CN103215305B - 培育高含硫氨基酸的转基因苜蓿的方法及其专用材料 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了培育高含硫氨基酸的转基因苜蓿的方法及其专用材料。本发明的培育氨基酸含量改变的转基因苜蓿的方法，包括向受体苜蓿中导入天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因，得到氨基酸含量改变的转基因苜蓿；所述天冬氨酸激酶是氨基酸序列如SEQ ID No.2第65-512位所示的蛋白质；所述腺苷硫酸还原酶是氨基酸序列如SEQ ID No.4第65-330位所示的蛋白质。本发明培育的氨基酸含量改变的转基因苜蓿的甲硫氨酸含量显著高于受体苜蓿——未转化保定苜蓿（野生型），是野生型的1.5倍；转pCAMBIAK-APR株系的半胱氨酸含量显著高于野生型，是野生型的1.2倍，转pCAMBIAK-APR株系的天冬氨酸含量显著高于野生型，是野生型的1.4倍；转pCAMBIAK-APR株系的赖氨酸含量显著高于野生型，是野生型的1.5倍。
Description
技术领域
本发明涉及培育高含硫氨基酸的转基因苜蓿的方法及其专用材料。
背景技术
苜蓿是苜蓿属（Medicago）植物的通称，是一种多年生开花植物，其中最著名的是作为牧草的紫花苜蓿（Medicago sativa L.）。紫花苜蓿是苜蓿属中很重要的多年生野生豆科牧草，主要分布在中国、蒙古、俄罗斯、巴基斯坦、印度、土耳其等国家。我国的紫花苜蓿品种资源丰富，主要分布在我国的东北、华北、西北地区。与其它种比较，紫花苜蓿具有抗逆性强、耐寒、耐旱、耐瘠薄和寿命长等突出特点，适宜在干旱、寒冷的地区种植，是我国北方建设高产优质人工草地的首选。紫花苜蓿为优质豆科牧草，开花期含粗蛋白22.75％、粗脂肪1.78％、粗纤维22.84％。虽然紫花苜蓿的蛋白含量较高，但是其蛋白质中含硫氨基酸的含量较低。实验证明含硫氨基酸含量的增加可提高羊毛产量22%以上，增产的幅度在22%～104%，同时还可增加牲畜的重量。创制高含硫氨基酸的苜蓿品种将促进畜牧业的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种培育氨基酸含量改变的转基因苜蓿的方法及其专用材料。
本发明所提供的培育氨基酸含量改变的转基因苜蓿的方法，包括向受体苜蓿中导入天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因，得到氨基酸含量改变的转基因苜蓿；
所述转基因苜蓿具有下述1）-4）中的全部特性或至少一种特性：
1）所述转基因苜蓿与所述受体苜蓿相比，甲硫氨酸含量提高；
2）所述转基因苜蓿与所述受体苜蓿相比，半胱氨酸含量提高；
3）所述转基因苜蓿与所述受体苜蓿相比，天冬氨酸含量提高；
4）所述转基因苜蓿与所述受体苜蓿相比，赖氨酸含量提高；
所述天冬氨酸激酶是如下a）或b）的蛋白质：
a）氨基酸序列如SEQ ID No.2第65-512位所示的蛋白质；
b）将SEQ ID No.2第65-512位经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有天冬氨酸激酶活性的由a）衍生的蛋白质；
所述腺苷硫酸还原酶是如下c）或d）的蛋白质：
c）氨基酸序列如SEQ ID No.4第65-330位所示的蛋白质；
d）将SEQ ID No.4第65-330位经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有腺苷硫酸还原酶活性的由c）衍生的蛋白质。
其中，SEQ ID No.2由512个氨基酸残基组成，为叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白TP-AK的氨基酸序列，SEQ ID No.2的第1-62位为叶绿体引导肽TP的氨基酸序列，SEQ ID No.2的第65-512位为天冬氨酸激酶AK的氨基酸序列。SEQ ID No.4由330个氨基酸残基组成，为叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白TP-APR的氨基酸序列，SEQ ID No.4的第1-62位为叶绿体引导肽TP的氨基酸序列，SEQ ID No.4的第65-330位为腺苷硫酸还原酶APR的氨基酸序列。
上述方法中，所述氨基酸含量是指叶片中的氨基酸含量。所述转基因苜蓿与所述受体苜蓿相比，总氨基酸含量没有差异。
上述方法中，所述天冬氨酸激酶编码基因可为如下1）或2）或3）或4）所示的基因，和/或所述腺苷硫酸还原酶为如下5）或6）或7）或8）所示的基因：
1）编码所述天冬氨酸激酶的DNA分子；
2）其编码序列是SEQ ID No.1的第1196-2542位核苷酸的DNA分子；
3）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述天冬氨酸激酶的DNA分子；
4）与1）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述天冬氨酸激酶的DNA分子；
5）编码所述腺苷硫酸还原酶的DNA分子；
6）其编码序列是SEQ ID No.3的第1196-1996位核苷酸的DNA分子；
7）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述腺苷硫酸还原酶的DNA分子；
