JPH06505387A - 高硫黄種子タンパク質遺伝子及び植物中の含硫アミノ酸含有量の増加法 - Google Patents

高硫黄種子タンパク質遺伝子及び植物中の含硫アミノ酸含有量の増加法

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JPH06505387A
JPH06505387A JP4505771A JP50577192A JPH06505387A JP H06505387 A JPH06505387 A JP H06505387A JP 4505771 A JP4505771 A JP 4505771A JP 50577192 A JP50577192 A JP 50577192A JP H06505387 A JPH06505387 A JP H06505387A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 種子の含硫アミノ酸含有量を増加させる方法が見いだされた。高硫黄ゼイン(H 8Z)遺伝子を用いて遺伝子を創造し、種々の作物植物の形質転換に用い、種子 又は葉の含硫アミノ酸含有量を増加させることがで、きる。特に本発明の1つの 特徴は、配列番号:2に示す配列に対応するH3Zとうもろこし貯蔵タンパク質 前駆体をコードするヌクレオチド配列又は実質的にそれと相同のヌクレオチド配 列を含む核酸フラグメントである。本発明の他の特徴は成熟HSZタンパク質を コードする核酸フラグメント(配列番号:3)、及びH3Zとうもろこし貯蔵タ ンパク質の高メチオニンドメイン()(MD)をコードする核酸フラグメント( 配列番号:4)である。
本発明の他の具体化は、前記の核酸フラグメントのいずれかを調節配列と作用的 に結合して含み、形質転換された植物中で発現することができるキメラ遺伝子で ある。核酸フラグメントをとうもろこし又は大豆の葉で活性な種−特異的プロモ ーターと作用的に結合したキメラ遺伝子が好ましい。
本発明の他の特徴は、形質転換された微生物、好ましくはE、co1本発明のさ らに別の特徴は、キメラ遺伝子により形質転換され、高硫黄タンパク質を生産す る宿主細胞である。
本発明のさらに別の特徴は、前記の核酸フラグメントのいずれかを含む植物及び 種子から誘導された形質転換植物及び種子である。とうもろこし、大豆、なたね 、タバコ及び米から成る群より選ばれる植物及び種子から誘導された植物及び種 子が好ましい。
本発明のさらに別の特徴は、開示されているキメラ遺伝子を用いて形質転換され た微生物である。
本発明のさらに別の具体化は、植物の含硫アミノ酸の含有量を増加させる方法、 及び高硫黄タンパク質を生産する能力を有する植物の生産のためのアグロバクテ リウム ツメファシェンス(Agrobacterium tumefacie ns)媒介法である。含硫アミノ酸の豊富なタンパク質を微生物中で生産する方 法も本発明に含まれる。
図面及び配列の簡単な説明 以下の詳細な説明、添付図面及び本発明の一部である配列(Sequence  Description)から、本発明をさらに十分に理解することができる。
配列は、ここに参照として挿入する37C,F。
R,1,822に定義されているアミノ酸に関する3文字コードを含む。
配列番号:1はとうもろこしH3Z遺伝子のヌクレオチド配列(2123bp) 及び−次翻訳産物の推定アミノ酸配列を示す。ヌクレオチド753−755は推 定翻訳開始コドンであり、ヌクレオチド1386−1388は推定翻訳停止コド ンである。ヌクレオチド1−752及び1389−2123は、それぞれ推定5 ゛及び3°調節配列を含む。
配列番号:2は本発明の好ましいヌクレオチド配列を示す。これはH8Zコード 領域のみを含む635bp DNAフラグメントを示し、Nco I (5’− CCATGG)からXbal(5° −TCTAGA)を用いた制限エンドヌク レアーゼ消化により単離することができる。本来のH3Zコード領域中に存在す る2つのNco 1部位を、コードされるアミノ酸配列を変化させることな(特 定部位の突然変異誘発により除去した。
配列番号:3は本発明の好ましいヌクレオチド配列を示す。これは成熟HSZタ ンパク質のコード領域のみを含む579bp DNAフラグメントを示し、Bs ph I (5’ −TCATGA)からXba I(5° −TCTAGA) を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化により単離することができる。本来のH8 Zコード領域に存在する2つのNe。
■部位を、特定部位の突然変異誘発により除去した。これは、コードされるアミ ノ酸配列を変化させることなく行われた。
配列番号:4はHMD遺伝子のヌクレオチド配列及び誘導アミノ酸配列を示す。
配列番号=5はとうもろこしの10kDゼイン遺伝子のDNA配列を示す[Ki rihara et al、(1988)Mo1.Gen。
Genet、21:477−484:Kirihara et al。
(1988)Gene 71:359−3701゜配列番号二6及び7は、高メ チオニン10kDゼイン遺伝子に関するとうもろこしライブラリーのスクリーニ ングのために実施例1で用いた。
配列番号=8及び9は、H8Z遺伝子の突然変異誘発を行うために実施例2で用 いた。
配列番号=10及び11は、ユニークエンドヌクレアーゼ部位を変えた形態のH 8Z遺伝子の創造のために実施例2で用いた。
配列番号二12及び13は成熟形態のHSZをコードする遺伝子の創造のために 実施例2で用いた。
配列番号:14及び15は、HSZのHMDをコードする遺伝子の構築のために 実施例5で用いた。
配列番号:16−21は、植物中のHSZの発現のためのキメラ遺伝子の構築に 実施例6で用いた。
配列番号=22は、ファゼオリンーH3Zキメラ遺伝子を用いたタバコの形質転 換物の分析のために、実施例7で用いた。
配列番号=23.24及び25は、植物中のHMDの発現のためのキメラ遺伝子 の構築のために実施例10で用いた。
配列番号=26は、カリフラワーモザイクウィルスからの355ブロモ−9−[ 0dell et al、(1985)Nature 313:810−812 コ、プラスミドpJR225(E、co l iから)からのハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子[Gritzet al、(1983)Gen e 25+179−188]、及びアクロバクテリウム ツメファシェンスのT iプラスミドのT−DNAからのツバリン合成遺伝子の3゛領域を含み、実施例 11において大豆の形質転換のための選択可能遺伝子マーカーとして用いられた キメラ遺伝子である。
配列番号:27は、H3Zタンパク質の中心領域である。
配列番号=28は、小胞体のルーメン中にタンパク質を保持するためのアミノ酸 配列である。
図1は1QkDゼイン(配列番号:5)及びHSZ(配列番号:2)のアミノ酸 配列の比較を示す。アミノ酸をコードする1文字を用いる。
2つのタンパク質の高メチオニンドメインに下線を引へ図1における2本の垂直 な線は、2つのタンパク質中の同一アミノ酸残基を示す。
図2は、形質転換された植物においてHSZを発現するためのキメラ遺伝子の構 築に有用な種子−特異的遺伝子発現カセットの略図を示す。
図3は、バイナリ−プラスミドベクターpZ397にの地図を示す。
図4は、バイナリ−プラスミドベクターpZS97の地図を示す。
発明の詳細な説明 本発明は、両方ともアミノ酸メチオニンが異常に豊富である、とうもろこしの高 硫黄ゼイン(HSZ)種子貯蔵タンパク質又は、HSZから誘導された高メチオ ニンドメイン(HMD)をコードする核酸フラグメントにつき記載する。
HSZタンパク質は非常にメチオニンの豊富な中心領域(約48%メチオニン残 基)を含み、メチオニン含有量の低い(それぞれ10%メチオニン及び7%メチ オニン)アミノ末端及びカルボキシ末端領域が隣接する。中心領域は繰り返しモ チーフMet−Met−Met−Pr。
(配列番号:27)の変形を含む。関連する10kDゼインタンパク質は類似で あるが別の構造を有する(図1を参照)。しかしH3Zタンパク質の中心領域は 、10kDゼインの対応する領域の約2倍の大きさであり、HSZのメチオニン 含有量の増加を説明している。10kDゼインと比較してHSZにおける中心高 メチオニンドメイン(HMD)が明らかに2倍であることは、中心高メチオニン ドメインが安定な構造を有し、それ自身により発現して非常に高メチオニンの貯 蔵タンパク質を与えることができることを示唆している。
種子貯蔵タンパク質調節配列及びメチオニンの豊富な種子貯蔵タンパク質コード 配列を含むキメラ遺伝子の導入は、作物植物からの種子の栄養的品質を向上させ る方法を与える。種子中のメチオニン含有量の増加は= (a)用いられた種子 −特異的発現シグナルに部分的に依存する、形質転換作物中のキメラ遺伝子の発 現の程度、(b)種子貯蔵タンパク質コード領域中のメチオニン残基のパーセン テージ、(C)その正しいプロセシング、細胞内ターゲツティング、ある場合に は高次構造への集合、及び乾燥に耐える能力に一部依存する、形質転換された作 物植物の種子中での導入タンパク質の安定性、ならびに(d)導入されたタンパ ク質と形質転換された作物の本来の種子タンパク質との適合性により決定される であろう。
本発明の核酸フラグメントを、適した調節配列を用いて生存細胞中に伝達すると 、タンパク質が生産又は過剰生産される。本発明の核酸フラグメントを、種子中 におけるタンパク質の直接発現に適した調節配列を用いて植物、特にとうもろこ し、大豆又はせいようあぶらなに伝達すると、含硫アミノ酸、特にメチオニンの 量が増加し、従って動物のための種子タンパク質の栄養的品質が向上する。
本開示の範囲内で、多くの用語が用いられる。本文で使用すa“核酸”という用 語は、糖、リン酸塩及びプリン又はピリミジンのいずれかを含むモノマー(ヌク レオチド)から成り、1本鎖又は2本鎖であることができる大分子を言う。“核 酸フラグメント”は、ある核酸分子の一部である。高級な植物の場合、デオキシ リポ核酸(DNA)は遺伝材料であり、一方リボ核酸(RNA)はタンパク質へ のDNAの情報の伝達に含まれる。“ゲノム”は、生物の各細胞に含まれる遺伝 材料の全体である。”ヌクレオチド配列“という用語は、1本鎖又は2本鎖であ るこ、とができ、場合によりDNA又はRNAポリマー中に挿入することができ る合成非天然、又は変更ヌクレオチド塩基を含む、DNA又はRNAのポリマー を言う。
本文で用いる“相同な”という用語は、2つの核酸分子のヌクレオチド配列間の 、又は2つのタンパク質分子のアミノ酸配列間の相補性を言う。そのような相同 性の評価は、当該技術における熟練者に周知の緊縮条件下におけるDNA−DN A又はDNA−RNAハイブリッド形成により[Hames and Higg ins(eds、)Nucleic Ac1d Hybridisation、 IRL Press、0xford、U、に、に記載の通引、あるいは2つの核 酸又はタンパク質の間の配列の類似性の比較により示される。
本文で用いられる“実質的に相同な”という用語は、相同な配列の場合よりハイ ブリッド形成に必要に緊縮度が低い核酸分子を言い、コードされるアミノ酸に変 化を起こさない塩基の変更を含む、あるいは1個か又はそれ以上のアミノ酸を変 化させるがDNA配列によりコードされるタンパク質の機能性に影響を与えない 塩基の変更を含むコードDNA配列も言う。従って本文に記載の核酸フラグメン トは、欠失、転位、核酸フラグメントの無作為な又は制御された突然変異誘発、 ならびにDNA配列が実質的に相同である限り偶然のヌクレオチド配列エラーに より誘導されたヌクレオチド塩基の可能な変更を含む分子を含む。
“遺伝子”は、コード領域の前(5゛非−コード)及び後(3′非−コード)の 調節配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを言う。“本来 の”遺伝子は、それ自身の調節配列を持って自然に存在する遺伝子を言う。“キ メラ”遺伝子は、異種調節及びコード配列を含む遺伝子を言う。“内在性“遺伝 子は、ゲノム中のその自然の位置に通常存在する本来の遺伝子を言う。“異種” 遺伝子は、宿主生物中に通常存在しないが遺伝子の伝達により導入された遺伝子 を言う。
“コード配列”は、特定のタンパク質をコードし、非コード配列を除いたDNA 配列を言う。これは、cDNAの場合のように“非分断コード配列”、すなわち イントロンを含まない配列を構成するか、あるいは適したスプライシング部位に より結合した1個又はそれ以上のイントロンを含むことができる。“イントロゾ は、−次転写において転写されるが、タンパク質に翻訳することができる成熟m RNAの創造のために細胞内でRNAの切断及び再連結により除去されるRNA の配列である。
“開始コドン”及び“停止コドン”は、タンパク質合成(mRNA翻訳)のそれ ぞれ開始及び連鎖停止を特定する、コード配列中の3つの隣接ヌクレオチドの単 位を言う。“読み取り枠”は、コード配列の翻訳開始及び停止コドンの間でコー ドされるアミノ酸配列を言う。
“RNA転写産物”は、DNA配列のRNAポリメラーゼ−触媒転写から生ずる 生成物を言う。RNA転写産物がDNA配列の完全な相補的コピーの場合、それ は−次転写産物であると言われるか、又は−次転写産物の転写後プロセシングか ら誘導されたRNA配列であることができ、それは成熟RNAと言われる。“メ ツセンジャーRNA″ (mRNA)は、イントロンを含まず、細胞によりタン パク質に翻訳されることができるRNAを言う。“cDNA“は、mRNAと相 補的でそれから誘導された2本鎖DNAを言う。
本文で用いられる“調節配列“は、コード配列の上流(5”)、その中、及び/ 又は下流(3′)に位置し、おそらく細胞のタンパク質生合成装置と連結してコ ード配列の転写及び/又は発現を調節するヌクレオチド配列を言う。これらのヌ クレオチド配列は、プロモーター配列、翻訳リーダー配列、転写停止配列、及び ポリアデニル化配列を含む。
“プロモーター”は、遺伝子中で通常そのコード配列の上流(5°)にあり、R NAポリメラーゼ及び正しい転写に必要な他の因子に関する認識を与えることに よりコード配列の発現を調節するDNA配列を言う。
プロモーターは生理学的又は発生的状態に対応して転写開始の効率を調節するタ ンパク質因子の結合に含まれるDNA配列も含むことができる。
これは又、エンハンサ−要素も含むことができる。
“エンハンサ−”は、プロモーターの活性を刺激することができるDNA配列で ある。これはプロモーターの先天性要素であることもでき、あるいはプロモータ ーの量及び/又は組織−特異性の増強のために挿入された異種要素であることも できる。“構成プロモーター”はすべての組織で、及び常に遺伝子発現を指示す るプロモーターを言う。本文で言われる“組繊−特異的“又は“発生−特異的” プロモーターは、それぞれ葉又は種子などの特定の組織で、又は初期又は後期胚 形成などの組織における特定の発生段階でほとんど排他的に遺伝子発現を指示す るプロモーターである。
本文で用いられる“発現”という用語は、遺伝子によりコードされるたんばく質 産物の生産を意味するものとする。“過剰発現”は、正常な、又は非−形質転換 生物における生産量を越えた、形質転換された生物における遺伝子産物の生産を 言う。
“3゛非−コード配列”は遺伝子のDNA配列の、転写停止シグナル、ポリアデ ニル化シグナル及びmRNAプロセシング又は遺伝子発現に影響を与えることが できる他の調節シグナルを含む部分を言う。ポリアデニル化シグナルは通常mR MA前駆体の3″末端へのポリアデニル酸尾部の付加を行うことを特徴とする特 “5゛非−コード配列”は遺伝子のDNA配列の、プロモーター配列及び翻訳リ ーダー配列を含む部分を言う。
