CN1242050A - 超量产生至少两个天冬氨酸家族氨基酸的具有天然高含水量的转基因植物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双基因构建体,其包括一种编码具有天冬氨酸激酶(AK)活性的酶的核酸序列以及一种编码具有二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)活性的酶的核酸序列。该构建体能在植物或植物部分中差异表达两种基因,产生高于野生型氨基酸水平5倍的赖氨酸和苏氨酸。

Description

超量产生至少两个天冬氨酸家族氨基酸的 具有天然高含水量的转基因植物

发明概述

本发明提供了一种嵌合双基因构建体，其包括一种编码具有天冬氨酸激酶(AK)活性的酶的核酸序列及一种编码具有二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)活性的酶的核酸序列。该构建体对两种基因的不同表达导致植物或其部分中的赖氨酸和苏氨酸水平比每个氨基酸野生型水平提高五倍。该构建体使甲硫氨酸水平也提高。这一表达目前可以不产生与植物中赖氨酸的高累积或AK与DHPS基因组合表达相关的先前出现的问题。表达调节应该是表达以如此方式发生：即在不伤害植物即与野生型植物相比表型不发生负畸变的限度内尽可能产生赖氨酸和苏氨酸。导致赖氨酸和苏氨酸水平增加的该构建体也提供了甲硫氨酸水平的增加。

发明背景

人和单胃动物不能合成20种氨基酸中的9种，因而需从其饮食中获取这些必需氨基酸。人类和家蓄的饮食大部分基于植物。在这些为人类和动物营养所必需的氨基酸是赖氨酸和苏氨酸。这些必需氨基酸在农作物植物中通常仅以低浓度存在。因而合成氨基酸通常作为补加物加入基于谷类及基于其它蔬菜类的饮食中以提高食物的营养价值。

过去已进行了各种尝试，通过传统培植及突变体筛选以提高植物中游离苏氨酸和赖氨酸水平，但收效甚微。同样地尝试了通过分子遗传学修饰以在同一转基因植物中同时提高赖氨酸及苏氨酸含量。游离赖氨酸水平的增加证明是在消耗游离苏氨酸的累积下进行的(Shaul and Galili，1993；Falco etal.，1995)。目前还未有提高甲硫氨酸水平的论述。

天冬氨酸家族氨基酸的生物合成方式

必需氨基酸赖氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸的合成是从天冬氨酸中通过一种类似细菌及高等植物的复杂途径进行的(图1)。该天冬氨酸家族途径已特别地在Escherichia coli中通过参与该途径的酶的分离而详述，这些酶后来也从高等植物中纯化出(Bryan，1980，Umbarger，1978)。

天冬氨酸家族氨基酸合成速度主要通过在途径中一些关键酶活性被相关氨基酸终末产物反馈抑制的复杂过程来调节。途径中第一个酶促活性即也通用于所有天冬氨酸家族氨基酸的天冬氨酸激酶(AK)活性被赖氨酸和苏氨酸反馈抑制。另外赖氨酸还抑制二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)的活性，DHPS是引起赖氨酸合成的分支点之后途径中的第一个酶。苏氨酸抑制高丝氨酸脱氢酶(HSD)的活性，HSD是参与苏氨酸生物合成的第一个酶(Mattews et al.，1989)。

天冬氨酸激酶(AK)在ATP水解的同时可催化天冬氨酸的磷酸化形成3-天冬氨酸磷酸盐。在E.coli和植物中一些不同的AK同工酶已被鉴别，其被赖氨酸或苏氨酸不同程度地抑制。AK-III，E.colilysC基因座的产物，已示出由两个作为同源二聚体的相同亚单位组成(Cassan et al.，1986；Richaud et al.，1973)。E.coli LysC基因已被克隆及测序(Cassan et al.，1986)。

AK活性产物的3-天冬氨酰磷酸在下一酶促步骤中转变为3-天冬氨酸半醛(3-ASA)，其是赖氨酸和苏氨酸合成的共同底物。二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)催化赖氨酸生物合成独有的第一个反应，3-天冬氨酸半醛(3-ASA)与丙酮酸缩合形成2，3-二氢二吡啶羧酸。在E.coli中此酶由dapA基因座编码并显示由四个作为同源四聚体的相同亚单位组成(Shedlarski and Gilvarg，1970)。E.colidapA基因已被克隆并测序(Richaud et al.，1986)。在植物中DHPS酶也呈现是类似于E.coli酶的单酶。在植物中天冬氨酸家族途径的主要调节酶之中，DHPS最易被其终末产物反馈抑制(对于赖氨酸DHPS的I₅₀为10～50μM)。植物DHPS对赖氨酸抑制的敏感程度比植物AK对赖氨酸抑制(I₅₀为100～700μM之间)的敏感程度高出10倍。植物DHPS比E.coli DHPS对赖氨酸抑制(I₅₀大约1mM)的敏感程度高出大约100倍(Yugari and Gilvarg 1962；Galili，1995)。

高丝氨酸脱氢酶(HDS)催化特异于苏氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸合成的第一个反应。高等植物通常具有至少两种形式的HSD：苏氨酸敏感型及不敏感型(Bryan，1980，Lea et al.，1985)。

许多证据表明在植物中AK是苏氨酸合成的限速酶，而DHPS是赖氨酸合成的主要限速酶。已发现一些具有反馈不敏感型AK同工酶的植物物种的突变体可超量产生游离苏氨酸，但赖氨酸水平仅微量提高(Bright et al.，1982；Cattoir-Reyhaerts et al.，1983；Dotson et al.，1990；Frankard et al；1992)。另一方面，一种反馈不敏感的DHPS突变烟草植物可超量产生赖氨酸(Negrutiu et al.，1984)。已报道在用表达来自E.coli的反馈不敏感的DHPS或AK的转基因植物可得相似结果(Glassman，1992；Perl et al.，1992；Shaul and Galili，1992 a andb)。表达E.coli AK的转基因植物超量产生苏氨酸，但赖氨酸水平仅微量提高。对转基因植物的研究也证实了AK和DHPS不仅受反馈抑制调节，而且这些酶的水平也限制苏氨酸和赖氨酸的产生速率。在转基因植物中，分别在细菌AK和DHPS酶的水平和游离苏氨酸和赖氨酸水平之间检测出明显的正相关性(Shaul and Galili，1992 aand b)。

