BG98042A - Ген,кодиращ семенен протеин с високо съдържание на сяра и метод за повишаване на серни амино киселини в растенията - Google Patents

Abstract

Новите фрагменти на нуклеинови киселини за суперекспресия на високо метиониново съдържание в протеина на растенията трансформират растения, по-специално зърнени, за суперекспресия на протеиновото съдържание в семената или листната маса. Особено значимо е повишаването на сярното съдържание на зърнени растения като жито и соя.

Description

Животинсткият хранителен пазар по целия свят, включващ жизнените ресурси, домашните птици, водното стопанство и домашните животни, възлиза на 475 милиона тона. В САЩ 180 милиона тона се изразходват за царвица / Zea mays L. /, възлизащи на около 61% и храни от соя / Glycine max L. /за около 10% от общото количество. Царвицата и соевите продукти са и най-значителния елемент на външната търговия. Тези две кул тури са агрономически добре адаптирани към много райони на

-2CALU, машинният парк и приспособленията за жьнене, складиране и обработка са широко достъпни в САЩ. Тъй като царвицата, соята и други култури, използувани за храна, се продават напоследък като предмети за потребление, съществува идеална възможност за повишаване на хранителното качество на протеините и така да се добави стойност за америкенските фермери и да се засили външната търговия.

Човешката храна и храната за животни, произлизащи от много зърна, имат липса на серните амино киселини, метионин и цистеин, които са нужни за животинскато хранене. При царвицата, серните амино киселини са третите най-лимитиращи амино киселини, след лизина и триптофана, за хранителните нужди на много животни. Нуждата от соева храна, която е богата на лизий и триптофан, за добавка към царвицата при храненето на животните е ограничена от ниското съдържание на серни амино киселини на зърното. Така, повишаването на съдържанието на серни амино киселини, както при царвицата, така и при соята, би подобрило хранителната стойност на смеските и да намали нуждата от други добавки, чрез прибавяне на по-скъпия метионин.

Усилията за подобряване съдържанието на серни амино киселини на културите, чрез развъждане на растения, срещнаха ограничен успех на лабораторно ниво и никакъв успех на търговско ниво. Царвична мутантна линия, притежаваща висока концентрация на метионин на невредимите зърна, бе изолирана от царвични клетки култивирани чрез селекция на прорасналите, в присъствие на инхибиращи концентрации на лизин и треонин / Phillips et al. (1985) Cereal Chem. 62:213-218/. Въпреки това, още не са изолирани от тази линия и пуснати в търговската мрежа, агрономически приемливи култури. Соеви клетъчни линии, с повише-5на вътреклетъчна концентрация на метионин, са изолирани чрез селекция при култивиране в присъствие на метионин / Madison and Thompson (1988) Plant Cell Reports 7:472-476/, но не бяха регенерирани растения от тези линии.

Амино киселинното съдържание на зърната се определя предварително чрез резервните протеини, които се синтезират по време на развитието на зърното и които служат като главен хранителен резерв, следващ покълваното. Количеството на протеин в зърната варира от около 10% от сухото тегло при житните, до 20 - 40% от сухото тегло при бобовите. При много семена, резервните протеини възлизат на около 50% и повече от общия протеин. Поради тяхното изобилие, растителните зърнени резервни протеини бяха сред първите изолирани. Но само наскоро, въпреки това, бяха определени амино киселенните последователности на някои от тези протеини, с помощта на молекулярно генетични техники. Тези техники осигуриха, също така, информация за генетичните сигнали контролиращи зърно-специфичната експресия и вътреклетъчното насочване на тези протеини.

Идентифицирани са голям брой богати на сяра растителни зърнени резервни протеини, а съответстващите им гени са изолирани. Ген от царевицата, кодиращ 15kD зеин протеин, съдържащ 11% метионин и 5% цистеин / Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chern. 261:6279-2684 / и ген за 10 kD зеин протеин, съдържащ 25% метионин и 5% цистеин, са били изолирани / Kirihara et al. (1988) Mol. Gen. 21:477-484; Kirihara et al. (1988) Gene 71:559-370/. Изолирани са два гена от грах за зърнени албумини, съдържащи 8% и 16% цистеини / Higgins et al. (1986) J. Biol. Chern. 261:11124-11150/. Изолиран е ген от бразилски орех, кодиращ за зърнен 2S албумин, съдържащ 18%

-4метионин и 8% цистеин / Altenbach et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8:239-250/. Последно, е изолиран и ген от ориз, кодиращ за 10 kD зърнен проламин, съдържащ 19% метионин и 10% цистеин / Masumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123-130 /.

Известни са множество доклади относно експресията на гените на зърнените резервни протеини в трансгенетичните растения. 2S албумина от бразилски орех, с високо съдържание на сяра, е експресиран в семена от тарансформиран тютюн, под контрола на регулаторните последователности на гена на фазеолин резервен протеин от фасул. Протеина ефикасно се подлага на процесинг от 17 kD предшественик към 9 kD и 3 kD субединици на зрялия нативен протеин. Акумолирането на богатия на метионин протеин в семената на тютюна се изразява в над 30% увеличение на нивото на метионин в семената / Altenbach et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:513-522 /. Химеричните гени, свързващи кодиращите области на гените на царевичните зърнени резервни протеини за 19 и 23 kD zeins на 35S промотора на вируса на мозайката по карфиола,се експресират в много ниска степен в семената, както в корените и листа, на трансформирения тютюн / Schernthaner et al. (1988) EMBO J. 7:1249-1255 /. Заместването на едносемеделните регулаторни области промотор и транскрипцонен тер минатор/ с двусемсделните зърно специфични регулаторни области, се изразява в ниско ниво на зърно-специфичната експресия на 19 kD зеин в трансформирана петуния / Williamson et al. (1988) Plant Physiol. 88:1002-1007 / и тютюн / htani et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:117-128 /. При друг случай бе открита висока степен на зърно-специфична експресия на 15 kD богат на сяра зеин в трансформиран тютюн и сигналната последователност на едносемеделния предшественик е също коректно процесирана / Hoffman et al.

-5-5(1987) EMBO J. 6:3213-3221 /.

C цел да се повиши съдържанието на серни амино киселини на зърната, съществено е да се изолира ген(и), кодиращи за зърнени резервни протеини, богати на съдържащите сяра метиоиин и цистеин. Метионина е предпочитан пред цистеина, тъй като метионина може да бъде превърнат в цистеин, но цистеина не може да бъде превърнат в метионин от повечето животни. Желателно е резервния протеин да бъде съвместим с растението от културата-мишена. Желателно е освен това, протеина да произлиза от източник, обикновено считан за сигурен като животинска храна.

СЪДЪРЖАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Открит е начин за повишаване на съдържанието на серни амино киселини в зъррната. Чрез използуване на гена за зеин с високо съдържание на Сяра /HSZ=3BC/, могат да бъдат създадени химерични гени и да бъдат използувани за трансформация на различни растителни култури, за повишаване на съдържанието на серни амино киселини в зърната или листата. Специфично, един аспект от настоящето изобретение е фрагмент от нуклеинова киселина, включващ нуклеотидна последователност, кодираща HSZ прекурсора / предшественика / на царевичния резервен протеин,съответстващ на последователността, показана на SEQ ID N0:2, или всяка нуклеотидна последователност, съществено хомоложна на посочената. Други аспекти на изобретението са тези фрагменти на нуклеинови киселини, кодиращи зрялия HSZ протеин / SEQ ID N0:3: /и кодиращи Домена за Високо съдържание на Метионин / ДВМ=НМБ / на HSZ царевчния резервен протеин / SEQ ID N0:4: /.

Друго възможно осъществяване на настоящето изобретение са химеричните гени, способни да бъдат експресирани в транс

-6формиряни растения, включващи всеки от предхождащите фрагменти на нуклеинови киселини, операционно свързани към регулаторните последователности. Предпочитани са тези химерични гени, които оперативно свързват фрагмента на нуклеиновата киселина към специфичните за зърното промотори, активни в листата на царевицата или соевите зърна.

Друг аспект на настоящето изобретение са химеричните гени, способни да бъдат експресирани в трансформирани микроорганизми, за предпочитане Е. coll, за произвеждане на протеини с високо съдържание на сяра.

Все пак, друг аспект на настоящето изобретение представляват клетките-гостоприемиици, трансформирани от химеричн гени, за произвеждане на протеини с високо съдържание на сяра.

Друг възможен вариант за осъществяване на настоящето изобретение са трансформираните растения и получените от тях семена / зърна /, съдържащи кой да е от предхождащите фрагменти нуклеинови киселини. Предпочитат се растения и получените от тях семена, селекционирани от групата състояща се от царвеица, соя, рапично семе, тютюн и ориз.

Допълнителни аспекти на изобретението включват микроорганизмите, трансформирани с описаните химерични гени.

Друг възможен вариант за осъществяване на изобретението представляват методите за увеличаване на съдържанието на серни амино киселини в растенията и метод за получаване на растения с висок капацитет за продуциране на протеини с високо съдържание на сяра, чрез Agrobacterium tumefaciens. Към изобретението се включват, също така, методи за продуциране на протеин, богат на амино киселини, съдържащи сяра, в микро организмите .

-ΊКРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ И ОПИСАНИЕ НА

ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ

Изобретеното може да бъде по-добре разбрано от следното подробно описание, от прилежащите фигури и от описанието на последователностите, които съставят част от настоящото описание. Описанието на последователностите съдържа трибуквения код за амино киселините, както е дефиниран в 37 С. F. R. 1.822, които са включени тук за справка.

SEQ ID NO : 1 показва нуклеотидна последователност ( 2123 Ър ) на царвеичния HSZ ген и предсказаната амино киселинна последователност на първичния транслационен продукт. Нуклеотиди 753 - 755 представляват предполагаемия кодон иницииращ транслацията, а нуклеотиди 1386-1388 представляват предполагаемия кодон за завършване на транслацията. Нуклеотиди 1-752 и 1389-2123 включват регулаторни секвенции, съответно.

SEQ ID N0 : 2 показва предпочитана нуклеотидна последователност, съгласно изобретението. Представлява ДНК фрагмент от 635 Ър /двойки бази/, включващ единствено HSZ кодиращата област, която може да бъде изолирана чрез смилане с рестрикционна ендонуклеаза, използувайки Neo 1(5’ -CCATGG ) за ХЬа I ( 5’ -TCTAGA ). Два Neo I сайта, които присъстват в нативната HSZ кодираща област, се елеминират чрез сайт-насочен мутагенез, без промяна на кодираната амино киселинна последователност.

SEQ ID N0 : 3 показва предпочитана нуклеотидна последователност, съгласно изобретението. Представлява ДНК фрагмент от 579 Ър, включващ единствено кодиращата област на зрелия HSZ протеин, която може да бъде изолирана чрез смилане с рестрикционна ендонуклеаза, използувайки Bsph 1(5* -TCATGA ) за Xba I ( 5’ -TCTAGA ). Два Neo I сайта, присъстващи в нативната

-8HSZ кодираща област, се елиминарат чрез сайт-насочена мутагенеза. Това се осъществява без да се променя кодираната амино киселинна последователност.

SEQ ID N0 : 4 показва нуклеотидната и производната на нея амино киселинни последователности на HMD гена.

SEQ ID N0 : 5 показва ДНК последователността на гена на царевичния 10 kD зеин протеин. / Kirihara et al. ( 1988 ) Mol. Gen. Genet. 21:477-484; Kirihara et al. ( 1988 ) Gene 71: 359-570 /.

SEQ ID NOS : 6 и 7 са използувани в пример 1 за скриниране на царевична банка за 10 kD зеин гена за високо съдържание на метионин.

SEQ ID NOS : 8 и 9 са използувани в пример 2 за осъществяване на мутагенезата на HSZ гена.

SEQ ID NOS : 10 и 11 са използувани в пример 2 за да се създаде форма на HSZ гена с алтернативни уникални ендонуклеазни сайтове.

SEQ	ID	NOS :	12	и	13 са използувани в пример	2	за	съз-
даване на ген,	който	да	кодира зрялата форма на HSZ.
SEQ	ID	NOS :	14	и	15 са използувани в пример	5	за	кон-
струиране на	. ген, кодиращ	HMD от HSZ.
SEQ	ID	NOS :	16	-	21 са използувани в пример	6	за	кон-

струрането на химеричните гени за експресия на HSZ в растенията.

SEQ ID N0 : 22 е използуван в пример 7 за анализиране на трансформантите на тютюна с фазеолин-HSZ химеричните гени.

SEQ ID NOS : 23, 24 и 25 са използувани в пример 10 за конструирането на химеричните гени за експресия на HMD в растенията.

SEQ ID N0 : 26 представлява химеричен ген, съставен

-9от 35S промотора на Вируса на Мозайката по Карфиола / Odell et al. ( 1985 ) Nature 313: 810-812 /, гена за хигромицин, фосфотрансфераза от плазмид pJR225 / от Е. coll / / Gritz et al. ( 1983 ) Gene 25:179-188 / и 3’ областта на гена за нопалин синтетаза от Т-ДНК от Т1 плазмида на Agrobacterium tumefaciens, използуван в пример 11, като селекционен генетичен маркер за трансформация на соеви зърна .

SEQ ID N0 : 27 представлява централната област на HSZ протеина.

SEQ ID N0 : 28 представлява амино киселинна последователност за задържането на протеините в лумена на ендоплазмения ретикулум.

Фигура 1 показва съпоставяне на амино киселинните последователности на 10 kD зеин ( SEQ ID N0 : 5 ) и HSZ ( SEQ ID N0:2). Използува се еднобуквен код за амино киселините. Подчертани са домените за високо съдържание на метионин на двата протеина. Вертикалните линии на фигура 1 означават идентични амино киселинни остатъци при двата протеина.

Фигура 2 показва схематично изображение на експресионните касети на зърно-специфичния ген, полезни при конструирането на химеричните гени за експресия на HSZ в трансгенетичните растения.

Фигура 3 показва карта на бинарния плазмиден вектор pZS97K.

Фигура 4 показва карта на бинарния плазмиден вектор pZS97.

ДЕТАЙЛНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение описва фрагменти от нуклеинови киселини, кодиращи царевичния зеин с високо съдържание на сяра

/. HSZ / зърнен резервен протеин или домена с високо съдържание на метионин / HMD /, произлизащ от HSZ, като и двата са необичайно богати на амино киселината метионин.

HSZ протеина се състои от централна много-богата-наметионин област / около 48% метионинови остатъци / заграден от омино терминална и карбокси терминална области с ниско съдържание на метионин / 10% метионин и 7% метионин, съответно /. Централният участък се състои от вариации на повтарящият се мотив Met-Met-Met-Pro ( SEQ ID NO : 27 ). Свързаният 10 kD зеин протеин притежава подобна, но отличаваща се структура /виж фиг. 1 /. Въпреки това, централната област на HSZ протеина е около два пъти по-широка от съответстващата й област в 10 kD зеин, допринасяйки за повишеното съдържание на метионин в HSZ. Явната дупликация на централния домен с високо съдържание на метионин / HMD / в HSZ, сравнена с 10 kD зеин предполага, че централния домен с високо съдържание на метионин, би трябвало да има стабилна структура и би могъл да се експресира самостоятелно, набавяйки резервен протеин с много високо съдържание на метионин.

Интродукцията / вкарването / на химеричен ген, включващ регулаторни последователности за зърнен резервен протеин и кодираща последователност за богат-на метионин зърнен резервен протеин, представлява един опит за подобряване хранителното качество на зърната от културни растения. Повишаването на съдържанието на метионин на зърната се определя от : / а / степента на експресия на химеричния ген в трансформираната култура, която зависи, отчасти от използуваните зърноспецифични експресионни сигнали, / б / процентното съдържание на метионинови остатъци в област-11та кодираща зърнения резервен протеин, / в / стабилността на вкарания резервен протеин в зърното на трансформираното културно растение, която от части зависи от собствения му процесинг, вътреклетъчното му насочване / таргетинг /, събирането в структури от по-висок порядък в някои случаи и способност 'за издържане на изсушаване и / г / съвместимостта на вкарания протеин към нативните зърнени протеини на трансформираната култура.

Трансфера на фрагментите нуклеинови киселини, съгласно изобретението, с подходящи регулаторни последователности, в живи клетки,се изразява в производство или свръхпроизводство на протеина. Трансфера на фрагментите нуклеинови киселини в растения, съгласно изобретението, в частност царевица, соеви зърна или рапично семе, с подходящи регулаторни последователности за директна експресия на протеина в зърната, може да се изрази в повишено равнище на съдържащите сяра амино киселини, в частност метионин, като така се подобрява хранителната стойност на зърнения протеин за животни.

Според контекста на настоящето описание, трябва да се използуват известен брой термини. Както е използуван тук, терминът нуклеинова киселина се отнася до голяма молекула, която може да бъде едноверижна или двуверижна, състояща се от мономери / нуклеотиди /, съдържащи захари, фосфати както и пурини или пиримидини. Фрагмент от нуклеинова киселина представлява фракция от дадена молекула нуклеинова киселина. При висшите растения, дезоксирибонуклеиновата киселина / ДНК / е генетичния материал, докато рибонуклеиновата киселина / РНК / се включва в трансфера на информация он ДНК към протеините. Геном е цялото тяло генетичен материал, съдържащ се във

-12всяка клетка' на организма. Терминът *' нуклеотидна последователност се отнася до ДНК или РНК полимер, който може да е едно-верижен или дву-верижен, по желание съдържащ синтетични, не-естестввни или променени нуклеотидни бази, които могат да се инкорпорират / включат / в ДНК или РНК полимери.

Както се използува тук, терминът хомоложен на се отнася до комплементарност между нуклеотидните последователности на две молекули нуклеинови киселини или между амино киселинните последователности на две протеинови молекули. Преценките за такива хомоложности се осигурява или чрез ДНК - ДНК или чрез ДНК - РНК хибридизация при строги условия, както добре се разбира от специлисти в областта / както е описано от Hames and Higgins ( eds.) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, U.K. /; или чрез сравняване на сходството на последователностите между две нуклеинови киселини или протеини.

Както се използува тук, “ съществено хомоложни се отнася до молекули нуклеинови киселини, които изискват по-малко строги условия на хибридизация, отколкото тези при хомоложните последователности, а също така се отнася до кодираща ДНК последователност, която може да включва промени на базите, които да не причиняват промяна на кодираната амино киселина или която включва промени на бази, които могат да променят една или повече амино киселини, но не засягат функционалните свойства на кодирания от ДНК последователността протеин. Така, описаните тук фрагменти нуклеинови киселини, включват молекули съдържащи възможни вариации на нуклеотидните бази, произлизащи от делеции, пренареждане, произволен или контролиран мутагенез на фрагмента нуклеинова киселина, а даже също и случайни грешки при нуклеотидно секвениране, доколко-13то ДНК последователностите са съществено хомоложни.

Ген се отнася до фрагмент нуклеинова киселина, който експресира специфичен протеин, включващ регулаторни последователности предшестващи ( 5’ не-кодираща ) и следващи ( 3’ не-кодиращи ) кодиращата област. Нативен ген се отнася до гена, както се открива в природата със собствените си регулаторни последователности. Химеричен ген се отнася до ген,.съдържащ хетерогенни регулаторни и кодиращи последователности. Ендогенен ген се отнася до нормално срещания нативен ген, в естественото му разположение в генома. Чужд ген се отнася до ген, който не се среща нормално в организма гостоприемник, но който е вкаран / интродуциран / чрез генен трансфер.

Кодираща последователност се отнася до ДНК последователност, кодираща специфичен протеин и изключваща не кодиращите последователности. Може да съставлява една непрекъсната кодираща последователност , например липса на интрон, така както в сДНК или може да включва един или повече интрони, свързани чрез подходящи свързващи връзки. Интрон представлява РНК последователност, която е транскрибирана в първичния транскрибт, но която се отделя чрез разцепване и повторно свързване от РНК в клетката, за да се създаде зрялата шРНК, която може да бъде транслирана в протеин.

Иницииращ кодон и терминален кодон се отнасят до единица от три съседни нуклеотида в кодиращата последователност, ^оито определят инициирането и завършването на веригата, съответно, на синтеза на протеини / шРНК транслация /. Отворена четяща рамка се отнася до амино киселинната последователност, закодирана между транслиращите иници-14иращ и терминален колони на кодиращата последователност.

РНК транскрибт се отнася до продукта получен от катализирана с РНК-полимераза транскрибция на ДНК последователност. Когато РНК транскрибта е съвършено комплементарно копие на ДНК последователността, то се отнася до първичния транскрибт или може да бъде РНК последователност, произлизаща от посттранскрипционен процесинг на първичния транскрибт и,се отнася също до зрялата РНК. Информационна РНК / шРНК / се отнася до тази РНК, която е без интрони и която може да * бъде транслирана от клетката в протеин. сДНК се отнася до дву-верижна ДНК, която е комплементарна на и произлизаща от шРНК.

Както са използувани тук, регулаторни последователности се отнася до нуклеотидни последователности локализирани нагоре / 3’ /, във и/или надолу /3’ / спрямо кодиращата последователност, която контролира транскрибцията и/или експресията на кодиращите последователности, потенциално във взаимовръзка с протеин-биосинтезиращия апарат на клетката. Тези нуклеотидни последователности включват промоторна последователност, транслационна водеща последователност, транскрибционна завършваща последователност и полиаденилираша последов ателност.

