WO1994010319A1 - Verfahren zur erhöhung des proteingehaltes von pflanzen - Google Patents

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WO1994010319A1 PCT/EP1993/003085 EP9303085W WO9410319A1 WO 1994010319 A1 WO1994010319 A1 WO 1994010319A1 EP 9303085 W EP9303085 W EP 9303085W WO 9410319 A1 WO9410319 A1 WO 9410319A1
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Wolfgang Rohde
Elke Wefels
Francesco Salamini
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    • C12N2770/34022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to a method for increasing the protein content of plants by means of stable transformation with genes which code for proteins with the property of being deposited in the plant cell in quasi-crystalline structures, and to transgenic plants, transgenic plant parts and seeds of transgenic plants which are caused by the increased protein content achieved by the invention are characterized.
  • the highest protein content is 2.1%.
  • potyviruses represent the largest and most economically important group of plant viruses, which are both mono- and Infect dicotelydons.
  • the object of the invention was to provide a generally applicable, plant-species-independent method for increasing the protein content in transgenic plants by expressing a protein with certain physicochemical properties, namely the ability to deposit itself as a quasi-crystalline structure in plants. to provide.
  • the invention is based on the observation of the deposition of proteins in healthy plants and the knowledge that e.g. the deposition of the potyviral Cl protein in the cytoplasm presumably does not cause causal symptoms in the case of potyvirus infection, but is a side effect of the infection without pathological effects on the virus-infected host plant, and that it is possible for the gene for a protein with these physicochemical properties , namely the possibility of forming quasicrystalline structures, integrating them stably into a plant genome and bringing them to expression.
  • the construct is stably integrated into the plant genome by A ⁇ robacterium-mediated transformation.
  • the construct is integrated into the plant genome by particle gun bombardment.
  • the construct is stably integrated into the plant genome by naked DNA transfer.
  • the method according to the invention is of particular importance for increasing the protein content of tuber plants, the most important representatives of which are currently: batate, potatoes, yam, cassava, taro and tania.
  • Strains of Agrobacterium. into which the construct produced in stage a) can be introduced are, for example, A robacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes.
  • the method according to the invention is of particular importance for bulbous plants, it can also be used in the case of other plants, for example in the case of cereals, by depositing the protein in the storage organs (grains).
  • the protein content of potatoes can be increased by a factor of 1.9 to 4.2 without the taste of the potato being adversely affected.
  • the protein As a quasi-crystalline structure, the protein is present in a high concentration and can therefore make a decisive contribution to increasing the protein ("concentration effect").
  • the proteins consist of 44.4-45.7% of the essential amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, trypthophane and valine, which the human body cannot synthesize and which are therefore caused by the food must be fed.
  • arginine which is synthesized but mainly metabolized in urea and excreted in the urine
  • the essential amino acids make up over 50% of the total protein.
  • the lysine residues (between 5.5 and 6.2% of the total protein) are evenly distributed over the Cl sequence and therefore ensure good biodegradability of the protein by trypsin and trypsin-like enzymes.
  • bioavailability Possibilities for the degradation of the protein in the digestive tract by trypsin and trypsin-like enzymes ("bioavailability").
  • the method for increasing the protein content in the potato bulb shown below shows the expression of the CI gene of a tobacco potyvirus (TVMV) in the heterologous host potato and, at the same time, the possibility of "protein engineering" using N-terminals Extension of the CI protein with the 42kDa P3 protein so that the proportion of the most important amino acid leucine increases from 8.5% (Cl) to 10.1% (P3 + CI).
  • TVMV tobacco potyvirus
  • Inclusion protein used TVMV cDNA fragment, obtained by Dralll (D) / EcoRV (EV) restriction digest from the TVMV cDNA clone pTVBam7. E: EcoRI restriction sites. The numbers indicate the number of nucleotides in kb.
  • Fig. 2 The binary plant transformation vector pGDW32.
  • Pnos nopaline synthase gene promoter pad g4 poly adenylation signals of the T ⁇ DNA gene 4: oriV and ori_, replication and conjugation transfer. Origins of the plasmids ColEl and RK2; RB and LB right and left T-DNA border sequences; HPT hygromycin phosphotransferase gene; Amp r Ampicillin resistance arker. Restriction enzymes: C Clal; E EcoRI; P PstI; K Kpnl; S Sacl; Sa Sall; Sm Smal and XB Xbal.
  • this 3.3 kb cDNA from the clone pTVBam7 is defined in more detail by a nucleic acid sequence and a resulting amino acid sequence and contains three open ones Reading frame (ORF) which code for the P3 protein (42 kDa), a 6Kl protein (6kDa) and the cytoplasmic inclusion protein Cl (67 kDa).
  • ORF Reading frame
  • This 3.3 kb fragment was brought under the control of regulatory signals for transcription which (1) produce a strong constitutive expression in all plant tissues (CaMV 35S promoter and terminator), or (2) a tissue-specific expression predominantly in the tuber (promoter of the waxy gene from the potato, (cf. W. Rohde, D. Becker, B. Kuli, F. Salamini: "Structural and functional analysis of two waxy gene promoters from potato. J. Genet. & Breed. 44: 311-315, 1990.
  • regulatory signals for transcription which (1) produce a strong constitutive expression in all plant tissues (CaMV 35S promoter and terminator), or (2) a tissue-specific expression predominantly in the tuber (promoter of the waxy gene from the potato, (cf. W. Rohde, D. Becker, B. Kuli, F. Salamini: "Structural and functional analysis of two waxy gene promoters from potato. J. Genet. & Breed. 44: 311-315, 1990.