但是，同时表达反馈不敏感的AK和反馈不敏感的DHPS的转基因植物(Shaul and Galili，1993)所含游离赖氨酸水平远远超过在只表达导入的不敏感的AK或DHPS的植物中的水平。此赖氨酸的提高也伴随着与只表达不敏感AK的转基因植物相比苏氨酸累积的明显减少。这意味着当DHPS变为负调节时，导致赖氨酸合成的分支与途径中其它分支强烈竞争，从而相当量的3-天冬氨酸半醛在苏氨酸消耗基础上被转化成赖氨酸。通过赖氨酸超量产生突变体与特征在于分别经DHPS和AK交替调节的苏氨酸超量产生突变体杂交可得到相同结果(Frankard et al.，1992)。

欧洲专利申请485,970揭示了一种通过在植物细胞中导入包含编码具有AK活性的酶的DNA序列的第一个嵌合基因，及包含编码具有DHPS活性的酶的DNA序列的第二个嵌合基因，从而同时提高游离苏氨酸和赖氨酸水平的方法。两种嵌合基因还包含一个能在植物细胞中使酶表达并随后将酶导向叶绿体中的DNA序列。

欧洲专利申请EP 93908395阐述了两个分离的DNA片段，其包含一个编码对赖氨酸抑制不敏感的AK的片段及编码DHPS(其对赖氨酸抑制的敏感比植物DHPS至少低20倍)的第二个片段。其指出对赖氨酸不敏感的AK使在转化植物中苏氨酸产量比正常要高，且DHPS使在转化植物中赖氨酸产量比正常高。

但是，虽已示出表达来自E.coli的反馈不敏感的DHPS的转基因植物可超量产生赖氨酸且表达E.coli AK的转基因植物可超量产生苏氨酸(Glassman，1992：Perl et al.，1992；Shaul and Galili，1992 a andb)，而将这两个基因在转基因植物中组合却从不产生可比的苏氨酸和赖氨酸的同时提高。Shaul和Galili(1993)通过杂交分别表达这些酶的转基因植物得到了同时表达反馈不敏感的AK和反馈不敏感的DHPS的转基因植物。这些植物示出所含游离赖氨酸水平远超于那些只表达不敏感的DHPS的植物中游离赖氨酸水平。但此赖氨酸的提高伴随着与只表达不敏感AK植物相比的苏氨酸累积的明显降低。

当分别由棒状杆菌dapA基因和突变E.coli lysC基因编码的反馈不敏感的细菌DHPS和AK酶被一起在转基因canola和大豆种子中表达时可发现有相同结果。观测到在转基因中种子中游离赖氨酸水平的几百倍提高，而见于只表达反馈不敏感的AK的转基因种子中的过量苏氨酸的累积由DHPS的共表达而被阻止(Falco et al.，1995)。

进一步地，在转基因植物中已观测到异常表型，其中在整个植物中游离赖氨酸浓度比在未转化植物中的浓度高出10倍(Shaul andGalili，1992；Glassman，1992；Frankard et al.，1992)。

在欧洲专利申请EP435970中，反馈不敏感的AK及DHPS基因的表达是通过同一个组成型CaMV35S启动子驱动的。同样在Galili和Shaul的试验(1993)及Falco等的实验(1995)中，反馈不敏感的AK和DHPS在转化植物中共表达，所用的是相同启动子以驱动这两种基因的表达。

当使用基因工程技术以同时提高植物中游离赖氨酸和苏氨酸水平时所遇到的问题已由Falco等(1995)报道。他们还示出使用相同种子特异性启动子以同时驱动反馈不敏感的AK和DHPS的表达，只得到canola及大豆种子的赖氨酸含量的提高。进一步地，他们示出来自最高水平赖氨酸累积的转化子的种子具有异常外观及低发芽率(Falco et al.，1995)。

下面的设想在先前文章的发现的基础上提出的。植物中赖氨酸和苏氨酸合成比率的调节至少由两个因素控制，首先是特异于苏氨酸和赖氨酸合成的两种关键酶(分别为高丝氨酸脱氢酶和DHPS)的共同底物的3-ASA的量，其次，是两种关键酶对共同底物3-ASA的竞争。3-ASA的水平似可通过AK的活性加以检测。当反馈不敏感的AK在转基因植物中过量表达时，较高浓度的3-ASA可转入苏氨酸合成分支，其也可导致甲硫氨酸水平提高。但当DHPS变成反馈不敏感时，导致赖氨酸合成分支与途径中其它分支激烈竞争，这样相当数量的3-ASA在降低苏氨酸合成下转化成赖氨酸。为在转基因植物中将游离赖氨酸和苏氨酸的量同时提高到所要求水平，应很好地调节每个导入的反馈不敏感基因的表达时段及表达水平。天冬氨酸途径的另一氨基酸甲硫氨酸的生产也相伴提高。

根据本发明，编码具有天冬氨酸激酶(AK)活性的酶的核酸序列，和编码具有二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)活性的酶的核酸序列的表达被调节，使这两种序列的表达强度不同且AK编码序列的表达率比DHPS编码序列的表达率高。这可经使用不同强度的启动子或甚至使用相同启动子但单独为DHPS调节启动子提供增强子来获得。本发明的目的是产生同时超量产生达一定程度的苏氨酸和赖氨酸的植物。甲硫氨酸的超量产生也是本发明的一个目的。这可通过使用本发明的特殊序列及本领域熟知的如植物细胞转化的重组DNA技术进行。

优选地对DHPS和AK编码序列的表达在植物生长的不同阶段加以调节，从而植物有机会在没有超量产生的游离氨基酸尤其是超量产生的赖氨酸的干扰下生长和成熟。这可以多种方式完成。

首先至少要调节带一诱导型启动子的DHPS编码序列，该诱导型启动子在AK编码序列开始表达之后可被诱导。AK编码序列也可天然地被诱导型启动子调节，但限制是为AK编码序列提供一个比DHPS编码序列强的表达系统，并且DHPS的表达比AK编码序列的表达要晚一些。尤其优选的是当植物已达到一种不被赖氨酸的超量产生所消极影响的良好成熟度时，诱导DHPS编码序列。

其次，在本发明另一实施方案中，通过用与细胞类型或器官相关的并在植物发育的不同阶段驱动天然表达的启动子调节表达，可得到在不同阶段的表达。DHPS编码序列的合适启动子例如是在植物发育晚期甚或成熟时发生的进程相关的启动子。尤其是块茎或果实相关的启动子适于DHPS编码序列的调节表达。AK编码序列也可被如此启动子调节，但限制是为AK编码序列提供的表达系统比为DHPS编码序列提供的表达系统强。在这种实施方案中优选地例如由于诱导型启动子的使用DHPS编码序列比AK编码序列表达得晚一些。

