DE60024060T2

DE60024060T2 - Verfahren zum Modulieren der Biosynthese von organischen Schwefelverbindungen in Pflanzen

Info

Publication number: DE60024060T2
Application number: DE60024060T
Authority: DE
Inventors: Thomas Leustek; C. Mitchell TARCZYNSKI
Original assignee: Rutgers State University of New Jersey; Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Rutgers State University of New Jersey; Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1999-02-18
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2020-02-19
Also published as: WO2000049165A1; AU3702700A; DE60024060D1; ATE310095T1; ES2254160T3; EP1153135A1; EP1153135B1; US6576819B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die genetische Manipulation von Pflanzen, insbesondere die Veränderung des Schwefelmetabolismus in Pflanzen und Pflanzensamen.
Hintergrund der Erfindung
Schwefel spielt in seiner reduzierten Form eine wichtige Rolle im Pflanzenmetabolismus, in den er in der Biosynthese eines weiten Bereichs von primären und sekundären S-enthaltenden Metaboliten involviert ist. Bei Pflanzen beinhaltet der Schwefelmetabolismus die Aufnahme von Sulfat aus der Umgebung, die Assimilation zu organischen Verbindungen und eine Lenkung zu Proteinen und Sekundärsubstanzen.
Pflanzen und Mikroorganismen sind fähig, für eine Synthese der Thiolgruppe von Cystein Sulfat in Sulfid zu reduzieren. Sulfat wird zuerst durch ATP-Sulfurylase aktiviert, wodurch 5'-Adenylylsulfat (APS) gebildet wird. APS kann durch APS-Kinase phosphoryliert werden, wodurch 3'-Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat (PAPS) gebildet wird. APS oder PAPS kann zur Sulfatreduktion eingesetzt werden. Im Allgemeinen verwenden Prokaryoten und Pilze PAPS, wohingegen photosynthetische Eukaryoten APS verwenden.
Cystein, Methionin und schwefelhaltige Vitamine wie z.B. Biotin oder Thiamin sind in der menschlichen Ernährung essentiell. Schwefel-vermittelte Funktionen umfassen den Elektronentransport in Fe/S-Clustern, strukturelle und regulatorische Rollen via Proteindisulfidbrücken und katalytische Zentren. Zusätzlich beinhalten sekundäre Schwefelverbindungen Signal-transduzierende Moleküle, Antikarzinogene und atmosphärische Verbindungen. Siehe Hell (1997) Planta 202:138.
Oft mangelt es Pflanzenprotein an Schwefelaminosäuren, speziell Methionin, wie auch an anderen essentiellen Aminosäuren, zum Beispiel Lysin und Tryptophan. Als Resultat müssen Diäten bzw. Ernährungen mit diesen Aminosäuren ergänzt werden, um eine ausgewogene Ernährung bereitzustellen. Ein Ziel der Pflanzenzüchtung bestand darin, die Menge an im Samen vorhandenen Schwefelaminosäuren zu erhöhen.
Es wurde eine Reihe von Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Schwefelaminosäuren beschrieben. Im Allgemeinen sorgen diese Verfahren für eine Überexpression eines Samenspeicherproteins mit hohem Methioningehalt. Das Verfahren zieht ein Überexprimieren des Samenspeicherproteins in einer transformierten Pflanze mit sich. Vorher wurden Verfahren zur Erhöhung des Schwefelaminosäuregehalts von Nutzpflanzen durch Züchtung in Angriff genommen. Allerdings haben diese Verfahren nur einen begrenzten Erfolg gebracht. Demnach besteht ein Bedarf für Verfahren zur Herstellung signifikanter Konzentrationen der Schwefelaminosäuren in Pflanzen und Pflanzensamen.
Aerobe Organismen sind für eine Schädigung durch reaktive Sauerstoffspezies anfällig. Dies ist für Pflanzen ein besonderes Problem, da reaktive Sauerstoffspezies als Nebenprodukt der Sauerstoffphotosynthese und der Kohlendioxidfixierung gebildet werden. Es wäre daher wünschenswert, ein Verfahren zur Reduzierung des oxidativen Stress bei Pflanzen und zur Erhöhung der Nahrungsqualität von Pflanzen und Samen bereitzustellen.
APS-Reduktasen aus bestimmten Pflanzenspezies werden in WO 00/0416, die Teil des Stands der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ ist, bereitgestellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Erhöhung des Nährwerts von Pflanzen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Pflanzen und Pflanzenteilen mit erhöhtem Nährwert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Pflanzen und Pflanzenteilen, die erhöhte Konzentrationen an organischen Schwefelverbindungen haben.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Pflanzen und Pflanzenteilen, die erhöhte Konzentrationen an Methionin haben.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Verringerung des oxidativen Stress in Pflanzen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Modulierung der Konzentration wenigstens einer organischen Schwefelverbindung in Pflanzen bereitgestellt. Bereitgestellt werden ebenfalls Pflanzen, Pflanzengewebe, Pflanzensamen und Pflanzenzellen, die durch die Verfahren produziert werden. Die Verfahren umfassen stabiles Transformieren einer Pflanze mit einem DNA-Konstrukt, das für ein (P)APS-Reduktase-Enzym codiert. (P)APS-Reduktase ist als ein Enzym definiert, das fähig ist, Schwefel in Form von APS oder PAPS unter Herstellung von Sulfid zu reduzieren. Das (P)APS-Reduktase-Enzym hat eine solche Aktivität, dass die transformierte Pflanze veränderte Konzentrationen an wenigstens einer organischen Schwe felverbindung aufweist. Bereitgestellt wird auch ein Verfahren zur Verringerung des oxidativen Stress in Pflanzen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 führt die Biosynthese für die organischen Schwefelverbindungen Cystein und Methionin mit den vorgeschlagenen Modifikationen der Erfindung aus.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In Übereinstimmung mit dem Gegenstand der Erfindung werden Zusammensetzungen und Verfahren zur Modulierung der Biosynthese von organischen Schwefelverbindungen in Pflanzen, insbesondere von Schwefelaminosäuren, spezieller von Cystein und Methionin, bereitgestellt. Die Verfahren involvieren ein Transformieren einer Pflanze mit einer Nucleinsäure oder mehreren Nucleinsäuren, die für ein (P)APS-Reduktase-Enzym codiert (codieren), das in der Lage ist, die Biosynthese von wenigstens einer organischen Schwefelverbindung zu modulieren. Die Pflanze kann auch eine oder mehrere zusätzliche Nucleinsäure(n) umfassen, die aus Nucleinsäuren ausgewählt sind, die für Enzyme codieren, welche bei der Aminosäurebiosynthese und Sulfatreduktion involviert sind (1).
