los diversos
derivados, variantes, homólogos o análogos de las moléculas de
ácidos nucleicos descritas antes pueden compartir características
específicas comunes, como el peso molecular, la reactividad
inmunológica, la conformación, etc., así como propiedades físicas,
como la movilidad electroforética, el comportamiento cromatográfico,
los coeficientes de sedimentación, el pH óptimo, la temperatura
óptima, la estabilidad, la solubilidad, las propiedades
espectroscópicas, etc. Todas estas moléculas de ácidos nucleicos y
derivados se pueden emplear de conformidad con la presente invención
en tanto la actividad enzimática de la proteína codificada
permanezca sustancialmente inalterada en la clase, concretamente que
la proteína tenga actividad de SAT según se definió antes.
En una materialización preferida del método de
la invención, la molécula de ácido nucleico está unida operablemente
a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito
capaz de dirigir la(s) proteína(s) a un compartimiento
celular deseado. La molécula de ácido nucleico se puede modificar de
modo que la proteína codificada se ubique en cualquier
compartimiento deseado de la célula de la planta. Estos incluyen el
retículo endoplasmático (KDEL, Schouten, Plant Mol. Biol. 30 (1996),
781-793), la vacuola (Neuhaus, PNAS 88 (1991),
10.362-10.366), la mitocondria (Chaumont, Plant Mol.
Biol. 24 (1994), 631-641), los plástidos (Fuhr, EMBO
J. 5 (1986), 2.063-2.071), el apoplasto (von
Schaewen, EMBO J. 9 (1990), 3.033-3.044), el
citoplasma, etc. Los métodos para llevar a cabo estas modificaciones
y las secuencias señal que aseguran la ubicación en un
compartimiento deseado son bien conocidos por los técnicos con
experiencia en la materia. Preferentemente, dicho compartimiento
celular es un plástido. Según se describe en los ejemplos adjuntos,
la proteína que tiene actividad de SAT se dirigió al interior del
cloroplasto mediante la fusión traduccional a la secuencia señal 5'
de la subunidad pequeña de rubisco.
La molécula de ácido nucleico utilizada en el
método de la invención está unida operablemente a las secuencias
reguladoras que permiten la expresión de las moléculas de ácidos
nucleicos en las células de las plantas. Preferentemente, dichos
elementos reguladores comprenden un promotor activo en las células
de las plantas. La expresión comprende la transcripción de la
molécula de ácido nucleico en un ARNm traducible. Los elementos
reguladores que aseguran la expresión en las células de las plantas
son bien conocidos por los técnicos con experiencia en la
materia.
Estos elementos reguladores pueden ser
heterólogos u homólogos con respecto a la molécula de ácido nucleico
que se va a expresar así como con respecto a la especie de la planta
que se va a transformar. En general, tales elementos reguladores
comprenden un promotor activo en las células de las plantas. Para
obtener expresión en todos los tejidos de una planta transgénica, se
usan preferentemente promotores constitutivos, como el promotor 35S
de CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810-812) o
promotores de los genes de poliubiquitina del maíz (Christensen,
Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675-689). Para lograr
expresión en tejidos específicos de una planta transgénica es
posible usar promotores específicos de los tejidos (consulte, p.
ej., Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2.245-2.251). Se
conocen también promotores que son específicamente activos en los
tubérculos de las papas o en las semillas de diferentes especies de
plantas, como maíz, Vicia, trigo, cebada etc. Se pueden usar
promotores inducibles para poder controlar exactamente la expresión.
Un ejemplo de promotores inducibles son los promotores de los genes
que codifican proteínas de choque térmico. También se han descrito
elementos reguladores específicos de microsporas y sus usos
(WO96/16182). Además, se puede emplear el sistema de prueba
químicamente inducible (Gatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991);
229-237). Los técnicos con experiencia en la materia
conocen otros promotores adecuados que se describen, por ejemplo, en
Ward (Plant Mol. Biol. 22 (1993), 361-366). Los
elementos reguladores pueden comprender además potenciadores de la
transcripción y/o la traducción funcionales en las células de las
plantas. Potenciadores traduccionales de planta que se usan a menudo
son, por ejemplo, las secuencias omega de CaMV y/o la inclusión de
un intrón (Intrón-1 del gen de Shrunken del maíz,
por ejemplo) que se ha demostrado que aumenta los niveles de
expresión hasta en 100 veces. (Maiti, Transgenic Research 6 (1997),
143-156; Ni, Plant Journal 7 (1995),
661-676). Además, los elementos reguladores pueden
incluir señales de terminación de la transcripción, como una señal
de poliadenilación, que lleva al agregado de una cola
poli-A al transcrito que puede mejorar su
estabilidad. Las señales de terminación que se emplean generalmente
provienen del gen de la nopalina sintasa o del ARN del promotor 35S
de CaMV.
En una materialización preferida del método de
la invención, dicho promotor es inducible o es expresado
constitutivamente y/o es un promotor específico de una célula, un
tejido o un órgano. Preferentemente, dicho promotor es específico
del tubérculo, específico de la semilla, específico del endosperma,
específico del embrión o específico del floema. Los ejemplos de
dichos promotores incluyen pero no exclusivamente al promotor B33 de
patatin (específico del tubérculo, Rocha-Sosa, EMBO
J. 8 (1989), 23), el promotor de la faseolina (específico de la
semilla, Karchi, Plant J, 3 (1993), 721-727), el
promotor de la glutenina HMW (específico del endosperma, Helford,
Theor. Appl. Genet 75 (1987), 117-126), el promotor
de la \alpha,\beta-conglicina (específico del
embrión, Fujiwara, Plant Cell Reports 9 (1991),
602-606), el promotor de rolC (específico del
floema, Lerchl, Plant Cell 7 (1995), 259-270).
La presente invención también describe vectores,
particularmente plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros
vectores que se utilizan convencionalmente en manipulación genética
que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica una
proteína que tiene actividad de SAT. Se pueden usar métodos que son
bien conocidos por los técnicos con experiencia en la materia para
construir diversos plásmidos y vectores; consulte por ejemplo, las
técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current
Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and
Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternativamente, las moléculas y
vectores de ADN recombinante de la invención pueden reconstituirse
en los liposomas para ser entregados a las células deseadas.
De manera ventajosa los vectores descritos
anteriormente comprenden un marcador seleccionable y/o evaluable.