“翻訳リーダー配列”は遺伝子のDNA配列の、プロモーターとコード領域の間 の部分を言い、RNAに転写され、完全にプロセシングされたmRNA中で翻訳 開始コドンの上流(5′)に存在する。翻訳リーダー配列は、−次転写産物のm RNAへのプロセシング、mRNAの安定性又は翻訳効率に影響を与えることが できる。
“成熟”タンパク質は、転写後プロセシングされ、そのシグナルペプチドを含ま ないポリペプチドを言う。“前駆体“タンパク質は、mRNAの翻訳の一次産物 を言う。“シグナルペプチド”は、ポリペプチドのアミノ末端エクステンション を言い、それはポリペプチドと連結して翻訳されて前駆体ペプチドを形成し、ポ リペプチドが分泌経路に入るのに必要である。“シグナル配列”という用語は、 シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を言う。
“細胞内局在化配列(intracellular Iocalization  5equence)”は、細胞内ターゲツティングシグナルをコードするヌク レオチド配列を言う。“細胞内ターゲツティングシグナル″は、タンパク質と連 結して翻訳され、それを特定の細胞内区画に向けるアミノ酸配列である。“小胞 体(ER)ストップトランジット(stop transit)シグナル”は、 ポリペプチドのカルボキシ末端エクステンションを言い、ポリペプチドと連結し て翻訳され、分泌経路に入るタンパク質がER中に保持されるようにする。“E Rストップトランジット配列”は、ERターゲツティングシグナルをコードする ヌクレオチド配列を言う。他の細胞内ターゲツティング配列は、種子及び/又は 葉で活性なターゲツティングシグナル及び液胞ターゲツティングシグナルをコー ドする。
本文で“形質転換”は、宿主細胞のゲノム中への異種遺伝子の伝達及びその遺伝 的に安定な遺伝を言う。植物の形質転換の方法の例には、アグロバクテリウム− 媒介形質転換及び加速−粒子又は“遺伝子銃(gene gun)”形質転換法 が含まれる。
組み替えDNA法は、作物植物の含硫アミノ酸含有量の増加の可能性を与える。
特に有用な方法は: (a)分子クローニング及び遺伝子の試験管内操作の方法 [Sambrook et al、(1989)M。
1ecular Cloning+a Laboratory Manual、 Co1d Spring Harbor LaboratorV Pressを 参照〕、(b)大豆[Chee et al、(1989)Plant Phy siol、91:1212−1218;Christou et al、(19 89)Proc、Nat、Acad。
Sci U、S、A、86:7500−7504;Hinchee et al 、(1989)BiotechnologY 6:915−922 : EPO 公開0301 749 A2]、なたね[De Block et al、(1 989)Plant Physiol、91:6.94−7011及びとうもろ こし[Gordon−Kamm et al、(1990)Plant Ce1 l 2:603−618:Fr。
mm et al、(1990)Biotechnology 8:833−8 391などの農業的に重要な作物植物への形質転換を介した遺伝子の導入、なら びに(C)形質転換された植物における導入遺伝子の種子−特異的発現[Gol dberg et al、(1989)Ce11 56:149−160;Th ompson and Larkins(1989)BioEssays 10 :108−113]である。
含硫アミノ酸の含有量の増加した作物植物の開発にこれらの方法を用いるために 、商業的に重要な遺伝子の同定及び単離が不可欠である。
実験操作で用いられる種々の溶液は、“SSC”、“5SPE”、“デンハート 溶液”などのその慣用名で呼べこれらの溶液の組成は、Sambrook et  al、、(Molecular Cloning、a Laboratory  Manual、2nd ed、(1989)、Co1d Spring Ha rbor Laborat。
ly Press)の付録Bを参照すると見いだすことができる。
とうもろこしH3Z遺伝子のクローニングとうもろこしの10kDゼイン遺伝子 に関する公開されたDNA配列(配列番号:5)[Kirihara et a l、(1988)MOl、Gen、Benet、21:477−484:Kir iharaet al、(1988)Gene 71:359−3701に基づ き、ゲノムとうもろこしDNAを鋳型として用いたポリメラーゼ連鎖反応(PC R)のためのプライマーとして用いるためのオリゴヌクレオチド(配列番号=6 及び7)を設計した。PCR反応の生成物をアガロースゲルから単離し、ハイブ リッド形成プローブとして用いるためにニックトランスレーションにより放射活 性標識した。ベクターλ−EMBL−3中のとうもろこしゲノムDNAライブラ リーをC1ontechから購入し、プラークをPCR−生成クローンを用いて スクリーニングした。
これは、その5′及び3′調節領域を含む全−長10kDゼイン遺伝子の単離と いう結果を生ずることが予想された。
2つのハイブリッド形成λプラークを精製し、クローニングされたとうもろこし DNAフラグメントをさらに特性化した。制限エンドヌクレアーゼ消化及びアガ ロースゲル電気泳動は、2つのクローンが同一であることを示した。アガロース ゲルからのDNAフラグメントをニトロセルロース膜フィルター上に“サザンー プロット“し、ニックトランスレーションにより生成された放射活性−標識10 kDゼインDNAを用いて精査した。1個の7.5kb BamHIフラグメン ト及び1個の1.4kb Xba Iフラグメントがプローブとハイブリッド形 成した。これらのフラグメントを、DNA配列決定のためにファージミド(ph agemid)pTZ18R(Pharmaci a)中にサブクローニングし た。
驚くべきことに、単離された遺伝子は10kDゼイン遺伝子と関連しているが異 なることが配列から明らかであった。これを高硫黄ゼイン(H8Z)遺伝子と指 定した。DNAフラグメントは10kDゼイン遺伝子の453ヌクレオチドと比 較して633ヌクレオチドの読み取り枠を含んでいた。H3Zタンパク質は10 kDゼインと76%のアミノ酸配列同一性を示す。しかしHSZ遺伝子の長い読 み取り枠は10kDゼイン遺伝子中に存在しないメチオニンの豊富なドメインを コードし、成熟HSZタンパク質の場合の含硫アミノ酸の含有量を10kDゼイ ンの場合の26%(22%メチオニン)と比較して29%(28%メチオニン) とした。かくしてHSZ遺伝子は、現在既知のタンパク質の中でメチオニンが最 も高い種子貯蔵タンパク質をコードする。TATAボックスのような周知の遺伝 子発現シグナル及びポリアデニル化シグナルは、H3Z及び10kDゼイン遺伝 子中で類似の位置にあった。推定21アミノ酸シグナル配列は、前駆体ポリペプ チドのアミノ末端においてH3Z遺伝子によりコードされ、10kD遺伝子のそ れと類似している。
本発明のDNAフラグメントを用いて、実質的相同cDNA及びとうもろこし及 び他の植物種、特に単子葉植物からの種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子を 単離することができる。関連遺伝子の単離は当該技術において周知である。
植物品種改良におけるDNA断片の制限酵素に対する多量性(RFL・P)マー カーの利用は、当該技術において十分に記載されている[Tanksley e t al、(1989)Bio、Technology 7:257−264を 参照]。本発明の核酸フラグメントはとうもろこしRFLPマツプ上でマツピン グすることができる。従ってそれはマツピングされた遺伝子座と結合した特性に 関するRFLPマーカーとして用いることができる。
H3Z遺伝子の修飾 硫黄の豊富な種子貯蔵タンパク質をコードする本発明の核酸フラグメントは、適 した調節配列と結合させ、大腸菌(Escherichiacoli)又は酵母 などの微生物、あるいはとうもろこし、大豆及び他の作物植物などの形質転換植 物中でタンパク質を過剰生産するのに用いることができる。そのような組み替え DNA構築物は、本来のHSZ遺伝子又はキメラ遺伝子のいずれかを含むことが できる。当該技術における熟練者は、制限エンドヌクレアーゼ部位を用いる、及 び/又は創造することにより、本発明のフラグメントからコード配列を単離する ことができる[Sambrook et al、(1989)MolecuJa r Cloning+A Laboratory Manual。
Co1d Spring Harbor Laboratory Pressを 参照]。
翻訳開始コドンATGで始まり、翻訳停止コドンTAGで終わるコード配列の正 確な除去を可能にするNeo I (5’ −CCATGG)及びXba I  (5’−TCTAGA)に関する天然に存在する部位が特に有用である。しかし H8Zコード領域には3つのNco 1部位が存在した。これらの部位の2つを 除去し、翻訳開始コドンを含む1つの部位(配列番号=1におけるヌクレオチド 751−756)のみを保持するのが望ましかった。本発明の好ましいDNAフ ラグメント(配列番号=2)は、遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を変化 させずにコード配列内の2つのNco I部位を除去するような、試験管内の特 定の部位の突然変異誘発により創造した。従ってNeo I及びXba 1でD NAを完全に消化すると、前駆体H3Zポリペプチドの全コード配列を含むユニ ーク637bpフラグメントが得られる。キメラ遺伝子の構築をさらに容易にす るために、追加のユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位をHSZの翻訳停止シグ ナルの直後に加えた。オリゴヌクレオチド(配列番号:10及び11)をXba  I部位に挿入し、2つの新しい制限部位、Sma I及びKpn Iを導入し 、Xba I部位を破壊した。配列番号:1のヌクレオチド1−6からの、今や ユニークとなつたXba I部位、及び配列番号:1のヌクレオチド1823− 1828からのSsp I部位を用いてHSZコード領域及び5゛ならびに3゛ 調節領域を含むフラグメントを得た。Xba 、I及びSma Iで消化した商 業的に入手可能なベクターpTZ19R(Pharmac ia)中にこのフラ グメントをクローニングし、プラスミドpcc10を得た。プラスミドpcc1 0は1990年12月7日、ブタベスト条約により、ATCC,12301Pa rklawn Drive、R。
ckville、Maryland 20852に、受託番号68490として 寄託した。
成熟形態のHSZタンパク質を発現することができるために、成熟タンパク質の 最初にユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位を有するH8Z遺伝子の変形を創造 することが望ましかった。これを行うために、PCRを用いてDNAフラグメン トを生成した。オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号:12及び13)を、 PCR−生成フラグメント(配列番号:3)がBspHI部位を含み、Neo  I消化により生成されるものと同一の付着末端を生ずるように設計した。この部 位は、シグナル配列と成熟H3Zコード配列の結合部に位置した。PCR−生成 フラグメントは、H3Z遺伝子の翻訳末端にXba 1部位も含んだ。
PCR法を用い、HSZの高メチオニンドメイン(HMD)をコードする遺伝子 を構築した。翻訳開始コドンを含むNde I部位、及び翻訳停止コドンの直後 にEcoR1部位を加えるようにオリゴヌクレオチド(配列番号:14及び15 )を設計した(配列番号:4を参照)。
これらの部位は発現ベクターへのHMDの挿入を容易にする。
E、coliにおけるHSZの発現 バクテリオファージ T7 RNAポリメラーゼ/T7 プロモーター系[5t udier et al、(1990)Methods in Enzymol ogy 185:60−89コを用いてE、coli中でHSZコード配列を発 現した。H3Zコード配列を含むNc。
I−Xbalフラグメントを発現ベクターに挿入した。pccllと指定された このプラスミドは、前駆体H3Zタンパク質を発現することが予想された。さら にそのシグナル配列を含まない、H3Zタンパク質を発現するように設計された 、pcc12と指定されるプラスミドを構築した。この構築物のための成熟H8 ZコードDNAフラグメントを、上記のPCR法を用いて生成し、発現ベクター 中に挿入した。
H3Zポリペプチドの発現の検出のために、プラスミドpcc11及びpcc1 2をE、coli株HMS174中に形質転換し、35S−メチオニンを用いて 5tudier and Moffatt [(1986)J、Mo1.Bio l、189:113−1301に記載の通りに生体内標識実験を行った。H3Z タンパク質のメチオニン含有量が高いので、これは発現の検出のための特異的で 高感度な方法となる。細胞抽出物をSDSポリアクリルアミドゲル上で移動させ 、それを乾燥し、オートラジオグラフにかけた。約20kDの分子量の顕著な標 識タンパク質バンドがpccll及び90012両抽出物において明らかであっ た。
これは大体成熟した長さのH3Zポリペプチドに予想されるサイズであアクリル アミドゲル電気泳動の後にクーマシーブリリアントブルー染色を行うことにより 全細胞タンパク質を明らかにすると、顕著な誘導20kDタンパク質がpcc1 2ライセード中で明らかであり(しかしpC11ライセード中にはない)、成熟 形態のタンパク質の多量の発現を示した。
本発明の核酸フラグメントは、E、coli又は他の微生物の発酵を介して大量 のHSZ、HMD又は含硫アミノ酸、特にメチオニンの豊富な全タンパク質を生 産するのに用いることができる。これを行うために、本発明の核酸フラグメント をプロモーター配列、翻訳リーダー配列及び3゛非コ一ド配列を含む適した調節 配列に作用的に結合することができる。その後キメラ遺伝子を形質転換を介して 微生物中に導入し、形質転換された微生物を、キメラ遺伝子の高い発現を与える 条件下で成育することができる。含硫アミノ酸の豊富なタンパク質を含む細胞を 集め、豊富なタンパク質を抽出することができる。その後HSZタンパク質を精 製することができる。
E、coli中で大量のH8Zタンパク質を生産するために、pCC12で形質 転換した株BL21 (DE3)pLysE [5tudieret al、( 1990)Methods in Enzymol。
gy 185 : 60−891を用いた。H3Zタンパク質をIPTG(イソ プロピルチオ−β−ガラクトシド)−誘導培養物の抽出物から精製した。H3Z タンパク質は不溶性の沈澱中に存在し、それは細胞抽出物の低速遠心により容易 に集めることができる。細胞タンパク質の大半は上澄み液中に除去される。その 後10mMのβ−メルカプトエタノールを含む70%イソプロパツールで抽出す ることにより、遠心ペレットからHSZをほとんど(〉90%)純粋な形態で選 択的に溶解する。1リツトルの細胞培養物から10−100mgのHSZタンパ ク質が得られた。
ここでE、coli中のH3Zタンパク質の生産が細胞にとって毒性でないこと が決定されたので、株BL21 (DE3)[5tudieret al、(1 990)Methods in Enzymology 185 : 60−8 91を用いて多量の発現を斤うことかできる。
HSZ又はHMDのコード配列の発現に好ましい種類の宿主は真核宿主、特に高 級植物の細胞である。高級植物及びそれらがら誘導される種子の中で特に好まし いのは大豆、なたね(ブラシカ ナブス(B r a ss i ca nap us)、B、カムペスツリス(旦、campestr±且))、向日葵(へりア ンサス アヌス(Helianthus annus)L綿(ゴシピウム ヒル スッム(Gossypium hサチバ(Medicago 5ativa)) 、小麦(ツリチクム Sp (Triticum 5p))、大麦(ホルデウム  プルガレ(旦旦rdeum vulgare))、からす麦(アベナ ッチバ (Δveうな植物において機能的な調節配列を用いる。