Mit „organischen Schwefelverbindungen" sind Verbindungen wie Glutathion, Phytochelatine, Schwefel-enthaltende Vitamine, Glucosinolate, Dimethylsulfoniopropionat und Aminosäuren wie Methionin und Cystein gemeint.
APS-Reduktase katalysiert eine Schlüsselreaktion im Sulfat-Assimilationsweg höherer Pflanzen, die zur Synthese von Cystein und der Antioxidansverbindung Glutathion führt. Biochemische in vitro-Studien zeigten, dass das Enzym durch Oxidation aktiviert wird. Das Aussetzen von Pflanzen Ozon indu ziert einen schnellen Anstieg bei der APS-Reduktaseaktivität, welche mit der Akkumulation von Cystein und Glutathion zusammenfällt. Diese Resultate weisen darauf hin, dass eine Redoxregulation von APS-Reduktase einen Mechanismus für eine schnelle Antwort auf oxidativen Stress bereitstellen kann.
Glutathion ist ein Tripeptid, das aus den Aminosäuren Glutamat, Cystein und Glycin besteht. Glutathion existiert in der reduzierten Form und in der oxidierten Form, die zusammen einen biologischen Redoxpuffer bilden, der vornehmlich in einem reduzierten Zustand ist.
Eine Sulfatreduktion erfolgt sowohl in Wurzeln als auch in Schösslingen von Pflanzen. Der meiste Schwefel, der in Xylem zu den Blättern transportiert wird, liegt als nicht reduziertes SO₄ ^2– vor. Ein gewisser Transport zurück zu den Wurzeln und anderen Teilen der Pflanze erfolgt durch das Phloem, und es werden sowohl freies SO₄ ^2– als auch organische Schwefelverbindungen transportiert. In Blättern erfolgt der Prozess der Sulfatreduktion in Chloroplasten. In Wurzeln läuft der größte Teil des Prozesses oder der gesamte Prozess in Proplastiden ab.
Der erste Schritt der Sulfatassimilation in allen Zellen ist eine Reaktion von SO₄ ^2– mit ATP, die Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) und Pyrophosphat produziert. Dieser Schritt wird durch ATP-Sulfurylase katalysiert. In Pflanzen wird der Schwefel von APS durch (P)APS-Reduktaseaktivität weiter reduziert. Dieses Enzym wird während oxidativem Stress deutlich stimuliert und ist ein Schlüsselenzym bei der Sulfatassimilation in Pflanzen. Unter oxidativem Stress ist das Enzym etwa 40-fach stimuliert. Diese Änderung in der Aktivität scheint mit einer Konformationsänderung beim Enzym als Reaktion auf eine Änderung beim Redoxstatus der Chloroplasten aufzutreten.
Daher besteht eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer (P)APS-Reduktase-Expression, die unter reduzierenden Bedingungen relativ aktiv ist, z.B. im Chloroplasten. Zur Erhöhung der Aktivität des (P)APS-Reduktase-Enzyms können andere Verfahren eingesetzt werden, z.B. Protein-Engineering oder DNA-Shuffling.
Unter oxidativem Stress wird auch die Glutathionbiosynthese als Mechanismus zur Linderung der Wirkungen des Stress aktiviert. Unter Bedingungen von oxidativem Stress wird die Sulfatreduktion durch die erhöhte Aktivität von (P)APS-Reduktase-Enzym verstärkt. Der Fluss des resultierenden reduzierten anorganischen Schwefels ist auf die Glutathionbiosynthese über Cystein durch erhöhte Aktivität von Glutathionbiosyntheseenzymen gerichtet.
ATP-Sulfurylase, das erste Enzym bei der Sulfatreduktion, ist gegenüber oxidativem Stress relativ unempfindlich. Daher stellt dieses Enzym keinen bedeutenden limitierenden Faktor bei der Sulfatreduktion dar, wenn Sulfat selbst nicht limitierend ist. Wie in 1 gezeigt ist, kann durch Versorgen des Chloroplasten mit einem (P)APS-Reduktase-Enzym, das unter reduzierenden Bedingungen metabolisch aktiv ist, die Sulfatreduktion und anschließend die Produktion von organischen Schwefelverbindungen in der Pflanze erhöht werden.
Andere Nucleinsäuren, die für Enzyme codieren, die in der Sulfatreduktion oder der Biosynthese von organischen Schwefelverbindungen, z.B. der Cystein- und Methioninbiosynthese involviert sind, können verwendet werden, um den Weg in bestimmte Richtungen zu verschieben. Beispielsweise kann APS-Kinase eingesetzt werden, um APS zu (P)APS zu verschieben, was zu zusätzlichem Substrat für das (P)APS-Reduktase-Enzym führt. In der gleichen Weise kann Cystathionin-gamma-Synthase verwendet werden, um den Cysteinstrom zu Methionin zu lenken.
Es können auch Antisensekonstrukte für ein beliebiges der Enzyme verwendet werden, um die Biosynthese zu einem bestimmten Produkt zu lenken oder die Biosynthese für den Aufbau einer besonderen Verbindung zu stoppen. Beispielsweise kann ein Antisense-Konstrukt für gamma-Glutamylsynthetase (gs) verwendet werden, um reduzierten Schwefel zur Methioninproduktion aus Cystein selbst unter oxidativen Bedingungen zu verschieben.
