CN1413256A - 修饰的dhps基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及导致必需氨基酸在细胞中累积的生物合成关键酶的修饰。编码二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase，DHPS)或其功能片段的重组或分离核酸或其功能片段中已被引入一突变，以用半胱氨酸置换至少一个单氨基酸残基。

Description

修饰的DHPS基因
本发明涉及修饰生物合成的关键酶，以使必需氨基酸在细胞中累积。
20种必需氨基酸中有10种以上人和单胃动物不能合成，因此必需从其饮食中获得这些必需氨基酸。必需氨基酸是赖氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸和色氨酸。另外，酪氨酸和半胱氨酸尽管不是严格意义上的必需氨酸，但因为它们只能自必需氨基酸中合成：酪氨酸自苯丙氨酸中合成，半胱氨酸自甲硫氨酸中合成，因此也认为它们同必需氨基酸一样。人类及家畜的饮食(也称为食物和饲料)主要来自植物。在为动物和人类营养所必需的氨基酸中，有一些氨基酸如赖氨酸通常只以相对低的浓度存在于农作物中。因此，通常在谷物为主的饮食和其它饮食中加入合成的氨基酸作为补剂，以提高饮食的营养价值。饮食中的蛋白质不是营养等价的，其与不同蛋白质中氨基酸的组成相关。食用提供不适当数量的一种必需氨基酸的饮食导致负氮平衡，因为正常的蛋白质分解代谢继续进行，但由于必需氨基酸的相对缺乏而导致替代的新合成受限。这种情况甚至在蛋白质的总饮食摄入量是适量的时候也会发生。饮食蛋白可以用于合成组织蛋白质的程度，受限于相对于需要存在的最小量的必需氨基酸的含量。这是该蛋白质的限制性氨基酸。
许多农作物含有非常低水平的赖氨酸。因此，植物中赖氨酸的含量是一个重要的农艺学特性，而且在过去通过传统培育，突变选择或通过遗传修饰，已经进行了各种尝试以提高植物中赖氨酸水平。
调节氨基酸生物合成主要基于氨基酸终产物途径的关键酶的反馈抑制。提高植物中必需氨基酸的含量所遇到的问题是由于反馈抑制机制所致。
必需氨基酸赖氨酸是与苏氨酸和甲硫氨酸一起，通过在细菌和高等植物中相似的复杂途径从天冬氨酸中合成的(图1)。天冬氨酸家族途径已经在大肠杆菌中，通过分离参与途径中的酶而加以了详细定性，所述酶随后也从高等植物中纯化(Bryan，J.K.(1980)，植物的生物化学(由B.J.Miflin编辑)，第5卷：403-452，科学出版社，N.Y.；Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47：583-606)。
天冬氨酸家族氨基酸的合成速率，主要通过相应的氨基酸终产物途径中一些关键酶的活性的反馈抑制这一复杂过程调节的。与所有天冬氨酸家族氨基酸相同，这个途径中第一种酶活性，天冬氨酸激酶(AK)活性，是通过赖氨酸和苏氨酸反馈抑制的。另外，赖氨酸也抑制二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase，DHPS)的活性，这种酶是在分支点后途径的第一种酶，导致赖氨酸合成。伴随着ATP水解，AK催化天冬氨酸磷酸化，形成3-天冬氨酰磷酸酯。在大肠杆菌和植物中已经鉴别了一些不同的AK同工酶，它们由赖氨酸或苏氨酸抑制。AK活性的产物，3-天冬氨酰磷酸酯盐，在接下来的酶促步骤中转换为3-天冬氨酸半醛(3-ASA)，其作为合成赖氨酸和苏氨酸的共同底物。二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)催化赖氨酸生物合成独特的第一个反应，即3-天冬氨酸半醛与丙酮酸缩合形成2，3-二氢吡啶二羧酸。在大肠杆菌中，这种酶是由dapA基因座编码的，并呈现由4个相同的亚单位组成的同型四聚体(Shedlarski，J.G.和Gilvarg，C.(1970)生物化学杂志，245：1362-1373)。大肠杆菌基因dapA基因已经克隆并测序(Richaud，F.等，(1986)细菌学杂志166：297-300)。在植物中，DHPS酶也表现为是一种与大肠杆菌酶相似的单酶。目前纯化的所有植物DHPS示出具有由赖氨酸强力抑制的活性。在植物中天冬氨酸家族途径的主要调节酶中，DHPS对其终产物反馈抑制最敏感(DHPS对赖氨酸的I50为10-50μM)。DHPS对赖氨酸抑制的敏感性是植物赖氨酸敏感性AKs(I50为100-700μM)的大约10倍，对赖氨酸抑制的敏感性是大肠杆菌DHPS(I50大约为1mM)的大约100倍(Yugari，Y和Gilvarg，C.(1962)生物化学生物物理学学报62：612-614；Galili，G.(1995)植物学报7：899-906)。