一种非常强的组成型启动子可用于在器官发育的所有阶段驱动反馈不敏感的AK在整个植物中的表达，导致一较高3-ASA浓度，其可被通入苏氨酸合成分支且将导致苏氨酸和甲硫氨酸超量产生。与其相关的是反馈不敏感的DHPS酶可被调节，使得其只以低水平在较晚的阶段如在特异性植物器官中表达。AK编码序列的表达可以是组成型，其也可仅限于特殊器官。

AK编码序列可以如DHPS编码序列在同样器官中被表达，但该编码序列必须是差异表达。由于DHPS是在较晚阶段及低水平表达，所以导致赖氨酸合成的分支与途径中其它分支仅在发育特定阶段弱竞争，苏氨酸和赖氨酸均超量产生。天冬氨酸途径的另一组分甲硫氨酸也超量产生。

当需得到非常高水平的赖氨酸，如比正常高出10倍或更高时，优选将DHPS编码序列在特异靶器官中表达，以预防植物中呈现表型的负面特性。这种靶植物器官是在植物成熟中发育较晚的器官如块茎、种子、果实及花。由于赖氨酸只在如块茎的特异性定向植物器官中超量产生，植物的其它部分将正常发育，不产生异常表型。

DHPS编码序列的表达优选在高含水量的特异植物器官中进行。这也提供了表型破坏最小这一优势。如此器官包括块茎、果实、花或叶。优选富水器官含70％以上的水份，更优选80％以上的水份。另外，DHPS编码序列在高含水量植物器官中的表达使所需氨基酸良好溶于水，使其易于收集。由此还优选AK编码序列也至少在高含水量植物器官中表达。最优选的是这两种基因应在表达DHPS编码序列的高含水量植物器官中以重叠表达区域表达。优选富含水份的器官是易于收获的器官如块茎、花、果实、根茎或叶。

这种器官一方面可用作营养源，其含有高含量的选自甲硫氨酸、赖氨酸及苏氨酸之天冬氨酸家族的至少二种氨基酸，或可用于提取过程以得到水溶液。所述水溶液含有高含量的选自甲硫氨酸、赖氨酸及苏氨酸之天冬氨酸家族的至少二种氨基酸。可收获包括高含水量含量器官的植物或其部分并用作如食品或食品添加剂和/或进行水提取，得自本发明的植物或植物器官的如此水溶液也可随后用作营养之目的。已知许多简单经济的提取方法，如果汁或蔬菜汁的生产方法。这使以众所周知的方式提供果汁或蔬菜汁成为可能，所述果汁或蔬菜汁由于富含选自甲硫氨酸、赖氨酸和苏氨酸之天冬氨酸家族的至少二个氨基酸，而具有重要的附加营养价值。

因此，本发明的植物或植物的一部分如果实、花、块茎、根和叶尤其适用于素食者，这是由于其可自动补加两种必需氨基酸。另外，得自包括表达本发明组合基因的高含水量器官的植物或植物部分的水溶液提供了一个易得的高含量选自甲硫氨酸，赖氨酸和苏氨酸之天冬氨酸家族的至少二种氨基酸的来源，从中可以大量得到超量产生的氨基酸。甲硫氨酸的高水平使其来源较易得到还是第一次。目前以一种简单方式得到甲硫氨酸、赖氨酸和苏氨酸成为可能。

本发明涉及一种嵌合双基因构建体，包括：

(a)一种编码具有天冬氨酸激酶(AK)活性的酶的核酸序列，

(b)一种编码具有二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)活性的酶的核酸序列，

(c)一种可操纵地与编码序列(a)连接的编码序列(a)的表达调节序列

(d)一种可操纵地与编码序列(b)连接的编码序列(b)的表达调节序列，所述表达调节序列(c)和(d)使两种序列的表达强度不同，并且AK编码序列(a)比DHPS编码序列(b)的表达率高，即(c)强于(d)。另外，嵌合双基因构建体的序列(a)和(b)每个也必须含有一编码转运肽的核酸序列(e)，该转运肽参与蛋白质从胞质溶胶到质体中的转运(Van denBroek et al，1985；Schreier et al 1985)，这是由于高等植物中赖氨酸及大部分苏氨酸的生物合成的细胞器是质体。该编码叶绿体转运肽的核酸序列与编码序列(a)和(b)的融合在表达时将在转化的植物细胞的细胞质中产生一融合的AK/转运肽或DHPS/转运肽嵌合蛋白，该嵌合蛋白将转运至质体，从而使苏氨酸和赖氨酸的产量提高。编码任何质体转运肽的核酸序列都可用于本发明中，所提供的一个合适的例子是衍生自编码将蛋白质导向叶绿体基质的铁氧还蛋白基因(Smeekens et al，1985a)的DNA序列，及衍生自将蛋白质导向叶绿体腔的质体蓝素基因的序列(Smeekens et al，1985b)。优选的编码编码用于AK及DHPS的质体定向的DNA序列编码起源于豌豆rbcs-3A基因的转运肽(图2；Fluhr et al，1986)，编码转运肽的核酸序列的3’末端与编码AK或DHPS的序列融合。

编码AK及DHPS的序列(a)和(b)必须依次分别与转录终止DNA信号(g)和(h)融合。该终止信号包括3’转录终止信号及mRNA聚腺苷酸化信号。可以使用在任何克隆基因3’侧翼区存在的终止信号，如豌豆rbcs基因，豆类菜豆碱基因或衍生自根癌农杆菌的Ti质粒的胭脂氨酸合酶基因。优选的终止序列源自根癌农杆菌的Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的3’侧翼区(图2，Greve et al，1983)。

根据本发明的基因构建体优选包含作为核酸序列(b)的表达调节序列(d)的一种调节序列，其可使DHPS在发育阶段的表达晚于核酸序列(a)的表达。在另一实施方案中，表达调节序列(d)是一个不引起组成型表达的序列。优选该序列导致在一个或多个特异植物器官如块茎、花、果实、根或茎中的表达。优选该序列在富水器官中调节表达。

核酸序列(a)的表达调节序列(c)可以是使编码序列(a)在植物和/或植物器官发育早期阶段高表达的一种序列。该核酸序列(a)的表达调节序列(c)可以是使编码序列(a)在所有植物细胞或植物器官高表达的一种序列。表达调节序列(c)合适地是一个组成型启动子。如此的启动子可以是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。