Hefe- und Bakterien-(P)APS-Reduktase-Enzyme sind unter reduzierenden Bedingungen relativ aktiv, wohingegen das (P)APS-Reduktase-Enzym höherer Pflanzen unter diesen Bedingungen relativ inaktiv ist. Demnach ist die Expression von Bakterien- oder Hefe- oder eines modifizierten (P)APS-Reduktase-Enzyms in Chloroplasten, der unter normalen Bedingungen eine relativ reduzierende Umgebung aufrechterhält, ein Verfahren zur Verstärkung der Sulfatreaktion. Auf diese Weise kann der Stoffwechselweg von Interesse für die hohe Produktion von Schwefe lenthaltenden Aminosäuren oder anderen organischen Schwefelverbindungen stromabwärts manipuliert werden.
Wie oben angegeben ist, kann der Weg auch zur Senkung der Konzentrationen einer bestimmten Verbindung durch Transformation von Antisense-DNA-Sequenzen, die verhindern, dass die Umwandlung der Vorläuferverbindung in die bestimmte Verbindung reguliert wird, manipuliert werden. Dieses Verfahren kann zum „Shunting" von reduziertem Schwefel von einem Weg zu einem anderen nützlich sein.
Ein beliebiges Mittel zur Herstellung einer Pflanze, die die (P)APS-Reduktase-Nucleinsäure oder beide, die (P)APS-Reduktase-Nucleinsäure und wenigstens eine zweite Nucleinsäure, umfasst, ist von der vorliegenden Erfindung mit umfasst. Beispielsweise kann die zweite (oder zusätzliche) Nucleinsäure (die zweiten oder zusätzlichen Nucleinsäuren) von Interes se eingesetzt werden, um eine Pflanze zur gleichen Zeit wie die (P)APS-Reduktasenucleinsäure zu transformieren (Co-Transformation). Die zweite Nucleinsäure kann auch in eine Pflanze eingeführt werden, die bereits mit der (P)APS-Reduktasenucleinsäure transformiert wurde. Alternativ können transformierte Pflanzen eine, die das (P)APS-Reduktase-Enzym exprimiert, und eine, die die zweite Nucleinsäure exprimiert, gekreuzt werden, um die Nucleinsäuren in derselben Pflanze zusammenzubringen. Anschließende Kreuzungen oder Transformationen können zusätzliche Sequenzen zusammen in die Pflanze bringen.
Enzyme, die bei der Cystein- und Methioninbiosynthese involviert sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Aspartokinase (Masakazu et al. (1992) „Mutant Aspartokinase Gene", Japan. Patent 1994062866-A 1, B. März 1994, Eingangs-Nr. E06825; Omori et al. (1993) J. Bacteriol. 175(3):785–794; Eingangs-Nr. X60821; Moriya et al. (1995), Japan. Patent 1997070291-A 13, 18. März 1997; Eingangs-Nr. E12770); Aspartatsemialdehyddehydrogenase (Calzada, F.R.A., Direct Submission, Centro Nacional de Investigaciones Cientificas, Avenida 25 esq. 158 reparto Cubanacan, Playa Ciudad de la Habana, Codigo Postal 6990, CUBA (1997); Eingangs-Nr. Y15281; Daniel et al. (1993) J. Mol. Biol. 232(2):468–483; Eingangs-Nr. Z22554; Chen et al. (1993) J. Biol. Chem.; Eingangs-Nr. Z22554, Eingangs-Nr. U90239; Brakhage et al. (1990) Biochimie 72(10):725–734; Eingangs-Nr. Z75208; Gothel et al. (1997) Eur. J. Biochem. 244(1):59–65; Eingangs-Nr. Z75208); Homoserinkinase (siehe Nummer zwei unter Aspartokinase, Eingangs-Nr. X60821; Nakabachi et al. (1997) Insect Biochem. Mol. Biol. 27:1057–1062; Eingangs-Nr. AB004856; Ryoichi et al. (1986), Japan. Patent 1987232392-A 1, 12. Oktober 1987 (JP198676298); Eingangs-Nr. E01358; Sadao et al. Japan. Patent 1993207886-A 4, 20. August 1993; Eingangs-Nr. D14072); Threoninsynthase (siehe Nummer zwei unter Aspartokinase, Ein gangs-Nr. X6082; Eingangs-Nr. Z46263; Rognes, S.E., Direct Submission, 24. Oktober 1994, University of Oslo, Department of Biology, Blindern, 0316 Norwegen, Eingangs-Nr. Z46263; Eingangs-Nr. L41666; Clepet et al. (1992) Mol. Microbiol. 6(21):3109–3119; Eingangs-Nr. X65033 S50569; Cami, B., Direct Submission, 11. März 1992, Laboratoire de Chimie Bacterienne, Centre Nationale de la Recherche, Scientifique, 31 Chemin I. Aiguier, BP 71 13277 Marseille Cedex, Frankreich, Eingangs-Nr. X65033 550569); Cystathionin-gamma-Synthase (cgs) (Kim und Leustek (1996) "Cloning and analysis of the gene for Cystathionin gamma-synthase from Arabidopsis thaliana", Plant Mol. Biol. 32(6), 1117–1124, USA, Eingangs-Nr. AF069317; Locke et al., Direct Submission, 3. Juni 1997, AG Biotechnology, Dupont AF Products, PO Box 80402, Wilmington, DE 19880-0402 USA, Eingangs-Nr. AF007786); Cystathionin-beta-lyase (Bork et al. (1997) Plant Physiol. 115:864–864; Eingangs-Nr. AJ001148; Sienko, M., Direct Submission, 5. Juni 1995, Marzena Sienko, Genetics, Institute of Biochemistry and Biophysics, Pawinskiego 5a, Warschau 02–106, Polen, Eingangs-Nr. U28383; Ravanel et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):875–882; Eingangs-Nr. L40511); Methioninsynthase (Kurvari et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:1235–1252; Eingangs-Nr. U36197; Ravanel et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(13):7805–7812; Eingangs-Nr. U97200; Michalowski et al, Direct Submission, 12. Januar 1997, Biochemistry, University of Arizona BioSciences West 513, Tucson, AZ 85721 USA, Eingangs-Nr. U84889; Eichel et al. (1995) Eur. J. Biochem. 230(3):1053:1058; Eingangs-Nr. X83499); ATP-Sulfurylase (Murillo et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 323(1):195–204; Eingangs-Nr. U06275; Leustek et al. (1994) Plant Physiol. 