8）与1）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述腺苷硫酸还原酶的DNA分子。
其中，SEQ ID No.1由3132个核苷酸组成，为天冬氨酸激酶编码基因表达盒的核苷酸序列，第1-1003位为35S启动子序列，第1004-1189位为叶绿体引导肽基因序列，第1196-2542位为天冬氨酸激酶AK基因序列，第1004-2542位为叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合蛋白TP-AK的基因序列，第2543-3132位为ocs终止子序列。SEQ ID No.3由2586个核苷酸组成，为腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒的核苷酸序列，第1-1003位为35S启动子序列，第1004-1189位为叶绿体引导肽基因序列，第1196-1996位为腺苷硫酸还原酶APR基因序列，第1004-1996位为叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白TP-APR的基因序列，第1997-2586位为ocs终止子序列。
上述方法中，所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因通过天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因表达载体导入所述受体苜蓿；所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因表达载体含有天冬氨酸激酶编码基因表达盒和腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒；所述天冬氨酸激酶编码基因表达盒包括启动子1和由所述启动子1启动的叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因和终止所述叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因转录的终止子1；所述叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因是所述天冬氨酸激酶编码基因与所述叶绿体引导肽基因相连接形成的融合基因，所述叶绿体引导肽基因位于所述天冬氨酸激酶编码基因的上游；
所述腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒包括启动子2和由所述启动子2启动的叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合基因和终止所述叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白基因转录的终止子2；所述叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白基因是所述腺苷硫酸还原酶编码基因与所述叶绿体引导肽基因相连接形成的融合基因，所述叶绿体引导肽基因位于所述腺苷硫酸还原酶编码基因的上游。
上述方法中，所述叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白可为TP-AK，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白可为TP-APR，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
上述方法中，所述叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合基因序列如SEQ ID No.1的第1004-2542位所示；所述叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合基因序列如SEQ ID No.3的第1004-1996位所示。
上述方法中，所述叶绿体引导肽基因的核苷酸序列可如SEQ ID No.1的第1004-1189位所示；所述启动子1和启动子2均是35s(核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1-1003位)，所述终止子1和所述终止子2均是ocs(核苷酸序列如SEQ ID No.1的第2543-3132位)。
上述方法中，所述天冬氨酸激酶编码基因表达盒的核苷酸序列具体如SEQ ID No.1所示；腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒的核苷酸序列具体如SEQ ID No.3所示。
上述方法中，所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因表达载体具体可为在pCAMBIA2300的多克隆位点插入所述天冬氨酸激酶编码基因表达盒和腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒得到的重组表达载体pCAMBIAK-APR。
上述方法中，所述受体苜蓿具体可为紫花苜蓿，如保定苜蓿。