一些迹象表明在植物中，DHPS是赖氨酸合成的主要限速酶。一些具有反馈不敏感AK同工酶的植物物种突变体，发现超量产生游离苏氨酸，但赖氨酸水平只微量提高(Bright，S.W.J.等(1982)自然299：278-279；Cattoir-Reynaerts A.等(1983)生物化学生理学，Pflanzenl78：81-90；Dotson，S.B.等(1990)植物学182：546-552；Frankard，V.等(1992)，植物生理学99：1285-1293)。另一方面，一种反馈不敏感DHPS突变体烟草植物超量产生赖氨酸(Negrutiu，I.等(1984)，应用遗传学原理6：11-20；Shaver，J.M.等(1996)P.N.A.S.USA93：1962-1966)。表达来自大肠杆菌的反馈不敏感DHPS或AK的转基因植物报道了相似结果(Glassman，K.F.(1992)植物中氨基酸的生物合成和分子调节(由B.K.Singh等编辑)，217-228；Perl，A.等(1992)植物分子生物学19：815-823；Shaul，O.和Galili，G.(1992a)植物杂志2：203-209；Shaul，O.和Galili，G.(1992b)植物生理学100：1157-1163)。表达大肠杆菌DHPS的转基因植物超量产生赖氨酸，而那些表达大肠杆菌AK的转基因植物超量产生苏氨酸，并呈现出赖氨酸水平只微量提高。
欧洲专利申请No.429458揭示了一种提高植物中游离赖氨酸水平的方法，包括(a)将一个外源基因导入植物组织来源的细胞中，及(b)在细胞中表达此外源基因，其中此基因的第一个DNA序列编码DHPS，其通过内源性产生游离L-赖氨酸而对反馈抑制有抗性。所述外源基因可以包含附着于第一个DNA序列5，末端的第二个序列，其编码将DHPS定位于细胞叶绿体中的叶绿体转运肽(CTP)。所述植物产生的赖氨酸水平提高。欧洲专利申请No.EP93908395阐述了两个分离的DNA片段，包括一个编码对赖氨酸抑制不敏感的AK的片段，和另一个编码DHPS的片段，所述DHPS对赖氨酸抑制的敏感性比植物DHPS至少低20倍。据称在转化植物中，赖氨酸不敏感性AK导致产生高于正常的苏氨酸产量，DHPS导致产生高于正常的赖氨酸产量。
当分别由棒杆菌dapA基因和突变的大肠杆菌lysC基因编码的反馈不敏感细菌DHPS和AK酶，一起在转基因canola和大豆种子中表达时，获得相同结果。在转基因种子中观测到游离赖氨酸水平提高几百倍，而在只表达反馈不敏感AK的转基因种子中观测到的苏氨酸超量积累却由与DHPS共表达而阻止(Falco，S.C.等(1995)，生物/技术13：577-582)。美国专利申请No.577369l涉及四种嵌合基因，第一种编码细菌赖氨酸不敏感性天冬氨酸激酶(AK)，其可操纵地与植物叶绿体转运序列连接，第二种编码细菌赖氨酸不敏感性DHPS，其可操纵地与植物叶绿体转运序列连接，第三种编码富赖氨酸蛋白，第四种编码植物赖氨酸酮戊二酸还原酶，所有这些均可操纵地与植物特异性调节序列连接。所述转基因植物的种子比未转化的植物积累较高水平的赖氨酸或苏氨酸。
本发明提供了一种编码DHPS或其功能性片段的重组或分离的核酸或其功能性片段，该核酸有一突变导致至少一个单一氨基酸残基被半胱氨酸残基置换。存在一个额外的半胱氨酸残基例如可以导致不同的或额外的硫桥形成。结果影响酶的整体结构和/或柔性，优选的情况下导致赖氨酸反馈抑制的丧失。在本申请中，使用的DHPS基因对赖氨酸不敏感，是通过优选在野生型酶保守天冬氨酸残基的位点的至少一个定向氨基酸残基修饰，并再插入原来的细胞中进行脱敏的。在本发明的一个优选的实施方案中，置换位于或大约在DHPS的推定的赖氨酸结合位点进行，大肠杆菌中所述位点位于75-85位之间，置换优选在野生型酶保守的天冬氨酸残基的位点。
优选将突变的基因移回最适于其表达，活性和与其它成分相互作用的原始环境中。通过改变其原始宿主如酵母，真菌，植物或细菌中的酶中至少一个氨基酸残基而改变内源性酶，也远比用异源基因置换更为公众和消费者接受。
本发明尤其提供了突变的植物DHPS基因；编码来自各种植物物种的DHPS的基因已经克隆，如来自Nicotiana sylvestris(Ghislain，M.等(1995)植物杂志8：733-743)，大豆(SilkG.W.(1994)植物分子生物学26：989-993)，小麦(Kaneko，T.等(1990)生物化学杂志265：17451-17455)和玉米(Frisch，D.A.等(1991)分子基因遗传288：287-293)的DHPS基因。已经在寻求对赖氨酸敏感性降低的植物DHPS突变体，以使用突变的植物基因提高植物中游离赖氨酸的水平。直接选择烟草(Nicotiana sylvestris)UV照射的组织培养物以选择赖氨酸类似物S-2-氨乙基-L-半胱氨酸(AEC)，产生DHPS的赖氨酸抑制降低及叶片和种子中游离赖氨酸的浓度提高的显性突变(Negrutiu，I.等(1984)应用遗传学原理68：11-20)。然而，通过AEC选择没有获得其它具有改变的DHPS抑制的植物。烟草突变的DHPS基因示出在一个10个氨基酸长的区域内含有一个二核苷酸突变，所述区域预测是DHPS酶的赖氨酸结合位点(Ghislain，M.等(1995)植物杂志8：733-743)。突变导致保守的天冬氨酸残基变为异亮氨酸残基。通过UV照射获得将天冬氨酸转换为异亮氨酸所需的二核苷酸突变的变化是非常低的，这可以解释没有其它AEC抗性植物可以拯救这一事实。