Los marcadores genéticos seleccionables útiles para la selección de
las células de las plantas, el callo, el tejido de las plantas y las
plantas transformadas son bien conocidos por los técnicos con
experiencia en la materia y comprenden, por ejemplo, resistencia al
antimetabolito como base para la selección de dhfr, que confiere
resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.)
13 (1994), 143-149); npt, que confiere resistencia a
los aminoglicósidos neomicina, kanamicina y paromicina
(Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983),
987-995) e hygro, que confiere resistencia a la
higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se han
descrito otros genes seleccionables, concretamente trpB, que
permite que las células utilicen indol en lugar de triptofano; hisD,
que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina
(Hartman, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8.047); la isomerasa
de manosa-6-fosfato que permite que
las células utilicen manosa (WO 94/20627) y ODC
(ornitina-descarboxilasa) que confiere resistencia
al inhibidor de la ornitina-descarboxilasa,
2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO
(McConlogue, 1987, en: Current Communications in Molecular Biology,
Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus
terreus que confiere resistencia a Blasticidin S (Tamura, Biosci.
Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2.336-2.338). Los
marcadores evaluables útiles también son conocidos por los técnicos
con experiencia en la materia y se encuentran a la venta. De manera
ventajosa, dicho marcador es un gen que codifica luciferasa
(Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J.
Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS
Lett. 389 (1996), 44-47) o
\beta-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987),
3.901-3.907). Esta materialización es
particularmente útil para el cribado simple y rápido de las células,
los tejidos y los organismos que contienen un vector de la
invención.
El método de la invención es útil en particular
para la manipulación genética de las células de las plantas, el
tejido de las plantas y las plantas para aumentar su contenido de
compuestos que contienen azufre y para obtener plantas con fenotipos
modificados, preferentemente con fenotipos mejorados o útiles. Por
lo tanto, la presente invención proporciona un método para la
producción de plantas transgénicas, células o tejido de plantas
transgénicas que consiste en la introducción de una molécula de un
ácido nucleico que codifica una proteína con actividad de SAT que
está unida operablemente a elementos reguladores que permiten la
expresión en las células de las plantas en el genoma de dichas
plantas, dichas células de las plantas o dicho tejido de las
plantas.
Los métodos para la introducción de ADN extraño
en las plantas también son bien conocidos por los técnicos en la
materia. Estos incluyen, por ejemplo, transformación de las células
de las plantas, el tejido de las plantas o las plantas con
ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogenes, fusión de los protoplastos,
transferencia directa de genes (consulte, p. ej.,
EP-A 164 575), inyección, electroporación, métodos
biolísticos como bombardeo de partículas y otros métodos conocidos
por los técnicos en la materia. Los vectores usados en el método de
la invención pueden contener otros elementos funcionales, por
ejemplo secuencias de ADN-T del "borde
izquierdo" y del "borde derecho" de Agrobacterium que
permiten la integración estable en el genoma de la planta. Además,
los técnicos con experiencia en la materia conocen métodos y
vectores que permiten la generación de plantas transgénicas exentas
de marcador, es decir el gen marcador seleccionable o evaluable se
pierde en una cierta etapa del desarrollo de la planta o del
mejoramiento de la planta. Esto se puede lograr mediante, por
ejemplo, cotransformación (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13 (1989),
151-161; Peng, Plant Mol. Biol. 27 (1995),
91-104) y/o mediante el uso de sistemas que utilizan
enzimas capaces de promover la recombinación homóloga en plantas
(consulte, p. ej., WO97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992),
353-361); Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242 (1994),
653-657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991),
170-176; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19 (1991),
6373-6378). Métodos para la preparación de vectores
apropiados son descritos por, p. ej., en Sambrook (Molecular
Cloning; A Laboratory Manual, 2da Edición (1989), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Cepas de Agrobacterium tumefaciens y
vectores adecuados así como transformación de Agrobacterias y medios
de cultivo y de selección apropiados son bien conocidos por los
técnicos con experiencia en la materia y se describen en la
tecnología anterior (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204
(1986), 383-396; C58C1 (pGV 3850kan), Deblaere,
Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic, Acid Res. 12
(1984), 8.711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989),
8.467-8.471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992),
963-976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging
and expression studies, In: Plant Molecular Biology Manual Vol 2,
Gelvin y Schilperoort (Eds.), Dordrecht, Países Bajos: Kluwer
Academic Publ. (1994), 1-22;
EP-A-120 516; Hoekema: The Binary
Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam
(1985), Chapter V, Fraley, Crit, Rev. Plant. Sci., 4,
1-46; An, EMBO J. 4 (1985),
277-287). Aunque en el método de la invención se
prefiere el uso de Agrobacterium tumefaciens, se pueden usar
otras cepas de
Agrobacterium, como Agrobacterium rhizogenes, por ejemplo, si se desea un fenotipo conferido por dicha cepa.
Agrobacterium, como Agrobacterium rhizogenes, por ejemplo, si se desea un fenotipo conferido por dicha cepa.
Los métodos para la transformación utilizando
métodos biolísticos son bien conocidos por los técnicos en la
materia; consulte, p. ej., Wan, Plant Physiol. 104 (1994),
37-48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993),
1.553-1.558 y Christou (1996) Trends in Plant
Science 1, 423-431. La microinyección se puede
realizar según se describe en Potrykus y Spangenberg (eds.), Gene
Transfer To Plants. Springer Verlag, Berlín, NY (1995).
La transformación de la mayoría de las plantas
dicotiledóneas es posible con los métodos descritos
anteriormente.
Pero también para la transformación de plantas
monocotiledóneas se han desarrollado varias técnicas de
transformación exitosas.
Estas incluyen la transformación usando métodos
biolísticos como, p. ej, los descritos anteriormente así como
transformación del protoplasto, electroporación de células
parcialmente permeabilizadas, introducción de ADN usando fibras de
vidrio, etc.
En general, las plantas, las células y el tejido
de las plantas que pueden modificarse con una molécula o vector de
ADN recombinante de acuerdo con la invención y que presentan
(sobre)expresión de una proteína que tiene actividad de SAT y
opcionalmente de C\gammaS, respectivamente, se pueden derivar de
cualquier especie de planta deseada. Pueden ser plantas
monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, preferentemente
pertenecen a especies de plantas de interés en la agricultura, el
cultivo de la madera o la horticultura, como las plantas cultivadas
(por ejemplo, maíz, arroz, cebada, trigo, centeno, avenas. etc.),
papas, plantas que producen aceite (p. ej., colza oleaginosa,
girasol, maní, soja, etc.), algodón, remolacha azucarera, caña de
azúcar, plantas leguminosas (p. ej., frijoles, guisantes etc.),
plantas que producen madera, preferentemente árboles, etc.