  • in vitro tubers for the wx / CI lines 1, 4, 8, 9, 10 were germinated in normal earth in the greenhouse and the matured tubers were subjected to a further analysis. In the phanotype these tubers were indistinguishable from those of the non-transgenic control plant, and the protein values showed a good agreement with the values obtained for in vitro tubers.
  • YEB medium 0.5% sucrose, 0.5% peptone, 0.5%
  • the base salt mixture (company Duchefa, Netherlands) described by Murashige and Skoog (1962) was used for the plant tissue culture.
  • MSI medium (after agrobacterial transformation): MS medium with 3% glucose.
  • MSII medium (callus and shoot medium):
  • MSIII medium root medium: analogous to MSII medium but without hormones.
  • the starting material was that of Dr. RE. Plasmid clone pTVBam7 made available to Rhoads (University of Kentucky). This contains 4.7 kb (corresponding to nucleotides 1934 to 6648) of the TVMV sequence (Doier et al., Nucleic Acids Res. (1986), 14; pp. 5417-5430) in the BamHI site of pUC119 . DNA from this clone was cut with the restriction enzymes Dralll and EcoRV. After this restriction mixture had been separated on a 1% agarose gel, a DNA band of 3.3 kb was cut out. The DNA was electro-eluted from the gel and purified over DEAE cellulose.
  • the 3.3 kb swirl / EcoRV fragment comprises the sequence for the helper component (120 3'-terminal nucleotides), the complete PS sequence and the entire sequence coding for the cytoplasmic inclusion protein (Cl) to to the 3 'terminals 23 nucleotides.
  • the 3.3 kb swirl / EcoRV fragment was treated with the enzyme mung bean nuclease.
  • the Dralll / EcoRV fragment is referred to as a CI fragment.
  • Wx waxy locus
  • pBR plasmid which carries the promoter sequence of the waxy locus (Wx) (from Solanum tuberosum, cv. Granola) was also used (Rohde et al., J. Genet. & Breed. 44: 311-315, 1990 ) isolated a 0.9 kb Wx promoter fragment.
  • Wx plasmid was treated with the restriction enzymes EcoRI and BamHI, ie an EcoRI / BamHI-Wx promoter fragment was obtained.
  • the necessary terminator sequence was taken from the previously mentioned pBR plasmid (1).
  • the plasmid (1) with the restriction enzyme BamHI was opened between the CaMV 35S promoter and the terminator sequence and cut with the restriction enzyme EcoRI.
  • the 0.25 kb BamHI / EcoRI terminator fragment was purified as described in 2a). Due to the overlapping BamHI interface, a new promoter / terminator unit was constructed between the Wx promoter and the CaMV 35S terminator.
  • the binary vector system of Wing and co-workers (Mol. Gew. Genet. 219: 9-16, 1989) was used for the plant transformation.
  • This vector pGDW32 was opened with the restriction enzyme EcoRI in the T-DNA and dephosphorylated with the calf intestine phosphatase (CIP).
  • CIP calf intestine phosphatase
  • One of the promoter / terminator units described above (CaMV 35S promoter / terminator or Wx promoter / CaMV 35A terminator) was subcloned into this EcoRI site.
  • the two plant vectors pPTGDW pGDW32 with CaMV 35S promoter / terminator) and pGWX (pGDW32 with Wx promoter / CaMV 35S terminator) were thus obtained.
  • Each of the plant vectors described in 2b) was opened with the restriction enzyme BamHI between the corresponding promoter and terminator sequence and treated with the enzyme mung bean nuclease.
  • the 3.3 kb CI fragment described under 2a) was subcloned into the plant vectors pretreated in this way. In these subclonings, a stop codon was generated at the 3 1 end of the CI coding sequence.
  • Solanum tuberosum plants of the Desiree variety had been grown on MSII medium (without antibiotics) with a day / night change from 16 h light / 24 ° C. and 8 h darkness / 18 ° C. Leaves were cut at the base under sterile conditions and incubated with each of the above bacterial suspensions for 1 hour in the dark. The leaves were then placed on MSI plates and incubated for two days in the dark at 24 ° C. Then the leaves were washed in MSI medium with cefotaxime and placed on MSII plates (with antibiotics) and kept at the day / night change described above.
  • T-DNA of the plasmid pGDW32 carries a hygromycin resistance gene, it was possible to use hygromycin to select those plant cells which had taken up this T-DNA.
  • the leaves were transferred to fresh plates every 14 days. After the shoots had formed, they were cut off from the callous tissue and rooted on MSIII plates. Internodes of the rooted shoots were placed on MS8 plates to induce in vitro tuber formation. Similarly, internodes of non-transformed wild-type potato plants (cv. Desiree) were brought into MS8 medium (without antibiotics).
  • a "Southern blot" analysis of the transformed plants checked that they had really taken up the T-DNA with the inserted CI constructs.
  • the supernatants were mixed with a 3-fold volume of acetone and the precipitated proteins were washed three times with pelleting (by centrifugation) with 70% acetone.
  • the precipitated proteins were then dissolved in 300 ⁇ l MTPBS [100 M NaCl / 16 mM Na HPO / 4 mM NaH_P0 / pH 7.0].
  • MTPBS 100 M NaCl / 16 mM Na HPO / 4 mM NaH_P0 / pH 7.0.
  • 10 ⁇ l were used in each case and two determinations were carried out for each protein preparation. If the average soluble protein content determined for the wild-type tuber (cv.
  • tubers of the Wx-CI transgenic potato lines have a 1.9 to 4.2 times higher content and the tubers of the CaMV 35S-CI transgenic potato lines have a 1.8 to 4 times higher content of soluble Proteins versus wild-type tubers.