Промотор ’ се отнася до ДНК последователност в гена, обикновено нагоре /5’ / спрямо кодиращата последователност, която контролира експресията на кодиращата последователност чрез осигуряване на разпознаване за РНК-полимеразата и други фактори, нужни за правилната транскрибция. Промоторът може също да съдържа ДНК последователности, които се включват в >

свързването на протеиновите фактори, които контролират ефек-15' 4 тивността на инициирането на транскребцията в отговор на физиологичните или на развитието условия. Може също да съдържа инхансерни / засилващи / елементи.

Бнхансерът представлява ДНК последователност, която може да стимулира промоторната активност. Може да е присъщ елемент на промотора или хетероложен елемент, вмъкнат за да засилва степента и/или тъканната - специфичност на промотора.

Конститутивни промотори се отнася до тези, които направляват генната експресия във всички тъкани и по всяко време.

Органо - специфични или специфични за развитието промотори, както се отнасят тук, са тези, които направляват генната експресия почти изключително в специфични органи, като листата или семената или при специфични етапи на развитие на *

органа, така както при ранния или късния ембриогенезиз, съответно.

Терминът експресия , както се използува тук, трябва да означава продукцията на протеиновият продукт, кодиран от ген. Свръхекспресия се отнася до продукцията на генен продукт в трансгенетичен организъм, която надвишава степента на продукция в нормални или не - трансформирани организми.

3’ не - кодиращите последователности се отнасят до участък от ДНК последователност от ген, съдържащ сигнал за завършване ;.на транскрибцията, сигнал за полиаденилация и всеки друг ^гулаторен сигнал, способен да въздейства тРНК процесинг или генна експресия. Сигнала за полиаденилация обикновено се характеризира с въздействие върху прибавянето на местата с полиаденилова киселина на 3’ края на шРНК прекурсора / предшественика /.

5’ не - кодиращите последователности се отнасят

-16до участък от ДНК последователност от ген, съдържащ промоторна последователност и транслационна лидерна последователност.

Транслационна лидерна последователност се отнася до този участък на ДНК последователност от ген между промотора и кодиращата последователност, която се транскрибира в РНК и присъства в пълната процесиирана шРНК нагоре /5’ / от транслациофния стартов кодон. Транслационната лидерна последователност мсЖе да засегне процесинга на първичния транскрибт към шРНК, стабилността на шРНК или ефективността на транслация .

Зрял протеин се отнася до пост - транслационния процесииран полипептид без неговия сигнален пептид. Пре курсорен / предшестващ / протеин се отнася до първичния продукт от транслацията на шРНК. Сигнален пептид се отнася до амино - крайното удължаване на полипептида, който се транслира свързан с полипетида, образуващ прекурсорния пептид и който е нужен за навлизането му в секреторния път. Терминът сигнална последователност се отнася до нуклеотидна последователност, кодираща сигналния пептид.

Вътреклетъчна локализираща последователност се отнася до нуклеотидна последователност, която кодира вътреклетъчен мишенен сигнал. Вътреклетъчен мишеиен сигнал представлява амино киселинна последователност, която се транслира свързана с протеин и го направлява до определено суб - клетъчно отделение. Стоп транзит сигнал на ендоплазматичния ретикулум / ER / се отнася до карбокси - крайно удължаване на полипептид, който е транслиран свързан с полипептида и образува полипептид, който влиза в секреторния път за да се задържи в ендоплазматичния ретикулум / ER /. ER стоп транзит-мния сигнал се отнася до нуклеотидна последователност, кодираща ER миш^нния сигнал. Други вътреклетъчни мишении последователности кодират мишенни сигнали активни в семената и/или листата и съдовите мишенни сигнали.

Трансформация се отнася тук до трансфера на чужд ген в генома на организма - гостоприемник и неговата генетично стабилна наследственост. Примери за методи за трансформация на растения включват Agrobacterium - медиирани трансформации и ускорена - частица или ” gene gun трансформационна технология.

Рекомбинантната ДНК технология предлага потенциал за увеличаване съдържанието на серни амино киселини в културните растения. Следните технологии са изключително полезни : / а / ме^оАи за молекулярно клониране и in vitro манипулации на гени / виж Sambrook et al. ( 1989 ) Molecular Cloning : a laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press / / 6 / вкарване на гени, чрез трансформация, в селскостопански - важни културни растения, като соята / Chee et al. ( 1989 )

Plant Physiol. 91 : 1212 - 1218; Christou et al. ( 1989 ) Proc.

Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86 : 7500 - 7504; Hinchee et al. ( 1989 )

Biotechnology 6 : 915 - 922; EPO публикация 0501 749 A2 / рапично семе / De Block et al. ( 1989 ) Plant Physiol. 91 : 694 - 701 / и царевица / Gordon - Каиша et al. ( 1990 ) Plant Cell 2 : 605 - 618; Fromm et al. ( 1990 ) Biotechnology 8 : 853 - 839 / и /в / зърно - специфична експресия на вкараните гени в трансгенетичните растения / виж Goldberg et al. ( 1989 ) Cell 56 :

149 - 160; Thompson and Larkins ( 1989 ) BioEssays 10 : 108 113/C цел да се използуват тези технологии за развитието на културните растения с повишено съдържание на серни амино ки-18селини, съществено е да се идентифицират и изолират важните за търговията гени.

Разнообразни разтвори, използувани в експерименталните манипулации, са описани чрез тяхните обичайни имена като SSC , SSPE , Denhardt’s solution и др. Съставът на тези разтвори може да бъде открит чрез справка в Appendix В of Sambrook et al., / Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed. ( 1989 ), Cold Spring Harbor Laboratory Press /.

КЛОНИPAHE HA ЦАЕРВИЧЕН HSZ ГЕН

Олигонуклеотидите / SEQ ID NOS :6 и 7 /, базиращи се на публикуваната ДНК последователност / SEQ ID NOS : 5 / на царвичен 10 kD зеин ген / Kirihara et al. ( 1988 ) Mol. Gen. Genet. 21 : 477 - 484; Kirihara et al. ( 1988 ) Gene 71 : 359 370 / са посочени за употреба като праймери за полимеразната j ¹ верижна реакция ( PCR = ПВР ) с геномна царвична ДНК като матрица. Продукта на PCR реакцията се изолира от агарозен гел и се маркира радиоактивно чрез nick транслация за използуване като хибридизационно изследване. Царевична геномна ДНК библиотека вEMBL - 3 вектор се набавя от Clontech, а плаките се скринират с PCR - генерирана проба. Очаква се това да има за резултат .изолирането в цяла-дължина на 10 kD зеин ген, съдърI жащ неговите 5’ и 3’ регулаторни области.

Две хибридизиращи плаки се пречистват и клонирания царевичен ДНК фрагмент се охарактеризира по - нататък. Смила се с рестрикционна ендонуклеаза и електрофореза в агарозен гел показва$ че двата клона са идентични. ДНК фрагментите от агау, розния ге/^се Southern - blotted върху нитроцелулозни мембранни филтри и се изследват с радиоактивно - маркирана 10 kD зеин ДНК, генерирана чрез nick транслация. Еденичен 7.5 кб

-19BamH I фрагмент и единичен 1.4 кб Xba I фрагмент се хибридизират към пробата. Тези фрагменти се субклонират във фагемид pTZ18R / Pharmaciа / за ДНК секвенционен анализ.

Учудващо, от последователността бе явно, че изолираният ген бе свързан със, но различен от 10 kD зеин ген. Бе обозначен като Зеин с Високо Съдържание на Сяра / HSZ / ген. ДНК фрагцанта съдържа отворена четяща рамка от 633 нуклеотида, сравнен с 453 нуклеотида от 10 kD зеин ген. HSZ протеинът показва 76 % идентичност на амино киселинната последователност с 10 kD зеин. Все пак, по - дългата отворена четяща рамка ot)HSZ гена кодира за богат на метионин домен, не присъстващ в 10 kD зеин гена, което води до 29 % съдържание на серни амино киселини / 28 % метионин / за зрялия HSZ протеин сравнен с 26 % / 22 % метионин / за 10 kD зеин. Така, HSZ гена кодира за зърнен резервен протеин, който е с най - високо съдържание на метионин от познатите до сега. Добре познатите гении експресионни сигнали като TATA box и сигнала за полиаденилация са на подобни позиции в HSZ и 10 kD зеин гените. Предполагаема 21 амино киселинна сигнална последователност е кодирана от HSZ гена при амино края на предшестващия полипептид, подобно на тази от 10 kD гена.

гени, кодиращи зърнени резервни протеини от царевица й други видове растения, предимно едносемеделни растения. Изолирането на свързаните гени е добре известно от нивото на техниката.

Употребата маркери за полиморфизъм на рестрикцията на дължината на фрагмента / RFLP / при размножаването на растенията е добре документирана в нивото на техниката / виж

-20Tanksley 6t al. ( 1989 ) Bio. Technology 7 : 257 - 264 /.

If

Фрагмента⁷ нуклеинова киселина, съгласно изобретението, може да бъде картографиран върху царвичната RFLP карта. Така може да бъде използуван като RFLP маркер за характерни черти, свързани с картографирания локус.

МОДИФИКАЦИЯ НА HSZ ГЕНА

Фрагмента нуклеинова киселина, съгласно настоящето изобретение, кодиращ за богат на сяра зърнен резервен проте* ин, може да бъде прикрепен към подходящи регулаторни последователности и използуван за свръхпродукция на протеина в микроорганизми като Escherichia coll или дрожди или трансгенетични растения, като царевицита, соята и други културни растения. Такава рекомбинантна ДНК конструкция може да включва нативния HSZ ген или химеричен ген. Специалист в областта може да изолира кодиращите последователности от фрагмента, съгласно нас-

сайтове sat рестрикционна ендонуклеаза / виж Sambrook et al. ( 1989 ) Mdlecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press /.

От изключителна полза са естествено срещаните сайтове

1' за Neo J / 5’ -CCATGG / и ХЬа 1/5’ -TCTAGA /, което позволява точно отделяне на кодиращата последователност започваща с синия иницииращ кодон ATG и завършваща с трансла

ционния стоп кодон TAG. Въпреки това, три Neo I сайта присъстват в HSZ кодираща област. За предпочитане е да се елеминират два от тези сайта и да се подържа само единия сайт / нуклеотиди 751 - 756 в SEQ ID N0 : 1 /,който включва транслационния стартов кодон. Предпочитан ДНК фрагмент, съгласно изобретението / SEQ ID NO :2 / е създаден чрез in vitro сайт - на-21сочен мутдгенез,така че двата Neo I сайта в кодиращата послеlit дователнрет са отделени без да се променя амино киселинната последователност, кодирана от гена. Така, пълно смилане на ДНК с Neo I и Xba I води до един фрагмент от 637 Ьр, съдържащ цялата кодираща последователност на прекурсорния HSZ полипептид. За да се улесни по - нататък конструирането на химерични .гени, се прибавят допълнителни единични рестрикцион4 г ни ендонуклеазни сайта, непосредствено следващи транслационния стоп сигнал на HSZ. В Xba I сайта се инсерират / вмъкват / олигонуклеотиди / SEQ ID NOS : 10 и 11 /, чрез вкарване на два нови рестрикционни салта - Sma I и Κρη I и разрушаване на Xba I сайта. Двата единични Xba I сайта от нуклеотиди 1 - 6 в SEQ ID N0 : 1 и Ssp I сайта от нуклеотид 1823 1828 в SEQ ID N0 : 1 се използуват за получаването на фрагмент, съдържащ HSZ кодиращата област плюс неговите 5’ и 3’ регулаторни области. Този фрагмент се клонира в достъпния на пазара вектор pTZ19R ( Pharmaciа ), смлян с Xba I и Ssm I,

плазмид рСС1.

Плазмид рСС10 е депозиран на 07.12.

Ши»

1990 в АТСС, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 под входящ номер 68490, съгласно изискванията на будапещенската спогодба.

С цел да бъде възможно да се експресира зрялата форма на HSZ протеина, за предпочитане е създаването на*една променена форма на HSZ гена с единичен рестрикционнен ендонуклеазен с^т на старта на зрядия протеин. За осъществяването на това, генерира се ДНК фрагмент, чрез използуване на PCR. Олигонуклеотидни п^аймери ( SEQ ID NOS : 12 и 13 ) се означават така, че PCR - генерираният фрагмент ( SEQ ID N0 : 3 )

I да съдържа Bsph I сайт, който да образува кохезивен / лепкав /

^ж I -22край, идентичен на този, генриран от Neo I смилане. Този сайт се локализира при връзката между сигналната секвенция и кодиращата последователност на зрялия HSZ. PCR - генерираният фрагмент също притежава Xba I сайт на транслационния край на HSZ гена.

Конструира се ген, използувайки PCR - методика, за закодиран^ на домен за високо съдържание на метионин ( HMD ) на HSZ. оЦигонуклеотиди ( SEQ ID NOS : 14 и 15 ) се посочват да прибавят един Nde I сайт, който да включва транслационния иницииращ кодон и един EcoR I сайт непосредствено след транслационния завършващ кодон ( виж SEQ ID N0 : 4 ). Тези сайтове позволяват лесно инсериране на HMD в експресионни вектори.

ЕКСПРЕСИЯ НА HSZ В Е.coll

HSZ кодиращата последователност се експресира в Е. coll използувайки бактериофага Т7 РНК полимераза / Т7 промотарна система / Studier et al. ( 1990 ) Methods in Enzymology 185 : 60 - 89 /. Neo I - Xba I фрагмента, съдържащ HSZ кодиращата последователност, се, инсерира в експресионен вектор. От този плазмид, означен като рСС11, се очаква да експресира прекурсорниц / предшестващ / HSZ протеин. Допълнително се конструира плазмид определен да експресира HSZ протеина без неговата сигнална последователност, означен като рСС12. Зрялият HSZ кодиращ ДНК фрагмент за тази конструкция се генерира, като -се използува PCR както е описано по - горе и се инсерира в експресионния вектор.

За да се установи екпресията на HSZ полипептидите, плазмиди рСС11 и рСС12 се трансформират в Е. coll - щам HMS174 и се провежда един in vivo маркиращ експеримент, използувайки

S - метионин, както е описано от Studier и Moffatt / ( 1986 )

-23J. Mol. Biol. 189 : 113 - 130 /. Заради високото съдържание на метионин на HSZ протеина, така се предлага специфичен и чувствителен начин за откриване на експресията. Клетъчни екстракти се пускат на SDS полиакриламидни гелове, които се промиват и авторадио£рафират. Лента със забележително маркиран протеин с молекулно Мгло около 20 kD се открива при двата - рСС11 и рСС12 екстракта*. Това е приближителния очакван размер за зрялия дълъг HSZ полипептид и предполага, че прекурсорния протеин направен в рСС11 трансформанта е процесииран от Е. coll. Когато общия клетъчен протеин^се проявява със светещ / блестящ / Comassiе blue, оцветяването следващо индукцията и SDS поли9 акриламидната гел електрофореза, се разкрива забележим индуциран 20 kD протеин в рСС12 лизатите / но не в рСС11 лизатите /, посяваща високо ниво на експресия на зрялата форма на протеина.

Фрагментите нуклеинови киселини, съгласно изобретението, могат да се използуват за продуцирането на големи количества HSZ, HMD или общ белтък, обогатен с сяра - съдържащи амино киселини, в частност метионин, чрез култивиране на Е. coll и други микроорганизми. За да се осъществи това, фрагментит^нуклеинови киселини, съгласно изобретението, могат да бъдат оперативно свързани към подходяща регулаторна последователност, включваща промоторна последователност, транслационна^лидерна последователност и 3’ не-кодираща последователност. После, х^смерич^я ген може да бъде въведен в микроорганизъм посредством трансформация и трансформираният микроорганйръм може да се отглежда при условия водещи до висока степен на експресия на химеричния ген. Клетките съдържаifщи протеин, обогатен със сяра - съдържащи амино киселини, мо-24ι гат да сй'съберат, а обогатеният протеин може да си екстраZ хира. HSZ протеинът може да се пречисти, след това.

За да се продуцират големи количества HSZ протеин в

Е. coll, щам BL21 ( DE3 ) pLysE / Studier et al. ( 1990 )

Methods in Enzymology 185· : 60 - 89, се използуват трансформирани c| pCC12. HSZ протеина се пречиства от екстрактите на

IPTG / *и4о iip опилтио - β - уалактозид / - индуцирани култури.

HSZ протеин се открива в неразтворим преципитат, който лесно може да се събере чрез ниско - скоростно центрофугиране на

I клетъчния екстракт. По - голямата част от клетъчните протеини се отделя в супернатАнтата. След това, HSZ селективно се разтваря в почти (>$Ю %) чиста форма от уплътнената утайка от центрофугирането, чрез екстракция с 70 % изопропанол, съдържащ 10 мМ $- меркапт^етанол. Получават се около 10 и 100

I мг HSZ протиен от един литър клетъчна култура. Тъй като вече е установено, че продуцирането на HSZ протеин в Е. coli не е токсично за клетките, могат да се постигнат по - високи степени на експресия, използувайки щам BL21 ( DE3 ) / Studier et al. ( 1990 ) Methods in Enzymology 185 : 60 - 89/.

ЕКСПРЕСИЯ HA HSZ В РАСТЕНИЯТА

Предпочитаният клас - гостоприемници за експресия на кодиращата^ последователност на HSZ или HMD са еукариотни госi топриемници, особено клетките на висшите растения. Особено предпочитани измежду висшите растения и семената произлизащи от тях са соевите зърна, Наличното семе ( Brassica napus, В.

campestris ), слънчоглед ( Helianthus annus ), памук ( Gossypium hirsutum ), царевица, тщтюн ( Nicotiana tabасurn ), алфалфа ( Medicage sativa ), жито ( Triticum sp. ), ечемик ( Hordeum vulgare ),, овес ( Avena sativa ), copro ( Sorghum bicolor ),

-25ориз ( Oryza sativa ) и форажйитв треви. Експресията в растенията използува регулаторните последователности на тези растения.

Експресията на чуждД гени в растенията е добре устаI новена / DeBlaere et al. ( 1987 ) Meth. Enzymol. 153 : 277 291 ода на промотора, избран да води експресията на кодиращата последователност не е критичен / съществен /, доколкото притежава достатъчнр транскрипционна активност за да осъществи изобретението чрез увеличаване нивото транслируеми шРНК за HSZ или HMD в ж хната тъкан - гостоприемник. Предпо-

читани пуомотори за експрерий; |ъв всеки растителен орган и по - специално за експресия в листата, включват тези насочващи 19S и 358 транскрибти във, вируса на мозайката по карфиола / Odell et al. ( 1985 ) Nature 313 : 810 - 812; Hull et al. ( 1987 ) Virology 86 : ^82 - 493 /, малката субединица на рибулоЗо - 1,5 -Лифосфат - карбоксилазата / Morelli et al.

( 1985 ) Nature 315 : 200; Broglie et al. ( 1984 ) Science

224 : 838; Hererra - Estr11a et al. ( 1984 ) Nature 310 : 115; Coruzzi et al. ( 1984 ) EMBO J. 3 : 1671; Faciotti et al.

( 1985 )|'Bio/Technology 3 : 241 /, царвичен зеинов протеин / Matzke et al. ( 1984 ) EMBO J. 3 : 1525 / и хлорофил a/b свързващ протеин /. Lampa et al. ( 1986 ) Nature 316 : 750 752/ .

Съгласно описанието,‘желателно е да се селекционират промотори, к<^ито са специфични за експресия в един или повече органи на растението. Преврите включват светлинно - индуцируеми промотори от малката субединица на рибулозо - 1,5 - дифосфат карбоксилаза, «Ако експресията е желана във фотосинтетични органи или промотори активни специфично в семената.

-26Предпочитани промотори са тези, които позволяват екс-

*
пресия на прй	>теина рпецифично в семената.Това може да бъде
изключите лист	полезно, тъй като семената са първичния източник

на растителен протеин, а също и тъй като зърно - специфичната експресия ще избегне всеки потенциално вреден ефект в не зърнените органи. Примери за зърно - специфични промотори включват , но без да се ограничават само до тях, промоторите на зърнените резервни протеини! които представляват повече от 50 от общия зърнен протеин в много растения. Зърнените ре зервни протеини са стриктно регулирани, като се експресират най - вече изключително в зърната / семената / по висш орга• i но - специфичен и етап - специфичен начин / Higgins et al.

( 1984 ) Ann. Rev. Plant Physiol. 35 : 191 - 221; Goldberg et al. ( 1989 ) Cell 56 :1¼ - 160; Thompson et al. ( 1989 ) BioEssays 10 : 108 - 113 Освен това, различни зърнени реГ зервни протеини могат да се експресират в различни стадии от развитието на зърната.

Обикновено съществуват многобройни примери за зърно специфична експресия на гегите на зърнения резервен протеин в трансгенетичните двусемеделни растения. Това включва гени от двусемцделни растения за бобов β - фааеолин / Sengupta ’* · J·’· I

Gopalan et al. ( 1^85 ) l4oc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 3320 3324; Hoffman et al. ( 1988 ) Plant Mol. Biol. 11 : 717 - 729 /, бобов лектин / Okamuro et ¢1. ( 1986 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 8240 - 8244 /, соев kunitz трипсин инхибитор / Perez Grau et al. ( 1989 ) Plant Cell 1 : 095 - 1109 /, соев f - kohглицинин / Beachy et al. ( 1985 ) EMBO J. 4 : 3047 - 3053;

Barker al. ( 1988 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 458 462; Chen et al. ( 1988 ) EMBO J. 7 : 297 - 302; Chen et al.

