DE69231439T2 - Schwefelreiches proteingen aus samen und verfahren zur steigerung des schwefelhaltigen aminosaeurengehaltes in pflanzen - Google Patents

Schwefelreiches proteingen aus samen und verfahren zur steigerung des schwefelhaltigen aminosaeurengehaltes in pflanzen

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Der weltweite Tierfuttermarkt, welcher lebendes Inventar, Federvieh, Aquakultur und zahme Tiere umfaßt, ist 475 Millionen Tonnen. In den Vereinigten Staaten werden 180 Millionen metrische Tonnen mit Mais (Zea mays L.) verbraucht, was etwa 67% ausmacht, und Sojabohnen-(Glycine max L.) Mehl, was etwa 10% des Gesamten ausmacht Mais- und Sojabohnenprodukte sind auch ein Hauptelement vom Auslandshandel. Diese zwei Feldfrüchte sind agronomisch an viele Teile der U. S. gut angepaßt, und Maschinen und Erleichterungen zum Ernten, Lagern und Verarbeiten sind umfassend über die U. S. erhältlich. Weil Mais, Sojabohne und andere verwendeten Feldfrüchte für Futter gegenwärtig als Waren verkauft werden, besteht eine ausgezeichnete Gelegenheit, zum auf eine höhere Ebene stellen der Ernährungsqualität des Proteins und somit Wert für den U. S. Farmer hinzuzufügen und ausländischen Handel zu erhöhen.
  • Menschlicher Nahrung und Tierfutter, abstammend von vielen Körnern, mangelt es an Schwefelaminosäuren, Methionin und Cystein, welche in der Tiernahrung verlangt werden. Bei Mais sind die Schwefelaminosäuren die dritthäufigsten begrenzenden Aminosäuren nach Lysin und Tryptophan für die Nahrungsforderungen vieler Tiere. Die Verwendung von Sojabohnenmehl, welches reich an Lysin und Tryptophan ist, zum Ergänzen von Mais in Tierfutter ist durch den geringen Schwefelaminosäusengehalt der Hülsenfrüchte begrenzt. Somit würde ein Anstieg an dem Schwefelaminosäurengehalt von entweder Mais oder Sojabohne die Ernährungsqualität der Mischungen verbessern und die Notwendigkeit für weitere Ergänzung durch Zugabe von teurerem Methionin reduzieren.
  • Bemühungen zum Verbessern des Schwefelaminosäurengehalts von Ernten durch Pflanzenzüchten ist mit beschränktem Erfolg im Labormaßstab und keinem Erfolg im kommerziellen Maßstab begegnet worden. Eine Mutantenmaislinie, welche eine erhöhte Vollkem-Methioninkonzentration hatte, wurde aus in Kultur gezüchteten Maiszellen durch Auswählen für Wachstum in der Anwesenheit von inhibierenden Konzentrationen von Lysin plus Threonin [Philipps et al. (1985) Cereal Chem. 62: 213-218] isoliert. Jedoch sind agronomisch annehmbare Kulturformen noch nicht von dieser Linie abgeleitet und kommerzialisiert worden. Sojabohnenzelllülien mit erhöhten intrazellulären Konzentrationen von Methionin wurden durch Selektion in Bezug auf Wachstum in der Anwesenheit von Etbionin isoliert [Madison und Thompson (1988) Plant Cell Reports 7: 472-476], aber Pflanzen wurden nicht aus diesen Linien wiedergewonnen.
  • Der Aminosäurengehalt von Samen wird in erster Linie durch die Lagerproteine bestinunt, welche während Samenentwicklung synthetisiert werden, und welche als eine Hauptemährungsreserve nach Keimung dienen. Die Menge von Protein in Samen variiert von etwa 10% des Trockengewichts in Getreiden bis 20-40% des Trockengewichts von Hülsenfrüchten. In vielen Samen betragen die Lagerproteine 50% oder mehr des Gesamtproteins. Wegen ihres Überflusses waren Pflanzenlagerproteine unter den ersten zu isolierenden Proteinen. Erst kürzlich sind jedoch die Aminosäurensequenzen von einigen dieser Proteine unter Verwendung von Molekülgentechniken bestimmt worden. Diese Techniken haben auch Information über die genetischen Signale geliefert, die die samenspezifische Expression und das intrazelluläre Treffen dieser Proteine kontrollieren.
  • Eine Anzahl von schwefelreichen Pflanzensamenlagerproteinen ist identifiziert worden, und ihre entsprechenden Gene sind isoliert worden. Ein Gen in Mais für ein 15 kD Zeinprotein, enthaltend 11% Methionin und 5% Cystein [Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6279-6284], und ein Gen für ein 10 kD Zeinprotein, enthaltend 23% Methionin und 3% Cystein, sind isoliert worden [Kirihara et al. 1988) Mol. Gen. Genet. 21: 477-484, Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359-370]. Zwei Gene aus Erbse für Samenalbumine, enthaltend 8% und 16% Cystein, sind isoliert worden [Higgins et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11124-11130]. Ein Gen aus Brasiliennuß für ein Samen 25 Albumin, enthaltend 18% Methionin und 8% Cystein, ist isoliert worden [Altenbach et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 239-250]. Letztendlich ist aus Reis ein Gen, codierend ein 10 kD Samenprolamin, enthaltend 19% Methionin und 10% Cystein, isoliert worden [Masumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123-130].