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Erhöhung des Proteingehaltes von Pflanzen, insbesondere von Knollenpflanzen, wie z.B. Batate-, Kartoffel-, Yam-, Maniok-, Taro- und Tania-Pflanzen, bei dem man zunächst ein Konstrukt durch Kombination von konstitutiven oder gewebsspezifischen Transkriptions-Regulationssignalen mit einem cDNA-Fragment für ein Protein, das als quasi-kristalline Struktur in den Pflanzen abgelagert werden kann, herstellt und mit dem erhaltenen Konstrukt Pflanzen, insbesondere Knollenpflanzen, transformiert. Auf diese Weise gelingt es z.B. den Proteingehalt von Kartoffeln auf das 1,8- bis 4,2-fache zu erhöhen.

Description

Verfahren zur Erhöhung des Proteinqehaltes von Pflanzen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung des Protein¬ gehaltes von Pflanzen durch stabile Transformation mit Genen, die für Proteine mit der Eigenschaft der Ablagerung in der Pflanzenzelle in quasikristallinen Strukturen kodieren, sowie transgene Pflanzen, tranεgene Pflanzenteile und Samen von transgenen Pflanzen, die durch den durch die Erfindung erreich¬ ten erhöhten Proteingehalt gekennzeichnet sind.
Es ist allgemein bekannt, daß sich mittels gentechnologischer Arbeitstechniken gezielt einzelne Gene in das pflanzliche Genom übertragen lassen. Diese als Transformation bekannte Technik wird routinemäßig auf verschiedenen Wegen durchgeführt, z.B. durch "particle gun bombardment" (vergl. M.E. Fromm, F. Morrish, C. Armstrong, R. Williams, J. Thomas und T.M. Klein "Inneritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants". Bio/Technology 8: 833-839 (1990) , "nackten DNA-Transfer" (vergl. P. Meyer, I. Heidmann, G. Fork¬ mann und H. Saedler "A new petunia flower colour generated by transfor ation of a utant with a maize gene". Nature 330: 677- 678 (1987) oder Acrrobacterium-vermittelte stabile Integration von Genen oder Genabschnitten in das Genom der Empfängerpflan¬ ze. Auf diese Weise wurden in transgenen Pflanzen z.B. Resisten¬ zen gegen Insekten, Viren oder Pflanzenschutzmittel erhalten. Angesichts der Bevölkerungsexplosion ist das wichtigste Ziel klassischer sowie gentechnologisch orientierter Pflanzenzüch¬ tung, wie sich z.B. aus K. Hahlbrock: "Kann unsere Erde die Menschen noch ernähren?" Verlag Piper, München, 1991 und Bundes¬ ministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten: "Priori- ties in International Agricultural Research" , Landwirtschaftε- verlag GmbH, D-4400 Münster-Hiltrup, 1986, ergibt, die Erhöhung von Eiweißmenge und Eiweißqualität. Die klassische Züchtung hat bei derartigen Versuchen zur Quali¬ tätsverbesserung von Kultursorten durch Erhöhung des Eiweißge¬ halts in vielen Fällen aufgrund eines beschränkten Genpools oder nachteiliger Eigenschaften der erhaltenen Kreuzungsnach- kommen (geringer Ertrag, Geschmacksveränderungen etc.) keine bemerkenswerten Fortschritte erzielt. Dies gilt vor allem für die stärkereichen Knollenpflanzen Kartoffel, Batate (Süßkar¬ toffel) , Yam und Maniok (Kassava) , die in den Ländern der Drit¬ ten Welt größte Bedeutung haben und zu den wichtigsten Nah¬ rungspflanzen gehören. Neben dem hohen Gehalt an Kohlehydraten als Energielieferant ist der Anteil an Vitamin C und anderen Vitaminen bemerkenswert. Der Eiweißanteil in frischen Knollen beträgt jedoch weniger als 2%.
In der folgenden Tabelle sind die Nährstoffe in 100 g frischem Material zusammengestellt.
Figure imgf000004_0001
* weißfleischige etwa 50, sehr intensiv orange gefärbte auch über 2500 I.E. ** Dioscorea alata.
Wie sich der Tabelle entnehmen läßt, liegt der höchste Eiwei߬ gehalt bei 2,1 %.
Es ist ferner ganz allgemein bekannt, z.B. aus R.E.F. Matthews: "Plant Virology", 2. Ausgabe, Academic Press, New York 1989 und R.I.B. Francki, R.G. Milne, T. Hatta: "Atlas of Plant Viru- ses", Vol. II, CRC Press, Boca Raton 1985, daß die Potyviren die größte und ökonomisch wichtigste Gruppe der Pflanzenviren darstellen, die sowohl Mono- als auch Dikotelydonen infizieren.
Weiterhin ist aus diesen Literaturstellen bekannt, daß drei der viralen Genprodukte, nämlich das zytoplas atische Inklusions¬ protein Cl sowie die nuklearen Inklusionsproteine NIa (eine der viralen Proteasen) und NIb (die potentielle virale Replikase) als quasikristalline Verbindungen im Zytoplasma (Cl) bzw. im Nukleus (NIa, NIb) der infizierten Zelle abgelagert werden. Derartige zytopathologische Effekte sind auch für andere Pflan¬ zenvirus/Wirt-Systeme beschrieben und unter Umständen auch bei nicht-virusinfizierten Pflanzen zu beobachten.
Aufgabe der Erfindung war es, ein allgemein gültiges, pflanzen- spezies-unabhängiges Verfahren zur Erhöhung des Eiweißgehalts in transgenen Pflanzen durch Expression eines Proteins mit be¬ stimmten physikochemischen Eigenschaften, nämlich der Fähig¬ keit, sich als quasikristalline Struktur in Pflanzen abzula¬ gern, bereitzustellen.