另外两个研究小组试图以不同的方式突变参与植物DHPS酶赖氨酸结合的保守区域。Shaver等((1996美国科学院院报93：1962-1966)在大肠杆菌dapA-营养缺陷体中表达玉米DHPS cDNA，用诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理细胞，并在赖氨酸类似物AEC上选择细胞。他们发现一些单核苷酸变化导致氨基酸置换，引起赖氨酸抑制几乎全部丧失。然而，在马铃薯DHPS酶中改变的保守天冬氨酸残基未观测到突变。将含有这些突变的玉米DHPS基因的基因构建体导入玉米细胞培养物中，突变体DHPSl66ay与野生型细胞相比，转化的细胞中赖氨酸含量提高4倍(Bittel，D.C.等(1996)营养遗传学原理92：70-77)。美国专利申请No.5545545中也提及了这种突变的玉米DHPS基因的应用。
Silk和Mattews的小组((1997)植物分子生物学33：931-933)使用上述在烟草和玉米中的突变信息，改变大豆DHPS酶中保守的氨基酸。克隆的大DHPS cDNA通过PCR进行定位突变。一种突变体含有在104位密码子的一个单氨基酸取代(在烟草DHPS突变体中在相同位置保守的天冬氨酸转变为异亮氨酸)，在另一种突变体中在112位进行一个单氨基酸取代(在玉米DHPS突变体中相同位置保守的丙氨酸转变为缬氨酸)。第三种突变体含有这两种突变。当在大肠杆菌dapA-营养缺陷体细胞中表达时，所有突变体示出相同的赖氨酸不敏感性。没有关于这些突变体DHPS基因构建体在植物中的表达数据。
当对比一些细菌和植物DHPS酶的氨基酸序列时，一些保守的氨基酸序列变得清晰了(Shaver等((1996)美国科学院院报93：1962-1966)。在大肠杆菌中161位的不变的赖氨酸残基是结合丙酮酸所需的。另外，在DHPS酶的长度为10个氨基酸的节段中有非常保守的3个氨基酸残基，所述节段可能或推定参与赖氨酸结合。这个位点包含78位(在大肠杆菌中的位置)的保守的甘氨酸，80位的保守的天冬酰胺，和82位的保守的苏氨酸。根据本发明优选由半胱氨酸置换的一个氨基酸残基是80位(在马铃薯DHPS中是134位，在玉米中是158位)的保守的天冬酰胺。这个相同保守的氨基酸残基在烟草DHPS突变体中被突变，然而其转变为异亮氨酸而不是半胱氨酸。天冬酰胺或与该天冬酰胺邻近的氨基酸突变成半胱氨酸表观上导致提高转基因生物体的赖氨酸产量，然而令人惊奇地，直至目前克隆的野生型和突变的细菌，真菌或植物DHPS基因中，无一在(在野生型酶中)保守的天冬酰胺位或其周围发现半胱氨酸残基。
本发明还提供了一种选择转化的宿主细胞的方法，该宿主细胞包含一种编码DHPS酶或其功能片段的重组核酸或其功能片段，所述方法包括在存在S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸的情况下培养宿主细胞，并选择对S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸相对反馈不敏感的所需的宿主细胞。由于组合使用了随机定点诱变方法和反馈不敏感性的选择，本发明提供了一种极端不敏感的DHPS突变体，当例如在马铃薯植物中表达时，导致积累的游离赖氨酸含量占块茎中总游离氨基酸水平的30％多。在马铃薯中提高赖氨酸水平远比在例如烟草中困难，通过Perl等((1993)植物分子生物学19：815-823)所进行的实验可以得出这个结论，在这个实验中，在马铃薯中表达细菌DHPS(dapA)基因产生的赖氨酸积累远比在烟草中表达此基因所产生的赖氨酸少。
本发明还提供了编码马铃薯DHPS或其功能片段的重组的或分离的核酸或其功能片段，优选其中所述核酸与图2A所示核酸有至少60％，更优选至少75％，最优选至少90％的同源性。我们通过PCR非常特异性地将在所述马铃薯DHPS酶中134位的天冬酰胺残基诱变为所有其它可能的氨基酸残基。将以此方式获得的在134位含有所有可能的氨基酸残基的突变的DHPS克隆集合，在大肠杆菌dapA-营养缺陷体细胞中表达，并用赖氨酸类似物AEC选择赖氨酸不敏感性。待突变的保守氨基酸残基由我们选择，但是转变为其它氨基酸残基是通过在大肠杆菌dapA细胞中选择。
本发明还提供了一种驱动本发明提供的DHPS基因表达的启动子或其功能片段。本领域已知适当的启动子，如植物特异性启动子。尤其地，本发明提供了一种还包含组织特异性启动子或其功能片段的本发明的核酸。驱动本发明DHPS酶表达的优选的启动子是块茎特异性颗粒结合淀粉合酶(GBSS)启动子(Visser，R.G.植物分子生物学17：691-699，1991)。其它可用于驱动DHPS表达的块茎特异性启动子如是来自Solanum tuberosum的I型patatin启动子(Mignery，C.A.等(1988)基因62：27-44；Wenzler，H.C.等(1989)植物分子生物学12：41-50)，AGP酶启动子(Muller-Rober，B.等，植物细胞6：601-612，1994)，来自马铃薯的蛋白酶抑制剂II启动子(Keil，M.等(1989)EMBO杂志8：1323-1330)，或来自马铃薯的组织蛋白酶D抑制剂启动子(Herbers，K.等(1994)植物分子生物学26：73-83)。也可以使用其它组织特异性启动子，如来自马铃薯多聚半乳糖醛酸酶基因的果实特异性启动子(Grierson，D.等，核酸研究14：8595-8603)，或来自菜豆的种子特异性菜豆碱启动子(Sengupta-Gopalan，C.(1985)，美国科学院院报82：3320-3324)。其它可以使用的启动子是诱导型启动子，如衍生自豌豆rbcS基因的诱导型启动子(CoruzziG.等(1984)，EMBO杂志3：1671-1679)和来自水稻的肌动蛋白启动子(McElroy，D.等(1990)植物细胞2：163-171)。