  • Es hat viele Berichte in Bezug auf die Expression von Samenlagerproteingenen in transgenen Pflanzen gegeben. Das Hoch-Schwefel 25 Albumin aus Brasiliennuß ist in den Samen von transformiertem Tabak unter der Kontrolle der Regulationssequenzen von einem Bohnenphaseolinlagerproteingen exprimiert worden. Das Protein wurde wirksam aus einem 17 kD Vorläufer zu den 9 kD und 3 kD Untereinheiten des reifen nativen Proteins verarbeitet. Die Anreicherung des an Methionin reichen Proteins in den Tabaksamen führte bis zu einem 30% Anstieg in dem Methioninspiegel in den Samen [Altenbach et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 513-522]. Chimäre Gene, die die Codierungsregionen von Maissamenlagerproteingenen für 19 und 23 kD Zeine an den Blumenkohl Mosaic Virus 35S Promotor koppeln, wurden bei sehr geringen Spiegeln in Samen wie auch Wurzeln und Blättern von transfonniertem Tabak [Schernthaner et al. (1988) EMBO J. 7: 1249-1255] exprimiert. Ersatz der Einkeimblatt (moncot)- Regulationsregionen (Promotor und Transkriptionsterminator) durch Zweikeimblatt(dicot)- samenspezifische Regulationsregionen führte zu samenspezifischer Expression von geringem Spiegel eines 19 kD Zeins in transformierter Petunie [Williamson et al. (1988) Plant Physiol. 88: 1002-1007] und Tabak [Ohtani et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16: 117-128]. In einem anderen Fall wurde samenspezifische Expression von hohem Spiegel des 15 kD schwefekeichen Zeins in transformiertem Tabak gefunden, und die Signalsequenz des Einkeimblatt-(moncot) Vorläufers wurde auch korrekt verarbeitet [Hoffmann et al. (1987) EMBO J. 6: 3213-3221].
  • Um den Schwefelaminosäurengehalt von Samen zu erhöhen, ist es wesentlich, ein Gen(e) zu isolieren, das (die) für Samenlagerproteine codiert (codieren), die reich an den schwefelhaltigen Amionosäuren Methionin und Cystein sind.
  • Methionin ist gegenüber Cystein bevorzugt, weil Methionin in Cystein umgewandelt werden kann, aber Cystein kann nicht zu Methionin durch die meisten Tiere umgewandelt werden. Es ist wünschenswert, daß das Lagerprotein kompatibel mit jenen der Zielerntepflanze ist. Ferner ist es wünschenswert, daß das Protein aus einer Quelle kommt die im allgemeinen als sicher für Tierfutter betrachtet wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Mittel zum Erhöhen des Schwefelaminosäurengehalts von Samen ist festgestellt worden. Unter Verwenden des Hochschwefelzein-(HSZ) Gens können chimäre Gene erzeugt und verwendet werden, verschiedene Erntepflanzen unter Erhöhen des Schwefelaminosäurengehalts der Samen oder Blätter zu transformieren.
  • Insbesondere ist ein Aspekt der gegenwärtigen Erfindung ein Nucleinsäurefragment, umfassend eine Nucleotidsequenz, die den HSZ Maislagerproteinvoriäufer codiert, der der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Sequenz entspricht, oder irgendeine im wesentlichen homologe Nucleotidsequenz damit. Andere Aspekte der Erfindung sind diejenigen Nucleinsäurefragmente, die das reife HSZ Protein (SEQ ID NR: 3:) codieren und die Hochmethionindomäne (HIMD) des HSZ Maislagerproteins (SEQ ID NR: 4:) codieren.
  • Andere Ausführungsformen dieser Erfindung sind chimäre Gene, füllig, in transformierten Pflanzen exprimiert zu werden, umfassend irgendeines der vorhergehenden, operabel an Regulationssequenzen gekoppelten Nucleinsäurefiagmente. Bevorzugt sind diejenigen chimären Gene, welche operabel die Nucleinsäurefragmente an samenspezifische Promotoren oder Promotoren, aktiv in Blättern von Mais oder Sojabohne, koppeln.
  • Ein anderer Aspekt dieser Erfindung sind chimäre Gene, fähig in transformierten Mikroorganismen, vorzugsweise E. coli, unter Herstellen von Hochschwefelproteinen exprimiert zu werden.
  • Noch ein anderer Aspekt dieser Erfindung sind Wirtszellen, transformiert durch chimäre Gene unter Herstellen von Hochschwefelproteinen.
  • Noch andere Ausführungsformen der Erfindung sind transformierte Pflanzen und die von ihnen abstammenden Samen, enthaltend irgendeines der vorhergehenden Nucleinsäurefragmente. Bevorzugt sind Pflanzen und die von ihnen abstammenden Samen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mais, Sojabohnen, Rapssamen, Tabak und Reis.
  • Zusätzliche Aspekte der Erfindung sind die mit den offenbarten chimären Genen transformierten Mikroorganismen.
  • Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind Verfahren zum Erhöhen des Schwefelaminosäurengehalts von Pflanzen und Agrobacterium tumefaciens behandelte Verfahren zum Herstellen von Pflanzen mit der Fähigkeit, Hochschwefelproteine herzustellen. Auch innerhalb der Erfindung inbegriffen sind Verfahren zum Herstellen von Protein, reich an Schwefel enthaltenden Aminosäuren, in einem Mikroorganismus.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND SEQUENZBESCHREIBUNGEN
  • Diese Erfindung kann vollständiger aus der folgenden detaillierten Beschreibung, den Begleitzeichnungen und den Sequenzbeschreibungen, die einen Teil dieser Anmeldung bilden, verstanden werden. Die Sequenzbeschreibungen enthalten die drei Buchstabencodes für Aminosäuren, wie in 37 C. F. R. 1.822 definiert, welche hier durch Bezugnahme eingeführt sind.
