DE69930270T2

DE69930270T2 - Verfahren zur erhöhung des gehaltes an schwefelverbindungen in pflanzen

Info

Publication number: DE69930270T2
Application number: DE69930270T
Authority: DE
Inventors: Holger Hesse; Karsten Harms; Rainer Höfgen
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1998-07-07
Filing date: 1999-07-07
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2019-07-08
Also published as: HUP0203469A3; US6608239B1; CA2336893A1; DE69930270D1; HUP0203469A2; CZ200118A3; PL345346A1; EP1095155B1; ATE319847T1; AU773973B2; ES2260926T3; EP1095155A1; PL205174B1; CZ301853B6; WO2000001833A1; AU5370399A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhöhen des Gehalts an schwefelhaltigen Verbindungen in transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe, bestehend aus der Einführung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Protein mit Serin-Acetyltransferase-(SAT)-Aktivität codiert, in eine Pflanze, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell mit Regulationselementen verknüpft ist, die die Expression des Nucleinsäuremoleküls in Pflanzenzellen erlauben, wobei die Pflanze, Pflanzenzelle oder das Pflanzengewebe ein exogen eingeführtes Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit O-Acetylserin-(Thiol)-Lyase-(OASTL)-Aktivität codiert, nicht exprimiert. Ebenfalls beschrieben wird ein rekombinantes DNA-Molekül umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit Serin-Acetyltransferase-(SAT)-Aktivität codiert; wobei das Nucleinsäuremolekül bzw. die Nucleinsäuremoleküle funktionell mit Regulationselementen, die die Expression des Nucleinsäuremoleküls bzw. der Nucleinsäuremoleküle in Pflanzenzellen erlauben, verknüpft ist bzw. sind. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Vektoren, umfassend die rekombinanten DNA-Moleküle, sowie Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzen, die damit transformiert sind. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin die Verwendung der oben genannten rekombinanten DNA-Moleküle und Vektoren in der pflanzlichen Zell- und Gewebekultur, in der Pflanzenzüchtung und/oder in der Landwirtschaft. Weiterhin beinhaltet die vorliegende Erfindung die Herstellung von Nahrungsmitteln, Futtermitteln oder Zusätzen dafür, die die oben beschriebenen Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzen umfassen.
Die höheren Pflanzen nutzen das anorganische Sulfat im Boden als Hauptschwefelquelle für die Synthese der schwefelhaltigen Aminosäuren Cystein und Methionin. Es wurde die Theorie aufgestellt, daß die Cysteinbiosythese in Pflanzen eine wesentliche Rolle im Schwefelzyklus in der Natur spielt. Reduzierter Schwefel in Form von Cystein wird für viele unterschiedliche Funktionen in Pflanzen benötigt (Rennenberg, 1990; Schmidt, 1992). Es ist für den normalen pflanzlichen Metabolismus deshalb essentiell, da es den Serin- und den Methioninmetabolismus verbindet, und zwar dadurch, daß es den für die Methioninbiosynthese erforderlichen reduzierten Schwefel überträgt (Giovanelli, 1990; Ravanel, 1997; Brunold und Rennenberg, 1997). Außerdem dient Cystein als Substrat für andere schwefelhaltige Moleküle wie gewisse Kofaktoren, Membranverbindungen sowie als essentielle Aminosäure für die Proteinsynthese (Giovanelli, 1980; Schmidt, 1992). Cystein ist auch als Vorstufe für die Produktion von Glutathion (GSH) und anderen mit Stress assoziierten Metaboliten essentiell. Der Cysteinbedarf schwankt während der Pflanzenentwicklung und ist auch von Umweltveränderungen abhängig, darunter Licht, Verfügbarkeit von Sulfat und gewisse Arten von abiotischem oder biotischem Stress (von Arb und Brunold 1986; Nussbaum, 1988; Delhaize, 1989; Rauser 1991; Ghisi, 1993; Hell, 1994).
Für die Cysteinbiosynthese muß zuerst L-Serin aktiviert werden, und zwar durch die Übertragung einer Acetylgruppe von Acetyl-Coenzym A unter Bildung des Zwischenprodukts O-Acetyl-L-Serin (OAS). Diese wichtige Reaktion wird durch die Serin-Acetyltransferase (SAT) katalysiert. Die Aktivierung von Serin, eine Schlüsselreaktion im Cystein-Biosyntheseweg, wurde auf molekularer Ebene nur an Prokaryonten untersucht (Breton, 1990; Monroe, 1990; Evans, 1991, Lai und Baumann, 1992). Die Cysteinsynthese in Pflanzen erfolgt durch Sulfhydrylierung von O-Acetyl-L-Serin in Gegenwart von freiem oder gebundenem Sulfid und wird durch die O-Acetylserin(Thiol)-Lyase (OAS-TL, Cysteinsynthase, CSase; EC 4.2.99.8.) katalysiert (Schmidt und Jäger, 1990). Diese Reaktion wurde intensiv untersucht (Saito, 1992; 1993 und 1994; Rolland, 1993 und 1996; Youssefian, 1993; Noji, 1994; Hell, 1994; Kuske, 1994 und 1996; Takahashi und Saito, 1996).
Bei Bakterien bilden die SAT und die OAS-TL einen bifunktionellen Komplex, der als Cysteinsynthase bezeichnet wird. Bei diesem Komplex ist die O-Acetylserin(Thiol)-Lyase nur in geringem Ausmaß (5%) mit der SAT-Aktivität assoziiert (Kredich, 1969). Außerdem haben Untersuchungen zur Regulation der Cysteinbiosynthese bei Bakterien gezeigt, daß die Serin-Acetyltransferase gegenüber Feedback-Hemmung durch L-Cystein empfindlich ist und daß an der transkriptionsmäßigen Aktivierung von mehreren der Cys-Operon-Promoter O-Acetylserin (oder N-Acetylserin) beteiligt ist (Ostrowski und Kredich, 1989; Kredich, 1993).
In jüngster Zeit wurden pflanzliche cDNAs, die Serin-Acetyltransferasen codieren, aus unterschiedlichen Arten kloniert (Bogdanova, 1995; Murillo, 1995; Ruffet, 1995; Saito, 1995; Roberts und Wray, 1996). Bei Pflanzen liegt die SAT ebenfalls in einem Komplex mit der OAS-TL vor, was eine wirksame Umlenkung des Stoffwechsels von Serin zu Cystein nahelegt, und zwar dadurch, daß die Diffusion des Zwischenprodukts O-Acetyl-L-Serin verhindert wird (Nakamura, 1988; Nakamura und Tamura, 1990; Ruffet, 1994; Bogdanova und Hell, 1997; Hesse, 1997). Es wurde berichtet, daß sowohl die SAT als auch die OAS-TL bei mehreren Pflanzen in den Plastiden, in den Mitochondrien und im Cytosol lokalisiert sind, was nahelegt, daß die Fähigkeit, Cystein zu synthetisieren, in allen Zellkompartimenten mit einer endogenen Fähigkeit zur Proteinbiosynthese erforderlich zu sein scheint (Smith und Thompson, 1969; Smith, 1972; Brunold und Suter, 1982; Lunn, 1990; Rolland, 1992; Ruffet, 1994). Bei Pisum sativum zum Beispiel existieren drei unterschiedliche Isoformen der SAT, und jede Isoform scheint für ein bestimmtes Kompartiment in der Zelle spezifisch zu sein (Ruffet, 1995). Zusätzlich zu diesen erforderlichen Stellen in der Zelle legt die Tatsache, daß die Cysteinbiosynthese in komplexer Wechselwirkung mit der Aufnahme und Reduktion von Sulfat steht, welche selbst wiederum durch die Photosynthese und die Nitratassimilation reguliert ist (Anderson, 1990; Brunold, 1993), nahe, daß die Cysteinbiosynthese eine wichtige Rolle beim Schwefelmetabolismus von höheren Pflanzen spielt.
Ein sehr wichtiges Merkmal der Reaktionssequenzen der Cysteinbildung ist, daß die SAT-Aktivität im Vergleich zu der Aktivität der OAS-TL wesentlich niedriger ist. In Samen und Keimlingen ist die OAS-TL 10 bis 20 mal aktiver als die SAT (Smith, 1971; Ngo und Shargool, 1974). In ganzen Blättern beträgt das Aktivitätsverhältnis der beiden Enzyme 100 bis 300 (Nakamura, 1987), während dieses Verhältnis in den Chloroplasten alleine bis zu 345fach ist (Ruffet, 1994). Wie in Allium und Spinat gezeigt wurde, ist die SAT im Vergleich zu OAS-TL ein Enzym mit geringer Abundanz (Nakamura und Tamura, 1990; Ruffet, 1994). Außerdem wurde diskutiert, daß die Verfügbarkeit der OAS geschwindigkeitsbegrenzend für die Cysteinsynthese ist (Neuenschwander, 1991; Ghisi, 1990; Rennenberg, 1983; Brunold, 1993; Saito, 1994). Bei der Wassermelone wird die SAT-Aktivität in hohem Ausmaß durch Feedback-Hemmung von Cystein reguliert (Saito, 1995). Auf Genexpressionsebene findet ebenfalls eine SAT-Regulation statt. Bei Arabidopsis thaliana wird ungefähr die doppelte Menge an SAT-mRNA als Reaktion auf Stress durch Schwefel und Licht akkumuliert (Bogdanova, 1995). Die Funktion und Rolle der SAT, OAS und OAS-TL in der Reaktionskaskade der Cystein-Biosynthese waren zwar Thema zahlreicher Untersuchungen, Versuche zur Veränderung der Cysteinsyntheserate sind jedoch bis jetzt fehlgeschlagen (Saito, 1994). Wie die Regulation des Cystein-Biosynthesewegs im Detail reguliert wird, ist noch immer nicht vollständig geklärt und wird umstritten diskutiert. Mittel für die Steuerung des Schwefelgehalts in Pflanzen, die bei verschiedenen Aspekten der Landwirtschaft Anwendung finden können, waren daher bis jetzt nicht verfügbar.