105:897–902; Eingangs-Nr. U05218; Bolchi et al., Direct Submission, 28. Juli 1997, Scienze Biochimiche, Viale delle Scienze, Parma, PR 43100 ITALIEN, Eingangs-Nr. AF016305; Laue et al. (1994) J. Bacteriol. 176:3723–3729; Eingangs-Nr. L26897; Laeremans et al., Eingangs-Nr. AJ001223); APS-Kinase (apk) (Korch et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 229(1):96–108; Eingangs-Nr. 555315; Arz et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1218 (3):447–452; Eingangs-Nr. AF044285; Schiffmann et al. „Isolation of cDNA clones encoding adenosine-5'-phosphosulfate-kinase (EC2.7.1.25) from Catharanthus roseus (Eingangs-Nr. AF044285) and an isoform (akn2) from Arabidopsis (Eingangs-Nr. AF043351)(PGR98–116), „Plant Physiol. 117(3):1125(1998); Eingangs-Nr. AF044285; Jain et al. (1994) Plant Physiol. 105:771–772; Eingangs-Nr. U05238; Lee et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 247:171–175; Eingangs-Nr. U05238); APS-Reduktase (Speich et al. (1994) Microbiology 140 (Pt6):1273–1284; Eingangs-Nr. Z69372; Setya et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(23):13383–1338; Eingangs-Nr. U56921; Bick et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14):8404–8409; Eingans-Nr. U56921); PAPS-Reduktase (Krone et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225(2):314–319; Eingangs-Nr. Y07525; Krone et al. (1990) FEBS Lett. 260(1):6–9: Eingangs-Nr. Y07525; Gutierrez-Marcos et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13377–13382; Eingangs-Nr. U53865; Schwenn, J.D., Direct Submission, 2. Juli 1993, Ruhr-Universität-Bochum, Fak. Biologie, Biochemie von Pflanzen, Universitätsstr. 150, D44780 Bochum, Deutschland, Eingangs-Nr. Z23169; siehe Nummer fünf unter ATP-Sulfurylase, Eingangs-Nr. AJ001223; Bussey et al. (1997) Nature 387 (6632 Suppl.):103–105; Eingangs-Nr. U25840 U00094); Sulfitreduktase (Eingangs-Nr. Y07525; Eingangs-Nr. Z23169; Hipp et al. (1997) Microbiology 143(Pt9):2891–2902; Eingangs-Nr. U84760; Pott et al. (1998) Microbiology 144 (Pt7):1881–1894; Eingangs-Nr. U84760; Bork et al. (1998) Gene 212(1):147–153; Eingangs-Nr. Y10157; Mbe-guie-A-Mbeguie et al. Eingangs-Nr. AF071890; Bruehl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1295:119–124; Z49217; Hummerjohann et al. (1998) Microbiology 144 (Pt 5):1375–1386; Eingangs-Nr. AF026066; Serinacetyltransferase (Eingangs-Nr. X80938; Eingangs-Nr. D88529; Saito et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(27):16321–16326; Eingangs-Nr. D49535); Cystein synthase (Hesse et al. (1998) „Isolation of cDNAs encoding cytosolic (Accession No. AF044172) and Plastidic (Eingangs-Nr. AF044173) cysteine synthase isoforms from Solanum tuberosum (PGR98-057)," Plant Physiol. 116:1604, Eingangs-Nr. AF044173: Brander et al. (1995) plant Physiol. 108:1748–1748; Eingangs-Nr. X85803; Topczewski et al. (1997) Curr. Genet. 31(4):348–356; Eingangs-Nr. U19395; gamma-Glutamylcysteinsynthase (Powles et al. (1996) Microbiology 142 (Pt 9):2543–2548; Eingangs-Nr. U81808 L75931; Eingangs-Nr. AL031018; EU Arabidopsis sequencing project, Direct Submission, 3. Juli 1997, am Max-Planck-Institut für Biochemie, Am Klopferspitz 18a, D-82152 Martinsried, Deutschland, Eingangs-Nr. AL031018); Glutathionsynthetase (Okumura et al. (1997) Microbiology 143 (Pt 9):2883–2890; Eingangs-Nr. D88540; Inoue et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1395 (3):315–320; Eingangs-Nr. Y13804; Eingangs-Nr. Y10984; Eingangs-Nr. U22359).
Varianten und funktionelle Fragmente einschließlich Verschiebungen „shufflents" der obigen Enzyme oder von P(APS)-Reduktase können verwendet werden. Es ist nur erforderlich, dass die Enzyme eine Aktivität haben, die ausreichend ist, um die Konzentration einer bestimmten organischen Schwefelverbindung in einer Pflanze zu modulieren. Nach fachbekannten Verfahren können Varianten produziert werden. Variantenproteine umfassen solche Proteine, die durch Deletion (sogenannte Verkürzung bzw. Trunkation), Addition oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein abgleitet sind.
Aminsäuresequenzvarianten des Polypeptids können zum Beispiel durch Mutationen in der klonierten DNA-Sequenz, die für das native Protein von Interesse codiert, hergestellt werden. Methoden zur Mutagenese und für Nucleotidsequenzveränderungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe zum Beispiel Walker und Gaastra, Herausgeber, (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488–492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367–383; Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York); US-Patent Nr. 4,873,192 und die darin zitierten Referenzen. Ein Leitfaden für geeignete Aminosäuresubstitutionen, die die biologische Aktivität des Proteins von Interesse nicht beeinträchtigen, kann im Modell von Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), das hier durch Referenz aufgenommen wird, gefunden werden. Konservative Substitutionen, z.B. Austausch einer Aminosäure durch eine andere mit ähnlichen Eigenschaften, können bevorzugt sein.