Die Erfindung geht aus von der Beobachtung der Ablagerung von Proteinen in gesunden Pflanzen und der Erkenntnis, daß z.B. die Ablagerung des potyviralen Cl-Proteins im Zytoplasma vermutlich nicht ursächlich Krankheitssymptome bei Potyvirus-Infektion hervorruft, sondern eine Begleiterscheinung der Infektion ohne pathologische Effekte auf die virusinfizierte Wirtspflanze ist, und daß es möglich ist, das Gen für ein Protein mit diesen phy¬ sikochemischen Eigenschaften, nämlich der Möglichkeit zur Aus¬ bildung von quasikristallinen Strukturen, stabil in ein Pflan¬ zengenom zu integrieren und zur Expression zu bringen.
Gelöst wird die gestellte Aufgabe mit dem in den Ansprüchen ge¬ kennzeichneten Verfahren. Demzufolge läßt "sich das erfindungsgemäße Verfahren kennzeich¬ nen durch:
a) die Herstellung eines Konstrukts durch Kombination von kon¬ stitutiven oder gewebsspezifischen Transkriptions-Regulations- signalen mit einem DNA-Fragment für ein Protein, das als quasi¬ kristalline Struktur in den Pflanzen abgelagert werden kann und b) die Transformation von Pflanzen mit dem erhaltenen Konstrukt in an sich bekannter Weise.
Gemäß einer ersten Ausgestaltung der Erfindung wird das Kon¬ strukt durch Aαrobacterium vermittelte Transformation in das Pflanzengenom stabil integriert.
Gemäß einer zweiten Ausgestaltung der Erfindung wird das Kon¬ strukt durch particle gun bombardment in das Pflanzengenom sta¬ bil integriert.
Gemäß einer dritten Ausgestaltung der Erfindung wird das Kon¬ strukt durch nackten DNA-Transfer in das Pflanzengenom stabil integriert.
Von besonderer Bedeutung ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Erhöhung des Proteingehaltes von Knollenpflanzen, deren wichtigste Vertreter zur Zeit sind: Batate, Kartoffeln, Yam, Maniok, Taro und Tania.
Eine Zusammenstellung von Potyviren, die als Lieferanten von cDNA-Fragmenten in Frage kommen, die sich für das erfindungs¬ gemäße Verfahren eignen, findet sich in der bereits erwähnten Literaturstelle R.I.B. Francki, R.G. Milne, T. Hatta: "Atlas of Plant Viruses", Vol. II CRC Press, Boca Raton 1985.
Agrobacterium-Stämme . in die sich das in der Stufe a) herge¬ stellte Konstrukt einbringen läßt, sind z.B. A robacterium tu- mefaciens und Agrobacterium rhizogenes. Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren von besonderer Bedeutung für Knollenpflanzen ist, läßt es sich auch im Falle anderer Pflanzen anwenden, wie beispielsweise im Falle von Getreiden durch Ablagerung des Proteins in den Speicherorganen (Körnern) .
Erfindungsgemäß läßt sich beispielsweise wie im folgenden Bei¬ spiel der Kartoffel gezeigt werden wird, der Proteingehalt von Kartoffeln um einen Faktor von 1,9 bis 4,2 erhöhen, ohne daß der Geschmack der Kartoffel nachteilig beeinflußt wird. Insbe¬ sondere werden folgende Vorteile erreicht:
(1) Als quasikristalline Struktur liegt das Protein in hoher Konzentration vor und kann daher entscheidend zur Eiweißerhö¬ hung beitragen ("Konzentrationseffekt") .
(2) Als quasikristalline Struktur ist das Protein nicht in Lö¬ sung und daher vor dem Abbau durch zelluläre, eiweißabbauende Enzyme (Proteasen) geschützt ("Protease-Insensitivität") .
(3) Als quasikristalline Struktur interferiert das Protein nicht mit den normalen Stoffwechsel-Vorgängen in der pflanz¬ lichen Zelle ("normaler Phänotyp") .
Die Erfindung soll im folgenden am Beispiel der Expression des potyviralen Cl-Proteins in der Kartoffel näher erläutert wer¬ den.
Für vier der bisher bekannten Potyviren ist die Gesamtsequenz des viralen RNA-Geno s sowie die Lage der einzelnen viralen offenen Leseraster (open reading frame, ORF) , ermittelt worden. Verwiesen wird auf J.L. Riechmann, S. Lain, J.A. Garcia: "High¬ lights and prospects of potyvirus molecular biology." J. Gen. Virol. 73: 1-16 (1992). Damit war auch die Sequenz für das CI- Gen zugänglich, und zwar für die Viren plum pox virus (PPV) , tobacco vein mottling virus (TVMV) , tobacco etch virus (TEV) und potato virus Y (PVY) . Ein Sequenzvergleich der Cl-Proteine dieser vier Viren zeigt, daß die N- und C-terminalen Bereiche sehr stark divergieren, ohne daß offensichtlich die physiko- chemischen Eigenschaften der Proteine davon berührt wurden. Weiterhin ist bemerkenswert, daß die Proteine zu 44,4-45,7 % aus den essentiellen Aminosäuren Histidin, Isoleuzin, Leuzin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Trypthophan und Valin bestehen, die der menschliche Körper nicht synthetisieren kann und die daher durch die Nahrung zugeführt werden müssen. Zählt man Arginin dazu, das zwar synthetisiert, aber vorwiegend in Harnstoff metabolisiert und mit dem Harn ausgeschieden wird, so machen die essentiellen Aminosäuren über 50 % des Gesamtpro- teins aus. Die Lysinreste (zwischen 5,5 und 6,2 % des Gesamt¬ proteins) sind dabei gleichmäßig über die Cl-Sequenz verteilt und sorgen daher für eine gute biologische Abbaubarkeit des Proteins durch Trypsin und trypsinähnliche Enzyme. Zusätzlich zu den oben erwähnten Vorteilen 1-3 lassen sich erfindungsgemäß somit die folgenden weiteren Vorteile erzielen:
(4) Möglichkeiten zur gentechnologischen Modifikation durch Einführung bestimmter Aminosäuren, ohne daß die physikochemi- schen Eigenschaften des Proteins verändert würden ("protein engineering") ;
(5) Die Erzielung eines ausgezeichneten Nährwerts durch einen hohen Anteil an essentiellen Aminosäuren ("nutritional value") ;
(6) Möglichkeiten zum Abbau des Proteins im Verdauungstrakt durch Trypsin und trypsinähnliche Enzyme ("bioavailability") .