表达调节序列(c)不只包括启动子，还包括表达增强子序列。在这种情况下，表达调节序列(d)可以包括与表达调节序列(c)相同的启动子或同样强度的启动子，因为编码序列(a)和(b)的表达水平是不同的。

发现表达调节序列尤其是启动子位于每个编码序列(a)和(b)的5’区域。在启动子的3’末端可以加入一代表5’mRNA非翻译序列的短核酸序列，其增强转录自嵌合基因的mRNA的翻译。一个例子是衍生自烟草花叶病毒的外被蛋白基因(Gallie et al，1987)的Ω序列，或苜蓿花叶病毒翻译增强子(Brederode et al，1980)的Ω序列。

驱动本发明的AK酶编码序列(a)表达的表达调节序列(c)的合适增强的启动子是增强的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(Benfey etal，1990；Pen et al；1992)。在此启动子中，增强子序列是重复的，使其成为在整个植物所有发育阶段组成型驱动表达的强启动子。也可使用其它驱动高水平组成型表达的启动子。

表达调节序列(c)和(d)的启动子可以源自单子叶或双子叶植物。它们优选是组织特异性的但也可以是非组织特异性的启动子。当与增强子融合时可以使用与调节DHPS(b)表达的表达调节序列(d)中相同的组织特异性启动子以驱动反馈不敏感的AK表达(a)。

驱动本发明的DHPS酶编码序列(b)表达的合适的器官特异性调节序列(d)是来自Solanum tuberosum的块茎特异性I类patatin启动子(Mignery et al，1988；Wenzler et al，1989)。可使用驱动DHPS表达的其它块茎特异性启动子如来自马铃薯的蛋白酶抑制剂II启动子(Keilet al；1989)，或组织蛋白酶D抑制剂马铃薯启动子(Herbers etal；1994)。也可使用其它组织特异性启动子如来自番茄聚半乳糖醛酸糖苷酶基因的果实特异性启动子(Grierson et al，1986)，来自豆类的种子特异性菜豆碱启动子(Sengupta-Gopalan，1985)或根特异性CaMV35S启动子亚功能域(Benfey et al，1990)。

表达调节序列(c)和(d)均可包括诱导型启动子，优选地，两个启动子的诱导刺激物是不同的，以使与其可操作连接的编码序列差异表达。其它诱导型启动子的例子是来自豌豆rbcS基因的轻诱导型启动子(Coruzzi et al，1984)及来自水稻的肌动蛋白启动子(McElroy etal，1990)。

核酸编码序列(a)和(b)可以衍生自任何合适的来源，如不同的植物细胞或细菌，或可以是一合成编码序列。在一优选的实施方案中，序列(a)编码一种与相应的野生型植物酶相比对赖氨酸抑制的敏感性低的酶，及序列(b)编码一种与相应的野生型植物酶相比对苏氨酸的抑制易感性低的酶。合适地，这些序列衍生自内源性器官，优选的外源物是细菌如E.coli。合适的编码AK活性的核酸序列(a)是编码同工酶AK-III的E.coli突变LysC基因的DNA序列，该酶对赖氨酸的敏感性比植物酶低(Boy et al，1979；Cassan et al，1983)。合适的编码DHPS酶的核酸序列(b)是源自E.coli的dapA基因(Richaud etal，1983)。所得表达产物对赖氨酸抑制的敏感性比植物DHPS酶低。编码对反馈抑制敏感性低的突变的植物酶的天然序列也是可以使用的序列的例子。

举例来说，嵌合双基因构建体可由存在于同一个双价载体中的编码由不同启动子驱动的AK和DHPS的两种编码序列组成(图2)。嵌合基因构建体的AK编码部分具有在5’区与ΩDNA序列5’末端连接的(增强的)花椰菜花叶病毒35S启动子；ΩDNA序列与编码衍生自豌豆rbcS-3A基因的叶绿体转运肽的DNA序列的5’末端连接，该序列与编码不敏感的AK-III的突变E.coli lysC等位基因的编码序列5’末端连接，后者与章鱼氨酸合酶终止序列的5’末端连接。

嵌合基因构建体的DHPS编码部分具有基本相同的结构，但AK基因构建体的强组成型启动子由较弱的块茎特异性马铃薯patatin(I类)启动子代替，且编码不敏感的AK-III的lysC基因由编码DHPS的E.coli dapA基因代替。

本发明还涉及一种包括任何所述实施方案中描述的本发明的嵌合双基因构建体的表达载体。

在其细胞中含有所述双基因构建体的转基因植物，这种转基因植物的部分也属于本发明范围。

优选的植物是那些高含水量的植物或其部分：块茎、叶、根、果实、茎或花。合适的植物是马铃薯、甜菜、草及用于提供果汁或蔬菜汁的果实或蔬菜。合适的果实如苹果、橙、葡萄柚、葡萄、番茄、芒果、香蕉、甜瓜、草莓、樱桃、猕猴桃。合适的蔬菜如马铃薯和甜菜。其它相似水含量的果实或蔬菜也认为是合适的。

优选的植物或植物部分衍生自正常认为可供消费以产生供消费目的的赖氨酸和苏氨酸的植物或植物一部分。为经济原因优选那些在每英亩地单位时间内以最经济的价格得到最高量水性提取组分的植物。由于地理环境与气候影响，每个国家品种是有变化的。所述植物可以是商业培育的，或目前不是商业植物，但掺入本发明的基因构建体时可引起商业兴趣的植物。

包括可表达本发明的双基因构建体的富水器官的植物部分构成优选实施方案的植物部分，可发育成如此富水器官的植物细胞构成优选实施方案的植物细胞。优选的植物部分也是这种富水器官。合适的器官是花、块茎、果实，已在本文中阐述过其实例。

本发明的植物或植物细胞相伴产生高水平的苏氨酸和赖氨酸。本发明的植物或植物细胞可超量产生甲硫氨酸。优选地天冬氨酸家族的至少二种氨基酸相伴超量产生。优选在本发明的植物或植物部分中，赖氨酸只在特异的高含水量的器官中产生。本发明的植物，植物部分或植物细胞对游离赖氨酸的表达比野生型要高10倍。优选地，DHPS编码序列只在晚期发育器官如块茎、种子、果实及花中表达。衍生自本发明的转基因植物或植物细胞的植物组织也包含于本发明范围。