Die (P)APS-Reduktasenucleinsäure wie auch beliebige zusätzliche Gene von Interesse können für eine verstärkte Expression in Pflanzen von Interesse optimiert werden, siehe z.B., E-PA0359472; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324–3328; und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477–498. Auf diese Weise können die Nucleinsäuren unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Codons synthetisiert werden. Siehe zum Beispiel Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477–498, deren Offenbarung hier durch Referenz aufgenommen wird. Auf diese Weise können auch synthetische Nucleinsäuren auf der Basis der Verteilung von Codons, die ein bestimmter Wirt für eine bestimmte Aminosäure verwendet, hergestellt werden.
Ein anderes Verfahren zum Erhalt modifizierter Enzyme, die die Konzentration wenigstens einer organischen Schwefelverbindung verändern können, ist Sequenz-„Shuffling". Sequenz-„Shuffling" ist in der PCT-Publikation Nr. 96/19256 beschrieben. Siehe auch Zhang et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504–4509. Bibliotheken rekombinanter Polynukleotide wer den aus einer Population verwandter Sequenzpolynukleotide erzeugt, die Sequenzregionen umfassen, die substantielle Sequenzidentität haben und die in vitro oder in vivo homolog rekombiniert werden können.
In einigen Fällen werden die Enzyme von Interesse nativ in der Pflanze exprimiert. Allerdings können durch Transformation mit heterologen Promotoren die Expressionslevel oder – muster verändert werden. Siehe zum Beispiel Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) und Innis et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nucleinsäuren von Interesse auf den Chloroplasten zur Expression gerichtet. Auf diese Weise wird die Expressionskassette, wenn die Nucleinsäure von Interesse nicht direkt in den Chloroplasten insertiert wird, zusätzlich eine Nucleinsäure enthalten, die für ein Transitpeptid kodiert, um die Nucleinsäure von Interesse zu den Chloroplasten zu lenken. Solche Transitpeptide sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104–126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544–17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965–968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414–1421; und, Shah et al. (1986) Science 233:478–481.
Chloroplastentargetingsequenzen sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen die Chloroplasten- kleine Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase (Rubisco), (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769:780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335–3342); 5-(Enolpyruviyl)shikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789–810); Tryptophan synthase (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081–6087); Plastocyanin (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357–20363); Chorismatsynthase (Schmidt et al. (1993) J.Biol.Chem. 268(36):27477–27457); und das Lichtsammelnde Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996–14999). Siehe auch Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Bio1. Rep. 9:104–126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544–17550; della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965–968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res Commun. 196:1414–1421; und Shah et al. (1986) Science 233:278–481.
Methoden zur Transformation von Chloroplasten sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526–8530; Svab und Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913:917; Svab und Maliga (1993) Embo J. 12-601–606. Die Methode beruht auf der Partikelkanonenabgabe von DNA, die einen selektierbaren Marker enthält, und Targeting der DNA zu dem Plasmidgenom durch homologe Rekombination. Zusätzlich kann eine Plastidtransformation durch Transaktivierung eines stummen Plastid getragenen Transgens durch gewebespezifische Expression einer im Kern kodierten und Plasmid-gesteuerten RNA-Polymerase erreicht werden. Ein derartiges System wurde von McBride et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301–7305 beschrieben.
Die Nucleinsäuren können mit konstitutiven, Gewebespezifischen oder Chloroplasten-Promotoren zur Expression des Metaboliten von Interesse kombiniert werden. Solche konstitutiven Promotoren umfassen zum Beispiel den Kernpromotor des Rsyn7 (gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung Serie Nr. 08/661,601), den Kern-CaMV 35S-Promotor (Odell et al. (1985) Nature 313:810–812); Reisaktin (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163–171); Ubiquitin (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619–632 und Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675–689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581–588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723–2730); den ALS-Promotor (US-Patentanmeldung-Serial Nr. 08/409,297) und dergleichen. Andere konstitutive Promotoren sind z.B. in den US-Patenten Nr. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; und 5,608,142 beschrieben.
„Samenspezifische" Promotoren der Erfindung umfassen Embryospezifische Promotoren. Zusätzlich umfassen solche Promotoren Globulin 1, Cruciferin, Napin, B-Conglycinin, Phaseolin wie auch andere Promotoren, die mit Speicherproteinen in Verbindung stehen oder bei der Fettsäurebiosynthese involviert sind.
Expressionskassetten werden eine Transkriptionsstartregion umfassen, die mit der codierenden Sequenz oder der Antisensesequenz des Nucleotids von Interesse verknüpft ist. Eine solche Expressionskassette wird im Allgemeinen mit einer Vielzahl von Restriktionsstellen zur Insertion der Sequenz, die unter der transkriptionalen Regulation der regulatorischen Regionen steht, ausgestattet sein. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Markergene enthalten.
Die Transkriptionsstartregion, der Promotor, kann nativ oder analog oder fremd oder heterolog für den Pflanzenwirt sein. Zusätzlich kann der Promotor eine synthetische Sequenz sein. Mit fremd ist gemeint, dass die Transkriptionsstartregion nicht in der nativen Pflanze gefunden wird, in die die Transkriptionsstartregion eingeführt ist.
Die Transkriptionskassette wird in der 5'-zu-3'-Transkriptionsrichtung eine Transkriptions- und Translationsstartregion, eine DNA-Sequenz von Interesse und ein Transkriptions- und Translations-Terminierungsregion, die in Pflanzen funkti onell sind, enthalten. Die Terminierungsregion kann mit der Transkriptionsstartregion nativ sein, kann mit der DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann aus einer anderen Quelle stammen. Zweckdienliche Terminierungsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens verfügbar, zum Beispiel die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminierungsregionen. Siehe auch Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141–144; Proudfoot (1991) Cell 64:671–674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141–149; Mogen et al. (1990) Plant Cell. 2:1261–1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151–158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891–7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627–9639.
