JPH11506007A

JPH11506007A - 種子中の必須アミノ酸の蓄積を増加させる方法

Info

Publication number: JPH11506007A
Application number: JP8536664A
Authority: JP
Inventors: アール．ビーチ，ラリー; シー．ターツィンスキー，ミッチェル
Original assignee: パイオニアハイ−ブレッドインターナショナル，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-05-31
Filing date: 1996-05-30
Publication date: 1999-06-02
Also published as: AU5956196A; HUP9900864A2; CA2222673A1; WO1996038574A1; CN1195377A; EP0828845A1; HUP9900864A3; AR002175A1; US6127600A

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物の種子中の必須アミノ酸のレベルを増大させ、それにより種子の栄養価を増強させるための方法を提供する。この方法は、アミノ酸の代謝経路を操作して、標的遊離アミノ酸の増大した供給源を提供する工程、および付随的に、タンパク質に結合した標的アミノ酸の蓄積が存在するように、標的アミノ酸を含有するタンパク質をコードする予備選択された遺伝子を過剰発現する工程を包含する。従って、補足的なタンパク質シンクが産生される。本発明は、種子中のメチオニン、リジン、およびスレオニンのレベルを増大させることにおいて特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】種子中の必須アミノ酸の蓄積を増加させる方法発明の分野本発明は、動物の栄養の分野に関する。詳細には、本発明は、飼料として使用される種子の栄養含有量を増大させる方法に関する。背景飼料処方は、動物に、成長するために重要な必須の栄養を提供するために必要とされる。しかし、作物植物は、一般に、乏しい栄養的品質の食物供給源にされる。なぜなら、これらは単胃動物に必須であるが、単胃動物が合成することができない低比率の数種のアミノ酸を含有するからである。長年、研究者は、繁殖計画を通して重要な作物の種子のタンパク質における必須アミノ酸のバランスを改善しようと試みてきた。種子の貯蔵タンパク質およびこれらのタンパク質をコードする遺伝子の発現についてより多くが知られるにつれて、そして形質転換系がより種々の植物について開発されるにつれて、種子のタンパク質の栄養的品質を改善することについての分子アプローチはより慣習的なアプローチに対する代替物を提供し得る。従って、特異的なアミノ酸レベルを、バイオテクノロジーを介して、所定の作物で増強し得る。１つの代替法は、飼料の補充を回避するのに十分なレベルで、好都合のアミノ酸組成の異種タンパク質を発現することである。例えば、硫黄アミノ酸に富む多くの種子タンパク質が同定されている。このようなタンパク質の良好な発現に対する鍵は、種子特異的プロモーターを有する効率的な発現カセットに関する。遺伝子制御領域がmRNAの高レベルの合成を指示しなければならないだけでなく、このmRNAが安定なタンパク質に翻訳されなければならない。作物植物由来のしばしば限定されている、動物の栄養に必要である必須アミノ酸には、メチオニン、スレオニン、およびリジンがある。繁殖、変異選択、および／または作物植物中に蓄積される貯蔵タンパク質の組成の変更によるこれらの遊離アミノ酸のレベルを増大させる試みは、最小限の成功しかおさめていない。通常、トランスジェニック貯蔵タンパク質の発現は、総種子アミノ酸の十分な増加をもたらさなかった。ファゼオリン(phaseolin)促進ブラジルナッツ2S発現カセットは、有効なキメラの種子特異的遺伝子の一例である。しかし、たとえブラジルナッツタンパク質が総メチオニンおよび結合メチオニンの量を増大し、それにより栄養価を改善するとしても、種子中に蓄積するメチオニンの総量に関しては閾値の制限があるようである。メチオニンの供給源およびメチオニンの補充が上記のダイズを利用する食餌に必要とされるので、種子は不十分なままである。所望のアミノ酸を含有するタンパク質のレベルを変化させることによる特異的なアミノ酸レベルの増強に対する代替物は、アミノ酸生合成の改変である。組換えDNAおよび遺伝子移入技術は、アミノ酸生合成経路における鍵となる段階を触媒する酵素活性を変化させるために適用されてきた。Glassman、米国特許第5,25 8,300号；Galiliら、欧州特許出願第485970号；(1992)；（本明細書中にその全体が援用される）。しかし、種子中のアミノ酸レベルの改変は、これらのアミノ酸を組み込むタンパク質のレベルの変化と常には相関しない。Burrowら、Mol. G en. Genet.;第241巻、431〜439頁；（1993）；（本明細書中にその全体が参考として援用される）。葉および種子中の遊離リジンレベルの増大は、DHDPS変異についての選択により、または植物中のE. coli DHDPSを発現することにより得られている。しかし、一般に、種子中の遊離アミノ酸のレベルは、単に総アミノ酸含有量の少部分であるにすぎないので、これらの増大は、種子の総アミノ酸含有量を有意に増大するには不十分であった。 lysC遺伝子は、リジンおよびスレオニンによるフィードバック阻害に対して感受性が減少した、変異細菌性アスパラギン酸キナーゼである。この遺伝子の発現は、メチオニンおよびスレオニン生合成のレベルの増大をもたらす。しかし、種子特異的発現カセットを用いたこの遺伝子の発現は、種子中の総スレオニンおよびメチオニンレベルの６〜７％のみの増大をもたらしている。Karchiら、The Pl ant J.;第３巻；721〜７頁;(1993)；その全体が本明細書中に参考として援用される、を参照のこと。従って、種子の栄養価に対する最小限の影響、および必須アミノ酸の補充がなお必要とされる。上記のことに基づくと、植物の種子中の必須アミノ酸レベルを増大させる方法に対する必要性が存在する。先行技術に見られ得るように、先のアプローチは、飼料の栄養含有量を有意に増強するための遊離アミノ酸および結合アミノ酸の両方のレベルの不十分な増大を導いてきた。