Die technische Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegt, bestand daher, dem Bedarf an Verfahren zur Modulation des Gehalts an Schwefelverbindungen in Pflanzen zu entsprechen.
Diese technische Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen beschriebenen Ausführungsformen gelöst.
Außerdem wird in der Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül beschrieben, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit Serin-Acetyltransferase-(SAT)-Aktivität codiert, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell mit Regulationselementen verknüpft ist, die die Expression des Nucleinsäuremoleküls bzw. der Nucleinsäuremoleküle in Pflanzenzellen erlauben.
Der Ausdruck "Protein mit Serin-Acetyltransferase-(SAT)-Aktivität" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang, daß das Protein fähig ist, eine Acetylgruppe von Acetyl-Coenzym A auf L-Serin zu übertragen, wodurch das Zwischenprodukt des Cystein-Biosynthesewegs O-Acetyl-L-Serin gebildet wird.
Der Ausdruck "Protein mit Cystein-γ-Synthase(CγS)-Aktivität" bezeichnet ein Protein, das fähig ist, je nach dem schwefelhaltigen Substrat, nämlich L-Cystein oder Sulfid, die Bildung von L-Cystathionin bzw. L-Homocystein zu katalysieren. Dieses Protein ist auch unter der Bezeichnung Cystathionin-γ-Synthase bekannt. Im vorliegenden Text werden die Ausdrücke "Cystein-γ- Synthase" und "Cystathionin-γ-Synthase" gleichwertig verwendet. Bei Pflanzen katalysiert die CγS üblicherweise die erste für die Methioninbiosynthese spezifische Reaktion, nämlich die Gamma-Substitution des Phosphorylsubstituenten von O-Phosphohomoserin durch Cystein. Cystein stellt daher eine sehr wichtige Vorstufe in der pflanzlichen Methioninbiosynthese dar.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die Codiersequenz des cysE-Gens aus Escherichia coli (Denk und Böck, 1987), das ein Enzym des Cysteinbiosynthesewegs, nämlich die Serin-Acetyltransferase (SAT, EC 2.3.1.30) codiert, unter der Kontrolle des Blumenkohlmosaikvirus-(CaMV)-35S-Promoters in das Genom von Kartoffelpflanzen eingeführt. Um das Protein in den Chloroplasten zu dirigieren, wurde cysE translationsmäßig mit der 5'-Signalsequenz der kleinen Rubisco-Untereinheit fusioniert; siehe Beispiel 1. Erfolgreich transformierte Pflanzen wiesen eine Anhäufung der cysE-mRNA in großen Mengen auf. Weiterhin lag in Rohextrakten von Blättern dieser Pflanzen eine SAT-Aktivität in beträchtlicher Höhe vor, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen bis zu 20 mal höher war. Die transgenen Kartoffelpflanzen, die das E. coli-Gen überexprimierten, wiesen erhöhte Cystein- und Glutathion-(GSH)-Gehalte auf, die zwei- bis dreimal höher als in den Kontrollpflanzen waren; siehe Beispiel 2. Überraschenderweise hatte jedoch die Erhöhung der SAT-Enzymaktivität und des Substrats für die Cysteinbiosynthese, O-Acetyl-L-Serin (OAS), keine Auswirkung auf die Expression und Aktivität der O-Acetylserin(Thiol)-Lyase (OAS-TL), das Enzym, das das OAS, das Produkt der SAT, in Cystein umwandelt; siehe Beispiele 3 und 4. Sowohl die Expression dieses Gens auf RNA-Ebene als auch die Enzymaktivität waren im Vergleich zu den Wildtyppflanzen unverändert.
Aufgrund dieser Versuche gelangte man zu den folgenden Schlußfolgerungen: einerseits wurde die in den transgenen Kartoffelpflanzen exprimierte bakterielle E. coli-SAT als katalytisch funktionelles Protein in den Chloroplasten angehäuft; andererseits war der Cystein- und der Glutathiongehalt in den Zellen in Blättern der transgenen Pflanzen signifikant erhöht. Der Cysteingehalt in einer Transformante (SAT-48) war beinahe dreimal höher, und der in einer anderen Transformante (SAT-26) zweimal höher, als die in untransformierten Kontrollpflanzen gefundenen Mengen, was anzeigt, daß die Expression von cysE für die Stimulation der Cysteinsynthese verantwortlich ist. Die erfindungsgemäß durchgeführten Versuche haben auch gezeigt, daß beide Transformanten signifikant erhöhte Glutathiongehalte aufwiesen, die bis zu zweimal höher als bei den Wildtyppflanzen waren. Diese unerwarteten Ergebnisse zeigen, daß der endogene SAT-Gehalt unter Normalbedingungen ohne Schwefelstress ein limitierender Schritt im Cysteinbiosyntheseweg ist, zumindest im Chloroplasten, an den die E. coli-SAT dirigiert wurde. Dies bedeutet, daß unter den üblichen Bedingungen der OAS-TL-Gehalt ausreicht, um alles in der Zelle produzierte OAS umzuwandeln, und daher für einen normalen Ablauf der Cysteinbiosynthese nicht limitierend ist. Daß eine Überexpression der SAT in den transgenen Kartoffelpflanzen den Cystein- und Glutathiongehalt erhöhen kann, impliziert weiterhin, daß unter Normalbedingungen die Schritte im Sulfat-Assimilationsweg vor dem Einbau von Sulfid in Cystein, also Aufnahme von Sulfat, Aktivierung von Sulfat und Reduktion von Adenosin-5'-Phosphosulfat (APS), ebenfalls für die Cysteinbiosynthese nicht limitierend sind. Die Pflanzen verfügen offenbar über eine ausreichend hohe Sulfataufnahmefähigkeit und Aktivität, um Sulfat in Sulfid umzuwandeln, reduzierten Schwefel, der für die Produktion von Cystein erforderlich ist, in ausreichenden Mengen bereitzustellen. Schließlich muß erwähnt werden, daß die gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellten Ergebnisse direkt den Zusammenhang zwischen freiem Cystein und Glutathion zeigen. Die erhöhten Cysteinmengen in den transgenen Kartoffelpflanzen stimulieren die Glutathionbiosynthese, was zu Tripeptidgehalten führt, die bis zu zweimal höher als bei Wildtyppflanzen sind. Dies legt nahe, daß die Glutathionbiosynthese in Kartoffelblättern durch die Verfügbarkeit von Cystein limitiert wird. Diese Ergebnisse werden durch Versuche an der Pappel, die in jüngster Zeit durchgeführt wurden, bestätigt (Strohn, 1995; Noctor, 1996).
Wie in den gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuchen gezeigt wurde, verfügen Pflanzen über eine ausreichend hohe Sulfataufnahmefähigkeit und Aktivitäten, um Sulfat in Sulfid umzuwandeln, um ausreichende Mengen an reduziertem Schwefel, die für die Biosynthese von schwefelhaltigen Verbindungen erforderlich sind, bereitzustellen. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Erfindung kann also erwartet werden, daß durch das Einführen der Cystein-γ-Synthase, dem ersten Enzym, das für den Methioninbiosyntheseweg in transgenen Pflanzen spezifisch ist, der Methioningehalt in Pflanzen signifikant gegenüber dem Wildtyp erhöht werden kann. Diesbezüglich ist festzustellen, daß eine Erhöhung des Gehalts an schwefelhaltigen Verbindungen in Pflanzen von mindestens 10% bereits vorteilhafte Auswirkungen auf die Pflanze hat, zum Beispiel eine verbesserte Toleranz gegen abiotischen Stress. Vorzugsweise wird der Gehalt an diesen Verbindungen um mindestens ungefähr 50%, am stärksten bevorzugt um 100% erhöht, und ganz besonders bevorzugt ist eine Erhöhung des Gehalts an schwefelhaltigen Verbindungen auf das mehr als einsfache, vorzugsweise das zweifache. Locke, Keystone Meeting 6. – 11.4.1997, Abstract 306 (1997) berichteten den Anstieg des Methioningehalts um das 3- bis -5fache, wenn CγS in Pflanzen exprimiert wurde. Da das Einführen der SAT zu einer Erhöhung des CγS-Substratgehalts führt, wird erwartet, daß dadurch, daß man die CγS in erfindungsgemäße SAT-exprimierende Pflanzen einführt, oder umgekehrt, der erhöhte Gehalt an schwefelhaltigen Verbindungen noch weiterhin um das ungefähr 1- bis 10fache, vorzugsweise um das 5- bis 10fache oder noch höher, erhöht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Protein mit SAT-Aktivität eine Serin-Acetyltransferase, die aus Prokaryonten oder Archaebakterien stammt. Zu prokaryontischen Organismen können sowohl gramnegative als auch grampositive Bakterien zählen, wie zum Beispiel E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens, Bacillus subtilis und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl auch andere verwendet werden können. So können zum Beispiel Nucleinsäuremoleküle, die Proteine mit SAT-Aktivität codieren, mit dem Stand der Technik erhalten werden (z.B. Bogdanova, FEBS Lett. 358 (1995), 43–47; Denk, J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 515–525; Evans, J. Bacteriol. 173 (1991), 5457–5469).
Weiterhin können in dem erfindungsgemäßen Verfahren Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die mit den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren und ein Protein mit SAT-Aktivität codieren. Solche Nucleinsäuremoleküle können mit Hilfe von Techniken, die in der Fachwelt wohlbekannt sind, zum Beispiel aus Bibliotheken, wie cDNA-Bibliotheken oder genomischen Bibliotheken, isoliert werden. So können zum Beispiel hybridisierende Nucleinsäuremoleküle dadurch identifiziert und isoliert werden, daß man die oben beschriebenen fachbekannten Nucleinsäuremoleküle oder ihre Fragmente oder ihre Komplemente als Sonden für das Durchmustern von Bibliotheken verwendet, und zwar durch Hybridisieren mit diesen Molekülen, wobei man nach Standardtechniken vorgeht. Eine andere Möglichkeit, solche Nucleinsäuremoleküle zu isolieren, ist die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wobei man als Primer Oligonukleotide verwendet, die von den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen abstammen. Zu den Nucleinsäuremolekülen, die mit beliebigen der oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, zählen auch Fragmente, Derivate und Allelvarianten der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein mit SAT-Aktivität oder biologisch aktive Fragmente davon codieren. Unter Fragmenten sind Teile von Nucleinsäuremolekülen zu verstehen, die lang genug sind, um das beschriebene Protein oder ein Fragment davon, das die oben definierte biologische Aktivität aufweist, zu codieren.