Bei der Herstellung der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass sie für die DNA-Sequenzen in der geeigneten Orientierung und, wenn es passend ist, im geeigneten Leseraster sorgen. Zu diesem Zweck können Adaptoren oder Linker verwendet werden, um die DNA-Fragmente zu verknüpfen, oder es können andere Manipulationen involviert sein, um für zweckdienliche Restriktionsstellen, Entfernung von überflüssiger DNA, Entfernung von Restriktionsstellen oder dergleichen zu sorgen. Zu diesem Zweck können eine in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, ein Annealing, Resubsitutionen, zum Beispiel Transitionen und Transversionen, involviert werden.
Transformationsprotokolle wie auch Protokolle zur Einführung von Nucleotidsequenzen in Pflanzen können in Abhängigkeit vom Pflanzentyp oder der Pflanzenzelle, das heißt, Monokotyle oder Dikotyle, die zur Transformation targetiert wird, variieren. Geeignete Methoden zur Einführung von Nucleotidsequenzen in Pflanzenzellen und zur anschließenden Insertion in das Pflanzengenom umfassen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320–334), Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602–5606), Agrobacteri um-vermittelte Transformation (Townsend et al., US-Patent Nr. 5,563,055); direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717–2722), und ballistische Partikelbeschleunigung (siehe zum Beispiel Sanford et al., US-Patent Nr. 4,945,050; Tomes et al. (1995) „Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Herausg. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); und McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923–926). Siehe auch Weissinger et al. (1988) Annual Rev. Genet. 22:421–277; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27–37 (Zwiebel); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671–674 (Sojabohne); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923–926 (Sojabohne); Finer und McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Bio1. 27P:175–182 (Sojabohne); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319–324 (Sojabohne); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736–740 (Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305–4309 (Mais) ; Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559:563 (Mais); Tomes, US-Patent-Nr. 5,240,855; Buising et al., US-Patent Nrn. 5,322,783 und 5,324,646; Tomes et al. (1995) „Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Heraus. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440–444 (Mais); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833–839 (Mais); Hooykaas-Van Slogteren und Hooykaas (1984) Nature (London) 311:763–764; Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345–5349 (Liliacaceae); De Wet et al. (1985) in „The Experimental Manipulation of Ovule Tissues"; Herausg. Chapman et al. (Longman, New York), S. 197–209 (Pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415–418; und Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560–566 (Whisker-vermittelte Transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495–1505 (Electroporation); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250–255 und Christou und Ford (1995) Annals of Botany 75:407–413 (Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745–750 (Mais via Rgrobacterium tumefaciens).
Die Biosynthese von organischen Schwefelverbindungen kann in einer beliebigen Pflanze von Interesse verändert werden. Von besonderem Interesse sind Pflanzen, die für menschliche Nahrungsmittel und Haustiernahrungsmittel verwendbar sind. Solche Pflanzen umfassen Futterpflanzen und Samenkulturpflanzen, z.B. Getreidepflanzen und Ölsamenpflanzen. Von besonderem Interesse sind Pflanzen, in denen Samen in hohen Mengen produziert wird oder der Samen oder ein Samenteil essbar ist. Samen von Interesse umfassen die Ölsamen, z.B. Samen von Brassica, Baumwolle, Sojabohne, Saflor, Sonnenblume, Kokosnuss, Palm usw.; Getreidesamen wie Weizen, Gerste, Reis, Mais, usw.; andere Samen, einschließlich Hafer, Kürbis, Cucurbita, Mohn, Sesam, Erdnuss, Erbsen, Bohnen, Kakao, Kaffee usw.; und Baumnüsse wie Walnuss, Pekan, Mandeln usw.. Speziell bevorzugte Pflanzen sind Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Brassica, Weizen, Gerste, Roggen, Reis, Hirse, Sorghum, Saflor, Kartoffel, Erbse und Lyzerne.
Die modifizierte Pflanze kann auf herkömmlichen Wegen zu Pflanzen wachsen gelassen werden. Siehe zum Beispiel McCormick et al. (1986) Plant Cell. Reports 5:81–84. Diese Pflanzen können dann wachsen gelassen werden und entweder mit demselben transformierten Stamm oder anderen Stämmen bestäubt werden und die resultierende Hybride, die das gewünschte phenotypische Merkmal hat, identifiziert werden. Es können zwei oder mehr Generationen wachsen gelassen werden, um sicherzustellen, dass das gewünschte phenotypische Merkmal in stabiler Weise aufrechterhalten wird und vererbt wird, und dann der Samen geerntet, um sicherzustellen, dass der gewünschte Phänotyp oder eine andere Eigenschaft erhalten worden ist.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung angeführt.
BEISPIELE
Beispiel 1: Transformation und Regeneration von Maiscallus.
Unreife Maisembryos aus Gewächshausdonorpflanzen werden mit einem Plasmid, das eine (P)APS-Reduktasenucleinsäure funktionell mit dem Ubiquitinpromotor plus ein Plasmid, dass das selektierbare Markergen PAT, welches Resistenz gegenüber dem Herbizid Bialaphos verleiht, enthält, beschossen. Eine Transformation wird wie folgt durchgeführt:
Die Ähren werden in 30% Clorox-Bleiche plus 0,5% Mikro-Detergenz für 20 Minuten oberflächensterilisiert und dann zweimal mit sterilem Wasser gespült. Die unreifen Embryos werden ausgeschnitten und mit der Embryoachse nach unten (Scutellum-Seite nach oben), 25 Embryos pro Platte, auf 560 Y-Medium für vier Stunden gelegt und dann in der 2,5-cm-Zielzone in Vorbereitung zum Beschuss angeordnet.
Ein Plasmidvektor, der eine (P)APS-Reduktasenucleinsäure funktionell mit dem Ubiquitinpromotor verknüpft umfasst, wird konstruiert. Diese Plasmid-DNA plus Plasmid-DNA, die einen selektierbaren PAT-Marker enthält, wird auf 1,1 μm (durchschnittlicher Durchmesser) Wolframpellets präzipitiert, wobei ein CaCl₂-Präzipitationsverfahren wie folgt angewendet wird: 100 μl präparierte Wolframpartikel in Wasser, 10 μl (1 μg) DNA in TrisEDTA-Puffer (insgesamt 1 μg), 100 μl 2,5 M CaCl₂ und 100 μl 0,1 M Spermidin.