  • SEQ ID NR: 1 zeigt die Nucleotidsequenz (2123 bp) des Mais HSZ Gens und die vorhergesagte Aininosäurensequenz des primären Translationsprodukts. Nucleotide 753-755 sind der vermeintliche Translationsinitiierungscodon, und Nucleotide 1386-1388 sind der vermeintliche Translationsterminatorcodon. Nucleotide 1-752 und 1389-2123 umfassen vermeintliche 5' und 3' Regulationssequenzen.
  • SEQ ID NR: 2 zeigt eine bevorzugte Nucleotidsequenz der Erfindung. Sie zeigt ein 635 bp DNA Fragment, nur die HSZ Codierungsregion einschließend, welche durch Restriktionsendonucleaseverdauung unter Verwenden von Nco I (5'-CCATGG) zu Xba I (5'-TCTAGA) isoliert werden kann. Zwei Nco I Stellen, die in der nativen HSZ Codierungsregion vorhanden waren, wurden durch Mutationsort-gerichtete Mutagenese ohne Ändern der codierten Aminosäurensequenz eliminiert.
  • SEQ ID NR: 3 zeigt eine bevorzugte Nucleotidsequenz der Erfindung. Sie stellt ein 579 bp DNA Fragment dar, nur die Codierungsregion des reifen HSZ Proteins einschließend, welche durch Restriktionsendonucleaseverdauung unter Verwenden von BspH I (5'-TCATGA) zu Xba I (5'-TCTAGA) isoliert werden kann.
  • Zwei Nco I Stellen, die in der nativen HSZ Codierungsregion vorhanden waren, wurden durch Mutationsort-gerichtete Mutagenese eliminiert. Dieses wurde ohne Ändern der codierten Aminosäurensequenz durchgeführt.
  • SEQ ID NR: 4 zeigt das Nucleotid und abgeleitete Aminosäurensequenz des HMD Gens.
  • SEQ ID NR: 5 zeigt die DNA Sequenz des Mais 10 lcD Zein Gens [Kirihara et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 21: 477-484; Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359-370].
  • SEQ ID NR: 6 und 7 wurden in Beispiel 1 zum Sreenen einer Maisbibliothek in Bezug auf ein Hochmethionin 10 kD Zein Gen verwendet.
  • SEQ ID NR: 8 und 9 wurden in Beispiel 2 zum Durchführen der Mutagenese des HSZ Gens verwendet.
  • SEQ ID NR: 10 und 11 wurden in Beispiel 2 zum Erzeugen einer Form des HSZ Gens mit alternativen einzigartigen Endonucleasestellen verwendet.
  • SEQ ID NR: 12 und 13 wurden in Beispiel 2 zum Erzeugen eines Gens zum Codieren der reifen Form von HSZ verwendet.
  • SEQ ID NR: 14 und 15 wurden in Beispiel 5 zum Konstruieren eines Gens zum Codieren der HMD von HSZ verwendet.
  • SEQ ID NR: 16-21 wurden in Beispiel 6 der Konstruktion von chimären Genen für Expression von HSZ in Pflanzen verwendet.
  • SEQ ID NR: 22 wurde in Beispiel 7 für die Analyse von Transformanten von Tabak mit dem Phaseolin-HSZ chimären Genen verwendet.
  • SEQ ID NR: 23, 24 und 25 wurden in Beispiel 10 für die Konstruktion von chimären Genen fur Expression von HMD in Pflanzen verwendet.
  • SEQ ID NR: 26 ist ein chimäres Gen, gebildet aus dem 35S Promotor von Blumenkohl Mosaik Virus [Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812], dem Hygromycinphosphotransferasegen aus Plasmid pJR225 (aus E. co/i) [Gritz et al. (1983) Gene 25: 179-188] und der 3' Region des Nopalinsynthasegens von der T-DNA des Ti Plasmids von Agrobacteriurn tumefaciens, verwendet als ein selektierbarer genetischer Marker für Transformation von Sojabohne in Beispiel 11.
  • SEQ ID NR: 27 ist die Zentralregion des HSZ Proteins.
  • SEQ ID NR: 28 ist eine Aminosäurensequenz für die Retention von Proteinen in dem Lumen des endoplasmatischen Retikulums.
  • Fig. 1 zeigt einen Vergleich der Aminosäurensequenzen des 10 kD Zein (SEQ ID NR: 5) und HSZ (SEQ ID NR: 2). Einzelbuchstabencodes fur Aminosäuren werden verwendet. Hochmethionindomänen der zwei Proteine sind unterstrichen. Die vertikalen Linien in Fig. 1 zeigen identische Aminosäurereste in den zwei Proteinen.
  • Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung von samenspezifischen Genexpressionskasserten, geeignet zum Konstruieren chimärer Gene für Expression von HSZ in tranagenen Pflanzen.
  • Fig. 3 zeigt eine Karte des binären Plasmidvektors pZS97K.
  • Fig. 4 zeigt eine Karte des binären Plasmidvektors pZS97.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die gegenwärtige Erfindung beschreibt Nucleinsäurefragmente, die ein Mais-Hoch-Schwefel Zein (HSZ) Samenlagerprotein oder eine Hochmethionindomäne (HMD), abstammend von HSZ, codieren, wobei beide ungewöhnlich reich an der Aminosäure Methionin sind.