在另一实施方案中，本发明提供了含有本发明的表达载体或被本发明的表达载体转化的转基因植物细胞。

两种嵌合基因构建体都可被亚克隆入表达载体如根癌农杆菌的Ti质粒中，优选的质粒是双元载体pBINPLUS(Van Engelen etal，1995)。

然后将表达载体(其中克隆了双基因构建体)导入植物细胞中。该导入可使用能将DNA转移至单子叶或双子叶植物中的各种转化方案。例如，植物细胞的转化可通过经电穿孔(Dekeyser et al，1990)，经PEG沉淀(Hayashimoto et al，1990)或经粒子轰击(Gordon-Kann etal，1990)的直接DNA转移，及经用农杆菌感染将DNA转移至植物细胞来实现，优选的方法是用根癌农杆菌感染植物细胞(Horsch etal，1985；Visser，1991)。本文实施例中用于马铃薯或甜菜的方法可用于改良上述类型的农作物如番茄和苹果。

然后通过对卡那霉素或其它如潮霉素的抗生素的抗性筛选转化的植物。对超量产生苏氨酸，赖氨酸和甲硫氨酸任一种的植物细胞或植物的筛选也可通过向植物生长培养基中加入苏氨酸，赖氨酸及甲硫氨酸中的任一种来进行。

在其细胞中同时含有本发明的基因构建体的AK和DHPS组分的植物，也可通过将分别具有相应的表达调节序列(c)和(d)的只含AK基因构建体(a)的转基因植物和只含DHPS基因构建体(b)的转基因植物杂交而获得。单基因构建体可任选地包括上述嵌合双基因构建体的终止序列和/或转运序列。

实施例以例证说明了本发明，但不代表是仅有的实施方案，引用的现有技术内容并入参考文献。

实施例1表达AK及DHPS的嵌合双基因构建体的构建

用标准方法进行DNA的分离，亚克隆、限制性分析及DNA序列分析(Sambrook et al，1989；Ausubel et al，1994)。

含lysC基因的嵌合基因通过将增强的CaMV35S启动子与嵌合lysC基因融合而构建。该嵌合lysC构建体含有突变的lysC等位基因的DNA片段，其已在5’末端源自烟草花叶病毒的包被蛋白的ΩDNA序列(Gallie et al，1989)融合。在lysC序列的下游，插入了源自根癌农杆菌的章鱼氨酸合酶基因的终止信号(Greve et al，1983)。将含有豌豆rbcS-3A转运肽编码序列的DNA片段(Fluhr et al，1986)插入在ΩDNA和lysC编码序列之间。将嵌合lysC基因构建体作为BamHI/SpeI片段克隆在pBluescipt(Stratagen)中。增强的CaMV35S启动子(Benfey et al.，1990)作为SamI/BamHI片段被连接在双元载体pBINPLUS(Van Engelen et al.，1995)的XbaI/SmaI片段中用BamHI/XbaI消化的lysC嵌合基因之前(pAAP30；图2A)。

通过增强的CaMV35S启动子与嵌合DapA基因的融合构建含DapA基因的嵌合基因。该嵌合DapA构建体含有E.coli DapA基因的DNA片段(Richaud et al.，1986)，其在5’末端与源自烟草花叶病毒包被蛋白的ΩDNA序列(Gallie et al.，1983)融合。在该DapA序列下游插入了源自根癌农杆菌的章鱼氨酸合酶基因的终止信号(Greve et al.，1983)。将含有豌豆rbcS-3A转运肽编码序列的DNA片段(Fluhr et al.，1986)插入到ΩDNA和DapA编码序列之间。将嵌合DapA基因构建体作为BamHI/SpeI片段克隆在pBluescript中(Stratagen)。将作为平端(Hind III填满的)/BamHI片段的patatin启动子(Wenzler et al.，1989)连接在用SmaI/BamHI消化的DapA嵌合基因之前。

双基因构建体可通过将patatin-dapA嵌合基因作为来自pAAp31的KpnI/SacI片段连入经SacI/KpnI消化的具有增强的CaMV35S-LysC(pAAP30)的双元载体得以实现(pAAP50；图2C)。

实施例2，嵌合基因导入马铃薯中

2.1马铃薯植物的转化

将双元载体pAAP50用于根癌农杆菌菌株AGLO的冻融转化(Hofgen and Willmitzer 1988)。随后将转化的AGLO用于二倍体马铃薯(Solanum tuberosum，Kardal变种)茎外植体的接种，如Visser所述(1991)。茎和根在含卡那霉素的培养基上再生之后，将植物置入土壤中并转移至温室中。从用不含双元载体的农杆菌菌株AGLO处理的茎外植体中再生的植物(在不含卡那霉素游离培养基上)作为对照物。

2.2体外块茎的形成

为诱导体外块茎形成，将转化的马铃薯小植株切下的茎节(大约4-5cm长)垂直置于补加10％(w/v)蔗糖，5μM BAP的固体Murashige及Skoog(1962)培养基中。将培养物在黑暗中于19℃保持。14天后，收集直径4mm的微块茎并分析游离赖氨酸和苏氨酸含量及AK和DHPS活性。

实施例3在转基因马铃薯植物中游离赖氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸含量的分析

将组织(0.5-1.0g)用研钵研匀并在2ml含1mM二硫苏糖醇的50mM Pi缓冲液(pH7.0)中捣碎。将正亮氨酸作为内标而加入。用5ml的水∶氯仿∶甲醇混合物(3∶5∶12)萃取将游离氨基酸部分提纯。收集水相并再萃取两次。在经冻干浓缩至3ml之后，将20μl样品用于6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC)衍生反应。根据厂商指导在逆相C18柱中经DHPS分析衍生的氨基酸(WatersAccQ.Tag系统)

实施例4在转基因马铃薯植物中AK活性的分析

收集微块茎，叶或成熟块茎并用研钵研匀，并在等体积的含30mMβ-巯基乙醇，0.1mM L-赖氨酸，0.1mM L-苏氨酸，1mM苯甲基磺酰氟和0.5μg/ml亮抑蛋白酶肽的冷的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中捣碎。离心5分钟后(16000g，4℃)，收集上清液并检测其蛋白质浓度。然后如Black及Wright(1995)所述测试等量蛋白质AK的活性。分析混合物(终体积约0.25ml)含有300μg蛋白质，100mM tris-HCl，pH8.0，200mM NH₂OH，在使用前先用KOH中和，10mM ATPm，5mM MgCl₂及30mM L-天冬氨酸。对照分析含有除L-天冬氨酸外所有成分。在37℃进行反应1小时，然后加入在使用前混合的0.25ml 10％(w/v)FeCl₃ 0.1N HCl，3N HCl和12％TCA的1∶1∶1溶液终止反应。置于冰上5分钟后，将反应混合物离心(5分钟，16,000g4℃)，并测上清液在490nm的光吸收。对于每个样品，从L-天冬氨酸存在下得到的活性中减去在缺少L-天冬氨酸下得到的非特异活性。