La presente invención también describe células
de plantas transgénicas que contienen establemente integrada en el
genoma una molécula de un ácido nucleico que codifica una proteína
que tiene actividad de SAT unida a elementos reguladores que
permiten la expresión de la molécula del ácido nucleico en las
células de las plantas y donde la molécula del ácido nucleico es
extraña a la célula de la planta transgénica.
Por "extraña" se quiere dar a entender que
la molécula del ácido nucleico es o bien heteróloga con respecto a
la célula de la planta, esto significa derivada de una célula o un
organismo con antecedentes genómicos diferentes, o bien es homóloga
con respecto a la célula de la planta pero está ubicada en un
entorno genómico diferente del homólogo de origen natural de dicha
molécula de ácido nucleico. Esto significa que, si la molécula de
ácido nucleico es homóloga con respecto a la célula de la planta, no
está ubicada en su ubicación natural en el genoma de dicha célula de
la planta, en particular está rodeada por genes diferentes. En este
caso la molécula de ácido nucleico puede estar o bien bajo el
control de su propio promotor o bien bajo el control de un promotor
heterólogo.
La presencia y expresión de la molécula del
ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad de SAT
en las células de la planta transgénica lleva a la síntesis de
proteína(s) que tiene(n) una influencia sobre, p. ej.,
la resistencia al estrés de las células de la planta y lleva a los
cambios fisiológicos y fenotípicos correspondientes en las plantas
que contienen dichas células. Según se describe en los ejemplos
adjuntos, las plantas que expresan constitutivamente SAT de E.
coli presentan altos niveles de cisteína. Además, el contenido
del tripéptido glutatión
(\gamma-glutamil-cisteinil
glicina) fue considerablemente mayor que en las plantas silvestres,
porque este compuesto es la principal forma de almacenamiento del
azufre reducido del reino vegetal y sirve como vertedero principal
de la cisteína producida. El glutatión desempeña no sólo un papel
esencial en la regulación de la nutrición azufrada, sino que también
es un factor importante en la defensa de las plantas contra diversas
formas de estrés, incluidas intensidades luminosas elevadas, sequía,
frío, calor y deficiencia de minerales (Smith, 1990; Rennenberg y
Brunold, 1994). El tripéptido se sintetiza en plantas así como en
otros organismos en dos reacciones catalizadas por enzimas a partir
de los aminoácidos constituyentes (Meister y Anderson, 1983;
Rennenberg, 1995).
Según se trató precedentemente, la
cisteína-\gamma-sintasa es capaz
de usar cisteína como el sustrato que contiene azufre. Por
consiguiente, puesto que se ha demostrado en el curso de la presente
invención, que las plantas transgénicas que sobreexpresan una
proteína que tiene actividad de SAT tienen un contenido
considerablemente mayor de cisteína, se puede concebir que la
coexpresión de una molécula de un ácido nucleico que codifica una
proteína que tiene actividad de C\gammaS debería asegurar un
efecto sinérgico en la producción de metionina, ya que ambos la
enzima clave de la vía biosintética de la metionina y su sustrato,
son sobreproducidos en las plantas.
La célula de la planta transgénica descrita
también puede comprender un marcador seleccionable. Como se
describió anteriormente, se pueden emplear diversos marcadores
seleccionables de conformidad con la presente invención. De manera
ventajosa, se pueden usar marcadores seleccionables que sean
adecuados para la selección directa de las plantas transformadas,
por ejemplo, el gen de la
fosfinotricin-N-acetiltransferasa el
producto génico de la cual detoxifica el herbicida
L-fosfinotricina (glufosinato o BASTA); consulte,
por ejemplo, De Block, EMBO J. 6 (1987), 2.513-2.518
y Dröge, Planta 187 (1992), 142-151.
Además, la presente invención también describe
plantas transgénicas y tejido de plantas transgénicas que comprenden
las células de plantas transgénicas descritas antes. Estas pueden
presentar, por ejemplo, una mejor resistencia al estrés.
Preferentemente, el nivel de glutatión, cisteína y/o metionina en la
planta transgénica de la invención es más mayor en comparación con
el de una planta silvestre. Un aumento del nivel de glutatión,
cisteína y/o metionina se entiende que hace referencia a un
contenido elevado de cualquiera de los compuestos que contienen
azufre mencionados precedentemente, ya sea solo o en combinación, en
las células o el tejido de las plantas transgénicas o en las plantas
transgénicas de la presente invención en el orden de al menos
aproximadamente 10% en comparación con la célula o el tejido de la
planta silvestre o la planta silvestre sin transformar,
correspondientes, lo cual ya asegura efectos benéficos sobre la
vitalidad de la planta como, p. ej., mejor tolerancia al estrés. De
manera ventajosa, el contenido de los compuestos descritos
anteriormente aumenta en al menos aproximadamente un 50%,
preferentemente en más de aproximadamente un 75%, se prefiere
particularmente que aumente al menos aproximadamente un 100% o más y
se prefiere aún más que aumente más de aproximadamente un 200%.
Considerando el contenido de cisteína, metionina y glutatión
combinados se puede lograr incluso un aumento en 10 a 20 veces de
los compuestos que contienen azufre en comparación con el nivel de
cisteína libre en las plantas silvestres aunque se conciben aumentos
mayores de compuestos que contienen azufre en las plantas de la
presente invención.
De manera ventajosa, el nivel de cisteína libre
en las plantas descritas es aproximadamente superior a 20 nmol por
gramo de peso fresco (gpf) de tejido de hoja, preferentemente
superior a 30 nmol/gpf y más preferentemente superior a 40 nmol/gpf,
vea también el Ejemplo 2. Además, el contenido de glutatión en las
plantas descritas puede ser preferentemente superior a 350 nmol/gpf,
más preferentemente superior a 500 nmol/gpf. El contenido de
metionina se puede aumentar en al menos aproximadamente 5 veces,
preferentemente en más de 10 veces.