( 1989 ) Dev. Genet. 10 : 112 - 122; Naito et al. ( 1988 ) Plant Mol. Biol. 11 : 109 - 125 /, грахов вицилин / Higgins et al. ( 1988 ) Plant Mol. Biol. 11 : 685 - 695 /, грахов конвицилин / Newbigin et al. ( 1990 ) Planta 180 : 461 /, грахов легюмин / Chirsat et al. ( 1989 ) Mol. Gen. Genetics 215 : 526 /; напин от рапичево семе / Radke et al. ( 1988 ) Theor. Appl. Genet. 75 : 685 - 694 / както и гени от едносемеделни растения, като например, царвичен 15 kD zein / Hoffman et al.

( 1987 ) EMBO J. 6 : 5215 - 5221; Schernthaner et al. ( 1988 ) EMBO J. 7 : 1249 - 1255; Williamson et al. ( 1988 ) Plant Physiol. 88 : 1002 - 1007 /, ечемичен ( 1988 ) Plant Mol. Biol. 10 : 559 - 566 / и пшеничен глутенин / Colot et al. ( 1987 ) EMBO J. 6 : 5559 - 5564 /. Освен това, промотори но зърно - специфични гени, оперативно свързани към хетероложните кодиращи последователности в химеричните генни конструкции, също поддържат тяхния временен и пространствен експресионен образец в трансгенетичните растения. Такива примери включват генен промотор на Arabidopsis thaliana 2S зърнен резервен протеин, за да експресира енкефалин пептиди в зърната на Arabidopsis и В. napus / Vandekerckhove et al. (1989)

Bio/Technology 7 : 929 - 952 /, бобен лектин и бобен р - фазеолин промотори за експресиране на люцифераза / Riggs et al. ( 1989 ) Plant Sci. 65 : 47 - 57 /, и пшеничен глутенин промотори за експресиране хлорамфеникол - ацетил - трансфераза / Colot et al. EMBO J. 6 : 5559 - 5564 /.

От изключително значение за експресията на фрагментите нуклеинови киселини, съгласно изобретението, са хетероложните промотори от някои широко охарактеризирани соеви гени за зърнен резервен протеин, като тези за Kunitz трипсин

-28инхибитор / Jofnku et al . (

1989 )

Plant Cell 1 : 1079 - 1093;

1989 ) Plant

Cell 1 : 1095 - 1109 /, глицинин / Nielson et al. (

1989 )

Plant

Cell 1 : 313 - 328 /,

- конглицинин / Harada et

425 /. Промотори за J- / субединици от al. ( 1989 ) соев - конглицин

Ϊ резервен протези са особено полезни при експресия на HSZ тРНК тието на соевг зърна / Beachy et al. ( 1985 ) EMBO J. 4 :

3047 - 3055; Б -ker

USA 85 : 458

Chen et al. ( 1 ( 1988 ) Plant.

растения, тъй /а/ при

462;

989 има много et al. ( 1988 ) Proc. Natl. Acad. Sci.

Chen et al. ( 1988 ) EMBO J. 7 : 297 - 302;

) Dev. Genet 10 : 112 - 122; Naito et al.

Biol. 11 : 109 -123 /в трансгенетичните позиционен ефект върху тяхната експресия трансгене? гните зърна и двата προί'-торя показват различна временна регулация : „П „аЗ субединица ое екопреонра няколко гена на - субединица.

г /б/

промоторът	за г
дена преди	тоз
От	изг.
нуклеинови	КИТ

ложните промо телна полза ч, съгласно и от различни за царвичен з

Kirihara et за експресията на фрагментите изобретението, също са хетерообширно охарактеризирани гени чек резервен протеин, като тези от 10 kD зеин . ^l. 1988 ) Gene 71 : 359 - 370 /, 27 kD зеин

Prat et al .

49; Gallardo et al.

. 54 : 211 - 281 /, и 19 kD зеин / Marks et al.

'al. Chern. 260 : 16451

16459 /.

Свързанив цар°^г”’’ата - -чни / Kodrzyck et al. ( 1989 ) Plant Cell урявайки база за избор на промотор за изте / репативн’ τ· пнскрибционни действия на тези промотори

-29ползуване в химеричните гении конструкции за царевицата»

Същинското равнище на експресия на HSZ или HMD mPHK може да изисква употребата на различни химерични гени, използувайки различни промотори. Такива химерични гени могат да бъдат трансферирани в растения - гостоприемници или заедно в единичен експресионен вектор или последователно, използувайки повече от един вектор.

подобни моторни вичната

Предвижда се елементи или конструкции, транскрибция вкарването на енхансери или в нативния HSZ промотор или енхансеро в други прокоето ще осигури повишени нива на пърза HSZ или HMD, за изпълнение на изобретението. Това би включвало вирусни енхансери, като този открит в 35S промотор / Odell et al. ( 1988 ) Plant Mol. Biol. 10 ; 236 - 272 /, енхансери от предполагаемите гени / Fromm et al. ( 1989 ) Plant Cell 1 : 977 - 984 /, или енхансери от кой да е друг източник, които водят до повишено тронскрибция когато се поставят в проомотор, оперативно свързан към фраг мента нуклеинови киселини, съгласно изобретението.

От изключително значение е ДНК секвенционен елемент, изолиран от гена зао/’- на β конглицин, който може да придаде на конститутивен промотор

- пъти засилване на зърно специфичността / Chen et al. (

1988 ) ЕМВО J. 7

297 - 302;

Chen et al. ( 1989 ) Dev. Genet. 10 : 112 - 122

/. Специалист в областта може лесно да изолира този елемент и да го инсерира / вмъкне / в промоторната област на кай да е ген, с цел да се получи зърно - специфична засилена експресия с промотора в трансгенетичните растения. Инсерцията на такъв елемент в кой да е зърно - специфичен ген, който се експресира по време различно от това за р - конглициновия ген, ще има за

30резултат експресия в трансгенетичните растения за по - дълъг период,по време на развитието на зърната.

Изобретението също може да се осъществи чрез многообразни други методи, за получаване на целения резултат. От една страна изобретението се базира на модифициране на растенията за да продуцират повишено ниво на HSZ протеин по силата на притежаването им на значително по - голям брой копия на HSZ.

За осъществяване на изобретението може да се изпол-

зува коа да е 3’ не - кодираща област, способна да осигури

W' сигнал за завършване на транскрибцията сигнал лация или други регулаторни последователности да бъдат нужни при същинската експресия на HSZ за полиаденикоито могат кодиращата област. Това би включвало нативния 3’ край на HSZ гена (-ните),

3’ край от хетероложния зеинов зервен протеин, както и 3’край

Г8Н, 3’ край от кой да е рена соевия β - конглицинов ген, ’ край или 19S

3’ край лозо - 1 от от от ,5 вирусни гени, както и 3’ транскрибта на вируса на гените за предполагаемия край от 35S субединицата мозайката по карфиола, синтез, 3’ край от рибубифосфат - карбоксилаза или хлорофил а/Ь свързваш протеин или 3’ крайни последователности от кой да е из точник, нужната така че използуваната последователност да осигури регулаторна информация в секвенцията на нейната нуклеинова киселина, за да се получи същинската експресия на комбинацията на кодиращите области на промотора/HSZ или на промотора/HMD, към които е оперативно свързан. Съществуват многобройни примери от нивото на техниката, които наблягат на полезността от различни 3’ некодиращи области / например, виж Ingelbrecht et al. ( 1989 ) Plant Cell 1 : 671 - 680 /.

-31ДНК последователности, кодиращи за вътреклетъчно локализираните последователности, могат да бъдат прибавени към HSZ или HMD кодиращата последователност, ако се изисква за същинската експресия на протеините, за да се осъществи изобретението. Така, нативната сигнална последователност от HSZ може да се отдели или да се замести със сигнална последователност, известна да функционира в растението - мишена. Ако се отстранят сигналните последователности, се очаква HSZ про-

теина да остане в цитоплазмата на клетката. Алтернативно, монокотиледоновата / едносемеделна / сигнална последователност от HSZ може да бъде заместена от сигналната последователност от ^5 - субединицата на фазеолин от боба Phaseolus vulgaris или сигналната последователност отс/ ’субединицата от β - конглоцин от соя / Doyle et al. ( 1986 ) J. Biol. Chem. 261 :

9228 - 9238 /, която функционира в двусемеделните растения.

Hoffman et al. /( 1987 ) EMBO J. 6 : 3231 - 3221 / показват, че сигналната последователност от едносемеделния предшественик / прекурсор / от 15 kD зеин, насочва протеина в секретор-

ния път, а също провилно се процесиира в трансгенетични тю тюневи семена. Все пак, протеинът не остава в ендоплазматич ния ретикулум, както в случая с царевицата. За да се задър жи протеина в ендоплазматичния ретикулум е нужно да се добавят стоп транзитни последователности. Известно е от ниво то на техниката, че прибавянето на ДНК последователности, кодиращи за амино киселинната последователност / lys - asp glu - leu / ( SEQ ID NO : 28 ) при карбоксилния край на протнеина задържа протеините в лумена на ендоплазматичния ретикулум / Munro et al. ( 1987 ) Cell 48 : 899 - 907; Pelham ( 1988 ) EMBO J. 7 : 913 - 918; Pelham et al. ( 1988 ) EMBO

-52J. 7 : 1757 - 1762; Inohara et al. ( 1989 ) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 : 3564 - 3568; Hesse et al. ( 1989 ) EMBO J.

: 2453 - 2461 /. При някои растения зърнените резервни провини са локализирани във вакуолите на клетката. За да се осъществи изобретението е нужно да се направляват HSZ или HMD протеините към вакуолите на тези растения, като се прибавя последователност за вакуолите - мишени. Къс амито киселинен домен, който служи като последователност за вакуоли - мишени, е идентифициран от бобов фитохемгаглутенин, който се акумолира във вакуолите за резервен протеин на котиледона / семеделен лист / / Tague et al. ( 1990 ) Plant Cell 2 : 553 - 546/.

В други статии се описва карбоксил крайната амино киселинна последователност, нужна за направляването на ечемичния лектин към вакуолите на трансгвнетичен тютюн / Bednarek et al. ( 1990 ) Plant Cell 2 : 1145 - 1155 /.

КОНСТРУИРАНЕ HA ХИМЕРИЧНИ ГЕНИ ЗА ЕКСПРЕСИЯ

НА HSZ В РАСТЕНИЯ

Три експресионни касети за зърно - специфични гени се

използуват за конструиране на химерични гени за експресия на

HSZ в растения. Експресионните касети съдържат регулаторните области от три гена с висока експресия на зърнен резервен протеин

1\ {5 субединицата на фазеолин от боба Phaseolus vulgaris;

2\ ob ’ субединицата от - конглицин от соя; и

5\ kD зеин от царевица

Касетите са показани схематично на фиг. 2. Всяка една от тях притежава уникален Neo I сайт, непосредствено следващ 5’ре гулаторна област и, в добавка, някои или всички сайтове Xba I,

-33Sma I и Κρη I, непосредствено предхождащи 3' регулаторната област.

Neo I - Xba I фрагмента, съдържащ цялата HSZ кодираща област / SEQ ID N0 : 2 / и Bsph I - Xba I, фрагмента, съдържащ гена без сигналната последоватерност, т. е. кодираща та последователност на зрелия протеин / SEQ ID N0 : 3 / , се вмъкват във фазеолин и β- конглицин икспресионните касети / фиг. 2 /, които са били смляни с Neo I и Xba I. За инсерция в 10 kD зеиновата касета, Neo I - Sma I фрагмента, съдър-

жащ HSZ кодиращата област се инсерира в смляната е Neo I - Sma I kD зеинова касета.

Различни методи за трансформация на клетки от висши растения, съгласно настоящето изобретение, са на разположение на специалистите в областта / виж ЕРО публикации 0 295 959 А2 и 0 138 341 А1 /. Такива методи включват тези, базиращи се на трансформационни вектори, базиращи се на Ti и Ri плазмиди от Agrobacterium spp. Специално се предпочита да се използува бинарния тип на тези вектори. Ti - производните вектори, трансформират голям брой висши растения, включително едносемеделни и двусемеделни растения, като соята, памука и рапицата / Pacciotti et al. ( 1985 ) Bio/Technology 3 : 241; Byrne et al. ( 1987 ) lant Cell, Tissue and. Organ Culture 8 : 3; Sukhapinda et al. ( 1987 ) Plant Mol. Biol. 8 : 209 - 216; Lorz et al. ( 1985 ) Mol. Gen. Genet. 199 : 178; Potrykus ( 1985 ) Mol. Gen. Genet. 199 : 183 /.

Касетите на фазеолин - HSZ химеричния ген се инсерират във вектор pZS97K / фиг. 3 /, който е част от бинарна Ti плазмидна векторна система / Bevan ( 1984 ) Nucl. Acids. Res.

: 8711 - 8720 / на Agrobacterium tumefaciens. Векторът съ-34държа :

/1/ химеричния ген нопалин синтетаза / неомицин фосфотрансфераза /nos : NPT II / като селекционен маркер за трансформирани растителни клетки / Bevan et al. ( 1983 ) Nature 304 :

184 - 186 /, /2/ лявата и дясна граница на Т - ДНК на Т1 плазмида / Bevan

( 1984	) Nucl	. Acids.	Res. 12	: 8711	- 8720	/.
/3/ Е.	coli	lacZ	комплемеитарен	сегмент	/	Vieria and Mes-
sing (	1982 )	Gene 19	: 259 -	267 / c	уникални	сайтове за
рестрикционни	ендонуклеази за	EcoR I,	BamH I	и	Sal I,

/4/ бактериално начало на репликация от Pseudomonas плазмид pVS1 / Itoh et al. ( 1984 ) Plasmid 11 : 206 - 220 /, и /5/ бактериален ген за неомицин фосфотрансфераза от Тп5 / Berg et al. ( 1975 ) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 :

3628 - 3632 / като селекционен маркер за трансформиран A. tumefaciens.

Бинарните вектори, съдържащи химерйчните HSZ гени, се трансформират чрез три - родителски matings / Ruvkin et al.

( 1981 ) Nature 289 : 85 - 88 / за Agrobacterium щам LBA44O4/

PAL4404 / Hockema et al. ( 1983 ) Nature 303 : 179 - 180/.

Използуват се трансформанти от Agrobacterium за инокулиране на тютюнева листна петура / Horsch et al. ( 1985 ) Science 227 ; 1229 - 1231 /. Растенията се регенирират в селективна среда, съдържаща канамицин.

Специалистите в областта разполагат и с други методи за трансформация, като направлявано повдигане на чужда ДНК конструкция / виж ЕРО публикация 0 295 959 А2 /, техники на електропорация / виж Fromm et al. ( 1986 ) Nature ( London )

319 : 791 / или високо - скоростно балистично бомбардиране

-35с метални частици обвити с конструкциите от нуклеинови киселини / виж Kline et al. ( 1987 ) Nature ( London ) 327 : 70, и виж U.S. Pat. No. 4,945,050 /. Веднъж трансформирани, клетките могат да бъдат регенерирани от специалистите в областта.

Изключително релевантни са наскоро описаните методи за тронсформация на чужди гени в икономически важни култури, като рапичното семе / виж De Brock et al. ( 1989 ) Plant Physiol. 91 694 - &01 /, слънчоглед / Everett et al. ( 1987 ) Bio/Technology 5 : 1201 /, соя / McCabe et al. ( 1988 ) Bio/ Technology 6 : 923; Hinchee et al. ( 1988 ) Bio/Technology 6 ; 915; Chee et al. ( 1989 ) Plant Physiol. 91 : 1212 - 1218; Christou et al. ( 1989 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 7500 - 7504; EPO Publication 0 301 749 А2/, и царевица / Gordon Kamm et al. ( 1990 ) Plant Cell 2 : 603 - 618; Fromm et al.

( 1990 ) Biotechnology 8 : 833 - 839/.

ПРИМЕРИ

Настоящето изобретение е дефинирано по - пълно в следващите примери, в които всички части и проценти са тегловни, а градусите са по Целзий, ако не е уточнено друго. Трябва да се приеме, че тези примери, доколкото описват един предпочитан за осъществяване на изобретението, са дадени само като илюстративен пример. От следното разескване и тези примери, всеки специалист в областта може да установи съшествените характеристики на настоящето изобретение и без да се отделя от този ред на мисли и обхват, може да напрови различни промени и модификации на изобретението, за да се приспособи към различни приложения и условия.

ПРИМЕР 1

-56МОЛЕКУЛЯРНО КЛОНИРАНЕ НА HSZ ГЕНА

Геномна банка на царевица в бактериофаг ламбда се набавя от Clontech / Palo Alto, California /. Удостоверенията от доставчика показват, че царевичната ДНК е от седем - дневни израстъци, растящи на тъмно. Векторът е /t - EMBL - 3, носещ BamH I фрагменти 15 кб среден размер. Титъра от 1 до 9 х

плаки формиращи единици (рГи)/мл са посочени от доставчика. При пристигането си, банката се титрува и съдържа 2.5 х pfu/мл.

Протоколът за скриниране на банката / библиотека / чрез ДНК - хибридизация се осигурява от продавача. Около 30 000 pfu се посяват на 150 - mm петри от общо 15 Luria Broth ( LB ) агарови блюда даващи 450 000 плаки.. Посяването се извършва използувайки Е. coli LE592 отгледан на LB + 0.2 % малтоза като гостоприемник и LB - 7.2 % агароза като посевна среда. Плаките се абсарбират върху нитроцелулозни филтри / Millipore HATF, 0,45 мМ размер на порите /, денатурират се в 1,5 М NaCl, 0,5 М Tris - Cl pH 7,5 и се промиват в 3XSSC / Sambrook et al. ( 1989 ) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laaboratory Press /. Филтрите се попиват върху Whatman ЗММ хартия и се загряват под вакуум при

С в продължение на два часа, за да се осигури устойчиво закрепване на фаговата ДНК в мембраните.

Генерира се хибридизационна проба за скриниране на библиотиката за 10 kD зеин ген за високо съдържание на метионин / Kirihara et al. ( 1988 ) ol. Gen Genet. 211 : 477 - 484 / заедно със своите 5’ и 3’ заграждащи области. Синтезирани са два нуклеотида с дължина 30 бази, ограждащи този ген, изпол-37зувайки Applied Biosystems ДНК синтезатор. Олигомера SM56 ( SEQ ID NO : 6 ) кодира за положителната верига, обхващаща първите десет амино киселини :

SM56	5’ -ATG	GCA	GCC	AAG	ATG	CTT	GCA	TTG	TTC	GCT- 5
								(	SEQ	ID NO
	Met	Ala	Ala	Lys	Met	Leu	Ala	Leu	Phe	Ala

( амино киселини -21 до -12 от SEQ ID NO : 5 )

Олигомер Ъ0Ъ77 ( SEQ ID N0 : 7 кодира за негативната верига, обхващаща последните десет амино киселини :

CFC77	3’ -AAT	GTC	GTT	GGG	AAA	CAA	CCA	CGA	CGT	AAG- 5’
								(	SEQ	ID NO : 7 )
	Leu	Gin	Gin	Pro	Phe	Vai	Gly	Ala	Ala	Phe

( амино киселини 120 до 129 от SEQ ID N0 : 5 ) Използуват се за генериране чрез полимеразна верижна реакция / PCR / на 10 kD кодиращата област, използувайки царевична геномна ДНК / В85 щам / като шаблон. PCR се изпълняват използувайки кит на Perkin - Elmer Cetus, съгласно инструкциите на продавача, върху термоциклер, произведен от същата фирма.

Реакционният продукт, след пропускане през 1 % агарозен гел и оцветяване с етидиев бромид, показва силна ДНК ивица, с раз мер очакван за 10 kD зеиновия ген, 450 Ьр, със слаба ивица за около 650 Ьр. 450 Ьр ивицата се подлага на електро - елюиране върху DEAE целулозна мембрана / Schleider & Schuell / ο

с последващо елюиране от мембраната при 65 С с 1М NaCl, 0.1 mM

EDTA, 10 mM Tris - Cl, pH 8.0. ДНК се преципитира с етанол и се промива с 70 % етанол и се изсушава. Изсушените образувания се ресуспендират в 10 1 вода и аликвотно количество

/ бикновено 1 1 / се използува за друг комплект PCR реакции, за генериране чрез асиметрично попълвано на едно - верижни линеини ДНК. За целта, праймерите SM56 и CFC77 присъстват в 1 : 20 моларно съотношение и 20 : 1 моларно съотношение. Продуктите, и двата позитивни и негативни вериги от 10 kD зеинов ген, се екстрахират с фенол, преципитират се с етанол и се пропускат през NACS / Bethesda Research Laboratories / колона за отделяне на излишъка на олигомери. Елуатите се преципитират с етанол двукратно, промиват се с 70 Ία етанол и се изсушават. ДНК секвенирането се извършва чрез използуване на подходящите комплементарни праймери и секвеназен кит от United States Biochemicals Company, съгласно инструкциите на продавача. Последователността на PCR продукта е идентичен на публикуваната последователност на 10 kD зеин гена. Извършва се радиоактивно изследване с nick - транслация от PCR - генери52 ран зеин ген, използувайки Р - dCTP и nick - транслационен кит, набовен от Bethesda Research Laboratories.