  • Das HSZ Protein wird aus einer zentralen, sehr Methionin reichen Region (annähernd 48% Methioninreste), flankiert durch Aminoend- und Carboxyendregionen mit geringerem Methioningehalt (10% Methionin bzw. 7% Methionin), gebildet. Die Zentralregion wird aus Variationen des sich wiederholenden Motifs Met-Met-Met-Pro (Seq ID NR: 27) gebildet. Das verwandte 10 kD Zein Protein hat eine ähnliche aber verschiedene Struktur (siehe Fig. 1). Jedoch ist die zentrale Region des HSZ Proteins etwa zweimal so groß wie die entsprechende Region in dem 10 kD Zein, was den erhöhten Methioningehalt von HSZ erklärt. Die offensichtliche Verdopplung der zentralen Hochmethionindomäne (HMD) in HSZ, verglichen mit 10 kD Zein, schlug vor, daß die zentrale Hochmethionindomäne eine stabile Struktur haben könnte und durch sich selbst exprimiert werden könnte, ein sehr hohes Methioninlagerprotein ergebend.
  • Die Einführung eines chimären Gens, umfassend Samenlagerproteinregulationssequenzen und Methionin reiche Samenlagerproteincodierungssequenz, stellt eine Annäherung zum Verbessern der Ernährungsqualität von Samen aus Erntepflanzen dar. Der Anstieg an Methioningehalt des Samens wird bestimmt durch: (a) den Expressionsspiegel des chimären Gens in der transformierten Ernte, welcher teilweise von den verwendeten samenspezifischen Expressionssignalen abhängt, (b) den Prozentsatz von Methioninresten in der Samenlagerproteincodierungsregion, (c) der Stabilität des in den Samen der transformierten Erntepflanze eingebrachten Proteins, welche teilweise von ihrem richtigen Verarbeiten, intrazellulärem Zieltreffen, Zusammenfügen in Strukturen höherer Ordnung in einigen Fällen und Fähigkeit, Austrocknung zu widerstehen, abhängt, und (d) der Verträglichkeit des eingeführten Proteins mit den nativen Samenproteinen der transformierten Ernte.
  • Transfer der Nucleinsäurefragmente der Erfindung mit geeigneten Regulationssequenzen in eine lebende Zelle führt zu der Herstellung oder Überproduktion des Proteins. Transfer der Nucleinsäurefragmente der Erfindung in eine Pflanze, insbesondere Mais, Sojabohne oder Ölsamenraps, mit geeigneten Regulationssequenzen zum Lenken von Expression des Proteins in den Samen kann zu einem erhöhten Spiegel von Schwefel enthaltenden Aminosäuren, insbesondere Methionin, führen und somit die Ernährungsqualität des Samenproteins für Tiere verbessern.
  • Im Zusammenhang dieser Offenbarung soll eine Anzahl von Ausdrücken verwendet werden. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck " Nucleinsäure" auf ein großes Molekül, welches einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann, gebildet aus Monomeren (Nucleotiden), enthaltend einen Zucker, Phosphat und entweder ein Purin oder Pyrimidin. Ein "Nucleinsäurefragment" ist eine Fraktion eines gegebenen Nucleinsäuremoleküls. In höheren Pflanzen ist Deoxyribonucleinsäure (DNA) das genetische Material, während Ribonucleinsäure (RNA) in den Transfer der Information in DNA in Proteine verwickelt ist. Ein "Genom" ist der gesamte Körper von genetischem Material, enthalten in jeder Zelle eines Organismus. Der Ausdruck "Nucleotidsequenz" bezieht sich auf ein Polymer von DNA oder RNA, welche einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann, wahlfrei synthetische, nicht natürliche oder geänderte Nucleotidbasen enthaltend, fähig des Einbaus in DNA oder RNA Polymere.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "homolog zu" auf die Komplemetarität zwischen der Nucleotidsequenz von zwei Nucleinsäuremolekiilen oder zwischen den Aminosäuresequenzen von zwei Proteinmolekülen. Schätzungen derartiger Homologie werden durch entweder DNA-DNA oder DNA-RNA Hybridisierung unter Bedingungen von Stringenz zur Verfügung gestellt, wie von den Fachleuten gut verstanden wird [wie in Hames und Higgins (Herausgeber) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, U. K. beschrieben]; oder durch den Vergleich von Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Nucleinsäuren oder Proteinen.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich im "wesentlichen homolog" auf Nucleinsäuremoleküle, welche weniger strikte Hybridisierungsbedingungen als diejenigen für homologe Sequenzen erfordern, und bezieht sich auch auf Codieren von DNA Sequenz, welches Basenänderungen umfassen kann, die nicht eine Änderung in der codierten Aminosäure erzeugen, oder welche Basenänderungen umfassen, die eine oder mehrere Aminosäuren ändern können aber nicht auf die funktionellen Eigenschaften des durch die DNA Sequenz codierten Proteins wirken. Somit umfassen die hier beschriebenen Nucleinsäurefragmente Moleküle, welche mögliche Variationen der Nucleotidbasen, abstammend von Deletion, Wiederanordnung, zufälliger oder kontrollierter Mutagenese des Nucleinsäurefragments und sogar gelegentliche Nucleotidsequenznummer, so lange, wie die DNA Sequenzen im wesentlichen homolog sind, umfassen.