Das im folgenden beispielsweise dargestellte Verfahren zur Er¬ höhung des Proteingehalts in der Kartoffelknolle zeigt die Ex¬ pression des CI-Gens eines Potyvirus des Tabaks (TVMV) im he- terologen Wirt Kartoffel sowie gleichzeitig die Möglichkeit zum "protein engineering" durch N-terminale Verlängerung des CI- Proteins mit dem 42kDa großen P3-Protein, so daß der Anteil der wichtigsten essentiellen Aminosäure Leuzin von 8,5 % (Cl) auf 10,1 % (P3+CI) steigt. In den Figuren sind dargestellt:
Fig. 1 oben: die schematische Struktur des TVMV RNA-Genoms
unten: das für die Expression des zytoplas atischen
Inklusionsproteins eingesetzte TVMV cDNA-Frag- ment, erhalten durch Dralll (D) / EcoRV (EV) Restriktionsverdau aus dem TVMV cDNA-Klon pTVBam7. E: EcoRI-Restriktionsstellen. Die Zah¬ len geben die Anzahl der Nukleotide in kb an.
Fig. 2 Der binäre Pflanzentransformationsvektor pGDW32. Pnos Nopalinsynthase-Gen Promotor: pad g4 Poly- adenylierungs-Signale des Tτ-DNA Gens 4: oriV- und ori_, Replikations- und Konjugationstransfer. Ursprünge der Plasmide ColEl und RK2; RB und LB rechte und linke T-DNA GrenzSequenzen; HPT Hy- gromycin-Phosphotransferase-Gen; Ampr Ampicil- lin-Resistenz arker. Restriktionsenzyme: C Clal; E EcoRI; P PstI; K Kpnl; S Sacl; Sa Sall; Sm Smal und XB Xbal.
Aus einer Arbeit von
L.L. Do ier; S.M. Franklin; M. Shahabuddin; G.M. Hellmann; J.H. Overmeyer; S.T. Hiramath; M.F.E. Siaw; G.P. Lomonosoff; J.G. Shaw sowie R.E. Rhoads: "The nucleotide sequence of tobacco vein mottling virus". Nucleic Acids Res. 14: 5417-5430 (1986) ist die Gesamtsequenz des TVMV bekannt. Dazu wurden DNA-Kopien (cDNA) der genomischen TVMV-RNA hergestellt und deren Sequenz bestimmt. Eine 4,7 kb große TVMV cDNA im Plasmid pTVBam7 (ent¬ sprechend der cDNA-Sequenz zwischen den BamHI-Schnittsrellen, Nukleotide 1934 bis 6648; Fig. 1 oben) wurde von Dr. Rhoads zur Verfügung gestellt, und aus diesem Plasmid ein 3,3 kb großes Dralll/EcoRV-Fragment isoliert (Fig. 1 unten) . Nach den Anga¬ ben in der zitierten Arbeit ist diese 3,3 kb große cDNA aus dem Klon pTVBam7 durch eine Nukleinsäure- und eine daraus resultie¬ rende Aminosäuresequenz näher definiert und enthält drei offene Leseraster (ORF) , die für das P3-Protein (42 kDa) , ein 6Kl-Pro- tein (6kDa) sowie das zytoplasmatische Inklusionsprotein Cl (67 kDa) kodieren.
Dieses 3,3 kb-Fragment wurde unter die Kontrolle von Regula¬ tionssignalen für die Transkription gebracht, die (1) eine starke konstitutive Expression in allen pflanzlichen Geweben bewirken (CaMV 35S-Promotor und -Terminator) , oder (2) eine gewebsspezifische Expression vorwiegend in der Knolle (Promotor des waxy-Gens aus der Kartoffel, (vergl. W. Rohde, D. Becker, B. Kuli, F. Salamini: "Structural and functional analysis of two waxy gene promoters from potato. J. Genet. & Breed. 44: 311-315, 1990) hervorrufen. Diese mit Regulationssignalen ver¬ sehenen cDNA-Fragmente wurden nun in den binären Agrobacterium turnefaciens-Vektor pGDW32 (Fig. 2) kloniert, in Agrobacterien- zellen eingebracht und mit Hilfe der als Transformation be¬ zeichneten Arbeitstechnik stabil in das Genom der Kartoffel (Solanum tuberosum. cv. Desiree) übertragen. Die nach Selektion mit dem Antibiotikum Hygromycin erhaltenen Kalli wurden in Ge¬ webekultur zu Pflanzen regeneriert und in vitro für einen er¬ sten Protein-Test durch hohe Succrose-Konzentrationen zur Bil¬ dung von Knollen angeregt. Obwohl die Ergebnisse der Proteinbe- stimmungen an den Knollen von 10 unabhängigen Transformanden mit dem waxy/CI-Konstrukt sowie von 6 Transformanden mit dem CaMV 35S/CI-Konstrukt einen dramatischen Anstieg der Protein¬ konzentration aufwiesen, zeigten alle Transformanden im Ver¬ gleich zur nicht-transformierten Kontrolle Desiree einen abso¬ lut anomalen Phanotyp. Um einen Artefakt auszuschließen, wurden in vitro-Knollen für die wx/CI-Linien 1, 4, 8, 9, 10 im Ge¬ wächshaus in normaler Erde zum Keimen gebracht und die abge¬ reiften Knollen einer weiteren Analyse unterzogen. Im Phanotyp waren diese Knollen nicht von denen der nicht-transgenen Kon¬ trollpflanze zu unterscheiden, und die Proteinwerte zeigten eine gute Übereinstimmung mit den für in vitro-Knollen erhal¬ tenen Werten. Ausführungsbeispiel:
1) Verwendete Medien
la) Medien für die Anzucht von Bakterien:
YEB-Medium: 0,5 % Saccharose, 0,5 % Pepton, 0,5 %
Beefextrakt und 0,1 % Hefeextrakt, pH 7,4;
für Festmedium wurde 1,5 % AgarAgar zugegeben.