Петнайсетте 150 - мм нетроцелулозни филтри, носещи

фаг плаките се скринират, използувайки радиоактивна 10 kD ген проба. След четири часа прехибридизация при 60 С в 50XSSPE, 5Х Denhardt’s, / виж Sambrook et al. ( 1989 ) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press / 0.1 Ία SDS, 100 г/л телешка тимусна ДНК, филтрите се прехвърлят на прясна хибридизационна смес, съдържаща денатурирания радиомаркиран 10 kD зеин ген ( cpm/mL ) и престояват и един час при 68 С в 1XSSC - 0.1 % SDS. Следва накапване вър ху 5ММ Whatman хартия, после се изсушава на въздух и се подедна нощ при 60 С. На следващия ден се промиват при строги условия : един час при стайна температура в 2XSSC - 0.5 Ί> SDS

-59о лага на авторадиография при -70 С с Kodak XAR - 5 филми с

R

Du Pont Cronex Lightning Plus интензифициращи екрани. От тези авторадиограми, се идентифицират 20 хибридизирани плаки. Тези плаки се взимат от оргиналното петриево блюдо и се посяват при разреждане равно на около 100 плаки на 80-мм блюдо. Тези плаки се абсорбират върхе нитроцелулозни филтри и се изследват отново, като се използува ъсъщата процедура.

След авторадиография, само една от първоначалните плаки, номер 10, показва две хибридизирани плаки. Тези плаки се из-

следват с пробата за трети път; всички дъщерни колонии хибридизират, което означава, че е изолирана чиста култура / клонове, колонии /.

ДНК се приготвят от тези фагови клонове, Л 10 - 1,

Л Ю - 2, използувайки протокол за ДНК изолация от малокалибрени течни . - фаг лизати / Ansual et al. ( 1987 ) Current Protocols in Molecular Biology, pp. 1.12.2, 1.13.5 - 6 /.

Смилането c рестрикционна ендонуклеаза и електрофорезата на

агарозен гел показват двата клона като идентични. ДНК фрагментите от агарозния гел се подлагат на Southern - Blott I виж Sambrook et al. ( 1989 ) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press / върху нитроцелулозни мембранни филтри и се изследват с радиоактивно маркиран 10 kD зеин ДНК, генерирана от nick транслация. Единичен 7.5 кб BamH I фрагмент и единичен 1.4 кб Xba I фрагмент хибридизират с пробата.

7.5 кб BamH I фрагмент се изолира от BaamH I смилане на ДНК, пропуснат през 0.5 % агарозен гел с ниска точка на топене ( LMP ). Изрямва се ивицата с 7.5 кб, разтваря се и се разрежда в 0.5 % NaCl и се нанася върху NACS колона, която се

промива след това с 0.5 % NaCl, 10 мМ Tris - Cl, pH 7.2, 1 mM EDTA и фратмента се елюира с 2 М NaCl, 10 mM Tris - Cl, pH 7.2, 1 mM EDTA. Този фрагмент се лигира с фагемид pTZ18R / Pharmacia /, който е разцепан с BamH I и се третира с телешка чревна алкална фосфатаза / виж Sambrook et al. ( 1989 ) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press / за да се избегне лигиране на фагемида към себе си.

В следствие трансформация на Е. coli се получават субклонове с тези трансформанти в двете ориентации като се държи сметка за pTZ18R ДНК.

Клонирана ДНК от фага, смляна с Xba I се пропуска през 0.8 % агарозен гел и се изолира 1.4 кб фрагмент, използувайки DEAE целулозна мембрана [ същата процедура както за PCR - генериран 10 kD зеин ДНК фрагмент, описана по - горе ]. Този фрагмент се лигира към pTZ18R, отрязън с Xba I, по същия начин, като описания по - горе. В следствие на трансформация на Е. coli се получават субклонове с тези фрагменти в двете ориентации, като се държи сметка за pTZ18R ДНК, обозначени като рХ8 и рХЮ. От субклоновете се образуват едноверижни ДНК използувайки протокола, осигуран от Pharmacia. Секвениран е целия 1.4 кб Xba I фрагмент. Допълнителни 700 близкостоящи бази до Xba I фрагмента са секвенирани от BamH I фрагмента в клон рВ5 / фрагмент рВЗ е в същата ориентация като рХ8 /, давайки последователност от общ брой 2125 бази /SEQ ID N0:1/.

ПРИМЕР 2

МОДИФИКАЦИЯ НА HSZ ГЕНА ЧРЕЗ САЙТ - НАСОЧЕН

МУТАГЕНЕЗ

В 1.4 kD Xba I фрагмента, носещ HSZ гена, присъстват три Neo I сайта, всички в HSZ кодиращата област. Желателно е да се поддържа само един от тези сайтове / нуклеотиди 751 756 в SEQ ID N0 : 1 /, който да съдържа колона за начало на транслация. Следователно, Neo I сайтовете на позиции 870 875 и 1535 - 1338 се елеминират чрез олигонуклеотид - насочен сайт - специфичен мутагенез / виж Sambrook et al. ( 1989 ) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press /. Синтезираните за мутагенезата олигонуклеотида са :

CFC99	ATGAACCCTT	GGATGCA	(	SEQ	ID	N0 :	8	)
CFC98	CCCACAGCAA	TGGCGAT	(	SEQ	ID	N0 :	8	)
Мутагеназът се	осъществява	чрез използуване	на	кит,	доставен

от Bio - Rad / Richmond, СА /, следвайки протокола, осигурен от продавача.

При този процес се променя А на Т при 872 и С на А при 1334. И двете са при трета позиция на съответните им колони и не причивяват промяна в кодираната от гена амино киселинна последователност, от ССА до ССТ, все още кодиращи за

Pro и GCC до GCA, все още кодиращи за Ala. Плазмидният клон, съдържащ модифицирания HSZ ген с единичен Neo I сайт при ATG стартовия кодон, се обозначава като рХ8т. Тъй като нативният HSZ ген притежава уникален Xba I сайт при стоп кодона на гена / 1384 - 1389, SEQ ID N0 : 1 /, пълно смилане на ДНК с Neo I и Xba I води до 637 Ьр фрагмент, съдържащ пълната кодираща последователност на предшественика на HSZ полипептида / SEQ ID N0 : 2 /.

Желателно е да се създаде форма на HSZ гена с алтернативни уникални рестрикционни ендонуклеазни сайтове, веднага след края на кодиращата област. За тази цел, олигонуклеотиди CFC104 / SEQ ID N0 : 10 / и CFC105 /SEQ ID N0 : 11 / :

-42CFC104 5’-CTAGCCCGGGTAC -3’ / SEQ ID NO : 10 /

CFC105 3^s- GGGCCCATGGATC-5’ / SEQ ID NO : 11 / се анилират и лигират в Xba I сайта, като се вмъкват два нови рестрикцонни сайта, Sma I и Κρη I, и се разрушава Xba I сайта. Уникалният с^га Xba I сайт от нуклеотиди 1 - 6 в SEQ ID N0 : 1 и Ssp I сайта от нуклеотиди 1823 - 1838 в SEQ ID

N0 се използуват за получаване на фрагмент, който включ ва HSZ кодиращата област плюс неговия 5’ и 3’ регулаторни области. Този фрагмент се клонира в достъпния на пазара вектор

pTZ19R / Pharmacia / клониран с Xba I и Sma I, водещ до плазмид рССЮ.

Желателно е да се създаде променена форма на HSZ гена с уникален рестрикциозен ендонуклеазен сайт при старта на зрелия протеин, т.е. с отделена амино крайна сигнална подледователност. За тази цел се генерира ДНК фрагмент, използувайки PCR както е описано в ПРИМЕР 1. ДНК шаблон за PCR реакцията е плазмид рХ8т. Олитонуклеотидни праймери за реак-

цията са :

CFC106 5’-CCACTTCATGACCCATATCCCAGGGCACTT-3 / SEQ ID N0 : 12 /

CFC88 5’-TTCTATCTAGAATGCAGCACCAACAAAGGG-3’ / SEQ ID NO : 13 /

CFC106 / SEQ ID NO : 12 / олигонуклеотида доставя на PCR генерирания фрагмент BspH I сайт / подчертан /, който, кога то се смели с BspH I осигурява лепкав край, идентичен на този, генериран от Neo I смилане. Този сайт се локализира на свръзката на сигналната последователност и зрялата HSZ кодираща последователност. CFC88 / SEQ ID N0 : 13 / олигонуклеотид, осигурява PCR - генерирания фрагмент с Xba I сайт / подчертан / при транслационния клай на HSZ гена. BspH I - Xba I фрагмента / SEQ ID NO : 3 /, получен чрез смилане на PCR -43генерирания, кодира зрялата форма на HSZ с добавяне на метионинов остатък при амино края на протеина, за да позволи инициирането на транслацията.

ПРИМЕР 3

ЕКСПРЕСИЯ НА HSZ ГЕНА В Е. coli

За да се експресира HSZ кодиращата последоветилност

в Е. coli, се използува бактериалния експресионен вектор рВТ430. Този вектор е производен на рЕТ - За / Rosenberg et al. ( 1987 ) Gene 56 : 125 - 135 /, който използува бактериофага Т7 РНК полимераза / Т7 промоторна система. Плазмида рВТ43О се конструира като първо се разрушава EcoR I и Hind .III сайтовете в рЕТ - За на тяхните оргинални / първоначални / позиции. Един олигонуклеотиден адаптор, съдържащ EcoR I и Hind III сайтове се инсерира след това при BamH I сайта на рЕТЗа. Това създава рЕТ - ЗаМ с допълнителни уникални клониращи сайтове за инсериране на гени в експресионния вектор. После, Nde I при позицията за иницииране на транслацията се превръща в Neo I сайт, използувайки олигонуклеотид - насочена мутагенеза. ДНК последователността от рЕТ - ЗаМ в тази област, 5’ - CATATGG ( Nde I подчертан сайт ), се первръща в 5’ -CCCATGG ( Neo I подчертан сайт ) в рВТ43О.

Neo I - Xba I фрагмента от pX8m / SEQ ID N0 : 2, виж

ПРИМЕР 2 / се изолира от агарозен гел след електрофореза, използувайки DEAE целулозна мембрана, както е описано в пример 1 . Този фрагмент се лигира към два анилирани олигонуклеотида, CFC104 ( SEQ ID N0 : 10 ) и CFC105 ( SEQ ID N0 : 11)

CFC104 5’-CTAGCCCGGGTAC -3’ ( SEQ ID NO : 10 )

CFC105 3’- GGGCCCATGGATC-5’ ( SEQ ID NO : 11 ) като се вкарват два нови рестрикционни сайта, Ssm I и Κρη I

-44при Xba I края на фрагмента. Лигирането се завършва чрез нао гряване при 65 С в продължение на 10 минути. Продукта от лигирането се смила с Ssm I, като се оставя фрагмент с 5’тъп край. Експресионният вектор рВТ43О се смила с EcoR I и лепкавите краища се попълват чрез прибавяне на άΑΤΦ, άΑΤΦ и фрагмент на Klenow от Е. coli ДНК полимераза. ДНК вектора с тъп край се смила с Neo I и реакционната смес се екстрахира с фенол

Neo

Neo и двукратно се преципитира с етанол. Фрагмента 640 Ър

I - Sma I, съдържащ HSZ кодиращата област, се лигира към

I - тъп рВТ430 вектор. Клон, съдържащ плазмид, обозначен като рСС11 се идентифицира чрез скриниране на Е. coll транс форманти за желания рекомбинантен продукт. Очаква се този плазмид да експресира предшественика на HSZ протеина.

Конструира се също плазмид, определен да експресира

HSZ протеина, без неговата сигнална последователност, в

Е. coli. Зрялият HSZ кодиращ ДНК фрагмент за тази конструкция се генерира, използувайки PCR с плазмид рХ8ш като шаблон и олигонуклеотидите CFC106 ( SEQ ID

N0 : 12 и CFC88 ( SEQ

ID N0 :

) като праймери, както е описано пример 2 :

CFC106 5’-CCACTTCATGACCCATATCCCAGGGCACTT-5’ ( SEQ ID N0 : 12 )

Met Thr His lie Pro Gly His Leu / амино киселини до 8 от

SEQ ID N0:3/

CFC88 3’-GGGAAACAACCACGACGTAAGATCTATCTT-5’ ( SEQ ID NO : 13 )

Pro Phe Vai Gly Ala Ala Phe End / амино киселини

185 до 191 от

SEQ ID NO : 3 /

-45CFC106 / SEQ ID NO : 12 / олигонуклеотид предоставя PCR фрагмента c BspH I сайт / подчертан по - горе /, коъто генерира лепливи крайща, идентични на Neo I. ATG последователността в сайта представлява колона за иницииране на транслацияна, а следващата я АСС последователност кодира за треониновия остатък при амино край на зрялия протеин. Xba I сайта в CFC88 / SEQ ID N0 : 13 / олигонуклеотида / подчертан по - горе / доставя подходящ сайт за клониране при края на кодиращата по следователност. Продукта на PCR реакцията се преципитира в

М амониев ацетат, и двукратно се промива с 70 £ етанол за отстраняване на излишъка от нуклеотидни праймери. Крайщата на ДНК фрагмента се правят тъпи чрез реакция с фратмента на Klenow от Е.coli ДНК полимераза, в присъствието на всичките четири дезоксирибонуклеотидни трифосфати. Реакционните про дукти се разделят чрез агарозна гел - електрофореза и се оцветяват с етидиев бромид. Доминиращата 570 Ър ивица се елуира, използувайки DEAE целулозна мембрана, както е описано по горе. След това ДНК се смила с BspH I, двукратно се преци-

питира с етанол и се лигира към същия Neo I - тъп рВТ43О експресионен векторен фрагмент,описан по - горе. Чрез скри ниране на Е. coli трансформантите за желания рекомбинантен продукт се идентифицира клон, съдържащ плазмид, обозначен ка то рСС12. Клонираният PCR - ганариран фрагмент се секвенира;

последователността е идентична на SEQ ID N0 : 3.

За да се открие експресия на HSZ полипептиди, плазмиди рСС11 и рСС12 се трансформират в Е. coli шам HMS174 и се извършва експеримент с in vivo маркиране, както е описано от Studier and Moffat ( 1986 ) J. Mol. Biol. 189 : 113 130. Протеините се маркират един час след индуцирането / чрез

-46инфектиране с_д фаг СЕ6, носеш Т7 РНК полимеразен ген / с 35

S - метионин, което се очаква да доведе до много забележително маркиране на тези богати на метионин полипептиди. Клетъчните екстракти се пропускат през SDS полиакриламидни телове, които се изсушават и се авторадиографират. Забележителна ивица с молекулно тегло около 20 kD е налична и в двата рСС11 и рСС12 екстракта. Това е приблизителният размер, очакван за дължината на зрялия HSZ полипептид и предполагащ че прекурсорният протеин, създаден в рСС11 трансформанта, е процесиран от Е. coll. Когато общия клетъчен протеин се прояви чрез оцветяване с блестящо Coomassie синьо следващо индукцията и SDS полиакриламидната гел - електрофореза, се открива в рСС12 лизата забележително индуциран 20 kD протеин, но не и в рСС11 лизата.

ПРИМЕР 4

ПРЕЧИСТВАНЕ НА HSZ ПРОТЕИНА, ПРОДУЦИРАН

В E.coli

- L култура на Е. coli щам BL21( DES )pLysE / Studier et al. ( 1990 ) Methods in Enzymology 185 : 60 - 89 /, транс формирана c pCC12, се култивира в LB среда, съдържаща ампио цилин / 100 мг/л / и хлорамфеникал / 10 мг/л / при 37 С. При оптическа плътност от 600 nm от 1.08, се прибавят 1.2 мл от

0.1 М IPTG / изопропилтио - и - галактозид, индуциращия агент / о и инкубацията продължава 3 часа при 57 С. Клетките се отде лят чрез центрофугиране, промиват се с 50 мМ NaCl; 50 мМ Tris Cl, pH 7.5; 1 мМ EDTA се ресуспендира с 10 мл от същия буфер о

и се замразява при -20 С.

Суспенсията се разтопява и се прибавя Triton X - 100 в концентрация 0.1 %, следвано от 3000 единици дезоксирибо-47нуклеаза I / Boehringer - Mannheim /. След инкубиране при стай на температура в продължение на 60 минути, суспенсията се подлага на ултразвук върху лед, с цел да се намали вискозитета. Сместа се центрофугира, а супернатантата се изхвърля. Плътната утайка се екстрахира двукретно с 5 мл 70 изопропанол;

мМ β- меркаптоетанол. HSZ, различен от повечето протеини, е разтворим в този разтворител. SDS полиакриламидна гел елек трофореза и оцветяване с блестящо Comassie синьо разкриват,

че HSZ протеинът е главния протеин от първата екстракция ( >90 Ί> ) и единственият присъстващ протеин във втората екстракця. Получени са между 10 и 100 мг HSZ протеин от 1л клетъчна кул тура. Пречистеният HSZ протеин е изпратен на Hazelton Research

Facility, 510 Swampridge Road, Denver, PA 17517, за получа ване на заешки антитела срещу протеина.

ПРИМЕР 5

КОНСТРУИРАНЕ НА ГЕН, КОДИРАЩ ЗА ДОМЕНА С ВИСОКО

СЪДЪРЖАНИЕ НА МЕТИОНИН НА HSZ

HSZ протеинът е съставен от централна област, много

богата на метионин / приблизително 48 % метионинови остатъци / обградена от амино крайна и карбокси крайна области с ниско съдържание на метионин / 10 % метионин и 7 % метионин, съответно /. Централната област се състои от повтарящ се мотив Met - Met - Met - Pro ( SEQ ID NO : 27 ). Свързаният 10 kD зеин протеин притежава подобна структура ( виж фигура 5 ).

Все пак, централната област на HSZ протеина е около два пъти по - широка от съответната област в 10 kD зейна, отчитайки повишеното съдържание на митионин на HSZ. Очевидната дупликация на централния домен с високо съдържание на метионин в

HSZ, сравнена с 10 kD зеин, предполага, че. централният домен

-48с високо съдържание на метионин трябва да притежава стабилна структура и би могъл да се експресира самостоятелно, като во ди до резервен протеин с много високо съдържание на метионин.

Конструиран е ген, който да кодира домена за високо съдържание зи PCR, се матричната на метионин ( HMD ) на HSZ. За да се осъществи то използува, както е описано в пример 1, рХ8 като

ДНК и олигонуклеотидите JR5 ( SEQ ID N0 : 14

JR6

SEQ ID NO : 15 ) като праймери за ДНК синтеза :

JR5

5’-TCACCGCTTCAGCAGTGCCATATGCCAATG-3’ ( SEQ ID N0 )

JR6

5’-TCTTAGAATTCTATGGCATCATCATTGGTGACACCATGCT-3’ ( SEQ ID N0 )

Ви*

Праймерът JR5 ( SEQ ID N0 : 14 ) причинява прибавянето на Nde I сайт ( подчертан по - горе ) в PCR продукта. Праймерът JR6 ( SEQ ID N0 : 15 ) прибавя един EcoR I сайт ( подчертан по - горе ) в PCR продукта. Тези сайтове позволяват лигиране на HMD към рЕТ - ЗаМ експресионния вектор / Rosenberg et al. ( 1987 ) Gene 56 : 125 - 135 и пример 3 /· ATG нуклеотидът от Nde I сайта представлява колона за иницииране на транслацията в експресионния вектор и EcoR I сайта непосредствено следва колона за прекратяване на транслацията.

PCR продукта се смила с Nde I и EcoR I и се лигира към рЕТ - ЗаМ, който е смлян с Nde I и EcoR I. След трансформацията на Е. coli, се идентифицират клонове, съдържащи желани рекомбинантен плазмид и се проверяват чрез ДНК секвениране на вмъкнатия ДНК фратмент. Нуклеотида и производната амино киселинна последоватерност на HMD гена е показана на

-49SEQ ID NO : 4.

ПРИМЕР 6

КОНСТРУИРАНЕ HA ХИМЕРИЧНИ ГЕНИ ЗА ЕКСПРЕСИЯ

НА HSZ В РАСТЕНИЯТА

Използуват се три зърно - спезифични ген експресионни касети за конструиране на химерични гени за експресия на HSZ в растенията. Експресионните касети съдържат регулаторните области от три гена за висока експресия на зърнени резервни протеини :

субединицата на субединицата на фазеолин от боб Phaseolus vulgaris;

конглицин от соя; и

3/ 10 kD зеин от царевица.

Касетите са показани схематично на фигура 2.

Фазеолиновата касета включва около 500 нуклеотида на-

горе ( 5’) от кодона за иницииране на транслацията и около 1650 нуклеотида надолу ( 3’) от кодона за прекратяване на транслацията на фазеолин. Между 5’ и 3’ областите са единствените рестрикционни ендонуклеазни сайтове Neo I / който включва ATG кодона за иницииране на транслацията /, Sma I, Κρη I и ХЬа I. Цялата касета е обградена от Hind III сайтове. ДНК последователността на тези регулаторни области е описана в литературата / Doyle et al. ( 1986 ) J. Biol. Chern. 261 :

9228 - 9238 /. Скорошни работи на Bustos et al. /( 1991 )

EMBO J. 10 ; 1469 - 1479 / посочван, че промоторната област на тази касета не включва всички елементи от ДНК последователността, нужни за пълното експресионно равнище на фазеолиновия промотор, но трябва да се очакват около 20 - 30 % от пълното равнище на експресия.