上述方法中，所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998，Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition)。
所述方法还包括从导入所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因的植株中筛选表达所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因的植株，得到所述氨基酸含量改变的转基因苜蓿的步骤。
所述转基因苜蓿理解为不仅包含将所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因转化受体苜蓿得到的第一代转基因苜蓿，也包括其子代。对于转基因苜蓿，可以在该物种中繁殖所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因，也可用常规育种技术将所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因苜蓿包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
下述任一种生物材料也属于本发明的保护范围：
A、在pDES200的loxp位点插入SEQ ID No.1所示的天冬氨酸激酶编码基因表达盒和SEQ ID No.3所示的腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒得到的重组表达载体；
B、含有SEQ ID No.1所示的天冬氨酸激酶编码基因表达盒和SEQ ID No.3所示的腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒的表达载体；
C、SEQ ID No.1所示的天冬氨酸激酶编码基因表达盒和SEQ ID No.3所示的腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒；
D、SEQ ID No.2所示的融合蛋白的编码基因和SEQ ID No.4所示的融合蛋白的编码基因；
E、SEQ ID No.1的第1004-2542位所示的叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合基因；SEQ ID No.3的第1004-1996位所示的叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合基因。
本发明还要求保护SEQ ID No.2所示的叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白和SEQ ID No.4所示的叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白。
实验证明，本发明培育的氨基酸含量改变的转基因苜蓿的甲硫氨酸含量显著高于受体苜蓿——未转化保定苜蓿（野生型），是野生型的1.5倍；转pCAMBIAK-APR株系的半胱氨酸含量显著高于野生型，是野生型的1.2倍，转pCAMBIAK-APR株系的天冬氨酸含量显著高于野生型，是野生型的1.4倍；转pCAMBIAK-APR株系的赖氨酸含量显著高于野生型，是野生型的1.5倍。
附图说明
图1为共表达载体pCAMBIAK-APR的物理图谱。
图2为共表达载体pCAMBIAK-APR酶切鉴定图。
图中，1是AscI内切酶，2是I-sceI内切酶，M为1kb DNA ladder（Fermentas），由下到上分别为2500bp,3000bp,3500bp,4000bp,5000bp,6000bp,8000bp,10000bp。
图3为转基因植株的PCR检测图，WT为野生型植株（阴性对照），1-6为转pCAMBIAK-APR苜蓿的PCR产物，7为未加样品PCR产物（空白对照），8为质粒pCAMBIAK-APR的PCR产物（阳性对照），M为GeneRuler TM1kb DNA ladder(MBIFermentas,Maryland,USA)。
图4为转基因植株的RT-PCR检测图，WT为野生型植株（阴性对照），1-8为转pCAMBIAK-APR苜蓿的RT-PCR产物,Actin是内参基因。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的生物材料如下：
大肠杆菌K12（赵倩等.大肠杆菌天冬氨酸激酶lysC基因的克隆及定点突变.农业生物技术学报.1999，7（4）），公众可从商业途径获得，也可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。
pOSB108、pOSB208、pDES200、大肠杆菌SW106（Lei Ma,Jiangli Dong,YongshengJin,Mingliang Chen,Xiaoye Shen,Tao Wang.RMDAP:A Versatile,Ready-To-UseToolbox for Multigene Genetic Transformation.PLoS ONE|www.plosone.org.May2011.Volume6.Issue5.e19883），公众可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。