启动子通常在每个基因的5’区域内发现。由于在高等植物中发生赖氨酸生物合成的细胞器是质体，因此基因构建体还包含一个编码转运肽的DNA序列，所述转运肽参与蛋白质从细胞溶胶中进入质体的转运(Van和Broeck，G.等(1985)自然313：358-363；Schreier，P.H.等(1985)EMBO杂志4：25-32)。叶绿体定向信号可以天然存在于源于植物的DHPS基因中，或当DHPS基因源自细菌，真菌或藻类时叶绿体定向信号被加入其中。融合于编码DHPS的DNA序列的编码叶绿体转运肽的DNA序列，在转化的植物细胞的胞质中表达产生融合的DHPS/转运肽嵌合蛋白，将其转运至质体，从而获得赖氨酸产量增加。
在本发明的一个具体的实施方案中，将编码转运肽的DNA序列的3’末端融合于编码DHPS的DNA序列中，将其融合于一转录终止DNA信号。此终止信号包含一个3’转录终止信号和一个mRNA聚腺苷酸化信号。可以使用在任何克隆的基因3’侧翼区的终止信号，所述基因例如是豌豆rbcS基因，菜豆菜豆碱基因，或衍生自Agrobacterium tumefaciens的Ti质粒的胭脂氨酸合酶基因。优选的终止子序列源自来自Agrobacterium tumefaciens的Ti质粒的章鱼氨酸合酶基因的3’侧翼区(图3；Greve，H.D.等(1983)分子应用遗传学杂志1：499-511)。
本发明还提供了一种包含本发明核酸的载体。例如，表达载体可以是高拷贝数pUC或pBR322衍生的质粒类型，可用于直接转化方法，如电穿孔，颗粒轰击或聚乙二醇介导的转化方法。或者，表达构建体包含在Ti质粒衍生的所谓二元载体(binary vector)如pBINPLUS(Van Engelen，F.A.等(1995)转基因研究4：288-290)上。Ti质粒可以在Agrobacterium tumefaciens中增殖，从中将插入在左右边界之间的DNA片段移至植物细胞中。
将表达载体导入宿主细胞中如真菌，细菌，藻类或植物细胞中，所述表达载体中克隆有本发明提供的基因构建体如嵌合的基因构建体。可以使用任何能转移DNA的转化方法进行导入；针对植物，已经开发了针对单子叶或双子叶植物细胞的方法。例如，通过电穿孔(Dekeyser，R.A.等(1990)植物细胞2：591-602)，通过PEG沉淀(Hayashimoto，A.等(1990)植物生理学93：857-863)，或通过颗粒轰击(Gordon-Kann，W.J.等植物细胞2：603-618)直接转移DNA而转化植物细胞，及通过用农杆菌感染将DNA移至植物细胞中。优选的方法是用Agrobacterium tumefaciens感染植物细胞(Horsch，R.B.等(1985)，科学227：1229-1231；Visser，R.G.F.(1991)植物组织培养手册B5(K.Lindsey编辑)：1-9，Kluwer科学出版社，荷兰)。本发明所用的马铃薯或草的方法也可用于改良许多其它农作物如转基因甜菜，胡萝卜，木薯，canola，紫花苜蓿，豆类，和禾本科植物如水稻，玉米，小麦，高粱，大麦，及草类如Lolium perenne。在本发明的一个优选的实施方案中，所述植物包含一个块茎，如马铃薯，从中通过本发明所述的组织特异性表达可以获得富集赖氨酸的植物。可以优先表达DHPS基因的其它特异性组织包括根和种子。
转化的植物例如是通过对卡那霉素或其它抗生素如潮霉素，或对除草剂如bialaphos或phosphinotricin的抗性加以选择的。
或者，具有高赖氨酸含量的所需转基因植物或转基因宿主细胞(从中可获得植物)，是通过在存在赖氨酸类似物如S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)的情况下培养而加以选择，而不用通过如上所述选择大肠杆菌宿主细胞时使用的对抗生素或除草剂的抗性加以选择。在一个优选的实施例中，用于驱动DHPS表达的组织特异性启动子在AEC选择期间被激活。例如，块茎特异性颗粒结合淀粉合酶(GBSS)启动子由高水平蔗糖诱导(Visser，R.G.F.等(1991)植物分子生物学17：691-699)，AGP酶启动子(Muller-Rober，B.等(1990)分子基因遗传学224：136-146)和I型patatine启动子(Wenzler，H.C.等(1989)植物分子生物学12：41-50)同样如此。其它组织特异性启动子如来自菜豆的种子特异性菜豆碱启动子，和来自玉米的玉米醇溶蛋白启动子是在AEC选择期间通过加入ABA诱导的(Muller，M.等(1997)植物杂志12(2)：281；Bustos，M.M.等(1998)植物分子生物学37(20)：265)。因此除了DHPS基因之外，不需导入标记基因。