lb) Medien für die Pflanzengewebekultur:
Für die Pflanzengewebekultur wurde die von Murashige und Skoog (1962) beschriebene Basissalz-Mischung (Firma Duchefa, Nieder¬ lande) verwendet.
MSI-Medium (nach Agrobakterien-Transformation) : MS-Medium mit 3 % Glucose.
MSII-Medium (Kallus- und Sproßmedium) :
MS-Medium mit 3 % Glucose, 2 mg/1 Zeatinribosid, 0,02 mg/1 Naphtylessigsäure, 0,02 mg/1 Gibberel- linsäure A_, 500 mg/1 Cefotaxim und 10 mg/1 Hy- gromycin.
MSIII-Medium (Wurzelmedium) : analog MSII-Medium jedoch ohne Hormone.
MS8-Medium (Knollenmedium) :
MS-Medium mit 8 % Saccharose und Antibiotika.
Für Festmedien wurden 0,8 % AgarAgar zugegeben.
2) Subklonierung der Sequenz des zytoplasmatischen Inklu¬ sionsproteins (Cl) des Tobacco Vein Mottling Virus (TVMV) 2a) Isolierung des 3,3 kb großen CI-Fragments
Als Ausgangsmaterial diente der von Dr. R.E. Rhoads (Universi¬ tät Kentucky) zur Verfügung gestellte Plasmidklon pTVBam7. Die¬ ser enthält 4,7 kb (entsprechend den Nukleotiden 1934 bis 6648) der TVMV-Sequenz (Do ier et al., Nucleic Acids Res. (1986), 14; S. 5417-5430) in der BamHI-Schnittstelle des pUC119. DNA dieses Klons wurde mit den Restriktionsenzymen Dralll und EcoRV geschnitten. Nach Auftrennung dieses Restrik- tionsansatzes auf einem l%igen Agarosegel wurde eine DNA-Bande von 3,3 kb ausgeschnitten. Die DNA wurde aus dem Gel elektro- eluiert und über DEAE-Cellulose gereinigt. Das 3,3 kb große Dralll/EcoRV-Fragment umfaßt die Sequenz für die Helferkompo¬ nente (120 3'-terminale Nukleotide), die vollständige PS-Se¬ quenz und die gesamte für das zytoplasmatische Inklusionspro¬ tein (Cl) kodierende Sequenz bis auf die 3 '-terminalen 23 Nu¬ kleotide. Zur Subklonierung wurde das 3,3 kb große Dralll/- EcoRV-Fragment mit dem Enzym mung bean nuclease behandelt. Zum einfacheren Verständnis wird das Dralll/EcoRV-Fragment als CI- Fragment bezeichnet.
2b) Verbindung des binären Vektorsystems pGDW32 mit Trans¬ kriptionssignalen
Aus einem pBR-Plasmid, das den Promotor und den Terminator des 35S-Transkriptes des Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) trägt [Na- ture (1985), 313; S. 810-812] wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI das CaMV 35S Promotor/Terminator-Fragment (0,79 kb) herausgeschnitten und wie schon unter 2a) beschrieben gerei¬ nigt.
Des weiteren wurde aus einem anderen pBR-Plasmid, das die Promotorsequenz des Waxy-Locus (Wx) (aus Solanum tuberosum, cv. Granola) trägt (Rohde et al., J. Genet. & Breed. 44: 311-315, 1990) ein 0,9 kb großes Wx-Promotorfragment isoliert. Dazu wur- de das Wx-Plasmid mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI behandelt, d.h., es wurde ein EcoRI/BamHI-Wx-Promotorfragment erhalten. Die notwendige Terminatorsequenz wurde aus dem zuvor schon erwähnten pBR-Plasmid (1) entnommen. Zu diesem Zweck wur¬ de das Plasmid (1) mit dem Restriktionsenzym BamHI zwischen der CaMV 35S Promoter und Terminatorsequenz geöffnet und mit dem Restiktionsenzym EcoRI nachgeschnitten. Die Aufreinigung des 0,25 kb großen BamHI/EcoRI-Terminatorfragments erfolgte wie un¬ ter 2a) beschrieben. Durch die überlappende BamHI-Schnittstelle wurde so eine neue Promotor/Terminatoreinheit zwischen Wx-Pro- motor und CaMV 35S-Terminator konstruiert.