植物における異種遺伝子の発現は、十分に確立されている[De BIarer  et al、(1987)Meth、Enzymol、153 : 277− 2911゜コード配列の発現を促進するために選ばれるプロモーターは、それが 所望の宿主組織中でHSZ又はHMDのための翻訳可能なmRNAの量を増加さ せて本発明を遂行するのに十分な転写活性を持っている限りその起源は重要でな い。すべての植物組織における発現、特に葉における発現に好ましいプロモータ ーには、カリフラワーモザイクウィルス中で193及び35S転写産物を指示す るプロモーター[0dell et al、(1985)Nature 313 :810−812:Hull et al、(1987)Virology 8 6 : 482−4931 、リブロース 1.5−ビスホスフェートカルボキ シラーゼの小サブユニット[Morelli et al、(1985)Nat ure 315:200;Broglie et al。
(1984)Science 224:838;Hererra−Estrel la et al、(1984)Nature 310:115;Coruzz i et al、(1984)EMBOJ、3:1671;Faciotti  et al(1985)Bio/Techno logy 3 : 2411  、とうもろこしゼインタンパク質[Matzke et al、 (1984) EMBOJ、 3:1525]、及びクロロフィルa/b結合タンパク質[La mpa et al、(1986)Nature 316:750−7521が 含まれる。 用途に依存して、植物の1つ又はそれ以上の組織における発現に特 異的なプロモーターを選択することが望ましい。例として、光合成組織における 発現が望まれている場合のりブロース 1,5−ビスホスフェートカルボキシラ ーゼの小サブユニットの光−誘導可能なプロモーター、あるいは種子中で特異的 に活性なプロモーターが含まれる。
好ましいプロモーターは、種子中で特異的にタンパク質を発現させるプロモータ ーである。種子は植物タンパク質の主要供給源であり、又種子−特異的発現は非 一種子組織に悪影響を与える可能性を避けることができるので、これは特に有用 である。種子−特異的プロモーターの例には、多くの植物において全種子タンパ ク質の50%以上を成す種子貯蔵タンパク質のプロモーターが含まれるが、これ に限られるわけではない。
種子貯蔵タンパク質は厳密に調節され、高度に組繊−特異的及び段階−特異的方 法でほとんど排他的に種子中で発現される[Higginset al、(i9 84)Ann、Rev、Pfant Physi。
1.35:191−221;Goldberg et al、(1989)Ce ll 56:149−160;Thompson et al。
(1989)BioEssays 10:108−113コ。さらに種子の発生 の異なる段階で異なる種子貯蔵タンパク質を発現することができる。
現在、形質転換された双子葉植物における種子貯蔵タンパク質遺伝子の種子−特 異的発現の多数の例がある。これらには双子葉植物からの、豆β−ファゼオリン [Sengypta−Gopalan et al。
(1985)Proc、Natl、Acad、Sci、USA 82:3320 −3324;Hoffman et al、(1988)PIant Mo1. Bio、11 : 717−7291 、豆レクチン[V。
elker et al (1987)EMBOJ、6:3571−35771 、大豆レクチン[Okamuro et al、(1986)Proc、Na1 .Acad、Sci、USA83:8240−8244]、大豆クニッットリプ シンインヒビター[Perez−Grauet al、(1989)Plant  Ce1l 1:095−1109]、大豆β−コングリシニン[Beachy  et al、(1985)EMBOJ、4:3047−3053;Barke r etal、(1988)Proc、Natl、Acad、Sci、USA8 5:458−462;Chen et al、(1988)EMBOJ、7:2 97−302;Chen et al、(1989)Dev、Genet、10 :112−122;Na1to et al。
(1988)Plant Mo1.Biol、11+109−1231、えんど うピシリン[Higgins et al、(1988)Plant Mo1. Biol、11:683−695]、えんどうコンビシリン[Newbigin  et al、(199Q)Plata 180:461コ、えんどうレグミン [5hirsat et al、(1989)Mo1.Gen、Genetic s 215:326]、なたねナピン[Radke et al、(1988) Theor、Appl、Genet、75:685−6941の遺伝子、ならび に単子葉植物からの遺伝子、例えばとうもろこし15kDゼイン[Hoffma net al、(1987)EMBOJ、6:3213 3221:5cher nthaner et al、(1988)EMBOJ。
7:1249−1253;Williamson et al、(1988)P lant Physiol、88:1002−10071、大麦β−ホルデイン [Marris et al、(1988)Plant Mo1.Biol、1 0:359−3661及び小麦グルテニン[Co1ot et al、(198 7)EMBOJ、6:3559−35641の遺伝子が含まれる。さらに、キメ ラ遺伝子構築物中の異種コード配列に作用的に結合された種子−特異的遺伝子の プロモーターも、形質転換された植物中でその時期的及び空間的発現パターンを 保持している。そのような例にはアラビドプシス(Arabidopsis)及 びB、ナプス種子中でエンケファリンペプチドを発現するアラビドプシス タリ アナ(Arabidopsis thaliana)2S種子貯蔵タンパク質遺 伝子プロモーター[Vandeke rckhoveet al、(1989) Bio/Technology 7:929−932]、及びルシフェラーゼを 発現する豆レクチン及び豆β−ファゼオリンプロモーター[Riggs et  al、(1989)PIant Sci、63:47−571、及びクロラム7  ニー1− コール7セチルトランスフエラーゼを発現する小麦グルテニンプロ モーター[C。
lot et al、(1987)EMBOJ、6:3559−3564]が含 まれる。
本発明の核酸フラグメントの発現において特に有用なのは数種の広範囲に特性化 された大豆種子貯蔵タンパク質遺伝子からの異種プロモーター、例えばクニッッ トリプシンインヒビター[Jofuku et al、(1989)Plant  Ce1l 1:1079−1093:Perez−Grau et al ( 1989)Plant Cel 11 :1095−11091 、グリシニン [N1elson et al。
(1989)Plant Ce1l 1+313−328]、β−コングリシニ ン[Harada et al、(1989)Plant Ce I l 1  : 415−4251の遺伝子のプロモーターである。大豆β−コングリシニン 貯蔵タンパク質のα゛ −及びβ−サブユニットの遺伝子のプロモーターは、形 質転換された植物中で大豆種子の発生の中−から後−期に子葉にてHSZ mR NAを発現するのに特に有用である[Beachy at al、(1985) EMBOJ、4:3047−3053;Barker et al、(1988 )Proc、Natl、Acad、Sci、USA 85:458−462;C henet al、(1988)EMBOJ、7:297−302;Chen  et al、(1989)Dev、Genet、10:112−122;Na1 to et al、(1988)Plant Mol。
Biol、11:109−123]、そのわけはa)形質転換された種子におけ るその発現への位置的効果がほとんどない、及びb)2つのプロモーターは異な る時期的調節を示しα゛ −サブユニット遺伝子のプロモーターはβ−サブユニ ット遺伝子のプロモーターの数日前に発現されることである。
数種の広範囲に特性化されたとうもろこし種子貯蔵タンパク質遺伝子からの異種 プロモーター、例えば10kDゼイン[Kiriharae t a 1. ( 1988)Gene 71 : 359−3701.27kDゼイ:z[Pra t et al、(1987)Gene 52:51−49:Ga1lardo  et al、(1988)Plant Sc i、54 : 211−281 1 、及び19kDゼイン[Marks et al、(1985)J、Bio l、Chem、260:16451−164591の遺伝子からのプロモーター も本発明の核酸フラグメントの発現に特に有用である。とうもろこしにおけるこ れらのプロモーターの相対的転写活性が報告され[Kodrzyck et a l、(1989)Plant Ce1l 1+105−114]、とうもろこし のためのキメラ遺伝子構築物において用いるプロモーターの選択の基礎となって いる。
適した量のHSZ又はHMD mRNAの発現には異なるプロモーターを用いた 異なるキメラ遺伝子の使用が必要である。そのようなキメラ遺伝子は1つの発現 ベクターと共に、又は1個以上のベクターを順に用いて宿主植物中に伝達するこ とができる。
本来のHSZプロモーター又は他のプロモーター構築物中にニン/%ンサー又は エンハンサー一様要素を導入することも、本発明の遂行のためにHSZ又はHM Dのための一次転写産物の量を増すと思われる。これには35Sプロモーター中 に存在するようなウィルスエンハンサ−[0dell et al、(1988 )Plant Mo1.Biol。
10 : 263−272] 、オパイン遺伝子からのエンハンサ−[Fr。
mm et al、(1989)Plant Ce1l 1:977−9841 、あるいは本発明の核酸フラグメントに作用的に結合されたプロモーター中に置 いた時に転写を増加させる他の供給源からのエンハンサ−が含まれる。
特に重要なのは構造プロモーターに40倍の種子−特異的増強を与えることがで きるβ−コングリシニンのα゛−サブユニツト遺伝子から単離したDNA配列要 素である[Chen et a 1. (1988)EMBOJ、7:297− 302;Chen et al、(1989)Dev、Genet、10:11 2−122]o当該技術における熟練者は容易にこの要素を単離し、それをいず れの遺伝子のプロモーター領域にも挿入し、形質転換植物中でプロモーターを用 いて増強された種子−特異的発現を得ることができる。β−コングリシニン遺伝 子と異なる時期に発現されるいずれかの種子−特異的遺伝子にそのような要素を 挿入すると、種子の発生の間に長期にわたって形質転換植物中で発現が起こる。
本発明は多様な他の方法により行って所望の結末を得ることができる。
ある形態の場合本発明は、HSZの非常に大量のコピーを有するためにH3Zタ ンパク質の生産量を増加させる植物の改良に基づいている。
転写停止シグナル、ポリアデニル化シグナル及びH3Zコード領域の正しい発現 のために必要な他の調節配列を与えることができるいずれの3゛非−コード領域 も本発明の遂行に用いることができる。これにはH8Z遺伝子の本来の3°末端 、異種ゼイン遺伝子からの3′末端、いずれかの貯蔵タンパク質からの3゛末端 、例えば大豆β−コングリシニン遺伝子の3′末端、ウィルス遺伝子からの3゛ 末端、例えば35S又は19Sカリフラワーモザイクウイルス転写産物からの3 ゛末端、オパイン合成遺伝子からの3′末端、リブロース 1,5−ビスホスフ ェートカルボキシラーゼ又はクロロフィルa / b結合タンパク質の3′末端 、あるいは用いた配列がその核酸配列中に必要な調節情報を備えており、それが 作用的に結合しているプロモーター/H8Z又はプロモーター/HMDコード領 域組み合わせを正しく発現するいずれの供給源からの3゛末末端列も含まれる。
異なる3″非−コード領域の有用性につき記載した多くの例が文献中にある[例 えばIngelbrecht etal、(1989)Plant Ce1l  1:671−680を参照]。
タンパク質を正しく発現して本発明を遂行するために必要な場合、細胞内局在化 (local 1zation)配列をコードするDNA配列をHSZ又はHM Dコード配列に加えることができる。従ってHSZの本来のシグナル配列を除去 するか又は標的植物中で機能することが知られているシグナル配列と置換するこ とができる。シグナル配列を除去すると、H8Zタンパク質は細胞の細胞質中に 留まると思われる。別の場合H8Zの単子葉シグナル配列を、双子葉植物中で機 能する豆ファゼオルス ブルガリス(Phaseolus vulgaris) からのファゼオリンのβサブユニットからのシグナル配列又は大豆からのβ−コ ングリシニンのα′サブユニットからのシグナル配列(Doyle et al 、(1986)J、Biol、Che’m、261:9228−92381で置 換することができる。Hoffman et al。
[(1987)EMBOJ、6:3213−32211は、15kDゼインの単 子葉前駆体のシグナル配列がタンパク質を分泌経路に向かわせ、形質転換タバコ 中でも正しくプロセシングされたことを示した。しかしとうもろこしの場合のよ うにタンパク質は小胞体中に留まらなかった。タンパク質を小胞体中に保持する ためには、ストップトランジット配列を加える必要がある。タンパク質のカルボ キシ末端にアミノ酸配列[1ys−asp−glu−1eu] (配列番号:2 8)をコードするDNA配列を加えるとタンパク質を小胞体のルーメンに保持す ることが当該技術において既知である[Munro et al、(1987) Cell 48:899−907;Pelham(1988)EMBOJ、7: 913−918;Pelham et al、(1988)EMBOJ、7:1 757−1762;Inohara et al。
(1989)Proc、Natl、Acad、Sci、U、S、A、86 二3 564−3568;He5se et al、 (1989) EMBOJ、8 :2453−2461]。いくつかの植物では種子貯蔵タンパク質が細胞の液胞 中に位置している。本発明を行うために、液胞ターゲツティング配列を加えるこ とによってHSZ又はHMDタンパク質をこれらの植物の液胞に向かわせること が必要である。液胞ターゲツティング配列として働く短いアミノ酸ドメインが、 双子葉のタンパク質貯蔵液胞に蓄積する豆フィトヘマグルチニンから同定された [T a g u eet al、(1990)Plant Ce1l 2:5 33−546]。他の報告には、大麦レクチンを形質転換タバコ中の液胞に向か わせるのに必要なカルボキシ末端アミノ酸配列が記載されてL)る[Bedna rek et al、(1990)Plant Ce1l 2:1145−11 551゜ 植物中におけるHSZの発現のためのキメラ遺伝子の構築植物中におけるHSZ の発現のためのキメラ遺伝子の構築に3つの種子−特異的遺伝子発現カセットを 用いた。発現カセットは3つの高度番二発現された種子貯蔵タンパク質遺伝子か らの調節領域を含んだ=1)豆ファゼオルス ブルガリスからのファゼオリンの βサブユニツト: 2)大豆からのβ−コングリシニンのα′サブユニツト;及び3)とうもろこし からの1QkDゼイン。
カセットを図2に略図的に示す。これらはそれぞれユニークNc。
■部位を5′調節領域の直後に有し、さらにXba ISSma I及びKpn  I部位のいくつか、又はすべてを3′調節領域の直前薯こ有する。