Der Ausdruck "Derivat" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang, daß sich die Nucleotidsequenz von diesen Nucleinsäuremolekülen von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Nucleotidpositionen unterscheiden, wobei jedoch eine starke Homologie mit diesen Nucleinsäuremolekülen besteht. Unter Homologie versteht man eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, stärker bevorzugt mehr als 80% und noch stärker bevorzugt mehr als 90%. Die Abweichungen von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle können zum Beispiel aufgrund von Nucleotidsubstitution(en), -deletion(en), -addition(en), -insertion(en) und/oder -rekombination(en), entweder allein oder in Kombination, entstanden sein, wobei diese natürlich vorkommen oder mit Hilfe von fachbekannten DNA-Rekombinationstechniken erzeugt werden; siehe zum Beispiel die in Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), N.Y., und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. (1989) beschriebenen Techniken. Homologie bedeutet weiterhin, daß die jeweiligen Nucleinsäuremoleküle oder codierten Proteine funktionell und/oder strukturell äquivalent sind. Die Nucleinsäuremoleküle, die zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen homolog sind und bei denen es sich um Derivate dieser Nucleinsäuremoleküle handelt, sind zum Beispiel Variationen dieser Nucleinsäuremoleküle, die Modifikationen mit der gleichen biologischen Funktion aufweisen, insbesondere die für Proteine mit der gleichen oder im wesentlichen gleichen biologischen Aktivität wie im vorliegenden Zusammenhang definiert codieren. Es kann sich dabei um natürlich vorkommende Variationen, wie um SAT-Protein-Codiersequenzen von anderen Prokaryonten bzw. von Pflanzen, oder um Mutationen handeln. Diese Mutationen können natürlich vorkommen oder durch Mutagenesetechniken, siehe oben, erhalten werden. Die Allelvariationen können natürlich vorkommende Allelvarianten sowie künstlich hergestellte oder durch Gentechnik erzeugte Varianten sein; siehe oben. So weisen zum Beispiel die Aminosäuresequenzen von Pflanzen-SATs signifikante Ähnlichkeiten mit bakteriellen Serin-Acetyltransferasen auf (Vuorio, 1994; Bogdanova und Hell, 1997). Die am stärksten konservierte Region innerhalb aller SATs, und zwar sowohl von pflanzlichen als auch von bakteriellen SATs, befindet sich am C-terminalen Ende und soll angeblich die Transferaseaktivität vermitteln (Vaara, 1992; Vuorio, 1994). In dieser konservierten Region existiert in Hexapeptid-Motiv; es wurde vorgeschlagen, daß es sich bei diesem Motiv um eine katalytische Domäne in bakteriellen Acetyltransferasen handelt. Dieses Motiv wurde in jüngster Zeit auch in der OAS-TL/SAT-Kontaktregion im Cystein-Synthase-Komplex aus Arabidopsis thaliana nachgewiesen (Bogdanova und Hell, 1997). Außerdem können gemäß der vorliegenden Erfindung auch Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die Homologe oder Analoge der oben beschriebenen Proteine mit SAT-Aktivität codieren, sonst aber mit diesen Proteinen nicht verwandt sind. So codiert zum Beispiel mal Y von E. coli ein Enzym, das an der Aufnahme und am Metabolismus von Maltose und Maltodextrinen im Maltosesystem von E. coli beteiligt ist, zusätzlich jedoch auch die enzymatische Aktivität einer Cystathionin-β-Lyase aufweist; siehe Zdych, J. Bacteriol. 177 (1995), 5035–5039. Diese Proteine sind jedoch gemäß Aminosäuresequenz-Homologieanalyse nicht zueinander homolog. Solche Proteine, die keine wesentlichen Homologien mit üblichen SAT-Proteinen aufweisen, können vom Fachmann mit Hilfe von wohlbekannten Techniken identifiziert werden, zum Beispiel durch Komplementierung von am Cystein- oder Methionin-Biosyntheseweg beteiligten Genmutanten, zum Beispiel in entsprechenden E. coli-Stammutanten; siehe auch Zdych oben.
Den von den verschiedenen Derivaten, Varianten, Homologen oder Analogen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteinen können bestimmte Eigenschaften gemeinsam sein, wie Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation usw., sowie physikalische Eigenschaften wie elektrophoretische Wanderungsfähigkeit, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, pH-Optimum, Temperaturoptimum, Stabilität, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften usw. Alle diese Nucleinsäuremoleküle und Derivate können erfindungsgemäß verwendet werden, solang die Enzymaktivität des codierten Proteins im wesentlichen als solche erhalten bleibt, nämlich daß das Protein wie oben definiert SAT-Aktivität aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das Nucleinsäuremolekül funktionell mit einer Nucleotidsequenz verknüpft, die für ein Transitpeptid codiert, das geeignet ist, das/die Protein e) in ein gewünschtes Zellkompartiment zu bringen. Das Nucleinsäuremolekül kann derart modifiziert sein, daß das codierte Protein in einem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert ist. Dazu zählen das endoplasmatische Retikulum (KDEL, Schouten, Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781–793), die Vakuole (Neuhaus, PNAS 88 (1991), 10362- 10366), die Mitochondrien (Chaumont, Plant Mol. Biol. 24 (1994), 631–641), die Plastiden (Fuhr, EMBO J. 5 (1986), 2063–2071), der Apoplast (von Schaewen, EMBO J. 9 (1990), 3033–3044), das Cytoplasma usw. Verfahren, mit denen diese Modifikationen durchgeführt werden, sowie Signalsequenzen, die eine Lokalisierung in einem gewünschten Kompartiment gewährleisten, sind dem Fachmann wohlbekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Zellkompartiment um einen Plastiden. Wie in den beigelegten Beispielen beschrieben, wurde das Protein mit SAT-Aktivität über die translationsmäßige Fusion mit der 5'-Signalsequenz der kleinen Rubisco-Untereinheit in den Chloroplasten adressiert.
Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nucleinsäuremolekül ist funktionell mit Regulationssequenzen verknüpft, die die Expression der Nucleinsäuremoleküle in Pflanzenzellen erlauben. vorzugsweise umfassen diese Regulationselemente einen in Pflanzenzellen aktiven Promoter. Die Expression umfaßt die Transkription des Nucleinsäuremoleküls in eine translatierbare mRNA. Regulationselemente, die die Expression in Pflanzenzellen gewährleisten, sind dem Fachmann wohlbekannt.
Diese Regulationselemente können in bezug auf das zu exprimierende Nucleinsäuremolekül sowie in bezug auf die zu transformierende Pflanzenart heterolog oder homolog sein. Im allgemeinen umfassen solche Regulationselemente einen Promoter, der in Pflanzenzellen aktiv ist. Für eine Expression in allen Geweben einer transgenen Pflanze werden vorzugsweise konstitutive Promoter verwendet, wie der 35S-Promoter des CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810–812) oder Promoter der Polyubiquitin-Gene von Mais (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675–689). Für eine Expression in bestimmten Geweben einer transgenen Pflanze können gewebespezifische Promoter verwendet werden (siehe z.B. Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245– 2251). Ebenfalls bekannt sind Promoter, die spezifisch in Knollen von Kartoffeln oder in Samen von verschiedenen Pflanzenarten wie Mais, Vicia, Weizen, Gerste usw. aktiv sind. Für eine genaue Kontrolle der Expression können induzierbare Promoter verwendet werden. Ein Beispiel für induzierbare Promoter sind die Promoter von Genen, die Hitzeschockproteine codieren. Außerdem wurden mikrosporenspezifische Regulationselemente und ihre Verwendungen beschrieben (WO 96/16182). Außerdem kann das chemisch induzierbare Test-System verwendet werden (Gatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991); 229–237). Andere geeignete Promoter sind dem Fachmann bekannt und z.B. in Ward (Plant Mol. Biol. 22 (1993), 361–366) beschrieben. Die Regulationselemente können weiterhin Transkriptions- und/oder Translationsenhancer, die in Pflanzenzellen funktionsfähig sind, umfassen. Ein häufig verwendeter Pflanzen-Translationsenhancer ist z.B. die CaMV-Omega-Sequenzen und/oder die Mitverwendung eines Introns (zum Beispiel Intron-1 des Shrunken-Gens von Mais), das nachweislich die Expressionsniveaus auf das bis zu 100fache erhöht hat. (Maiti, Transgenic Research 6 (1997), 143–156; Ni, Plant Journal 7 (1995), 661–676). Außerdem können zu den Regulationselementen Transkriptionsterminationssignale, wie ein Poly-A-Signal, zählen, die dazu führen, daß dem Transkript ein Poly-A-Schwanz angehängt wird, was dessen Stabilität verbessern kann. Die üblicherweise verwendeten Terminationssignale stammen vom Nopalinsynthasegen oder vom CaMV-35S-RNA-Gen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Promoter induzierbar oder wird konstitutiv exprimiert und/oder ist ein zell-, gewebe- oder organspezifischer Promoter. Vorzugsweise ist der Promoter knollenspezifisch, samenspezifisch, endospermspezifisch, embryospezifisch oder phloemspezifisch. Beispiele für solche Promoter sind der Patatin-Promoter B33 (knollenspezifisch, Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23), der Phaseolin- Promoter (samenspezifisch, Karchi, Plant J. 3 (1993), 721–727), der HMW-Glutenin-Promoter (endospermspezifisch, Helford, Theor. Appl. Genet. 75 (1987), 117–126), der α,β-Conglycin-Promoter (embryospezifisch, Fujiwara, Plant Cell Reports 9 (1991), 602–606), und der rolC-Promoter (phloemspezifisch, Lerchl, Plant Cell 7 (1995), 259–270), was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und sonstige Vektoren, die üblicherweise in der Gentechnik verwendet werden und die ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Protein mit SAT-Aktivität codiert, enthalten. Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, können für die Konstruktion von verschiedenen Plasmiden und Vektoren verwendet werden; siehe zum Beispiel die in Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), N.Y., und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. (1989) beschriebenen Techniken. Die rekombinanten DNA-Moleküle und Vektoren der Erfindung können jedoch zwecks Adressierung an Zielzellen auch in Liposomen rekonstituiert werden.