- конглициновата касета включва около 610 нуклео

-50тида нагоре ( 5’) от колона за иницииране на транслацията на 6 - конглицина и около 1650 нуклеотила надолу ( 5’) от колона за прекратяване на транслацията на фазеолин. Между 5’ и 5’ областите са единствените рестрикционни ендонуклеазни сайтове Neo I / които включват ATG колона за иницииране на транслацията /, Sma I, Κρη I и Xba I. Цялата касета е обградена от Hind III сайтове. ДНК последователността на тези регулаторни области е описана в литературата / Doyle et al. ( 1986 ) J. Biol. Chem. 261 : 9228 - 9238 /.

kD зеиновата касета включва около 925 нуклеотила нагоре ( 5’) от колона за иницииране на транслацията и около

945 нуклеотила надолу. ( 3’) от кодона за прекратяване на транс лацията на фазеолин. Между 5’ и 3’ областите са единствените рестрикционни ендонуклеазни сайтове Neo I / който включва ATG кодона за иницииране на транслацията / и Sma I. Цялата касета е обградена от един и Hind III сайтове при зи регулаторни области

EcoR I сайт при 5* края и BamH I, Sal I

3’ края. ДНК последователността на те е описана в литературата / Kirihara et al. ( 1988 ) Gene 71 : 359 - 370 /.

Neo I фрагмента, съдържащ цялата HSZ кодираща област / виж пример 2 / се изолира от аагарозен гел в следствие на електрофореза, използувайки DEAE описано в пример 1. BspH I - Хпа без сигналната последователност, целулозна мембрана, както е

I фрагмента, съдържащ гена

т.е. кодиращата последователност на зрялия протеин, се изолира както е описано в пример 3. Тези ДНК фратменти се вмъкват във фазеолиновата и р конглциновата експресионни касети, които са смляни с Neo I Xba I. Така се създават четири химерични гени :

1/ фазеолин 5’ област / нативен HSZ / фазеолин 3’ област

-512/ фазеолин 5’ област / зрял HSZ / фазеолин 3’ област

3/ ft - конглицин 5’ област / нативен HSZ / фазеолин 3’ област

4/ - конглицин 5’ област / зрял HSZ / фазеолин 3’ област

Котструирани са допълнителни химерични гени за да заместат нативната едносемеделна сигнална последоветилност на HSZ с двусемеделна сигнална последователност от фазеолин.

За тази цел се синтезират олигонуклеотиди CFC112 / SEQ ID N0 :

/ и CFC113 / SEQ ID N0 : 17 /. Анилирани са олигонуклеотиди от Neo I съвместим край и Nhe I / Spe I съвместим край

/ виж по - долу /.

CFC112 5’-CATGATGAGAGCAAGGGTTCCACTCCTGTTGCTGGGAATTCTT

CFC113 3’ TACTCTCGTTCCCAAGGTGAGGACAACGACCCTTAAGAA

Met Met Arg Ala Arg Vai Pro Leu Leu Leu Leu Gly lie Leu

CFC112 TTCCTGGCATCACTTTCTGCTAGCTTTG 3’ I SEQ ID NO : 16 / CFC113 AAGGACCGTAGTGAAAGACGATCGAAACGATC-5’ / SEQ ID NO : 17 /

Phe Leu Ala Ser Leu Ser Ala Ser Phe / SEQ ID NO : 16 /

Плазмид pCC13, съдържащ HSZ гена, обграден от фазеолин 5’ и 3’ регулаторни области, се смилат с Neo I и Spe I, отстранявайки по - голямата част от нативната сигнална последователност на HSZ. Анилираните олигонуклеотиди, CFC112 / SEQ ID N0 : 16 / и CFC113 / SEQ ID N0 : 17 / се лигират към смляния рСС13. Така създаденият плазмид се обозначава като рСС18, а последователността на химеричния ген, съдъражщ зрялия HSZ протеин, слян с фазеолиновата сигнална последователност, се потвърждава чрез ДНК секвениране / SEQ ID N0 : 18 /.

-52Тъй като Spe I сайта / нуклеотиди 57 - 62 в SEQ ID

N0 : 2 / не е на точното место на свръзка между HSZ сигнална последователност / зрял протеин, по този начин се добавят две допълнителни амино киселини между края на фазеолиновата сигнална последователност и зрялия HSZ протеин. С цел да се отделят тези HSZ фрагменти се генерира, чрез PCR, използувайки олигонуклеотидите FC114 / SEQ ID N0 : 19, виж по - долу / и CFC88 / SEQ ID N0 : 13, виж пример 2 / като праймери и рСС18 като ДНК матрица.

CFC114 TTCTGCTAGC TTTGCTACCC ATATCCCAGG G / SEQ ID N0 : 19 /

PCR продукта се смила с Nhe I и Xba I и се пречиства чрез гел електрофореза. Плазмидът рСС18 се смила със същия ензим за отстраняване на ДНК фрагментите, кодиращи за слятия протеин, съдържащ двете допълнителни амино киселини, a PCR - генерирания ДНК фрагмент след това се инсерира. Сруктурата на полу чения плазмид, обозначен като рСС24, се потвърждава чрез ДНК

секвениране / SEQ ID N0 : 20 /.

С цел да се замести нативната сигнална последователност на HSZ с фазеолиновата сигнална последователност в химеричния ген, който съдържа·^ - конглициновата 5’ област, синтезира се PCR - генериран фрагмент, използувайки CFC123 / SEQ ID N0 : 21, виж по - долу / и CFC88 / SEQ ID N0 : 13, виж пример 2 / като праймери и рСС24 като матрица.

PCR - генерираният ДНК фрагмент се смила с BspH I и Xba I и

CFC123 ACTAATCATG ATGAGAGCAA GGGTTCCACT / SEQ ID N0 : 21 /

53се пречиства чрез гел - електрофореза. Този ДНК фрагмент се инсерира в β - конглициновата експресионна· касета, която е била смляна с Neo I - Xba I и структурата на инсерирания фрагмент се потвърждава чрез ДНК секвениране / SEQ ID N0 : 20/„ Този плазмид се обозначава като рССЗО.

Олигонуклеотидите CFC104 / SEQ ID N0 : 10 / и CFC105 / SEQ ID N0 : 11 // виж пример 3 / се инсерират в 10 kD зеиновата касета при Xba I сайта при карбоксилния край, прибавяйки уникален Sma I сайт. Neo I - Sma I фрагмента, съдържащ

HSZ кодиращата област се изолира от плазмид рССЮ / виж при мер 2 / и се инсерира в Neo I - Sma I смляна 10 kD зеинова касета.

ПРИМЕР 7

ТРАНСФОРМАЦИЯ НА ТЮТЮН С ФАЗЕОЛИН - HSZ

ХИМЕРИЧНИТЕ ГЕНИ

Фазеолин - HSZ химеричните генни касети, фазеолин 5’ област / нативен HSZ / фазеолин 3 ’ област и фазеолин 5⁹ област / зрял HSZ / фазеолин 3’ област / пример 6 / се изоли-

рат като приблизително 2,3 kb Hind III фрагменти. Прибавят се Hind III - BamH I адапторни олигонуклеотиди към тези фраг менти, за инсерция в уникалния BamH I сайт на вектора pZS97K / фигура 3 /, който е част от бинарната Ti плазмидна векторна система / Bevan, ( 1984 ) Nucl. Acids. Res. 12 : 8711 8720 / от Agrobacterium tumefaciens. Векторът съдържа : 1/ химерична ген нопалин синтетаза / неомицин фосфотрансфераза ( nos : NPT II ) като селекционен маркер за трансформирани растителни клетки / Bevan et al. ( 1983 ) Nature 304 : 184 - 186 /,

2/ лявата и дясна граници на Т - ДНК от Ti плазмид / Bevan ( 1984 ) Nucl. Acids. Ress. 12 : 8711 - 8720 /,

3/ E. coli lacZ*^ - коплментарен сегмент / Vieria and Messing ( 1982 ) Gene 19 : 259 - 267 / c уникални рестрикционни ендонуклеазни сайтове за EcoR I, Kpn I, BamH I и Sal I, 4/ бактериалното начало на репликация от Pseudomonas плазмид pVS1 / Itoh et al. ( 1984 ) Plasmid 11 : 206 - 220 /, и

5/ бактериалният неомицим фосфотрансферазен ген от Тп5 / Berg et al. ( 1975 ) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 :

3628 - 3632 / като селекционен маркер за трансформирани А.

tumefасiens.

Фазеолин - HSZ химерична генна касета, фазеолин 5’ област / фазеолинова сигнална последователност / зрял HSZ / фазеолин 3’ област, ( пример 6 ) се изолира като един приблизителен 2.3 kb Hind III фрагмент. Този храгмент се инсерира в уникалния Kind III сайт на бинарния вектор pZS97 / фигура 4 /. Този вектор е подобен на pZS97K, описан по - горе, с изключение на присъствието на два допълнителни уникални клонирани сайта, Sma I и Hind III и бактериалния β - лактамазен ампицилина /, като селекген / причиняващ резистентност към ционен маркер за трансформирани А.

tumefaciens вместо бактериолния неомицин фосфотрансферазен ген.

Бинарните вектори, съдържащи химеричните HSZ гени се трансферират чрез три - родителско съчетаване / Ruvkin et al.

( 1981 ) Nature 289 : 85 - 88 / в Agrobacterium щам LBA4404 / pAL44O4 / Hockema et al. ( 1983 ) Nature 303 : 179 - 180 /.

Трансформантите Agrobacterium се използуват на тютюневи петури / Horsch et al. ( 1985 ) за инокулиране

Science 227 :

лектевна среда, съдържаща канамицин.

1229 - 1231 /· Трансгенетичните растения се регенират в се-55Геномна ДНК се извлича от млади листа и се анализира използувайки PCR за откриване присъствието на химеричните HSZ гени в трансформирания тютюн. Олигонуклеотидите CFC95 / SEQ ID N0 ; 22, виж по - долу / и CFC77 / SEQ ID N0 : 7, виж пример 1 / се използуват като праймери за PCR реакцията.

CFC93 GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA . / SEQ ID N0 : 22 /

Очаква трешен се тези праймери да генерират 425 Ър ДНК фрагмент, въ за HSZ гена. Шестнайсет от тестирани двадесет и чети ри трансформанта, са положителни за това изследване / виж та блици 1 и 2 /.

За да се изследва експресията на химиричните гени, трансформираните растения се оставят да разцъфнат, да се само опращат и да образуват семе. Общия протеин се извлича от зря лите семена както следва. Приблизително 200 мг зърна / семена / се поставят в 1.5 мл свободна пластмасова микрофужна епруветка и mM EDTA , осъществява / наконечници в 0.25 мл 50 мМ Tris - Cl, pH 6.8,

- меркаптоетанол. Смилането се автоматизирана мелачка със сменящи се дръжки /, определени да се поставят в епруветката. По лучените суспенсии се центрофугират в продължение на 5 мину ти при стайна температура, за отделяне на частиците. Съдър жанието на общ протеин на супернатантите са изследва, изпол зувайки опита на BioRad протеин с говежди серумен албумин ка то стандарт.

От всеки екстракт се пускат по 10 г протеин на патеха върху SDS полиакриламиден гел с бактериално продуциран зрял HSZ, служещ като положителна контрола и протеин, извле-56чен от нетрансформирани семена на тютюн, служещ като отрицателна контрола· След това протеините се попиват електрофоретично в нитроцелулозна мембрана. Мембраните се излагат на HSZ антитела / виж пример 4 / при разреждане 1 : 700 на заешки серум, използувайки стандарта\ен протокол, предоставен от BioRad с тяхния Immun - Blot Kit. След промиване за отстраняване на несвързаните първоначално антитела, мембраните се излагат на вторичното антитяло, магарешки анти - заешки Ig конюгиран с пероксидаза от хрян ( Amersham) при разреждане

: 3000. След промиване за отстраняване на несвързаното вторично антитяло, мембраните се обработват с хемилуминесцен тен реагент X - гау филм.

Повечето от трансформантите, които съдържат HSZ гена, базиращи се на PCR анализ, също продуцират KSZ протеин базиращ се на имунологичен скрининг ( таблици 1 - 3 ). При всички случаи размерът на продуцирания протеин е приблизително равен на зрялия KSZ, продуциран в Е. coli, показващ, че две те - нативната и фазеолиновата сигнална последователност,са отстранени, като това подсказва,че протеина е навлязъл в ендо плазматичния ретикулум.

Зърната също се екстрахират с 70 % изопропанол / 1 % меркаптоетанол, разтворител, в който се разтварят малко протеини, различни от HSZ. След това протеините се подлагат на SDS - PAGE, Western blotting, и имунологичен анализ,както е описано по-горе. При тези условия се наблюдава отново протеин с размера на зрялия HSZ, потвърждавайки идентичността на откритите протеини като HSZ.

Степента на експресия на HSZ в трансформираните линии се изчислява на база на чувствителността на HSZ антитяло

-57то и количеството протеин,зареден на SDS - PAGE гел. HSZ заема около 0.05 - 0.5 % от общия зърнен протеин.

За да се измери аминокиселинния състав на зърната, 6 зърна се хидролизират в 6 N солна киселина, 0.4 % 0 - меркаптоетанол в азотна среда,в продължение на 24 часа при 110 о

- 120 С; 1/10 от пробата се пуска на Beckman Model 6300 аминокиселинен анализатор.използувайки пост - колонно откриване с нинхидрин.

Относителните нива на метионин в зърната се сра-

вняват като отношение метионин : левцин, като по този начин левцинът се използува като вътрешен стандарт. На лице са около 6 % отклонение от стандарта в отношението метионин : лев цин. При най-високата степен на експресия на HSZ, определена чрез Western blot анализ,се очеква HSZ да повиши нивото на метионин в зърното с около 10 % . Тъй като това е толкова близо до стандартното отклонение, не се наблюдава ефект от експресията на HSZ върху общия зърнен метионин ( таблици 1 - 3 ).

Таблица 1	рСС1 5	тр ансформанти
фазеолин	5’ /	зрял HSZ / фазеолин 3’
LINE	PCR	Western	Met: Leu
15-17А	+	+
15-29А	+	-
15-34А	+	+
15-4ОА	+	+	0.19
15-50А	+	+++	0.19
15-55А	+	+
15-27В	+	+
15-49В		+
15-54В	+	—
Таблица 2	рСС16	трансформанти
фазеолин	5’ /	нативен HSZ / фазеолин	3’
LINE	PCR	Western	Met: Leu
1 6-7А	+	+++	0.20
16-16А	+	+
16-24А	-	-
16-48А	-	-
1 6-бВ	+	-
16-11В	-	-	0.19
16-ЗЗВ	+	+
16-49В	+	-
16-54В	+	-
16-55В	+	—

Таблица 5	рССЗб	трансформанти
фазеолин	5’ /	фазеолин ss / зрял	HSZ / фазеолин 3’
LINE	PCR	Western	Met:Leu
36-1В		+
36-4В		+
36-5А		+
56-20А		+++	0.20
36-23С		+
36-35В		++
36-39А		+
36-46В		++
36-47D		-
36-55D

-60ПРИМЕР 8 ( Studier et

ЕКСПРЕСИЯ НА HMD ПРОТЕИНА В Е. COLI

Култура от Е.coll щам BL21 ( DE3 ) pLysE al. ( 1990 ) Methods in Enzymology 185 : 60 - 89 ) трансформи рана с плазмид жаща ампицилин рХ8М - 18 се култивира о ) при 37 С.

в 10 л. LB среда , съдър ( 100 мг/л от около 1 при

600 нм. се добавя IPTG

При оптическа плътност ( изопропилтио - галактозид, индуктор ) до крайна концентрация цията се провежда в продължение на 8 часа при мМ и инкуба о

C. Клетките се събират чрез центрофугиране, промиват се с мМ NaCl, мМ Tris - Cl , ( рХ 7.5 ), 1 мМ EDTA ( буфер о мръзяват при - 80 С.

А ), и се за

Замръзените клетки се размръзяват върху лед в 5 мл от буфер А / грам клетки. Дозоксирибонуклеаза I ( Sigma ) се до бавя до концентрация 0.1 мг / мл. След инкубация при стайна температура в продължение на 60 минути суспенсията се обработва с ултразвук върху лед за намаляване на вискозитета. Сместта се центрофугира и супернатантата се изхвърля. Уплътнената утайка се екстрахира двукратно с 25 мл 70^ изопропанол, 10 мМ меркаптоетанол. HMD, както HSZ, е разтворим в този разтво рител. SDS полиакриламидна гел електрофуреза и оцветяване с блестящо Coomassie синьо показват че HMD протеинът е главният протеин на екстракцията. Western blot анализ показва че HMD протеинът реагира кръстосано със заешко антитяло срещу HSZ.

ПРИМЕР 9

ТРАНСФОРМАЦИЯ НА ТЮТЮН С

Р - КОНГЛИЦИНИН - HSZ

Химерични - конглиценин ген касети, β конглиценин 5’

ХИМЕРИЧНИ ГЕНИ

-61 област / нативен HSZ / фазеолин 3’ област, Р - ко ^лчцинин 5’ oblast / зрял HSZ / фазеоли 3’ област, и конг : -нин 5’ област - фазеолин сигнална последователност / зря ‘Z / фазеолин 3’ област ( приме.р б ) се изолират приб;т —елно като като 2.4 kb Hind III фрагменти. Тези рагменти ct рват в уникален Hind III site на бинарния вектор pZS97 *гура 4 ) =

Този вектор е подобен на pZS97K описан в пример о изклю чение наличието на два допълнителни уникални сайт а клониране,

Sma I и Hind III, и бактериален β лактамазен ге ващ резистентност към ампицилин ) като селекциони трансформиран A. tumefaciens вместо бактериален н фотрансферазен ген.

Бинарните вектори , съдържащи химеричните прехвърлят посредством три - родителски връзки ( (1991) Nature 289 : 85 - 88 ) върху Aarobacteriun / pAL4404 ( Hockema et al (1985), Nature 303 : 1

Agrobakterium трансформантите се използват тютюневи листни петури. ( Horesch et al. (

1985)

1229

1231 )). Тр ансгенетични растения се per ене предизвик ркер за чин фос ' гени се

Zin et al.

LBA44O4 >ане на .nsе 227 :

т в селек тивна среда съдържаща канамицин.

За анализ на експресията на химеричните г ,трансформираните растения се оставят до цъьтеж,самооп· •е и до зърно. Общият протеин се екстрахира от зрялите се както следва.Около 200 мг от зърната се поставят в 1.5 адвижна микрофужна епруветка и се смилат в 0.75 мл 50 мМ

- меркаптоетанол.

6.8 , 2mM EDTA, 1% SDS, 1%

Cl pH това се накрайници, направени така , че да влизат в микр;

та епроветка.

смилат като се използва електромелачк.ч с подвижи;

масови

-62Получените суспенсии се центрофугират в продължение на 5 ми нути при стайна температура в микрофужна епруветка за отстра няване на частичките. Съдържанието на общ протеин на супер >

натантите^ се изследва посредством BioRad протеинов анализ с говежди (^д^умен албумин като стандарт.

f ♦ < jpceKH екстракт 10 микрограма протеин пуска на пъ тека от SDS полиакриламиден гел , с получен бактериален зрял

HSZ , служещ като положителна контрола и протеин екстрахиран от нетрансформирани тютюневи семена , служещ като отрицателна

контрола. След това протеините се нанасят електрофуретично върху нитроцелулозна мембрана. Мембраните се подлагат на дей ствието на HSZ антитела ( виж примрр 4 ) при разреждане 1 : 700 заешки серум като се използва стандартния протокол предложен от BioRad с тяхния Immun - Blot кит. След промиване за отстра няване на несвързаното първично антитяло мембраните се подла гат на действието на второ антитяло, магарешки антизаешки Ig конюгиран с пероксидаза от хрян ( Amerscham ) при разреждане : 3000 . След промиване за отстраняване на вторичното анти -

тяло мембраните се подлагат на действието на Amerscham хемило минисцентен реагент и X - лъчи филм.

Един трансформант , съдържащ химеричен ген β - конгли цинин 5’ област / зрял HSZ / фазеолин 3’ област и два транс форманта съдържащи химеричния ген β - конглицинин 5’ област / нативен HSZ / фазеолин 5’ област, като всеки един произ вежда HSZ протеин. Четири от седем трансформанта съдържащи химеричния ген β - конглицинин 5’ област / фазеолин сигнална последователност - зрял HSZ / фазеолин 3’ област произвеждат

HSZ протеи ( таблица 4 ). При всичките случаи размерът на про дуцираният протеин е приблизително равен на зрялия HSZ проду -65циран в Е. coll , което показа 'аете нати”ята и фа зеолиновата сигнална последователност а отстранет ч това ' тичния р чкулум

За да се измери аминокиселик тав на чената , семена се хидролизират в 6 И солн :ина , меркаптоетанол в азотна среда в продал о

120 С ; 1 / 10 от пробата си>

ну. е на .са при

110 а модел

6300 аминокиселинен анализатор, като в семената се сравняват като отноше!

така левцинът се използва като вътр шението метионин левцин има около

Линията с най високо ниво на ίί.'Ζ <

Western blot анализ има най метион (

Тъй като това е много близко до гро:

вероятно това високо метиониново hi на HSZ >ползва г метионл : ионин андартно :ИЯ , б:

^; ри точн ължи на ко и нива ’ТНО лонение.

^т,а на ¹ семенен дното черване, тресията

-64таблица 4 рСС39 трансформанти

конглицинин

5*

фазеолин	сигнална секвенция	- зрял I
фазеолин	3’
LINE	Western	Met : :
59-1С	+	0.20
39-9С	-	0.20
39-1 ЗА	-	0.21
39-14С	+	0.20
39-15С	-	0.20
39-28А	++	0.21
39-36А	+	0.20

ПРИМЕР 10

КОНСТРУКЦИЯ НА ХИМЕРИЧЕН ГЕН ЗА ЕКСПРЕСИЯ НА HMD

В РАСТЕНИЯ

Както в пример 6 , се използва касета за зърно - спе ифична генна експресия за конструкция на химеричен ген за екс пресия на HMD в растения. Касетата за експресия съдържа регу латорна област от β - субединици на фазеолин от боб Phaseolus vulgaris о Създаденият химеричен ген също съдържа двусемеделна сигнална последователност от фазеолин : фазеолин 5’ област / фазеолин сигнална последователност / HMD / фазеолин 3’ об ласт .