全H3Zコード領域を含むNcol−XbaIフラグメント(配列番号:2)及 びシグナル配列を含まない遺伝子、すなわち成熟タンノくり質コード配列を含む BspHI−Xba Iフラグメント(配列番号=3)を、Neo I及びXb a Iで消化したファゼオリン及びβ−コングリシニン発現カセット(図2)に 挿入した。10kDゼインカセツトに挿入する場合、H3Zコード領域を含むN co I−8maIフラグメントをNcoI−3maI消化10kDゼインカセ ットに挿入した。
高級植物の細胞を形質転換するための本発明に従う種々の方法が、当該技術にお ける熟練者に利用できる(EPO公開0 295 959A2及び0 138  341 Alを参照)。そのような方法にはアグロバクテリウム spp、のT i及びRiプラスミドに基づく形質転換ベクターに基づ(方法が含まれる。これ らのベクターのバイナリ−型の利用が特に好ましい。Ti−誘導ベクターは、単 子葉及び双子葉植物、例えば大豆、綿及びせいようあぶらなを含む多様な高級植 物を形質転換した[Pacciotti et al、(1985)Bio/T eChnology 3:241;Byrne et al、(1987)Pl ant Ce1l、Ti5sue and Organ Cu1ture 8: 3;5ukhapinda et al、(1987)PIant Mo1.B iol、8:209−216;Lorz etal、(1985)Mo1.Ge n、Genet、199:178;Potrykus (1985)Mo1.G en、Genet、199:183]。
ファゼオリンーH3Zキメラ遺伝子カセットは、アグロバクテリウムツメファシ ェンスのバイナリ−Tiプラスミドベクター系[Re v an (1984) Nucl、Ac1ds、Res、12:8711−8720]の一部であるベク ターpZS97K (図3)中に挿入した。ベクターは: (1)形質転換植物 細胞のための選択可能マーカーとしてのキメラ遺伝子 ツバリンシンターゼ/ネ オマイシンホスホトランスフェラーゼ(nos:NPT II)[Bevan  et at、(1983)Nature 304:184 186]、(2)T i−プラスミドのT−DNAの左及び右端[Bevan (1984)Nuc  1.Ac ids、Res、12:8711−8720コ 、(3)EcoRI 、Kpn I、BamHI及びSal Iに関するユニーク制限エンドヌクレア ーゼ部位を有するE、coli 1acZ α−相補セグメントCa−comp lementing segment)[Vieriaand Messing (1982)Gene 19:259−267コ、(4)シュードモナス(Ps eudomonas)プラスミドpvS1からのバクテリア複製起点[1toh  et al、(1984)Plasmid 11:206−2201、及び5 )形質転換A、ツメファシェンスのための選択可能マーカーとしてのTn5から のバクテリアネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子[Berg et  al、(1975)Proc、Natl、Acad、Sci、U、S、A。
72 : 3628−3632]を含む。
キメラH3Z遺伝子を含むバイナリ−ベクターを、二親交配[Ruvkin e t al、 (1981)Naure 289:85 88コによりアグロバク テリウム株LBA4404/pAL4404 [Hockema et al( 1983)Naure 303:179−1801に形質転換した。アグロバク テリウム形質転換産物を用いてタバコの葉のディスクに接種した[Horsch  et al、(1985)Science 227:1229−1231]o 植物をカナマイシンを含む選択培地中で再生した。
異種DNA構築物の直接吸収[EPO公開0 295 959 A2を参照〕、 エレクトロポレーションの方法[Fromm et al。
(1986)Nature (London)319 : 791を参照]又は 核酸構築物を塗布した金属粒子を用いた高速弾道衝撃(high−veloci ty ballistic bombardment)[K11ne et a l、(1987)Nature(London)327 : 70、及び米国特 許第4,945.050号明細書を参照コなどの他の形質転換法を当該技術にお ける熟練者は利用することができる。
形質転換されたら、細胞は当該技術における熟練者により再生することができる 。
特に適しているのは、なたね[De Brock et al、(1989)P lant Physiol、91:694−701を参照]、向日葵[Ever ett et al、(1987)Bio/Technology 5:120 1]、大豆[McCabe et al。
(1988)Bio/Technology 6:923;Hinchee a t al (1988)Bio/Technology 6:915;Chee  et al、(1989)Plant Physi。
1.91:1212−1218:Christou et al、(1989) Proc、Natl、Acad、Sci USA 86:7500−7504  ; EPO公開0 301 749 A2コ、及びとうもろこし[Gordon −Kamm et al、(1990)Plant Ce1l 2:603−6 18:Fromm et al、(1990)BiotechnologV 8 :833−8391などの商業的に重要な作物中に異種遺伝子を形質転換するた めの、最近記載された方法である。
衷塵男 本発明を以下の実施例にてさらに定義する。他に記述がなければ実施例中すべて の部及びパーセンテージは重量により、度は摂氏である。これらの実施例は本発 明の好ましい具体化を例示しているが単に例示のみのために示すと理解するべき である。上記の議論及びこれらの実施例から、当該記述における熟練者は本発明 の不可欠の特性を認識することができ、その精神及び範囲から逸脱することなく 本発明を種々の用途及び条件に適合させるためにその種々の変更及び修正を行う ことができる。
バクテリオファージラムダ中のとうもろこしのゲノムリイブラリーをC1ont ech(Palo Alto、Ca1ifornia)から購入した。供給者か らのデータシートは、とうもろこしDNAは暗所で成育した7日令の実生からで あることを示していた。ベクターは平均サイズが15kbのBamHIフラグメ ントを有するλ−EMBL−3であった。1−9xlO9プラ一ク形成単位(p fu)/mLの力価が供給者により示されていた。それが到着してからライブラ リーを滴定すると、2. 5 x 10’p f u/mLを含んテイタ。
DNAハイブリッド形成によるライブラリーのスクリーニングのための案が販売 者により与えられた。合計15のルリアブロス(L B)寒天プレート上で15 0−mmのプレート当たり約30,0OOpfuを平板培養し、450.000 プラークを得た。平板培養は、宿主としてLBBO22%マルトース中で成育し たE、coliLE392を用い、平板培養培地としてLB−7,2%アガロー スを用いて行った。プラークをニトロセルロースフィルター(Millipor e HATF、0゜45mM孔径)上に吸着し、1.5MのNaC1,0,5M のトリス−CIpH7,5中で変性さ−、3xssc中で濯いだ[S amb  r’ Ook et al、(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual、Co1d SpringHarb or Laboratory Press]。フィルター’;−Whatman  3MM紙上にプロットし、80℃の真空炉中で2時間加熱して膜中のファージ DNAをしつかり固定した。
その5゛及び3′隣接領域と共に高メチオニン10kDゼイン遺伝子[Kiri hara et al、(1988)Mo1.Gen、Genet、211:4 77−4841に関してライブラリーをスクリーニングするためのハイブリッド 形成プローブを生成した。この遺伝子に隣接する30塩基長の2つのオリゴヌク レオチドを、Appliecl Biosystems DNA合成機を用いて 合成した。オリゴマー5M56(配列番号:6)は、最初の10アミノ酸におよ ぶプラス鎖をコードする。
5M56 5’−ATG GCA GCCMG ATG C費賦^TTG TT CGe丁−31(配列番号・6)H@tAla Ala LyS Met Le u Ala Leu Ph@Ala (配列番号・5のアミノ酸−21 から−12) オリゴマー〇FC77(配列番号ニア)は最後の10アミノ酸におよぶマイナス 鎖をコードする。
CFC’77 3’−AAT GTCGTT GGG AAA CAA CCA  CGA CGT AAG−5’ (配列番号、7)Lau Gin Gユn  Pro Phga Va1Gly入1a Ala i’h* (配列番号、5の アミノ酸120 から129) これらは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりとうもろこしゲノムDNA( Ba5株)を鋳型として10kDコード領域を生成するために用いられた。PC Rは販売者の指示に従ってPerkin−E1meた。反応生成物を1%アガロ ースゲル上で移動させ、エチジウムプロミドで染色すると、10kDゼイン遺伝 子の場合に予想される450bpのサイズの強いDNAバンドを、約650bp の弱いバンドと共に示した。450bpバンドをDEAEセルロース膜(Sch  l e i che r& 5chue 11)上に電気溶出し、続いて65 ℃にてIMのNaCL 0.1mMのEDTA、20mMのトリス−CIpH8 ,0を用いて膜から溶出した。DNAをエタノール沈澱させ、70%のエタノー ルで濯ぎ、乾燥した。乾燥ペレットを10μLの水に再懸濁し、アリコート(通 常1μL)を別の組のPCR反応に用い、非対称ブライミング(asymmet ric priming)により1本鎖直鎖状DNAを生成した。この場合、プ ライマー5M56及びCFC77は、1:20のモル比及び20:1のモル比率 で存在した。生成物である10kDゼイン遺伝子のプラス及びマイナス鎖の両方 をフェノール抽出し、エタノール沈澱させ、NAC3(Bethesda Re 5earchLaboratories)カラムを通過させて過剰のオリゴマー を除去した。溶出物を2回エタノール沈澱し、70%のエタノールで濯ぎ、乾燥 した。適した相補的プライマー及びUnited StatesBiochem ivals Companyからのシークエナーゼキットを用い、販売者の指示 に従ってDNA配列決定を行った。PCR産物の配列は、10kDゼイン遺伝子 に関して公開されている配列と同一であった。32P−dCTP及びBethe sda Re5earch Laboratoriesから購入したニックトラ ンスレーションキ・ソトを用い、PCR−生成10kDゼイン遺伝子のニックト ランスレーションにより放射活性プローブを形成した。
λフアージプラークを有する15の150−mmニトロセルロースフィルターを 、放射活性10kD遺伝子プローブを用いてスクリーニングした。50XSSP E、5Xデンハート[Sambrook et al、(1989)Molec ular Cloning:A Lab。
ratory Manual、Co1d Spring HarborLabo ratory Pressを参照1.0.1%SDS、100g/mLウシ胸腺 DNA中で60℃にて4時間予備ハイブリッド形成した後、フィルターを、変性 放射標識10kDゼイン遺伝子(cpm/mL)を含む新しいハイブリッド形成 混合物に移し、60℃で終夜保存した。翌日それらを緊縮条件下で濯いだ:2x SSC−0.05%SDS中の室温で1時間及びlX5SC−0,1%SDS中 の68℃で1時間。その後3MM Whatman紙上にプロットし、空気乾燥 し、Du Pont CronexRLightning Plus強調スクリ ーンを用いてKodak XAR−5フイルムで一70℃にてオートラジオグラ フィーを行った。これらのオートラジオダラムから、20のハイブリッド形成プ ラークが同定された。これらのプラークを最初のペトリ皿から取り上げ、80− mm皿当たり約100プラークを与える希釈度で平板培養した。これらのプラー クをニトロセルロースフィルターに吸着させ、同一の方法で再精査した。オート ラジオグラフィーの後、最初のプラーク中の10番の1つだけが2つのハイブリ ッド形成プラークを示した。これらのプラークにつきプローブを用いて3回目の 試験を行った。すべての子孫プラークがハイブリッド形成し、純粋なりローンが 単離されたことを示した。
これらの2つのファージクローン、λ10−1、λ10−2から、小規模液体λ −ファージライセードからのDNA単離の案を用いてDNAを調製した(Ans ul et al、(1987)CurrentProtocols in M o1ecular Biology、pp、1. 12. 2. 1. 13.  5−6)。制限エンドヌクレアーゼ消化及びアガロースゲル電気泳動は、2つ のクローンが同一であることを示した。アガロースゲルからのDNAフラグメン トを、ニトロセルロース膜フィルター上に“サザンープロット”し[Sambr ook etal、 (1989)Molecular Cloning:A  Laboratory Manual、Co1d Spring Harb。
r Laboratory Pressを参照]、ニックトランスレーションに より生成した放射活性−標識10kDゼインDNAを用いて精査した。1個の7 .5kbのBamHIフラグメント及び1個の1゜4kbのXba Iフラグメ ントがプローブにハイブリッド形成した。
7.5kbのBamHIフラグメントを、0,5%低融点(LMP)アガロース ゲル上で移動させたλDNAのBamHI消化産物から単離した。7.5kbバ ンドを切り出し、融解し、0.5MのNaCl中に希釈し、NACSカラム上に 負荷し、その後それを0.5MのNaC1,10mMのトリス−CIl)H7, 2,1mMのEDTAで洗浄し、2MのNaC1,10mMのトリス−CIl) H7,2,1mMのEDTAでフラグメントを溶出した。このフラグメントを、 BamHIで切断し、ファージミドがそれ自身に連結するのを防ぐためにウシ腸 アルカリホスファターゼで処理した[Sambrook et al、(198 9)Molecular Cloning:A Laborat。
ry Manual、Co1d Spring Harbor Laborat ory Pressを参照コファージミドpTZ18R(Pharmacia) に連結した。E、coliの形質転換の後に、これらのフラグメントを用いたサ ブクローンがpT218RDNAに関して両方に配向して得られた。
クローニングされたλフアージDNAのXba I消化産物を0.8%アガロー スゲル上で移動させ、DEAEセルロース膜を用いて1.4kbフラグメントを 単離した(上記のPCR−生成10kDゼインDNAフラグメントの場合と同方 法)。このフラグメントを上記と同方法で、Xba Iで切断したpTZ18R に連結した。E、coliの形質転換の後、pTZ18RDNAに関して両方に 配向した、これらのフラグメントを用いたサブクローンを得、pX8及びpXl oと指定した。
Pharmaciaによって示された案を用い、サブクローンから1本鎖DNA を形成した。1.4kbのXba Iフラグメント全体を配列決定した。さらに Xba Iフラグメントに隣接する700塩基を、クローンpB3 (フラグメ ントpB3はpX8と同一配向)のBamHIフラグメントから配列決定し、合 計2123塩基の配列(配列番号:1)を得た。