实施例5 在转基因马铃薯块茎中DHPS活性的分析

用研钵研匀微块茎或成熟块茎，并在等体积的含2mM EDTA，1.4％抗坏血酸钠1mM苯甲基磺酰氟和0.5μg/ml亮抑蛋白酶肽的冷的100mM tris-HCl(pH7.5)中捣碎。离心5分钟后(16,000g，4℃)收集上清液。用如Yugari及Gilvarg(1965)所述的使用O-氨基苯甲醛(O-ABA)的方法测DHPS活性。

实施例6 经直接基因转移转化甜菜的双基因构建体的构建

为将嵌合双构建体导入甜菜，将嵌合基因插入特异于甜菜直接基因转化的质粒载体中。将含有编码膦丝菌素乙酰基转移酶的pat基因的质粒pPG5(Hall et al.，1996)用Hind III消化，填满并用Sacl消化。将双元载体pAAP50(图2B)用Xbal消化，填满并用Sacl消化。分离含双构建体的钝端/Sacl片段，并与pPG5质粒的钝端/Sacl片段连接(pAAP60，图2D)

实施例7 将嵌合基因导入甜菜

根据前述方法(Hall etal.，1996)，将双子叶甜菜(Beta vulgaris L.)繁殖系(Bv-NF，Hall et al.，1993)的茎尖培养物用于转化。在此方法中使用的是聚乙二醇-介导的DNA转移技术，其适用于特别富含衍生自气孔保卫细胞的细胞类型的原生质体群，在补加200μl/lbialaphos培养基上培养4周筛选稳定转化的细胞。随后在非选择性培养基中传代培养Bialaphos抗性愈伤组织，并在茎和根再生后将植物置入土壤并转移至温室中。

实施例8 转基因甜菜植物中游离赖氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸的分析

根据实施例3所述方法分析转基因甜菜植物的叶及直根组织中游离氨基酸水平。

附图描述

图1：天冬氨酸家族生物合成途径的流程图。只标明了主要关键酶及其产物。弯曲箭头代表由终末产物氨基酸的反馈抑制。DHPS：二氢二吡啶甲酸合酶；HDS：高丝氨酸脱氢酶；TDH：苏氨酸脱水酶。

图2A＝pAAP30构建体

图2B＝pAAP31构建体

图2C＝pAAP50构建体

图2D＝pAAP60构建体参考文献-Ausubel，F.M.et al.(1994)分子生物学当前方案，John Wiley & Sons-Benfey.P.N.et al.(1990)EMBO J.9：1685-1696.-Black，S.et al.(1995)生物化学杂志213：27-38.-  Boy，E.et al.(1979)生物化学61：1151-1160.-  Brederod，F.T.et al.(1980)核酸研究8：2213-2223.-  Bright，S.W.J.et al.(1982)自然299：278-279.-  Bryan，J.K.(1980)植物生物化学(B.J.Miflin编辑)vol.5：403-452.Academic Press，N.Y.-  Cassan，M.et al.(1986)，生物化学杂志261：1052-1057.-  Cattoir-Reynaerts A.et al.(1983)Biochem.Physiol.Pflanzen 178：81-90.-  Coruzzi G.et al.(1984)EMBO J.3：1671-1679.-  Dekeyser，R.A.et al.(1990)植物细胞2：591-602-  Dotson，S.B.et al.(1990)植物182：546-552.-  Falco，S.C.et al.(1995)生物/技术13：577-582.-  Fluhr，R.et al.(1986)EMBO J.5：2063-2071.-  Frankard，V.et al.(1992)植物生理学99：1285-1293.-  Galili.G.(1995)植物细胞7：899-906.-  Gallie，D.R.et al.(1987)核酸研究15：3257-3273.-  Glassman，K.F.(1992)植物中氨基酸的生物合成及分子调控(B.K.Singh等编辑)：217-228.-  Gordon-Kann，W.J.et al.(1990)植物细胞2：603-618.-  Greve，N.D.et al.(1983)分子应用遗传学1：499-511.-  Grierson，D.et al.(1986)核酸研究14：8595-8603。-  Hall，R.D.et al.(1993)植物细胞报道12：339-342.-  Hall，R.D.et al.(1996)自然生物工程14：1133-1138.-  Hayashimoto，A.et al.(1990)植物生理学93：857-863.-  Harbers，K.et al.(1994)植物分子生物学26：73-83.-  Hfgen，R.and Willmitzer.L.(1988)核酸研究16：9877.-  Horsch，R.B.et al.(1985)科学227：1229-1231-  Keil，M.et al.(1989)EMBO J.8：1323-1330-  Lea，P.J.et al(1985)氨基酸的化学及生物化学(G.C.Barrett编辑)：197-226，London：Chapman and Hall.-  Matthews，B.F.et al.(1989)植物生理学91：1569-1574.-  McElroy，D.et al.(1990)植物细胞2：163-171.-  Mignery，C.A.et al.(1988)基因62：27-44-  Murashige，T.and Skoog，F.(1962)生理学植物15：473-497.-  Negrutiu，I.et al.(1984)理论及应用遗传学6：11-20.-  Pen，J.et al.(1992)生物/技术10：292-296.-  Perl，A.et al.(1992)植物分子生物学19：815-823.-  Richaud.C.et al.(1973)欧洲生物化学杂志40：619-629.-  Richaud，F.et al.(1986)细菌学杂志166：297-300.-  Sambrook，J.et al.(1989)分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社-  Schreier，P.H.et al.(1985)EMBO J.4：25-32.-  Sengupta-Gopalan，C.(1985)美国科学院院刊82：3320-3324.-  Shaul，O.and Galili.G.(1992a)植物2：203-209.-  Shaul，O.and Galili，G.(1992b)植物生理学100：1157-1163.-  Shaul，O.and Galili，G.(1993)植物分子生物学23：759-768.-  Shedlarski，J.G.and Gilvarg，C.(1970)生物化学杂志245：1362-1373.-  Smeekens，S.et a.(1985a)核酸研究13：3179-3194.-  Smeekens，S.et al.(1985b)自然317：456-458.-  Umbarger，H.E.(1978)生物化学年度综述47：533-606.-  Van den Broeck.G.et al.(1985)自然313：358-363.-  Van Engelen，F.A.et al.(1995)转基因研究4：288-290.-  Visser，R.G.F.(1991)植物组织培养手册B5(ed.by K.Lindsey)：1-9，Kluwer Acad.Publishers，The Netherlands.-  Wenzler，H.C.et al.(1989)植物分子生物学12：41-50.-  Yugari，Y.and Gilvarg.C.(1962)生物化学生物物理杂志62：612-614.-  Yugari，Y.and Gilvarg，C.(1965)生物化学杂志240：4710-4716.