100％（現存レベルの倍加）まで必須アミノ酸のレベルを増大させる必要性が存在する。これが達成されれば、補充はもはや必要ない。従って、本発明の目的は、植物の種子を遺伝的に改変して、このような植物の種子中の必須アミノ酸であるスレオニン、メチオニン、およびリジンのレベルを増大させるための方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、同一種子の野生型種よりも高レベルの必須アミノ酸である、スレオニン、メチオニン、およびリジンを含有する食物および／または飼料のための種子を提供することである。本発明のさらなる目的は、必須アミノ酸のレベルを２倍にし、したがって飼料補充の必要性を回避するような食物および飼料のための種子を提供することである。要旨本発明は、植物の種子を遺伝的に改変して、必須アミノ酸であるスレオニン、メチオニンおよびリジンのレベルを増大させるための方法を提供する。本発明の方法は、標的遊離アミノ酸集団の増大した供給源を提供すること、付随して産生される、補足的なタンパク質シンクとの組み合わせ（この結果は、タンパク質の結合した標的アミノ酸の予期しない蓄積の増大である）に関する。この方法は、１）スレオニン、メチオニン、および／もしくはリジンのような必須アミノ酸のレベル、ならびに／または利用可能性の増大を提供するための種子中のアミノ酸代謝経路の操作；および２）スレオニン、メチオニン、および／またはリジンのような必須アミノ酸を含む種子タンパク質をコードする内在性または異種のいずれかの予備選択された遺伝子の過剰発現を包含する。シンクとして作用する、付随して合成された選択されたタンパク質への組み込みのための供給源としての十分な遊離標的アミノ酸の合成は、飼料中の必須アミノ酸補充の必要性を排除する。図面の簡単な説明図１は、アスパラギン酸ファミリーの生合成経路の図を示す。発明の詳細な説明本明細書中で使用される「シンク」は、豊富な量の標的化アミノ酸を含有し得る安定に蓄積したタンパク質を意味する。本明細書中で使用される「供給源」は、タンパク質生合成に利用し得る遊離アミノ酸を意味する。これらは生合成経路を介して新たに合成される。本明細書中で使用される「遊離アミノ酸」は、改変されていないアミノ酸またはそれらの合成の直接の結果であるアミノ酸を意味する。本明細書中で使用される「結合したアミノ酸」は、改変された（例えば、ペプチドおよびタンパク質に組み込まれた）アミノ酸を意味する。本明細書中で使用される「標的アミノ酸」は、過剰に生産されるべきアミノ酸を意味する。本明細書中で使用される「選択されたタンパク質」は、上昇したレベルの標的アミノ酸を含有するタンパク質、またはその遺伝的等価物を意味する。本明細書中で使用される「遺伝的に改変された」は、形質転換法により導入された核酸構築物を安定に組み込んでいる植物細胞を意味する。用語「野生型」は、非形質転換植物細胞をいう。「内在性」タンパク質は、植物中のその天然の位置で通常見出される本来のタンパク質をいう。さらに、本発明は、本発明の種々のDNA構築物を調製および使用する方法を包含する。記載された核酸配列で形質転換された植物、種子、および微生物もまた本発明の実施態様である。タンパク質含有量が本方法により改善され得る種子を産生する好ましい植物は、ダイズ、キャノーラ（canola）、トウモロコシ、ヒマワリ、コムギ、オオムギ、エンバク、キビ、イネ、サトウモロコシ、およびライムギを含むがこれらに限定されない。種子は、飼料あるいは食物として直接的に使用され得るか、またはさらなるプロセシングが起こり得る。本発明の実施において、最も好ましい植物種子は、Glycine maxである。本発明に従って、得られる種子中の必須アミノ酸の増大した蓄積を伴う、トランスジェニックダイズ植物の産生のための簡単、迅速、かつ信頼性のあるプロセスが提供される。この方法は遺伝子型非依存的であり、そして以前に使用された系よりも実質的な、予期されない改善を示す。アミノ酸の代謝経路の操作組換えDNAおよび遺伝子移入技術における近年の進展は、遺伝子の単離、配列決定、操作、および生物への再導入を可能にする。例えば、Plant Biotechnolog y:Commercial Prospects and Problems，(1993)、Prakashら編、Oxford & IBH P ublishing Co.，New Delhi，India; Molecular Biology and Genetic Engineeri ng of Yeasts，(1992)，Heslotら、CRC Press，Inc.,USA; およびMolecular Clo ning:A Laboratory Manual，(1989)，Sambrookら、Cold Spring Harbor Laborat ory Press，Cold Spring Harbor，New York；（すべて本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと。これらの技術の使用は、最終的に特定の代謝物の濃度の変化に導く代謝経路の遺伝的操作を可能にする。Baileyら、「代謝の操作の科学のために」、Science;第252巻；1668-1675頁；(1991)；Muller -Roberら、「トランスジェニックジャガイモにおけるADP-グルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖貯蔵塊茎を導き、そして塊茎形成および塊茎貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす」The EMBO Journal; 第11巻(4)；1229-1238頁； (1992)；Sonnenwaldら、「サイトゾル、液胞、またはアポプラストのいずれかにおいて酵母由来のインベルターゼを発現するトランスジェニックタバコ植物：スクロース代謝およびシンク／供給源相互作用の研究のための強力な道具」、The plant Journal，第1巻(1)、95-106頁；(1991); およびTarczynskiら、「トランスジェニックタバコにおける細菌性mtlD遺伝子の発現は、マンニトールの産生および蓄積を導く」、Proc. Natl. Acad. Sci.，第89巻、2600-2604頁；（199 2)；（全てが本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと。植物の種子中のスレオニン、メチオニン、およびリジンの代謝のための代謝経路を変化させ得る標準的な分子アプローチを本明細書中以下に記載する。これらの制限されないアプローチの目的は、これらの必須アミノ酸の供給を増大させることである。標的酵素をコードする遺伝子の過剰発現このアプローチは、通常は調節され、かつ代謝の分岐点で速度を制限する酵素である、所望の標的酵素の濃度を増大させる。例えば、Van Schaewen，A.ら、EM BO J.; 第９巻、3033-3044頁；(1990)；およびDickinson，C.D.ら、Plant Physi ol. ; 第95巻；420-425頁；(1991)（両方が本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと。例えば、遺伝子の転写を駆動するために用いられるプロモータの強さを増大させることにより、および／または遺伝子およびその調節エレメントのコピー数を増大させることにより、標的酵素をコードする遺伝子の増大した発現が達成され得る。強力な遺伝子発現およびその遺伝子の複数のコピーは、mRNAおよび標的酵素のレベルの増大を導く。標的酵素の濃度の増大は、速度-制限段階を介する代謝の流れを増大する。例えば、シスタチオニンγシンターゼ(「CS」)の増大は、メチオニン生合成の増大と相関している。例えば、Thompsonら、「Lemnaにおけるメチオニン生合成」Plant Physiol.; 第69巻；1077-1083頁；(1982)；（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。 CSは、メチオニン生合成の第一段階を触媒する（図１を参照のこと）。見かけの生理学的な基質は、O-ホスホホモセリンであり、従って、CSは、この基質に対して、スレオニン生合成に関与する酵素であるスレオニンシンターゼと競合する。CSレベルはメチオニンレベルと反比例的に相関し、これは、メチオニンまたは関連する化合物による調節を示している。CSの過剰発現は、CSを介する流動の増大を導くはずであり、これは、メチオニン生合成の増大を可能にする。増大したスレオニン合成のために、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ (「MAT」)を、過剰発現し得る。MATの直接産物である、S-アデノシルメチオニン (「SAM」)は、インビトロでスレオニンシンターゼ(「TS」)を強力に活性化することが実証されている。MATの発現の増大は増大したSAMの合成を導き、これはより高い濃度のTSを活性形態にさせる。増大したTS活性は、スレオニン生合成の増大を導く。シンクタンパク質の同時発現のため、本発明により意図されるように、遊離スレオニンのレベルは標的タンパク質合成の間は十分に高くはなく、アスパラギン酸キナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性にネガティブに影響を及ぼすか、または異化活性を促進する。増大したリジン合成のために、ジヒドロジピコリネートシンターゼ(「DHPS」) の過剰発現が有効である。DHPSの基質である、アスパラギン酸セミアルデヒドは、ホモセリン生合成およびDHP生合成に対する前駆物質であり、分岐点中間体である。DHPS活性の増大は、DHP生合成および従って、リジン生合成に向かうより多くの変換を可能にする。シンクタンパク質の同時発現は、標的タンパク質合成の間、遊離リジンのレベルを十分に低くするはずであり、その結果、DHPSまたは AK-HSD活性はネガティブな影響を及ぼされない。標的酵素をコードする遺伝子の過小発現標的酵素の濃度の減少を、例えば、アンチセンス構築物を用いることによって達成する。例えば、Temple，S．J.ら、「センスおよびアンチセンス方向でのアルファルファグルタミンシンセターゼ遺伝子の導入によるタバコにおけるグルタミンシンセターゼ遺伝子発現の調節：分子分析および生化学分析」Molecular an d General Genetics，第238巻（2-3）；315-325頁；（1993）；（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。アンチセンス遺伝子構築物の発現は、酵素合成のための翻訳可能なmRNAの減少を導き、それにより標的酵素濃度の減少および標的酵素での代謝の流れの減少を導く。例えば、スレオニンシンターゼ(「TS」)は、スレオニン生合成の最初に掛かり合う段階を触媒する。TSの生理学的な基質はO-ホスホホモセリンであり、従って TSはこの基質に対してCSと競合する。TSの過小発現はTSを介した流動を減少し、従ってCSにさらなる基質（O-ホスホホモセリン）を提供し、それによりメチオニン生合成に向かう代謝の流れを増大する。さらに、TSの減少したレベルは、スレオニン生合成および濃度の減少を導き、これは次いで、AK-HSDにおけるこの代謝物によるフィードバック阻害のレベルを減少し、増大したメチオニン生合成をさらにもたらす。従って、炭素および代謝エネルギーはメチオニン生合成に向かい、スレオニン生合成から離れるように向けられる。スレオニンにとって、DHPSおよびCSの過小発現は、先に議論されたものと同一の理由のために有効である。例えば、CSの減少したレベルは、TSに対するO-ホスホホモセリンの利用可能性を増大させ、それによりスレオニン生合成が増大する。さらに、TSのレベルの減少は、スレオニン生合成、およびスレオニンによるAK -HDS活性の阻害を減少させる。なぜなら、遊離スレオニンレベルが比較的低いからである。これらの作用はリジン（およびメチオニン）生合成を増大する。MAT はTS活性に強力にポジティブな影響を有するので、その合成の抑制は活性なTSのレベルを減少し、そしてその効果はTSの過小発現と類似している。別の代謝分岐点の生成主要な分岐点から離れた代謝の流れを向け直すことがときに所望される。ここで、１つの代謝物はより直接的なルート、または新規の代謝物の産生への、数種の競合する経路の間で共有される。これは、標的酵素をコードする単一の遺伝子を発現することにより行われ得るか、または複数の酵素をコードする複数の遺伝子の発現を含み得る。例えば、Tarczynski，M．C.ら、「トランスジェニックタバコ中の細菌性mtlD遺伝子の発現はマンニトールの産生および蓄積を導く」Proc . Natl. Acad. Sci. USA; 第89巻；2600-2604頁；(1992)；（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。