Für die Pflanzentransformation wurde das binäre Vektorsystem von Wing und Mitarbeitern (Mol. Gew. Genet. 219: 9-16, 1989) benutzt. Dieser Vektor pGDW32 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI in der T-DNA geöffent und mit der calf intestine phospha- tase (CIP) dephosphoryliert. Jeweils eine der oben beschriebe¬ nen Promotor/Terminatoreinheiten (CaMV 35S Promotor/Terminator bzw. Wx-Promotor/CaMV 35A Terminator) wurde in diese EcoRI- Schnittstelle subkloniert. Somit wurden die zwei Pflanzenvekto¬ ren pPTGDW pGDW32 mit CaMV 35S Promotor/Terminator) und pGWX (pGDW32 mit Wx-Promotor/CaMV 35S-Terminator) erhalten.
2c) Subklonierung des CI-Fragments in die Pflanzenvektoren pPTGDW und pGWX
Jeder der in 2b) beschriebenen Pflanzenvektoren wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI zwischen der entsprechenden Promotor- und Terminatorsequenz geöffnet und mit dem Enzym mung bean nu- clease behandelt. In die so vorbehandelten Pflanzenvektoren wurde das unter 2a) beschriebene 3,3 kb große CI-Fragment sub¬ kloniert. Bei diesen Subklonierungen wurde am 31 Ende der CI- kodierenden Sequenz ein Stopkodon erzeugt.
2d) Einbringung der CI-Konstrukte in Agrobacterium tume- faciens Beide Promotor/CI-Konstrukte wurden mit der Methode der direk¬ ten Agrobacterium tumefaciens-Transformation in den bei Koncz und Schell in Mol. Gew. Genet. 204: 383-396 (1986) beschriebe¬ nen Agrobakterien-Stamm GV3101 (pMP90RK) transformiert. Hierfür wurde eine Bakterienkolonie des Stammes in 5 ml YEB-Medium über Nacht bei 28°C angezogen. Am nächsten Tag wurde mit dieser Bak¬ teriensuspension 100 ml YEB-Medium angeimpft und 4 h bei 28°C ge-schüttelt, in einer Heraeus Minifuge RF bei 6000 rpm zentri- fugiert und das Pellet in 1 ml YEB-Medium resuspendiert. Zu je¬ weils 200 μl dieser Suspension wurden 200 ng der unter- 2c) be¬ schriebenen Konstrukte hinzugegeben und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach einem Hitzeschock von 5 min bei 37°C wurde 0,8 ml YEB-Medium zugegeben und 1 h bei 28°C inkubiert. Durch Wachstum bei 28°C unter selektiven Bedingungen (100 mg/1 Rifam- picin, Selektion auf das bakterielle Chromosom; 25 mg/1 Kanamy- cin, Selektion auf das Helferplasmid pMP90RK; 100 mg/1 Carbeni- cillin, Selektion auf das Plasmid pGDW32) wurden dann plasmid- haltige Bakterienkulturen isoliert.
Mittels der "Southern blot"-Analyse wurde überprüft, daß die isolierten Bakterienklone die rekombinanten Plasmide des pGDW32 mit den entsprechenden intakten Transkriptionseinheiten be¬ saßen.
3) Transformation von Solanum tuberosum mit den selektionier- ten Agrobakterien
3a) Anzucht von Bakterien
Einzelne Bakterienkulturen wurden in 5 ml YEB-Medium mit den in 2d) genannten Antibiotika 2 Tage lang bei 28°C angezogen. Mit dieser Kultur wurden 100 ml Antibiotika-haltiges YEB-Medium an¬ geimpft und über Nacht bei 28°C geschüttelt. Die Bakterienkul¬ tur wurde 10 min bei 4°C und 6000 rpm in einer Heraeus Minifuge RF zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 ml einer 10 mM MgSO - Lösung resuspendiert, erneut zentrifugiert und in 20 ml MSI-Me¬ dium resuspendiert. 3b) Blattscheiben-Transformation
Solanum tuberosum-Pflanzen der Varietät Desiree waren auf MSII- Medium (ohne Antibiotika) angezogen worden bei einem Tag/Nacht- Wechsel von 16 h Licht/24°C und 8 h Dunkelheit/18°C. Blätter wurden unter sterilen Bedingungen an der Basis abgeschnitten und mit jeweils einer der obigen Bakteriensuspensionen 1 h lang im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Blätter auf MSI- Platten gelegt und zwei Tage im Dunkeln bei 24°C inkubiert. Dann wurden die Blätter in MSI-Medium mit Cefotaxim gewaschen und auf MSII-Platten (mit Antibiotika) gelegt und bei dem oben beschriebenen Tag/Nacht-Wechsel gehalten. Da die T-DNA des Plasmids pGDW32 ein Hygromycin-Resistenzgen trägt, konnte mit Hygromycin auf solche Pflanzenzellen selektioniert werden, die diese T-DNA aufgenommen hatten. Alle 14 Tage wurden die Blätter auf frische Platten transferiert. Nach der Sproßbildung wurden diese vom kallösen Gewebe abgeschnitten und auf MSIII-Platten zur Bewurzelung gebracht. Zur Induktion von in vitro-Knollen- bildung wurden Internodien der bewurzelten Sprößlinge auf MS8- Platten gesetzt. Analog dazu wurden Internodien von nicht- transfor ierten Wildtyp-Kartoffelpflanzen (cv. Desiree) MS8- Medium (ohne Antibiotika) gebracht. Durch eine "Southern blot"- Analyse der transformierten Pflanzen wurde überprüft, daß diese wirklich die T-DNA mit den inserierten CI-Konstrukten aufge¬ nommen hatten.