PCR праймери , CLM 1 ( SEQ ID : 23 ) и CLM 2 ( SEQ

ID N0 : 24 ) ( виж по - надолу ) се синтезират и използват с плазмид pJRHMD! като матрица за генериране на ДНК фрагмент

-65съдържащ HMD последователност слята към 3’ края на фазеолин сигналната последователност и оградена от Nhel и Xbal сайтове. Плазмид рСС24 , разглеждан в пример 6 се смила с Nhel , който срязва в фазеолиновата сигнална последователност, и Xbal и се пречиства посредством agarose гел електрофуреза . Пречис теният вектор се свързва с PCR продукта , образуван от SLM 1 ( SEQ ID N0 : 23 ) , М 2 ( SEQ ID N0 : 24 ) и pJRHMD 1 , като така се регенерира пълната фазеолинова сигнална последовател ност , свързана към HMD. Свързаният продукт се означава pJRHMD 2 и последователността на химеричния ген ( SEQ ID

N0 : 25 ) се потвърждава от ДНК секвенцията.

CLM 1

Nhel

5’ TGCTTGCTAGCTTTGCTATGCCAATGATGATGCCGGGT 3’( SEQ ID N0 : 23)

AlaSerPheAlaMetProMetMetMetProGly

CLM 2

Xbal

5’ TGCTTTCTAGACTATGGCATCATCATTGGTGACACC 3’ ( SEQ ID NO : 24 )

ПРИМЕР 11

ТРАНСФОРМАЦИЯ HA СОЯ C ФАЗЕОЛИН - HSZ ХИМЕРИЧЕН ГЕН

За да се индуцират соматични ембриони, семеделни листа 4-5 мм дължина изрязани от стерилна повърхност , незряли о

зърна от соя култура ХР 3015 , се култивира на тъмно при 25 С на агарова среда ( SB1 или SB2 ) в продължение на 8-10 сед мици . Соматичните ембриони , които продуцират вторични ембри они се изрязват и се поставят в течна среда ( SB55 ). След повтаряне на селекцията за натрупване на соматични ембриони,

-66които се мултиплицират като ранни , ембриони от глобуларния стадий , суспенсията се запазва както е описано по - долу.

Суспенсионните култури от соеви ембриони се държат в 35 мл течна среда ( SB55 ) на ротационна клатачка 150 оборота о в минута при 28 С със смесена флуоресцентна и бяла свет лина в продължение на 16 : 8 часа ден / нощ по расписание. Културите се субкултивират всеки 4 седмици чрез инокулиране на приблизително 35 мг от тъкънната култура в 35 мл течна среда.

Суспенсионните култури от соеви ембриони се трансфор мират по метода на бомбардиране с частици ( Kline et al. (1987) Nature (London) 327 : 70 , U.S. Patent No. 4,945,050 ) . 3a (ζ) тази трансформация се използва Du Pont Biolistic PDS 1000/HE инструмент ( helium retrofit ) .

Плазмидният вектор , използван за трансформация , προ излиза от pGEM9Z ( Ргomega Biologikal Research Products ) . Като селективен маркер , химеричен ген съставен от 35S про моторът от вируса на мозайката по карфиола ( Odell el. (1985) Nature 313 : 810-812 ) , хидромицин фосфотрансферазният ген от плазмид pJR225 ( от Е. Coli ) ( Grtz et al. ( 1985 ) Gene 25 : 179 - 188 ) и 3’ областта на нопалин синтетазния ген от Т - ДНК на Ti плазмид от Agrobacterium tumefaciens ( SEQ ID NO : 26 ) е на Sal I сайта на вектора . Фазеолин - HSZ химе ричната касета , фазеолин 5’ област / фазеолин сигналната сек венция / зрял HSZ / фазеолин 5’ областта , ( пример 6 ) се изолира приблизително като един 2.3 кб Hind III фрагмент.

Този фрагмент се инсерира в уникалния Hind III сайд на вектора.

Към 50 микролитра едно микромуларна суспенсия с кон центрация 60 мг на мл златни частици , се прибавят ( последо вателно ) ; 5 микролитра ДНК ( един микрограм на микролитър ) ,

-6720 микролитра спермидин ( 0.1 М ) , и 50 микролитра CaCL ( 2.5 М ) получената смес от частици се разбърква в продъл жение на 3 минути , върти се на микрофуга в продължение на 10 секунди и супернатантата се отделя . Частичките , сздържали ДНК след това се промиват еднократно в 400 микролитра 7О?6 етанол и се ресуспендират в 40 микролитра анхидро етанол . Суспенсията ДНК / частици се третират трикратно с ултразвук , в продължение на 1 секунда всеки път . Пет микролитра от задържалите ДНК златни частици след това се нанасят на макроносителен диск .

Приблизително 300 - 400 мг от суспенсия на четириседмична култура се поставя в празно петриево блюдо 60 х 15мм и остатъчната течност се отстранява от тъканта с пипета.За всеки експеримент по трансформиране обикновенно се бомбардират приблизително 5-10 петрита с тъкан.Налягането за разкъсването на мембраната се установява на 1000 psi и камерата се евакуира от 28 инча живачен стълб.Тъканта се поставя на разстояние приблизително 3.5 инча от защитния екран,и се бомбардира трикратно.След бомбардирането тъканта се връща отново в течността,и се култивира,както епосочено по-горе=

Седем дни след бомбардирането,течната среда се подменя със свежа SSB55,съдържаща 50 мг/мл хигромицин.Селективната среда се подновява всякя седмица.Седем седмици след бомбардирането , се наблюдава прорастване на зелена,трансформирана тъкан,от нетрансформираните.некротични,ембриогенни клостери.Изолираната зелена тъкан се отстранява и се инокулира в индивидуални колби за ново генериране,на клонално разпространени, суспенсии на ембриогенни култури.Така всяка нова линия се обработва като независимо трансформационно събитие. Тези суспенсии могат след това да се субкултивират, и да се

-68поддържат като клостери на незряли ембриони,или да се регенерират в цялостните растения посредством узряване и растеж на индивидуални соматични ембриони.

Трансформираните ембриогенни клостери се отстраняват от течната култура,и се прехвърлят на твърда агарова среда (SB105),която не съдържа хормони,или антибиотици.Ембрионите о

се култивират в продължение на осем седмици при 26 0 със смесени флуоресцентна и бяла светлини,при 16:8 ден/нощ часово разписание.В течение на този период.индивидуални ембриони се отделят от клостерите,и се анализират за продуциране на HSZ протеина,както е описано по-надолу.След осем седмици ембрионите са подходящи за растеж.

Индивидуални ембриони се замразяват в течен азот и се смилат до фин прах в хаванче , като пестика предварително се замръзява с течен азот . Прахът се слага в епендорфна цен трофужна епроветка и се екстрахира двукратно с хексан при о

стайна температура . Остатъкът се инкубира при 60 С в про дължение на 50 минути , за да се даде възможност остатъчният хексан да се изпари . След това 100 микролитра от 50 мМ Tris - НС1 pH 6.7 , 2 тМ EDTA , 1% SDS , 1% β- меркапто етанол ( TES ) се добавя към утайката и се смила при ниска скорост в продължение на 10 секунди , като се използва елек трическа мелачка с подвижни пластмасови накрайници , които са направени така , че да влизат в микрофюжната епруветка. Получената суспенсия се цунтрофугира в продължение на 5 минути при стайна температура в микрофюйжна епруветка и супернатантата се отстранява и се запазва.Утайката се ресуспендира в 50 микролитра 70¾ изопропанол,10 мМ - меркаптоетанол посредством смилане,както по-горе.Епруветката се инкубира при

-69о

С в продължени4 на 5 минути, и се центрофугира,както погоре . Супернатантата се запазва,и утайката се екстрахира отново с 50 микролитра 70% изопропанол, 1 0 мМ β -меркаптоетанол. Алкохолните екстракти се събират и се лиофилизират ; след това остатъкът се ресуспендира в 50 мкл TESβ . Тази проба и първият екстракт с TESy0 се изследват за наличие на HSZ протеин чрез Western blot, както е описано в пример 9.Две от три тестирани трансформирани линии показват експресия на HSZ протеин.

СРЕДИ :

SB55 разтвори на Stock ( грам на литър )

MS сулфат 100 х Stock

MgSO 4	7H 0 2	37.0 ,
MnSO	H 0	1.69,
4	2
ZnSO	7H 0	0.86
4	2
CuSO	5H 0	0.0025
4	2

MS Халиди 100 n Stock

CaCl	2H 0	44.0,
2	2
KI		0.083,
CoCi	6H 0	0.00125
2	2

MS Ρ,Β,Μο 100 n Stock
KH PO 2 4	17.0,
H BO	0.62

3

Na MoO 2H 0

4 2

0.025

-70MS FeEDTA 100 n Stock

Na EDTA

FeSO 7H 0

2

3.724,

2.784

B5 Витамин Stock r m - инозитол,

100 мг никотинова киселина,

100 мг пиридоксин НС1,

г тиамин

SB55 ( на литър ) мл от всеки MS stock, мл В5 Витамин stock

0.8 г NH N0

3

3.033 г KNO мл 2,4 - D ( 10 мг/мл stock) г захароза

0.667 г аспарагин pH 5.7

SB 105 ( на литър )

MS Соли % малтоза

750 мг MgCl

0.28 Gelrite pH 5.7

-71 SB1 ( на литър )

MS Соли

В5 Витамини

0.175 М гликоза мг 2 , 4 - D

0.8 % агар pH 5.8

SB2 също,както SB1,с изключение на 40 мг/ л 2,4 - D.

ПРИМЕР 12

ТРАНСФОРМИРАНЕ НА ЦАРЕВИЦА С ГЕН ЗА РЕЗЕРВЕН ПРОТЕИН

С ВИСОКО СЪДЪРЖАНИЕ НА СЯРА

Калусни култури се инициират от незряли ембриони ( около 1.5 до 2.0 мм ) отрязани от ядките на зърната,про излизащи от кръстосването на генотипи А188 и В73,от 10 до 12 дни след опрашването.Ембрионите се поставят със страната на главното стебло обърната надолу и в контакт с твърда агарозна N6 среда.

о

Ембрионите се съхраняват на тъмно при 27 С . Рохкавият ембри огенен калос , който се състои от недиференцирани маси на клет ки със суматични проенброиди и емброиди зародили се върху суспенсионни структури , пролиферира от скутелума на тези не зряли ембриони . Ембриогенният калос , изолиран от първичният explant , се култивира на среда N6 , и се субкултивира на тази

-72среда от две до три седмици .

Използав се методът на бомбардиране с частици за пре даване на гени на клетките от халосната култура . За този ек сперимент се използва Biolistic PDS - 1000 / He ( BioRAD Laboratories , Hercules , СА ).

В тази трансформация се използва плазмиден вектор , съдържащ ген със селективен маркер . Плазмидият pALSLUC ( Fromm et al. (1990) Biotecnology 8:833-839 ) , съдържащ сДНК на заревична ацетолактат синтетазен ( ALS ) ген . ALS сДНК

мутира in vitro така че ензимът кодиран от гена да бъде ре зистентен на хлорсулфурон . Промянатаа се състои в мутиране на триптофан кодон на позиция 1626 от сДНК в левцин кодон . Генът

ALS е под контрола на 35S промотор от вируса на мозайката по карфиола .( Odell et al. , (1985) Nature 315:810-812 ) и 3U областта на нопалин синтетазният ген от Т - ДНК на Ti - плаз мид на Agrobacterium tumefaciens . Този плазмид също съдър жа ген , който използва 35S промотора от вируса на мозайката по карфиола и 3U областта на нопалин синтетазния ген за екс -

пресиране на луцифераза кодираща област от светулка ( de Wet et al. (1987) Molec. Sell Biol 7:725 - 737 ). Химеричниат HSZ ген се отделя върху вторичен плазмид . Този плазмид ( рСС21, виж пример 6 ) съдържа HSZ кодиращата област под контрола на промотор областта и 3U края от гена който кодира за 10 kd ген резервен протеин от царевица ( Kirihara et al. (1988) Gene 71:359-370 ) .

Тези плазмиди ( pALSLUC и рСС21 ) се съутаяват върху повърхност от златни частици . За да се осъществи това , 5 мкг от pALSLUC и 2 мкг от рСС21 ( всеки от тях в Tris - EDTA бу фер при концентрация около около 1 мкг / мкл ) се прибавят към

-7350 мкл от златни частици ( среден диаметър 1 Е 5 м ) , сус пендирани в вода ( 60 мг злато на мл ) . След това към сус пенсията злато - ДНК се добавят калциев хлорид ( 50 мкл от 2.5 М раствор ) и спермидин ( 20 мкл от 1.0 М раствор ) , и епроветката се обработва на вортекс. След това чаастичките се центрофугират на микрофужни епроветки в продължение на 10 се кунди и супернатантата се отделя . След това частичките се ре суспендират в 200 мкл абсолютен етанол . Частичките отново се центрофугират и супернатантата се отделя . След това частич ките се ресуспендират в 30 мкл етанол . След това 5 мкл от задържалите ДНК златни частици се поставят върху всеки макро дисков носител .

Малки клъстери ( от 2 до 3 мм в диаметър ) от ембри огенния калос се нареждат върху повърхността на втвърдена ага розна N6 среда , съдържаща в петриеви блюда с диаметър 12 см . Тъканта покрива кръгла повърхност от около 6 см в диаметър .

Петриевите блюда съдържащи тъканта се поставят в камера при

PDS - 1000 / Не . След това въздухът от камерата се евакуира до вакуум от 28 инча живачен стълб . Макроносителят се уско рява с ударна хелиева вълна , като се използва разкъсването на менбраната която се пръсва когато налягането на хелия в шоковата епроветка достигне 1000 psi . Тъканта се поставя приблизително на 8 см от защитния екран . След това петри евите блюда с тъканта се бомбардират с задържалите ДНК-зла тни частици .

Седен дни след бомбардирането тъканта се прехвърля върху среда N6 , която съдържа хлор - сулфурон ( 50 нМ ) , и отсъствие на казеин или пролин . Тъкаанта продължава да расте бавно на тази среда . След още две допълнителни сед -Ί4мици тъканта се прехвърля на свежа среда N6 , съдържаща хлор сулфурон . След 8 седмици една повърхност с около 1 см в ди аметър от активно прораснал калус се идентифицира в едно от петриевите блюда , съдържащо обогатена с хлорсулфурон среда . Този калус продължава да расте , когато се събкултивира върху селективна среда . Една част от този калус се прехвърля на среда , която позволява регенерирането на растението .

На този калус се измерва луциферазната активност . Не трансформираните калусни тъкани имат луциферазна активност от /*· около 500 светлинни единици на мг. свежа тъкан . Калусът , кой то расте върху хлорсулфурон

000 светлинни единици на има луциферазна активност от около мг свежа тъкан . Този резултат показва,че гените от pALSLUK са експресирани в тази калусна линия .Извършва се анализ на Southern,за наличие и на двата вмъкнатия ALS ген,и вмъкнатия химеричен ген за резервен протеин. И двата вкарани гена се наоблюдават при Southern анализ.

За анализ на

HSZ гена.геномна ДНК от трансформираната калусна линия (Тх

- Х8А ) , или калус , производен на същия генотип , но това не се трансформира ( АВ91 ) а се смила или с

Xba I или EcoR I . Смляната

ДНК се фракционира посредством гел електрофуреза върху агароза , и се прехвърля върху найлонова мембрана , като се използва стандартна техника . Петното върху найлона се хибридизира с пробата,приготвена от част от HSZ колиращата област. Калус АВ91 показва една доминантна ивица,която съответствува на нативния HSZ гена . В калус Тх - Х8А се открива една допълнителна ивица с по - високо молекулно тегло.

Тази ивица съответствува на вмъкнатия химеричен HSZ ген .

-75N6 СРЕДА :

количество за литър

компоненти

разтвор I	10.0	мл
CaCl ( 1М )		1.25	мл
2
разтвор III		10.0	мл
MgSO ( 1М )		0.75	мл
4
разтвор V		1 .0	мл
витамин на Сток		1 .0	мл
казеинов хидролизат	0.1	г
захароза		60.0	г
Мио - инозитол		0.1	г
2.4-D ( 2 мг/мл	Сток )	0.5	мл
pH до 5.8
добавят се б гр.	агароза на	петри

разтвор I
( NH ) SO	23.0	г
4 2 4 ΚΝ0	141.5	г
3 КН РО	20.0	г
2 4 Н 0	500.0	м

витамин на Stock

ниацин	0.1 3	г
тиамин	0.025	г
пиридоксин	0.025	г
калциев пантотенат	0.025	г
Н 0	100.0	мл

-76количество за литър компоненти разтвор III

Na EDTA

FeSO .7H 0

2

H 0 .85 г

1.55 г

500.0 мл разтвор V

Н BO

MnSO .H 0

ZnSO .7H 0

KI

Na MoO .2H 0

42

CuSO .5H 0

CoCi .2H 0

2

H 0

0.16 r

0.53 r

0.15 r

0.08 r

0.025 r

0.0025 r

0.0025 r

100.0 r

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ /1/ ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ /А/ ЗАЯВИТЕЛ:

SAVERIO С. FALCO

CHOK-FUN CHUI

ЗАГЛАВИЕ

JANET A. RICE

НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: ГЕН КОДИРАЩ СЕМЕНЕН ПРОТЕИН

С ВИСОКО СЪДЪРЖАНИЕ НА СЯРА И МЕТОД ЗА ПОВИШАВАНЕ СЪДЪРЖАНИЕТО НА СЕРНИ АМИНО КИСЕЛИНИ В РАСТЕНИЯТА

ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ:

БРОЙ НА

АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:

/А/	АДРЕСАНТ:	Е. I. DU PONT DE N1
		AND COMPANY
/В/	УЛИЦА:	1007 MARKET STREET
/с/	ГРАД:	WILMINGTON
/Ф	ЩАТ:	DELAWARE
/Е/	ДЪРЖАВА:	U.S.A.
А/	ZIP	19898

А/ ΦΟΒΙΑ, КОЯТО /А/ /В/ /С/ ж

/Л/

СЕ

СРЕДЕН ТИП

КОМПЮТЪР

ОПЕРАЦИОННА

СОФТУЕЪР:

ТЕКУЩИ ДАННИ

ЧЕТЕ ДИРЕКТНО ОТ КОМПЮТЪРА:

ДИСКЕТА,3.50 инча,1.0МВ

МАКИНТОШ

СИСТЕМА: · СИСТЕМА МАКИНТОШ, 6.0

МИКРОСОФТ УЪРД, 4.0

ПО ЗАЯВКАТА:

/а/	НОМЕР НА ЗАЯВКАТА:
/в/	ДАТА НА ПОДАВАНЕ:
/с/	КЛАСИФИКАЦИЯ:
//Ζί/	ПРИОРИТЕТНИ ДАННИ ПО	ЗАЯВКАТА:
/А/	ПРИОРИТЕТНА ДАТА:	14 февруари
/в/		07/656,687
/V t	ПАТЕНТЕН ПРЕДСТАВИТЕЛ/АГЕНТ:

1991 г /А/ /В/ /С/

Линда Аксамети Флойд

РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 33,692

РЕФЕРАТИВЕН НОМЕР: ВВ-1027-А

-is /1х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ТЕЛЕКОМУНИКАЦИЯ:

/А/ ТЕЛЕФОН: /302/ 092-4929 /В/ ТЕЛЕФАКС: /302/ 892-7949 /С/ ТЕЛЕКС: 835420 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА SE-Q о /уО:1:

/ / ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 2123 нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /и/ ВЕРИГА: единична // /ТОПОЛОГИЯ/: линейна /U/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: геномна ДНК /di/ ХИПОТЕТИЧНА: НЕ /|>/ АНТИ-СЕНС: НЕ

А/ , W НА ФРАГМЕНТА:

/^/ ОРИГИНАЛЕН ИЗТОИЦИК:

/А/ иРГАНИЗЪМ: царевица /В/ ЩАМ: неизвестен /С/ ТИП КЛЕТКА: неизвестен /i/Н/ НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК: , /к/ БАНКА: геномна царевична банка, получена otgCg’MLccl /В/ кЛОН: Х8 /vdi/ П03^иЦ^т'Я В ГЕНОМА: неизвестна /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАПД™: непубликувана последователност /хЕ/ иП^ттСАН^т<Е НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: S&Q 10 N0:1:

TCTAGAGCCT	АТТАССАТСТ	CTACTCACGG	GTCGTAGAGG	TGGTGAGGTA	50
GGCTACAGCT	GGTGACAATC	СТАСТСАССС	TTTGTAATCC	TCTACGGCTC	100
TACGCGTAGT	TAATTGGTTA	GATGTCAACC	СССТСТСТАА	GTGGCAGTAG	150
TGGGCTTGGT	TATACCTGCT	AGTGCCTGGG	GATGTTCTAT	TTTTCTAGTA	200
GTGCTTGATC	AAACATTGCA	TAGTTTGACT	TGGGACAAAC	TGTCTGATAT	250
АТАТАТАТАТ	TTTTGGGCAG	AGGGAGCAGT	AAGAACTTAT	TTAGAAATGT	300
AATCATTTGT	TAAAAAAGGT	TTAATTTTGC	TGCTTTCTTT	CGTTAATGTT	350
GTTTTCACAT	TAGATTTTCT	TTGTGTTATA	TACACTGGAT	АСАТАСАААТ	400