例えば、O-ホスホホモセリンは、高等植物中のCSに対する唯一の生理学的な基質でない場合、第１のものである。メチオニン生合成において最初に掛かり合う酵素(CS)およびスレオニン生合成において最初に掛かり合う酵素(TS)は、O-ホスホホモセリンについて競合する。メチオニン生合成を増大するために、ホモセリンを、ホモセリンマロニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現により、マロニルホモセリンに向けて部分的に迂回させ得る。O-ホスホホモセリンに加えて、マロニルホモセリンは、CSに対する基質であるがTSに対する基質ではなく、従って、基質の増大したレベルは、CSが利用可能であるはずであり、このことはメチオニン生合成の増大を導く。標的酵素の生化学的特性の変化標的酵素をコードする遺伝子の改変を、このアプローチに従って行い、この酵素の生化学的特徴を変化させる。例えば、米国特許第5,367,110号、Galiliらに対して1994年11月22日発行（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。酵素の生化学的特性を変化させるための数種の公知の方法が存在する。これらの方法には部位特異的変異誘発が含まれる。例えば、Dengら、「独特の部位を排除することによる事実上すべてのプラスミドの部位特異的変異誘発」Anal. Bioc hem. ; 第200巻、81-88頁；(1992)；（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。変化の結果に依存して、代謝の流動は標的酵素を介して増大または減少され得る。例えば、Shaulら、「Escherichia coliの感受性の減少した変異アスパラギン酸キナーゼを発現するトランスジェニックタバコ植物におけるスレオニン過剰産生」Plant Phys.; 第100巻、1157-1163頁；(1992)；およびBrzovicら、「アスパラギン酸によるグルタミン酸109の置換は、Salmonella Typhimurium 由来のトリプトファンシンターゼバイエンザイム(Bienzyme)複合体中のβサブユニットの基質特異性および触媒活性を変化させる」Biochemistry; 第31巻、1180 -90；(1992)；（両者は本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。 AK-HSDは、アミノ酸のアスパラギン酸ファミリーの生合成における第１段階を触媒する。この酵素は、リジンおよびスレオニンにより、通常フィードバック調節されている。AK-HSDの変異形態は、E. coli 中および植物中の両方で選択されている。これらの生物は、遊離のスレオニン、およびメチオニン、リジン、およびイソロイシンを過剰産生することが示されている。結合したスレオニン、メチオニン、リジン、またはイソロイシン含有量にはほとんど変化がないか、または変化が全くない。例えば、Galiliら（本明細書中上記で引用）を参照のこと。予備選択された遺伝子の過剰発現本発明は、予備選択されたタンパク質を優先的に発現するための植物種子の遺伝的改変をさらに包含する。例としては、メチオニンに富むタンパク質、システインに富むタンパク質、リジンに富むタンパク質、グリシンに富むタンパク質、トリプトファンに富むタンパク質、およびチロシンに富むタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される「富む（rich）」は、平均的なタンパク質よりも高い割合のアミノ酸を含有することを意味する。本明細書中で使用される「プロモーター」は、通常そのコード配列に対して上流（５′）にある遺伝子中のDNA配列をいい、これは、RNAポリメラーゼ、およびプロモーターの転写に必要な他の因子に対する認識を提供することによりコード配列の発現を制御する。好ましいプロモーターは、予備選択されたタンパク質を特異的に種子において発現させ、種子でない器官における任意の潜在的な有害な効果を回避するプロモーターである。このようなプロモーターは当業者に周知である。種子特異的プロモーターの例としては、高度に調節された様式で種子中の種子貯蔵タンパク質を発現する、種子貯蔵タンパク質のプロモーターが含まれるが、これに限定されない。Thompsonら、BioEssays; 第10巻、108-113頁；(1989)；（本明細書中にその全体が参考として援用される）。双子葉植物の種子においてタンパク質の発現のための特に使用される数種の種子特異的プロモーターとしては、マメβファゼオリン、ナピン（napin）、βコングリシニン（conglycinin）、およびダイズレクチンが含まれる。単子葉植物については、トウモロコシ15 kD ゼイン、22 kDゼイン、γ-ゼイン、ワクシー(waxy)、シュルンケン(shrunken)１、グロブリン１、およびシュルンケン２プロモーターは、ペプチドの発現を生じるために特に有用である。当業者は、形質転換のために選択された植物において、予備選択されたタンパク質の増大したレベルのための構築物を提供する、他のプロモーターもまた認識する。大いに好ましい実施態様において、予備選択されたタンパク質は、ブラジルナッツタンパク質(BNP)のようなメチオニンに富む2S種子貯蔵タンパク質である。A ltenbachら、Plant Mol. Biol.；第８巻；239-250頁；（1987）；（本明細書中にその全体が参考として援用される）。このタンパク質をコードする天然のまたは構築されたDNAまたはRNA配列を、植物ゲノム中に遺伝子を安定に組み込む任意の形質転換の方法により、植物細胞中に導入する。これは、ウイルスベクター、エピソームベクター、シャトルベクター、Tiプラスミドベクターなど（これらはすべて周知の手順に従う）のような種々のベクターを含み得る。Sunら、欧州特許出願EP第295,959号；（1991）；（本明細書中にその全体が参考として援用される）。「ベクター」は、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージのようなレプリコンであり、これに、別のDNAセグメントが結合されて、結合したセグメントの複製をもたらし得るか、または細胞宿主へのその導入を可能にし得る。