  • "Gen" bezieht sich auf ein Nucleinsäurefiagment, das ein spezifisches Protein, einschließend Regulationssequenzen, vorhergehend (5' nicht codierend) und folgend (3' nicht codierend) der Codierungsregion, codiert. "Natives" Gen bezieht sich auf das Gen, wie in Natur mit seinen eigenen Regulationssequenzen gefunden. "Chimäres" Gen bezieht sich auf ein Gen; umfassend heterogene Regulations- und Codierungssequenzen. "Endogenes" Gen bezieht sich auf das native Gen, das üblicherweise an seinem natürlichen Ort in dem Genom gefunden wird. Ein "fremdes" Gen bezieht sich auf ein Gen, das normalerweise nicht in dem Wirtsorganismus gefunden wird, aber das durch Gentransfer eingeführt wird.
  • "Codierungssequenz" bezieht sich auf eine DNA Sequenz, die ein spezifisches Protein codiert und die Nicht-Codierungssequenzen ausschließt. Sie kann eine "nicht unterbrochene Codierungssequenz" bilden, d. h. es mangelt an einem Intron, wie beispielsweise in einer cDNA, oder sie kann ein oder mehrere Introns, gebunden durch entsprechende Spleißstellen, einschließen. Ein "Intron" ist eine Sequenz von RNA, die in das primäre Transcript transkribiert wird, aber welche durch Spaltung und Wieder-Ligasierung der RNA innerhalb der Zelle unter Erzeugen der reifen mRNA entfernt wird, die in ein Protein translatiert werden kann.
  • "Initiationscodon" und "Terminatorcodon" beziehen sich auf eine Einheit von drei benachbarten Nucleotiden in einer Codierungssequenz, die Initiation und Kettentermination von Proteinsynthese (mRNA Translation) spezifiziert. "Offenes Leseraster" bezieht sich auf die Aminosäurensequenz, codiert zwischen Translationsinitiations- und Terminatorcodons einer Codierungssequenz.
  • "RNA Transcript" bezieht sich auf das Produkt, das aus RNA Polymerase-katalysierter Transcription einer DNA Sequenz herrührt. Wenn das RNA Transcript eine perfekte komplementäre Kopie der DNA Sequenz ist, wird sie als das primäre Transcript bezeichnet, oder sie kann eine RNA Sequenz sein, abstammend von posttranscriptionellem Verarbeiten des primären Transcripts und wird als die reife RNA bezeichnet. "Messenger RNA" (mRNA) bezieht sich auf die RNA, die ohne Introns ist, und die in Protein durch die Zelle transiatiert werden kann. "cDNA" bezieht sich auf eine doppelsträngige DNA, die komplementär zu und abstammend von mRNA ist.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich "Regulationssequenzen" auf Nucleotidsequenzen, angeordnet stromaufwärts (5') innerhalb und/oder stromabwärts (3') zu einer Codierungssequenz, welche die Transcription und/oder Expression der Codierungssequenzen kontrollieren, möglicherweise in Verbindung mit der Proteinbiosynthesevorrichtung der Zelle. Diese Nucleotidsequenzen schließen eine Promotorsequenz, eine Translations-Leadersequenz, eine Transcriptionsterminatorsequenz und eine Polyadenylierungssequenz ein.
  • "Promotor" bezieht sich auf eine DNA Sequenz in einem Gen, üblicherweise stromaufwärts (5') zu seiner Codierungssequenz, welche die Expression der Codierungssequenz durch zur Verfligung stellen der Erkennung für RNA Polymerase und andere Faktoren, die für richtige Transcription benötigt werden, kontrolliert. Ein Promotor kann auch DNA Sequenzen enthalten, die in das Binden von Proteinfaktoren verwickelt sind, welche die Wirksamkeit von Transcriptionsinitiation als Reaktion auf physiologische oder Entwicklungsbedingungen kontrollieren. Er kann auch Enhancerelemente enthalten.
  • Ein "Enhancer" ist eine DNA Sequenz, welche Promotoraktivität stimulieren kann. Sie kann ein Mitbewohnerelement des Promotors oder ein heterologes Element, eingeführt zum Erhöhen des Spiegels und/oder Gewebe-Spezifität eines Promotors, sein.
  • "Konstitutive Promotoren" beziehen sich auf diejenigen, die Genexpression in allen Geweben und zu allen Zeiten lenken.
  • "Organspezifische" oder "entwicklungsspezifische" Promotoren, wie hier bezeichnet, sind diejenigen, die Genexpression beinahe ausschließlich in spezifischen Organen, wie beispielsweise Blättern oder Samen, oder bei spezifischen Entwicklungsstufen in einem Organ, wie beispielsweise bei früher oder später Embryogenese, leiten.
  • Der Ausdruck "Expression", wie hier verwendet, soll die Herstellung des Proteinprodukts bedeuten, das durch ein Gen codiert wird. "Überexpression" bezieht sich auf die Herstellung eines Genprodukts in transgenen Organismen, die Produktionsspiegel in normalen oder nicht transformierten Organismen übersteigt.
  • Die "3'-Nicht-Codierungssequenzen" beziehen sich auf den DNA Sequenzteil eines Gens, das ein Transcriptionsterminatorsignal, Polyadenylierungssignal und irgendein anderes Regulationssignal enthält, fähig auf mRNA Verarbeiten oder Genexpression zu wirken. Das Polyadenylierungssignal ist üblicherweise gekennzeichnet durch Beeinßussen der Zugabe von Polyadenylsäurestrecken zu dem 3' Ende des mRNA Vorläufers.