铜绿假单孢杆菌（George Tsakraklides1et al.Sulfate reduction is increasedin transgenic Arabidopsis thaliana expressing50-adenylylsulfate reductasefrom Pseudomonas aeruginosa.The Plant Journal(2002)32,879–889），公众可从商业途径获得，也可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。
根癌农杆菌EHA105记载在下述文献中：抗生素抑制农杆菌的效果及对条斑紫菜生长发育的影响，王萍等，水产科学，2009，28(7)，公众可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。
保定苜蓿（张万军王涛.紫花苜蓿愈伤成苗高频再生体系的建立及其影响因子的研究.中国农业科学2002，35（12）：1579-1583），公众可从商业途径获得，也可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。
实施例1、利用天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因培育氨基酸含量改变的转基因苜蓿
一、构建天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因表达载体pCAMBIAK-APR
1、构建含有天冬氨酸激酶编码基因表达盒的中间载体pOSB108-AK
用正向引物为5’-CTCGAGTCTGAAATTGTTGTCTCCAA-3’和反向引物5’-TCTAGATTACTCAAACAAATTACTAT-3’，正向引物自5’端第1到6位是XhoI酶切位点，反向引物从5’端起第1-6位是XbaI酶切位点，从大肠杆菌K12中扩增出天冬氨酸激酶编码基因（AK基因），回收PCR扩增产物。对PCR扩增产物进行测序。测序结果为，该PCR产物中的AK基因的编码序列是SEQ ID No.1的第1196-2542位，编码SEQ ID No.2的第65-512位所示的天冬氨酸激酶AK。
将AK基因的PCR产物用XhoI和XbaI双酶切后插入载体pOSB108的XhoI和XbaI位点，得到载体pOSB108-AK。pOSB108-AK中含有天冬氨酸激酶编码基因表达盒，该天冬氨酸激酶编码基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No.1。SEQ ID No.1由3132个核苷酸组成，为天冬氨酸激酶编码基因表达盒的核苷酸序列，第1-1003位为35S启动子序列，第1004-1189位为叶绿体引导肽基因序列，第1196-2542位为天冬氨酸激酶AK基因序列，第1004-2542位为叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合蛋白TP-AK的基因序列，第2543-3132位为ocs终止子序列。SEQ ID No.1的第1004-2542位所示的叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合蛋白TP-AK的基因编码SEQ ID No.2所示的叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白TP-AK。SEQ ID No.2的第1-62位为叶绿体引导肽TP的氨基酸序列，SEQ ID No.2的第65-512位为天冬氨酸激酶AK的氨基酸序列。
2、构建含有腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒的中间载体pOSB208-APR
用正向引物为5’-CCGCTCGAGCTGCCCTTTGCTACCATTCC-3’和反向引物5’-GCTCTAGATCAGGCCTTGCTGATCAGGT-3’，正向引物自5’端第4到9位是XhoI酶切位点，反向引物从5’端起第3到8位是XbaI酶切位点，从铜绿假单孢杆菌中扩增出腺苷硫酸还原酶编码基因（APR基因），该PCR产物中的APR基因的编码序列是SEQ IDNo.3的第1196-1996位，编码SEQ ID No.4的第65-330位所示的腺苷硫酸还原酶APR。
将APR基因的PCR产物用XhoI和XbaI双酶切后插入载体pOSB208的XhoI和XbaI位点，得到载体pOSB208-APR。pOSB208-APR中含有腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒，该腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No.3。SEQ ID No.3由2586个核苷酸组成，为腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒的核苷酸序列，第1-1003位为35S启动子序列，第1004-1189位为叶绿体引导肽基因序列，第1196-1996位为腺苷硫酸还原酶APR基因序列，第1004-1996位为叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白TP-APR的基因序列，第1997-2586位为ocs终止子序列。SEQ ID No.3的第1004-1996位所示的叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白TP-APR的基因编码SEQ ID No.4所示的叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白TP-APR。SEQ ID No.4的第1-62位为叶绿体引导肽TP的氨基酸序列，SEQ ID No.4的第65-330位为腺苷硫酸还原酶APR的氨基酸序列。