タンパク質に関して本明細書中で用いられる場合、用語「異種」は、タンパク質をコードする遺伝子または遺伝子フラグメントが、それが最終的に発現される植物の種のゲノム以外の１つ以上の供給源から得られることを意味する。供給源は天然であり得る。例えば、遺伝子を、細菌、酵母、真菌など、または異なる植物種のような、生存している材料の別の供給源から得ることができる。供給源はまた合成でもあり得る。例えば、遺伝子または遺伝子フラグメントは化学的合成によりインビトロで調製され得る。予備選択されたタンパク質に関して本明細書中で用いられる場合、用語「発現する」は、このタンパク質をコードする遺伝子が細胞のゲノム中に安定に組み込まれ、その結果、この遺伝子によりコードされる産物（例えば、ブラジルナッツタンパク質(BNP)のようなメチオニンに富むタンパク質）が細胞内で産生されることを意味する。例えば、BNPの発現から生じる新規の植物は、0.5％、および好ましくは、少なくとも２％の抽出可能な種子BNPレベルを含有する。予備選択されたタンパク質をコードする核酸配列の特性は変化し得、そして好ましい実施態様は有利であり得るが全く必須ではないものとして当業者に認識される、多くの特徴を記載する。これらは、細胞へ配列を導入し、そしてタンパク質の発現を生じるための、特定の構築物およびベクターの選択を包含する。当業者は、過度の実験をすることなく、選択された細胞系において予備選択されたタンパク質の発現に適切な発現カセットを構築し得る。本発明の本質は、予備選択されたタンパク質のレベルである；従って、核酸配列のさらなるコピーは、通常、内在性タンパク質の合成の増大した阻害をもたらす。例のため、そして限定のためではなく、さらなるタンパク質である、10kDaゼインおよびアルファルファ由来の2Sアルブミンが、予備選択された種子タンパク質としてBNPタンパク質の代わりに置換され得ることを当業者は容易に認識する。例えば、それぞれ、Mol. Gen. Genet.(1988)第211巻、477-484頁；およびJ. E xp. Bot. 、第41,233巻、1541-7頁、1990；（これらの両方が本明細書中にその全体が参考として援用される）。予備選択されたタンパク質の選択が、タンパク質のアミノ酸組成および種子中に蓄積するその能力に基づくことを、当業者は認識する。これは、種子貯蔵タンパク質（タンパク質中の指定されたアミノ酸の含有量を増大するための改変を伴うかまたは伴わない、2S、7S、および11Sタンパク質）の全てのクラスを含む。アミノ酸は、植物に付加価値特性を生じるためのその栄養価、ならびに指定された内在性タンパク質に対する利用可能性を制限するシンクとしてのその目的について選択され得る。本発明に従って使用可能なタンパク質配列に対する適切な供給源の例は、植物、特に高等植物である。付加価値特性ならびに内在性タンパク質の合成を制限するための供給源に対して望ましいアミノ酸としては、メチオニン、システイン、グリシン、リジン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される「植物」は、全植物、植物の部分、植物細胞、または植物細胞の群のいずれかをいう。本発明の方法で使用され得る植物のクラスは、単子葉および双子葉植物の両方を含む、形質転換技術の影響を受けやすい、種子を結ぶ高等植物のクラスと一般的に同じ位広範である。本発明に従う植物の形質転換は、植物分子生物学の当業者に公知の本質的に任意の種々の方法で行われ得る。これらには、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびアグロバクテリウム媒介性DNA移入が含まれるが、これらに限定されない。形質転換後、再生は、通常形質転換プロセスから全植物を得る工程を含む。形質転換プロトプラストまたはカルス細胞株のような組織培養物から植物を再生するための技術は、当業者に公知である。例えば、Phillipsら、Plant Cell Tissu e Organ Culture;第１巻、123頁；(1981)；Patterson,KE.およびN.P．Everett，Plant Sci.; 第42巻；125-132頁;(1985)；Wrightら、Plant Cell Reports; 第６巻；83-89頁；(1987)；Barwaleら、Planta; 第167巻；473頁；(1986)；（全て本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと。適切な方法の選択は当業者の範囲内である。本明細書中に詳述される本発明の実施の例は、ダイズ植物および双子葉植物中で実施可能な発現ベクターに特に関する。これらの実施例のためのモデル系として、主としてダイズを選択した。なぜなら、形質転換された個々のダイズ細胞からダイズ植物を再生するための現在の能力が、ある意味では現在当該分野で公知であるからである。本明細書中で利用される発現ベクターは、組織培養物中および全植物中の両方で、多くの双子葉植物の細胞において明白に操作が可能である。従って、本明細書中で開示される本発明は、双子葉植物種において実施可能であり、個々の植物細胞を形質転換し、そして形質転換植物カルスから再生され得、そして予備選択された種子タンパク質を発現する双子葉植物種において完全で、インタクトな植物を達成する。現在再生可能でない種については、このような再生に対する技術が開発された場合に、本発明は完全に実施可能である。さらに、種子タンパク質を含むキメラ発現ベクターもまた公知であり、そして単子葉植物の細胞において、少なくとも組織培養物中において実施可能であることを実証する文献に記載されている。次いで、任意の予備選択された種子タンパク質が任意の単子葉植物種子において発現され得るように、これらの植物を再生するための技術が完成された場合、これらのベクターがまた全単子葉植物において実施可能であることが予想されることが理解される。従って、本発明は、双子葉植物と同様に単子葉植物についても適用可能である。従って、本発明の実施は、イネ、トウモロコシ、コムギ、およびオオムギのような作物植物を、ほとんど改変を加えずに改善するために使用され得る。このような実施態様の例は、種子のピューロチオニン含有量を減少させ、そしてそのリジン含有量を増大させるための、オオムギまたはコムギ細胞へのαホルドチオニン(hordothionin)の高リジン誘導体の導入である。チオニンは、オオムギ、コムギ、および他の植物種の内胚乳に存在する小さな抗菌性タンパク質である。