  • Die "5' Nichtcodierungssequenzen" beziehen sich auf den DNA Sequenzteil eines Gens, der eine Promotorsequenz und eine Translations-Leadersequenz enthält.
  • Die "Translations-Leadersequenz" bezieht sich auf denjenigen DNA Sequenzteil eines Gens zwischen dem Promotor und der Codierungssequenz, der in RNA transkribiert wird und in der vollständig verarbeiteten mRNA stromaufwärts (5') des Translationsstartcodons vorhanden ist. Die Translations- Leadersequenz kann Verarbeiten des primären Transcripts zu mRNA, mRNA Stabilität oder Translationswirksamkeit beeinflussen.
  • "Reifes Protein" bezieht sich auf ein post-translationsverarbeitetes Polypeptid ohne dessen Signalpeptid. "Vorläufer"-Protein bezieht sich auf das primäre Translationsprodukt von mRNA. "Signalpeptid" bezieht sich auf die aminoterminale Extension eines Polypeptids, welches in Verbindung mit dem Polypeptid translatiert wird, ein Vorläuferpeptid bildend, und welches für seinen Eintritt in den Ausscheidungsweg benötigt wird. Der Ausdruck "Signalsequenz" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die das Signalpeptid codiert.
  • "Intrazelluläre Lokalisierungssequenz" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die ein intrazelluläres Zielsignal codiert. Ein "intrazelluläres Zielsignal" ist eine Aminosäurensequenz, die in Verbindung mit einem Protein translatiert wird, und es zu einem besonderen sub-zellulären Kompartiment fuhrt. "Endoplasmatisches Retikulum (ER) Stop Transit Signal" bezieht sich auf eine carboxyterminale Extension eines Polypeptids, welche in Verbindung mit dem Polypeptid translatiert wird und ein Protein erzeugt, das in den Ausscheidungsweg eintritt, in dem ER zurückgehalten zu werden. "ER Stop Transit Sequenz" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die das ER Zielsignal codiert. Andere intrazelluläre Zielsequenzen codieren Zielsignale, aktiv in Samen und/oder Blättern und vakuoläre Zielsignale.
  • "Transformation" hier bezieht sich auf den Transfer eines Fremdgens in das Genon eines Wirtsorganismus und seine genetisch stabile Vererbung. Beispiele von Verfahren von Pflanzentransformation umfassen Agrobacterium-behandelte Transformation und beschleunigte-Teilchen oder "Gengewehr" Transformationstechnologie.
  • Rekombinante DNA Technologie bietet das Potential zum Erhöhen des Schwefelaminosäurengehalts von Erntepflanzen. Besonders geeignete Techniken sind: (a) Verfahren für das molekulare Klonieren und in vitro Manipulation von Genen [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press], (b) Einfülming von Genen über Gentrausformation in landwirtschafflich-wichtige Erntepßanzen wie Sojabohne [Chee et al. (1989) Plant Physiol. 91: 1212-1218; Christou et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci U. S. A. 86: 7500-7504; Hinchee et al. (1989) Biotechnology 6: 915-922; EPO Veröffentlichung 0301749 A2], Rapssamen [De Block et al. (1989) Plant Physiol. 91: 694-701] und Mais [Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839] und (c) samenspezifische Expression von eingeführten Genen in transgenen Pflanzen [siehe Goldberg et al. (1989) Cell 56: 149-160; Thompson und Larkins (1989) BioEssays 10: 108-113]. Um diese Technologien zu verwenden, Erntepflanzen mit erhöhtem Schwefelaminosäuregehalt zu entwickeln, ist es wesentlich, kommerziell wichtige Gene zu identifizieren und zu isolieren.
  • Verschiedene bei den experimentellen Manipulationen verwendete Lösungen werden durch ihre gebräuchlichen Namen bezeichnet, wie beispielsweise "SSC", "SSPE", "Denhardt's Lösung", etc. Die Zusammensetzung dieser Lösungen kann durch Bezugnahme auf Anhang B von Sambrook et aL, (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) festgestellt werden.
  • KLONIEREN DES MAIS HSZ GENS
  • Basierend auf der veröffentlichten DNA Sequenz (SEQ ID NR: 5) des Mais 10 kd Zein Gens [Kirihara et al. 1988) Mol. Gen. Genet. 21: 477-484; Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359-370] wurden Oligonucleotide (SEQ ID NR: 6 und 7) für Verwendung als Primer für Polymerasekettenreaktion (PCR) mit genomischer Mais DNA als Matrize konstruiert. Das Produkt der PCR Reaktion wurde aus einem Agarosegel isoliert und radioaktiv durch Nick-Translation für Verwendung als eine Hybridisierungssonde markiert. Eine genomische Mais DNA Bibliothek in dem Vektor X-EMBL-3 wurde von Clontech gekauft, und Plaques wurden mit der PCR-erzeugten Sonde gescreent. Hiervon wurde erwartet, daß es zu der Isolierung eines 10 kD Zein Gens voller Länge, einschließlich seiner 5' und 3' Regulationsregionen, führte.