Die Reagenzien werden jeweils sequentiell zu der Wolframpartikelsuspension gegeben, wobei diese mit einem Mehrröhrchen-Vortexer aufrechtgehalten wird. Das Endgemisch wir kurz be schallt und für zehn Minuten unter konstanter Vortex-Behandlung inkubieren gelassen. Nach dem Präzipitationszeitraum werden die Röhrchen kurz zentrifugiert, Flüssigkeit wird entfernt, es wird mit 500 ml 100% Ethanol gewaschen und für 30 Sekunden zentrifugiert. Die Flüssigkeit wird erneut entfernt und es werden 105 μl 100 Ethanol zu dem fertigen Wolframpartikelpellet gegeben.
Zur Partikelkanonenbehandlung werden die Wolfram/DNA-Partikel kurz beschallt und es werden 100 μl auf den Mittelpunkt jedes Makroträgers aufgetüpfelt und etwa 2 Minuten vor Beschuss trocknengelassen.
Die Probenplatten werden mit Einstellung Nr. 4 mit der Partikelkanone Nr. HE34-1 oder Nr. HE34-2 beschossen. Alle Proben erhalten einen einzelnen Schuss mit 650 PSI, wobei insgesamt 10 Aliquots aus jedem Röhrchen hergestellter Partikel/DNA genommen werden .
Nach Beschuss werden die Embryos auf 560 Y-Medium, einem Medium auf N6-Basis, für zwei Tage gehalten, dann auf 560 R-Selektionsmedium, einem Medium auf N6-Basis, das 3 mg/l Bialaphos enthält, transferiert und alle zwei Wochen subkultiviert. Nach etwa 10 Wochen Selektion werden selektionsresistente Callusklone auf PCR und Aktivität der Nucleinsäure von Interesse analysiert. Positive Linien werden auf 288 J-Medium, ein Medium auf N6-Basis mit geringerer Saccharose- und Hormonkonzentration, transferiert, um die Pflanzenregeneration zu initiieren. Nach somatischer Embryoreifung (2–4 wochen) werden gut entwickelte somatische Embryos auf Medium zur Keimung übertragen und in den beleuchteten Kulturraum gebracht. Etwa 7 bis 10 Tage später werden sich entwickelnde Pflänzchen auf Medium in Röhrchen für 7 bis 10 Tage umgepflanzt, bis die Pflänzchen gut entwickelt sind. Die Pflanzen werden dann in Einsätze in Anzuchtplatten (entspricht 2,5'' – Topf), die Topferde enthalten, umgepflanzt und für eine Woche in einer Wachstumskammer wachsen gelassen, anschließend für weitere 1 bis 2 Wochen im Gewächshaus wachsen gelassen und dann in klassische 600-Töpfe (1,6-Gallone) transferiert und zur Reife wachsen gelassen. Die Pflanzen werden bezüglich Expression der (P)APS-Nucleinsäure und Methionin überwacht.
Obgleich die vorstehende Erfindung in gewissem Detail durch Erläuterung beschrieben wurde und ein Beispiel zum besseren Verständnis angeführt wurde, wird es klar sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

Verfahren zum Modulieren der Biosynthese von mindestens einer organischen Schwefelverbindung in Pflanzen, wobei das Verfahren umfasst, die Pflanze stabil mit einem DNA-Konstrukt zu transformieren, das eine Nucleinsäure umfasst, die ein Hefe- oder bakterielles (P)APS-Reductase-Enzym codiert, das in der Lage ist, Schwefel in der Form von APS oder PAPS zu Sulfit zu reduzieren, wobei die Nucleinsäure funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der Expression in einer Pflanze steuert, und wobei der Level der mindestens einen organischen Schwefelverbindung verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Konstrukt ferner eine Sequenz umfasst, die ein Chloroplastentransitpeptid codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Transformieren der Pflanze mit wenigstens einem zweiten DNA-Konstrukt, das wenigstens eine zweite Nucleinsäure umfasst, die ein Enzym, funktionell in der Biosynthese einer ausgewählten organischen Schwefelverbindung, codiert, wobei die wenigstens zweite Nucleinsäure funktionell mit einem Promoter verknüpft ist, der Expression in einer Pflanze steuert.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das zweite Konstrukt eine Sequenz umfasst, die ein Chloroplastentransitpeptid codiert.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die zweite Nucleinsäure das Enzym cgs oder das Enzym apk codiert.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die zweite Nucleinsäure das Enzym cgs codiert.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Pflanze ein drittes DNA-Konstrukt umfasst, das eine dritte Nucleinsäure umfasst, die ein Enzym, funktionell in der Biosynthese einer ausgewählten organischen Schwefelverbindung, codiert, wobei die dritte Nucleinsäure das Enzym apk codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die organische Schwefelverbindung eine Aminosäure oder Glutathion ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Aminosäure Cystein oder Methionin ist.
Pflanze, die erhöhte Level von mindestens einer organischen Schwefelverbindung aufweist, wobei die Pflanze stabil in ihr Genom transformiert ein DNA-Konstrukt aufweist, das eine Nucleinsäure umfasst, die ein Hefe- oder bakterielles (P)APS-Reductase-Enzym codiert, das in der Lage ist, Schwefel in der Form von APS oder PAPS zu Sulfit zu reduzieren, wobei die Nucleinsäure funktionell mit einem Promoter verknüpft ist, der Expression in einer Pflanze steuert.
Pflanze nach Anspruch 10, wobei das Konstrukt ferner eine Sequenz umfasst, die ein Chloroplastentransitpeptid codiert.
Pflanze nach Anspruch 10, die ferner wenigstens ein zweites DNA-Konstrukt umfasst, das wenigstens eine zweite Nucleinsäure umfasst, die ein Enzym, funktionell in der Biosynthese einer ausgewählten organischen Schwefelverbindung, codiert, wobei die wenigstens zweite Nucleinsäure funktionell mit einem Promoter verknüpft ist, der Expression in einer Pflanze steuert.