Die oben beschriebenen Vektoren umfassen vorteilhaft einen selektierbaren und/oder bonitierbaren Marker. Selektierbare Markergene, die sich für die Selektion von transformierten Pflanzenzellen, transformiertem Kallus, transformiertem Pflanzengewebe und transformierten Pflanzen eignen, sind dem Fachmann wohlbekannt; dazu zählen zum Beispiel Antimetabolitenresistenz als Grundlage für die Selektion für dhfr, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143–149), npt, das Resistenz gegen die Aminoglycoside Neomycin, Kanamycin und Paromycin verleiht (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987–995) sowie Hygro, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Marsh, Gene 32 (1984), 481–485). Es wurden noch weitere selektierbare Gene beschrieben, nämlich trpB, das es den Zellen ermöglicht, Indol statt Tryptophan zu verwerten; hisD, das es den Zellen ermöglicht, Histinol statt Histidin zu verwerten (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); Mannose-6-Phosphat-Isomerase, die es den Zellen ermöglicht, Mannose zu verwerten (WO 94/20627) sowie ODC (Ornithin-Decarboxylase), die Resistenz gegen den Ornithin-Decarboxylase-Hemmer, 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hersg.) verleiht, oder Desaminase aus Aspergillus terreus, das Resistenz gegen Blasticidin S verleiht (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336–2338). Auch geeignete bonitierbare Marker sind dem Fachmann bekannt und im Handel erhältlich. Vorteilhaft handelt es sich bei dem Marker um ein Gen, das Luciferase (Giacomin, P1. Sci. 116 (1996), 59–72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), "green fluorescent protein" (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44–47) oder β-Glucuronidase (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901–3907) codiert. Diese Ausführungsform eignet sich ganz besonders für ein rasches und einfaches Durchmustern von Zellen, Geweben und Organismen, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich ganz besonders für die genetische Manipulation von Pflanzenzellen, Pflanzengeweben und Pflanzen, um ihren Gehalt an schwefelhaltigen Verbindungen zu erhöhen und um zu Pflanzen mit modifizierten, vorzugsweise verbesserten oder nützlichen, Phänotypen zu gelangen. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren für die Erzeugung von transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe bereit, das darin besteht, daß man ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Protein mit SAT-Aktivität codiert und das funktionell mit Regulationselementen verknüpft ist, die eine Expression in Pflanzenzellen erlauben, in das Genom dieser Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe einführt.
Verfahren für die Einführung von Fremd-DNA in Pflanzen sind ebenfalls in der Fachwelt wohlbekannt. Dazu zählen zum Beispiel die Transformation von Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen mit T-DNA unter der Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes, die Protoplastenfusion, der direkte Gentransfer (siehe z.B. EP-A 164 575), die Injektion, die Elektroporation, biolistische Verfahren wie den Beschuß mit der Genkanone und andere fachbekannte Verfahren. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Vektoren können weitere funktionelle Elemente enthalten, zum Beispiel "left border"- und "right border"-Sequenzen der T-DNA von Agrobacterium, die eine stabile Integration in das pflanzliche Genom ermöglichen. Außerdem sind dem Fachmann Verfahren und Vektoren bekannt, die die Erzeugung von markerfreien transgenen Pflanzen ermöglichen, d.h., daß das selektierbare oder bonitierbare Markergen in einem gewissen Stadium der Pflanzenentwicklung oder des Pflanzenzüchtungsvorgangs verloren geht. Dies kann zum Beispiel durch Kotransformation (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 151–161; Peng, Plant Mol. Biol. 27 (1995), 91–104) erzielt werden und/oder dadurch, daß man Systeme verwendet, bei denen Enzyme, die fähig sind, die homologe Rekombination in Pflanzen zu fördern, verwendet (siehe z.B. WO 97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353–361); Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 653–657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170–176; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19 (1991), 6373–6378). Verfahren zur Herstellung von entsprechenden Vektoren sind z.B. bei Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) beschrieben.
Geeignete Stämme von Agrobacterium tumefaciens und Vektoren sowie die Transformation von Agrobakterien und geeignete Wachstums- und Selektionsmedien sind dem Fachmann wohlbekannt und im Stand der Technik beschrieben (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383–396; C58C1 (pGV 3850kan), Deblaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucl. Acid Res. 12 (1984), 8711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467–8471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 963–976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies [Spezialvektoren für das Tagging von Genen und Expressionsuntersuchungen] In: Plant Molecular Biology Manual Band 2, Gelvin & Schilperoort (Hersg.) Dordrecht, Niederlande; Kluwer Academic Publ. (1994), 1–22; EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1–46; An, EMBO J. 4 (1985), 277–287). Obwohl bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens bevorzugt wird, können auch andere Agrobacterium-Stämme, wie Agrobacterium rhizogenes, verwendet werden, zum Beispiel wenn ein von solch einem Stamm vermittelter Phänotyp gewünscht wird.
Verfahren für die Transformation mit Hilfe von biolistischen Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt; siehe z.B. Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37–48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993), 1553–1558 und Christou (1996), Trends in Plant Science 1, 423–431. Die Mikroinjektion kann gemäß Potrykus und Spangenberg (Hersg.), Gene Transfer To Plants, Springer Verlag, Berlin, NY (1995) durchgeführt werden.
Die Transformation der meisten zweikeimblättrigen Pflanzen ist mit den oben beschriebenen Verfahren möglich. Es wurden jedoch auch für die Transformation von einkeimblättrigen Pflanzen verschiedene erfolgreiche Transformationstechniken entwickelt. Dazu zählen die Transformation mit Hilfe von biolistischen Verfahren, wie sie z.B. oben beschrieben wurden, sowie die Protoplastentransformation, die Elektroporation von teilweise permeabilisierten Zellen, die Einführung von DNA mit Hilfe von Glasfasern usw.
Im allgemeinen können die Pflanzen, Pflanzenzellen und Pflanzengewebe, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekül oder Vektor modifiziert werden können und die eine (Über-)Expression eines Proteins mit SAT- sowie gegebenenfalls CyS-Aktivität aufweisen, von beliebigen Pflanzenarten stammen. Es kann sich um einkeimblättrige Pflanzen oder um zweikeimblättrige Pflanzen handeln; vorzugsweise zählen sie zu einer Pflanzenart, die von landwirtschaftlichem, forstwirtschaftlichem oder gartenbaulichem Interesse ist, wie Nutzpflanzen (z.B. Mais, Reis, Gerste, Weizen, Roggen, Hafer usw.), Kartoffeln, Ölpflanzen (z.B. Raps, Sonnenblume, Erdnuß, Sojabohne usw.), Baumwolle, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Leguminosen (z.B. Bohnen, Erbsen usw.), holzproduzierenden Pflanzen, vorzugsweise Bäumen, usw.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch transgene Pflanzenzellen, die ein Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit SAT-Aktivität codiert, in Verknüpfung mit Regulationselementen, die die Expression des Nucleinsäuremoleküls in Pflanzenzellen erlauben, stabil in ihr Genom integriert haben und wobei das Nucleinsäuremolekül in bezug auf die transgene Pflanzenzelle fremd ist.
Unter "fremd" versteht man, daß das Nucleinsäuremolekül in bezug auf die Pflanzenzelle entweder heterolog ist, das heißt, daß es von einer Zelle oder einem Organismus mit einem unterschiedlichen genomischen Hintergrund abstammt oder in bezug auf die Pflanzenzelle homolog ist, jedoch in einer unterschiedlichen genomischen Umgebung als das natürlich vorkommende Gegenstück dieses Nucleinsäuremoleküls vorliegt. Das heißt, daß, wenn das Nucleinsäuremolekül in bezug auf die Pflanzenzelle homolog ist, es nicht in seiner natürlichen Stelle im Genom dieser Pflanzenzelle liegt, insbesondere, daß es von unterschiedlichen Genen umgeben ist. In diesem Fall kann das Nucleinsäuremolekül entweder unter der Kontrolle seines eigenen Promoters oder unter der Kontrolles eines heterologen Promoters stehen.
Vorhandensein und Expression des Nucleinsäuremoleküls, das ein Protein mit SAT-Aktivität codiert, in den transgenen Pflanzenzellen führt zur Synthese von Proteinen, die einen Einfluß auf z.B. Stressresistenz der Pflanzenzellen hat (haben) und führt zu entsprechenden physiologischen und phänotypischen Veränderungen bei Pflanzen, die solche Zellen enthalten. Wie in den beigelegten Beispielen beschrieben, weisen Pflanzen, die konstitutiv E. coli-SAT exprimieren, hohe Cysteingehalte auf. Außerdem war der Gehalt an dem Tripeptidglutathion (γ-Glutamylcysteinylglycin) beträchtlich höher als in Wildtyppflanzen, da es sich bei dieser Verbindung um die wichtigste Speicherform von reduziertem Schwefel im Pflanzenreich handelt und als wichtigste "Sink" für produziertes Cystein dient. Glutathion spielt nicht nur bei der Regelung der Schwefelernährung eine wesentliche Rolle, sondern ist auch ein wichtiger Faktor bei der pflanzlichen Abwehr von verschiedenen Formen von Stress, darunter hohen Lichtintensitäten, Trockenheit, Kälte, Hitze und Mineralstoffdefizienz (Smith, 1990; Rennenberg und Brunold, 1994). Das Tripeptid wird in Pflanzen sowie in anderen Organismen in Form von zwei enzymkatalysierten Reaktionen aus den die Bestandteile bildenden Aminosäuren synthetisiert (Meister und Anderson, 1983; Rennenberg, 1995).