  • Zwei hybridisierende λ Plaques wurden gereinigt, und das klonierte Mais DNA Fragment wurde ferner charakterisiert. Restriktionsendonucleaseverdauungen und Agarosegelelektrophorese zeigte, daß die zwei Klone identisch waren. Die DNA Fragmente von dem Agarosegel wurden auf Nitrocellulosemembranfiltern "Southern geblottet" und mit radioaktivmarkierter 10 kD Zein DNA, erzeugt durch Nick-Translation, sondiert. Ein einzelnes 7,5 kb BamH I Fragment und ein einzelnes 1,4 kb Xba I Fragment hybridisierten an die Sonde. Diese Fragmente wurden in Phagemid pTZ18R (Pharmacia) für DNA Sequenzanalyse subkloniert.
  • Überraschenderweise war es aus der Sequenz offenkundig, daß das isolierte Gen verwandt zu aber unterschiedlich von dem 10 kd Zein Gen war. Es ist als das Hochschwefelzein-(HSZ)Gen bezeichnet worden. Das DNA Fragment enthält ein offenes Leseraster aus 633 Nucleotiden verglichen mit den 453 Nucleotiden des 10 kD Zein Gens. Das HSZ Protein zeigt 76% Aminosäurensequenzidentität mit dem 10 kD Zein. Jedoch codiert das längere offene Leseraster des HSZ Gens eine Methionin- reiche Domäne, nicht in dem 10 kD Zein Gen vorhanden, welches zu einem Schwefelaminosäurengehalt von 29% (28%) Methionin für das reife HSZ Protein im Vergleich zu 26% (22% Methionin) für das 10 kD Zein führt. Somit codiert das HSZ Gen ein Samenlagerprotein, welches das höchste an Methionin von irgendeinem gegenwärtig bekannten ist. Gut bekannte Genexpressionssignale wie die TATA Box und Polyadenylierungssignal waren bei ähnlichen Positionen in den HSZ und 10 kD Zein Genen. Eine vermeintliche 21 Aminosäurensignalsequenz wird durch das HSZ Gen an dem Aminoende des Vorläuferpolypeptids codiert, ähnlich zu demjenigen des 10 kD Gens.
  • Das DNA Fragment der gegenwärtigen Erfindung kann verwendet werden, im wesentlichen homologe cDNAs und Gene zu isolieren, die Samenlagerproteine aus Mais und anderen Pflanzenspezies, insbesondere einkeimblättrigen Pflanzen, codieren. Isolierung von verwandten Genen ist in der Technik gut bekannt.
  • Die Verwendung von Resiriktionsfragmentlängenpolymorphismus- (RFLP) Markern bei Pflanzenzüchten ist in der Technik gut dokumentiert worden [siehe Tanksley et al. (1989) Bio. Technology 7: 257-264]. Das Nucleinsäureiragment der Erfindung kann auf einer Mais RFLP Karte kartiert werden. Es kann somit als ein RFLP Marker für Eigenschaften, gekoppelt an den kartierten Ort, verwendet werden.
  • MODIFIZIERUNG DES HSZ GENS
  • Das Nucleinsäurefragment der gegenwärtigen Erfindung, das das Schwefelreiche Samenlagerprotein codiert, kann an geeignete Regulationssequenzen angefügt werden und verwendet werden, das Protein in Mikroben, wie beispielsweise Escherichia coli, oder Hefe oder in transgenen Pflanzen, wie beispielsweise Mais, Sojabohne und anderen Erntepflanzen, überzuproduzieren. Eine derartige rekombinante DNA Konstruktion kann entweder das native HSZ Gen oder ein chimäres Gen einschließen. Ein Fachmann kann die Codierungssequenzen aus dem Fragment der Erfindung durch Verwenden und/oder Erzeugen von Restriktionsendonucleasestellen isolieren [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press].
  • Von besonderer Nützlichkeit sind natürlich vorkommende Stellen für Nco I (5'-CCATGG) und Xba I (5'-TCTAGA), die genaue Entfernung des Codieningssequenzstartens mit dem Translation initiierenden Codon ATG und Enden mit dem Translationsstopcodon TAG erlauben. Jedoch waren drei Nco I Stellen in der HSZ Codierungsregion vorhanden. Es war wünschenswert, zwei dieser Stellen zu eliminieren und nur die eine Stelle (Nucleotide 751-756 in SEQ ID NR: 1) beizubehalten, die das Translationsstartcodon einschloß. Ein bevorzugtes DNA Fragment der Erfindung (SEQ ID NR: 2) wurde durch in vitro Mutationsort-gerichtete Mutagenese so erzeugt, daß die zwei Nco I Stellen innerhalb der Codierungssequenz entfernt worden sind, ohne die durch das Gen codierte Aminosäurensequenz zu ändern. Somit ergibt eine vollständige Verdauung der DNA mit Nco I und Xba I ein einzigartiges 637 bp Fragment, das die gesamte Codierungssequenz des Vorläufer HSZ Polypeptids enthält. Um ferner die Konstruktion von chimären Genen zu erleichtern, wurden zusätzliche einzigartige Restriktionsendonucleasestellen unmittelbar nach dem Translationsstopsignal von HSZ hinzugegeben. Oligonucleotide (SEQ ID NK 10 und 11) wurden in die Xba I Stelle eingefugt, Einbringen von zwei neuen Restriktionsstellen, Sma I und Kpn I und Zerstören der Xba I Stelle. Die jetzt einzigartige Xba I Stelle aus Nucleotid 1-6 in SEQ ID NR: 1 und die Ssp I Stelle von Nucleotid 1823-1828 in SEQ ID NR: 1 wurden verwendet, ein Fragment zu erhalten, das die HSZ Codierungsregion plus ihre 5' und 3' Regulationsregionen einschloß. Dieses Fragment wurde in den kommerziell verfügbaren Vektor pTZ19R (Pharmacia) kloniert, mit Xba I und Sma I verdaut, was Plasmid pCCIO ergab. Plasmid pCCIO wurde am 7. Dezember 1990 bei der ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter der Hinterlegungsnummer 68490 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt.