H3Z遺伝子を有する1、4kDのXba Iフラグメント中には、すべてH8 Zコード領域にある3つのNco 1部位が存在する。これらの部位の中で翻訳 開始コドンを含む1つだけ(配列番号:1のヌクレオチド751−756)を保 持するのが望ましかった。従ってオリゴヌクレオチド−指示による特定部位の突 然変異誘発[Sambrooket al、(1989)Molecular  Cloning:ALaboratory Manual、Co1d Spri ng Harbor Laboratory Pressを参照]により870 −875及び1333−1338の位置のNeo I部位を除去した。突然変異 誘発のために合成したオリゴヌクレオチドは:CFC99ATGAACCCTT  GGATGCA(配列番号:8) CFC98CCCACAGCAA TGGCGAT(配列番号:9) である。Bio−Rad (Richmond、CA)から購入したキットを用 い、販売者による案に従って突然変異誘発を行った。
方法により872のAがTに、及び1334のCがAに変わった。これらは両方 共それぞれのコドンの第3位置にあり、9旦Δが9且工に変化してもやはりPr oをコードし、GCCがε9Δに変化してもやはりAlaをコードし、遺伝子に よりコードされるアミノ酸配列に変化を生じない。ATG開始コドンに1個のN co 1部位を有する修飾H8Z遺伝子を含むプラスミドクローンをpX8mと 指定した。本来のH3Z遺伝子は遺伝子の停止コドンにユニークXba 1部位 を有するので(1384−1389、配列番号:l)、Nco I及びXba  IでDNAを完全に消化すると前駆体H8Zポリペプチドの全コード領域を含む 637bpフラグメントを与える(配列番号=2)。
コード領域の末端の直後に別のユニークエンドヌクレアーゼ部位を有するH3Z 遺伝子の形態を創造するのが望ましかった。これを行うためにオリゴヌクレオチ ドCFC104(配列番号=10)及びCFCIO5(配列番号:11) をアニーリングし、Xba I部位に連結し、2つの新しい制限部位、Sma  I及びKpn Iを導入し、Xba I部位を破壊した。今やユニークとなった 配列番号=1のヌクレオチド1−6のXba 1部位、及び配列番号:1のヌク レオチド1823−1828のSsp I部位を用い、H8Zコード領域及びそ の5゛ならびに3゛調節領域を含むフラグメントを得た。Xba I及びSma  Iで消化した商業的に入手可能なベクターpTZ19R(Pharmac i  a)中にこのフラグメントをクローニングし、プラスミドpcc10を得た。
成熟タンパク質の最初にユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、すなわ ちアミノ末端シグナル配列が除去された、H8Z遺伝子の別の形態を創造するこ とが望ましかった。これを行うために、実施例1に記載のPCRを用いてDNA フラグメントを生成した。PCR反応のための鋳型DNAはプラスミドpX8m であった。反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーは: CFC106S’−CCACTEトコCCCATATCCCAGGGCACT? −3’ (配列番号:12)CF’C885雪−TTCTA−コニリTGCAG CACCAACAAAGGG−3’ (配列番号 13)であうな。CFC10 6(配列番号=12)オリゴヌクレオチドはBspHI部位(下線)を有するP CR−生成フラグメントを与え、それはBspHIで消化するとNco I消化 により生成されるものと同一の付着末端を生ずる。この部位はシグナル配列と成 熟H3Zコード配列の接合部に位置した。CFC88(配列番号=13)オリゴ ヌクレオチドは、H8Z遺伝子の翻訳末端にXba 1部位(下線)を有するP CR−生成フラグメントを与える。PCR−生成フラグメントの消化により得ら れるBspHI−Xba Iフラグメント(配列番号=3)は成熟形態のH8Z をコードし、翻訳を開始させるタンパク質のアミノ末端にメチオニン残基が付加 されている。
ベクターpBT430を用いた。このベクターはバクテリオファージT7 RN Aポリメラーゼ/T7 プロモーター系を使用したpET−3a [Rosen berg et al、(1987)Gene 56:125−135コの誘導 体である。最初にpET−3aのEcoRI及びHind I11部位をその元 の位置で破壊することによりプラスミドp BT430を構築した。その後Ec oRI及びHind II■部位を含むオリゴヌクレオチドアダプターをpET 3aのBamH1部位に挿入した。これにより発現ベクターへの遺伝子の挿入の ために追加されたユニーククローニング部位を有するpET−3dMが創造され た。その後翻訳開始位置のNde I部位を、オリゴヌクレオチド−指示突然変 異誘発を用いてNco 1部位に変換した。この領域のpEに変換された。
実施例1に記載の通りDEAEセルロース膜を用いた電気泳動の後、アガロース ゲルからpX8mのNcoI−XbaIフラグメント(配列番号:2、実施例2 を参照)を単離した。このフラグメントラ2つのアニールヌクレオチド、CFC 104(配列番号:10)及びCFC105(配列番号:11)に連結し、CF C1045’−CTAGCCCGGGTAC−3’ (配列番号:10)CF’ ClO33’−GGGCCCATGGATC−5’ (配列番号=11)2つの 新しい制限部位、Sma I及びKpn IをフラグメントのXba エ末端に 導入した。65℃で10分間加熱することにより連結を停止した。連結産物をS ma Iで消化し、3′平滑末端フラグメントを残した。発現ベクターpBT4 30をEcoRIで消化し、dATP、dTTP及びE、co l 1DNAポ リメラーゼのフレノウフラグメントを加えることにより付着末端を満たした。そ の後平滑末端ベクターDNAをNco Iで消化し、反応混合物をフェノール抽 出し、2回エーテル沈澱した。H3Zコード領域を含む640bpのNcol− Sma IフラグメントをNeo I−平滑p BT430ベクターに連結した 。E、coli形質転換産物を所望の組み替え産物に関してスクリーニングする ことにより、pccllと指定するプラスミドを含むクローンを同定した。この プラスミドは前駆体H3Zタンパク質を発現することが予想された。
E、coli中でそのシグナル配列なしでHSZタンパク質を発現するように設 計されたプラスミドも構築した。この構築のための成熟HSZコードDNAフラ グメントは、鋳型としてプラスミドpX8mを用い、プライマーとしてCFC1 06(配列番号=12)及びCF088 (配列番号=13)を用い、実施例2 に記載の通りPCRにより生成した。
(JC1065’−CCACTz1z込CCCATATCCCAGGGCACT ?−3’ (配列番号、12)a*tThrHisXl@ProGlyHisX J@u (配列番号:3のアミノ酸 1から8) CTC’S 3’−GGGAAACAACCACGACGTAAGAEDTCT ?−5’ (配列番号、13)185から191) CFC106(配列番号=12)オリゴヌクレオチドは、Nco Iと同一の付 着末端を生成するBspHI部位(上記の下線)を有するPCRフラグメントを 与えた。この部位中のATG配列は翻訳開始コドンであり、それに続<ACC配 列は成熟タンパク質のアミノ末端のトレオニン残基をコードする。CFC88( 配列番号=13)オリゴヌクレオチド中のXba I部位(上記の下線)はコー ド配列の末端における簡便なりヨーニング部位となった。PCR反応生成物を2 Mの酢酸アンモニウム、70%のエタノール中で2回沈澱させ、過剰のオリゴヌ クレオチドプライマーを除去した。DNAの末端は、4種類すべてのデオキシリ ボヌクレオチドトリホスフェートの存在下でE、colt DNAポリメラーゼ のフレノウフラグメントと反応させることにより平滑にした。反応生成物をアガ ロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムプロミドで染色した。主要な57 0bpバンドを上記の通りDEAEセルロース膜を用いて溶出した。その後DN AをBspHIで消化し、エタノールで2回沈澱させ、上記と同一のNco I −平滑pBT430発現ベクターフラグメントに連結した。E、coli形質転 換産物を所望の組み替え産物に関してスクリーニングすることにより、pcc1 2と指定されるプラスミドを含むクローンを同定した。クローニングされたPC R−生成フラグメントを配列決定すると、配列は配列番号=3と、同一であった 。
H3Zポリペプチドの発現の検出のために、プラスミドpcc11及びpcc1 2をE、coli株HMS174中に形質転換し、5tudier and M offatt (1986)J、Mo1.Biol。
189 :113−130に記載の通りに生体内標識実験を行った。タンパク質 を(T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を有するλファージCE6に感染させるこ とにより)誘導の1時間後に、これらのメチオニンの豊富なポリペプチドを非常 に顕著に標識すると思われる3sS−メチオニンを用いて標識した。細胞抽出物 をSDSポリアクリルアミドゲル上で移動させ、それを乾燥し、オートラジオグ ラフィーにかけた。約20kDの分子量の顕著なバンドがpccll及びpcc 12抽出物において明らかであった。これは成熟長HSZポリペプチドの場合に 大体予想されるサイズであり、pcc11形質転換産物中で作られた前駆体タン パク質b<E、c o I iによりプロセシングされていることを示唆した。
全細胞タンパク質を誘導及びSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の後にクー マシーブリリアントブルー染色することにより明らかにすると、顕著な誘導20 kDタンパク質がpcc12ライセード中で明らかであるが、pcc11ライセ ード中にはなかった。
pcc12を用いて形質転換されたE、coli株BL21 (DE3)pLy sE [5tudier et al、(1990)Methods in E nzymology 185+60−891の1−Lの培養物をアンピシリン( 100mg/L)及びクロラムフェニコール(10mg/L)を含むLB培地中 で37°Cにて成育した。600nmlこおける光学密度が1.08において、 l、2mLのO,LM IPTG(イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、誘導 物質)を加え、インキュベーションを37℃で3時間続けた。遠心により細胞を 集め、5QmMのNaC1;50mMのトリス−CI、pH7,5; 1mMの EDTAで洗浄し、lQmLの同緩衝液を用いて再懸濁し、−20°Cで凍結し た。
懸濁液を解凍し、Triton X−100を0.1%の濃度まで加え、続いて 3000単位のデオキシリボヌクレアーゼ I (Boehri nger−M annhe im)を加えた。室温で60分間インキュベーションした後、懸濁 液を氷上で音波処理し、粘度を丁番デた。混合物を遠心し、上澄み液を捨てた。
ペレットを5mLの70%イソブロノくノール;10mMのβ−メルカプトエタ ノールで2回抽出した。(よとんどのタンパク質と異なりHSZはこの溶媒に不 溶性である。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及びクーマシーブリリアン トブル−染色により、H3Zタンパク質が第1抽出物中の主要タンノくり質(〉 90%)であり、第2抽出物中の唯一の明白なタンノ々り質であることカベ明ら めA1こなった。
ILの細胞培養物から10−100mgのH3Zタンノ々り質力(得られた。
精製されたH3Zタンパク質は、タンノくり質に対して誘起されたウサギ抗体を 得るためにHazelton Re5earch Facility、310  Swampridge Road、Denver、PA17517に送った。
実施例5 HSZの高メチオニンドメインをコードする遺伝子の構築HSZは、非常にメチ オニンの豊富な中心領域(約48%メチオニン残基)を含み、メチオニン含有量 が低い(それぞれ10%メチオニン及び7%メチオニン)アミノ末端及びカルボ キシ末端領域が隣接している。
中心領域はMet−Met−Met−Pro (配列番号:27)の繰り返しモ チーフを含む。関連する10kDゼインタンパク質は類似の構造を有する(図3 を参照)。しかしH8Zタンパク質の中心領域は、10kDゼインの対応する領 域の約2倍の大きさであり、HSZのメチオニン含有量の増加を説明している。
10kDゼインと比較してHSZ中の中心高メチオニンドメインが明らかに2倍 であることは、中心高メチオニンドメインが安定な構造を有し、それ自身により 発現されて非常にメチオニンの豊富な貯蔵タンパク質を与えることを示唆した。
HSZの高メチオニンドメイン(HMD)をコードする遺伝子を構築した。これ を行うために、pX8を鋳型DNAとし、オリゴヌクレオチドJR5(配列番号 =14)及びJR6(配列番号:15)をDNA合成のためのプライマーとして 実施例1に記載のPCRを用いた:JR5S’−TCACCGCTTCAGCA GTGCChXhX!GCCAATG−3’ (配列番号:14)J只65゛− 丁Cττ入qムムエエC丁入丁GGCATCATCATTGGTGACACCA TGCτ−3’ (配列番号・ 15)ブライv−JR5(配列番号:14)は 、PCRC物産にNde 1部位(上記の下線)を付加した。プライマーJR6 (配列番号:15)は、PCRC物産にEcoRI(上記の下線)を加えた。こ れらの部位はHMDをpET−3aM発現ベクターに連結することを可能にした [Rosenbcrg et al、(1987)Gene 56:125−1 35及び実施例3]。Nde I部位のATGヌクレオチドは発現ベクター中の 翻訳開始コドンであり、EcoR1部位は翻訳停止コドンの直後にある。
PCR産物をNde I及びEcoRIで消化し、Nde I及びEcoRIで 消化したpET−3aMに連結した。E、coliの形質転換の後、所望の組み 替えプラスミドを含むクローンを同定し、挿入DNAフラグメントのDNA配列 決定により証明した。HMD遺伝子のヌクレオチド及び誘導アミノ酸配列を配列 番号=4に示す。
実施例6 植物中におけるH8Zの発現のためのキメラ遺伝子の構築植物中におけるH3Z の発現のためのキメラ遺伝子の構築のために、3つの種子−特異的遺伝子発現カ セットを用いた。発現カセットは3つの高度に発現された種子貯蔵タンパク質遺 伝子:1)豆ファゼオルス ブルガリスからのファゼオリンのβサブユニット; 2)大豆からのβ−コングリシニンのα°サブユニット;及び3)とうもろこし からの10kDゼインからの調節領域を含んだ。
カセットを図2に略図的に示す。
ファゼオリンカセットは翻訳開始コドンから上流に(5゛)約500ヌクレオチ ド、及びファゼオリンの翻訳停止コドンから下流に(3°)約1650ヌクレオ チドを含む。5°及び3°領域の間にユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位Nc ol(これはATG翻訳開始コドンを含む)、Sma l5Kpn I及びXb a Iがある。カセット全体にHind I11部位が隣接している。これらの 調節領域のDNA配列は文献に記載されている[Doyle et al、(1 986)J。
Biol、Chem、261 : 9228−92381 、Bus tose t al [(1991)EMBOJ、10:1469−14791による最近 の研究は、このカセットのプロモーター領域がファゼオリンプロモーターの完全 な発現量に必要なすべてのDNA配列要素を含んではおらず、完全な発現量の2 0−30%が予想されることを示している。