3、pCAMBIAK-APR的构建
通过电转化将载体pOSB108-AK和目的载体pDES200共转化到带有Cre蛋白的大肠杆菌SW106中，通过Cre/loxP同源重组整合，经过氨苄青霉素和卡那霉素的双重筛选，得到抗性菌种，提质粒，用I-sceI内切酶切掉T载体骨架，再用T4DNA连接酶进行自连后得到重组载体pDES200-AK，然后pDES200-AK再和质粒pOSB208-APR进行第二轮的Cre/loxP同源重组，共转化大肠杆菌SW106，经过氨苄青霉素和卡那霉素的双重筛选，用AscI内切酶切掉T载体骨架，自连得到共表达载体pDESAK-APR。分别用EcoRI和HindⅢ双酶切pDESAK-APR及pCAMBIA2300（pCAMBIA-2300，其全序列见GenBank:AF234315.1，update date是2010年11月16日）），回收双酶切pDESAK-APR得到的小片段（含有SEQ ID No.3所示的腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒和SEQ ID No.1所示的天冬氨酸激酶编码基因表达盒）和双酶切pCAMBIA2300得到的大片段，然后再用T4DNA连接酶连接，获得含有SEQ ID No.3所示的腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒和SEQ ID No.1所示的天冬氨酸激酶编码基因表达盒的重组植物表达载体pCAMBIAK-APR（图1）。
pCAMBIAK-APR的AscI酶切鉴定结果和pCAMBIAK-APR的I-sceI酶切鉴定结果如图2所示。
二、pCAMBIAK-APR转化苜蓿培育氨基酸含量改变的转基因苜蓿
1.农杆菌感受态细胞的制备
挑取根癌农杆菌EHA105单菌落接种于5ml YEP（含75mg/L利福平）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜；将菌液按1:100转移至200mlYEP（含75mg/L利福平）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD600=0.4(约4-5h)；转入250ml的无菌离心瓶，4℃，4000rpm离心10min，弃上清；加入10ml预冷的0.15M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；4℃，5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预冷的含有10%甘油的0.15M的CaCl2溶液，轻轻悬浮；每管100μL分装于1.5mL无菌的EP管中，-80℃保存。
2.表达载体pCAMBIAK-APR转化农杆菌EHA105：
取1μg的表达载体质粒pCAMBIAK-APR的DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀；液氮中速冻1min，37℃水浴5min，加入1ml YEP液体培养基，28℃150rpm振荡培养4h；10000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1ml YEP液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含50μg/ml Kan（卡那霉素）和125μg/ml利福平的YEP固体平板上，28℃培养大约48h；挑取平板上长出的单菌落，接种于YEP液体培养液（含50μg/ml Kan和125μg/ml利福平）中，28℃220rpm振荡过夜培养。长出的单菌落用PCR鉴定，鉴定用的引物是上述步骤一的AK和APR基因的扩增引物，结果显示载体pCAMBIAK-APR已经成功转入农杆菌中。
3.农杆菌转化苜蓿：
1）植物受体材料的准备：选取紫花苜蓿品种保定苜蓿的饱满种子在75%的酒精中浸泡2min，然后在0.1%的氯化汞溶液中消毒10min，再用无菌水冲洗3－5次，接种在1/2MS培养基上发芽。5天后取长出的子叶和下胚轴，子叶以横向切成2－3mm宽的小条，下胚轴切成2－4mm长的小段，用于转化试验。
2）农杆菌菌液的制备：将含有植物表达载体pCAMBIAK-APR的农杆菌EHA105接种于YEB培养液（加入卡那霉素）中，加入乙酰丁香酮（AS）至终浓度50-200μm。28℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，4000rpm离心5分钟，去上清，沉淀用SH液体培养基将菌液稀释5倍，加入乙酰丁香酮（AS）至终浓度50-200μm。
3）切好的苜蓿子叶和下胚轴在稀释的农杆菌菌液中浸泡10－30分钟。