本发明还提供了一种获得具有相对高赖氨酸含量的植物的方法，包括收获至少一部分本发明的植物。本领域已知收获农作物和获得特异性植物原料如种子，叶，茎，根，块茎或果实的方法，根据这些方法从本发明的植物中获得植物原料。本发明因此提供了一种提高赖氨酸含量相对较低的食物中赖氨酸含量的方法，包括将本发明的植物原料加入所述食物中。本发明还提供了富含赖氨酸的食物，而且还可使用本发明的富含赖氨酸的植物原料本身，如将富含赖氨酸的马铃薯，草类，种子或果实作为食物。在以下非限制性详述中进一步阐述了本发明。
详述实施例1：克隆马铃薯DHPS cDNA
使用标准方法进行DNA分离，亚克隆，限制分析和DNA测序分析(Sambrook，J.等(1989)分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版；Ausubel，F.M.等(1994)分子生物学通用方法，JohnWiley&Sons)。
为分离编码DHPS的Solanum tuberosum cv Kardal基因，在载体λTriplEx(Clontech)中构建制备自幼块茎的mRNA的cDNA文库。将用于通过异源杂交筛选cDNA文库的一个特异的600碱基对的DHPS DNA片段在分离自Arabidopsis thaliana的总RNA上，通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)克隆，随后与载体pMOSBlue(Amersham)连接，产生pAAP15。为此，使用基于Arabidopsis thalianaDHPS基因的序列的合成寡核苷酸(Vauterin&Jacobs，1994)。
选择来自与pAAP15杂交的cDNA的一个单噬斑，并对其1190bp的DNA插入体完全测序(图2A)。推断其编码DHPS酶。将包含完整编码序列的DNA片段，通过基于PCR的方法克隆入克隆载体pBluescript SK(+)(Stratagene)中，以使β-半乳糖苷酶-DHPS融合蛋白在lac启动子控制下可以在大肠杆菌中表达。所得质粒称为pAAP57。这个基因构建体能互补大肠杆菌AT997(Yeh等，1988)，这是一种DHPS缺陷菌株，使其能在没有DL-α，ε-二氨基庚二酸的情况下在基本培养基上生长。实施例2：产生赖氨酸不敏感性DHPS基因的诱变
为产生反馈不敏感DHPS，将pAAP57中相应于进化保守的氨基酸残基134(天冬酰胺)的核苷酸，通过基于PCR的方法随机改变换(QuickChange定位诱变，Stratagen)，产生编码在134位具有不同氨基酸残基的DHPS酶的质粒群。在用这些质粒群转化大肠杆菌AT997后，在存在1mM赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)的情况下，选择反馈不敏感性。挑取一些AEC抗性菌落，并对产生AEC抗性的质粒DHPS编码区进行测序(图2B)。将AAC转变为TGT或TGC导致在DHPS的134位的天冬酰胺相应转变为半胱氨酸残基。将编码突变DHPS的DNA片段(称为DHPS-134ncl)用于在马铃薯植物中表达。实施例3：具有突变的马铃薯DHPS基因的嵌合基因构建体
将来自pTriplex载体(pAAP42)的DHPS cDNA首先亚克隆在pCR-Script SK(+)(pAAP55)中，并从这个载体中将其作为用XbaI-EcoR消化的XbaI-EcoRI片段亚克隆在pBluescript SK载体(pAAP57)中，构建含有突变的DHPS基因的嵌合基因。用这个克隆进行诱变，产生pAAP57-134ncl克隆。在5’末端，将突变的DHPScDNA融合于800bp长的GBSS启动子片段的HindIII-SalI片段(Visser等，如前)。在突变的DHPS序列的下游，插入作为SstI-EcoRI片段的来自Agrobacterium tumefaciens的胭脂氨酸合酶基因的终止信号(Greve，H.D.等(1983)分子应用遗传学1：499-511)。将完整的嵌合基因亚克隆入pBINPLUS的HindII-EcoRI位点(Van Engelen，F.A.等(1995)转基因研究4：288-290)(pAAP105，图3)。实施例4：将嵌合基因导入马铃薯4.1转化马铃薯植物
将二元级载体pAAP105用于冻-融转化Agrobacteriumtumefaciens菌株AGLO(Hofgen，R.和Willmitzer，L.(1988)核酸研究16：9877)。接着将转化的AGLO用于接种马铃薯(Solanumtuberosum，Kardal的变种)茎外植体，如Visser所述(Visser，R.G.F.(1991)植物组织培养手册B5(K.Lindsey编辑)：1-9，Kluwer科学出版社，荷兰)。在含有卡那霉素的培养基上再生茎与根之后，将植物置于土壤中，并移至温室中。将从茎外植体中再生的植物(在没有卡那霉素的培养基上再生的)，用没有二元载体的农杆菌菌株AGLO处理作为对照。4.2在AEC上选择转化的植物细胞
