PL205174B1 - Sposób zwiększania zawartości związków zawierających siarkę w roślinach transgenicznych, transgeniczna komórka roślinna, roślina transgeniczna, zbierane części rośliny transgenicznej, materiał rozmnożeniowy i żywność, karma lub dodatki - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększania zawartości związków zawierających siarkę w roślinach transgenicznych, transgeniczna komórka roślinna, roś lina transgeniczna, zbierane cz ęści rośliny transgenicznej, materiał rozmnożeniowy i żywność, karma lub dodatki. Wynalazek został zrealizowany w oparciu o rekombinowaną cząsteczkę DNA kodujące białko posiadające aktywność acetylotransferazy serynowej (SAT) oraz ewentualnie, cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko o aktywności syntazy γ-cysteiny (CyS); przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z elementami regulacyjnymi, umożliwiającymi ekspresję cząsteczek kwasów nukleinowych w komórkach roślin. Rośliny wyższe wykorzystują nieorganiczny siarczan zawarty w glebie jako podstawowe źródło siarki do syntezy aminokwasów zawierających siarkę, takich jak cysteina i metionina. Uważa się, że biosynteza cysteiny w roślinach odgrywa zasadniczą rolę w obiegu siarki w przyrodzie. Zredukowana siarka w postaci cysteiny jest wymagana dla wielu różnorodnych funkcji u roślin (Rennenberg, 1990; Schmidt, 1992); jest niezbędna dla normalnego metabolizmu roślinnego, z powodu połączenia metabolizmu seryny i metioniny poprzez przenoszenie siarki niezbędnej do biosyntezy metioniny (Giovanelli, 1990; Ravanel, 1997; Brunold i Rennenberg, 1997). Dodatkowo, cysteina służy jako substrat dla innych cząsteczek zawierających siarkę, takich jak pewne kofaktory, związki zawarte w błonie komórkowej oraz jako aminokwas niezbędny do syntezy białek (Giovanelli, 1980; Schmidt, 1992). Cysteina jest również niezbędna jako prekursor do produkcji glutationu (GSH) i innych, związanych ze stresem metabolitów. Zapotrzebowanie na cysteinę zmienia się w trakcie rozwoju rośliny i zależy również od zmian w środowisku, w tym światła, dostępności siarki oraz pewnego rodzaju stresów, abiotycznych lub biotycznych (von Arb i Brunold 1986; Nussbaum, 1988; Delhaize, 1989; Rauser, 1991; Ghisi, 1993; Hell, 1994).

W biosyntezie cysteiny w pierwszej kolejności L-seryna musi ulec aktywacji poprzez przeniesienie grupy acetylowej z acetylokoenzymu A celem utworzenia związku pośredniego O-acetylo-L-seryny (OAS). Ta ważna reakcja jest katalizowana przez acetylotransferazę serynową (SAT). Aktywacja seryny będąca kluczową reakcją w szlaku biosyntezy cysteiny została zbadana na poziomie molekularnym jedynie w Procaryota (Breton, 1990; Monroe, 1990; Evans, 1991; Lai i Baumann, 1992). Synteza cysteiny w roślinach dokonuje się poprzez wytworzenie wiązań siarczkowych w O-acetylo-L-serynie w obecności wolnego lub związanego siarczku i jest katalizowana poprzez O-acetyloseryno(tiolo)-liazę (OAS-TL, syntaza cysteinowa, CSase; EC 4.2.99.8.) (Schmidt i Jager, 1990). Reakcja ta była intensywnie analizowana (Saito, 1992, 1993 i 1994; Holli, 1993 i 1996; Youssefian, 1993; Noji, 1994; Hell, 1994; Kuske, 1994 i 1996; Takahashi i Saito. 1996).

W bakteriach SAT i OAS-TL tworzą dwufunkcyjny kompleks zwany syntazą cysteiny. W kompleksie tym jedynie mała część O-acetyloseryno(tiolo)liazy (5%) jest związana z całkowitą aktywnością SAT (Kredich, 1969). Dodatkowo, badania nad regulacją biosyntezy cysteiny u bakterii pokazały, że acetylotransferaza seryny jest wrażliwa na sprzężenie zwrotne ujemne przez L-cysteinę, zaś O-acetyloseryna (lub N-acetyloseryna) bierze udział w transkrypcyjnej aktywacji kilku promotorów operonów cys (Ostrowski i Kredich, 1989; Kredich, 1993).

Ostatnio sklonowano cDNA kodujące roślinne acetylotransferazy seryny dla różnych gatunków (Bogdanova, 1995; Murillo, 1995; Ruffet, 1995; Saito, 1995; Roberts i Wray, 1996). U roślin SAT występuje również w kompleksie z OAS-TL, wskazując na efektywny metaboliczny przepływ od seryny do cysteiny poprzez zapobieganie dyfuzji związku pośredniego -O-acetylo-L-seryny (Nakamura, 1988; Nakamura i Tamura, 1990; Ruffet, 1994; Bogdanova i Hell, 1997; Hesse, 1997). Zarówno SAT, jak i OAS-TL są zlokalizowane w plastycydach, mitochondriach i cytozolu kilku roślin, wskazując na wagę zdolności do syntezy cysteiny dla wszystkich przedziałów komórkowych, posiadających endogenną zdolność do syntezy białek (Smith i Thompson, 1969; Smith, 1972; Brunold i Suter, 1982; Lunn, 1990; Rolli, 1992; Ruffet, 1994). U Pisum sativum, na przykład, istnieją trzy różne izoformy SAT, zaś każda izoforma wydaje się być specyficzna dla danego przedziału wewnątrzkomórkowego (Ruffet, 1995). Poza tymi trzema wymaganymi lokalizacjami komórkowymi, fakt, że biosynteza cysteiny znajduje się w złożonej interakcji z pobieraniem i redukcją siarczanów, która to sama jest regulowana poprzez fotosyntezę i asymilację azotanów (Ierson, 1990; Brunold, 1993), pozwala wskazać na istotna rolę biosyntezy cysteiny w metabolizmie siarki w roślinach wyższych.

Bardzo ważną cechą sekwencji reakcji w tworzeniu cysteiny jest fakt, że aktywność SAT jest znacznie niższa w porównaniu do aktywności OAS-TL. W nasionach i siewkach OAS-TL jest 10 do 20 razy aktywniejsza niż SAT (Smith, 1971; Ngo i Shargool, 1974). W całych liściach stosunek aktywnoPL 205 174 B1 ści obu enzymów jest 100 lub 300-krotny (Nakamura, 1987), podczas gdy stosunek w samych chloroplastach wynosi do 345-razy (Ruffet, 1994). Jak pokazano w Allium i szpinaku, w porównaniu do OASTL, enzym SAT występuje w małej ilości (Nakamura i Tamura, 1990; Ruffet, 1994). Dodatkowo uważa się, że dostępność OAS ogranicza szybkość reakcji syntezy cysteiny (Neuenschwier, 1991; Ghisi, 1990; Rennenberg 1983; Brunold, 1993; Saito, 1994). Aktywność SAT w arbuzie jest istotnie regulowana poprzez sprzężenie zwrotne ujemne (Saito, 1995). Regulacja SAT ma również miejsce na poziomie regulacji ekspresji genów. W odpowiedzi na światło i stres siarczanowy dochodzi do dwukrotnej akumulacji mRNA dla SAT u Arabidopsis thaliana (Bogdanova, 1995). Jednakże podczas gdy funkcja i rola SAT, OAS oraz OAS-TL w kaskadzie biosyntezy cysteiny były przedmiotem wielu badań, nie powiodły się poprzednie próby zmiany szybkości syntezy cysteiny (Saito, 1994). A zatem, dokładna regulacja szlaku biosyntezy cysteiny jest w dalszym ciągu nie w pełni zrozumiana i stanowi przedmiot kontrowersyjnej dyskusji. Tym samym, środki do kontroli zawartości siarki w roślinach, które mogłyby mieć zastosowanie w szeregu aspektach rolnictwa były niedostępne.

A zatem, problemem technicznym leżącym u podstaw niniejszego wynalazku był o zaspokojenie potrzeb i sposobów modulacji zawartości związków siarki w roślinach.

Zgodnie z powyższym, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu zwiększenia zawartości związków zawierających siarkę w transgenicznych roślinach, komórkach lub tkance roślinnej, polegający na tym, że wprowadza się co najmniej jedną cząsteczkę rekombinowanego DNA stanowiącego cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego białko posiadające aktywność acetylotransferazy serynowej (SAT) lub wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego białko posiadające aktywność SAT do rośliny, do komórki roślinnej lub tkanki rośliny, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest operacyjnie związany z elementami regulatorowymi pozwalającymi na ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego w komórkach roślinnych, przy czym we wspomnianej roślinie, komórce roślinnej lub tkance rośliny nie prowadzi się ekspresji egzogennie wprowadzonej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej białko posiadające aktywność liazy(tiolo)-O-acetyloserynowej (OASTL).

Wspomniane białko mające aktywność SAT jest acetylotransferazą serynową z prokariontów lub archebakterii.

W sposobie według wynalazku, korzystnie czą steczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z sekwencją nukleotydową kodującą peptyd tranzytowy zdolny do kierowania białek do odpowiedniego przedziału komórkowego, którym to przedziałem korzystnie jest plastyd.

W sposobie według wynalazku wspomniane elementy regulatorowe zawierają promotor aktywny w komórkach roślinnych, który korzystnie jest indukowalnym, ulegającym konstytutywnej ekspresji promotorem i/lub jest promotorem komórkowo, tkankowo lub organospecyficznym.

Jeszcze bardziej korzystnie, wspomniany promotor aktywny w komórkach roślinnych jest specyficzny dla bulw, nasion, bielma, zarodka lub floemu.

W kolejnej korzystnej realizacji sposobu wedł ug wynalazku wektor zawierają cy czą steczkę kwasu nukleinowego kodującego białko posiadające aktywność SAT do rośliny zawiera dodatkowo marker selekcyjny.

Przedmiotem wynalazku jest również transgeniczna komórka roślinna, charakteryzująca się tym, że zawiera stabilnie wbudowaną do genomu co najmniej jedną cząsteczkę rekombinowanego DNA jak zdefiniowano powyżej. Komórka według wynalazku korzystnie zawiera marker selekcyjny.

Przedmiotem wynalazku jest również roślina transgeniczna lub tkanka roślinna charakteryzująca się tym, że zawiera transgeniczne komórki roślinne zdefiniowane powyżej. W roślinie według wynalazku poziom glutationu, cysteiny i/lub metioniny jest podwyższony w porównaniu z rośliną typu dzikiego. Rośliną transgeniczną według wynalazku korzystnie jest kukurydza.

Następnym przedmiotem wynalazku są zbierane części rośliny transgenicznej zdefiniowanej powyżej, które zawierają transgeniczne komórki roślinne również zdefiniowane powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również materiał rozmnożeniowy rośliny transgenicznej według wynalazku jak zdefiniowano powyżej, który zawiera transgeniczne komórki roślinne według wynalazku. Korzystnie materiałem rozmnożeniowym jest nasiono.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest żywność, karma zwierzęca, lub dodatki, charakteryzująca się tym, że zawierają transgeniczne komórki roślinne, tkankę roślinną lub komórkę rośliny, zbierane części roślin lub materiał rozmnożeniowy jak zdefiniowano w powyżej.