β−コングリシニンカセットはβ−コングリシニンの翻訳開始コドンから上流に (5°)約610ヌクレオチド、及びファゼオリンの翻訳停止コドンから下流に (3′)約1650ヌクレオチドを含む。5゛及び3°領域の間にユニーク制限 エンドヌクレアーゼ部位NcoT(これはATG翻訳開始コドンを含む)、Sm a I、Kpn I及びXbaIがある。カセット全体にHind III部位 が隣接している。これらの調節領域のDNA配列は文献に記載されている[Do yle et al、(1986)J、Biol、Chem、261+9228 −92381゜ 10kDゼインカセツトは翻訳開始コドンから上流に(5′)約925ヌクレオ チド、及びファゼオリンの翻訳停止コドンから下流に(3°)約945ヌクレオ チドを含む。5°及び3°領域の間にユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位Nc oI(これはATG翻訳開始コドンを含む)及びSma Iがある。カセット全 体に5°末端でEcoRI部位が、3°末端でBamHl5Sal I及びHi nd III部位が隣接している。これらの調節領域のDNA配列は文献に記載 されている[Kirihara et al、(1988)Gene 71:3 59−370]。
全HSZコード領域を含むNcol−XbaIフラグメント(実施例2を参照) を、実施例1に記載の通りにDEAEセルロース膜を用いた電気泳動の後にアガ ロースゲルから単離した。シグナル配列を含まない遺伝子、すなわち成熟タンパ ク質コード配列を含むBspHr−Xba Iフラグメントを、実施例3に記載 の通りに単離した。これらのDNAフラグメントを、Ncol−XbaIで消化 したファゼオリン及びβ−コングリシニン発現カセット中に挿入した。かくして 4つのキメラ遺伝子が創造された: 1)ノアゼオリン5°領域/本来のH3Z/ファゼオリン3″領域2)ファゼオ リン5”領域/成熟H8Z/ファゼオリン3′領域3)β−コングリシニン5′ 領域/本来のH3Z/ファゼオリン3′領域 4)β−コングリシニン5′領域/成熟H3Z/フアゼオリン3″領域H3Zの 本来の単子葉シグナル配列をファゼオリンからの双子葉シグナル配列と置換する ための別のキメラ遺伝子を構築した。これを行うために、オリゴヌクレオチドC FC112(配列番号:16)及びCFC113(配列番号=17)を合成した 。アニールされたオリゴヌクレオチドは、Nco T適合末端及びNhe I/ Spe I適合末端を形成する(下記参照)。
Mat’sセArg入l&入r:9ValPrOL4uL4uLauLauGl y工1@LeuCFC112TTccrGGcxtcxcrtTcTacrAc crTTa 3・(配列番号・16)crcu3’AAaGAccaTAara AAAahca入rcイMccarc−sl(配列番号・17)PhaLe+u AλasarLauserAlaserPhe (配列番号・16)ファゼオリ ン5′及び3°調節領域が隣接するH3Z遺伝子を含むプラスミドpcc13を Nco I及びSpe Iで消化し、H8Zの本来のシグナル配列のほとんどを 除去した。アニールされたオリゴヌクレオチド、CFC113(配列番号:16 )及びCFC113(配列番号:17)を消化されたpcc13に連結した。か (して創造されたこのプラスミドをpcc18と指定し、ファゼオリンシグナル 配列と融合した成熟H3Zタンパク質を含むキメラ遺伝子の配列をDNA配列決 定により確認した(配列番号:18)。
Spe I部位(配列番号:2におけるヌクレオチド57−62)は、H3Zシ グナル配列/成熟タンパク質の正確な接合部にないので、この方法によりファゼ オリンシグナル配列と成熟H3Zタンパク質の間に2つの余分のアミノ酸を加え た。これらを除去するために、プライマーとして働くオリゴヌクレオチドCFC 114(配列番号=19、下記参照)及びCFC88(配列番号=13、実施例 2を参照)、ならびにDNA鋳型としてpcc18を用いたPCRによりH5Z フラグメントを生成した。
rrcTccrAcc TTTGCTACCCATATCCC入GGG(配列番 号 19)PCR産物をNhe I及びXba Iで消化し、ゲル電気泳動によ り精製した。プラスミドpcc18を同一の酵素で消化し、余分の2個のアミノ 酸を含む融合タンパク質をコードするDNAフラグメントを除去し、その後PC R−生成りNAフラグメントを挿入した。得られたプラスミドをpCC24と指 定し、その構造をDNA配列決定により確認した(配列番号:20)。
β−コングリシニン5′領域を含むキメラ遺伝子においてH8Zの本来のシグナ ル配列をファゼオリンシグナル配列と置換するために、プライマーとしてCFC l23 (配列番号=21、下記参照)及びcFc88(配列番号:13、実施 例2を参照)、ならびに鋳型としてpCC24を用いてPCR−生成フラグメン トを合成した。
FCl23 ACTAATCATG ATGAGAGCAA GGGTTCCACT (配列 番号=21)PCR−生成りNAフラグメントをBspHI及びXba Iで消 化し、ゲル電気泳動により精製した。このDNAフラグメントをNe。
I−XbaIで消化したβ−コングリシニン発現カセット中に挿入し、挿入フラ グメントの構造をDNA配列決定により確認した(配列番号・20)。このプラ スミドをpcc30と指定した。
オリゴヌクレオチドCFC104(配列番号: 10) 及びFCl105(配 列番号+11)(実施例3を参照)を、カルボキシ末端のXba1部位にて10 kDゼインカセツト中に挿入し、ユニークSma 1部位を加えた。H3Zコー ド領域を含むNcol−SmaIフラグメントをプラスミドpcc10 (実施 例2を参照)がら単離し、Nc。
1−3ma I消化10kDゼインカセット中に挿入した。
実施例7 フアゼオリンーH8Zキメラ遺伝子を用いたタバコの形質転換ファゼオリンーH 3Zキメラ遺伝子カセット、ノアゼオリン5゛領域/本来のkH8Z/フ7ゼオ リン3′領域、及びファゼオリン5′領域/成熟HSZ/ファゼオリン3′領域 (実施例6)を、約2.3kbのHind IIIフラグメントとして単離した 。アグロバクテリウムツメファシェンスのバイナリ−Tjプラスミドベクター系 EB e v a n。
(1984)Nucl、Ac1ds、Res、12:8711−8720〕の一 部であるベクターpZ897K (図3)のユニークBamH1部位に挿入する ために、これらのフラグメントにHind III−BamHIアダプターオリ ゴヌクレオチドを加えた。ベクターは=(1)形質転換された植物細胞に関する 選択可能なマーカーとしてのキメラ遺伝子ツバリンシンターゼ/ネオマイシンホ スホトランスフェラーゼ(nos:NPT II) [Bevan et al 、 (1983)Nature 304:184−186コ、(2)Tiプラス ミドのT−DNAの左及び右端EBevan (1984)Nuc 1.Ac  ids。
Res、12:8711−87201、(3)EcoRL KpnI、BamH I及びSal Iに関するユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位を有するE、c oli 1acZ α−相補セグメント[Vieria and Messin g(1982)Gene 19:259−2671、(4)シュードモナスプラ スミドpvs1からのバクテリア複製起点[Itoh et al、(1984 )Plasmidll : 206−2201 、及び(5)形質転換されたA 、ツメファシェンスのための選択可能なマーカーとしてのTn5からのバクテリ アネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子[Berg et al。
(1975)Proc、Natl、Acad Sci、U、S、A、72 :  3628−36321を含む。
ファゼオリンーH8Zキメラ遺伝子カセット、ノアゼオリン5′領域/ファゼオ リンシグナル配列/成熟H3Z/ファゼオリン3゛領域(実施例6)を、約2. 3kbのHind IIIフラグメントとして単離した。このフラグメントをバ イナリ−ベクターpZS97 (図4)のユニークHind III部位に挿入 した。このベクターは、2つの追加のユニーククローニング部位Sma I及び Hind IIIが存在し、形質転換されたA、ツメファシェンスのための選択 可能なマーカーとしてバクテリアネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子 の代わりにバクテリアβ−ラクタマーゼ遺伝子(アンピシリン耐性を起こす)が 存在する以外は、上記のpZS97にと類似している。
キメラHSZ遺伝子を含むバイナリ−ベクターを三親交配[Ruvkin et  al、 (1981)Naure 289:85−881によりアグロバクテ リウム株LBA4404/pAL4404 [Hockema et al、( 1983)Nature 303+179−180〕に伝達した。アグロバクテ リウム形質転換産物をタバコの葉のディスクに接種した[Horsch et  al、(1985)Science 227 :1229−12311゜形質転 換植物をカナマイシンを含む選択培地中で再生した。
ゲノムDNAを若い葉から抽出してPCRを用いて分析し、形質転換されたタバ コ中のキメラH8Z遺伝子の存在を検出した。PCR反応のプライマーとしてオ リゴヌクレオチドCFC93(配列番号=22、下記参照)、及びFCl77  (配列番号=7、実施例1を参照)を用いた。
rC93 G品TGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGT詰 (配列番号 、22)これらのプライマーはH8Z遺伝子の内部の425bp DNAフラグ メントを生成すると思われる。調べた2oの形質転換産物中の16がこの分析に おいて陽性であった(表1及び2を参照)。
キメラ遺伝子の発現の分析のために、形質転換された植物を開花させ、自家受粉 させ、結実させた。成熟種子から以下の通りにして全タンパク質を抽出した。約 200mgの種子を1゜5mLの使い捨てプラスチック微量遠心管(micro fuge tube)に入れ、0.25mLの50mMトリス−CI DH6, 8,2mM EDTA、1% SDS、1% β−メルカプトエタノール中で粉 砕した。粉砕は、微量遠心管に合うように設計された使い捨てプラスチック軸を 持つ電動式粉砕機を用いて行った。得られた懸濁液を、微量遠心管中、室温で5 分間遠心し、粒子を除去した。上澄み液の合計タンパク質含有量を、ウシ血清ア ルブミンを標準として用いたBioRadタンパク質分析を用いて分析した。
バクテリア生産成熟H3Zを正の標準とし、非形質転換タバコ種子から抽出した タンパク質を負の標準として、SDSポリアクリルアミドゲル上で1列当たり各 抽出物に関して10μgのタンパク質を移動させた。
その後タンパク質を電気泳動によりニトロセルロース膜上にプロットした。膜を 、B i oRadからそのImmun−B l o tキットと共に与えられ た標準的案を用い、ウサギ血清の1 : 700希釈にてHSZ抗体(実施例4 を参照)に暴露した。濯いで非結合−次抗体を除去した後、膜を二次抗体、ホー スラディツシュパーオキシダーゼと複合化したロバ抗−ウサギIg (Amer sham)に1 : 3000希釈にて暴露した。
濯いで非結合二次抗体を除去した後、膜をAmersham化学発光試薬及びX −線フィルムに暴露した。
PCR分析に基づいてH3Z遺伝子を含む形質転換産物のほとんどは、免疫学的 スクリーニングに基づいてH8Zタンパク質も生産した(表1−3)。いずれの 場合も生産されたタンパク質のサイズはE、coli中で生産された成熟H8Z と大体等しく、本来のシグナル配列及びファゼオリンシグナル配列の両方が除去 されたことを示し、従ってタンパク質が小胞体に入ったことを示唆した。
H3Z以外にほとんどのタンパク質が溶解しない溶媒である70%イソプロパツ ール/1% β−メルカプトエタノールを用いても種子を抽出した。その後上記 の通りにタンパク質につき5DS−PAGE、ウェスターンブロッティング及び 免疫学的精査を行つた。これらの条件下で成熟H8Zのサイズのタンパク質が再 度観察され、検出されたタンパク質のHSZとしての同定を確証した。
形質転換された系におけるHSZの発現の程度をH3Z抗体の感度及び5DS− PAGEゲルに負荷されたタンパク質の量に基づいて評価した。HSZは合計種 子タンパク質の約0.05−0.5%の範囲であった。
種子のアミノ酸組成を測定するために、6個の種子を6N塩酸、0゜4% β− メルカプトエタノール中の窒素下にて、110−120℃で24時間加水分解し :試料の1/10を、カラム後ニンヒドリン検出を用いたBeckman Mo del 6300アミノ酸分析機にかけた。
種子中のメチオニンの相対的量をメチオニン:ロイシン比として、従ってロイシ ンを内部標準として用いて比較した。メチオニン:ロイシン比には約6にの標準 偏差があった。ウェスターンプロット分析により決定したHSZの最大の発現に おいて、HSZは種子中のメチオニンの量を約10%増加させることが予想され る。これは標準偏差に非常に近かったので、合計種子メチオニンへのHSZの発 現の効果は観察されなかった(表1−3)。
表1 pcc15形質転換産物 ノアゼオリン成熟/成熟H8Z/ファゼオリン3′系 PCRウェスターン M et:Leu15−34A++ 15−40A + + 0.1g 15−50A + +++ 0.19 15−55A 十 +十 表2 pcc16形質転換産物 フッゼオリン5′フ本来のH3Z/ファゼオリン3′系 PCRウェスターン  Met:Leu16−7A 十 +++ 0.20 16−11B −0,19 16−33B + −4− 表3 pCC36形質転換産物 ノアゼオリン5′/フアゼオリンシグナ成熟列/成熟H3Z/ファゼオリン3′ 系 PCRウェスターン Met:Leu36−20A +++ Q、20 36−55D 一 実施例8 E、coliにおけるHMDタンパク質の発現プラスミドpX8M−18で形質 転換したE、coli株BL21(DE3)pLYsE[5tudier et  al、(1990)Methods in Enzymology 185: 60−891の培養物を、アンピシリン(100mg/L)を含む10LのLB 培地中で37℃にて成育した。600nmにおける光学密度が約1にて、IPT G(イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、誘導物質)を最終濃度1mMまで加 え、インキュベーションを37℃にて8時間続けた。細胞を遠心によって集め、 50mMのNaC1,50mMのトリス−CI(pH7,5)、1mMのEDT A (緩衝液A)で洗浄し、−80℃t’凍結した。
凍結した細胞を5mL緩衝液A/グラム細胞中にて氷上で解凍した。
デオキシリボヌクレアーゼ I (S i gma)をO,1mg/mLの濃度 まで加えた。室温で60分間インキュベートした後、懸濁液を氷上で音波処理し 、粘度を下げた。混合物を遠心し、上澄み液を捨てた。ベレットを25mLの7 0%イソプロパツール、10mM β−メルカプトエタノールを用いて2回抽出 した。HMDはHSZと同様にこの溶媒に溶解性である。SDSポリアクリルア ミドゲル電気泳動及びクーマシーブリリアントブルー染色により、HMDタンパ ク質が抽出物の主要タンパク質であることが明らかになった。ウェスターンプロ ット分析は、HMDタンパク質がHSZに対して誘起されたウサギ抗体と交叉反 応することを示した。
実施例9 β−コングリシニン−H3Zキメラ遺伝子を用いたタバコの形質転換β−コング リシニンキメラ遺伝子カセットであるβ−コングリシニン5゛領域/木来のH5 Z/ファゼオリ〉3°領域、β−コンクリシニン5°領域/成熟HSZ/ファゼ オリン3′領域、及びβ−コングリシニン5′領域/ファゼオリンシグナル配列 /成熟HSZ/ファゼオリン3′領域(実施例6)を約2.4kbHind I IIフラグメントとして単離した。このフラグメントをバイナリ−ベクターpZ S97 (図4)のユニークHind III部位に挿入した。このベクターは 、2つの追加のユニーククローニング部位Sma I及びHind IIIが存 在し、形質転換されたA、ツメファシェンスのための選択可能なマーカーとして バクテリアネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の代わりにバクテリア β−ラクタマーゼ遺伝子(アンピシリン耐性を起こす)が存在する以外は、実施 例7に記載のpZS97にと類似している。