Florackら、Plant Mol. Biol.; 第24巻、83-96頁；(1 994)；（本明細書中にその全体が参考として援用される）。天然のαホルドチオニンはアルギニンおよびリジン残基に富み、それぞれ５残基（10％）を含有する。このタンパク質の数種の誘導体が作製されており、これらは、真菌に対する毒性のより少ない化合物を産生するために、他のアミノ酸がリジンで置換され、そしてリジンが有意により富化されている(29％リジン)。ピューロチオニンはまた、コムギおよびGramineaeの数種の他の種の内胚乳中の、小さな、リジンに富むタンパク質である。Wada,K．Plant & Cell Physiol 2 3(8)、1357-1361；(1982)；（本明細書中にその全体が参考として援用される）。ピューロチオニンは醸造酵母に対して致死であり、そして結果として、高レベルのこれらのタンパク質を含有するオオムギまたはコムギは高品質のビールを作製するために使用され得ない。しかし、本発明に従って、高リジンαホルドチオニン、またはリジン富化のために設計され、そして微生物に対する毒性が減少した別の遺伝子操作されたチオニンが、ピューロチオニンのレベルを減少させ、そしてオオムギ、コムギ、または他のイネ科の植物のリジン含有量を増大させるために使用され得る。リジン富化残基は、醸造プロセス後、飼料として販売され得る。上記のものは、本発明の範囲の１つの記述であり、そして当業者は、本発明に適用可能な植物の改善の多くの他の例を認識する。本発明は、以下のより詳細な実施例を参照することによりさらに理解され得る。この実施例は種々の適用を例示するが、本発明の範囲を制限することは決して意図されない。実験アミノ酸経路の変化 AK遺伝子の種子特異的発現を達成するため、および上記酵素を色素体に対して標的化するために、Karchiら、「細菌性の感受性を減少させたアスパラギン酸キナーゼの種子特異的発現は、トランスジェニックタバコにおける種子スレオニンおよびメチオニンの産生を増大させる」、The Plant Journal；第３巻（5）；72 1〜727頁；（1993）；（本明細書中で参考としてその全体を援用する）に記載される手順を用いる。ファゼオリン構築物を使用する。メチオニンに富む種子貯蔵タンパク質を用いたGlycine maxの形質転換植物の形質転換ダイズ（Glycine max）の種子（Pioneer品種9341）を、ガラス鐘内に放出させた塩素ガスに曝露することにより表面滅菌した。ガスを、3.5mlの塩酸（34〜37 ％ w/w）を100mlの次亜塩素酸ナトリウム（5.25％ w/w）に添加することにより生成させた。曝露を、容積が約１立方フィートの容器内で16〜20時間行なった。表面を滅菌した種子をペトリ皿中で室温で保存した。植物成長調節因子を含まない、Gamborgによる1/10強度の寒天凝固培地（最少有機物を含有するB5基礎培地、Sigma Chemical Co.、カタログ番号G5893、0.32g/L；スクロース0.2％ w/v、および2-〔N-モルフォリノ〕エタンスルホン酸（MES）3.0mM）に種子を播き、そして日長16時間で、約20mEm2S1の冷白蛍光照明のもとで28℃で培養することにより発芽させた。３または４日後、種子を共培養のために調製し得る。種皮を除去し、そして伸びている根を子葉の３〜４mm下で除去した。数個のペトリ皿のそれぞれにおいて調製した種子を10個維持した。プラスミドの構築キメラのメチオニンに富むタンパク質遺伝子（BNP）を１コピー含むプラスミドp12GUSBN17を構築するため、プラスミドpARC12（Prosen D.E.およびR.B．Simp son、Biotechnology第５巻、966〜971頁；（1987）；（その全体を本明細書中で援用する））を用いた。これはアグロバクテリウムのバイナリーベクター系の一部であり、そして植物細胞の選択マーカーとしてキメラ遺伝子であるノパリンシンターゼ／ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIを含む29.5kbのプラスミドである。プラスミドpB1221（Jefferson、R.A.、Plant Mol ．Bio．Reporter；第５巻（4）、387〜405頁；（1987）；（その全体を参考として本明細書中で援用する））から得られたキメラ遺伝子、CaMV35S/βグルクロニダーゼをPARC12に挿入して、プラスミドp12GUS-15を得た。プラスミドpD3-8-12（Altenbachら、Plan t Mol ．Biol. ：第13巻；513〜522頁；（1989）；（その全体を参考として本明細書中で援用する））は、ベクターpTZ19U中にBNP遺伝子を含む。Hind IIIを用いてpD3-8-12プラスミドを切断し、そしてプラスミドp12GUS-15のHind III部位に挿入した。得られたプラスミドp12GUSBN17はサイズが約36kbであり、BNP遺伝子を１コピー含み、そして細菌宿主に、アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性を付与する。メチオニンに富むタンパク質遺伝子を４コピー含むプラスミドを構築するため、出発点として、プラスミドpD3-8-12を用いた。Eco R1 Hind III，およびXmn 1 を用いた消化により、pD3-8-12からBNP遺伝子を切り出した。フラグメントの末端をDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて平滑にし、そしてこのキメラ遺伝子を含む３kbのフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、Sm a 1で消化し、そして仔ウシ腸ホスファターゼで処理したプラスミドpD3-8-12に連結した。得られたプラスミド（これをpD3-8-12-2Xと呼ぶ）は、タンデムに並んだキメラのメチオニンに富むBNP遺伝子を２コピー含んでいた。このキメラ遺伝子を４コピー含むプラスミドを作製するため、Eco R1およびHi nd IIIを用いてpD3-8-12-2Xプラスミドを消化し、そして末端をDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて平滑にした。キメラ遺伝子を２コピー含む６kb のフラグメントを単離した。