除了以上(4.1)中如Visser所述在含有卡那霉素培养基上选择转化的植物细胞(Visser，R.G.F.(1991)植物组织培养手册B5(K.Lindsey编辑)：1-9，Kluwer科学出版社)，含有突变的DHPS基因的转化的植物细胞也可以在赖氨酸类似物AEC之上进行选择。在用转化的(AGI0)菌株接种例如马铃薯茎外植体之后，一般将外植体首先在没有AEC的培养基上培养。在短期例如12-20天，如16天后，将它们移至具有0.1mM AEC和足够浓度(例如5％)蔗糖的培养基中。当观测到第一个原基后，将外植体移至0.025mM AEC和蔗糖中。在没有AEC/蔗糖选择的情况下进行根诱导。4.3体外块茎形成
为在体外诱导块茎形成，将转化的马铃薯小植株的节段(大约4-5cm长)垂直置于固体Murashige和Skoog培养基中(Murashige，T.和Skoog，F.(1962)植物生理学15：473-497)，该培养基补加了10％(w/v)蔗糖，5TM BAP。将培养物在黑暗中保持在19℃。在14天之后，收获直径4mm的微块茎并分析游离赖氨酸和苏氨酸含量，及AK和DHPS活性。如下所述分析蛋白质含量和蛋白质组成。4.4：通过在氨乙基半胱氨酸(AEC)上选择具有高DHPS*表达的转化的嫩茎
除了通过农杆菌接种，用pAAP105构建体转化之后在卡那霉素上进行选择(见实施例4.1)，可以通过在含有赖氨酸类似物的培养基上生根选择转化的嫩茎。突变的DHPS基因可以用作选择标记，因为具有高含量赖氨酸的植物细胞可以在毒性赖氨酸类似物上生长，毒性赖氨酸类似物例如是氨乙基半胱氨酸(AEC)。由于反馈不敏感和所得高内源性赖氨酸水平，毒性类似物被稀释且不能结合突变的酶中的赖氨酸结合位点。
在用含有pAAP105的农杆菌菌株转化马铃薯茎外植体(见4.1)之后，将外植体置于没有卡那霉素的嫩茎再生培养基上。当出现嫩茎时，将它们直接置于含有0.06mM AEC和50g/l蔗糖(为诱导GBSS启动子)的生根培养基上，或首先在没有AEC的生根培养基上生根，随后再在含有0.06mM AEC和50g/l蔗糖的培养基中生根。切下能在这种AEC浓度生根的嫩茎，在含有0.1mM AEC和50g/l蔗糖的培养基上生根。耐受0.06和0.1mM AEC的生根标准如下：
—根应在嫩茎的切口处出现
—切口不应是黄褐色和腐烂的
—根尖应是淡色的。
使转基因植物块茎中具有高赖氨酸水平的转化频率为大约0.5％。实施例5：多年生黑麦草(Lolium perenneL)的DHPS修饰植物材料
来自不同的Lolium perenne栽培品种如栽培品种Moronda和Aurora的胚发生悬浮培养物，直接来自种子产生的成熟胚，或来自得自未成熟的花序节片的胚发生愈伤组织培养物，基本如Creemers-Molenaar等，植物科学63：167-176(1989)所述。对于直接方法，将种子在10％次氯酸中灭菌，漂洗及在无菌自来水中浸泡2天，并再次灭菌。在彻底漂洗后，从40个种子中割裂成熟胚，剁碎并移至在60ml塑料样品容器(Thovadex)中的5ml MS10培养基(即Murashige和Skoog基本盐和维生素，补加10mg/l 2，4-D和3％蔗糖，pH5.8)中。准备多份。胚发生愈伤组织是在用5％次氯酸灭菌和用无菌水漂洗后，在温室中生长的植物的未成熟的花序节片上诱导的。将花序的基底部分切成2个1-2mm长的节段，并置于用0.8％Daichin琼脂固化的MSt5培养基(即MS基本盐和维生素，补加0.4mg/l(＝额外的)维生素B1，5mg/l 2，4-D和3％蔗糖)上。在25℃在黑暗中培养。在4-8周后，从2-5个植物的外植体(即基因型)切下胚发生愈伤组织。将愈伤组织混合，用解剖刀剁碎，并将0.1g FW等分移至样品容器中5ml MS10培养基中。从此，同样处理这两个来源的培养物。将培养物在旋转混合器中在25℃在持续间接光照下(200-4001ux)温育(140revs./分)。
在10天后，将培养基用MS5(与MS10相同，但具有5mg/l2，4-D)置换。在培养物中一周加入一次2ml的新鲜培养基，直至终体积为15ml。接着，将培养物移至新的190ml透明的聚苯乙烯容器中(Greiner)，并加入5ml新鲜的培养基。为进行进一步的实验，选择良好增殖的，充分分散的培养物，并保持每周在20ml新鲜MS5培养基中传代培养2.5g FW材料。温育是在黑暗中在25℃以120revs./分持续摇动进行。
培养物的再生潜力通过将0.5-1.0g FW原料置于固体MS0(0mg/l 2，4-D；0.8％琼脂)上确定。在前两周在25℃在黑暗中培养后，将愈伤组织在后两周置于暗光(500-1000lux)中16小时/天。最后，在移至新鲜MS0中后，将它们置于4000lux，16小时/天条件下，并在4周后评估产生嫩茎的愈伤组织数目。转化