4) Nachweis der Expression des TVMV CI-Fragments unter Kon¬ trolle des CaMV 35S Promotors bzw. des Wx-Promotors aus Granola
Transformierte Pflanzen wurden durch DNA-Analyse ("Southern blotting") auf das Vorhandensein der entsprechenden Promo- tor/3,3 kb TVMV CI-Fragment/Terminator-Konstrukte überprüft. Die Expression des CI-Fragments wurde durch immunologische Re¬ aktion mit dem entsprechenden Antiserum in der "Western blot¬ ting"-Analyse nachgewiesen. 5) Untersuchungen zum Proteingehalt von in vitro-Knollen CI- transgener Kartoffellinien
Zur Bestimmung des Proteingehalts der in vitro-erzeugten Knol¬ len wurden pro regenerierter, transgener Kartoffellinie drei Proteinpräparationen durchgeführt. Dazu wurden jeweils 300 mg tiefgefrorenes Knollenmaterial (sowohl von transgenen Kartof¬ fellinien als auch von Wildtyp) in 100 μl Laemmli-Puffer [0,0625 M Tris-HCl pH 8,0/2 % (w/v) SDS/10 % (v/v) Glycerin/1 % (w/v) DTT/5 % (v/v) ß-Mercaptoethanol/0,005 % BPB] mit Quarz¬ sand zermörsert und anschließend 10 min bei 100°C inkubiert. Durch Zentrifugation wurden die festen Bestandteile abgetrennt. Zur Entfernung des SDS und Entfärbung der Proteine wurden die Überstände mit einem 3fachen Volumen Aceton versetzt und die ausgefällten Proteine nach Pelletierung (mittels Zentrifuga¬ tion) dreimal mit 70%igem Aceton gewaschen. Anschließend wurden die präzipitierten Proteine in 300 μl MTPBS [100 M NaCl/16 mM Na HPO /4 mM NaH_P0 /pH 7,0] gelöst. Für die Bestimmung des Proteingehalts nach Bradford (Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976) wurden jeweils 10 μl eingesetzt und pro Proteinpräparation zwei Bestimmungen durchgeführt. Setzt man den für die Wildtyp-Knolle (cv. Desiree) bestimmten durchschnittlichen Gehalt an löslichem Protein gleich 1, so kann dem Proteingehalt der Cl-transgenen Knollen ein Faktor zugeordnet werden. Demnach besitzen Knollen der Wx-CI-transgenen Kartofellinien einen 1,9- bis 4,2-fach höheren Gehalt und die Knollen der CaMV 35S-CI-transgenen-Kar- toffellinien einen 1,8- bis 4-fach höheren Gehalt an löslichen Proteinen gegenüber den Wildtyp-Knollen.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Erhöhung des Proteingehaltes von Pflanzen, g e k e n n z e i c h n e t durch a) die Herstellung eines Konstrukts durch Kombination von kon¬ stitutiven oder gewebsspezifischen Transkriptions-Regulations- signalen mit einem DNA-Fragment für ein Protein, das als quasi¬ kristalline Struktur in den Pflanzen abgelagert werden kann und b) die Transformation von Pflanzen mit dem erhaltenen Konstrukt in an sich bekannter Weise.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß man das Konstrukt durch Agrobacteriu - vermittelte Transformation in das Pflanzengenom stabil inte¬ griert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß man das Konstrukt durch particle gun bombardment in das Pflanzengenom stabil integriert.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß man das Konstrukt durch nackten DNA- Transfer in das Pflanzengenom stabil integriert.
5. Verfahren nach Anspruch 1, g e k e n n z e i c h ¬ n e durch die Herstellung des Konstrukts durch Kombination von konstitutiven oder gewebsspezifischen Transkriptions-Regu- lationssignalen mit einem cDNA-Fragment eines Potyvirus, das für das zytoplasmatische Inklusionsprotein Cl oder die nukle¬ aren Inklusionsproteine NIa oder NIb kodiert.
6. Verfahren ' nach Anspruch 1 oder 5, g e k e n n ¬ z e i c h n e t durch a) die Herstellung eines Konstrukts durch Kombination von kon¬ stitutiven oder gewebsspezifischen Transkriptions-Regulations- signalen mit einem cDNA-Fragment eines Potyvirus, das für das zytoplasmatische Inklusionsprotein Cl oder die nuklearen Inklu¬ sionsproteine NIa oder NIb kodiert, b) Einbringen des erhaltenen Konstrukts in ein Agrobacterium, und c) Transformation von Pflanzen mit den selektionierten Agrobak- terien.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 5 oder 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man von einem cDNA-Fragment der Potyviren TEV, TVMV, PPV oder PVY ausgeht.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man von einem cDNA-Fragment ausgeht, das erhalten wurde durch Schneiden des cDNA-Klons pTVBam7 des Potyvirus TVMV mit den Restriktionsenzymen Dralll und EcoRV.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man von einem cDNA-Fragment ausgeht, das zusätzlich die Information für das TVMV-Protein P3 enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß man in Stufe b) das Konstrukt in Agro¬ bacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes einbringt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man das Konstrukt in das Genom von Knollenpflanzen stabil integriert.
12. Verfahren "nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man in Stufe c) mit den selektionierten Agrobakterien Knollenpflanzen transformiert.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch g e k e n n ¬ z e i c h n e t , daß man das Konstrukt in das Genom von Batate-, Kartoffel-, Yam-Maniok-, Taro- oder Tania-Pflanzen stabil integriert.
14. Transgene Pflanzen, insbesondere transgene Knollenpflan¬ zen, transgene Pflanzenteile sowie Samen von transgenen Pflan¬ zen, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 erhalten wurden.
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