Wie in der Diskussion oben erwähnt kann die Cystein-γ-Synthase Cystein als schwefelhaltiges Substrat verwerten. Weil ja im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wurde, daß transgene Pflanzen, die ein Protein mit SAT-Aktivität überexprimieren, einen beträchtlich höheren Cysteingehalt aufweisen, ist es denkbar, daß die Koexpression eines Nucleinsäuremoleküls, das für ein Protein mit CyS-Aktivität codiert, zu einer synergistischen Wirkung bei der Produktion von Methionin führen könnte, da sowohl das Schlüsselenzym des Methionin-Biosynthesewegs als auch sein Substrat in den Pflanzen überexprimiert werden.
Die beschriebene transgene Pflanzenzelle kann auch einen selektierbaren Marker enthalten. Wie oben beschrieben können gemäß der vorliegenden Erfindung verschiedene selektierbare Marker verwendet werden. Vorteilhaft können selektierbare Marker verwendet werden, die sich für die direkte Selektion der transformierten Pflanzen eignen, zum Beispiel das Phosphinothricin-N-Acetyltransferase-Gen, dessen Genprodukt das Herbizid L-Phosphinothricin (Glufosinate bzw. BASTA) entgiftet; siehe z.B. De Block, EMBO J. 6 (1987), 2513–2518 und Dröge, Planta 187 (1992), 142–151.
Weiterhin werden in der vorliegenden Erfindung auch transgene Pflanzen und Pflanzengewebe, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen umfassen, beschrieben. Diese können zum Beispiel eine verbesserte Stressresistenz aufweisen. Vorzugsweise ist der Glutathion-, Cystein- und/oder Methioningehalt in der transgenen Pflanze der Erfindung im Vergleich zu einer Wildtyppflanze erhöht. Unter einer Erhöhung des Glutathion-, Cystein- und/oder Methioningehalts soll ein erhöhter Gehalt an einer der oben genannten schwefelhaltigen Verbindungen, entweder allein oder in Kombination, in den transgenen Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen der vorliegenden Erfindung in der Größenordnung von mindestens ungefähr 10% im Vergleich zu der bzw. dem nichtransformierten Wildtyp-Pflanzenzelle, -Pflanzengewebe oder -Pflanze verstanden werden, was bereits positive Auswirkungen auf die Vitalität der Pflanze wie z.B. verbesserte Stresstoleranz ausübt. Der Gehalt an den oben beschriebenen Verbindungen ist vorteilhafterweise um mindestens ungefähr 50%, vorzugsweise um mehr als ungefähr 75%, besonders bevorzugt mindestens ungefähr oder mehr als 100% und noch stärker bevorzugt mehr als ungefähr 200 erhöht. Zieht man den kombinierten Cystein-, Methionin- und Glutathiongehalt in Betracht, so kann im Vergleich zu dem freien Cysteingehalt in Wildtyppflanzen sogar eine um das 10- bis 20fache erhöhte Menge an schwefelhaltigen Verbindungen erzielt werden, obwohl auch noch stärker erhöhte Gehalte an schwefelhaltigen Verbindungen in den Pflanzen der vorliegenden Erfindung vorgesehen werden.
Der freie Cysteingehalt in den beschriebenen Pflanzen ist vorteilhafterweise ungefähr höher als 20 nmol pro Gramm Frischgewicht (gFG) Blattgewebe, vorzugsweise höher als 30 nmol/gFG und noch stärker bevorzugt höher als 40 nmol/gFG; siehe auch Beispiel 2. Außerdem kann der Glutathiongehalt in den beschriebenen Pflanzen vorzugsweise höher als 350 nmol/gFG, stärker bevorzugt höher als 500 nmol/gFG sein. Der Methioningehalt kann um mindestens ungefähr das 5fache, vorzugsweise mehr als das 10fache, erhöht sein.
In der Erfindung werden weiterhin auch erntebare Teile und Vermehrungsmaterial der beschriebenen transgenen Pflanzen, die wie oben beschriebene transgene Pflanzenzellen enthalten und/oder die sich von den oben beschriebenen Pflanzen ableiten und erhöhte Mengen an schwefelhaltigen Verbindungen wie oben beschrieben aufweisen, beschrieben. Erntebare Teile können im Prinzip beliebige nützliche Teile einer Pflanze sein, zum Beispiel Blätter, Stengel, Früchte, Samen, Wurzeln usw. Zu Vermehrungsmaterial zählen zum Beispiel Samen, Früchte, Ableger, Keimpflanzen, Knollen, Wurzelstöcke usw.
Weiterhin beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Protein mit SAT-Aktivität codiert, für die Herstellung von transgenen Pflanzen, die einen erhöhten Glutathion-, Cystein- und/oder Methioningehalt aufweisen. Vorzugsweise führt dieser erhöhte Methionin- oder Cysteingehalt zu beschleunigten Reifungsvorgängen, veränderten Blüten und/oder Pathogenresistenz.
Die konstitutive Expression des SAT-cysE-Gens aus E. coli in transgenen Kartoffelpflanzen zeigt direkt in vivo, daß die SAT-katalysierte Reaktion tatsächlich im pflanzlichen Cystein-Biosyntheseweg geschwindigkeitsbegrenzend wirkt, wie dies aus den hohen Cysteingehalten in den Transformanten hervorgeht; siehe die beigelegten Beispiele. Weiterhin wird wie in der Diskussion oben erwähnt erwartet, daß die entsprechenden hohen Glutathiongehalte in den transgenen Pflanzen Resistenz gegen verschiedene Formen von Stress vermitteln können. Glutathion spielt in Pflanzen eine wichtige Rolle bei der Abwehr von aktivierten Sauerstoffspezies, Xenobiotika, Schwermetallen sowie anderen Formen von Stress, darunter Trockenheit, Hitze und Mineralstoffmangel (Alscher, 1989; Smith, 1990; Schmidt und Jäger, 1992; Rennenberg und Brunold, 1994; Rennenberg, 1995). Diese Kenntnis ist auch von praktischer Bedeutung. Eine höhere Resistenz der Pflanzen gegen aktivierte Sauerstoffspezies kann in der Zukunft eine sehr wichtige Rolle spielen, wenn man an die erhöhten Ozonkonzentrationen in der Atmosphäre denkt. Weiterhin ist eine verstärkte Toleranz gegenüber Xenobiotika, zum Beispiel Herbizide, aufgrund der höheren Glutathiongehalte in den erfindungsgemäßen Pflanzen sinnvoll. Weiterhin besteht eine mögliche Strategie darin, transgene Pflanzen zu konstruieren, die auf höheren Schwermetallionenkonzentrationen wachsen können und die daher für die biologische Sanierung verwendet werden könnten. Weiterhin können sich die beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküle und Vektoren für die Veränderung oder Modifikation der Pflanzen-Pathogen-Wechselwirkung eignen. Der Begriff "Pathogen" beinhaltet zum Beispiel Bakterien, Viren und Pilze sowie Protozoen.
Wie in der Diskussion oben erwähnt können die beschriebenen transgenen Pflanzenzellen, Gewebe und Pflanzen dazu verwendet werden, die toxischen Auswirkungen von Umweltgiften im Boden inklusive Wasserhaushalt zu mildern. Umweltgifte können aus natürlichen Gründen vorhanden sein oder durch das Bergbau-, Industrie- und Stadtwesen verursacht sein. Zu solchen Umweltgiften zählen Verbindungen, die schwefelhaltige Proteine, insbesondere Enzyme, inaktivieren können oder die als Antagonisten oder Hemmer im Cystein- und/oder Methionin-Biosyntheseweg wirken. Beispiele für solche Antagonisten oder Hemmer sind Herbizide, Fungizide, Pestizide bzw. insbesondere Metallionen, z . B . Hg²⁺. So ist es zum Beispiel möglich, aufgrund der erhöhten GSH-Gehalte in den oben beschriebenen Pflanzen, die durch die Expression der Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein mit SAT-Aktivität codieren, vermittelt werden, Boden für die Landwirtschaft zu verwenden, der sonst aufgrund des Vorhandenseins von z.B. toxischen Verbindungen, die eine störende Auswirkung auf die schwefelhaltigen Enzyme und daher das Pflanzenwachstum ausüben, nicht geeignet ist. Dies ist insbesondere bei Boden der Fall, in dem große Mengen an Schwermetallen vorliegen. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzen für die biologische Sanierung von Boden, der mit Umweltgiften kontaminiert ist, verwendet werden. Eine vorteilhafte Nebenwirkung besteht darin, daß zum Beispiel aufgrund einer erhöhten Metalltoleranz aufgrund des Vorhandenseins des erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküls oder Vektors die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzen für den "biologischen Bergbau" verwendet werden können (Cunningham, TIBTECH 13 (1995), 393–397). Dies bedeutet, daß die erfindungsgemäßen Pflanzen, Pflanzengewebe und Pflanzenzellen für die Gewinnung von Metallen wie Quecksilber, Nickel und Kupfer mittels Pflanzen verwendet werden können. Weiterhin kann wie oben erwähnt ein höherer GSH-Gehalt in den beschriebenen Pflanzenzellen, Pflanzengeweben und Pflanzen eine erhöhte Resistenz ermöglichen. Außerdem wird erwartet, daß der in den oben beschriebenen Pflanzenzellen und Pflanzengeweben und Pflanzen vorhandene hohe GSH-Gehalt zu einem verbesserten Keimlingswachstum und einer verbesserten Biomasseproduktion führt. Insgesamt hat die Erhöhung des GSH-Gehalts vielerlei Auswirkungen auf die Lebenskraft von Pflanzen und ist insbesondere für den Pflanzenzüchter von Interesse.