Claims (56)

1、一种嵌合双基因构建体，包括：

(a)一种编码具有天冬氨酸激酶(AK)活性的酶的核酸序列，

(b)一种编码具有二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)活性的酶的核酸序列，

(c)一种可操纵地与编码序列(a)连接的编码序列(a)的表达调节序列，

(d)一种可操纵地与编码序列(b)连接的编码序列(b)的表达调节序列，所述表达调节序列(c)和(d)使两种序列的表达强度不同且AK编码序列(a)的表达率比DHPS编码序列(b)的表达率高，即(c)强于(d)，

(e)一种编码参与(a)的表达产物的转运的转动肽的核酸序列，该编码叶绿体转运肽的核酸序列(e)在表达时在植物细胞的细胞质中产生一融合的AK/转运肽或DHPS/转运肽嵌合蛋白，该嵌合蛋白被转运至质体中，从而获得经天冬氨酸家族途径产生的至少两种氨基酸的增高的产量，

(f)一种编码参与(b)的表达产物的转运的转运肽的核酸序列，该编码叶绿体转运肽核酸序列(f)在表达时在植物细胞的细胞质中产生一融合的AK/转运肽或DHPS/转运肽嵌合蛋白，该嵌合蛋白被转运至质体中，从而获得经天冬氨酸家族途径产生的至少两种氨基酸的增高的产量，

(g)一种为(a)的转录提供转录终止DNA信号的核酸序列，

(h)一种为(b)的转录提供转录终止DNA信号的核酸序列。

2、根据权利要求1的基因构建体，其中的至少两种氨基酸选自赖氨酸，苏氨酸和甲硫氨酸。

3、根据权利要求2的基因构建体，其中的至少两种氨基酸包括赖氨酸和苏氨酸。

4、根据前述任一项权利要求的基因构建体，包括一个调节序列，其作为核酸序列(b)的表达调节序列(d)能使DHPS的表达在比核酸序列(a)的表达晚的发育阶段进行。

5、根据前述任一项权利要求的基因构建体，包括一个调节序列，其作为核酸序列(b)的表达调节序列(d)能使DHPS非组成型表达。

6、根据前述任一项权利要求的基因构建体，包括一个调节序列，其作为核酸序列(b)的表达调节序列(d)能使DHPS在一个或多个特异性植物器官如块茎、种子、花、茎、叶、根或果实中表达。

7、根据权利要求6的基因构建体，其中驱动DHPS酶的编码序列(b)表达的器官特异性调节序列(d)是来自Solanum tuberosum的块茎特异性I类patatin启动子(Mignery et al.，1988；Wenzleretal.，1989)，组织蛋白酶D抑制剂马铃薯启动子(Herbers et al.，1994)，来自番茄的聚半乳糖醛酸酶基因的果实特异性启动子(Grierson etal.，1986)或来自豆类的种子特异性菜豆碱启动子(Sengupta-Gopalan，1985)。

8、根据前述任一项权利要求的基因构建体，包括一调节序列，其作为核酸序列(b)的表达调节序列(d)能使DHPS在一个或多个富水的植物器官如块茎、花、茎、果实、根或叶中表达。

9、根据前述任一项权利要求的基因构建体，包括一种核酸序列(a)的表达调节序列(c)，其能使编码序列(a)在植物和/或植物器官发育早期高表达。

10、根据权利要求9的基因构建体，其中核酸序列(a)的表达调节序列(c)是能使编码序列(a)在所有植物细胞或植物器官中高表达的序列。

11、根据权利要求10的基因构建体，其中核酸序列(a)的表达调节序列(c)是一种组成型启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。

12、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中表达调节序列(c)包括一启动子及一表达增强序列如衍生自烟草花叶病毒的包被蛋白基因的Ω序列(Gallie et al.，1987)或苜蓿花叶病毒翻译增强子(Brederode et al.，1980)。

13、根据权利要求12的基因构建体，其中表达调节序列(d)包括与表达调节序列(c)相同的启动子或相同强度的启动子，从而使编码序列(a)与(b)的表达水平不同。

14、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中表达调节序列尤其是启动子被发现位于每个编码序列(a)与(b)的5’区。

15、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中表达调节序列(c)与(d)的启动子可源于单子叶或双子叶植物。

16、根据权利要求1-10，12-15任一项的基因构建体，其中表达调节序列(c)与(d)均包括诱导型启动子。

17、根据权利要求16的基因构建体，其中两个启动子的诱导刺激物不同，以使与其可操纵连接的编码序列的表达不同。

18、根据权利要求16或17的基因构建体，其中诱导型启动子选自光诱导型启动子。

19、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中序列(e)是一个衍生自编码将蛋白质导入叶绿体基质的铁氧还蛋白基因的核酸序列(Smeekens et al.，1985a)，一个衍生自编码将蛋白质导入叶绿体腔的质体蓝素基因的序列(Smeekens et al.，1985b)，或优选源自豌豆rbcs-3A基因的转运肽的序列(图2，Fluhr et al.，1986)。

20、根据权利要求19的基因构建体，其中编码转运肽的核酸序列的3’末端与每个编码序列(a)与(b)融合。

21、根据前述任一项权利要求的基因构建体，编码序列(a)与(b)分别与(g)和(h)的转录终止DNA信号融合。

22、根据权利要求21的基因构建体，其中终止信号(g)与(h)包括一3’转录终止信号和一mRNA聚腺苷酸信号。

23、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中终止信号是存在于豌豆rbcs基因、豆类菜豆碱基因、衍生自根癌农杆菌的Ti质粒的胭脂氨酸合酶基因或优选地来自根癌农杆菌的Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因(图2，Greve et al.，1983)的3’侧翼区的终止信号。