キメラH3Z遺伝子を含むバイナリ−ベクターを三親交配[Ru v kin  et al、 (1981)Naure 289:85−88コ によりアグロ バクテリウム株LBA4404/pAL4404 [Hockema et a l、(1983)Nature 303:179−180〕に伝達した。アグロ バタテリウム形質転換産物をタバコの葉のディスクに接種した[Horsch  et al、(1985)Science 227:1229−12311.形 質転換植物をカナマイシンを含む選択培地中で再生した。
キメラ遺伝子の発現の分析のために、形質転換された植物を開花させ、自家受粉 させ、結実させた。成熟種子から以下の通りにして全タンパク質を抽出した。約 200mgの種子をl、5mLの使い捨てプラスチ・ツク微量遠心管(micr ofuge tube)に入れ、0.25mLの50mMトリス−CIpH6, 8,2mM EDTA、1% SDS、1% β−メルカプトエタノール中で粉 砕した。粉砕は、微量遠心管に合うように設計された使い捨てプラスチック軸を 持つ電動式粉砕機を用いて行った。得られた懸濁液を、微量遠心管中、室温で5 分間遠心し、粒子を除去した。上澄み液の合計タンパク質含有量を、ウシ血清ア ルブミンを標準として用いたBioRadタンパク質分析を用いて分析した。
バクテリア生産成熟H8Zを正の標準とし、非形質転換タバコ種子から抽出した タンパク質を負の標準として、SDSポリアクリルアミドゲル上で1列当たり各 抽出物に関して10μgのタンパク質を移動させた。
その後タンパク質を電気泳動によりニトロセルロース膜上にプロットした。膜を 、BioRadからそのImmun−B1 otキットと共に与えられた標準的 案を用い、ウサギ血清の1 : 700希釈にてHSZ抗体(実施例4を参照) に暴露した。濯いで非結合−次抗体を除去した後、膜を二次抗体、ホースラディ ツシュパーオキシダーゼと複合化したロバ抗−ウサギIg (Amersham )に1 : 3000希釈にて暴露した。
濯いで非結合二次抗体を除去した後、膜をAmersham化学発光試薬及びX −線フィルムに暴露した。
キメラ遺伝子β−コングリシニン5′領域/成熟H8Z/フアゼオリン3′領域 を含む1つの形質転換産物、及びキメラ遺伝子β−コングリシニン5°領域/本 来のHSZ/ファゼオリン3′領域を含む2つの形質転換産物のそれぞれがH3 Zタンパク質を生産した。キメラ遺伝子β−コングリシニン5′領域/フアゼオ リンシグナル配列−成熟H3Z/ファゼオリン3゛領域を含む7つの形質転換産 物中の4つがHSZタンパク質を生産した(表4)。いずれの場合も生産された タンパク質のサイズはE、C01l中で生産された成熟HSZと大体等しく、本 来のシグナル配列及びフッゼオリンシグナル配列の両方が除去されたことを示し 、従ってタンパク質が小胞体に入ったことを示唆した。
種子のアミノ酸組成を測定するために、6個の種子を6N塩酸、0゜4% β− メルカプトエタノール中の窒素下にて、110−120℃で24時間加水分解し :試料の1/10を、カラム後ニンヒドリン検出を用いたBeckman Mo de l 6300アミノ酸分析機にかけた。
種子中のメチオニンの相対的量をメチオニン:ロイシン比として、従ってロイシ ンを内部標準として用いて比較した。メチオニン:ロイシン比には約5%の標準 偏差があった。ウェスターンプロット分析に基づくH8Zの発現が最大である系 が、観察された中で最大の合計種子メチオニンを有した(表4)が、これは平均 より7%高いだけであった。これは確かであるとするには測定誤差に近すぎるが 、この高メチオニン量はH8Zの発現によると思われる。
表4 pCC39形質転換産物 β−コングリシニン5゛/フアゼオリンシグナル配列−成熟H3Z/フ7ゼオリ ン3′ 系 ウェスターン Met:Leu 39−IC+ 0.20 39−9C0,20 39−13A −0,21 39−14C+ 0.20 39−15C−0,20 39−28A ++ 0.21 39−36A + 0.20 実施例10 植物中におけるHMDの発現のためのキメラ遺伝子の構築実施例6と同様に、種 子−特異的遺伝子発現カセットを植物中におけるHMDの発現のためのキメラ遺 伝子の構築に用いた。発現カセットは豆ファゼオルス ブリガリスからのファゼ オリンのβ−サブユニットからの調節領域を含んだ。創造されたキメラ遺伝子は ファゼオリンからの双子葉シグナル配列も含んだ:ノアゼオリン5″領域/ファ ゼオリンシグナル配列/HMD/ファゼオリン3′領域。
PCRプライマー、CLMI (配列番号=23)及びCLM2 (配列番号: 24)(下記参照)を合成し、鋳型としてのプラスミドpJRHMDIと共に、 フッゼオリンシグナル配列の3′末端に融合し、NheI及びXbaI部位が隣 接したHMD配列を含むDNAフラグメントの生成に用いた。実施例6で議論し たプラスミドpCC24を、フッゼオリンシグナル配列内で切断するNhel及 びXbaIで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製した。精製ベクターを CLMI (配列番号、23) 、CLM2 (配列番号:24)及びpJRH MDlから形成したPCR産物に連結し、かくしてHMDに結合する完全なフッ ゼオリンシグナル配列を再生した。連結産物をpJRHMD2と指定し、キメラ 遺伝子(配列番号:25)の配列をDNA配列決定により確認した。
5電 τGCTTGCTAGC丁丁TGCTATGCC入ATGATGATGC CGGGτ 3′ (配列番号: 23)AlaSerPheAlaM@tPr oMetMs+tMetProGlys i TGC?τfCTAGACTxt GGCATCATcAttcatGACACC3′ (配列番号: 24)実施 例11 ファゼオリンーH8Zキメラ遺伝子を用いた大豆の形質転換体細胞胚の誘導のた めに、大豆培養物XP3015の表面滅菌未成熟種子から切開した4−5mmの 長さの子葉を暗所の寒天培地(SBI又は5B2)上、25℃にて8−10週間 培養した。二次胚を製造した体細胞胚を切り出し、液体培地(SB55)中に入 れた。早期球状段階胚として増加した体細胞胚の培養物の選択を繰り返した後、 懸濁液を下記の通りに保持した。
大豆胚形成懸濁培養液を、150rpmの回転震盪機上の35mLの液体培地( SB55)中で、16:8時間昼/夜スケジュールで蛍光及゛び白熱光の混合光 を用い、28℃にて保持した。約35mgの組織を35mLの液体培地中に接種 することにより4週間毎に培養物を継代培養した。
大豆胚形成懸濁培養液を、粒子銃衝撃(particle gunbombar dment)(Kl ine et al、(1987)Nature (Lo ndon)327 : 70.米国特許第4. 945.050号明細書)の方 法により形質転換した。これらの形質転換に、DuPont Biolisti c’ PDS100O/HE装置(ヘリウム レトロフィツト(retrofi t))を用いた。
形質転換に用いられたプラスミドベクターは、pGEM9Z (Pr。
mega Biological Re5earch ProductS)の誘 導体であった。選択可能なマーカーとして、カリフラワーモザイクウィルスから の358プロモーター[0dell et al。
(1985)Nature 313:810−8121、プラスミドpJR22 5(E、col iから)からのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ[ Gritz et al、(1983)Gene 25:179−1881及び アグロバクテリウムツメファシェンスのTiプラスミドのT−DNAからのツバ リンシンターゼ遺伝子の3°領域(配列番号:26)を含むキメラ遺伝子がベク ターのSal 1部位にある。
ファゼオリンーH8Zキメラ遺伝子カセット、ノアゼオリン5゛領域/ファゼオ リンシグナル配列/成熟H8Z/フ7ゼオリン3′領域成熟施例6)を約2.3 kbのHind IIIフラグメントとして単離した。
このフラグメントをベクターのユニークHind III部位に挿入した。
1μmの金粒子の60mg/mLの懸濁液50μLに(順に)、5μLのDNA (1Mg/μL)、2oμLのスペルミジン(0,1M)、及び50μLのCa 01! (2,5M)を加えた。粒子の調剤を3分間撹拌し、微量遠心機にて1 0秒間回転させ、上澄み液を除去した。その後DNA−被覆粒子を400μLの 70%エタノールで1回洗浄し、40μLの無水エタノールに再懸濁した。DN A/粒子懸濁液を1秒間づつ3回音波処理した。その後5μLのDNA−被覆金 粒子を各マクロキャリヤーディスク(macro carrier disk) 上に負荷した。
約300−400mgの4週令の懸濁培養液を60x15mmの空のベトリ皿に 入れ、残留液を組織からピペットで除去した。各形質転換実験のために通常5− 10プレートの組織を衝撃した。膜の破裂圧を1゜00psiに設定し、室を2 8インチ水銀の真空度に排気した。組織は保持スクリーンから約3.5インチ離 して置き、3回衝撃した。衝撃に続いて組織を液体に戻し、上記の通りに培養し た。
衝撃の7日後、液体培地を、50mg/mLのハイグロマイシンを含む新しい5 B55と交換した。選択培地は週毎に新しくした。衝撃の7週間後、緑色の形質 転換組織が、非形質転換の壊死胚形成培養物から成長しているのが観察された。
単離した緑色の組織を取り出し、別個のフラスコに接種し、クローン的に増殖し た新しい形質転換胚形成懸濁培養物を形成した。従って新しい各県を独立した形 質転換産物として処理した。これらの懸濁液をその後継代培養し、未成熱狂のク ラスターとして保持するか、又は各体細胞胚の成熟及び発芽により植物全体に再 生することができる。
形質転換された胚形成りラスターを液体培地から取り出し、ホルモン又は抗生物 質を含まない固体寒天培地(S B 103)上に置いた。胚を、16:8昼/ 夜スケジユールで蛍光及び白熱光の混合光を用い、26°Cにて8週間培養した 。この期間に各胚を培養物から取り出し、下記の通りにしてHSZタンパク質の 生産に関して分析した。8週間後、胚は発芽に適する。
各胚を液体窒素中で凍結し、液体窒素で予備冷却した乳鉢と乳棒を用いて微粉末 に粉砕した。粉末をエッペンドルフ遠心管中にかき集め、室温にてヘキサンを用 いて2回抽出した。残留物を60’Cで30分間インキユベートシ、残留ヘキサ ンを蒸発させた。その後100μLの50mMトリス−HCl pH6,7,2 mM EDTA、1% SDS、1% β−メルカプトエタノール(TESβ) をペレットに加え、微量遠心管に合うよう1−設計された使い捨てプラスチック 軸を持つ電動式粉砕機を用いて約10秒間低速でそれを粉砕した。得られた懸濁 液を微量遠心管中、室温で5分間遠心し、上澄み液を取り出し、保存した。ペレ ットを上記のように粉砕することにより、5oμLの70%インプロパツール、 10mM β−メルカプトエタノール中に再懸濁した。管を60℃で5分間イン キュベートし、上記のように遠心した。上澄み液を保存し、ペレットを50μL の70%イソプロパツール、10mM β−メルカプトエタノールで再度抽出し た。アルコール抽出物を集め、凍結乾燥し、その後残留物を50μLのTESβ 中に再懸濁した。この試料及び最初のTESβ抽出物を、実施例9に記載の要領 でウェスターンプロットによりH3Zタンパク質の存在に関して分析した。調べ た3つの形質転換系の中の2つがH3Zタンパク質の発現を示した。
撞世: 5B55原液(リットル当たりダラム):MS硫酸塩100Xストック MSハ ライド100Xストック□ MgSO47H2037,O,CaCl22Hz0 44.O。
Mn5O4H201,69,KI 0.083゜ZnSO47H200,86, C0CJ16H200,00125゜CuSO45H20o、0025 M5 P、B、Mo100Xストツク MS FeEDTA100xストックK HzPO417,0NazEDTA 3.724゜HxBO30,62FeSO 47HzO2,784゜NaxMoQ42HtO0,025 B5ビタミンストツク 5B55 (1リツトル当たり)10g m−イノシト ール、 10mL 各MSストック。
100mg ニコチン酸、 1mL B5ビタミンストック100mg ピリド キシン HC1,0,8g NH<NOx1g チアミン 3.033g KN OxlmL 2.4−D (10mg/mLストック) 60g スクロース 0.667g アスパラギン MS* MS塩 6% マルトース B5ビタミン 750mg MgCh 0.175M グルコース0.2% Ge1rite  20mg 2.4−DpH5,70,8% 寒天 40mg/L 2,4−D以外はSBIと同様。
実施例12 彫譚肋町之出」1畷王胆虚点徴擾遅巴星よ孝遺伝子型A188とB73の交雑か ら誘導された穀粒力)ら受粉後1〇−12日に切り分けた未成熟胚(約1. 5 −2. 0mm)力Aらカルス培養を開始した。胚を、軸−側を下に向け、アガ ロース−固化N6培地と接触させて置いた。胚は27℃の暗所に保った。もろI I)胚形成カルス1ま、これらの未成熟胚の胚盤から増殖した胚柄上に支えられ た体細胞前胚様体及び胚様体を有する細胞の未分化塊を含む。−次外植片から単 離された胚形成カルスをN6培地上で培養し、2−3週間毎にこの培地上で継代 培養した。
カルス培養細胞への遺伝子の伝達に、粒子衝撃法を用いた。これらの実験にBi olistic’PDS−1000/He (BioRadLaborator ies、Hercules、CA)を用いた。
形質転換において、選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドベクターを用い た。プラスミドpALSLUC[Fromm e t a 1゜(1990)B iotechnology 8:833−8391はとうもろこしくノイズ)  アセトラクテートシンターゼ(ALS)遺伝子のcDNAを含む。ALS cD NAは、遺伝子によりコードされる酵素がクロルスルフロンに対して耐性となる ように試験管内で突然変異させである。変化はcDNAの位置1626のトリプ トファンコドンのロイシンコドンへの突然変異を含む。ALS遺伝子はカリフラ ワーモザイクウィルスからの358プロモーター[0dell et al、( 1985)Nature 313:810−8121、及びアグロバクテリウム  ツメファシェンスのTiプラスミドのT−DNAからのツバリンシンターゼ遺 伝子の3U領域の制御下にある。このプラスミドは、カリフラワーモザイクウィ ルスからの353プロモーター及びツバリンシンターゼ遺伝子の3U領域を用い てホタルルシフェラーゼコード領域を発現する遺伝子も含む[de Wet e t al、(1987)M。
lec、Ce1l Biol、7:725−7371゜キメラH3Z遺伝子を第 2のプラスミドに与えた。このプラスミド(pcc21、実施例6を参照)はプ ロモーター領域及びとうもろこしからの10kD貯蔵タンパク質遺伝子をコード する遺伝子からの3U末端の制御下にあるH8Zコード領域を含む[Kirih ara et al、(1988)Gene 71 : 359−3701゜こ れらのプラスミド(pALSLUC及びpcc21)を金粒子の表面上に共沈さ せた。これを行うために、5μgのpALSLUC及び2μgのpcc21 ( それぞれトリス−EDTA緩衝液中で約1μg/μLの濃度)を〈水中に懸濁さ せた(mL当たり60mgの金)50μLの金粒子(平均直径15m)に加えた 。その後塩化カルシウム(2,5M溶液を50μL)及びスペルミジン(1,0 M溶液を20μL)を、管を渦動させながら金−DNA懸濁液に加えた。その後 粒子を微量遠心機にて10秒間遠心し、上澄み液を除去した。その後粒子を20 0μLの無水エタノール中に再懸濁した。粒子を再度遠心し、上澄み液を除去し た。その後粒子を30μLのエタノール4こ再懸濁した。その後5μLのDNA −被覆金粒子を各マクロキャリヤーディスクに負荷した。