Termin „białko posiadające aktywność γ-syntazy cysteiny (CyS) jak zastosowano w niniejszym opisie, oznacza białko zdolne do katalizowania tworzenia L-cystationiny lub L-homocysteiny, w zależności od zawartości siarki w substracie, L-cysteinie lub siarczku. Białko to jest również znane jako

PL 205 174 B1 γ-syntaza cystationiny. Terminy „γ-syntaza cysteiny oraz „γ-syntaza cystationiny są tutaj stosowane zamiennie. W roślinach CyS zazwyczaj katalizuje pierwszą reakcję specyficzną dla biosyntezy metioniny, to znaczy podstawienie w pozycji gamma podstawnika fosforanowego w O-fosfohomoserynie przez cysteinę. A zatem, cysteina jest głównym prekursorem w biosyntezie metioniny w roślinach.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, sekwencja kodująca genu cysE z Escherichia coli (Denk i Bock, 1987), kodująca enzym szlaku biosyntezy cysteiny, to znaczy acetylotransferazę seryny (SAT, EC 2.3.1.30) została wprowadzona do genomu ziemniaka pod kontrolą promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S (CaMV). Celem skierowania białka do chloroplastów cysE został translacyjnie połączony z sekwencją sygnałową na końcu 5' małej podjednostki rubisco; patrz przykład 1. Rośliny pomyślnie stransformowane wykazywały wysoką akumulację cysE mRNA. Co więcej, surowe ekstrakty z liści tych roślin miały znacząco wysoką aktywność SAT, o 20 razy wyższą w porównaniu do roślin typu dzikiego. Transgeniczne ziemniaki wykazujące nadekspresję genu E. coli wykazywały podwyższone poziomy cysteiny i glutationu (GSH), o dwa do trzech razy wyższe niż w roślinach kontrolnych; patrz Przykład 2. Jednakże, co zaskakujące, wzrost aktywności enzymu SAT i substratu do biosyntezy cysteiny O-acetylo-L-seryny (OAS) nie miały wpływu na ekspresję i aktywność O-acetyloseryno(tiol)liazy (OAS-TL), enzymu przekształcającego OAS, produkt SAT, do cysteiny; patrz przykłady 3 i 4. Zarówno ekspresja tego genu na poziomie RNA jak i aktywność enzymatyczna pozostały niezmienione w porównaniu z roślinami typu dzikiego.

Na podstawie tych eksperymentów wyciągnięto następujące wnioski. Z jednej strony bakteryjny SAT z E. coli produkowany w transgenicznych ziemniakach był gromadzony jako katalitycznie funkcjonalne białko w chloroplastach, z drugiej strony, komórkowa zawartość cysteiny i glutationu była znacząco zwiększona w liściach roślin transgenicznych. Poziom cysteiny w jednym z transformantów (SAT-48) był niemal trzykrotnie, a w innym transformancie (SAT-26) dwukrotnie wyższy w porównaniu do poziomów wykrywanych w niestranformowanych roślinach kontrolnych, wskazując, że ekspresja cysE jest odpowiedzialna za stymulację syntezy cysteiny. Eksperymenty wykonane zgodnie z niniejszym wynalazkiem wykazały również, że oba transformanty miały znacząco podniesione poziomy glutationu, około dwukrotnie wyższe niż w dzikim typie roślin. Te niespodziewane wyniki pokazują, że w normalnych warunkach bez stresu siarkowego, endogenny poziom SAT jest etapem ograniczającym w szlaku biosyntezy cysteiny, przynajmniej w chloroplastach, gdzie SAT z E. coli był kierowany. Oznacza to, że w normalnych warunkach poziom OAS-TL jest wystarczający do przekształcenia całego OAS produkowanego w komórkach, a tym samym nie ogranicza normalnego przebiegu biosyntazy cysteiny. Fakt, że nadekspresja SAT w transgenicznych ziemniakach jest w stanie zwiększyć zawartość cysteiny i glutationu wskazuje na to, że etapy szlaku asymilacji siarczanu przed inkorporacją siarczku do cysteiny, tj. pobieranie siarczanów, aktywacja siarczanu i redukcja adenozyno 5'-fosfosiarczanu (APS), w normalnych warunkach również nie ograniczają biosyntezy cysteiny. Rośliny wydają się posiadać wystarczającą zdolność do pobierania siarczanów oraz aktywność umożliwiającą przekształcenie siarczanów do siarczków, a tym samym dostarczania wystarczających ilości zredukowanej siarki, niezbędnej do produkcji cysteiny. Ostatecznie, wartym wspomnienia jest to, że przedstawione wyniki zgodnie z niniejszym wynalazkiem bezpośrednio wskazują na połączenie pomiędzy wolną cysteiną a glutationem. Zwiększony poziom cysteiny w transgenicznych ziemniakach stymuluje biosyntezę glutationu, prowadząc do dwukrotnie większego poziomu trójpeptydu w porównaniu do roślin dzikiego typu. Wskazuje to, że biosynteza glutationu jest ograniczana przez dostępność cysteiny. Ostatnio wykonane eksperymenty na topoli potwierdzają te wyniki (Strohm, 1995; Noctor, 1996).

Jak pokazano w doświadczeniach wykonanych zgodnie z niniejszym wynalazkiem, rośliny posiadają wystarczającą zdolność do pobierania siarczanów oraz aktywność umożliwiająca przekształcenie siarczanów do siarczków, a tym samym dostarczania wystarczających ilości zredukowanej siarki, niezbędnej do biosyntezy związków zawierających siarkę. A zatem, w oparciu o spostrzeżenia poczynione w wynalazku, oczekuje się, że wprowadzenie γ-syntazy cysteiny, pierwszego enzymu specyficznego dla szlaku biosyntazy metioniny w roślinach transgenicznych, zawartość metioniny w roślinach powinna być znacząco zwiększona w porównaniu z dzikim typem. Z tego względu, zauważalne jest, że wzrost zawartości związków zawierających siarkę w roślinach o co najmniej 10% ma już korzystny wpływ na rośliny, nadając, na przykład, większą odporność na stres abiotyczny. Korzystnie, zawartość tych związków jest zwiększona o co najmniej około 50%, najkorzystniej 100%, a szczególnie korzystnym jest wzrost zawartości związków zawierających siarkę więcej niż jednokrotny, a korzystnie dwukrotny. Locke, Keystone Meeting 6.-11.4.1997, Abstract 306 (1997) doniósł o 3-5 krotnym wzroście metioniny przy ekspresji CyS w roślinach. Ponieważ wprowadzenie SAT daje wzrost

PL 205 174 B1 substratu CyS, oczekuje się, że wprowadzenie CyS do roślin produkujących SAT lub vice versa, prowadzi do wzrostu zawartości związków zawierających siarkę około 1 do 10-krotnego, korzystnie 5 do 10-krotnego lub większego.

W wynalazku opisano rekombinowaną cząsteczkę DNA, kodującą białko o aktywność SAT, które jest acetylotransferazą seryny, pochodzącą z prokariota lub archebakterii. Organizmy prokariotyczne mogą dotyczyć zarówno bakterii gram dodatnich jak i gram ujemnych, takich jak, na przykład,

E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens, Bacillus subtilis oraz różnych gatunków z rodzaju Pseudomonas, Streptomyces i Staphylococcus, chociaż zastosowanie mogą znaleźć również inne. Przykładowo, cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące białka mające aktywność SAT mogą zostać otrzymane na podstawie poprzedniego stanu techniki (np., Bogdanova, FEBS Lett. 358 (1995), 43-47; Denk, J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 515-525; Evans, J. Bacteriol. 173 (1991), 5457-5469).

Generalnie, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko mające aktywność CyS może być otrzymana z jakiegokolwiek źródła materialnego, na przykład, z jakiejkolwiek rośliny posiadającej takie cząsteczki, korzystnie z roślin jednoliściennych lub dwuliściennych, w szczególności z jakichkolwiek roślin stosowanych w rolnictwie, ogrodnictwie lub leśnictwie, takich jak rośliny uprawne, szczególnie te z rodziny Poaceae, jakichkolwiek roślin produkujących skrobię, takich jak ziemniak, maniok, warzywa, roślin produkujących olej, takich jak rzepak, len itd., roślin wykorzystujących polipeptydy jako substancje zapasowe, takie jak soja, roślin wykorzystujących sacharozę jako substancję zapasową, takich jak burak cukrowy, trzcina cukrowa, drzewa, rośliny ozdobne, itd., lub roślin należących do rodziny Graminae. Cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące γ-syntazę cysteiny są opisane na przykład, w Ravanel, Biochem. J. 331 (1998), 639-648 i zacytowanych tam odniesieniach.

Ponadto, mogą być stosowane cząsteczki kwasów nukleinowych hybrydyzujące do wyżej wspomnianych cząsteczek kwasów nukleinowych i kodujące białko posiadające aktywność, odpowiednio - SAT i CyS. Takie cząsteczki kwasów nukleinowych mogą być wyizolowane, np., z bibliotek takich jak biblioteki cDNA i genomowe technikami dobrze znanymi fachowcom. Na przykład, hybrydyzujące cząsteczki kwasów nukleinowych mogą być zidentyfikowane i wyizolowane poprzez wykorzystanie wyżej opisanych cząsteczek kwasów nukleinowych, lub ich fragmentów, sekwencji komplementarnych jako sond do przeszukiwania bibliotek poprzez hybrydyzację ze wspomnianymi cząsteczkami zgodnie z technikami standardowymi, znanymi przez fachowców. Możliwa jest również izolacja takich cząsteczek kwasu nukleinowego przy zastosowaniu reakcji łańcuchowej polimeryzacji (PCR) z użyciem starterów oligonukleinowych otrzymanych z powyżej opisanych cząsteczek kwasów nukleinowych. Cząsteczki kwasów nukleinowych, które hybrydyzują z jakąkolwiek z wyżej wspomnianych cząsteczek kwasów nukleinowych zawierają również fragmenty, pochodne i warianty alleliczne wyżej wspomnianych cząsteczek kwasów nukleinowych, kodujące białko mające aktywność SAT lub CyS, bądź ich fragmenty aktywne biologicznie. Fragmenty te są rozumiane jako części cząsteczek kwasów nukleinowych o długości wystarczającej, do kodowania opisanego białka lub jego fragment posiadający wyżej zdefiniowaną aktywność biologiczną.