4）用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的SH基本培养基（加入AS至终浓度50-200μm），置25℃暗培养。
5）三天后，将材料转到含有相应抗生素的SH愈伤组织保持培养基（SH培养基＋0.025mg/L KT＋2mg/L2,4-D＋20-25mg/L卡那霉素＋500mg/L羧苄青霉素）中培养两周。
6）两周后，将生长良好的愈伤组织夹成小块，转到新的含有抗生素的SH愈伤保持培养基（SH培养基＋0.05mg/L KT＋2mg/L2,4-D＋20-25mg/L卡那霉素＋500mg/L羧苄青霉素）中继续培养两周。
7）两周后，将生长良好的愈伤组织夹成小块，转到新的含有抗生素的SH愈伤保持培养基（SH培养基＋0.1mg/L KT＋2mg/L2,4-D＋20mg/L卡那霉素＋200mg/L羧苄青霉素）中继续培养两周。
8）两周后，将生长良好的愈伤组织夹成小块，转到新的含有抗生素的SH分化培养（SH培养基＋0.4mg/L KT＋20mg/L卡那霉素＋200mg/L羧苄青霉素）中继续培养两周，继代一次。
9）待抗性芽生长至2－3cm高时，切下小芽转入生根培养基（1/2MS基本培养基）中诱导生根；
10）待根长至足够10－20cm长（约3周），且具有一定数量即可去掉封口膜。
4、转基因苜蓿的筛选和检测
经过抗生素筛选的再生苗进行分子生物学检测：
a、DNA水平检测
以T0代转pCAMBIAK-APR各卡那霉素抗性株系的基因组DNA为模板，质粒pCAMBIAK-APR为阳性对照，未转化的保定苜蓿（野生型，WT）为阴性对照，以正向引物5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’（对应于35S启动子）和反向引物5’-TCTAGATTACTCAAACAAATTACTAT-3’，PCR扩增35S启动子-AK基因片段，以正向引物5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’（对应于35S启动子）和反向引物5’-GCTCTAGATCAGGCCTTGCTGATCAGGT-3’PCR扩增35S启动子-APR基因片段。这两个PCR的反应体系均为：
35S启动子-AK基因片段的PCR反应程序为：第一轮：95℃变性5min，第二轮：95℃变性40sec，51℃50sec，72℃延伸1min30sec，30个循环，第三轮：72℃延伸10min。
35S启动子-APR基因片段的PCR反应程序为：第一轮：95℃变性5min，第二轮：95℃变性40sec，61℃50sec，72℃延伸1min，30个循环，第三轮：72℃延伸10min。
1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。结果如图3所示，表明pCAMBIAK-APR和T0代转pCAMBIAK-APR各潮霉素抗性株系均得到了1500bp的35S启动子-AK基因片段和1000bp35S启动子-APR基因片段，未转化的保定苜蓿（野生型，WT）和未加样品PCR产物（空白对照）均没有得到PCR产物。
b.RNA水平检测
RT-PCR鉴定：用Trizol法提取步骤a中DNA水平检测阳性植株的总RNA，以完整性好、无污染的RNA为模板，用M-MLV酶（Promega）反转录RNA成cDNA，以反转录产物为模板进行RT-PCR扩增，反应体系与步骤a相同，以持家基因Actin作为内参校正模板量，AK基因的扩增引物是：正向引物5’-TGGCGGTACCAGCGTAGCTGA-3’和反向引物5’-GTTCCGCCAGCGCGGCTATA-3’，APR基因的扩增引物是：正向引物5’-AGCCGCCTTCGAGCACTTCG-3’和反向引物5’-CGGCGTGGAAAAGGCACCGT-3’，Actin基因的扩增引物是：5’-CCCACTGGATGTCTGTAGGTT-3’(正向引物)，5’-AGAATTAAGTAGCAGCGCAAA-3’(反向引物)。
PCR反应程序为：第一轮：95℃变性5min，第二轮：95℃变性40sec，各基因特定退火（退火温度AK:62℃,APR58℃）30sec，72℃延伸30sec，30个循环，第三轮：72℃延伸10min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。结果如图4所示，表明pCAMBIAK-APR和8株的T0代转pCAMBIAK-APR各DNA水平检测阳性植株均得到了500bp左右的AK基因片段和400bp左右的APR基因片段，为RNA水平检测阳性植株，将其编号分别记为L-1、L-2、L-3、L-4、L-5、L-6、L-7、L-8；未转化的保定苜蓿（野生型，WT）均没有得到PCR产物。
收获步骤4的编号为L-2、L-3、L-6和L-8的T0代转pCAMBIAK-APR RNA水平检测阳性植株所结的种子（T1代种子）。
5、转基因苜蓿氨基酸含量的检测
取L-2、L-3、L-6和L-8的T0代转pCAMBIAK-APR的T1代种子和未转化保定苜蓿（野生型）的种子在相同的条件下培育至早花初期，取相同部位的叶片1.5g收集后液氮速冻，经过干燥，研磨成细粉，按照GB/T18246-2000饲料中氨基酸的测定中的酸水解法，酸提取法和碱水解法将蛋白质分解成氨基酸，用日立L-8900氨基酸自动分析仪来测量氨基酸的含量。以三个平行样的测定结果的平均值±标准差表示氨基酸含量。每个处理测定3个植株。试验所有数据采用SPSS12.0（SPSS Inc.，USA）统计软件的独立样本t检验处理统计。