Die vorliegende Erfindung beschreibt daher auch die Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, das für ein Protein mit SAT-Aktivität codiert, einer erfindungsgemäßen Pflanzenzelle, einer erfindungsgemäßen Pflanze oder von erfindungsgemäßem Pflanzengewebe oder von deren erntebaren Teilen und Vermehrungsmaterial für die Herstellung eines Nahrungsmittels, Futtermittels, für die Verbesserung der Pathogenresistenz, für die Vermittlung von Schwermetall- oder Herbizidtoleranz, für die Verbesserung der Biomasseproduktion, für die Förderung des Keimlingswachstums, für die Vermittlung von Toleranz gegen biotischen oder abiotischen Stress oder für die Verbesserung des Aromas und/oder Geschmacks von Nahrungsmittel oder Futtermitteln. Zu der Verwendung des beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküls oder des beschriebenen Vektors für die Vermittlung von Herbizidtoleranz gehört zum Beispiel auch ihre Verwendung als selektierbare Marker in Pflanzen gemäß anderen Systemen, bei denen die (Über-)Expression von Enzymen verwendet werden, die eine Toleranz (also Resistenz) gegen die pflanzenzellenabtötenden Auswirkungen von Herbiziden vermitteln können. Ein Beispiel für solch ein System ist die Überexpression des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat- (EPSP-) Synthase, die eine Toleranz gegen das Herbizid Glyphosphate vermittelt. Ähnlich können die beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküle und Vektoren dazu verwendet werden, um eine Toleranz gegen Verbindungen zu vermitteln, die auf schwefelhaltige Enzyme einwirken, zum Beispiel dadurch, daß sie die Verbindung, die für die Hemmung dieser Enzyme durch den hohen Cystein-, GSH- und/oder Methioningehalt oder durch Peptide und Proteine, die aufgrund des erhöhten Gehalts an den schwefelhaltigen Aminosäuren in höherem Ausmaß vorliegen, sequestrieren.
Wie oben beschrieben wird der Nährwert der erfindungsgemäßen Pflanzen, Pflanzengewebe und Pflanzenzellen sowie von erntebaren Teilen und Vermehrungsmaterial solcher Pflanzen aufgrund des erhöhten Gehalts an schwefelhaltigen Verbindungen beträchtlich erhöht. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Nahrungsmittel und Futtermittel oder Zusatzstoffe für diese, die die oben beschriebenen Pflanzenzellen, Pflanzengewebe, Pflanze, erntebaren Teile oder Vermehrungsmaterial umfassen. Diese Futtermittel, Nahrungsmittel und Zusatzstoffe weisen vorzugsweise einen wie oben beschriebenen erhöhten Cystein-, Methionin- und/oder Glutathiongehalt auf.
Diese sowie weitere Ausführungsformen werden durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung offenbart und sind davon umfaßt. Sonstiges Lesematerial, das eine der erfindungsgemäß zu verwendenden Verfahren, Verwendungen und Verbindungen betrifft, ist zum Beispiel unter Verwendung von elektronischen Geräten in öffentlichen Bibliotheken zu finden. So kann zum Beispiel die öffentliche Datenbank "Medline", die über das Internet verfügbar ist, zum Beispiel unter http://www.ncbi.nim.nih.gov/PubMed/medline.html, verwendet werden. Dem Fachmann sind weitere Datenbanken und Adressen wie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research tools.html, http://www.tigr.org/ bekannt, und diese können ebenfalls zum Beispiel mit http://www.lycos.com erhalten werden. Eine Übersicht über Patentinformationen in der Biotechnologie sowie von geeigneten Quellen für Patentinformationen, die sich für nachträgliches Suchen und für eine Kenntnis des derzeitigen Wissensstands eignet, findet sich in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352–364.
In den Abbildungen ist folgendes dargestellt:
1: (a) Northern-Blot-Analyse von Gesamt-RNA aus Blättern von fünf unabhängigen transgenen Pflanzen (SAT-65, 26, 48, 3 und 71) und zwei Wildtyppflanzen (Kontrolle a und b). Als Sonde für den Blot wurde ³²P-markierte cysE-DNA aus E. coli verwendet. Jede Bahn enthielt 15 μg Gesamt-RNA.
(b) Maximale katalytische SAT-Aktivität in Blättern von fünf unabhängigen transgenen Pflanzen (SAT-65, 26, 48, 3 und 71) und zwei Wildtyppflanzen (Kontrolle a und b). Die spezifische Aktivität der Rohextrakte ist in pmol pro Minute produziertes CoA sowie μg Gesamtprotein angegeben. Die Irrtumsbalken stellen die Standardabweichung dar (<10 %). N = 4 unabhängige Messungen.
2 : (a) Endogene Cystein-Gehalte in Blättern von 6 Wochen alten transgenen Pflanzen (SAT-48 und SAT-26) sowie Wildtyppflanzen (Kontrolle a und b). Die Cysteinmengen sind in nmol pro gFG angegeben. Die Irrtumsbalken stellen die Standardabweichung dar (<20). N = 18; 6 unabhängie Pflanzen pro transgene Linie, 3 unabhängige Messungen pro Pflanze.
(b) Endogene Glutathion-Gehalte in Blättern von 6 Wochen alten transgenen Pflanzen (SAT-48 und SAT-26) sowie Wildtyppflanzen (Kontrolle a und b). Die Glutathionmengen sind in nmol pro gFG angegeben. Die Irrtumsbalken stellen die Standardabweichung dar (<10). N = 18; 6 unabhängie Pflanzen pro transgene Linie, 3 unabhängige Messungen pro Pflanze.
3: Northern-Blot-Analyse von Gesamt-RNA aus Blättern von fünf unabhängigen transgenen Pflanzen (SAT-65, 26, 48, 3 und 71) und zwei Wildtyppflanzen (Kontrolle a und b). Als Sonde für den Blot wurde ³²P-markierte OAS-TL-cDNA (p) aus Kartoffelplastiden sowie eine cytosolische Isoform (c) verwendet. Die Bahnen enthielten jeweils 15 μg Gesamt-RNA.
4: In-vitro-OAS-TL-Aktivität in Blättern von transgenen Pflanzen (SAT-48 und 26) und Wildtyppflanzen (Kontrolle a und b). Die spezifische Aktivität der Rohextrakte ist in pmol pro Minute produziertes Cystein sowie in μg Gesamtprotein angegeben. Die Irrtumsbalken stellen die Standardabweichung dar (<10%). N = 4 unabhängige Messungen.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:
Beispiel 1: Durchmusterung auf transgene Kartoffelpflanzen, die die SAT-mRNA aus E. coli enthalten
Um die E. coli-SAT an die Chloroplasten von Pflanzen zu adressieren, wurde eine Genfusion mit einem Rubisco-Transitpeptid aus Arabidopsis konstruiert. SAT aus genomischer DNA von E. coli wurde mittels PCR unter Verwendung von zwei synthetischen Oligonucleotiden (EcSAT-N: 5'- GAG AGA CCA TGG CGT GTG AAG AAC TGG AAA, EcSAT-C: 5' – GAG AGA TCT AGA TTA GAT CCC ATC CCC ATA) amplifiziert. Die doppelsträngige DNA wurde mit Nco I und Xba I verdaut und hinter das Transitpeptid cloniert. Das fusionierte Genprodukt wurde als Asp 718/Xho I Fragment in einen zuvor mit Asp 718/Sal I verdauten binären Vektor (Höfgen & Willmitzer, 1990) unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promoters insertiert. Das Plasmid wurde mittels Agrobacterium tumefaciens in Kartoffel (Solanum tuberosum der Sorte Desiree) wie von Rocha-Sosa et al. (1989) beschrieben eingeführt. Solanum tuberosum der Sorte Desiree wurde von Vereinigte Saatzuchten eG (Ebstorf, Deutschland) bezogen. Wildtyppflanzen und transgene Pflanzen wurden in Gewebekultur im 16-Stunden-Licht/8-Stunden-Dunkel-Rhythmus auf Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog, 1962) mit einem Zusatz von 2% (w/v) Saccharose bei 22°C erhalten. Im Gewächshaus wurden die Pflanzen bei 22°C während der Lichtperiode (16 Stunden) bzw. 15°C während der Dunkelperiode (8 Stunden) herangezogen. Die Pflanzen wurden in einzelnen Töpfen gezogen und ständig bewässert.
Die in Gewebekultur aufrechterhaltenen transgenen Kartoffelpflanzen waren optisch von den untransformierten Kontrollpflanzen nicht unterscheidbar. Um auf Pflanzen, die die SAT-mRNA aus E. coli exprimieren, zu durchmustern, wurden fünfzig Pflanzen zufallsmäßig für die Entnahme von Blattproben ausgewählt. Mit diesen Proben wurden eine RNA-Gel-Blot-Analyse mit einer radioaktivmarkierten SAT-cDNA E. coli als Sonde durchgeführt. Für die Isolation von RNA wurde das pflanzliche Blattmaterial direkt nach der Ernte in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Aus dem tiefgefrorenen Material wurde Gesamt-RNA gemäß Logemann et al. (1987) extrahiert. Nach Denaturieren bei 65°C wurde die Gesamt-RNA unter denaturierenden Bedingungen mittels Gelelektrophorese aufgetrennt (Lehrach, 1977) und anschließend auf Nylon-Membranen übertragen. Die Northern-Hybridisierung wurde bei einer entsprechenden Temperatur wie von Amasino (1986) beschrieben durchgeführt. Die Northern-Blots wurden dreimal 30 Minuten lang bei 55°C in 0,5 × SSC; 0,2% SDS gewaschen. Die Markierung der Fragmente mit ³²P wurde mit dem "Multiprime DNA-labelling-Kit" (Amersham Buchler, Braunschweig, Deutschland) durchgeführt. Für die weitere Analyse wurden fünf unabhängige Transformanten, in denen die Fremd-SAT-mRNA in hohen Mengen akkumuliert wurde, ausgewählt und ins Gewächshaus gestellt. In einer zweiten Northern-Analyse zeigte sich, daß die Transformanten auch unter Gewächshausbedingungen die Fremd-mRNA in hohen Mengen akkumulierten (1a). Die Länge des in den transgenen Kartoffelpflanzen nachgewiesenen Transkripts (≈ 1050 Basenpaare) stimmte mit der Länge, die für das cysE-Gen berichtet wurde, nämlich 819 Bp (Denk und Böck, 1987) und der verwendeten Rubisco-Signalsequenz (≈ 240 Bp) überein. Für die Bestimmung der SAT-Enzymaktivität wurde gemäß dem Verfahren von Kredich und Tomkins (1966) ein Assay durchgeführt. Dieses Verfahren beruht auf einem Disulfidaustausch zwischen CoA, das aus dem Acetylrest während der durch SAT katalysierten Reaktion freigesetzt wird, und 5,5'-Dithiobis(2-nitro-benzoesäure). Die CoA-Bildung wurde in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), das 1 mM 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure), 1 mM EDTA, 20 mM L-Serin sowie 100 μM Acetyl-CoA enthielt, bestimmt. Die Reaktion wurde durch Versetzen mit 10 μl Blatt-Rohextrakt (1,5 μg/μl Gesamtprotein) gestartet; die Inkubationstemperatur betrug 25°C. Die Produktion von Thionitrobenzoesäure wurde bei 412 nm mit einem Spektralphotometer (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) im Vergleich zu einer Blindkontrolle, die alle Substanzen mit Ausnahme von L-Serin enthielt, verfolgt. Mit Kontrollösungen, die alle Substanzen sowie unterschiedliche CoA-Konzentrationen (0–200 nmol/ml) enthielten, wurde eine Eichkurve erstellt. Der Aktivitätstest wurde unabhängig mit unterschiedlichen Volumina Blatt-Rohextrakt, nämlich 20, 40 bzw. 60 μl durchgeführt. Aus der Analyse der SAT-Aktivität in Blatt-Rohextrakten ging hervor, daß Kartoffelpflanzen, die das E. coli-Gen exprimieren, Serin wesentlich effizienter in OAS umwandeln als die untransformierten Kontrollpflanzen (1b), was nahelegt, daß die transformierten Pflanzen eine erhöhte SAT-Aktivität aufweisen, was vermutlich auf die Fremd-Serinacetyltransferase aus E. coli zurückzuführen ist. Trotz der stark erhöhten SAT-Aktivität in den Blättern der transgenen Pflanzen war mit einer Ausnahme keine drastische Veränderung beim Phänotyp dieser Pflanzen zu beobachten: nur die Transformante 48 wies eine verringerte Apikaldominanz auf, was zu einem buschartigen Phänotyp führte. Interessanterweise wies die Transformante 48 die höchste SAT-Aktivität von allen transgenen Pflanzen auf.