Termin pochodna oznacza w tym kontekście, że sekwencja nukleotydowa cząsteczek tych kwasów nukleinowych różni się od sekwencji wyżej opisanych cząsteczek kwasów nukleinowych jedną lub dwiema pozycjami nukleotydowymi i jest wysoce homologiczna do wspomnianych cząsteczek kwasów nukleinowych. Homologia jest rozumiana w odniesieniu do co najmniej 40% podobieństwa sekwencji, szczególnie 60% podobieństwa, korzystnie więcej niż 80%, a jeszcze bardziej korzystnie więcej niż 90%. Odchylenia od opisanych powyżej sekwencji kwasów nukleinowych mogą być, na przykład, wynikiem substytucji, delecji, addycji, insercji nukleotydów i/lub rekombinacji zarówno pojedynczej jak i występować naturalnie w kombinacjach, lub powstać w wyniku technik rekombinacji DNA dobrze znanych fachowcom patrz, na przykład, techniki opisane w Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. i Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates i Wiley Interscience, N.Y. (1989). W dalszej kolejności homologia oznacza, że odpowiednie cząsteczki kwasów nukleinowych lub kodowane białka są funkcjonalnymi i/lub strukturalnymi odpowiednikami. Cząsteczki kwasów nukleinowych, homologiczne do opisanych powyżej cząsteczek kwasów nukleinowych i będące pochodnymi wspomnianych cząsteczek kwasów nukleinowych są, na przykład, wariacjami wspomnianych cząsteczek kwasów nukleinowych, które stanowią modyfikacje o tej samej funkcji biologicznej, w szczególności kodujące białka o tej samej lub zasadniczo tej samej aktywności biologicznej, jak zdefiniowano powyżej. Stanowić mogą naturalnie występujące wariacje, takie jak sekwencje kodujące białka SAT i CyS z innych prokariontów i roślin, odpowiednio, bądź mutacje. Mutacje te mogą występować naturalnie lub mogą być

PL 205 174 B1 otrzymane technikami mutagenezy, patrz powyżej. Warianty alleliczne mogą być naturalnie występującymi wariantami allelicznymi lub wariantami wyprodukowanymi genetycznie; patrz powyżej. Przykładowo, sekwencje aminokwasowe roślinnych SAT wykazują znaczące podobieństwa z bakteryjnymi acetylotransferazami serynowymi (Vuorio, 1994; Bogdanova i Hell, 1997). Najbardziej zakonserwowany region we wszystkich SAT, zarówno u roślin jak i u bakterii, znajduje się na końcu C i uważa się, że nadaje aktywność transferazy (Vaara, 1992; Vuorio, 1994). W tym zakonserwowanym regionie obecny jest motyw heksapeptydowy, który uważa się za domenę katalityczną w bakteryjnych acetylotransferazach, a jego obecność ostatnio stwierdzono w regionie kontaktowym OAS-TL/SAT kompleksu syntazy cysteinowej z Arabidopsis thaliana (Bogdanova i Hell, 1997). Dodatkowo, zgodnie z niniejszym wynalazkiem zastosowane mogą być cząsteczki kwasów nukleinowych, kodujące homologi lub analogi powyżej opisanych białek mających aktywność SAT lub CyS ale pomimo to nie są spokrewnione z tymi białkami. Przykładowo, malY z E. coli koduje enzym, który bierze udział w pobieraniu i metabolizmie maltozy i maltodekstryn w systemie maltozy u E. coli ale ma jednak dodatkową aktywność O-liazy cystationinowej; patrz Zdych, J. Bacteriol. 177 (1995), 5035-5039. Jednakże, na podstawie analizy homologii aminokwasowej wspomniane białka nie są do siebie homologiczne. Tego typu białka, które nie wykazują znaczących homologii do znanych białek SAT lub CyS mogą zostać zidentyfikowane przez fachowca przy zastosowaniu dobrze znanych technik, na przykład, komplementacji zmutowanych genów biorących udział w szlaku biosyntezy cysteiny lub metioniny, na przykład, w odpowiednich szczepach mutantów E. coli; patrz również tych, powyżej.

Białka kodowane przez różne pochodne, warianty, homologi lub analogi wyżej opisanych cząsteczek kwasów nukleinowych mogą posiadać specyficzna wspólną charakterystykę, taką jak ciężar cząsteczkowy, reaktywność immunologiczną, konformację, itd., jak również właściwości fizyczne, takie jak ruchliwość elektroforetyczną i chromatograficzną, współczynniki sedymentacji, optimum pH, optimum temperaturowe, stabilność, rozpuszczalność, właściwości spektroskopowe, itd. Wszystkie te cząsteczki kwasów nukleinowych i pochodnych mogą być zastosowane w zgodzie z niniejszym wynalazkiem dopóty dopóki aktywność enzymatyczna kodowanego białka pozostaje zasadniczo niezmieniona, to znaczy, że białko ma aktywność STA i CyS, odpowiednio, jak zdefiniowano powyżej.

W korzystnym wykonaniu cząsteczki rekombinowanego DNA wynalazku, białko mające aktywność CyS jest γ-syntazą cysteiny z ziemniaka, tytoniu, pomidora, rzepaku lub Arabidopsis; patrz, np. Kirn i Leustek, Plant Mol. Biol. 32 (1996), 1117-1124.

W korzystnym wykonaniu cząsteczki rekombinowanego DNA wynalazku, cząsteczka kwasu nukleinowego z (a) i/lub (b) jest operacyjnie połączona z sekwencją nukleotydową kodującą peptyd sygnałowy zdolny do kierowania białka(łek) do wymaganego przedziału komórkowego. Cząsteczka kwasu nukleinowego obecna w rekombinowanym DNA według wynalazku może zostać zmodyfikowana w taki sposób, że kodowane białko jest zlokalizowane w dowolnym wymaganym przedziale komórkowym komórki roślinnej. Dotyczy to retikulum endoplazmatycznego (KDEL, Schouten, Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-793), wakuoli (Neuhaus, PNAS 88 (1991), 10362-10366), mitochondrium (Chaumont, Plant Mol. Biol. 24 (1994), 631-641), plastydów (Fuhr, EMBO J. 5 (1986), 2063-2071), apoplastu (von Schaewen, EMBO J. 9 (1990), 3033-3044), cytoplazmy, itd. Metody wprowadzania tych modyfikacji i sekwencji sygnałowych zapewniających umiejscowienie w wymaganym przedziale są dobrze znane fachowcom. Korzystnie, wspomniany przedział komórkowy jest plastydem. Jak opisano w załączonych przykładach, białko posiadające aktywność SAT zostało skierowane do chloroplastów poprzez fuzję translacyjną z końcem 5' sekwencji sygnałowej małej podjednostki rubisco. Korzystnie, białko mające aktywność CyS może ulegać koekspresji w tym samym przedziale komórkowym, na przykład w chloroplaście i powinno zatem zapewnić znaczący wzrost zawartości metioniny również w liściach rośliny.

Cząsteczka rekombinowanego według DNA wynalazku zawiera sekwencje regulatorowe, pozwalające na ekspresję cząsteczek kwasu nukleinowego w komórkach roślinnych. Korzystnie, wspomniane elementy regulatorowe zawierają promotor aktywny w komórkach roślinnych. Ekspresja dotyczy transkrypcji cząsteczki kwasu nukleinowego do ulegającego translacji mRNA. Elementy regulatorowe zapewniające ekspresję w komórkach roślinnych są dobrze znane fachowcom.

Sekwencje regulatorowe mogą być heterologiczne lub homologiczne w odniesieniu do cząsteczki kwasu nukleinowego mającego ulec ekspresji jak również w odniesieniu do mającego ulec transformacji gatunku rośliny. Ogólnie, takie sekwencje regulatorowe zawierają promotor aktywny w komórkach roślinnych. Celem otrzymania ekspresji we wszystkich tkankach rośliny transgenicznej, korzystnie stosuje się promotory konstytutywne, takie jak promotor 35S z CaMV (Odell, Nature 313

PL 205 174 B1 (1985), 810-812) lub promotory genów poliubikwityny z kukurydzy (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675-689). Celem osiągnięcia ekspresji w specyficznych tkankach rośliny transgenicznej możliwym jest zastosowanie promotorów specyficznych tkankowo (patrz np. Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Znane są również promotory, które są specyficznie aktywne w bulwach ziemniaka lub w nasionach różnych gatunków roślin, takich jak kukurydza, fasola, pszenica, jęczmień itd. Celem dokładnej kontroli ekspresji zastosowane mogą być promotory indukowalne. Przykładem promotorów indukowalnych są promotory genów kodujących białka szoku cieplnego. Opisane zostały również elementy regulatorowe specyficzne dla mikrospor oraz ich zastosowanie (WO96/16182). Co więcej, zastosowany może zostać indukowany chemicznie Test-system (Gatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991); 229-237). Inne odpowiednie promotory znane są fachowcom i są opisane, np. w Ward (Plant Mol. Biol. 22 (1993), 361-366). W dalszej kolejności elementy regulatorowe mogą zawierać wzmacniacze transkrypcji i/lub translacji funkcjonalne w komórkach roślinnych. Wykazano, że często stosowane wzmacniacze translacji, np. sekwencje omega z CaMV i/lub wstawienie intronu (Intron-1 z genu kukurydzy Shrunken, na przykład) zwiększa poziom ekspresji blisko 10-krotnie. (Maiti, Transgenic Research 6 (1997), 143-156; Ni, Plant Journal 7 (1995), 661-676). Co więcej, elementy regulatorowe mogą zawierać sygnały terminacji transkrypcji, takie jak sygnał poli-A, który prowadzi do addycji ogona poli-A do transkryptu, co zwiększa jego stabilność. Zazwyczaj stosowane sygnały terminacji pochodzą z genu syntazy Nopaliny z genu 35S RNA z CaMV.

W korzystnym wykonaniu cząsteczki rekombinowanego DNA jak opisano w wynalazku, wspomniany promotor ulega indukcji lub konstytutywnej ekspresji i/lub jest komórkowo, tkankowo lub organospecyficznym promotorem. Korzystnie, wspomniany promotor jest specyficzny dla bulw, nasion, bielma, zarodka lub floemu. Przykłady takich promotorów dotyczą, lecz nie ograniczają się do promotora patatyny promotora B33 (specyficznego dla bulw Roch-Soa, EMBO J. 8 (1989), 23), promotora fazeoliny (specyficznego dla nasion, Karchi, Plant J. 3 (1993), 721-727), promotora gluteniny HMW (specyficznego dla bielma, Helford, Theor. Appl. Genet. 75 (1987), 117-126), promotora α-, β-konglicyny (specyficznego dla zarodków, Fujiwara, Plant Cell Reports 9 (1991), 602-606), promotora rolC (specyficznego dla floemu, Lerchl, Plant Cell 7 (1995), 259-270).

Niniejszy wynalazek dotyczy również wektorów, w szczególności plazmidów, kosmidów, wirusów, bakteriofagów i innych wektorów konwencjonalnie stosowanych w inżynierii genetycznej, które zawierają co najmniej jedną cząsteczkę rekombinowanego DNA według wynalazku. Celem skonstruowania różnych plazmidów i wektorów zastosowane mogą zostać różne znane fachowcom techniki; zobacz na przykład, techniki opisane w Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. i Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates i Wiiley Interscience, N.Y. (1989). Alternatywnie, rekombinowane cząsteczki DNA oraz wektory według wynalazku mogą być rekonstytuowane w liposomach celem dostarczania do komórek docelowych.

Korzystnie, opisane powyżej wektory zawierają marker selekcyjny i/lub marker ilościowy. Geny markerów selekcyjnych stosowane do selekcji w stransformowanych komórkach roślinnych, kallusie, tkankach roślinnych i roślinach są dobrze znane fachowcom i dotyczą, na przykład, odporności antymetabolitowej, jako podstawy selekcji na dhfr, która nadaje odporność na metotreksat (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, który nadaje odporność na aminoglikozydy: neomycynę, kanamycynę i paromycynę (Herrera-Estreila, EMBO J. 2 (1983), 987-995) oraz hygro, który nadaje odporność na higromycynę (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Opisano dodatkowe geny selekcyjne, to znaczy trpB, który umożliwia komórkom wykorzystanie indolu zamiast tryptofanu; hisD, który umożliwia komórkom użycie histinolu zamiast histydyny (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); izomerazę mannozo-6-fosforanu, która umożliwia korzystanie z mannozy (WO 94/20627) i ODC (dekarboksylaza ornityny), która nadaje odporność na inhibitor dekarboksylazy ornityny, 2-(difluorometylo)-DL-ornityny, DFMO (McConlogue, 1987, W: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory wyd.) lub deaminazę z Aspergillus terreus, która nadaje odporność na elastycydynę S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338). Użyteczne markery ilościowe są również znane fachowcom i są dostępne komercyjnie. Korzystnie, wspomniany marker jest genem kodującym lucyferazę (Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), zielone białko fluorescencyjne (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) lub β-glukuronidazę (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). To wykonanie jest szczególnie korzystne dla szybkiego i prostego przeszukiwania komórek, tkanek i organizmów zawierających wektor opisany w wynalazku.