在传代培养3天后，将由对数期细胞组成的0.25g FW愈伤组织材料均匀分散于直径42mm的Whatman滤纸圆片(Schleicher&Schuell #604)表面。接着，将滤纸片通过加入0.5ml新鲜培养基而湿润，并将它们置于用0.2％Gelrite固化的培养基上，在25℃在黑暗中过夜。第二天，将携带多年生黑麦草悬浮材料的滤纸用于使用PDS1000-He粒子枪(BioRad)进行biolistic基因转移。将平均直径为1μm的0.375mg金粒用0.625μg质粒pAAP205的DNA包被，质粒pAAP205是实施例3中所述的质粒pAAP105的衍生物，其没有T-DNA边界，及nptII基因由hpt基因置换，以选择转基因多年生黑麦草细胞。为进行包被，将50μl(＝3mg)洗过的粒子通过涡旋彻底悬浮。接着，加入5μl质粒DNA(浓度为1μg/ul)和50μl 2.5MCaCl2，并涡旋10秒钟。然后，加入20μl 0.1M游离碱亚精胺，并通过涡旋2秒钟混合。将此混合物离心5秒钟，除去上清，之后加入250μl 96％的乙醇，保持在冰上直至使用。可以在1100-2200psi压力范围内进行轰击，但在此实施例中特别使用1800psi的压力，同时将含有滤纸的培养皿置于9cm处。在biolistics后，将滤纸在25℃在黑暗中在培养基上温育24小时，之后将它们移至选择培养基中。为进行选择，将滤纸首先置于用0.2％Gelrite固化的含有80mg/l潮霉素的MSt5培养基上；1周后将滤纸移至含有150mg/l潮霉素的选择培养基中。迄今为止，这基本如前所述(Van der Maas等，植物分子生物学24：401-405(1994))。4周后，将活性生长的愈伤组织分别移至新鲜的选择培养基中(150Hyg)。在这个第二次选择循环后，将存活的愈伤组织置于补加50mg/l潮霉素的再生培养基上。由此获得转基因多年生黑麦草植物并在8周后收获。将它们保持在含有一半浓度MS0(Creemers-Molenaar等，植物科学57：165-172(1988))的试管中，接着通过PCR和Southern杂交分析进行分子学定性，及通过实施例6-9所述的氨基酸，酶活性和蛋白质分析进行生物化学定性，以证实新导入的基因构建体存在并表达。实施例6：分析转基因植物中游离氨基酸含量
将组织(0.5-1.0g)用研钵和研杵在含有1mM二硫苏糖醇的2ml50mM Pi缓冲液(pH7.0)中均质。加入正亮氨酸作为内部标准。将游离氨基酸通过用5ml水∶氯仿∶甲醇混合物(3∶5∶12)提取而部分纯化。收集水相并将剩余物再提取两次。在通过冻干至3ml浓缩后，将20μl样品通过使用阳离子交换层析柱进行HPLC分析，及在570和440nm检测的氨基酸的柱后茚三酮衍生化(BIOCHROM 20，Amersham Pharmacia Biotech)。图4示出了27个未转化的马铃薯植物和含有突变的DHPS基因构建体pAAP105的30个马铃薯植物块茎中的以总氨基酸的百分比表示的赖氨酸水平。赖氨酸水平从对照的野生型块茎中的2-2.5％提高至转化的块茎中的最大30％，说明赖氨酸是“丰富”氨基酸而不是“低水平”必需氨基酸。实施例7：分析转基因植物中DHPS酶活性
将微块茎或成熟块茎用研钵和研杵在等体积的含有2mMEDTA，1.4％抗坏血酸钠，1mM苯甲基磺酰氟和0.5Tg/ml亮抑蛋白酶肽的冷的100mM Tris-HCl，pH7.5中均质。在离心5分钟后(16000g，4℃)，收集上清。使用Yugari和Gilvarg的O-氨基苯醛(O-ABA)方法(Yugari，Y和Gilvarg，C.(1965)生物化学杂志240：4710-4716)，测定DHPS活性。正如所期望的，当分别对比对照组(未转化的)及转化的马铃薯块茎的野生型和突变的DHPS活性时，转化的AEC敏感性降低，甚至即使在AEC提高的水平下也示出DHPS活性。实施例8：转基因植物的DNA分析
基因组DNA分离自生长于温室中的马铃薯植物的块茎。将冻干的组织在液氮中研磨，并加入至15ml提取缓冲液(100mMTris-HCl，pH8，500mM NaCl，50mM EDTA和10mMβ-巯基乙醇)和2ml 10％SDS中。在65℃温育20分钟后，加入5ml的5M KAc，并在冰上温育15分钟。在离心后，过滤上清，并用15ml异丙醇沉淀，将沉淀再悬浮于400μl TE中，并用1μg RNAse处理。接着将DNA用CTAB(N-十六烷基-NNN-三乙基溴化铵)纯化，通过加入400μl的CTAB缓冲液(200mM Tris-HCl pH7.5，50mM EDTA，2mM NaCl和2％CTAB)提取，在65℃温育15分钟。在用800μl氯仿/异戊醇24∶1提取后，将DNA用800μl异丙醇沉淀。将沉淀用70％乙醇洗并再悬浮于TE中。在将DNA用限制酶消化后，将DNA在琼脂糖凝胶上按大小分级，并印迹于Hybond-N+(Amersham)上。从DHPScDNA产生随机引物标记的探针(从337至811位，图2)。将滤膜在65℃在10％硫酸葡聚糖，1％SDS和1M NaCl中杂交16-20小时，接着在55℃和60℃用2×SSC，0.1％SDS洗，在65℃用0.1×SSC，0.1％SDS洗。实施例9：转基因植物在RNA水平的表达分析
根据Ausubel等(1994)所述的方法，从在温室中生长的马铃薯植物块茎中分离总RNA。将RNA在甲醛琼脂糖凝胶上按大小分级，并印迹于Hybond-N+(Amersham)上。将印迹短时染色以保证存在等量RNA。从DHPS cDNA产生随机引物标记的探针(从337至811位，图2)。将滤膜在65℃在10％硫酸葡聚糖，1％SDS和1M NaCl中杂交16-20小时，接着在55℃和60℃用2×SSC，0.1％SDS洗，在65℃用0.1×SSC，0.1％SDS洗。
附图简述：
图1：天冬氨酸家族生物合成途径图式。只示出了主要的关键酶。曲线箭头代表由终产物氨基酸的反馈抑制；DHPS，二氢吡啶二羧酸合酶；HSD，高丝氨酸脱氢酶；TDH，苏氨酸水解酶。