Beispiel 2: die Expression des cysE-Gens führt zu einer Erhöhung des endogenen Cystein- und Glutathiongehalts
Die Cysteinbiosynthese erfolgt bei Pflanzen in Form einer zweistufigen Reaktion. Die Bildung von Cystein aus Sulfid und O-Aceytyl-L-Serin wird durch die O-Aceytylserin(Thiol)Liase katalysiert. O-Aceytyl-L-Serin wird aus Acetyl-Coenzym A und Serin durch die Serin-Acetyltransferase synthetisiert (Brunold und Rennenberg, 1997). Um herauszufinden, ob die Expression des cysE-Gens in Kartoffelpflanzen den endogenen Cysteingehalt beeinflußt, wurde die Konzentration dieser schwefelhaltigen Aminosäure in untransformierten und transformierten Pflanzen bestimmt. Die Thiole wurden gemäß Rüegsegger und Brunold (1992) hergestellt. Trennung und quantitative Bestimmung wurden mittels Umkehrphasen-HPLC nach Derivatisierung mit Monobrombiman gemäß Newton et al. (1981) durchgeführt. Eine Modifikation wurde insofern vorgenommen, als die Reduktion der Disulfide mit Bis-2-mercaptoethylsulfon durchgeführt wurde und die Markierung mit Monobrombiman mit 15%iger HCl gestoppt wurde.
Das tiefgefrorene Blattmaterial wurde zu einem feinen Pulver homogenisiert und anschließend 20 Minuten lang mit 0,1 N HCl (2 ml/0,2 gFG) bei 4°C extrahiert. Nach der Zentrifugation der Mischung bei 4°C (20 min, 14 000 g) wurden 120 μl des Überstands zu 200 μl 0,2 M 2-(Cyclohexylamino)ethansulfonsäure (pH 9,3) zugegeben. Die Gesamt-Disulfide wurden durch Versetzen mit 10 μl Bis-2-mercaptoethylsulfon in 9 mM Tris-HCl 5 mM EDTA (pH 8) durchgeführt. Nachdem 40 Minuten lang bei Raumtemperatur umsetzen gelassen wurde, wurden die freien Thiolgruppen mit Monobrombiman markiert. Dazu wurden 20 μl 15 mM Monobrombiman in Acetonitril zum Ansatz gegeben und 15 Minuten lang im Dunklen bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 250 μl 15%iger HCl gestoppt. Nach 2 Stunden auf Eis im Dunklen wurde der Ansatz nochmals bei 4°C zentrifugiert (10 min, 14 000 g). Für die Cystein- und Glutathionanalyse wurde der Überstand entsprechend mit 0,1 N HCl verdünnt . Die Proben wurden gemäß Schupp und Rennenberg (1988) auf einer Umkehrphasen-HPLC-Säule (C₁₈, 250 × 4 mm, Teilchendurchmesser 5 μm, Macherey-Nagel, Oensingen, Schweiz) analysiert. Es wurde ein Lösungsmittelsystem aus 10% Methanol; 0,25% Essigsäure, pH 3,9 (NaOH) und 90% Methanol; 0,25%ige Essigsäure mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 ml/min verwendet. Nach der Chromatographie erfolgte ein Fluoreszenznachweis (Anregung: 380 nm; Emission: 480 nm, Fluoreszenzdetektor SFM 25 von Kontron, Zürich, Schweiz). Die Chromatogramme wurden durch Integration der Peak-Flächen quantitativ ausgewertet. Für die Cysteinanalyse wurden die beiden Transformanten mit der höchsten SAT-Aktivität verwendet, also SRT-48 und SAT-26 (siehe 2b). Dazu wurden junge grüne Blätter von 5 Wochen alten Pflanzen geerntet und extrahiert, und der Cysteingehalt wurde mittels HPLC bestimmt. Die transgenen Kartoffelpflanzen, die das cysE-Gen aus E. coli exprimierten, wiesen einen signifikant erhöhten Cysteingehalt auf (3a). Der Gehalt der Transformante SAT-48 betrug beinahe das dreifache (45 ± 10 nmol pro Gramm Frischgewichtblattgewebe) und der der Transformante SAT-26 das zweifache (33 ± 6 nmol/gFG) als die Mengen, die in nicht transformierten Kontrollpflanzen gefunden wurden (17 ± 3 nmol/gFG), woraus ersichtlich ist, daß die Expression von cysE zu einer Erhöhung des endogenen Gehalts an der Aminosäurecystein führt.
Eine der wichtigsten "Sinks" für Cystein aufgrund der Sulfatassimilation/-reduktionskaskade ist die Bildung von Glutathion, einem Tripeptid, das aus den Aminosäuren Glutamat, Cystein und Glycin besteht. Da die transgenen Kartoffelpflanzen, die die SAT aus E. coli exprimieren, mehr Cystein enthielten, ist es möglich, daß dies eine Auswirkung auf die Glutathionbiosynthese hatte, insbesondere im Hinblick darauf, daß Cystein ein Substrat für die Glutathionproduktion darstellt. Um herauszufinden, ob dies tatsächlich der Fall ist, wurde der Glutathiongehalt in den Blättern der transgenen Linien SAT-48 und SAT-26 sowie von Wildtyppflanzen analysiert. Aus diesen Bestimmungen ging hervor, daß die beiden Transformanten einen signifikant erhöhten Glutathiongehalt aufwiesen, der bis zu zweimal höher (500–600 nmol/gFG) als der der Wildtyppflanzen (300–350 nmol/gFG); (3b) war. Dies legt nahe, daß ein erhöhter Cysteingehalt die Glutathionbiosynthese stimuliert.
Angesichts der Tatsache, daß ein Molekül Glutathion ein Molekül Cystein enthält und daß die gesamte Glutathion-Molmasse in Kartoffelblättern über 10 mal größer ist als die Molmasse der freien Aminosäure cystein, kann geschlossen werden, daß die Fähigkeit zur Cysteinsynthese in den transgenen Kartoffelpflanzen wesentlich stärker erhöht ist als nur um das Zwei- oder Dreifache, was angesichts des Gehalts an freiem Cystein angenommen hätte werden können. Ein absoluter Anstieg von 200–300 nmol Glutathion/gFG in den transgenen Pflanzen entspricht daher einer um das ungefähr 10- bis 18fache erhöhten Cysteinbiosynthesefähigkeit, wenn ungefähr 15–20 nmol Cystein/gFG in den Blättern der Wiltyppflanzen vorliegt. Zählt man dazu noch den um das ungefähr zwei- bis dreifache erhöhten Gehalt an freiem Cystein in den transgenen Pflanzen, so ist die Cysteinbiosynthese in den Transformanten im Vergleich zu den Kontrollpflanzen ungefähr 20fach hinauf reguliert.