PL 205 174 B1

Cząsteczki rekombinowanego DNA według wynalazku są w szczególności korzystne do genetycznych manipulacji komórek roślinnych, tkanek roślinnych i roślin celem zwiększenia związków zawierających siarkę i otrzymania roślin ze zmodyfikowanymi, korzystnie poprawionymi lub użytecznymi fenotypami. A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu produkcji roślin transgenicznych, komórek roślinnych lub tkanek roślinnych zawierających co najmniej jedną wprowadzoną cząsteczkę rekombinowanego DNA lub wektora, opisanego w wynalazku, do genomu wspomnianych roślin, komórek roślinnych lub tkanek roślinnych.

Metody wprowadzania obcego DNA do roślin są również dobrze znane fachowcom. Dotyczy to, na przykład, transformacji komórek roślinnych, tkanek roślinnych, lub roślin T-DNA za pomocą Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium rhizogenes, fuzji protoplastów, bezpośredniego transferu genów, (patrz np. EP-A 164 575), iniekcji, elektroporacji, metod biolistycznych takich jak bombardowanie cząsteczkami i innych metod znanych fachowcom. Wektory zastosowane w sposobie według wynalazku mogą zawierać inne elementy funkcjonalne, na przykład, sekwencje lewostronne i prawostronne z T-DNA z Agrobacterium, które umożliwiają stabilną integrację z genomem rośliny. Co więcej, fachowcom znane są sposoby i wektory, które umożliwiają wytworzenie roślin transgenicznych pozbawionych markerów, tj. marker selekcyjny lub marker ilościowy ulega utracie na pewnym poziomie rozwoju lub hodowli rośliny. Może to zostać osiągnięte poprzez, na przykład, ko-transformację (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 151-161; Peng, Plant Mol. Biol. 27 (1995), 91-104) i/lub przy użyciu systemów, które wykorzystują enzymy zdolne do wzbudzania rekombinacji homologicznej w roślinach (patrz np. WO97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353-361); Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 653-657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170-176; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19 (1991), 6373-6378). Metody przygotowywania odpowiednich wektorów są opisane, np. w Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ie wydanie (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Odpowiednie szczepy Agrobacterium tumefaciens i wektorów, jak również transformacja Agrobacteria i odpowiednie podłoża wzrostowe i selekcyjne są dobrze znane fachowcom i opisane w poprzednich pracach (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383-396; C58C1 (pGV 3850kan), Debiaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan. Nucleic. Acid Res. 12(1984), 8711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467-8471; Koncz, Plant Mol. Biol. (1992), 963-976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging i expression studies. W: Plant Molecular Biology Manual tom 2, Gelvin i Schilperoort (wyd.), Dordrecht, The Netherlis: Kluwer Academic Publ. (1994), 1-22; EPA-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), rozdział³ V, Fraley, Crit Rev. Plant. Sci. 4, 1-46; An, EMBO J. 4 (1985), 277-287). Chociaż w sposobie według wynalazku korzystne jest zastosowanie Agrobacterium tumefaciens, użyte mogą być inne szczepy Agrobacterium, takie jak Agrobacterium rhizogenes, na przykład, jeśli wymagany jest fenotyp przejawiany przez dany szczep.

Metody transformacji stosujące metody biolistyczne są dobrze znane fachowcom; patrz np. Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558 i Christou (1996) Trends in Plant Science 1, 423-431. Mikroiniekcja może zostać wykonana jak opisano w Potrykus i Spangenberg (wyd.), Gene Transfer To Plants. Springer Verlag, Berlin, NY (1995).

Transformacja większości roślin dwuliściennych jest możliwa dzięki metodom opisanym powyżej. Również do transformacji roślin jednoliściennych zastosowano kilka skutecznych technik transformacji. Dotyczy to transformacji przy użyciu metod biolistycznych, np. opisanych powyżej, jak również transformacji protoplastu, elektroporacji częściowo permabilizowanych komórek, wprowadzania DNA przy użyciu włókien szklanych, itd.

Ogólnie, rośliny, komórki roślinne i tkanki roślinne, które mogą być zmodyfikowane cząsteczką rekombinowanego DNA lub wektorem według wynalazku i które wykazują (nad)ekspresję białek o aktywności SAT i opcjonalnie CyS, odpowiednio, mogą być otrzymane z jakiegokolwiek wymaganego gatunku roślinnego. Mogą być roślinami jednoliściennymi lub dwuliściennymi, korzystnie należą do grupy roślin mających zastosowanie w rolnictwie, leśnictwie lub ogrodnictwie, takich jak rośliny uprawne (np. kukurydza, ryż, pszenica, jęczmień, żyto i owies itd.), ziemniaki, rośliny produkujące olej (np. rzepak, słonecznik, orzeszki ziemne, soja, itd.), bawełna, burak cukrowy, trzcina cukrowa, warzywa strączkowe, (np. groch, fasola), rośliny produkujące drzewo, korzystnie drzewa, itd. A zatem, niniejszy wynalazek dotyczy również transgenicznych komórek roślinnych, które zawierają cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku stabilnie zintegrowaną z genomem i połączoną z elementami regulaPL 205 174 B1 torowymi, które pozwalają na ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego w komórkach roślinnych i gdzie kwas nukleinowy jest obcy w stosunku do transgenicznej komórki roślinnej.

Termin obcy oznacza, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest heterologiczna w odniesieniu do komórki roślinnej, to znaczy otrzymana z komórki lub organizmu o innym podłożu genetycznym, lub jest homologiczna w odniesieniu do komórki roślinnej ale zlokalizowana w innym środowisku genetycznym, niż naturalnie występujący odpowiednik wspomnianej cząsteczki kwasu nukleinowego. Oznacza to, że jeśli cząsteczka kwasu nukleinowego jest homologiczna w odniesieniu do komórki roślinnej, nie jest zlokalizowana w sposób naturalny w genomie wspomnianej komórki roślinnej, a w szczególności jest otoczona odmiennymi genami. W tym przypadku cząsteczka kwasu nukleinowego może być zarówno pod kontrolą własnego promotora lub pod kontrolą promotora heterologicznego. Wektor lub cząsteczka rekombinowanego DNA według wynalazku, która jest obecna w komórce gospodarza może zarówno być zintegrowana z genomem gospodarza, jak i być utrzymywana w jakiejś formie pozachromosomalnej.

Alternatywnie, komórka roślinna mająca (a) cząsteczkę(i) kwasu nukleinowego kodującą białko mające aktywność SAT i opcjonalnie CyS, obecna w genomie, może być zastosowana i modyfikowana w taki sposób, że wspomniana komórka roślinna produkuje endogenny gen(y) odpowiadający tym cząsteczkom kwasu nukleinowego pod kontrolą heterologicznego promotora i/lub elementów wzmacniających. Wprowadzenie heterologicznego promotora i wspomnianych elementów, które naturalnie nie kontrolują ekspresji kwasu nukleinowego kodującego oba wyżej wspomniane białka przy użyciu, np. wektorów kierujących do genu, może zostać dokonane przy użyciu metod standardowych, patrz powyżej i np. Hayashi, Science 258 (1992), 1350-1353; Fritze i Walden, Gene activation by T-DNA tagging. W Methods in Molecular biology 44 (Gartli, K.M.A. i Davey, M.R., wyd). Totowa: Human Press (1995), 281-294) lub znakowania transpozonu (Chilee, Physiologia Plantarum 78 (1990), 105-115). Odpowiednie promotory i inne elementy regulatorowe, takie jak wzmacniacze dotyczą tych wspomnianych tutaj.

Obecność i ekspresja cząsteczki(czek) kwasu nukleinowego obecnej(nych) w rekombinowanej cząsteczce DNA lub wektorze w roślinie transgenicznej prowadzi do syntezy białek, mających wpływ na np. odporność roślin na stres i prowadzi do odpowiednich zmian fizjologicznych i genotypowych w roślinach zawierających takie komórki. Jak opisano w dołączonych przykładach, rośliny produkujące konstytutywnie SAT z E.coli wykazują wysokie poziomy cysteiny. Dodatkowo, zawartość trójpeptydu glutationu (γ-glutamylocysteinyloglicyny) była znacząco wyższa, niż w dzikim typie roślin, ponieważ związek ten jest główną formą gromadzenia zredukowanej siarki w królestwie roślin i służy jako główny zbiornik wyprodukowanej cysteiny. Glutation odgrywa istotną rolę nie tylko w regulacji pobierania siarki ale jest również istotnym czynnikiem w obronie roślin przed różnego rodzaju stresami w tym nadmiernym o ś wietleniem, suszą, zimnem, gorącem i brakiem soli mineralnych (Smith, 1990; Rennenberg i Brunold, 1994). Trójpeptyd jest syntetyzowany w roślinach, jak również w innych organizmach w dwóch katalizowanych enzymatycznie reakcjach ze składowych aminokwasów (Meister i Anderson, 1983; Rennenberg, 1995).

Jak przedstawiono powyżej, syntaza γ-cysteiny zdolna jest do wykorzystania cysteiny jako substratu zawierającego siarkę. A zatem, ponieważ wykazano w trakcie niniejszego wynalazku, że rośliny transgeniczne nadprodukujące białko mające aktywność SAT, mają znacząco większą zawartość cysteiny, koekspresja cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego białko o aktywności CyS powinna wprowadzić efekt synergistyczny w produkcji metioniny, ze względu na fakt, że oba enzymy kluczowe dla szlaku biosyntezy metioniny ulegają nadprodukcji w roślinach. A zatem, w korzystnym wykonaniu wynalazku, wspomniana komórka roślinna zawiera (a) rekombinowaną cząsteczkę(i) DNA zawierającą:

(a) cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko mające aktywność acetylotransferazy seryny (SAT) oraz, (b) cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko mające aktywność γ-syntazy cysteiny (CyS), gdzie wspomniana cząsteczka(i) kwasu nukleinowego jest(są) operacyjnie połączona z elementami regulatorowymi, jak opisano powyżej.