La invención también describe partes cosechables
y material de propagación de las plantas transgénicas descritas los
cuales contienen células de las plantas transgénicas descritas
precedentemente y/o derivan de las plantas descritas precedentemente
y presentan mayores niveles de compuestos que contienen azufre según
se describió antes. Las partes cosechables pueden ser en principio
cualquier parte útil de una planta, por ejemplo, hojas, tallos,
fruto, semillas, raíces, etc. El material de propagación incluye,
por ejemplo, semillas, frutos, gajos, almácigos, tubérculos,
portainjertos, etc.
Además, la presente invención divulga el uso de
una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene
actividad de SAT para la producción de plantas transgénicas que
presenten un mayor nivel de glutatión, cisteína y/o metionina.
Preferentemente, dicho mayor nivel de metionina o cisteína da lugar
a procesos de maduración acelerados, flores alteradas y/o
resistencia a patógenos.
La expresión constitutiva del gen cysE de
SAT de E. coli en plantas de papa transgénica demuestra
directamente in vivo, que la reacción catalizada por SAT es
en verdad limitante de la tasa en la vía biosintética de la cisteína
en plantas, como se ve por los altos niveles de cisteína en los
transformantes; vea los ejemplos adjuntos. Además, según se trató
antes, se espera que los correspondientes niveles altos de glutatión
en las plantas transgénicas puedan conferir resistencia contra
diversas formas de estrés. En las plantas el glutatión juega un
papel importante en la defensa contra las especies de oxígeno
activo, xenobióticos, metales pesados y otras formas de estrés
incluidos sequía, calor y deficiencia de minerales (Alscher, 1989;
Smith, 1990; Schmidt y Jäger, 1992; Rennenberg y Brunold, 1994;
Rennenberg, 1995). El conocimiento acerca de esto también tiene
importancia práctica. La mayor resistencia de las plantas contra las
especies de oxígeno activo puede desempeñar un papel muy importante
en el futuro, pensando en las concentraciones elevadas de ozono en
la atmósfera. Además, es razonable una mayor tolerancia contra los
xenobióticos, por ejemplo los herbicidas, como resultado de mayores
niveles de glutatión en las plantas de la invención. Por otra parte,
una posible estrategia es construir plantas transgénicas que sean
capaces de crecer en concentraciones mayores de iones de metales
pesados y que por consiguiente podrían usarse para biorremediación.
Por otra parte, las moléculas y vectores de ADN recombinante
descritos pueden ser útiles para alterar o modificar la interacción
planta/patógeno. El término "patógeno" incluye, por ejemplo,
bacterias, virus y hongos así como protozoarios.
Según se trató antes, las células o el tejido de
plantas transgénicas y las plantas transgénicas descritas se pueden
usar para mejorar los efectos tóxicos de los contaminantes del suelo
incluida la economía de agua. Los contaminantes pueden ser de origen
natural o ser causados por la minería, las actividades industriales
y urbanas. Dichos contaminantes comprenden compuestos que pueden
inactivar proteínas que contienen azufre, en particular las enzimas,
o actuar como antagonistas o inhibidores de la vía biosintética de
la cisteína y/o la metionina. Son ejemplos de dichos antagonistas o
inhibidores los herbicidas, fungicidas, pesticidas o particularmente
los iones metálicos, por ejemplo, Hg^{2+}. Por ejemplo, debido a
los niveles elevados de GSH conferidos por la expresión de las
moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína que tiene
actividad de SAT en las plantas descritas anteriormente, es posible
emplear suelo para agricultura que de otro modo no sería adecuado
debido a la presencia de, por ejemplo, compuestos tóxicos que
interfieren con enzimas que contienen azufre y por lo tanto con el
crecimiento de las plantas. Esto es en particular cierto para el
suelo que contiene grandes cantidades de metales pesados. Es más,
las células de la planta, el tejido de la planta y las plantas de la
presente invención se pueden usar para la remediación del suelo
contaminado. Un efecto secundario ventajoso es que mediante, por
ejemplo, la mayor tolerancia a los metales debida a la presencia de
la molécula o vector de ADN recombinante de la invención, las
células de la planta, el tejido de la planta y la planta de la
presente invención se pueden usar para "bioprospección minera"
(Cunningham, TIBTECH 13 (1995), 393-397). Esto
significa que las plantas, el tejido de las plantas y las células de
las plantas de la presente invención se pueden usar para la
fitoextracción de metales como mercurio, níquel y cobre. Por otra
parte, como se mencionó anteriormente un mayor contenido de GSH en
las células o el tejido de las plantas y las plantas descritos
pueden asegurar una mayor resistencia. Además, el alto nivel de GSH
presente en las células o tejidos de las plantas y en las plantas
descritos antes se espera que dé como resultado un crecimiento de
los almácigos y una producción de biomasa mejores. En resumen, el
aumento del contenido de GSH tiene múltiples efectos sobre la
vitalidad de las plantas y es de particular interés para el
fitogenetista.
Por lo tanto, la presente invención también
describe el uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una
proteína que tiene actividad de SAT, una célula de una planta, una
planta o un tejido de una planta de la invención o, partes
cosechables o material de propagación de ésta, para la producción de
alimentos y piensos, para el mejoramiento de la resistencia a los
patógenos, para conferir tolerancia a los metales pesados o los
herbicidas, para mejorar la producción de biomasa, para potenciar el
crecimiento de los almácigos, para conferir tolerancia contra el
estrés biótico o abiótico, o para mejorar el sabor y/o gusto de los
alimentos o piensos. El uso de la molécula o vector de ADN
recombinante descritos para conferir tolerancia a los herbicidas
incluye, por ejemplo, su uso como marcadores seleccionables en
plantas de acuerdo con otros sistemas que emplean
(sobre)expresión de enzimas capaces de conferir tolerancia
(es decir resistencia) a los efectos de eliminación (muerte) de las
células de la planta de los herbicidas. Un ejemplo de dicho sistema
es la sobreexpresión de la enzima
5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato
(EPSP) sintasa que confiere tolerancia al herbicida glifosato. De
manera similar, las moléculas y vectores de ADN recombinante
descritos se pueden usar para conferir tolerancia contra compuestos
que actúan sobre las enzimas que contienen azufre mediante, p. ej.,
el secuestro del compuesto que es responsable de la inhibición de
dichas enzimas mediante el alto contenido de cisteína, GSH y/o
metionina mediante péptidos y proteínas que están presentes en
mayores niveles debido al elevado contenido de los aminoácidos que
contienen azufre.