胚形成カルスの小クラスター(直径2−3mm)を、直径が12cmのベトリ皿 に含まれるアガロース−固化N6培地の表面に配置した。組織は直径が約6cm の円形の領域を覆った。組織を含むベトリ皿をPDS−1000/Heの室に置 いた。その後室内の空気を28インチHgの真空度まで排気した。衝撃管のHe 圧が1000ps iに達すると破裂する破裂膜を用い、ヘリウム衝撃波により マクロキャリヤーを加速した。組織は停止スクリーン(stopping 5c reen)がら約8cmの位置に置いた。組繊のプレートをDNA−被覆金粒子 で衝撃した。
衝撃から7日後、組織をクロルスルフロン(50nM)を含みカゼイン又はプロ リンを含まないN6培地に移した。この培地上で組織はゆっ(り成長を続けた。
さらに2週間後、組織をクロルスルフロンを含む新しいN6培地に移した。8週 間後、クロルスルフロン−補充培地を含むプレートの1つで直径が約1cmの活 発に成長するカルスの領域が同定された。このカルスは選択培地上で継代培養す ると成長を続けた。このカルスの一部を植物を再生させる培地に移した。
このカルスのルシフェラーゼ活性を測定した。非形質転換カルス組織のルシフェ ラーゼ活性は、新しい組織1mg当たり約500光単位(1ight unit )である。クロルスルフロン上で成長したカルスのルシフェラーゼ活性は新しい 組織1mg当たり約20,000光単位であった。この結果はpALsLUcか らの遺伝子がこのカルス系で発現されたことを示す。導入ALS遺伝子及び導入 キメラ貯蔵タンパク質遺伝子の両方の存在に関してサザン分析を行った。両方の 導入遺伝子がサザン分析により観察された。
H8Z遺伝子の分析のために、形質転換されたカルス系(Tx−X8A)又は同 遺伝子型から誘導されたが形質転換されていないカルス(ABO3)からのゲノ ムDNAをXba I又はEcoRIで消化した。
消化されたDNAをアガロースを通したゲル電気泳動により分別し、標準的方法 を用いてナイロン膜に移した。ナイロンプロットを、H3Zコード領域の一部か ら調製したプローブにハイブリッド形成させた。AB91カルスは本来のH3Z 遺伝子に対応する1つの主要バンドを示した。
Tx−X8Aカルスでは、より高分子量の別のバンドが見いだされた。
このバンドは導入されたキメラHSZ遺伝子に対応する。
成分 リットル当たりの量 成分 リットル当たりの量溶液I 10. OmL  溶液■ CaC1t (LM) 1.25mL (NH4)!SO423,Og溶液II I 10.OmL KNOs 141.5gMg5Oa (IM) 0.75m L KHzPo、 20.0g゛溶液V 1.OmL HzO500,0mLビ タミンストック 1.0mL カゼイン加水分解産物 0.1g ビタミンストックスクロース 60.0g  ナイアシン 0.13gミオ−イノシトール 0.1g チアミン 0.025 g2、4−D 0.5mL ピリドキシン 0.025g(2mg/mLストッ ク) パントテン酸カルシウム 0.025gpH5,8に HzO100,O mL 平板培養の場合6gのアガロースを添加溶液III 溶液V NatEDTA 1.85g HsBOs 0.16gFeSO4−7HzO1 ,35g Mn5O4−H2O0,33gHzO500,OmL ZnSO4’  7HtOO,15gKI 0.08g NazMoO4・2HtO0,025gCuSO4・5HtO0,0025g CoC1,・2H!O0,0025g HzO100,OmL 配列表 配列番号:1 配列の長さ: 2123 配列の型:核酸 、鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源: 生物名:ゼア メイズ L (Zea mays L)株名:未知 細胞の種類:未知 直接の起源ニ ライブラリ−名:C1ontechからのメイズ ゲノム ライブラリー クローン名:X8 ゲノム内での位置二未知 出版物情報:非公開配列 配列 GTTTTC^CAT TAG^TTTTC丁 丁τGTGTTATA TAC ACTGGAT ACATAC入入A丁 400?CAGT?GCAG TAG TCTCTTA ATCCACATCA GCTAGGCATA CT’TTA GCAA^ 450CCA ATG ATG ATG CCG AGCATG  GTG TCA CCA 入丁G ATG ATG CCA AAC124/7 ATTGTCAG’!’CATCAGGTACG CACCACCATA CA CGCTTGCT TAAACλλλAA 2050AACAAGTGTA T GTGTTTGCG AAGAGAATTA AGACAGGCAG ACAC AAAGCT 2100人CCCG^CGAT GGCGAGTCGG TCA  2123配列番号:2 配列の長さ:639 配列の型:核酸 鎖の数=1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内突然変異Genomic DNA出版物情報:非公開配列 配列 配列番号:3 配列の長さ:579 配列の型:核酸 、鎖の数=1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内突然変異Genomic DNA出版物情報:非公開配列 配列 配列番号=4 配列の長さ:281 配列の型:核酸 鎖の数=1本鎖 トポロジー:直鎮状 配列の種類:試験管内突然変異Genomic DNA゛出版物情報:非公開配 列 配列 配列番号:5 配列の長さ=453 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類: cDNA 出版物情報: 著者:Kirihara、J、A。
Hunsperger、J、P。
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標題:Differential expression of agene  for a methionine−rich storage protei n in maize雑誌:MOl、Gen、Genet。
巻=211 ページ: 477−484 日付:1988年 配列番号:5中の関連残基:22−474配列 丁^G 453 配列番号二6 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種gI=試験管内合成りNA 出版物情報:非公開配列 配列 ATGGCλGCC^ ^GA〒GC丁TGC^TτG丁TCGC丁 30配列 番号ニア 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数二1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 出版物情報:非公開配列 配列 GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA 30配 列番号二8 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 出版物情報:非公開配列 配列 TTCTATCTAG AATGCAGCACCAACA入AGGG 30配列 番号=14 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数・1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 出版物情報:非公開配列 配列 配列番号=15 配列の長さ:40 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 出版物情報:非公開配列 配列 TCTT入G入ATT CTATGGC^TC^TC入丁τGIIJTG )I cλCC入TGCT 40配列番号=16 配列の長さニア1 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 配列の特徴: 特徴を表す記号:CDS 存在位置:2..70 配列 配列番号=17 配列の長さ=71 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 配列 CTAGCWGCTAGCAGAAAG TGATGCCAGG AAMGAA TTCCCAGCAAC八G GAGへGG入Ace 60CTTGCTCTC ^丁 71 配列番号:18 配列の長さ=653 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類: (Genomic) DNA直接の起源 クローン名: pc018 配列の特徴: 特徴を表す記号:CDS 存在位置:2..652 配列 コ 配列番号:19 配列の長さ:31 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 配列 丁τCTGCTAGC丁子τGCTACCCATATCCCAGG G 31配 列番号=20 配列の長さ二647 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種El: (Genomic) DNA配列の特徴: 特徴を表す記号:CDS 存在位置=21.646 配列 配列番号:21 配列の長さ;30 配列の型:核酸 鎖の数=1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 配列 A(:TAA?CATG kT(aAGkGc)Jh GGGTTCCACT  30配列番号:22 配列の長さ=30 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 配列 GAATGCAGCA CCMC入^^GG GTTGCTGτ入A 30配列 番号:23 配列の長さ=38 配列の型:核酸 鎖の数=1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: CDS 存在位置:6..38 配列 配列番号=24 配列の長さ:36 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:試験管内合成りNA 配列 TGCTTTCTAG ACTATGGCAT CA?CATTGGT GAC ACC36配列番号:25 配列の長さ:352 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー二直鎖状 配列の種類: (Genomic) DNA配列の特徴: 特徴を表す記号、CDS 存在位置:2..346 配列 ATG ATG CCA τAGTCTAGA 352配列番号:26 配列の長さ:3237 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類+ (Genomic) DNA配列の特徴: 特徴を表す記号:CDS 存在位置:1419..2444 配列 AAGAT丁CAGG ACTAAT丁GCA TCAAGAACACAGAG AAAGACATATTTCTCA AGATCAGAAG@720 ?ACTA’*CA GTATGGkCGA TTCAkGGCTT GCTT CATMA CCAAGGCAAG TAATAGAQAT@780 TAGTGAGGTA UCTAATAGTG AGATCCAACA CTT ACGTTTG CAACGTCCkA GAGCAAAT`G 2501 ACCACGACGCC0GAAGGrTG CCGCAGCGtG tGax rrccat CTCAATrCrC丁cT丁GcxGG^@2561 AT^丁AATTTCTGTTG入A丁TACGTTAAGCATGrAA?入 Aτ↑^AC)TGT)JTGCATGAeGTTA304P AGGrACA7CG GTCGAC 配列番号:27 配列の長さ=4 配列の型二アミノ酸 トポロジー:直鎮状 配列の種類:ペプチド 配列 、配列番号:28 配列の長さ:4 配列の型二アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種W4:ペプチド 配列 補正書の写しく翻訳文)提出書 (特許法第184条の8)平成5年8月16日 口風

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.“HSZとうもろこし種子貯蔵タンパク質”をコードする配列番号:2に示 す配列に対応する、又は実質的に相同な少なくとも1つのヌクレオチド配列を含 む、単離及び精製核酸フラグメント。
  2. 2.“成熟HSZとうもろこし種子貯蔵タンパク質”をコードする配列番号:3 示す配列に対応する、又は実質的に相同な少なくとも1つのヌクレオチド配列を 含む、単離及び精製核酸フラグメント。
  3. 3.“HMDとうもろこし種子貯蔵タンパク質”をコードする配列番号:4に示 す配列に対応する、又は実質的に相同な少なくとも1つのヌクレオチド配列を含 む、単離及び精製核酸フラグメント。
  4. 4.双子葉植物からのシグナル配列に作用的に結合した、請求の範囲2に記載の 核酸フラグメント。
  5. 5.植物シグナル配列に作用的に結合した、請求の範囲3に記載の核酸フラグメ ント。
  6. 6.細胞内局在化配列及び適した調節配列に作用的に結合した請求の範囲1−5 のいずれか1つに記載の核酸フラグメントを含む、形質転換植物において含硫ア ミノ酸の量を変えることができるキメラ遺伝子。
  7. 7.調節配列が種子−特異的調節配列から成る群より選ばれる、請求の範囲6に 記載のキメラ遺伝子。
  8. 8.請求の範囲6に記載のキメラ遺伝子を用いて形質転換された植物。
  9. 9.植物がとうもろこし、大豆、カノラ(canola)、タバコ及び米から成 る群より選ばれる、請求の範囲8に記載の植物。
  10. 10.請求の範囲8に記載の植物から得た種子。
  11. 11.適した調節配列に作用的に結合した請求の範囲2又は3に記載の核酸フラ グメントを含む、形質転換された微生物において含硫アミノ酸の量を変えること ができるキメラ遺伝子。
  12. 12.請求の範囲11に記載のキメラ遺伝子を用いて形質転換された徴生物。
  13. 13.請求の範囲1、2又は3に記載の核酸フラグメントの、原核又は真核宿主 細胞における発現のポリペプチド産物。
  14. 14.請求の範囲13に記載のポリペプチド産物を含む植物。
  15. 15.請求の範囲13に記載のポリペプチド産物を含む種子。
  16. 16.(a)請求の範囲6に記載のキメラ遺伝子を用いて植物細胞を形質転換し ; (b)形質転換された該植物細胞から繁殖能力のある性的に成熟した植物を育成 し; (c)繁殖能力のある該植物から非形質転換植物細胞と比較した含硫酸アミノ酸 の量の増加に関して子孫種子を選択する段階を含む、植物の含硫アミノ酸含有量 を増加させる方法。
  17. 17.(a)請求の範囲11に記載のキメラ遺伝子を用いて徴生物を形質転換し ; (b)該微生物を、含硫アミノ酸の豊富なタンパク質の発現のための条件下で成 育し; (c)段階(b)のタンパク質を単離する段階を含む、徴生物中で含硫アミノ酸 の豊富なタンパク質を生産する方法。
  18. 18.請求の範囲1に記載の核酸フラグメントを含み、供託受け入れ番号ATC C 68490により同定される、基本的に純粋なプラスミドpCC10。
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