Jest oczywistym dla fachowca, że cząsteczka rekombinowanego DNA według niniejszego wynalazku może nieść cząsteczki kwasu nukleinowego zdefiniowane w (a) i (b) zarówno jedną jak i obie. To samo dotyczy opisanych powyżej wektorów według niniejszego wynalazku, jak również komórek roślinnych, tkanek roślinnych i roślin nimi stransformowanych. Podobnie, ekspresja wspomnianych

PL 205 174 B1 cząsteczek kwasu nukleinowego może być pod kontrolą tych samych elementów regulatorowych lub może być kontrolowana oddzielnie. Z tego względu fachowiec szybko doceni, że cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące białko mające aktywność SAT i CyS, odpowiednio, może ulegać ekspresji w formie pojedynczego mRNA, jako fuzje transkrypcyjne i opcjonalnie translacyjne. Oznacza to, że białka mające aktywność SAT i CyS, odpowiednio, są produkowane jako oddzielne polipeptydy lub w tej ostatniej opcji, jako peptyd fuzyjny, który jest następnie poddawany obróbce do pojedynczych białek, na przykład poprzez miejsce cięcia dla proteinaz, które zostało włączone pomiędzy sekwencje aminokwasowe obu białek. Oczywiście białka mające aktywność SAT i CyS, odpowiednio, mogą ulegać ekspresji również jako peptyd bi- lub multifunkcjonalny, korzystnie rozdzielony linkerem petydowym, pozwalającym na wystarczającą elastyczność obu białek. Korzystnie, wspomniany peptyd linkerowy zawiera liczne, hydrofilowe, połączone wiązaniem peptydowym aminokwasy o długości wystarczającej do dostatecznego pokrycia odcinka pomiędzy końcem C wspomnianych białek, a końcem N innego ze wspomnianych białek, gdzie wspomniany polipeptyd przybiera konformację właściwą dla aktywności biologicznej obu białek umieszczonych w roztworze wodnym w komórce roślinnej. Co więcej, cząsteczki rekombinowanego DNA i wektory według wynalazku mogą zawierać dodatkowe geny kodujące białka biorące udział w biosyntezie cysteiny i/lub metioniny. Przykłady opisanych powyżej strategii ekspresji są odnajdywane w literaturze, np. dla dicistronowego mRNA (Reinitiation) w Hefferon, J. Gen. Virol. 78 (1997), 3051-3059, białka fuzyjne są opisane w Brinck-Peterson, Plant Mol. Biol. 32 (1996), 611-620 i Hotze, FEBS Lett. 374 (1995), 345-350; białka bifunkcjonalne są opisane w Lamp, Biochem. Biophys. Res. Com. 244 (1998), 110-114 i Dumas, FEBS Lett. 408 (1997), 156-160, a dla linekera peptydowego i proteaz w Doskeli, Biochem. J. 313 (1996), 409-414.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, komórka rośliny transgenicznej zawiera marker selekcyjny. Jak opisano powyżej, zastosowane mogą być różne markery selekcyjne, zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Korzystnie, zastosowane markery selekcyjne są odpowiednie do bezpośredniej selekcji roślin stransformowanych, na przykład, gen N-acetylotransferazy fosfinotricyny, którego produkt pozbawia toksyczności herbicyd L-fosfinotrycynę (glufosynat lub BASTA); patrz, np. De Block, EMBO J. 6 (1987), 2513-2518 i Droge, Planta 187 (1992). 142-151.

Ponadto, niniejszy wynalazek dotyczy również roślin transgenicznych i tkanek roślinnych zawierających powyżej opisane komórki roślinne lub możliwe do otrzymania opisanym sposobem. Mogą one wykazywać, na przykład, zwiększoną odporność na stres. Korzystnie, poziom glutationu, cysteiny i/lub metioniny w roślinach transgenicznych według wynalazku jest zwiększony w porównaniu do roślin dzikiego typu. Wzrost poziomu glutationu, cysteiny i/lub metioniny jest rozumiany w odniesieniu do zwiększonej zawartości któregokolwiek z zacytowanych powyżej związków zawierających siarkę jednego albo wielu, w komórkach roślin transgenicznych, tkankach roślinnych i roślinach według niniejszego wynalazku, o około 10% w porównaniu z odpowiednim, niestransformowanym dzikim typem roślin, tkanką roślinną lub rośliną, które już mają korzystny wpływ na żywotność takich roślin, np. zwiększoną tolerancję na stres. Korzystnie, zawartość wspomnianych wyżej związków jest zwiększona o co najmniej 50%, korzystnie o więcej niż około 75%, w szczególności korzystny jest wzrost o 100%, a jeszcze bardziej o więcej niż około 200%. Rozważając acetylotransferazy fosfinotricyny, którego produkt zawartość cysteiny, metioniny i glutationu łącznie, nawet 10-20 krotny wzrost związków zawierających siarkę w porównaniu do poziomu wolnej cysteiny w dzikim typie roślin może zostać osiągnięty również, choć można przewidzieć jeszcze większy poziom związków zawierających siarkę w roślinach według niniejszego wynalazku.

Korzystnie, poziom wolnej cysteiny w roślinach według niniejszego wynalazku jest większy o około 20 nmol na gram świeżej masy tkanki liścia (ang. gfw), korzystnie większy niż 30 nmol/gfw, a bardziej korzystnie większy niż 40 nmol/gfw, patrz Przykład 2. Co więcej, zawartość glutationu w roślinach według niniejszego wynalazku może być korzystnie wyższa niż 350 nmol/gfw, a jeszcze korzystniej wyższa niż 500 nmol/gfw. Zawartość metioniny może być zwiększona o około 5 razy, korzystnie więcej niż 10 razy.

W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy części zbieranych i materiału do namnażania roślin transgenicznych według wynalazku, które zawierają opisane powyżej komórki roślin transgenicznych, tj. co najmniej jedną cząsteczkę rekombinowanego DNA lub wektora według wynalazku, i/lub które zostały otrzymane z opisanych powyżej roślin i wykazują zwiększone poziomy związków zawierających siarkę, jak opisano powyżej. Zbierane części roślin mogą być w istocie jakąkolwiek użyteczną częścią rośliny, na przykład, liśćmi, łodygami, owocami, nasionami, korzeniami, itd. Materiał propagacyjny dotyczy, na przykład, nasion, owoców, siewek, sadzonek, bulw, kłączy itd.

PL 205 174 B1

Ponadto, niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania co najmniej jednej rekombinowanej cząsteczki DNA lub wektora według wynalazku do produkcji roślin transgenicznych wykazujących zwiększony poziom glutationu, cysteiny i/lub metioniny. Korzystnie, wspomniany zwiększony poziom metioniny lub cysteiny prowadzi do przyspieszenia procesów dojrzewania, zmiany kwiatów i/lub odporności na patogeny.

Konstytutywna ekspresja genu cysE dla SAT z E. coli w transgenicznych roślinach ziemniaka bezpośrednio pokazuje in vivo, że katalizowana przez SAT reakcja jest w istocie ograniczająca szybkość w roślinnym szlaku biosyntezy cysteiny, jak pokazano dzięki zwiększonym poziomom cysteiny w transformantach; patrz załączone przykłady. Ponadto, jak opisano powyżej, oczekuje się, że odpowiednio wysokie poziomy glutationu w roślinach transgenicznych mogą nadawać odporność na różne formy stresu. W roślinach glutation odgrywa istotną rolę w obronie przeciwko aktywnym rodzajom tlenu, ksenobiotykom, metalom ciężkim i innym formom stresu, takim jak susza, ciepło i brak soli mineralnych (Alscher, 1989; Smith, 1990; Schmidt i Jager, 1992; Rennenberg i Brunold, 1994; Rennenberg, 1995). Wiedza o tym ma również znaczenie praktyczne. Wyższa odporność roślin na aktywne rodzaje tlenu może odgrywać bardzo istotną rolę w przyszłości, odnosząc się do podniesionych poziomów ozonu w atmosferze. Co więcej, istotna jest zwiększona tolerancja na ksenobiotyki, na przykład, jako wynik podwyższonych poziomów glutationu w roślinach wynalazku. Następnie, możliwą strategią jest skonstruowanie roślin transgenicznych, które są w stanie rosnąć przy podwyższonych poziomach metali ciężkich i które mogą być zatem użyte do bioremidacji. Co więcej, rekombinowane cząsteczki DNA i wektory według wynalazku mogą być przydatne do zmiany lub modyfikacji oddziaływań roślina/patogen. Termin „patogen dotyczy, na przykład, bakterii, wirusów i grzybów, jak również pierwotniaków.

Jak opisano powyżej, komórki, tkanki roślin transgenicznych i same rośliny według wynalazku mogą być zastosowane celem zmniejszenia efektów toksycznych zanieczyszczeń w glebie, w tym ekonomii wodnej. Zanieczyszczenia mogą być naturalnie obecne lub być spowodowane przez górnictwo, przemysł i środowisko miejskie. Tego rodzaju zanieczyszczenia dotyczą związków, które mogą inaktywować białka zawierające siarkę, w szczególności enzymy, lub działają jako antagoniści lub inhibitory szlaku biosyntezy cysteiny i/lub metioniny. Przykładami takich antagonistów lub inhibitorów są herbicydy, fungicydy, pestycydy lub szczególne jony metali, np. Hg²⁺. Na przykład, dzięki zwiększonym poziomom GSH nadawanym poprzez ekspresję cząsteczek kwasów nukleinowych zawartych w cząsteczkach rekombinowanego DNA i wektorach według wynalazku, możliwe jest zastosowanie w rolnictwie gleby, która w innych warunkach nie jest zdatna z powodu obecności, przykładowo, związków toksycznych oddziałujących z enzymami zawierającymi siarkę, a tym samym ze wzrostem roślin. Jest to w szczególności prawdziwe dla gleby, która zawiera duże ilości metali ciężkich. Co więcej, komórki roślinne, tkanki roślinne i rośliny według niniejszego wynalazku mogą być zastosowane do ulepszenia gleby zawierającej zanieczyszczenia. Korzystnym efektem ubocznym jest, na przykład, zwiększona tolerancja na metale, możliwa dzięki obecności cząsteczki rekombinowanego DNA lub wektora według wynalazku, komórki roślinne, tkanki roślinne i rośliny według wynalazku mogą być zastosowane do biogórnictwa (Cunningham, TiBTECH 13 (1995), 393-397). Oznacza to, że rośliny, tkanki roślinne i komórki roślinne według niniejszego wynalazku mogą być zastosowane do fitoekstrakcji metali, takich jak rtęć, nikiel i miedź. Ponadto, jak wspomniano wcześniej, zwiększona zawartość GSH w komórkach roślinnych, tkankach roślinnych i roślinach według wynalazku może prowadzić do zwiększonej odporności. Dodatkowo, wydaje się, że wysoki poziom GSH obecny w opisanych powyżej komórkach lub tkankach roślinnych może prowadzić do polepszenia wzrostu siewek i produkcji biomasy. Podsumowując, wzrost zawartości GSH ma zwielokrotniony wpływ na żywotność roślin i jest przedmiotem szczególnego zainteresowania hodowcy.

Co więcej, nadekspresja γ-syntazy cysteiny w roślinach w połączeniu z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą SAT w transgenicznych komórkach roślinnych, tkankach roślinnych i roślinach według wynalazku prowadzi do wzrostu wolnej, jak również związanej metioniny w roślinach, co jest szczególnie korzystne dla żywności i paszy, ponieważ metionina jest aminokwasem podstawowym i zazwyczaj jest obecna w żywności i karmie w małych ilościach, co nie jest wystarczającym źródłem tego aminokwasu dla ludzi i zwierząt. A zatem, komórki roślinne, tkanki roślinne i rośliny, jak również zbierane części roślin i/lub materiał do rozmnażania mogą być zatem stosowane jako karma lub żywność lub dodatki. Ponadto, wzrost metioniny może wzmacniać proces dojrzewania, kwitnienia, jak również odporność na patogeny. Wysoka zawartość metioniny w roślinach lub ich częściach zbieral12

PL 205 174 B1 nych, jak również materiale rozmnożeniowym sprzyja atrakcyjnemu smakowi różnych produktów żywnościowych takich jak chleb, kawa palona i tym podobne.