Como se describió antes, el valor nutricional de
las plantas, del tejido de las plantas y de las células de las
plantas de la invención así como de las partes cosechables y del
material de propagación de dichas plantas mejora considerablemente
debido al mayor contenido de compuestos que contienen azufre. Por lo
tanto, la presente invención también se relaciona con alimentos,
piensos o sus aditivos que comprendan las células de la planta, el
tejido de la planta, la planta, las partes cosechables o el material
de propagación descritos antes. Estos piensos, alimentos y aditivos
tienen preferentemente mayores contenidos de cisteína, metionina y/o
glutatión como se describió precedentemente.
Estas y otras materializaciones se divulgan y se
engloban mediante la descripción y los ejemplos de la presente
invención. Bibliografía adicional referente a cualquiera de los
métodos, usos y compuestos que se van a emplear de conformidad con
la presente invención se pueden encontrar en bibliotecas públicas,
usando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo se puede
utilizar la base de datos pública "Medline" que está disponible
en internet, por ejemplo
en http://www.ncbi.nim.nih.gov/PubMed/medline.html. Otras bases de datos y direcciones como http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, son conocidas por los técnicos con experiencia en la materia y también se pueden obtener utilizando, por ejemplo,
http://www.lycos.com. Una visión general de la información sobre patentes en biotecnología y un informe acerca de fuentes pertinentes de información sobre patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y de temas de actualidad se proporciona en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
en http://www.ncbi.nim.nih.gov/PubMed/medline.html. Otras bases de datos y direcciones como http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, son conocidas por los técnicos con experiencia en la materia y también se pueden obtener utilizando, por ejemplo,
http://www.lycos.com. Una visión general de la información sobre patentes en biotecnología y un informe acerca de fuentes pertinentes de información sobre patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y de temas de actualidad se proporciona en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
Las figuras muestran
Figura
1
(a) Análisis de transferencia Northern del ARN
total extraído de hojas de cinco plantas transgénicas independientes
(SAT-65, 26, 48, 3 y 71) y de dos plantas silvestres
(Control a y b). La hibridación se realizó con una sonda de ADN de
cysE de E. coli marcado con ^{32}P. Los carriles contenían
15 \mug de ARN total cada uno.
(b) Actividad catalítica máxima de SAT en las
hojas de cinco plantas transgénicas independientes
(SAT-65, 26, 48, 3 y 71) y dos plantas silvestres
(Control a y b). La actividad específica de los extractos crudos se
informa en pmol de CoA producida por min y \mug de proteína total.
Las barras de error representan una desviación estándar (< 10%).
N = 4 medidas independientes.
Figura
2
(a) Niveles endógenos de cisteína en hojas de
plantas transgénicas de 6 semanas (SAT-48 y
SAT-26) y plantas silvestres (Control a y b). Las
cantidades de cisteína se informan en nmol por gpf. Las barras de
error representan una desviación estándar (< 20). N = 18; 6
plantas independientes por línea transgénica, 3 medidas
independientes por planta.
(b) Niveles endógenos de glutatión en hojas de
plantas transgénicas de 6 semanas (SAT-48 y
SAT-26) y plantas silvestres (Control a y b). Las
cantidades de glutatión se dan en nmol por gpf. Las barras de error
representan una desviación estándar (< 10), N = 18; 6 plantas
independientes por línea transgénica, 3 medidas independientes por
planta.
Figura
3
Análisis de transferencia Northern del ARN total
extraído de hojas de cinco plantas transgénicas independientes
(SAT-65, 26, 48, 3 y 71) y de dos plantas silvestres
(Control a y b). La hibridación se realizó con una sonda de ADNc de
OAS-TL plastídica de papa marcada con ^{32}P (p) y
también con una isoforma citosólica (c). Los carriles contenían 15
\mug de ARN total cada uno.
Figura
4
Actividad in vitro de
OAS-TL en hojas de plantas transgénicas
(SAT-48 y 26) y de plantas silvestres (Control a y
b). La actividad específica de los extractos crudos se informa en
pmol de cisteína producida por min y \mug de proteína total. Las
barras de error representan una desviación estándar (< 10%). N =
4 medidas independientes.
Los ejemplos ilustran la invención:
Ejemplo
1
Para dirigir la SAT de E. coli a los
cloroplastos de las plantas se construyó una fusión de genes con un
péptido de tránsito de Rubisco de Arabidopsis. Se amplificó
ADN genómico de SAT de E. coli por RCP usando dos
oligonucleótidos sintéticos (EcSAT-N; 5'-GAG
AGA CCA TGG CGT GTG AAG AAC TGG AAA, EcSAT-C:
5'-GAG AGA TCT AGA TTA GAT CCC ATC CCC ATA). Se
digirió ADN bicatenario con Nco I y Xba I y se clonó detrás del
péptido de tránsito. El producto génico fusionado se insertó como
fragmento Asp 718/Xho I en un vector binario predigerido con
Asp 718/Sal I (Höfgen y Willmitzer, 1990) bajo el
control del promotor 35S de CaMV. El plásmido se introdujo en papa
a través de Agrobacterium Tumefaciens (Solanum
tuberosum cv Désirée) según describen Rocha-Sosa
et al. (1989). La Solanum tuberosum cv Désirée se
obtuvo de Vereinigte Saatzuchten eG (Ebstorf, Alemania). Las plantas
transgénicas y silvestres se mantuvieron en cultivo tisular durante
un período de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad en medio
Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962) complementado con 2%
(p/v) de sacarosa a 22ºC. En el invernadero, las plantas se hicieron
crecer a 22ºC durante el período de luz (16 horas) y a 15ºC durante
el período de oscuridad (8 horas). Las plantas se cultivaron en
macetas separadas y se regaron continuamente.
Las plantas de papa transgénica mantenidas en
cultivo tisular fueron visualmente indistinguibles de las plantas de
control sin transformar. Para cribar plantas que expresaran el ARNm
de SAT de E. coli, se seleccionaron al azar cincuenta plantas
para tomar muestras de hojas. Estas muestras se sometieron a
análisis de ARN por transferencia en gel usando como sonda ADNc de
SAT de E. coli marcado radiactivamente. Para el aislamiento
del ARN, el material de hojas de la planta se congeló en nitrógeno
líquido inmediatamente después de la cosecha. El ARN total se
extrajo del material congelado según Logemann et al. (1987).