このフラグメントを、Sma Iで消化し、そして仔ウシ腸ホスファターゼで処理したプラスミドpD3-8-12-2Xに連結した。得られるプラスミドは、pD3-8-12-4Xである。次いで、このキメラBNP遺伝子をTiプラスミドベクターpARC12に挿入した。Eco R1およびHind IIIを用いた消化によりpD3-8-12-4Xから12kbフラグメントを切り出し、そしてこれをEco R1およびHind IIIで消化したpARC12に連結した。得られたプラスミドp12-4Xは、tDNAのボーダーの間にBNP遺伝子を４コピー、および植物細胞における選択のためのキメラのノパリンシンターゼネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子を含む。次いで、このプラスミドを三親交配によりE. Coli からAgrobacterium tumefaciens LBA 4404株に移入した。得られた細菌のアイデンティティーをサザンブロット分析により確認した。 Agrobacterium Tumefaciens LBA4404/p12GUSBN17 およびp12-4Xの調製テトラサイクリン1.0mg/mlを含有する最少Ａ培地中で対数増殖期まで増殖させた、バイナリープラスミドp12GUSBN17（DP1816、１コピーのBNP配列）またはp12 -4X（DP1813、４コピーのBNP配列）を保有するAgrobacterium tumefaciens LBA 4404株の一晩培養物をプールし、そして550nmにおける光学密度測定を行なった。沈降させた際、各チューブ中に1.0〜2.0×1010個の間の細胞が採集されるように、十分な量の培養物を15mlのコニカル遠心分離チューブに入れた（ここで、O. D.550 1.0＝1.4×109細胞／ml）。沈降は、6000gで10分間遠心分離することにより行なった。遠心分離後、上清を静かに別の容器に移し、そして接種物が必要となるまで（しかし１時間未満）、チューブを室温に保った。形質転換バッチで接種を実施し、その結果、各種子のプレートを新たに再懸濁させたアグロバクテリウムのペレットで処理した。一度に１つずつ、ペレットを20mlの接種培地中に再懸濁した。接種培地は、B5塩（G5893）3.2g/L；スクロース2.0％ w /v；6-ベンジルアミノプリン（BAP）44mM；インドール酪酸（IBA）0.5mM；アセトシリンゴン（AS）100mMからなり、そして10mMのMESを用いてpH5.5に緩衝化されていた。再懸濁をボルテックス攪拌によって行なった。次いで、調製した種子を入れたペトリ皿に接種物を注ぎ、そして外科用メスを用いて子葉節を浸軟させた。これを、２個の全子葉を保存しながら、茎頂を通る縦の切断により、種子を半分に分割することにより達成した。次いで、外科用メスを用いて取り外すことにより、茎頂を２等分したもの２つからそれぞれの子葉をちぎり取った。次いで、外科用メスを用いて対称軸に沿って繰り返し刻み目をつけることにより、子葉節を浸軟させた。軸から離れた（abaxial）側まで外植片側を通して完全に切断しないように注意した。およそ５分間で20個の外植片を調製し、次いで室温で30 分間、攪拌せずにインキュベートした。この時間の間にさらなるプレートを調製した。30分後、Gelrite（Merck & Co.，Inc.）0.2％ w/vで凝固させた同一の培地のプレートに外植片を移した。外植片を、軸側（adaxial）を上にし、かつ培地の表面の高さで埋め込んで、約20mEm²S¹の冷白蛍光のもとで３日間22℃で培養した。培養および選択３日後、外植片を液体対抗選択培地に移動させた。対抗選択培地は、B5塩（G5 893）3.2g/L；スクロース2.0％ w/v；BAP 5.0mM；IBA 0.5mM；バンコマイシン20 0mg/ml；セフォタキシム（cefotaxime）500mg/mlからなり、そして３mMのMESを用いてpH5.7に緩衝化されていた。10個の外植片を各ペトリ皿中で一定のゆるやかな旋回攪拌をしながら室温で４日間洗浄した。対抗選択培地を４回交換した。次いで、外植片を寒天凝固選択培地に移した。選択培地は、B5塩（G5893）3.2 g/L；スクロース2.0％ w/v；BAP 5.0mM；IBA 0.5mM；硫酸カナマイシン50mg/ml ；バンコマイシン100mg/ml；セフォタキシム30mg/ml；チメンチン（timentin）3 0mg/mlからなり、3.0mMのMESを用いてpH5.7に緩衝化されていた。選択培地を、0 .3％w/vのSeaKem寒天を用いて凝固させた。外植片を軸側を下にして培地に埋め込み、28℃で、日長を16時間とし、60〜80mEm²S¹の冷白蛍光照射を用いて培養した。２週間後、旋回振とう機上で外植片を再度液体培地で洗浄した。この時、洗浄を、50mg/mlの硫酸カナマイシンを含む対抗選択培地中で一晩実施した。翌日、外植片を寒天凝固選択培地に移した。外植片を軸側を下にして再度培地に埋め込んだ。さらに２週間、前と同じように培養した。再生選択培地上で１ケ月後、形質転換された組織は、白くなった、より不健康な組織の背景に対して、再生中の組織が緑色領域として見えるようになった。緑色領域のない外植片を捨て、緑色領域を有する外植片を伸長培地に移した。伸長培地はB5塩（G5893）3.2g/L；スクロース2.0％ w/v；IBA 3.3mM；ジベレリン酸1.7mM ；バンコマイシンl00mg/ml；セフォタキシム（cefotaxine）30mg/ml、およびチメンチン30mg/mlからなり、3.0mMのMESを用いてpH5.7に緩衝化されていた。伸長培地を、0.2％ w/vのゲルライト（gelrite）を用いて凝固させた。外植片を軸側を上にして埋め込み、そして前と同じように培養した。この培地上で培養を続け、２週間ごとに新鮮なプレートに移した。シュートが0.5cmの長さになった時、基部で切り取り、そして13×100mmのテストチューブに入れた発根培地中に配置した。発根培地はB5塩（G5893）3.2g/L；スクロース15g/L；ニコチン酸20mM；ピログルタミン酸（PGA）900mg/L、およびIBA 10mMからなっていた。この培地は、 3.0mMのMESを用いてpH5.7に緩衝化されており、そして0.2％ w/vのGelriteを用いて凝固されていた。10日後、IBAまたはPGAを含まない同じ培地にシュートを移した。シュートを根づかせ、そして上記と同じ環境条件下でこれらのチューブ中に保持した。