A zatem, niniejszy wynalazek można wykorzystać do zastosowania cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej białko mające aktywność SAT lub co najmniej jednej cząsteczki rekombinowanego DNA lub wektora według wynalazku, komórek roślinnych, roślin lub tkanek roślinnych według wynalazku lub części zbieranych lub materiału rozmnożeniowego, do produkcji żywności, karmy zwierzęcej, do zwiększenia odporności na patogeny, nadania odporności na metale ciężkie lub tolerancji wobec herbicydów, zwiększenia produkcji biomasy, poprawy wzrostu siewek, nadania tolerancji na stresy biotyczne lub abiotyczne lub do poprawy smaku i/lub aromatu żywności lub karmy. Zastosowanie cząsteczki rekombinowanego DNA lub wektora do nadania tolerancji na herbicydy dotyczy, na przykład, użycia markerów selekcyjnych w roślinach zgodnie z innymi systemami, które stosują (nad)ekspresję enzymów zdolnych do nadawania tolerancji (tj. odporności) na wpływ uśmiercający herbicydu wobec rośliny. Przykładem takiego systemu jest nadekspresja enzymu syntazy 5-enolopirogronianoszikimianu-3-fosforanu (EPSP), który nadaje tolerancję na herbicyd glifosforan. W podobny sposób, cząsteczki rekombinowanego DNA i wektory według wynalazku mogą zostać zastosowane do nadania tolerancji na związki, które działają na enzymy zawierające siarkę, poprzez, np. maskowanie związku odpowiedzialnego za hamowanie wspomnianych enzymów dzięki wysokiej zawartości cysteiny, GSH i/lub metioniny lub peptydów i białek zawartych w podwyższonych poziomach dzięki podniesionej zawartości aminokwasów zawierających siarkę.

Jak opisano powyżej, wartość odżywcza roślin, tkanek roślinnych i komórek roślinnych według wynalazku, jak również części zbieranych i materiału rozmnożeniowego z takich roślin jest znacząco zwiększona dzięki zwiększonej zawartości związków zawierających siarkę. A zatem, niniejszy wynalazek dotyczy żywności i karmy lub dodatków zawierających komórki roślinne, tkanki roślinne, rośliny, zbierane części roślin lub materiał rozmnożeniowy według wynalazku. Żywność, karma i dodatki korzystnie zwiększają zawartość cyteiny, metioniny i/lub glutationu, jak opisano powyżej.

Te i inne wykonania są zawarte i objęte opisem i przykładami według niniejszego wynalazku. Dalsza literatura obejmująca którykolwiek ze sposobów, zastosowań i związków stosowanych zgodnie z niniejszym wynalazkiem, może zostać uzyskana z bibliotek publicznych przy użyciu, na przykład, urządzeń elektronicznych. Na przykład zastosowana może być publiczna baza danych Medline, dostępna w Internecie, na przykład pod adresem http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Dalsze bazy danych i adresy, takie jak http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research.tools.html, http://www.tigr.org/, są znane fachowcom i również mogą zostać uzyskane z użyciem np. http://www.lycos.com. Opis informacji patentowych w biotechnologii i przegląd odpowiednich źródeł informacji patentowej korzystnej do przeszukiwania retrospektywnego oraz na bieżąco jest podana w Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Ryciny przedstawiają:

Fig. 1: (a) Analiza Northern blot całkowitego RNA wyekstrahowanego z liści pięciu niezależnych roślin transgenicznych (SAT-65, 26, 48, 3 i 71) i dwóch roślin typu dzikiego (kontrola a i b). Blot był sondowany DNA cysE znakowanym ³²P z E. coli. Ścieżki zawierały 15 μg całkowitego RNA każda.

(b) Maksimum aktywności katalitycznej SAT w liściach pięciu niezależnych roślin transgenicznych (SAT-65, 26, 48, 3 i 71) i dwóch roślin typu dzikiego (kontrola a i b). Specyficzna aktywność surowego ekstraktu jest podana w pmol wyprodukowanego CoA na min i μg całkowitego białka. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe (< 10%). N=4 niezależne pomiary.

Fig. 2: (a) Endogenne poziomy cysteiny w liściach 6-tygodniowych roślin transgenicznych (SAT48 i SAT-26) i dzikim typie roślin (kontrola a i b). Ilości cysteiny są podane w nmol na gśw. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe (< 20). N=18; 6 niezależnych roślin na linię transgeniczną, 3 niezależne pomiary na roślinę.

(b) Endogenne poziomy glutationu w liściach 6-tygodniowych roślin transgenicznych (SAT-48 i SAT-26) oraz roślin typu dzikiego (kontrola a i b). Ilości glutationu są podane w nmol na gram świeżej masy (ang. gfw). Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe (< 10). N=18; 6 niezależnych roślin na linię transgeniczną, 3 niezależne pomiary na roślinę.

Fig. 3: Analiza Northern blot całkowitego RNA wyekstrahowanego z liści pięciu niezależnych roślin transgenicznych (SAT-65, 26, 48, 3 i 71) i dwóch roślin typu dzikiego (kontrola a i b). Blot był sondowany cDNA plastydowego OAS-TL z ziemniaka i wyznakowanego ³²P (p) oraz izoformą cytozolową (c). Ścieżki zawierały 15 μg całkowitego RNA każda.

PL 205 174 B1

Fig. 4: Aktywność OAS-TL in vitro w liściach roślin transgenicznych (SAT-48 i 26) oraz roślin typu dzikiego (kontrola a i b). Specyficzna aktywność surowych ekstraktów jest podana w pmol produkowanej cysteiny na min i μg całkowitego białka. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe (< 10%). N=4 niezależne pomiary.

Przykłady ilustrujące wynalazek:

P r z y k ł a d 1: Przesiew pod względem transgenicznych roślin ziemniaka zawierających mRNA SAT z E. coli

Celem skierowania SAT z E. coli do chloroplastów roślin skonstruowano gen fuzyjny z peptydem tranzytowym Rubisco z Arabidopsis. SAT z genomowego DNA E. coli był amplifikowany PCR-em przy użyciu dwóch syntetycznych oligonukleotydów (EcSAT-N: 5'-GAG AGA CCA TGG CGT GTG AAG AAC TGG AAA, EcSAT-C: 5'-GAG AGA TCT AGA TTA GAT CCC ATC CCC ATA) Dwuniciowy DNA był trawiony Nco I oraz Xba I i klonowany poza peptydem tranzytowym. Produkt fuzji genów był wstawiany jako fragment Asp 718/Xho I do strawionego wcześniej Asp 718/Sal I wektora binarnego (Hofgen i Willmitzer, 1990) pod kontrolą promotora 35S-CaMV. Plazmid był wstawiany do ziemniaka poprzez Agrobacterium tumefaciens (Solanum tuberosum cv Desiree), jak opisano w Rocha-Sosa i wsp. (1989). Solanum tuberosum cv Desiree otrzymano z Vereinigte Saatzuchten eG (Ebstorf, Niemcy). Rośliny typu dzikiego i transgeniczne były trzymane w hodowli tkankowej w okresie 16-godzin-światło/8-godzin-ciemność na podłożu Murashige i Skoog (Murashige i Skoog, 1962) uzupełnionym 2% (cięż/obj) sacharozą w 22°C. W szklarni, rośliny hodowano w 22°C w okresie światła (16 godzin) i 15°C podczas pory ciemnej (8 godzin). Rośliny hodowano w oddzielnych pojemnikach i podlewano podsiąkowo.

Transgeniczne rośliny ziemniaka trzymane w hodowli tkankowej były wzrokowo nierozróżnialne od niestransformowanych roślin kontrolnych. Celem wyszukania roślin produkujących mRNA dla SAT z E. coli, wybrano losowo pięćdziesiąt roślin celem pobrania próbek liści. Próbki te były poddane analizie blot RNA w żelu przy użyciu radioaktywnie wyznakowanego cDNA SAT z E. Coli, jako sondy. Do izolacji RNA, komórki roślinne były zamrażane w ciekłym azocie natychmiast po pobraniu. Całkowite RNA było ekstrahowane z zamrożonego materiału według Logemann i wsp. (1987). Po denaturacji w 65°C, całkowite RNA było rozdzielane w warunkach denaturujących elektroforezy w żelu (Lehrach, 1977), a następnie przenoszone na błony nylonowe. Hybrydyzację Northern wykonywano w odpowiedniej temperaturze jak opisano w Amasino (1986). Northern bloty przemywano trzykrotnie przez 30 min w 55°C w 0,5xSSC; 0,2% SDS. Znakowanie fragmentów ³²P było wykonywane za pomocą Multiprime DNA-labelling-Kit (Amersham Buchler, Braunschweig, Niemcy). Wyselekcjonowano pięć niezależnych transformantów gromadzących duże ilości obcego mRNA SAT, celem dalszej analizy i przeniesiono do szklarni. Powtórna analiza Northern wykazała, że w warunkach szklarniowych transformanty również gromadziły duże ilości obcego mRNA (Fig. 2a). Długość wykrytego transkryptu w transgenicznych roślinach ziemniaka (= 1050 par zasad) zgadzała się z długością odnotowaną dla genu cysE, to znaczy 819 pz (Denk i Bock. 1987) i z użytą sekwencją, sygnałową z rubisco (= 240 pz). Celem pomiaru aktywności SAT zastosowano test według metody Kredich i Tomkins (1966). Metoda jest oparta na wymianie wiązań disiarczkowych pomiędzy CoA uwolnionym z reszty acetylowej podczas katalizowanej przez SAT reakcji, a 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoesanem). Tworzenie CoA było testowane w 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) zawierającym 1 mM kwas 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoesowy), 1 mM EDTA, 20 mM L-serynę i 100 pM acetylo-CoA. Reakcję rozpoczynano poprzez dodanie 10 μl surowego ekstraktu z liści (1,5 μg/μl całkowitego białka), temperatura inkubacji - 25°C. Powstawanie kwasu tionitrobenzoesowego było monitorowane przy 412 nm w spektrofotometrze (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja) wobec kontrolnej ślepej próby, zawierającej wszystkie materiały z wyjątkiem L-seryny. Krzywa kalibracyjna została ustalona z roztworami kontrolnymi, zawierającymi wszystkie materiały i różne stężenia CoA (0-200 nmol/ml). Test aktywności powtarzano niezależnie z różnymi objętościami surowego ekstraktu, tj. 20, 40 i 60 gl. Analiza aktywności SAT w surowych ekstraktach liści pokazała, że rośliny ziemniaka produkujące gen z E. coli przekształcały serynę do OAS znacznie bardziej wydajnie niż nietransformowane rośliny kontrolne (Fig. 2b), sugerując, że stransformowane rośliny posiadają zwiększoną aktywność SAT, która najprawdopodobniej pochodzi z obcej acetylotransferazy seryny E. coli. Pomimo silnego wzrostu aktywności SAT w liściach roślin transgenicznych nie obserwowano dramatycznej zmiany w fenotypie tych roślin w jednym wyjątkiem: transformant 48 wykazywał zredukowaną dominancję wierzchołkową prowadzącą do fenotypu krzaczastego. Co ciekawe, transformant 48 miał najwyższą aktywność SAT ze wszystkich roślin transgenicznych.