TCAGTTGCAG	TAGTCTCTTA	АТССАСАТСА	GCTAGGCATA	CTTTAGCAAA	450
AGCAAATTAC	ACAAATCTAG	TGTGCCTGTC	GTCACATTCT	СААТАААСТС	500
GTCATGTTTT	ACTAAAAGTA	CCTTTTCGAA	GCATCATATT	AATCCGAAAA	550
CAGTTAGGGA	AGTCTCCAAA	TCTGACCAAA	TGCCAAGTCA	TCGTCCAGCT	600
TATCAGCATC	CAACTTTCAG	TTTCGCATGT	GCTAGAAATT	GTTTTTCATC	650
TACATGGCCA	TTGTTGACTG	CATGCATCTA	TAAATAGGAC	CTAGACGATC	700
AATCGCAATC	GCATATCCAC	TATTCTCTAG	GAAGCAAGGG	AATCACATCG	750

СС 752

ATG Met

GCA Ala -20

GCC Ala

AAG Lys

ATG Met

TTT Phe

GCA Ala -15

TTG Leu

TTT Phe

GCG Ala

CTC Leu

CTA Leu -10

GCT Ala

CTT Leu

TGT Cys

797

GCA

ACC

GCC

ACT

AGT

GCT

ACC

CAT

ATC

CCA

GGG

CAC

TTG

TCA

CCA

842

Ala

Thr

Ala

Thr

Ser

Ala

Thr

His

lie

Pro

Gly

His

Leu

Ser

Pro

-5

1

5

СТА

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCA

TGG

ATG

CAG

TAC

TGC

887

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Ala

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

Gin

Tyr

Cys

10

15

20

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

932

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Vai

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

Thr

Leu

25

30

35

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

977

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

40

45

50

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

1022

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

55

60

65

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

1067

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Vai

Pro

Thr

Met

Met

Ser

70

75

80

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

1112

Pro

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

85

90

95

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

1157

Met

He

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

He

100

105

HO

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

1202

Met

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

He

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

115

120

125

CCA ATG

ATG ATG

CCG AGC

ATG Met

GTG Vai

TCA Ser

CCA Pro

ATG ATG

ATG Met

CCA Pro

AAC Asn

1247

Pro 130

Met

Met

Met

Pro

Ser 135

Met 140

Met

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

1292

Met

Met

Thr

Vai

Pro

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

lie

Ser

His

He

145

150

155

АТА

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCC

ATG

1337

lie

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

160

165

170

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

1382

Ala

He

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Vai

Gly

Ala

Ala

175

180

185

TTC TAG ATCTAGATAT AA 1400

Phe

190

GCATTTGTGT AGTACCCAAT AATGAAGTCG GCATGCCATC GCATACGACT1450

CATTGTTTAG GAATAAAACA AGCTAATAAT GACTTTTCTC TCATTATAAC1500

TTATATCTCT CCATGTCTGT TTGTGTGTTT GTAATGTCTG TTAATCTTAG1550

TAGATTATAT TGTATATATA ACCATGTATT CTCTCCATTC CAAATTATAG1600

GTCTTGCATT TCAAGATAAA TAGTTTTAAC CATACCTAGA CATTATGTAT1650

ATATAGGCGG CTTAACAAAA GCTATGTACT CAGTAAAATC AAAACGACTT1700

ACAATTTAAA ATTTAGAAAG TACATTTTTA TTAATAGACT AGGTGAGTAC1750

TTGTGCGTTG CAACGGGAAC ATATAATAAC ATAATAACTT ATATACAAAA1800

TGTATCTTAT ATTGTTATAA AAAATATTTC ATAATCCATT TGTAATCCTA1850

GTCATACATA AATTTTGTTA TTTTAATTTA GTTGTTTCAC TACTACATTG900

CAACCATTAG TATCATGCAG ACTTCGATAT ATGCCAAGAT TTGCATGGTC1950

TCATCATTGA AGAGCACATG TCACACCTGC CGGTAGAAGT TCTCTCGTAC2000

ATTGTCAGTC ATCAGGTACG CACCACCATA CACGCTTGCT TAAACAAAAA2050

AACAAGTGTA TGTGTTTGCG AAGAGAATTA AGACAGGCAG ACACAAAGCT2100

ACCCGACGAT GGCGAGTCGG TCA2123 /2 / ИНФОРМАЦИЯ ЗА ip :2:

/ ¹ / ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: /А/ ДЪЛЖИНА: 639 нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /3/ ВЕРИГА : единична /5/ ТОПОЛОГИЯ : линейна /{{/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро мутирана геномна ДНК /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ: непуб_ЛИКув_{й8&ледователнос} /хб/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ФО Ю νϊ'Ζ

СС ATG GCA GCC AAG ATG ТТТ GCA TTG ТТТ GCG СТС СТА GCT СТТ TGT 47

Met Ala Ala Lys Met Phe Ala Leu Phe Ala Leu Leu Ala Leu Cys

-20

-15

-10

GCA

ACC

GCC

ACT

AGT

GCT

ACC

CAT

ATC

CCA

GGG

CAC

TTG

TCA

CCA

92

Ala

Thr

Ala

Thr

Ser

Ala

Thr

His

He

Pro

Gly

His

Leu

Ser

Pro

-5

1

5

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

CAG

TAC

TGC

137

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Ala

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

Gin

Tyr

Cys

10

15

20

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

182

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Vai

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

Thr

Leu

25

30

35

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

227

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

40

45

50

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

272

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

55

60

65

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

317

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Vai

Pro

Thr

Met

Met

Ser

70

75

80

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

362

c

Pro 85

Met

Thr

Met

Ala

Ser 90

Met

Met

Pro

Pro

Met 95

Met

Met

Pro

Ser

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

407

Met

lie

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

lie

100

105

110

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

452

Met

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

lie

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

115

120

125

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

497

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Vai

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

130

135

140

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

542

Met

Met

Thr

Vai

Pro

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

He

Ser

His

lie

145

150

155

587

ATA lie 160

CAA Gin

CAA Gin

CAA Gin

CAA Gin

TTA Leu 165

CCA Pro

TTC ATG

TTC Phe

AGC Ser 170

CCC Pro

ACA Thr

GCA Ala

ATG Met

Phe

Met

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

Ala

He

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Vai

Gly

Ala

Ala

175

180

185

ТТС TAG A 639

Phe

190 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА IP N(? :3:

/// ХАРАКТЕРИСТИКИ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 579 нуклеатида /В/ ТИП: ДНК /С/' ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ : линейна /н / МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро мутирана геномна ДНК /х/ WOPKAW ЗА ПУБЛМ1рт_:непуб_ЛИКу_{йаВ9едователнос}._т /х ι / ОП«САН’’Е НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SfC ίο N ύ :i :

ТС ATG ACC CAT ATC CCA GGG CAC TTG TCA CCA CTA CTG ATG CCA TTG 47

Met Thr His lie Pro Gly His Leu Ser Pro Leu Leu Met Pro Leu

10 15

GCT Ala

ACC Thr

ATG Met

AAC Asn

CCT Pro 20

TGG Trp

ATG Met

CAG Gin

TAC Tyr

TGC Cys 25

ATG Met

AAG Lys

CAA Gin

CAG Gin

GGG Gly 30

92

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

137

Vai

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

Thr

Leu

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

35

40

45

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

182

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

Pro

Met

Met

Met

Pro

50

55

60

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

227

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Met

Pro

Ser

Met

Met

65

70

75

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

272

Pro

Ser

Met

Met

Vai

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Ala

80

85

90

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

317

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

lie

Ser

Pro

Met

95

100

105

- В5-

ACG Thr

ATG Met

CCG AGT ATG ATG CCT

TCG ATG ATA ATG

CCG Pro

ACC ATG

ATG Met 120

362

Pro

Ser

Met 110

Met

Pro

Ser

Met

He 115

Met

Thr

Met

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

407

Ser

Pro

Met

He

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

125

130

135

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

452

Ser

Met

Vai

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

Met

Met

Thr

Vai

Pro

140

145

150

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

497

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

lie

Ser

His

He

He

Gin

Gin

Gin

Gin

155

160

165

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG .

542

Leu

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

Ala

He

Pro

Pro

Met

170

175

180

TTC

TTA

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAG

A

579

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Vai

Gly

Ala

Ala

Phe

165

190

/2/

ИНФОРМАЦИЯ

3A

S&N I

.5 ,t

!? ·

4:

/Ф ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА : 281 нуклеотида /V ТИП: ДНК /С/ ВЕРИГА: единична

ТОПОЛОГИЯ: линейна /ιί/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро мутирана геномна ДНК /^х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ: непубликувана последователнос /хЧ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: jo 0:4:

CAT ATG Met

CCA ATG Pro Met

ATG Met

ATG CCG

GGT ATG

ATG Met

CCA Pro 10

CCG ATG ACG

ATG Met

Met 5

Pro

Gly

Met

Pro

Met

Thr

ATG

CCG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

Met

Pro

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Vai

Pro

Thr

Met

15

20

25

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

Met

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

30

35

40

CCA

AGC

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

Pro

Ser

Met

He

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

45

50

55

180

- 8‘i-

ATG Met 60

АТА lie

ATG Met

CCG P ro

ACC Thr

ATG Met 65

ATG Met

TCA Ser

CCA Pro

ATG Met

ATT lie 70

ATG Met

CCG Pro

AGT Ser

ATG Met

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Vai

Ser

Pro

Met

Met

Met

75

80

85

CCA TAG AATTC 281

Pro ___________90 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА StC fp ли) :5:

{ /ί/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НЛ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: /А/ ДЪЛЖИНА: 453 нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна

М/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: сДНК /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ:

/А/ АВТОРИ:

/В/ ЗАГЛАВИЕ: Диференциално експресиране на ген за богат на метионин резервен протеин в царевица.

/С/ СПИСАНИЕ:

/0/ ТОМ: 211 /Р/ СТРАНИЦИ; 477 - 484 /ф/ ДАТА: 1988

/К/

СЪОТВЕТНИ ОСТАТЪДО В S σ G< f D ЖСАНИЕ ΗΛ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА

•V'C :5: : SC-Q

OT to

22 Vc:

ДО 5 *

И74

X l

/ (

ATG

GCA

GCC

AAG

ATG

CTT

GCA

TTG

TTC

GCT

CTC

CTA

GCT

CTT

TGT

45

Met

Ala

Ala

Lys

Met

Leu

Ala

Leu

Phe

Ala

Leu

Leu

Ala

Leu

Cys

-20

-15

-10

GCA

AGC

GCC

ACT

AGT

GCG

ACC

CAT

ATT

CCA

GGG

CAC

TTG

CCA

CCA

90

Ala

Ser

Ala

Thr

Ser

Ala

Thr

His

lie

Pro

Gly

His

Leu

Pro

Pro

-5

1

5

GTC

ATG

CCA

TTG

GGT

ACC

ATG

AAC

CCA

TGC

ATG

CAG

TAC

TGC

ATG

135

Vai

Met

Pro

Leu

Gly

Thr

Met

Asn

Pro

Cys

Met

Gin

Tyr

Cys

Met

10

15

20

ATG

•CAA

CAG

GGG

CTT

GCC

AGC

TTG

ATG

GCG

TGT

CCG

TCC

CTG

ATG

180

Met

Gin

Gin

Gly

Leu

Ala

Ser

Leu

Met

Ala

Cys

Pro

Ser

Leu

Met

30 35

CTG CAG

CAA Gin

CTG TTG

GCC Ala 45

TTA CCG

CTT Leu

CAG ACG

ATG Met

CCA Pro

GTG Val

ATG Met

225

Leu 40

Gin

Leu

Leu

Leu

Pro

Gin

Thr 50

ATG

CCA

CAG

ATG

ATG

ACG

CCT

AAC

ATG

ATG

TCA

CCA

TTG

ATG

ATG

270

Met

Pro

Gin

Met

Met

Thr

Pro

Asn

Met

Met

Ser

Pro

Leu

Met

Met

55

60

65

CCG

AGC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

GTC

TTG

CCG

AGC

ATG

ATG

TCG

CAA

315

Pro

Ser

Met

Met

Ser

Pro

Met

val

Leu

Pro

Ser

Met

Met

Ser

Gin

70

75

80

ATG

ATG

ATG

CCA

CAA

tgt

CAC

TGC

GAC

GCC

GTC

TCG

CAG

ATT

ATG

360

Met

Met

Met

Pro

Gin

Cys

His

Cys

Asp

Ala

Val

Ser

Gin

lie

Met

85

90

95

CTG

CAA

CAG

CAG

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AAC

CCA

ATG

GCC

ATG

ACG

405

Leu

Gin

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe

Met

Phe

Asn

Pro

Met

Ala

Met

Thr

100

105

110

ATT

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CAA

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

450

lie

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

Phe

115

120

125

TAG 453 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ Si'U м А'Г:6:

/7 ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 30 нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /7/ МОЛЕКУЛЕН Т^Т*П: ин витро синтезирана ДНК /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ; непубликувана поел едователнос' /х/7 ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: TO /V'0:6:

ATGGCAGCCA AGATGCTTGC ATTGTTCGCT 30 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА :7:

/ / ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ дЪЛЖЧНА: 30 нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /с/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /7/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана ДНК

-ос/х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ: непубликувана последователност /хи/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: Stfi ID A’C :7:

<?ААТ6САГ-СА ССААСААА04 б-ТТС-СТб-ТАА 30 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ίά'ΐ д D N0:8:

/С/ ХАРАКТЕРИСТИКИ зд ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/а/ ДЪЛЖИНА: 17 нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /it / МОЛЕКУЛЕН Γ*!!: ин витро синтезирана дНК Ф /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ; непубликувана ** последователност /х/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: StC Ю N0 :8:

АТ&ААСССТТ Д-Д-АТФСА	17
Д/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА	StO Γ ι) м С :у:
/Ϊ/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛБИНА: 17 нуклеотида /б/ ТИП: ДНК /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /н/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана ДНК /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ: непубликувана

/χι/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:	последователност. N0:9:
СССАСА^САА TttOAT	17
/г/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА	5с'С ld N0:10:

/I/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/а/ ДЪЛЖИНА: 13 нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /it/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана ДНК /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛ^инАЦИИ: непубликувана последователност.

/xi/ иПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: Stb? jp _(VC :Ю:

СТАбСССФбС- TAC 13 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА St G ID A/P:ll:

/t/ ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/а/ ДЪЛЖИНА: 13 нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /м/ МОЛЕКУЛЕН ТИи: ин витро синтезирана ДНК /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ: непубликувана последователно!

/х^/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: $е£ 1D НО _:ц_: стАб-тсс trie- 13 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА fo НС :12:

Л/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/а/ ДЪЛЖИНА: jO нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /С/ ВЕРИГА: единична /В/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /ιί/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана ДНК /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ; непубликувана последователност /хр ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: StQ ДО УС:12:

ССАСТТСАТС- АСССАТАТСС CA&tZ-CACTT 30 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА j-р :13:

/// ΧΑΡΑΚΤΕΡΑυι^Η^τ* ΗΛ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/	ДЪЛЖИНА:	30 нуклеотида
/В/	ТИП: дНН
/с/	ВЕРИГА: единична
/й/	ТОПОЛОГИЯ	: линейна

/И/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана ДНК /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ: непубликувана последователност /xt/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: . ID NO :13:

ТТСТАТТСТАб- ААТ.ФСА6САС СААСААА№- -30

Л/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА Sfu ip n'С :14:

/t/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 30 нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /И/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана ДНК /х/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПУБЛИКАЦИИ; непубликувана последователност /хе/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: г D (4 С :14:

ТСАСС<~СТТС At-CAC-Te'CCA TAPCCAATi- 30 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА Г D Nf :15:

/с/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 40 нуклеотида /В/ ТИП: ДНК /и/ ВЕРИГА? единична /0/ ТО ПО Л0 гия: л и н е п на /И/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана дНК /х/ ЖОРМАЦия ЗА ПУБЛИКАЦИИ; непубликувана последователност /xjZ / ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: Sctf fl) NO :15:

ТСТТАб-ААТТ СТАТ66САТС АТСАТТ<--ГГ(Р АСАССАТС-СТ 40 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА 5tС J 0 /vd:16:

/I/ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 71 двойки бази /Й/ ТИП: нуклеинова киселина /и/ ВЕРИГА: единична /х)/ ТОПОЛОГИЯ: линейна ' /1с/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана ДНК

Λ х/ ХАРАКТЕРИСТИКА:

/А/ НАЗВАНие/пЛЮЧ : С OS /в/ ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 2..70 /х(/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: :16:

С АТб ΑΤέ- Αί-Α £СА А<Р£ ATT CCA СТС CT£ ТТ£ СТб- <-^А А1Г СТТ ТТС

Met Αη AАИ fb *-Си Lcm. Lin с-ύ fu

4 /

CTG GCA TCA CTT TCT GCT AGC TTT G 71

Leu Ala Ser Leu Ser Ala Ser Phe /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА S'^u' ID /V p :17:

/ L/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 71 двойна бази /в/ ТИП: нуклеинова киселина /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /ti/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана ДНК /хс/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: JD N 0

СТА6САААС-С ТАб-САс-АААсг Тб-АТГССА^- ААААС-ААТТС ССАбСААСА^ С7Т6СГС7с7) т М <ДАб-ТтАСС /27 ИНФОРМАЦИЯ ЗА stti др Ν I’ :18:

/с/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 653 двойки бази /В/ ТИП: нуклеинова киселина /и/ ьЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /И/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК /. геномна/ /пи/ НЕПОСРЕДСТВЕН ИЗТОЧНИК:

/В/ КЛОН : РСС18 /£х/ ХАРАКТЕРИСТИКА:

/А/ НАЗВАНИЕ/КЛШ : С OS /В/ ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 2..652 /х е./ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕГОВАТГЛЧОСТТА: 5£$ ID NO :18:

С ATG ATG AGA GCA AGG GTT ССА СТС CTG TTG CTG GGA ATT CTT ТТС 46

Met Met Arg Ala Arg Vai Pro Leu Leu Leu Leu Gly lie Leu Phe 15 10 15

CTG GCA

TCA Ser

CTT Leu

TCT GCT

AGC Ser

TTT Phe

GCT AGT GCT

ACC Thr

CAT His

ATC He

CCA Pro 30

GGG Gly

94

Leu

Ala

Ser 20

Ala

Ala

Ser 25

Ala

CAC

TTG

TCA

CCA

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

142

His

Leu

Ser

Pro

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Ala

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

35

40

45

CAG

TAC

TGC

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

190

Gin

Tyr

Cys

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Vai

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

50

55

60

ACC CTG ATG

CTG Leu

CAG Gin

CAA Gin

CTG Leu 70

TTG GCC

TCA Ser

CCG Pro

CTT Leu 75

CAG Gin

CAG Gin

TGC Cys

CAG Gin

238

Thr

Leu Met 65

Leu

Ala

ATG

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

286

Met

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

βο

85

90

95

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

334

Met

Pre

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Vai

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

100

105

110

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT

382

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

lie

115

120

125

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

ATG

CCG

ACC

430

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

He

Met

Pro

Thr

130

135

140

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

478

Met

Met

Ser

Pro

Met

lie

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

145

150

155

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

526

Pro

Ser

Met

Vai

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

Met

Met

Thr

Vai

Pro

160

165

170

175

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

574

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

lie

Ser

His

lie

He

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

180

185

190

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

622

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

•Ala

He

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

195

200

205

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAGA

653

Gin

Gin

Pro

Phe

Vai

Gly

Ala

Ala

Phe

210

215

/2/

ИНФОВ

1Α':τχ-· q > J. V/

> cr 1

J.