根系が十分確立された時、植物容器（con）に入れた滅菌土壌混合物（ICN Bio medicals，Inc.、カタログ番号26-720および1-02）に苗木を移した。温度、光周期、および光強度は前と同じままであった。これらの条件下で、再生体は強健な、（小さいが）ほぼ正常の植物になった。これらの根系が再度十分確立された時、植物容器の一角を切り取り、そして環境チャンバーまたは温室内で植物を漸次寒気にさらして丈夫にした。最後に、土壌混合物中で植物を鉢植えし、そして成熟するまで（種子を結ぶまで）温室中で栽培した。トランスジェニックダイズの栽培、繁殖、および収穫同一品種（9341）の非形質転換植物および形質転換植物由来の種子を、Iowaで、1992年の春に播き、そして1992年の秋に収穫した。最大繁殖のため、１つ以上の10.5フィートの列で栽培している間、各個々の系統を分離しておいた。BNP遺伝子１コピーを挿入した形質転換事象に由来する系統をBNP1Xと呼ぶ。４コピーを挿入した系統をBNP4Xと称する。 1992年秋に収穫したBNP4X種子のほとんどをプエルトリコにおいて繁殖させた。この種子を、1992年12月に系統によって播き、1993年３月に系統によって収穫した。繁殖させ、収穫した種子の一部を収量試験およびさらなる研究室試験のために送り返した。残りを、プエルトリコにて1993年３月に系統によって再度播き、そして1993年６月に収穫した。全体の第２サイクル繁殖は約２エーカーであるか、または１系統あたり0.1Ａより少し広かった。本明細書中に言及した全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的に、かつ個々に示されて参考として援用されている場合と同程度に本明細書中で参考として援用される。上記の実施態様に関する変化は当業者の能力の範囲内にあり、そしてそのような変化は以下の請求の範囲に記述する本発明の範囲から逸脱するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ターツィンスキー，ミッチェルシー. アメリカ合衆国アイオワ 50265，ウエストデスモニー，オフィスパークロードナンバー106 1201

Claims

【特許請求の範囲】１．植物の種子中の標的アミノ酸のレベルを増大させるための方法であって：ａ）該アミノ酸の代謝経路を操作して、該標的遊離アミノ酸のさらなる供給源を提供する工程；およびｂ）タンパク質に結合した標的アミノ酸の蓄積が存在するように、該標的アミノ酸を含有するタンパク質をコードする予備選択された遺伝子を過剰発現することにより、補足的なシンクを付随して産生する工程、を包含する、方法。２．前記標的アミノ酸が、リジン、メチオニン、およびスレオニンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。３．前記代謝経路が、鍵となる酵素の過剰発現、鍵となる酵素の過小発現、代謝分岐点の生成、または酵素の生化学的特性の変化により操作される、請求項２に記載の方法。４．前記種子が、ダイズ、キャノーラ、トウモロコシ、ヒマワリ、コムギ、オオムギ、エンバク、キビ、イネ、サトウモロコシ、およびライムギからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。５．前記代謝経路が、鍵となる酵素の過剰発現、鍵となる酵素の過小発現、または酵素の生化学的特性の変化により操作される、請求項４に記載の方法。６．前記種子が、ダイズ、トウモロコシ、サトウモロコシ、キャノーラ、およびヒマワリからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。７．前記種子が、ダイズ、トウモロコシ、およびキャノーラからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。８．前記種子が、ダイズ種子からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。９．前記代謝経路が、酵素の生化学的特性の変化により操作される、請求項７に記載の方法。１０．前記メチオニンのレベルを、ａ）ブラジルナッツタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する工程；およびｂ）鍵となる酵素の過剰発現、鍵となる酵素の過小発現、または酵素の生化学的特性の変化により前記種子中で増大させる、請求項６に記載の方法。１１．前記メチオニンのレベルを、酵素の生化学的特性の変化により前記種子中で増大させる、請求項１０に記載の方法。１２．植物の種子であって、該種子の種の野生型と比較して、標的アミノ酸の増大したレベルを発現するように遺伝的に改変されており、該改変が：ａ）該アミノ酸の代謝経路を操作して、該標的遊離アミノ酸の増大した供給源を提供する工程；およびｂ）タンパク質に結合した標的アミノ酸の蓄積が存在するように、該アミノ酸を含有するタンパク質をコードする予備選択された遺伝子を過剰発現することにより、補足的なシンクを付随して産生する工程、を包含する、種子。１３．前記標的アミノ酸が、メチオニン、リジン、およびスレオニンからなる群から選択される、請求項１２に記載の種子。１４．前記代謝経路が、鍵となる酵素の過剰発現、鍵となる酵素の過小発現、代謝分岐点の生成、または酵素の生化学的特性の変化により操作される、請求項１３に記載の種子。１５．前記種子が、ダイズ、キャノーラ、トウモロコシ、ヒマワリ、コムギ、オオムギ、エンバク、キビ、イネ、サトウモロコシ、およびライムギからなる群から選択される、請求項１４に記載の種子。１６．前記種子が、ダイズ、トウモロコシ、サトウモロコシ、キャノーラ、およびヒマワリからなる群から選択される、請求項１５に記載の種子。１７．前記種子が、ダイズ、トウモロコシ、およびキャノーラからなる群から選択される、請求項１６に記載の種子。１８．前記種子がダイズである、請求項１７に記載の種子。１９．前記メチオニンのレベルを、ａ）ブラジルナッツタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する工程；およびｂ）鍵となる酵素の過剰発現、鍵となる酵素の過小発現、または酵素の生化学的特性の変化により前記種子中で増大させる、請求項１８に記載の種子。２０．前記代謝経路が、酵素の生化学的特性の変化により操作される、請求項１９に記載の種子。