PL 205 174 B1

P r z y k ł a d 2: Ekspresja genu cysE prowadzi do wzrostu endogennych poziomów cysteiny i glutationu

Biosynteza cysteiny w roślinach jest dwuetapowa. Powstanie cysteiny z siarczku i O-acetylo-L-seryny jest katalizowane przez O-acetyloseryno(tiolo)liazę. O-acetylo-L-seryna jest syntetyzowana przez acetylotransferazę seryny z acetylokoenzymu A i seryny (Brunold i Rennenberg. 1997). Celem sprawdzenia, czy ekspresja genu cysE w roślinach ziemniaka wpływa na endogenny poziom cysteiny, określano stężenie tego zawierającego siarkę aminokwasu w roślinach niestransformowanych i stransformowanych. Przygotowano tiole jak opisano w Rϋegsegger i Brunold (1992). Rozdzielanie i ocena ilościowa była dokonywana poprzez HPLC z odwróconymi fazami po derywatyzacji z odczynnikiem monobromobinianem według Newton i wsp. (1981). Jako modyfikację, przeprowadzano redukcję dwusiarczków za pomocą bis-2-merkaptoetylosulfonu, a reakcję znakowania monobromobinianem zatrzymywano 15% HCl. Zamrożone liście rozcierano na drobny proszek, a następnie ekstrahowano 20 min w 0,1 N HCl (2 ml/0,2 gśw) w 4°C. Po odwirowaniu mieszaniny w 4°C (20 min, 14000 g), 120 μl supernatantu dodawano do 200 μl 0,2 M 2-(cykloheksylamino) etanosulfonianu (pH 9,3). Redukcję wszystkich dwusiarczków przeprowadzano poprzez dodanie 10 μl bis-2-merkaptoetylosulfonianu w 9 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (pH 8). Po 40 min reakcji w temperaturze pokojowej, wolne grupy tiolowe znakowano monobromobinianem. Celem przeprowadzenia tego, do mieszaniny dodawano 20 μl 15 mM monobromobinianu w acetonitrylu i trzymano 15 min w ciemności, w temperaturze pokojowej. Reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 250 μl 15% HCl. Po dwóch godzinach trzymania w lodzie w ciemności, mieszaninę reakcyjną ponownie wirowano w 4°C (10 min, 14000 g). Do analizy glutationu i cysteiny, supernatant odpowiednio rozcieńczano 0,1 N HCl. Próbki analizowano według metody Schupp i Rennenberg (1988) na kolumnie HPLC z odwróconymi fazami (C18, 250 x 4 mm, cząstki o wielkości 5 μm, Macherey-Nagel, Oensingen, Szwajcaria). Zastosowano system rozpuszczalników, składający się z 10% metanolu; 0,25% kwasu octowego, pH 3,9 (NaOH) oraz 90% metanolu; 0.25% kwasu octowego, z szybkością przepływu 1,5 ml/min. Po chromatografii następowała detekcja fluorescencyjna (ekscytacja: 380 nm, emisja: 480 nm, detektor fluorescencji SFM 25, Kontron, Zurich, Szwajcaria). Chromatogramy oceniano ilościowo poprzez integrację powierzchni pod wykresem. Do analizy cysteiny zastosowano dwa transformanty o najwyższej aktywności SAT, tj. SAT-48 i SAT-26 (patrz Fig. 2b). Celem wykonania tego, zbierano młode i zielone liście 5-tygodniowych roślin, ekstrahowano, a zawartość cysteiny była określana poprzez HPLC. Transgeniczne rośliny ziemniaka z ekspresją genu cysE z E. coli posiadały znacząco podwyższone poziomy cysteiny (Fig. 3a). Poziomy dla transformanta SAT-48 były niemal trzykrotnie (45 ± 10 nmol na gram masy świeżej tkanki), a transformanta SAT-26 dwukrotnie (33 ± 6 nmol/gśw) wyższe niż ilości w nietransformowanych roślinach kontrolnych (17 ± 3 nmol/gśw), wskazując na to, że ekspresja cysE prowadzi do wzrostu endogennych poziomów aminokwasu cysteiny.

Jednym z głównych magazynów cysteiny wyprodukowanej poprzez kaskadę asymilacji siarczanu/redukcji jest powstanie glutationu, trójpeptydu składającego się z aminokwasów glutaminianu, cysteiny i glicyny. Ponieważ transgeniczne rośliny ziemniaka produkujące SAT z E. coli zawierały więcej cysteiny, możliwe jest, że mogło to mieć wpływ na biosyntezę glutationu, biorąc pod uwagę, że cysteina jest jednym z substratów do produkcji glutationu. Celem sprawdzenia, czy tak jest w tym przypadku, analizowano poziomy glutationu w liściach transformantów linii SAT-48 i SAT-26 oraz roślin dzikiego typu. Pomiary wykazały, że oba transformanty miały znacząco podniesione poziomy glutationu, niemal dwukrotnie wyższe (500-600 nmol/gśw) niż w roślinach typu dzikiego (300-350 nmol/gśw; Fig. 3b). Sugeruje to, że zwiększone poziomy cysteiny stymulują biosyntezę glutationu.

Biorąc pod uwagę, że jedna cząsteczka glutationu zawiera jedną cząsteczkę cysteiny, a całkowita molowa zawartość glutationu w liściach ziemniaka jest ponad 10-krotnie wyższa niż molowe ilości wolnego aminokwasu cysteiny, wywnioskować można, że zdolność do syntezy cysteiny w transgenicznych roślinach ziemniaka jest znacznie większa niż tylko dwa- lub trzy razy, jak można by wywnioskować patrząc na poziomy wolnej cysteiny. Absolutny wzrost 200-300 nmol glutationu/gśw w roślinach transgenicznych odpowiada zatem około 10 do 18-krotnemu wzrostowi zdolności do syntezy cysteiny, przy około 15-20 nmol cysteiny/gśw w liściach roślin typu dzikiego. Dodając to do zwiększonych poziomów wolnej cysteiny w roślinach transgenicznych o około dwa do trzy razy, biosynteza cysteiny w transformantach jest prawie 20-krotnie wyższa niż w roślinach kontrolnych.

P r z y k ł a d 3: Zwiększone endogenne poziomy cysteiny i glutationu nie wpływają na wzór ekspresji izoform OAS-TL

PL 205 174 B1

Metabolicznie znacząca regulacja aktywności SAT poprzez allosteryczne hamowanie cysteiny została wykazana dla enzymu z arbuza (Saito, 1995). Bakteryjne SAT są na poziomie transkrypcyjnym hamowane w sposób zwrotny przez mikromolowe stężenie cysteiny. Przeciwnie, w sytuacji ograniczenia cysteiny, ekspresja bakteryjnych SAT ulega stymulacji (Kredich, 1987). Dodatkowo, O-acetyloseryno(tiolo)liaza, która jest enzymem działającym bezpośrednio po SAT w kaskadzie biosyntezy cysteiny, jest również regulowana przez cysteinę na poziomie transkrypcyjnym. Obserwowano, że ekspresja różnych cDNA kodujących izoformy 0-acetyloseryno(tiolo)liazy specyficzne dla przedziałów komórkowych z Arabidopsis była stymulowana w roślinach rosnących przy ograniczonym dostępie siarki (Hell, 1994; Barroso, 1995; Hesse, 1997). Również w szpinaku ekspresja izoform O-acetyloseryno(tiolo)liazy jest lekko podwyższona w warunkach braku siarki (Takahashi i Saito, 1996). Celem sprawdzenia, czy zwiększone poziomy cysteiny w transgenicznych roślinach ziemniaka z ekspresją genu cysE z E. coli wpływa na wzór ekspresji endogennego OAS-TL z ziemniaka, pobierano próbki liści z roślin transgenicznych i nietransformowanych i poddawano analizie blot RNA; patrz Przykład 1. Do radioaktywnego wyznakowania cDNA OAS-TL z ziemniaka (Hesse i Hofgen, 1998), DNA cięto za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych i rozdzielano na 1% żelu agarozowym. Fragmenty DNA izolowano z żelu, stosując zestaw NucleoSpin Extract z Macherey-Nagel (Diiren, Niemcy). Analiza ta wykazała, że chociaż transgeniczne rośliny zawierały znacznie więcej cysteiny w liściach, geny OAS-TL z ziemniaka (zarówno izoformy cytozolowej jak i chloroplastydowej, Hesse i Hofgen, 1998) nie wykazywały zmienionej szybkości transkrypcji w porównaniu z ekspresją w dzikim typie roślin (Fig. 4a). Sugeruje to, że zwiększone poziomy cysteiny w transgenicznych roślinach ziemniaka nie miały wykrywalnego wpływu na poziomie transkrypcji na wzór ekspresji OAS-TL.

P r z y k ł a d 4: Zwiększone endogenne poziomy cysteiny nie wpływają na aktywność O-acetyloseryno(tiolo)liazy

OAS-TL jest regulowany na poziomie aktywności przez stan siarki w komórce. Aktywność cytozolowej O-acetyloseryno(tiolo)liazy z Arabidopsis thaliana, na przykład, jest aktywowana dzięki ograniczeniu ilości siarki (Barroso, 1995; Hesse, 1997). Wzrost specyficznej aktywności przez wyczerpanie siarki był również obserwowany w hodowli komórek tytoniu i C. reinhardtii oraz w liściach kukurydzy (Bergmann, 1980; Passera i Ghisi, 1982; Leon, 1988). Przeciwnie, wysokie stężenie siarki wydaje się obniżać aktywność OAS-TL. Przykładowo, enzym z Datura innoxia jest hamowany przez wyższe stężenia siarczku (Kuske, 1994). W komórkach C. reinhardtii aktywność OAS-TL jest hamowana nie tylko przez siarczek, ale również przez OAS i cysteinę (Leon i Vega, 1991). Celem sprawdzenia, czy zwiększona aktywność SAT i zmienione poziomy cysteiny i glutationu w transgenicznych roślinach ziemniaka mają wpływ na aktywność OAS-TL, wykonywano test na aktywność tego enzymu z wykorzystaniem surowych ekstraktów z liści. Aktywność O-acetyloseryno(tiolo)-liazy była mierzona poprzez pomiar produkcji L-cysteiny. Każdy test zaczynał się dodaniem 5 μl surowego ekstraktu z liści (1 pg/pl białka całkowitego). Reakcje przeprowadzano w 50 mM K2HPO4/KH2PO4 (pH 7,5) w obecności 5 mM DTT, 10 mM O-acetyloseryny i 2 mM Na₂S (całkowita objętość 100 pl) i pozostawiane do zajścia reakcji na 20 min w 25°C. Reakcję zatrzymywano poprzez dodanie 50 pl 20% kwasu trójchlorooctowego, a następnie analizowane pod kątem produkcji L-cysteiny za pomocą odczynnika Gaitonde (Gaitonde, 1967). Zawartość cysteiny była monitorowana przy 560 nm w spektrofotometrze (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja) wobec ślepej próby zawierającej wszystkie odczynniki z wyjątkiem O-acetyloseryny. Eksperymenty powtarzano trzy razy. Jednakże, pomiary te wykazały brak różnic w aktywności OAS-TL pomiędzy ekstraktem z liści roślin transgenicznych, a roślin typu dzikiego (Fig. 4b). Tym samym, można przypuszczać, że wyższe poziomy cysteiny i glutationu w roślinach transgenicznych nie tylko nie miały wykrywalnego wpływu na poziom ekspresji genu ale nie miały również wpływu na aktywność OAS-TL.