D /V

0 :

19:

/С/ ХАРАКТЕР^СРЖ™ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛНДНА: 31 двойка бази /в/ ТИП: нуклеинова киселина /С/ ВЕР^ТТА: единична /17/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /it/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана дНК /х 1/ иПиСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: I 0 .44’ :19:

ТТСТе OTA··'С ТТТ6СТАССС АТАТСССАС-ώ G /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА 5cu jo ^0:20:

/(/ ХАРАКТЕР^ТТСТ^ТЛКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 647 двойка бази /в/ ТИП: нуклеинова киселина /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /U/ МОЛЕКУЛЕН Т^ТДП: ДНК / геномна / /ех/ ХАРАКТЕРИСТИКА:

/а/ НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: С ОЬ /в/ ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 2..646 /х;/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ScU IO ;V't? :20

С ATG ATG AGA GCA AGG GTT CCA CTC CTG TTG CTG GGA ATT CTT TTC 46

Met Met Arg Ala Arg Vai Pro Leu Leu Leu Leu Gly lie Leu Phe

5 10 15

CTG Leu

GCA Ala

TCA Ser

CTT Leu

TCT Ser 20

GCT Ala

AGC Ser

TTT Phe

GCT Ala

ACC Thr 25

CAT His

ATC He

CCA Pro

GGG Gly

CAC His 30

TTG Leu

94

TCA

CCA

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

CAG

TAC

142

Ser

Pro

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Ala

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

Gin

Tyr

35

40

45

TGC

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

190

Cys

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Vai

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

Thr

Leu

50

55

60

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

CCA

238

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

Pro

65

70

75

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

286

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Met

Pro

80

85

90

95

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

334

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Vai

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

Thr

100

105

110

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT

TCA

CCA

382

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

He

Ser

Pro

115

120

125

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

430

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

lie

Met

Pro

Thr

Met

Met

130

135

140

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

AGC

478

Ser

Pro

Met

He

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

145

150

155

- qZ~

ATG GTG

TCA Ser

CCA Pro

ATG ATG ATG

CCA Pro

AAC Asn

ATG Met

ATG Met 170

ACA Thr

GTG Vai

CCA Pro

CAA Gin

TGT Cys 175

526

Met 160

Vai

Met

Met 165

Met

ТАС

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

CCA

TTC

574

Туг

Ser

Gly

Ser

He

Ser

His

lie

He

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe

180

185

190

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CAG

622

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

Ala

He

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

195

200

205

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAGA

647

Pro

Phe

Vai

Gly

Ala

Ala

Phe

210 215 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА $t‘k j д'(? :21:

/L/ ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

А/	ДЪЛЖИНА: 30 двойка бази
/в/	ТИП: нуклеинова киселина
/с/	ВЕРИГА: единична
/W	ТОПОЛОГИЯ: линейна
/й/	шОЛЕКУЛЕН ТТДП: ин витро синтезирана ДНК
/^/	ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:	StQ. ID uo :21?
aCTAATCATC- AT^AC-Ai-CAA ^-PTTCCACT	3

/2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА WO :22:

Λ/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 30 двойка бази /В/ ТИП: нуклеинова киселина /С/ ВЕРИГА: единична /Д/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /г^/ МОЛЕКУЛЕН Т^ТДП: ин витро синтезирана дНК

А7 ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: St-к гр /ГО :22:

бААТе-САс-СА ССААСАААК сТТ^СТФТАА /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА НгЦ 10 УС?:23:

/с/ ХАРАКТЕРИ СТИК¹' НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/а/ ДЪЛЖАНА: 38 двойка бази /В/ ТИП: нуклеинова киселина /С/ ' ВЕРИГА: единична /П/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /сV/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана ДНК

- 95 ~ /^/ ХАРАКТЕРИСТИКА:

/А/ НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ:COS /В/ ЛОКАЛИЗАЦИЯ:6..38 /xt/ иРиСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: StG ID VO :23:

Т6СТТ £СТ -А6С- TTT бСТ -ATti CCA AT6 АТЬ AT6 CCe· ό-6-Т38

Ди< hr fce 44 wd пъ fat МЛ И4 Pro Счу

510

/2/ ИНФОРМАЦИЯ 3Λ SOO JD NO :24:

/0/ ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: .

/А/ ДЪЛЖИНА: 36 двойка бази /в/ ТИП: нуклеинова киселина /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна

Де/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ин витро синтезирана ДНК /хе/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: 5^4 ГР :24:

Т8СТТТСТА(^;- АСТАТс-С-САТ САТСЛТТ4ФТ 0-ЛСЛСС 36

/2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ίι=Ο 10 ^:25:

/0/ лАРАкТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 352 двойка бази /в/ ТИП: нуклеинова киселина /и/ ВЕРИГА: единична /0/ 101ЮЛ0ГИЯ: линейна /и/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК /геномна/

Ах/ ХАРАКТЕРИСТИКА: .

/А/ НАЗВАНие/КЛ©Ч: CPS /В/ ЛОКАЛИЗИРАНЕ: 2..346 /xt/ иПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

С ATG ATG AGA GCA AGG GTT CCA СТС CTG TTG CTG GGA ATT CTT TTC Met Met Arg Ala Arg Vai Pro Leu Leu Leu Leu Gly He Leu Phe 15 10 15 :25:

CTG Leu

GCA Ala

TCA Ser

CTT Leu

TCT Ser 20

GCT Ala

AGC Ser

TTT Phe

GCT Ala

ATG Met 25

CCA Pro

ATG Met

ATG Met

ATG Met

CCG Pro 30

GGT Gly

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

35

40

45

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

Met

Met

Vai

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

50

55

60

-7Ϋ -

CCG Pro

CCG Pro 65

ATG Met

ATG Met

ATG Met

CCA Pro

AGC Ser 70

ATG ATT

TCA Ser

CCA ATG

ACG Thr

ATG Met

CCG Pro

AGT Ser

238

Met

He

Pro

Met 75

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

286

Met

Met

Pro

Ser

Met

He

Met

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

He

Met

60

85

90

95

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

334

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Vai

Ser

Pro

Met

100

105

HO

<(**ATG ATG CCA TAGTCTAGA 352

Met Met Pro

115 /2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА ID N'C :/6:

/ί/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/А/ ДЪЛЖИНА: 3237 двойка бази /В/ ТИП: нуклеинова киселина /С/ ВЕРИГА: единична /0/ ТОПОЛОГИЯ: линейна /it-/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК /геномна/

Дх/ ХАРАКТЕРИСТИКА:

/А/ НАЗВАНИЕ/КЛЮЧ: С 05 /В/ ЛОКАЛИЗИРАНЕ: 1419..2444 /х(/ ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: 5t(2 W |VQ :26:

GTCGACTCTA	GAGGATCCAA	TTCCAATCCC	ACAAAAATCT	GAGCTTAACA	GCACAGTTGC	60
TCCTCTCAGA	GCAGAATCGG	GTATTCAACA	CCCTCATATC	AACTACTACG	TTGTGTATAA	120
CGGTCCACAT	GCCGGTATAT	ACGATGACTG	GGGTTGTACA	AAGGCGGCAA	CAAACGGCGT	180
TCCCGGAGTT	GCACACAAGA	AATTTGCCAC	TATTACAGAG	GCAAGAGCAG	CAGCTGACGC	240
GTACACAACA	AGTCAGCAAA	CAGACAGGTT	GAACTTCATC	CCCAAAGGAG	AAGCTCAACT	300
CAAGCCCAAG	AGCTTTGCTA	AGGCCCTAAC	AAGCCCACCA	AAGCAAAAAG	CCCACTGGCT	360
CACGCTAGGA	ACCAAAAGGC	CCAGCAGTGA	TCCAGCCCCA	AAAGAGATCT	CCTTTGCCCC	420
GGAGATTACA	ATGGACGATT	TCCTCTATCT	TTACGATCTA	GGAAGGAAGT	TCGAAGGTGA	480
AGGTGACGAC	ACTATGTTCA	CCACTGATAA	TGAGAAGGTT	AGCCTCTTCA	ATTTCAGAAA	540
GAATGCTGAC	CCACAGATGG	TTAGAGAGGC	CTACGCAGCA	GGTCTCATCA	AGACGATCTA	600
CCCGAGTAAC	AATCTCCAGG	AGATCAAATA	CCTTCCCAAG	AAGGTTAAAG	ATGCAGTCAA	660
AAGATTCAGG	ACTAATTGCA	TCAAGAACAC	AGAGAAAGAC	ATATTTCTCA	AGATCAGAAG	720

TACTATTCCA	GTATGGACGA	TTCAAGGCTT	GCTTCATAAA	CCAAGGCAAG	TAATAGAGAT	780
TGGAGTCTCT	AAAAAGGTAG	TTCCTACTGA	ATCTAAGGCC	ATGCATGGAG	TCTAAGATTC	840
AAATCGAGGA	TCTAACAGAA	CTCGCCGTGA	AGACTGGCGA	ACAGTTCATA	CAGAGTCTTT	900
TACGACTCAA	TGACAAGAAG	AAAATCTTCG	TCAACATGGT	GGAGCACGAC	ACTCTGGTCT	960
ACTCCAAAAA	TGTCAAAGAT	ACAGTCTCAG	AAGACCAAAG	GGCTATTGAG	ACTTTTCAAC	1020
AAAGGATAAT	TTCGGGAAAC	CTCCTCGGAT	TCCATTGCCC	AGCTATCTGT	CACTTCATCG	1080
AAAGGACAGT	AGAAAAGGAA	GGTGGCTCCT	ACAAATGCCA	TCATTGCGAT	AAAGGAAAGG	1140
CTATCATTCA	AGATGCCTCT	GCCGACAGTG	GTCCCAAAGA	TGGACCCCCA	CCCACGAGGA	1200
GCATCGTGGA	AAAAGAAGAC	GTTCCAACCA	CGTCTTCAAA	GCAAGTGGAT	TGATGTGACA	1260
TCTCCACTGA	CGTAAGGGAT	GACGCACAAT	CCCACTATCC	TTCGCAAGAC	CCTTCCTCTA	1320
TATAAGGAAG	TTCATTTCAT	TTGGAGAGGA	CACGCTCGAG	CTCATTTCTC	TATTACTTCA	1380
GCCATAACAA	AAGAACTCTT	TTCTCTTCTT	ATTAAACC ATG AAA AAG ι	CCT GAA	1433

Met Lys Lys Pro Glu

5

CTC Leu

ACC Thr

GCG ACG

TCT Ser 10

GTC Val

GAG Glu

AAG Lys

TTT Phe

CTG ATC GAA

AAG Lys

TTC Phe

GAC Asp 20

AGC Ser

1481

Ala

Thr

Leu 15

He

Glu

GTC

TCC

GAC

CTG

ATG

CAG

CTC

TCG

GAG

GGC

GAA

GAA

TCT

CGT

GCT

TTC

1529

Val

Ser

Asp

Leu

Met

Gin

Leu

Ser

Glu

Gly

Glu

Glu

Ser

Arg

Ala

Phe

25

30

35

AGC

TTC

GAT

GTA

GGA

GGG

CGT

GGA

TAT

GTC

CTG

CGG

GTA

AAT

AGC

TGC

1577

Ser

Phe

Asp

Val

Gly

Gly

Arg

Gly

Tyr

Val

Leu

Arg

Val

Asn

Ser

Cys

40

45

50

GCC

GAT

GGT

TTC

TAC

AAA

GAT

CGT

TAT

GTT

TAT

CGG

CAC

TTT

GCA

TCG

1625

Ala

Asp

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

Arg

Tyr

Val

Tyr

Arg

His

Phe

Ala

Ser

55

60

65

GCC

GCG

CTC

CCG

ATT

CCG

GAA

GTG

СГТ

GAC

ATT

GGG

GAA

TTC

AGC

GAG

1673

Ala

Ala

Leu

Pro

lie

Pro

Glu

Val

Leu

Asp

lie

Gly

Glu

Phe

Ser

Glu

70

75

80

85

AGC

CTG

ACC

TAT

TGC

ATC

TCC

CGC

CGT

GCA

CAG

GGT

GTC

ACG

TTG

CAA

1721

Ser

Leu

Thr

Tyr

Cys

lie

Ser

Arg

Arg

Ala

Gin

Gly

Val

Thr

Leu

Gin

90

95

100

GAC

CTG

CCT

GAA

ACC

GAA

CTG

CCC

GCT

GTT

CTG

CAG

CCG

GTC

GCG

GAG

1769

Asp

Leu

Pro

Glu

Thr

Glu

Leu

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Pro

Val

Ala

Glu

105

110

115

-9G-

GCC Ala

ATG GAT

GCG ATC GCT GCG

GCC GAT Ala Asp 125

CTT Leu

AGC CAG

ACG Thr 130

AGC Ser

GGG Gly

TTC Phe

1817

Met

Asp 120

Ala

He Ala

Ala

Ser

Gin

GGC

CCA

TTC

GGA

CCG

CAA

GGA

ATC

GGT

CAA

TAC

ACT

ACA

TGG

CGT

GAT

1865

Gly

Pro

Phe

Gly

Pro

Gin

Gly

He

Gly

Gin

Tyr

Thr

Thr

Trp

Arg

Asp

135

140

145

TTC

ATA

TGC

GCG

ATT

GCT

GAT

CCC

CAT

GTG

TAT

CAC

TGG

CAA

ACT

GTG

1913

Phe

lie

Cys

Ala

He

Ala

Asp

Pro

His

Vai

Tyr

His

Trp

Gin

Thr

Vai

150

155

160

165

ATG

GAC

GAC

ACC

GTC

AGT

GCG

TCC

GTC

GCG

CAG

GCT

CTC

GAT

GAG

CTG

1961

Met

Asp

Asp

Thr

Vai

Ser

Ala

Ser

Vai

Ala

Gin

Ala

Leu

Asp

Glu

Leu

170

175

180

ATG

CTT

TGG

GCC

GAG

GAC

TGC

CCC

GAA

GTC

CGG

CAC

CTC

GTG

CAC

GCG

2009

Met

Leu

Trp

Ala

Glu

Asp

Cys

Pro

Glu

Vai

Arg

His

Leu

Vai

His

Ala

185

190

195

W!

GAT

TTC

GGC

TCC

AAC

AAT

GTC

CTG

ACG

GAC

AAT

GGC

CGC

ATA

ACA

GCG

2057

Asp

Phe

Gly

Ser

Asn

Asn

Vai

Leu

Thr

Asp

Asn

Gly

Arg

He

Thr

Ala

200

205

210

GTC

ATT

GAC

TGG

AGC

GAG

GCG

ATG

TTC

GGG

GAT

TCC

CAA

TAC

GAG

GTC

2105

Vai

He

Asp

Trp

Ser

Glu

Ala

Met

Phe

Gly

Asp

Ser

Gin

Tyr

Glu

Vai

215

220

225

GCC

AAC

ATC

TTC

TTC

TGG

AGG

CCG

TGG

TTG

GCT

TGT

ATG

GAG

CAG

CAG

2153

Ala

Asn

lie

Phe

Phe

Trp

Arg

Pro

Trp

Leu

Ala

Cys

Met

Glu

Gin

Gin

230

235

240

245

ACG

CGC

TAC

TTC

GAG

CGG

AGG

CAT

CCG

GAG

CTT

GCA

GGA

TCG

CCG

CGG

2201

Thr

Arg

Tyr

Phe

Glu

Arg

Arg

His

Pro

Glu

Leu

Ala

Gly

Ser

Pro

Arg

250

255

260

CTC

CGG

GCG

TAT

ATG

CTC

CGC

ATT

GGT

CTT

GAC

CAA

CTC

TAT

CAG

AGC

2249

Leu

Arg

Ala

Tyr

Met

Leu

Arg

He

Gly

Leu

Asp

Gin

Leu

Tyr

Gin

Ser

265

270

275

TTG

GTT

GAC

GGC

AAT

TTC

GAT

GAT

GCA

GCT

TGG

GCG

CAG

GGT

CGA

TGC

2297

Leu

Vai

Asp

Gly

Asn

Phe

Asp

Asp

Ala

Ala

Trp

Ala

Gin

Gly

Arg

Cys

280

285

290

GAC

GCA

ATC

GTC

CGA

TCC

GGA

GCC

GGG

ACT

GTC

GGG

CGT

ACA

CAA

ATC

2345

Asp

Ala

He

Vai

Arg

Ser

Gly

Ala

Gly

Thr

Vai

Gly

Arg

Thr

Gin

lie

295

300

305

GCC

CGC

AGA

AGC

GCG

GCC

GTC

TGG

ACC

GAT

GGC

TGT

GTA

GAA

GTA

CTC

2393

Ala

Arg

Arg

Ser

Ala

Ala

Vai

Trp

Thr

Asp

Gly

Cys

Vai

Glu

Vai

Leu

310

315

320

325

GCC

GAT

AGT

GGA

AAC

CGA

CGC

CCC

AGC

ACT

CGT

CCG

AGG

GCA

AAG

GAA

2441

Ala

Asp

Ser

Gly

Asn

Arg

Arg

Pro

Ser

Thr

Arg

Pro

Arg

Ala

Lys

Glu

330 335 340

TAGTGAGGTA CCTAATAGTG AGATCCAACA CTTACGTTTG CAACGTCCAA GAGCAAATAG 2501

- 9/-

ACCACGACGC	CGGAAGGTTG	CCGCAGCGTG	TGGATTGCGT	CTCAATTCTC	TCTTGCAGGA	2561
ATGCAATGAT	GAATATGATA	CTGACTATGA	AACTTTGAGG	GAATACTGCC	TAGCACCGTC	2621
ACCTCATAAC	GTGCATCATG	CATGCCCTGA	CAACATGGAA	CATCGCTATT	TTTCTGAAGA	2681
ATTATGCTCG	TTGGAGGATG	TCGCGGCAAT	TGCAGCTATT	GCCAACATCG	AACTACCCCT	2741
CACGCATGCA	TTCATCAATA	TTATTCATGC	GGGGAAAGGC	AAGATTAATC	CAACTGGCAA	2801
ATCATCCAGC	GTGATTGGTA	ACTTCAGTTC	CAGCGACTTG	ATTCGTTTTG	GTGCTACCCA	2861
CGTTTTCAAT	AAGGACGAGA	TGGTGGAGTA	AAGAAGGAGT	GCGTCGAAGC	AGATCGTTCA	2921
AACATTTGGC	AATAAAGTTT	CTTAAGATTG	AATCCTGTTG	CCGGTCTTGC	GATGATTATC	2981
ATATAATTTC	TGTTGAATTA	CGTTAAGCAT	GTAATAATTA	ACATGTAATG	CATGACGTTA	3041
TTTATGAGAT	GGGTTTTTAT	GATTAGAGTC	CCGCAATTAT	ACATTTAATA	CGCGATAGAA	3101
AACAAAATAT	AGCGCGCAAA	CTAGGATAAA	TTATCGCGCG	CGGTGTCATC	TATGTTACTA	3161
GATCGATCAA	ACTTCGGTAC	TGTGTAATGA	CGATGAGCAA	TCGAGAGGCT	GACTAACAAA	3221
AGGTACATCG	GTCGAC					3237

/2/ ИНФОРМАЦИЯ ЗА <,£ ц _Ц) :27:

/^?/ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

/а/	ДЪЛЖИНА: 4	амино киселини
/В/	ТИП: амино	киселина
/о/	ТОПОЛОГИЯ:	линейна

Л1/ МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептиден /хс/ и ПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: 5сй ΣΟ N0:27:

Mil Mil Met i'i'c

Claims (16)

1 .. Изолиран и пречистен фрагмент нуклеинова киселина , съдържащ най - малко една нуклеотидна последователност , съот ветстващ на или съществено хомоложен на последователността, показана в SEQ ID N0 : 2 , кодиращ царевичен зърнен резервен протеин с Високо съдържание на Серен Зеин .

2. Изолиран и пречистен фрагмент нуклеинова киселина , съдържащ най - малко една нуклеотидна последователност , съот ветстващ на или съществено хомоложен на последователността, показана в SEQ ID N0 : 5 , кодиращ ” зрял царевичен зърнен резервен протеин с Високо съдържание на Серен Зеин ”.

Ъ. Изолиран и пречистен фрагмент нуклеинова киселина , съдържащ най - малко една нуклеотидна последователност , съот ветстващ на или съществено хомоложен на последователността, показана в SEQ ID N0 : 4 , кодиращ ·· домен царевичен зърнен резервен протеин с Високо съдържание на Метионин

4. Фрагментът нуклеинова киселина , съгласно претен ция 2 , оперативно свързан със сигнална последователност от двусемеделно растение.

5. Фрагментът нуклеинова киселина , съгласно претен - ция 3 , оперативно свързан със растителна сигнална последо вателност.

6. Химеричен ген способен да причинява промяна на ни вата на серни аминокиселини в трансформирани растения , като химеричният ген съдържа фрагментът нуклеинова киселина от коя да е от пртетенциите от 1 - 5 , оперативно свързан с една

- де вътреклетъчна локализираща последователност и подходяща ре гулаторна последователност.

7. Химеричният ген , съгласно претенция 6 , където регулаторната последователност се избира от групата , съста вена от зърно ( семе ) - специфични регулаторни последова телности.

8. Растение , траансформирано с химеричния ген , съг ласно претенция 6 .

съгласно претенция 8 , където растението се избира от групата тютюн и ориз .

10. Зърна ( семена ) , получени от растенията , съ гласно претенция 8.

11. Химеричен ген способен да причинява промяна на ни вата на серни аминокиселини в трансформирани микроорганизми , като химеричният ген съдържа фрагмента нуклеинова киселина , съгласно пртетенции 2 или 3 , оперативно свързан подходящата регулаторна последователност.

12. Микроорганизъм , трансформиран с химеричния ген , съгласно претенция 11 .

13. Полипептиден продукт на експресията на фрагмент нуклеинова киселина , съгласно претенции 1 , 2 или 3 , в про кариотни или елкариотни гостоприемни клетки .

14. Растение , съдържащо полипептидния продукт „ съг ласно претенция 13 .

15. Зърно ( семе ) , съдържащо полипептидния продукт съгласно претенция 13.

16. Метод за повишаване съдържанието на сярни амино - киселини в растенията , включващ ;

-ήοϋ a / трансформация на растителна клетка с химеричния ген , съгласно претенция 6 ;

б / сексуално зряли , с повишена кълняемост растения , от споменатата трансформираана растителна клетка : и в / избиране на потомствено зърно ( семе ) от спомена тите с повишена кълняемост растения , за повишаване нивата на серните аминокиселини , спрямо нетрансформираните растителни клетки.

17. Метод за продуциране на протеин , богат на сяра съдържащи аминокиселини , включващ :

а / трансформация на микроорганизми с химеричния ген съгласно претенция 11 ;

б / растеж на споменатите микроорганизми в условия за експесия на протеин , богат на сяра съдържащи аминоки селини ; и в / изолиране на протеина от подточка б/.

18. Абсолютно чист плазмид рССЮ , като споменатият плазмид фключва фрагмента аминокиселина , съгласно претенция 1 и се идентифицира с входящ номер на депозиране АТСС 68490.