Después de la desnaturalización a 65ºC el ARN total se separó en
condiciones de desnaturalización mediante electroforesis en gel
(Lehrach, 1977) y después se transfirió a membranas de nylon. La
hibridación de Northern se realizó a una temperatura apropiada según
describe Amasino (1986). Las transferencias de Northern se lavaron
tres veces durante 30 min a 55ºC en 0,5 x SSC; SDS al 0,2%. Se
realizó el marcado de los fragmentos con ^{32}P con el juego de
reactivos "Multiprime DNA-labelling" (Amersham
Buchler, Braunschweig, Alemania). Se seleccionaron cinco
transformantes independientes que acumulaban altas cantidades de
ARNm de SAT para el análisis posterior y se transfirieron al
invernadero. La repetición del análisis de Northern reveló, que
también en condiciones de invernadero los transformantes acumulaban
altas cantidades del ARNm extraño (figura 1a). La longitud de la
transcripción detectada en las plantas de papa transgénica
(\approx 1.050 pares de bases) estuvo de acuerdo con la longitud
informada para el gen cysE, concretamente 819 bp (Denk y
Böck, 1987) y la secuencia señal usada de rubisco (\approx 240
bp). Para medir la actividad enzimática de SAT se utilizó un
análisis que sigue un método de Kredich y Tomkins (1966). Este
método se basa en un intercambio de disulfuro entre CoA, liberada de
un residuo acetilo durante la reacción catalizada por SAT, y el
ácido
5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoico).
La formación de CoA fue analizada en Tris-HCl 50 mM
(pH 7,6) que contenía ácido
5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoico)
1 mM , EDTA 1 mM, L-serina 20 mM y
acetil-CoA 100 \muM. La reacción se inició
mediante el agregado de 10 \mul de extracto de hoja crudo (1,5
\mug/\mul de proteína total), la temperatura de incubación fue
de 25ºC. La producción de ácido tionitrobenzoico se controló a 412
nm en un espectrofotómetro (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia) contra un blanco de control que contenía todos los
materiales excepto L-serina. La curva de
calibración se estableció con soluciones de control que contenían
todos los materiales y diferentes concentraciones de CoA
(0-200 nmol/ml). El análisis de actividad se repitió
independientemente con diferentes volúmenes de extracto de hojas
crudo, es decir 20, 40 y 60 \mul. El análisis de la actividad de
SAT en los extractos de hojas crudos reveló que las plantas de papa
que expresan el gen de E. coli convierten serina en OAS mucho
más eficientemente que las plantas de control sin transformar
(figura 1b), lo que sugiere que las plantas transformadas poseen
mayor actividad de SAT, que es probablemente debido a la serina
acetiltransferasa extraña de E. coli. A pesar del fuerte
aumento de la actividad de SAT en las hojas de las plantas
transgénicas, ningún cambio drástico en el fenotipo de estas plantas
fue visible con una sola excepción: el transformante 48 mostró una
dominancia apical reducida que dio como resultado un fenotipo
tupido. Interesantemente el transformante 48 tuvo la actividad de
SAT más alta de todas las plantas transgénicas.
Ejemplo
2
La biosíntesis de cisteína en las plantas tiene
lugar mediante una reacción en dos pasos. La formación de cisteína a
partir de sulfuro y
O-acetil-L-serina es
catalizada por O-acetilserina(tiol)liasa. La
O-acetil-L-serina es
sintetizada por serina acetiltransferasa a partir de
acetil-coenzima A y serina (Brunold y Rennenberg,
1997). Para investigar si la expresión del gen cysE en las
plantas de papa influye en los niveles endógenos de cisteína, se
determinó la concentración de este aminoácido que contiene azufre en
plantas transformadas y sin transformar. Se prepararon los tioles
según describen Rüegsegger y Brunold (1992). La separación y
cuantificación fueron realizadas por HPLC en fase reversa después de
la derivatización con monobromobimano según Newton et al.
(1981). Como una modificación, la reducción de los disulfuros se
hizo con bis-2-mercaptoetilsulfona y
la reacción de marcado con monobromobimano se detuvo con HCl al
15%.
El material de hojas congelado se homogeneizó a
un polvo fino y después se extrajo durante 20 min en HCl 0,1 N (2
ml/0,2 gpf) a 4ºC. Después de la centrifugación de la mezcla a 4ºC
(20 min, 14.000 g), se agregaron 120 \mul del sobrenadante a 200
\mul de ácido 2-(ciclohexilamino)etansulfónico 0,2 M (pH
9,3). La reducción de los disulfuros totales se realizó agregando 10
\mul de bis-2-mercaptoetilsulfona
en Tris-HCl 9 mM, EDTA 5 mM (pH 8). Después del
tiempo de reacción de 40 min a temperatura ambiente, los grupos tiol
libres se marcaron con monobromobimano. Con este fin, se agregaron a
la mezcla 20 \mul de monobromobimano 15 mM en acetonitrilo y la
mezcla se mantuvo durante 15 min en la oscuridad a temperatura
ambiente. La reacción se detuvo agregando 250 \mul de HCl 15%.
Después de mantener la mezcla de reacción en hielo durante dos horas
en la oscuridad, se la centrifugó nuevamente a 4ºC (10 min, 14.000
g). Para el análisis de cisteína y glutatión, el sobrenadante se
diluyó adecuadamente con HCl 0,1 N. Las muestras se analizaron según
el método de Schupp y Rennenberg (1988) en una columna de HPLC de
fase reversa (C_{18}, 250 x 4 mm, 5 \mum de tamaño de partícula,
Macherey-Nagel, Oensingen, Suiza). Se usó un sistema
solvente consistente en metanol al 10%; ácido acético al 0,25%, pH
3,9 (NaOH) y metanol al 90%; ácido acético al 0,25% con una
velocidad de flujo de 1,5 ml/min. La cromatografía se siguió
mediante un detector de fluorescencia (excitación: 380 nm, emisión:
480 nm, detector de fluorescencia SFM 25, Kontron, Zürich, Suiza).