图2：(A)编码分离自马铃薯的DHPS的核酸片段。产生的氨基酸序列用单字母代码表示。(B)突变的DHPS(DHPS-134nc)的赖氨酸结合结构域的核酸序列及衍生的氨基酸序列。
图3：质粒pAAP105的T-DNA区域的示意图，涵盖了在颗粒结合淀粉合酶启动子(P-GBSS)控制下的突变的DHPS编码区(DHPS)，和在胭脂氨酸合酶启动子(P-NOS)控制下的作为选择标记的新霉素磷酸转移酶11编码区(NPT11)；I-NOS，胭脂氨酸合酶转录终止子。
图4：产生自不同的，独立的转化体或对照植物块茎的游离赖氨酸浓度(μmol/g鲜重)。将植物在温室的罐中生长直至成熟。在收获后，将块茎在分析之前干燥一周。将大约10g的块茎材料在50ml的1mM二硫苏糖醇(DTT)溶液中研磨。将2ml所得悬浮液用甲醇∶水∶氯仿混合物(12∶3∶5)提取。在浓缩至0.5ml后，将25μl在Biochrom20(Amersham-Phamacia)基于锂的离子交换氨基酸分析系统上进行分析。在研磨前在样品中掺加L-正亮氨酸，以使其校正。
图5：一些转化的马铃薯植物的Southern印迹DNA分析。从一些独立转化的和未转化的马铃薯植物中分离基因组DNA，并用HindII或HindII和BamHI组合消化。在分离和印迹后，将DNA片段与放射标记的DHPS探针杂交。未转化的对照植物(C)只示出内源性DHPS片段的杂交。在这些条带的上部，转化的植物示出一条(泳道7)或多条杂交条带(例如泳道5)，表明插入了一或多拷贝的GBSS-DHPS*构建体。C：对照植物；M：分子大小标记。
图6：一些转化的马铃薯植物块茎的Northern印迹RNA分析。从一些转化的植物(泳道1-15)和对照的未转化的植物(泳道C)的块茎中分离总RNA。将RNA通过凝胶电泳分离并印迹于尼龙膜上。将印迹与放射标记的DHPS DNA探针杂交。来自未转化植物的对照RNA示出内源性DHPS RNA杂交(泳道C)。来自一些转化植物的RNA示出与背景DHPS杂交相等的杂交(例如泳道4和9)。大多数转化植物示出与表达的外源性DHPS*RNA强杂交(例如泳道10-12)。
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Claims (26)

1.一种编码二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)或其功能片段的重组或分离的核酸，或其功能片段，其具有一导致至少一个单氨基酸残基被半胱氨酸残基置换的突变。
2.权利要求1的核酸，其中所述氨基酸置换位于或大约在DHPS的推定的赖氨酸结合位点，所述位点在大肠杆菌中位于大约75-85位。
3.权利要求1或2的核酸，其中所述单氨基酸残基包括天冬酰胺残基。
4.权利要求1-3任一项的核酸，其中在马铃薯DHPS中所述天冬酰胺残基位于134位。
5.权利要求1-4任一项的核酸，其中所述DHPS是细菌，真菌，藻类或植物来源的。
6.权利要求5的核酸，其中所述植物是马铃薯。
7.一种编码马铃薯DHPS或其功能片段的重组或分离的核酸或其功能片段。
8.权利要求7的核酸，其中所述核酸与图2A所示核酸有至少90％同源性。
9.权利要求1-8任一项的核酸，还包含一种组织特异性启动子或其功能片段。
10.权利要求9的核酸，其中所述启动子衍生自块茎特异性颗粒结合淀粉合酶(GBSS)启动子。
11.一种包含权利要求1-10任一项的核酸的载体。
12.一种包含权利要求1-10任一项的核酸或权利要求11的载体的宿主细胞。
13.权利要求12的宿主细胞，包括植物细胞。
14.权利要求13的宿主细胞，其中所述植物细胞来自马铃薯。
15.一种选择转化的宿主细胞的方法，所述宿主细胞包含编码二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)或其功能片段的重组核酸或其功能片段，所述方法包括在存在S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸的情况下培养宿主细胞，并选择对S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸有相对反馈不敏感性的所需宿主细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述核酸包含权利要求1-10任一项的核酸。
17.用权利要求15或16的方法获得的宿主细胞。
18.一种包含权利要求14或17的宿主细胞的植物。
19.权利要求18的植物，包括农作物。
20.权利要求18或19的植物，包括块茎。
21.一种来自权利要求20的植物的块茎。
22.一种获得具有相对高赖氨酸含量的植物材料的方法，包括收获权利要求18的植物的至少一部分。
23.通过权利要求22的方法获得的植物材料。
24.一种提高赖氨酸含量相对较低的食物或饲料的赖氨酸含量的方法，包括在所述食物或饲料中加入权利要求23的植物材料。
25.根据权利要求24的方法获得的食物或饲料。
26.包含权利要求24的植物材料的食物或饲料。
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