结果如表1所示，表明转pCAMBIAK-APR株系的甲硫氨酸含量显著高于受体苜蓿——未转化保定苜蓿（野生型），是野生型的1.5倍；转pCAMBIAK-APR株系的半胱氨酸含量显著高于野生型，是野生型的1.2倍，转pCAMBIAK-APR株系的天冬氨酸含量显著高于野生型，是野生型的1.4倍；转pCAMBIAK-APR株系的赖氨酸含量显著高于野生型，是野生型的1.5倍。表1中的氨基酸含量为氨基酸占植株干重的质量百分含量，总氨基酸含量为表1中的17种氨基酸含量之和。
表1、氨基酸含量（%）测定结果
注：*表示在0.05水平有显著差异。
Claims (9)
1.培育氨基酸含量改变的转基因苜蓿的方法，包括向受体苜蓿中导入天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因，得到氨基酸含量改变的转基因苜蓿；
所述转基因苜蓿具有下述1)-4)中的全部特性：
1)所述转基因苜蓿与所述受体苜蓿相比，甲硫氨酸含量提高；
2)所述转基因苜蓿与所述受体苜蓿相比，半胱氨酸含量提高；
3)所述转基因苜蓿与所述受体苜蓿相比，天冬氨酸含量提高；
4)所述转基因苜蓿与所述受体苜蓿相比，赖氨酸含量提高；
所述天冬氨酸激酶是氨基酸序列如SEQ ID No.2第65-512位所示的蛋白质；
所述腺苷硫酸还原酶是氨基酸序列如SEQ ID No.4第65-330位所示的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述天冬氨酸激酶编码基因为编码所述天冬氨酸激酶的DNA分子；和/或所述腺苷硫酸还原酶编码基因为编码所述腺苷硫酸还原酶的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述天冬氨酸激酶编码基因为编码序列是SEQ ID No.1的第1196-2542位核苷酸的DNA分子；和/或所述腺苷硫酸还原酶编码基因为编码序列是SEQ ID No.3的第1196-1996位核苷酸的DNA分子。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因通过天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因表达载体导入所述受体苜蓿；所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因表达载体含有天冬氨酸激酶编码基因表达盒和腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒；所述天冬氨酸激酶编码基因表达盒包括启动子1和由所述启动子1启动的叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因和终止所述叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因转录的终止子1；所述叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合蛋白基因是所述天冬氨酸激酶编码基因与所述叶绿体引导肽基因相连接形成的融合基因，所述叶绿体引导肽基因位于所述天冬氨酸激酶编码基因的上游；
所述腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒包括启动子2和由所述启动子2启动的叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合基因和终止所述叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白基因转录的终止子2；所述叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白基因是所述腺苷硫酸还原酶编码基因与所述叶绿体引导肽基因相连接形成的融合基因，所述叶绿体引导肽基因位于所述腺苷硫酸还原酶编码基因的上游。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述叶绿体引导肽天冬氨酸激酶融合基因序列如SEQ ID No.1的第1004-2542位所示；所述叶绿体引导肽腺苷硫酸还原酶融合基因序列如SEQ ID No.3的第1004-1996位所示；所述启动子1和启动子2均是35s，所述终止子1和所述终止子2均是ocs。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述天冬氨酸激酶编码基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述天冬氨酸激酶编码基因和腺苷硫酸还原酶编码基因表达载体是在pDES200的loxp位点插入所述天冬氨酸激酶编码基因表达盒和腺苷硫酸还原酶编码基因表达盒得到的重组表达载体。
9.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述受体苜蓿为紫花苜蓿。
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