Los cromatogramas se cuantificaron por integración de las áreas de
los picos. Para el análisis de cisteína se usaron los dos
transformantes con la actividad de SAT más alta, es decir
SAT-48 y SAT-26 (vea Figura 2b). Con
este fin, se cosecharon y se extrajeron hojas jóvenes y verdes de
plantas de 5 semanas y se les determinó el contenido de cisteína por
HPLC. Las plantas de papa transgénica que expresan el gen
cysE de E. coli presentaron niveles de cisteína
significativamente aumentados (Figura 3a). Los niveles del
transformante SAT-48 fueron casi tres veces mayores
(45 \pm 10 nmol por gramo de peso fresco de tejido de hoja) y los
del transformante SAT-26 dos veces mayores (33 \pm
6 nmol/gpf) que las cantidades encontradas en plantas de control sin
transformar (17 \pm 3 nmol/gpf), lo que indica que la expresión de
cysE lleva a un aumento de los niveles endógenos del
aminoácido cisteína.
Uno de los vertederos principales de la cisteína
producida mediante la cascada de asimilación/reducción de sulfato es
la formación de glutatión, un tripéptido que consiste en los
aminoácidos, glutamato, cisteína y glicina. Debido a que las plantas
de papa transgénica que expresan SAT de E. coli contenían más
cisteína, es posible que esto haya podido tener efecto sobre la
biosíntesis del glutatión, teniendo en mente que la cisteína es un
sustrato para la producción de glutatión. Para investigar si éste es
el caso, se analizaron los niveles de glutatión en hojas de plantas
de las líneas transgénicas SAT-48 y
SAT-26 y en plantas silvestre. Estas medidas
revelaron que ambos transformantes tuvieron niveles de glutatión
significativamente elevados, siendo hasta dos veces mayores
(500-600 nmol/gpf) que en las plantas silvestres
(300-350 nmol/gpf; Figura 3b). Esto sugiere que
mayores niveles de cisteína estimulan la biosíntesis de
glutatión.
Teniendo en cuenta que una molécula de glutatión
contiene una molécula de cisteína y que las cantidades molares
totales de glutatión en hojas de papa son más de 10 veces mayores
que las cantidades molares del aminoácido cisteína libre, se puede
concluir que la capacidad de síntesis de cisteína en las plantas de
papa transgénica aumenta mucho más que sólo dos o tres veces como se
podría pensar prestando atención sólo a los niveles de cisteína
libre. Un aumento absoluto de 200-300 nmol de
glutatión/gpf en las plantas transgénicas es por consiguiente
equivalente a una capacidad biosintética de cisteína aumentada en
aproximadamente 10 a 18 veces, cuando se tienen aproximadamente
15-20 nmol de cisteína/gpf en hojas de plantas
silvestres. Si se agrega a esto los mayores niveles de cisteína
libre en las plantas transgénicas en aproximadamente dos o tres
veces, la biosíntesis de cisteína en los transformantes es
favorecida hasta 20 veces en comparación con las plantas de
control.
Ejemplo
3
Se ha informado de una regulación
metabólicamente significativa de la actividad de SAT mediante
inhibición alostérica de cisteína para la enzima de la sandía
(Saito, 1995). Las SAT bacterianas son retroinhibidas a nivel de la
transcripción por concentraciones micromolares de cisteína. En
contraposición en una situación de limitación de la cisteína, se
estimula la expresión de las SAT bacterianas (Kredich, 1987).
Además, la O-acetilserina(tiol)liasa,
que es la enzima que sigue directamente después de SAT en la cascada
de reacciones de biosíntesis de la cisteína, también es regulada por
cisteína a nivel de la transcripción. Se observó que se estimulaba
la expresión de diferentes ADNc que codifican para isoformas de
O-acetilserina(tiol)liasa de
Arabidopsis específicas del compartimiento en plantas que
crecen con suministro de sulfato limitado, (Hell 1994; Barroso,
1995; Hesse, 1997). También en espinaca la expresión de isoformas de
O-acetilserina(tiol)liasa es
ligeramente favorecida en condiciones de privación de azufre
(Takahashi y Saito, 1996). Para investigar si los mayores niveles de
cisteína en las plantas de papa transgénica que expresan el gen
cysE de E. coli influye en el patrón de expresión de
la OAS-TL endógena de papa, se tomaron muestras de
hojas de plantas transgénicas y sin transformar y se sometieron a
análisis de transferencia de ARN; vea el Ejemplo 1. Para el marcado
radiactivo de los ADNc de OAS-TL de papa (Hesse y
Höfgen, 1998), el ADN se cortó con las enzimas de restricción
apropiadas y se separó en un gel de agarosa al 1%. Los fragmentos de
ADN se aislaron del gel utilizando el juego de reactivos
"NucleoSpin Extract" de Macherey-Nagel (Duren,
Alemania). Este análisis reveló que aunque las plantas transgénicas
contenían significativamente más cisteína en sus hojas, los genes de
OAS-TL de papa (tanto la isoforma citosólica como
cloroplastídica, Hesse y Höfgen, 1998) no se alteraron en su tasa de
transcripción en comparación con la expresión en plantas silvestres
(Figura 3). Esto sugiere que los mayores niveles de cisteína en las
plantas de papa transgénica no tienen influencia detectable en el
patrón de expresión de la OAS-TL de papa a nivel de
la transcripción.
\newpage
Ejemplo
4
La OAS-TL se regula a nivel de
la actividad mediante el estado del azufre dentro de la célula. La
actividad de una O-acetilserina(tiol)liasa
citosólica de Arabidopsis thaliana por ejemplo, es activada
por la limitación de azufre (Barroso, 1995; Hesse, 1997). También se
ha observado aumento de la actividad específica por agotamiento del
azufre en las células de tabaco cultivado y C. reinhardtii y
en hojas de maíz (Bergmann, 1980; Passera y Ghisi, 1982; Leon,
1988). En contraposición las concentraciones altas de azufre parecen
reducir la actividad de OAS-TL. La enzima de
Datura innoxia por ejemplo es inhibida por mayores
concentraciones de sulfuro (Kuske, 1994). En células de C.
reinhardtii la actividad de OAS-TL no es
inhibida sólo por el sulfuro, sino también por la OAS y la cisteína
(León y Vega, 1991). Para averiguar, si la mayor actividad de SAT y
los niveles alterados de cisteína y glutatión en las plantas de papa
transgénica tienen efecto sobre la actividad de
OAS-TL, se realizó para esta enzima un ensayo de
actividad con extractos de hojas crudos. La actividad de
O-acetilserina(tiol)-liasa se analizó
midiendo la producción de L-cisteína. Cada análisis
se inició agregando 5 \mul de extracto de hojas crudo (1
\mug/\mul de proteína total). Las reacciones se llevaron a cabo
en K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 50 mM (pH 7,5) en presencia de
DTT 5 mM, O-acetilserina 10 mM y Na_{2}S 2 mM (volumen
total 100 \mul) y se les permitió proceder durante 20 min a 25ºC.