Beispiel 3: ein erhöhter endogener Cystein- und Glutathiongehalt beeinflußt nicht das Expressionsmuster der OAS-TL-Isoformen
Es wurde berichtet, daß das Enzym aus der Wassermelone (Saito, 1995) eine metabolisch höchst wichtige Regulation der SAT-Aktivität dadurch ausübt, daß es Cystein allosterisch hemmt. Bakterielle SATs unterliegen auf Transkriptionsebene einer Feedback-Hemmung durch Cystein in Mikromol-Konzentrationen. Im Gegensatz dazu wird bei Cysteinbegrenzung die Expression von bakteriellen SATs stimuliert (Kredich, 1987). Außerdem wird auch die O-Acetylserin-Thiol-Lyase, bei der es sich um das Enzym handelt, das in der Reaktionskaskade der Cystein-Biosynthese direkt an die SAT anschließt, auf Transkriptionsebene ebenfalls durch Cystein reguliert. Es wurde beobachtet, daß die Expression von unterschiedlichen cDNAs, die kompartimentspezifische Isoformen der O-Acetylserin-Thiol-Lyase aus Arabidopsis codiert, in Pflanzen, die mit begrenztem Sulfatangebot herangezogen wurden, stimuliert war (Hell, 1994; Barroso, 1995; Hesse, 1997). Beim Spinat ist ebenfalls die Expression von O-Acetylserin-Thiol-Lyase-Isoformen unter Schwefelmangelbedingungen etwas hinaufreguliert (Takahashi und Saito, 1996). Um herauszufinden, ob der erhöhte Cysteingehalt in den transgenen Kartoffelpflanzen, die das cysE-Gen aus E. coli exprimieren, das Expressionsmuster der endogenen Kartoffel-OAS-TL beeinflußt, wurden Blattproben von transgenen Pflanzen sowie von untransformierten Pflanzen entnommen und damit eine RNA-Blot-Analyse durchgeführt; siehe Beispiel 1. Für die radioaktive Markierung der Kartoffel-OAS-TL-cDNAs (Hesse und Höfgen, 1998), wurde die DNA mit den jeweiligen Restriktionsenzymen geschnitten und auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Die DNA-Fragmente wurden aus dem Gel mit Hilfe des "NucleoSpin Extract"-Kits von Macherey-Nagel (Düren, Deutschland) isoliert. Diese Analyse zeigte, daß, obwohl die transgenen Pflanzen wesentlich mehr Cystein in ihren Blättern enthielten, Kartoffel-OAS-TL-Gene (und zwar sowohl eine Cytosolals auch eine Chloroplasten-Isoform, Hesse und Höfgen, 1998) im Vergleich mit der Expression in Wildtyppflanzen in Bezug auf ihre Transkriptionsrate nicht verändert waren (3). Dies legt nahe, daß der erhöhte Cysteingehalt in den transgenen Kartoffelpflanzen keinen nachweisbaren Einfluß auf das Expressionsmuster der Kartoffel-OAS-TL auf Transkriptionsebene ausübt.
Beispiel 4: ein erhöhter endogener Cysteingehalt hat keinen Einfluß auf die Aktivität der O-Acetylserin-Thiol-Lyase
Die OAS-TL wird auf ihrer Aktivitätsebene durch den Schwefelstatus innerhalb der Zelle reguliert. So wird zum Beispiel die Aktivität einer Cytosol-O-Acetylserin-Thiol-Lyase aus Arabidopsis thaliana durch Schwefelbegrenzung aktiviert (Barroso, 1995; Hesse, 1997). Ein Anstieg der spezifischen Aktivität durch Schwefelabreicherung wurde auch in kultivierten Zellen von Tabak und C. reinhardtii sowie in Maisblättern beobachtet (Bergmann, 1980; Passera und Ghisi, 1982; León, 1988). Im Gegensatz dazu scheinen hohe Schwefelkonzentrationen die OAS-TL-Aktivität zu reduzieren. Das Enzym aus Datura innoxia zum Beispiel wird durch höhere Sulfidkonzentrationen gehemmt (Kuske, 1994). In Zellen von C. reinhardtii wird die OAS-TL-Aktivität nicht nur durch Sulfid, sondern auch durch OAS und Cystein gehemmt (León und Vega, 1991). Um herauszufinden, ob die erhöhte SAT-Aktivität und der veränderte Cystein- und Glutathiongehalt in den transgenen Kartoffelpflanzen eine Auswirkung auf die Aktivität der OAS-TL ausüben, wurde ein Aktivitäts-Assay für dieses Enzym an Blatt-Rohextrakten durchgeführt. Die Aktivität der O-Acetylserin-Thiol-Lyase wurde durch quantitative Bestimmung der Produktion von L-Cystein getestet. Jeder Assay wurde durch Zugabe von 5 μl Blatt-Rohextrakt (1 μg/μl Gesamtprotein) gestartet. Die Reaktionen wurden in 50 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ (pH 7,5) in Gegenwart von 5 mM DTT, 10 mM O-Acetylserin und 2 mM Na₂S (Gesamtvolumen 100 μl) durchgeführt und 20 Minuten lang bei 25°C ablaufen gelassen. Sie wurden durch Versetzen mit 50 μl 20%iger Trichloressigsäure gestoppt und anschließend wurde die L-Cysteinproduktion mittels Gaitonde-Reagens analysiert (Gaitonde, 1967). Der Cysteingehalt wurde bei 560 nm in einem Spektralphotometer (UltraSpec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) gegen eine Blindkontrolle, die alle Substanzen mit Ausnahme von O-Acetylserin enthielt, verfolgt. Die Versuche wurden dreimal wiederholt. Diese Bestimmungen ergaben jedoch keine Unterschiede bezüglich der OAS-TL-Aktivitäten zwischen den Blattextrakten von Wildtyppflanzen und von transgenen Pflanzen (4). Es kann daher angenommen werden, daß der höhere Cystein- und Glutathiongehalt in den transgenen Pflanzen nicht nur keine nachweisbare Auswirkung auf das Ausmaß der Genexpression, sondern auch keine Auswirkung auf die OAS-TL-Aktivität ausübt.
Veranschaulichendes Beispiel 5: Expression für transgene Kartoffelpflanzen, die E. coli-SAT- und Pflanzen-Cγ S-mRNA enthalten
Es wurden zwei transgene Linien, die SAT aus E. coli (z.B. SAT-48 und SAT-26) für die Superinfektion mit einem binären Plasmidkonstrukt, das eine CγS-cDNA, z.B. Kartoffel, unter der Kontrolle des 355- bzw. B33-Promoters enthält, exprimieren, ausgewählt. Bei dem binären Vektor handelt es sich um ein pBIN19-Derivat, das z.B. Hygromycinresistenz für die Pflanzenselektion ermöglicht. Die Plasmide wurden in die transgenen Linien SAT-48 bzw. SAT-26 mittels Agrobacterium tumefaciens gemäß Rocha-Sosa (1989) eingeführt. Die Selektionsbedingungen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gewählt. Die superinfizierten transgenen Linien, die SAT und CγS aus E. coli exprimierten, wurden auf RNA-Ebene (Northern-Blot), auf Proteinebene (Western-Blot) sowie auf Enzymaktivität durchmustert. Die Northern-Blot-Versuche wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Linien mit hoher CγS-Expression wurden auf Proteingehalt und Enzymaktivität selektiert. 10 μg Protein von jedem Blattextrakt wurden in Western-Blot auf erhöhten Proteingehalt in Bezug auf den Wildtyp sowie die ursprünglich verwendete transgene Linie getestet. Linien mit erhöhtem Proteingehalt wurden zusätzlich auf Enzymaktivität getestet. 10 μg, 25 μg, 50 μg 100 μg Blattextrakt wurden 30 Minuten lang bei 30°C mit 10 μCi ³⁵S-Cystein sowie 10 mM Succinylhomoserin in einem Gesamtvolumen von 200 μl 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 und 10 mM DTT inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Versetzen mit 50 μl TCA (20%ig) gestoppt. Nach dem Neutralisieren und Zentrifugieren wurden 5 μl von jedem Überstand mittels Dünnschichtchromatographie analysiert. Als Laufmittel wurde eine Mischung von Methanol/Essigsäureethylester/H₂O = 60:30:10 verwendet. Transgene Pflanzen mit hoher Aktivität werden weiter auf GSH-, CγS- und Met-Gehalt analysiert.
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Claims

Verfahren zum Erhöhen des Gehalts an schwefelhaltigen Verbindungen in transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe, bestehend aus der Einführung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Protein mit Serin-Acetyltransferase-(SAT)-Aktivität codiert, in eine Pflanze, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell mit Regulationselementen verknüpft ist, die die Expression des Nucleinsäuremoleküls in Pflanzenzellen erlauben, wobei die Pflanze, Pflanzenzelle oder das Pflanzengewebe ein exogen eingeführtes Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit O-Acetylserin-(Thiol)-Lyase-(OASTL)-Aktivität codiert, nicht exprimiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Protein mit SAT-Aktivität eine Serin-Acetyl-Transferase aus Prokaryonten oder Archaebakterien ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell mit einer Nucleotidsequenz verknüpft ist, die ein Transit-Peptid codiert, das geeignet ist, das Protein in ein gewünschtes Zellkompartiment zu bringen.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das zelluläre Kompartiment ein Plastid ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Regulationselemente einen in Pflanzenzellen aktiven Promotor umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Promotor induzierbar, konstitutiv exprimiert und/oder ein zell-, gewebe- oder organ-spezifischer Promotor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der Promoter Knollen-spezifisch, Samen-spezifisch, Endosperm-spezifisch, Embryo-spezifisch oder Phloem-spezifisch ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Nucleinsäuremolekül in einem Vektor platziert ist, der ferner einen selektierbaren Marker umfasst .
Nahrungsmittel, Futtermittel oder Zusätze dafür, umfassend transgene Pflanzenzellen, in deren Genom ein rekombinantes DNA-Molekül stabil integriert ist, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit Serin-Acetyltransferase-(SAT)-Aktivität codiert, das funktionell mit Regulationselementen verknüpft ist, die die Expression des Nucleinsäuresmoleküls in Pflanzenzellen erlauben, oder umfassend eine Pflanze oder ein Pflanzengewebe, das die transgenen Pflanzenzellen, erntebaren Teile der Pflanze oder Vermehrungsmaterial der Pflanze umfasst, wobei die erntebaren Teile und das Vermehrungsmaterial die Pflanzenzellen umfassen, wobei die Pflanzenzellen ein exogen eingeführtes Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit O-Acetylserin-(Thiol)-Lyase-(OASTL)-Aktivität codiert, nicht exprimieren.
Nahrungsmittel, Futtermittel oder Zusätze dafür gemäß Anspruch 9, wobei die transgenen Pflanzenzellen einen selektierbaren Marker umfassen.
Nahrungsmittel, Futtermittel oder Zusätze dafür gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei in der transgenen Pflanze der Glutathion-, Cystein- und/oder Methioningehalt im Vergleich zu einer Wildtypflanze erhöht ist.
Nahrungsmittel, Futtermittel oder Zusätze dafür gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die transgene Pflanze Mais ist.
Nahrungsmittel, Futtermittel oder Zusätze dafür gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Vermehrungsmaterial Samen sind.