Pflanze nach Anspruch 12, wobei das zweite Konstrukt eine Sequenz umfasst, die ein Chloroplastentransitpeptid codiert.
Pflanze nach Anspruch 13, wobei die zweite Nucleinsäure das Enzym cgs oder das Enzym apk codiert.
Pflanze nach Anspruch 14, wobei die zweite Nucleinsäure das Enzym cgs codiert.
Pflanze nach Anspruch 15, wobei die Pflanze ein drittes DNA-Konstrukt umfasst, das eine dritte Nucleinsäure umfasst, die ein Enzym, funktionell in der Biosynthese einer ausgewählten organischen Schwefelverbindung, codiert, wobei die dritte Nucleinsäure das Enzym apk codiert.
Pflanze nach Anspruch 10, wobei die organische Schwefelverbindung eine Aminosäure oder Glutathion ist.
Pflanze nach Anspruch 17, wobei die Aminosäure Cystein oder Methionin ist.
Pflanze nach Anspruch 10, wobei die Pflanze eine Monocotyle oder eine Dicotyle ist.
Pflanze nach Anspruch 19, wobei die Monocotyle ausgewählt ist aus Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Reis, Hirse und Sorghum, oder wobei die Dicotyle ausgewählt ist aus Sojabohnen, Sonnenblumen, Brassica und Luzerne bzw. Alfalfa.
Samen der Pflanze nach Anspruch 10, der stabil in sein Genom transformiert ein DNA-Konstrukt umfasst, das eine Nucleinsäure umfasst, die ein Hefe- oder bakterielles (P)APS-Reductase-Enzym codiert, das in der Lage ist, Schwefel in der Form von APS oder PAPS zu Sulfit zu reduzieren, wobei die Nucleinsäure funktionell mit einem Promoter verknüpft ist, der Expression in einer Pflanze steuert.
Samen nach Anspruch 21, wobei das Konstrukt ferner eine Sequenz umfasst, die ein Chloroplastentransitpeptid codiert.
Samen nach Anspruch 21, der ferner wenigstens ein zweites DNA-Konstrukt umfasst, das wenigstens eine zweite Nucleinsäure umfasst, die ein Enzym, funktionell in der Biosynthese einer ausgewählten organischen Schwefelverbindung, codiert, wobei die wenigstens zweite Nucleinsäure funktionell mit einem Promoter verknüpft ist, der Expression in einer Pflanze steuert.
Samen nach Anspruch 23, wobei das zweite Konstrukt eine Sequenz umfasst, die ein Chloroplastentransitpeptid codiert.
Samen nach Anspruch 24, wobei die zweite Nucleinsäure das Enzym cgs oder das Enzym apk codiert.
Samen nach Anspruch 25, wobei die zweite Nucleinsäure das Enzym cgs codiert.
Samen nach Anspruch 26, wobei der Samen ein drittes DNA-Konstrukt umfasst, das eine dritte Nucleinsäure umfasst, die ein Enzym, funktionell in der Biosynthese einer ausgewählten organischen Schwefelbindung, codiert, wobei die dritte Nucleinsäure das Enzym apk codiert.
Samen nach Anspruch 21, wobei die organische Schwefelverbindung eine Aminosäure oder Glutathion ist.
Samen nach Anspruch 28, wobei die Aminosäure Cystein oder Methionin ist.
Pflanzenzelle, die erhöhte Level von mindestens einer organischen Schwefelverbindung aufweist, wobei die Pflanzenzelle stabil in ihr Genom transformiert ein DNA-Konstrukt auf weist, das eine Nucleinsäure umfasst, die ein Hefe- oder bakterielles (P)APS-Reductase-Enzym codiert, das in der Lage ist, Schwefel in der Form von APS oder PAPS zu Sulfit zu reduzieren, wobei die Nucleinsäure funktionell mit einem Promoter verknüpft ist, der Expression in einer Pflanze steuert, und wobei der Level der mindestens einen organischen Schwefelverbindung verändert ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 30, wobei das Konstrukt ferner eine Sequenz umfasst, die ein Chloroplastentransitpeptid codiert.
Pflanzenzelle nach Anspruch 31, die ferner wenigstens ein zweites DNA-Konstrukt stabil in das Genom der Zelle transformiert umfasst, wobei das wenigstens zweite Konstrukt wenigstens eine zweite Nucleinsäure umfasst, die ein Enzym, funktionell in der Biosynthese einer ausgewählten organischen Schwefelverbindung, codiert, wobei die wenigstens zweite Nucleinsäure funktionell mit einem Promoter verknüpft ist, der Expression in einer Pflanze steuert.
Pflanzenzelle nach Anspruch 32, wobei das zweite Konstrukt eine Sequenz umfasst, die ein Chloroplastentransitpeptid codiert.
Pflanzenzelle nach Anspruch 33, wobei die zweite Nucleinsäure das Enzym cgs oder das Enzym apk codiert.
Pflanzenzelle nach Anspruch 34, wobei die zweite Nucleinsäure das Enzym cgs codiert.
Pflanzenzelle nach Anspruch 35, wobei die Pflanze ein drittes DNA-Konstrukt umfasst, das eine dritte Nucleinsäure umfasst, die ein Enzym, funktionell in der Biosynthese einer ausgewählten organischen Schwefelverbindung, codiert, wobei die dritte Nucleinsäure das Enzym apk codiert.
Pflanzenzelle nach Anspruch 32, wobei die organische Schwefelverbindung eine Aminosäure oder Glutathion ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 37, wobei die Aminosäure Cystein oder Methionin ist.
Verfahren zum Verringern von oxidativem Stress in Pflanzen, das umfasst, die Pflanze stabil mit einem DNA-Konstrukt zu transformieren, das eine Nucleinsäure umfasst, die ein Hefe- oder bakterielles (P)APS-Reductase-Enzym codiert, das in der Lage ist, Schwefel in der Form von APS oder PAPS zu Sulfit zu reduzieren, wobei die Nucleinsäure funktionell mit einem Promoter verknüpft ist, der Expression in einer Pflanze steuert.