Se las detuvo mediante el agregado de 50 \mul de ácido
tricloroacético al 20% y después se analizaron para determinar la
producción de L-cisteína usando reactivo de Gaitonde
(Gaitonde, 1967). El contenido de cisteína se controló a 560 nm en
un espectrofotómetro (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala,
Suecia) contra un blanco de control que contenía todos los
materiales excepto O-acetilserina. Los experimentos se
repitieron tres veces. Sin embargo, estas medidas no revelaron
ninguna diferencia en las actividades de OAS-TL
entre los extractos de hojas de plantas transgénicas y silvestres
(Figura 4). Así que se puede especular, que los mayores niveles de
cisteína y glutatión en las plantas transgénicas no sólo no tienen
un efecto detectable sobre el nivel de expresión génica sino que
tampoco tienen efecto sobre la actividad de
OAS-TL.
Ejemplo ilustrativo
5
Se seleccionaron dos líneas transgénicas que
expresan SAT de E. coli (p. ej., SAT-48 y
SAT-26) para la sobreinfección con un constructo de
plásmido binario que contenía un ADNc de C\gammaS p. ej. papa bajo
el control del promotor 35S- y B33, respectivamente. El vector
binario es un derivado de pBIN19 que permite p. ej., la resistencia
la higromicina para la selección de plantas. Los plásmidos se
introdujeron en las líneas transgénicas SAT-48 y
SAT-26, respectivamente a través de Agrobacterium
tumefaciens según describen Rocha-Sosa, (1989).
Las condiciones de selección se eligieron según se describe en el
Ejemplo 1. Las líneas transgénicas sobreinfectadas que expresaban
SAT de E. coli y C\gammaS se sometieron a cribado a nivel
del ARN (transferencia Northern), a nivel proteico (transferencia
Western) y de la actividad enzimática. Los experimentos de
transferencia Northern se realizaron según se describe en el Ejemplo
1. Se seleccionaron las líneas con elevada expresión de C\gammaS
para determinar el contenido proteico y la actividad enzimática.
Diez \mug de proteína de cada extracto de hoja se analizaron por
transferencia Western para determinar si tenían mayor contenido
proteico con respecto a la línea silvestre y la línea transgénica
original utilizada. Las líneas con mayor contenido proteico se
analizaron además con relación a la actividad enzimática. Se
incubaron 10 \mug, 25 \mug, 50 \mug y 100 \mug de extracto
de hojas junto con 10 \muCi de ^{35}S-cisteína y
succinilhomoserina 10 mM durante 30 min a 30ºC en un volumen total
de 200 \mul de Tris/HCl 50 mM, pH 7,8 y DTT 10 mM. Las reacciones
se detuvieron agregando 50 \mul de TCA al 20%. Después de la
neutralización y la centrifugación se analizaron 5 \mul de cada
sobrenadante por cromatografía en capa fina. Se usó como solvente de
corrida una mezcla de metanol/acetato de etilo/H_{2}O =
60:30:10). Las plantas transgénicas con actividad alta se analizaron
después con respecto al contenido de GSH, C\gammaS y Met.
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Claims (13)
1. Un método para aumentar el contenido de
compuestos que contienen azufre en plantas transgénicas, células o
tejido de plantas transgénicas, que consiste en la introducción de
una molécula de un ácido nucleico que codifica una proteína que
tiene actividad de serina acetiltransferasa (SAT) en una planta
transgénica, célula o tejido de la planta transgénica, donde dicha
molécula de un ácido nucleico está unida operablemente a elementos
reguladores que permiten la expresión de la molécula del ácido
nucleico en las células de la planta, donde dicha planta, dicha
célula de la planta o dicho tejido de la planta no expresan una
molécula de un ácido nucleico introducida exógenamente que codifica
una proteína que tiene actividad de
O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL).
2. El método de la reivindicación 1, donde dicha
proteína que tiene actividad de SAT es una serina acetiltransferasa
de procariotas o arquebacterias.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde
la molécula del ácido nucleico está unida operablemente a una
secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito capaz
de dirigir la proteína al interior de un compartimiento celular
deseado.
4. El método de la reivindicación 3, donde dicho
compartimiento celular es un plástido.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde dichos elementos reguladores
comprenden un promotor activo en las células de las plantas.
6. El método de la reivindicación 5, donde dicho
promotor es inducible, expresado constitutivamente y/o es un
promotor específico de una célula, un tejido o un órgano.
7. El método de la reivindicación 6, donde
dicho promotor es específico del tubérculo, específico de la
semilla, específico del endosperma, específico del embrión o
específico del floema.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde la molécula del ácido nucleico está
ubicada en un vector que comprende además un marcador
seleccionable.
9. Alimentos, piensos o sus aditivos, que
comprendan células de la planta transgénica en el genoma de las
cuales está establemente integrada una molécula de ADN recombinante
que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una
proteína que tiene actividad de serina acetiltransferasa (SAT) la
que está unida operablemente a elementos reguladores que permiten la
expresión de la molécula de ácido nucleico en las células de la
planta, o que comprende una planta o tejido de una planta que
comprende dichas células de la planta transgénica, partes
cosechables de dicha planta o material de propagación de dicha
planta, comprendiendo dichas partes cosechables y material de
propagación dichas células de la planta, donde dichas células de la
planta no expresan una molécula de un ácido nucleico introducida
exógenamente que codifica una proteína que tiene actividad de
O-acetilserina(tiol)liasa (OASTL).
10. Los alimentos, piensos o sus aditivos de la
reivindicación 9, donde dichas células de la planta transgénica
comprenden un marcador seleccionable.
11. Los alimentos, piensos o sus aditivos de la
reivindicación 9 ó 10, donde en dicha planta transgénica el nivel de
glutatión, cisteína y/o metionina es mayor en comparación con el de
la planta silvestre.
12. Los alimentos, piensos o sus aditivos de
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde dicha planta
transgénica es maíz.
13. Los alimentos, piensos o sus aditivos de
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde dicho material de
propagación es la semilla.
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