24、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中核酸编码序列(a)与(b)可衍生自任何合适的来源，如源自不同植物细胞或细菌，或是一合成编码序列。

25、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中核酸编码序列(a)与(b)可以衍生自任何合适的来源，与相应野生型植物酶相比其中序列(a)编码一种对赖氨酸抑制的敏感性低的酶，序列(b)编码一种对苏氨酸抑制的易感性低的酶。

26、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中核酸编码序列(a)与(b)衍生自异源来源如细菌，例如E.coli。

27、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中编码AK活性的核酸序列(a)是编码与植物酶相比对赖氨酸的敏感性低的同工酶AK-III的E.coli突变LysC基因(Boy et al.，1979)的DNA序列。

28、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中编码DHPS酶的核酸序列(b)是源自E.coli的dapA基因(Richaud et al.，1983)。

29、根据前述任一项权利要求的基因构建体，其中核酸编码序列(a)和/或(b)编码一种对反馈抑制敏感性低的突变的植物酶。

30、一种表达载体，包括根据前述任一项权利要求的嵌合双基因构建体。

31、一种转基因植物，包括根据权利要求1-29任一项的双基因构建体，或者包括在根据权利要求1-29任一项的任一实施方案中的如权利要求1的双基因构建体的元件，其中(a)由(c)调节，(b)由(d)调节，调节的方式及程度如权利要求1-29所述，或者包括如权利要求30的表达载体。

32、一种转基因植物，包括根据权利要求1-29任一项的双基因构建体，或者包括在根据权利要求1-29任一项的任一实施方案中的如权利要求1的双基因构建体的元件，其中(a)由(c)调节，(b)由(d)调节，调节的方式及程度如权利要求1-29所述，或者包括如权利要求30的表达载体，其中该植物能将所述双基因构建体或其元件传递给子代植物。

33、根据权利要求31或32的转基因植物，其中该植物在相同培养条件下可产生比野生植物高5倍优选高7倍水平的苏氨酸和赖氨酸。

34、根据权利要求31-34任一项的转基因植物，其中该植物在相同培养条件下可产生比野生植物高8倍优选高10倍水平的苏氨酸和赖氨酸。

35、根据权利要求31-33任一项的转基因植物，其中在相同的培养条件下苏氨酸与赖氨酸在块茎、茎、种子、果实、根、花或叶中与野生植物相比是超量产生的。

36、根据权利要求31-35任一项的转基因植物，其中在相同的培养条件下苏氨酸与赖氨酸在富水器官中与野生型植物相比是超量产生的。

37、根据权利要求31-36任一项的转基因植物，其中在相同的培养条件下苏氨酸与赖氨酸在块茎、果实、茎、根、花或叶中与野生植物相比是超量产生的。

38、根据权利要求31-37任一项的转基因植物，所述植物在非转基因植物的正常培养条件下具有至少70％水含量。

39、根据权利要求31-38任一项的转基因植物，所述植物块茎、花、茎、根、果实在非转基因植物的正常培养条件下具有至少80％水含量。

40、根据权利要求31-39任一项的转基因植物，选自马铃薯、甜菜、草及用于提供果实或蔬菜以取汁的植物。

41、根据权利要求40的转基因植物，其是马铃薯、甜菜植物或草。

42、根据权利要求31-41任一项的转基因植物，其能够提供选自苹果、橙、葡萄柚、葡萄、番茄、香蕉、芒果、甜瓜、草莓、樱桃、猕猴桃的果实，或选自马铃薯，甜菜的蔬菜，优选马铃薯或甜菜。

43、转基因植物，其在相同条件下，能产生超过非转基因植物的野生型水平的甲硫氨酸。

44、转基因植物，其在相同条件下，能产生超过非转基因植物的野生型水平5倍的赖氨酸和苏氨酸。

45、根据权利要求43和/或44与权利要求31-42任一项相组合的转基因植物。

46、根据权利要求31-45任一项的植物的部分，至少包括细胞。

47、根据权利要求46的部分，所述部分衍生自块茎、果实、根、茎、种子或花，或是块茎，果实，茎、种子，花或叶。

48、根据权利要求46或47的部分，所述部分是富水器官或其部分。

49、根据权利要求31-45任一项的植物或根据权利要求46-48的植物部分的水性提取组分。

50、一种获得根据权利要求31-45任一项的植物的方法，包括：将根据权利要求1-29的任一项实施方案的双基因构建体的元件或基因构建体或根据权利要求30的载体以已知方式导入以将核苷酸导入植物细胞，随后在一定条件下将植物细胞培养为组织或成熟植物，并培养足够长的时间以使该组织或成熟植物与那些在相同条件下培养的、衍生自相应的不含所述元件、基因构建体或载体的植物细胞的组织或植物相比，能表达高出至少5倍的赖氨酸和苏氨酸，所述条件是调节序列(c)与(d)被激活。

51、根据权利要求50的方法，其中基因构建体经转化导入植物细胞。

52、根据权利要求50的方法，其中包括所述基因构建体亚片段的两种植物杂交，所述亚片段已以非必须生物学方式被导入至少一种植物中，以到达包括该双基因构建体元件的植物细胞中。

53、一种获得根据权利要求31-45任一项的植物的方法，包括选择根据权利要求50-52得到的植物或组织的一部分，并从该组织中或从衍生自该植物的组织或器官中培养出后续的植物，这包括将根据权利要求1-29的任一项实施方案的双基因构建体的元件或基因构建体或权利要求30的载体以已知方式导入以将核酸导入植物细胞，随后在一定条件下将该植物细胞培育成组织或成熟植物，并培养足够长的时间以使该组织或成熟植物与那些在相同条件下培养的、衍生自相应的不含所述元件、基因构建体或载体的植物细胞的组织或植物相比，能过量表达选自甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸的天冬氨酸家族的至少两个氨基酸，，所述条件是调节序列(c)与(d)被激活。

54、根据权利要求53的方法，其中赖氨酸和苏氨酸的表达程度至少是野生型植物的5倍。

55、根据权利要求53或54的方法，其中甲硫氨酸是过量表达的。

56、一种获得富含天冬氨酸途径的游离氨基酸即苏氨酸、赖氨酸及甲硫氨酸的水性提取组分的方法，包括从根据权利要求31-45任一项的转基因植物或根据权利要求46-48任一项的植物部分中以已知的从植物或植物部分中提取水性提取组分的方法提取水性提取组分。

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