P r z y k ł a d 5. Ekspresja w transgenicznych roślinach ziemniaka zawierających SAT z E. coli i roślinne mRNA CyS.

Dwie linie transgeniczne produkujące SAT z E. coli (np. SAT-48 i SAT-26) zostały wybrane do nadkażenia konstruktem plazmidu binarnego zawierającego cDNA dla CyS np. z ziemniaka pod kontrolą promotora 35S i B33, odpowiednio. Wektor binarny jest 19-pochodną pBIN umożliwiającą selekcję roślin na odporność na higromycynę. Plazmidy wprowadzano do transgenicznych linii SAT-48 i - 26, odpowiednio poprzez Agrobacterium tumefaciens, jak opisano w Rocha-Sosa, (1989). Warunki selekcji wybrano, jak opisano w przykładzie 1. Superinfekowane linie transgeniczne produkujące SAT z E. coli i CyS były badane na poziomie RNA (Northern Blot), białka (Western Blot) i aktywności enzymatycznej. Eksperymenty Northern Blot były wykonywane, jak opisano w przykładzie 1. Linie z wy16

PL 205 174 B1 soką ekspresją CyS zostały wyselekcjonowane pod kątem zawartości białka i aktywności enzymatycznej. Testowano 10 μg białka z każdego ekstraktu z liścia na Western Blot na zwiększoną zawartość białka w odniesieniu do typu dzikiego i oryginalnie stosowanej linii transgenicznej. Linie o zwiększonej zawartości białka były dodatkowo testowane na aktywność enzymatyczną. 10 μg, 25 μg, 50 μg i 100 gg ekstraktu z liścia było inkubowane z 10 μ Ci ³⁵S-Cysteiny i 10 mM sukcynylohomoserymy przez 30 min w 3 0°C, w całkowitej objętości 200 gl 50 mM Tris/HCl, pH 7.8 i 10 mM DTT. Reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 50 gl 20% TCA. Po neutralizacji i wirowaniu 5 gl każdego supernatantu było analizowane na chromatografii cienkowarstwowej. Jako rozwijacza stosowano mieszaninę metanol/etyloester kwasu octowego/ H2O=60:30:10). Rośliny transgeniczne o wysokiej aktywności były w dalszej kolejności analizowane na zawartość GSH, CyS i Met.

Literatura

Alscher, Physiol Plant 77 (1989), 457-464 Amasino, Anal Biochem 152 (1986), 304-307

Anderson, Sulfur metabolism in plants. W BJ Miflin, PJ Lea, wyd, The Biochemistry of Plants.

Academic Press, New York (1990), 327-381

Barroso, FEBS Lett 363 (1995), 1-5

Bergmann, Z Naturforsch 35c (1980), 952-957

Bogdanova, FEBS Lett 358 (1995), 43-47

Bogdanova, Plant J 11 (1997), 251-262

Breton, J Bid Chem 265 (1990), 18248-18255

Brunold, Planta 155 (1982), 321-327

Brunold, Academic Publishers, Haga, Holandia (1993), 61-76

Brunold, Prog Bot58 (1997), 164-186

Cook, Arch Biochem Biophys 178 (1977), 293-302

Delhaize, Plant Physiol 89 (1989), 700-706

Denk, J Gen Microbiol 133 (1987), 515-525

Droux, Arch Biochem Biophys 295 (1992), 379-390

Evans, J Bacteriol 173 (1991), 5457-5469

Gaitonde, Biochem J 104 (1967), 627-633

Ghisi, Plant Physiol 92 (1990), 846-849

Ghisi, Photosynthetica 29 (1993), 543-549

Giovanelli, The biochemistry of plants: A comprehensive treatise, amino acids and derivatives.

Academic Press, New York 5 (1980), 453-505

Giovanelli, Academic Publishers, Haga, Holandia (1990), 33-48

Hell, FEES Lett 351 (1994). 257-62

Hesse, WJ Cram I wsp., wyd, Sulphur Metabolism in Higher Plants. Backhuys Publishers, Leiden, Holandia (1997), 227-230

Hesse, Plant Phys 116 (1998), 1604

Kredich, J Biol Chem 241 (1966), 4955-4965

Kredich, J Biol Chem 244 (1969), 2428-2439

Kredich, Cellular i Molecular Biology. American Society of Microbiology,

Washington DC (1987), 419-428

Kredich, Academic Publishers, Haga, Holandia (1993), 37-47

Kuske, J Biol Chem 269 (1994), 6223-6232

Kuske, Plant Physiol 112 (1996), 659-667

Lai, Gene 119 (1992), 113-118

Lehrach, Biochem 16 (1977), 4743-4751

Leon, J Plant Physiol 132 (1988), 618-622

Leon, Plant Physiol Biochem 29 (1991), 595-599

Logemann, Anal Biochem 163 (1987), 21-26

Lunn, Plant Physiol 94 (1990), 1345-1352

Meister, Annu Rev Biochem 52 (1983), 711-760

Monroe, J Bacteriol 172 (1990), 6919-6929

Murashige, Physiol Plant 15 (1962), 473-479

Murillo, Cell Mol Biol 41 (1995), 425-433

Nakamura, Plant Cell Physiol 28 (1987), 885-891

PL 205 174 B1

Nakamura, Plant Cell Physiol 29 (1988), 689-693

Nakamura, Agric Biol Chem 54 (1990), 649-656

Neuenschwier, Plant Physiol 97 (1991, 253-258

Newton, Anal Biochem 114 (1981), 383-387

Ngo, Can J Biochem 52(1974), 435-440

Noctor, Plant Physiol 112 (1996), 1071-1078

Noji, Mol. Gen. Genet. 244 (1994), 57-66

Nussbaum, Plant Physiol 88 (1988), 1407-1410

Ostrowski. J Bacteriol 171 (1989), 130-140

Passera, J Exp Bot 33 (1982), 432-438

Rauser, Plant Physiol 97 (1991), 128-138

Ravanel, C R Acad Sci Paris 320 (1997), 497-504

Rennenberg, Plant Physiol 73 (1983), 560-565

Rennenberg, SPB Academic Publishers, Haga (1990), 276

Rennenberg, Prog Bot 55 (1994), 142-156

Rennenberg, Cambridge University Press, Cambridge, UK (1995), 155-171 Roberts, Plant Mol Biol 30 (1996), 1041-1049

Rocha-Sosa, EMBOJ 8 (1989), 23-29 Rolland, Plant Physiol 98 (1992), 927-935

Rolland, Arch Biochem Biophys 300 (1993), 213-222

Rolland, Eur J Biochem 236 (1996), 272-282

Rϋegsegger, Plant Physiol 99 (1992), 428-433

Ruffet, Plant Physiol 104 (1994), 597-604

Ruffet, Eur J Biochem 227 (1995), 500-509

Saito, Proc Nati Acad Sci USA 89 (1992), 8078-8082

Saito, FEBS Lett 324 (1993), 247-252

Saito, J Biol Chem 269(1994), 28187-28192

Saito, Plant Physiol 106 (1994), 887-895

Saito, J Biol Chem 270 (1995), 16321-16326

Schmidt, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 43 (1992). 325-349

Schupp, Plant Sci 57 (1988), 113-117

Smith, Biochem Biophys Res Commun 35 (1969), 939-945

Smith, Biochim Biophys Ada 277 (1971), 288-295

Smith, Plant Physiol 50 (1972), 477-479

Smith, Alscher RG, Cumming JR (wyd.) Wiley-Liss, New York (1990), 201-215

Takahashi, Plant Physiol 112 (1996), 273-280

Vaara, FEMS Microbioi Lett 97 (1992), 249-254 von Arb, Physiol Plant 67 (1986), 81-86

Vuorio, FEBS Lett 292 (1994), 90-94

Youssefian, Plant J 4 (1993), 759-769

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób zwiększenia zawartości związków zawierających siarkę w transgenicznych roślinach, komórkach lub tkance roślinnej, znamienny tym, że wprowadza się co najmniej jedną cząsteczkę rekombinowanego DNA stanowiącego cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego białko posiadające aktywność acetylotransferazy serynowej (SAT) lub wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego białko posiadające aktywność SAT do rośliny, komórki roślinnej lub tkanki rośliny, przy czym wspomniany kwas nukleinowy jest operacyjnie związany z elementami regulatorowymi pozwalającymi na ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego w komórkach roślinnych, przy czym we wspomnianej roślinie, komórce roślinnej lub tkance rośliny nie prowadzi się ekspresji egzogennie wprowadzonej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej białko posiadające aktywność liazy(tiolo)-O-acetyloserynowej (OASTL).
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniane białko mające aktywność SAT jest acetylotransferazą serynową z prokariontów lub archebakterii.

   PL 205 174 B1
3. 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z sekwencją nukleotydową kodującą peptyd tranzytowy zdolny do kierowania białka do odpowiedniego przedziału komórkowego
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wspomnianym przedziałem komórkowym jest plastyd.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że wspomniane elementy regulatorowe zawierają promotor aktywny w komórkach roślinnych.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że wspomniany promotor jest indukowalnym, ulegającym konstytutywnej ekspresji i /lub jest promotorem komórkowo, tkankowo lub organospecyficznym.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że wspomniany promotor jest specyficzny dla bulw, nasion, endospermy, zarodka lub floemu.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, znamienny tym, że wektor zawiera ponadto marker selekcyjny.
9. 9. Transgeniczna komórka roślinna, znamienna tym, że zawiera stabilnie wintegrowaną do genomu co najmniej jedną cząsteczkę rekombinowanego DNA jak zdefiniowano w zastrz. 1.
10. 10. Transgeniczna komórka roślinna według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera marker selekcyjny.
11. 11. Roślina transgeniczna lub tkanka roślinna, znamienna tym, że zawiera transgeniczne komórki roślinne zdefiniowane w zastrz. 9 lub 10.
12. 12. Roślina transgeniczna według zastrz. 11, znamienna tym, że poziom glutationu, cysteiny i/lub metioniny jest podwyższony w porównaniu z rośliną typu dzikiego.
13. 13. Roślina transgeniczna według zastrz. 11 lub 12, znamienna tym, że rośliną jest kukurydza.
14. 14. Zbierane części rośliny transgenicznej zdefiniowanej w zastrz. 11, znamienne tym, że zawierają transgeniczne komórki roślinne zdefiniowane w zastrz. 9 lub 10.
15. 15. Materiał rozmnożeniowy rośliny transgenicznej zdefiniowanej w zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera transgeniczne komórki roślinne zdefiniowane w zastrz. 9 lub 10.
16. 16. Materiał rozmnożeniowy według zastrz. 15, znamienny tym, że jest on nasieniem.
17. 17. Żywność, karma zwierzęca, lub dodatki, znamienne tym, że zawierają transgeniczne komórki roślinne zdefiniowane w zastrz. 9, tkankę roślinną lub komórkę rośliny zdefiniowaną w zastrz. 11, zbierane części roślin zdefiniowane w zastrz. 14 lub materiał rozmnożeniowy zdefiniowany w zastrz. 15.