  • Um fähig zu sein, die reife Form des HSZ Proteins zu exprimieren, war es wünschenswert, eine geänderte Form des HSZ Gens mit einer einzigartigen Restriktionsendonucleasestelle an dem Start des reifen Proteins zu erzeugen. Um dieses durchzuführen, wurde ein DNA Fragment unter Verwenden von PCR erzeugt. Oligonucleotidprimer (SEQ ID NR: 12 und 13) wurden so konstruiert, daß das PCR-erzeugte Fragment (SEQ ID NR: 3) eine BspH I Stelle enthielt welches zu einem kohäsiven Ende, identisch zu dem durch eine Nco I Verdauung erzeugtem, fuhrt. Diese Stelle war an der Verbindung der Signalsequenz und der reifen HSZ Codierungssequenz angeordnet. Das PCR-erzeugte Fragment enthielt auch eine Xba I Stelle an dem Translationsende des HSZ Gens.
  • Ein Gen wurde unter Verwenden von PCR Methodologie unter Codieren der Hochmethionindomäne (HMD) von HSZ erzeugt. Oligonucleotide (SEQ ID NR: 14 und 15) wurden konstruiert, eine Nde I Stelle hinzuzufügen, die das Translationsinitiationscodon und eine EcoR I Stelle gerade nach dem Translationsterminator-Codon (siehe SEQ ID NR: 4) einschloß. Diese Stellen erlauben leichte Insertion von HMD in Expressionsvektoren.
  • EXPRESSION VON HSZ IN E. COLI
  • Die HSZ Codierungssequenz wurde in E. coli unter Verwenden des Bacteriophagen T7 RNA Polymerase/T7 Promotorsystems [Studier et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 60-89] exprimiert. Das Nco I-Xba I Fragment, das die HSZ Codierungssequenz enthielt, wurde in einen Expressionsvektor eingefugt. Von diesem Plasmid, als pCC11 bezeichnet, wurde erwartet, das Vorläufer HSZ Protein zu exprimieren. Zusätzlich wurde ein Plasmid, konstruiert, das HSZ Protein ohne seine Signalsequenz, als pCC12 bezeichnet, zu exprimieren, konstruiert. Das reife HSZ codierende DNA Fragment für diese Konstruktion wurde unter Verwenden von PCR, wie zuvor beschrieben, erzeugt und in den Expressionsvektor eingefügt.
  • Zum Nachweisen von Expression der HSZ Polypeptide wurden Plasmide pCC11 und pCC12 in E. coli Stamm HMS174 transformiert, und ein in vivo Markierungsexperiment unter Verwenden von ³&sup5;S- Methionin wurde durchgeführt, wie von Studier und Moffatt beschrieben [(1986) J. Mol. Biol. 189: 113- 130]. Wegen des hohen Methioningehalts des HSZ Proteins liefert dieses ein spezifisches und empfindliches Mittel zum Nachweis von Expression. Zellextrakte wurden auf SDS Polyacrylamidgelen laufengelassen, welche getrocknet und autoradiographiert wurden. Eine hervorragende markierte Proteinbande von Molekulargewicht von etwa 20 kD war sowohl in pCC11 wie pCC12 Extrakten offenkundig. Dieses ist die angenäherte Größe, erwartet für das reife Längen HSZ Polypeptid, und schlug vor, daß das Vorläuferprotein, hergestellt in der pCC11 Transformante, durch E. coli verarbeitet wurde. Als Gesamtzellproteine durch Coomassie Brilliant Blue Färben nach Induktion und SDS Polyacrylamidgelelektrophorese enthüllt waren, war ein hervorragendes induziertes 20 kD Protein in den pCC12 Lysaten (aber nicht in pCCI 11 Lysaten) offenkundig, was den hohen Expressionsspiegel der reifen Form des Proteins anzeigt.
  • Die Nucleinsäurefragmente der Erfindung können verwendet werden, große Mengen von HSZ, HMD oder Gesamtprotein, angereichert an Schwefel enthaltenden Aminosäuren, insbesondere Methionin, über Fermentation von E. coli oder andere Mikroorganismen herzustellen. Um dieses durchzuführen, kann das Nucleinsäurefragment der Erfindung operabel an eine geeignete Regulationssequenz, umfassend eine Promotorsequenz, eine Translations-Leadersequenz und eine 3' Nichtcodierungssequenz, gekoppelt werden. Das chimäre Gen kann dann in einen Mikroorganismus über Transformation eingeführt werden, und der transformierte Mikroorganismus kann unter Bedingungen gezüchtet werden, die zu hoher Expression des chimären Gens führen. Die Zellen, die Protein, angereichert an Schwefel enthaltenden Aminosäuren, enthalten, können gesammelt werden, und das angereicherte Protein kann extrahiert werden. Das HSZ Protein kann dann gereinigt werden.
  • Um große Mengen von HSZ Protein in E. coli herzustellen, wurde Stamm BL21(DE3)pLysE [Studier et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 60-89], transformiert mit pCC12, verwendet. HSZ Protein wurde aus Extrakten von IPTG (Isopropylthio-β-Galactosid)-induzierten Kulturen gereinigt. HSZ Protein wird in einem unlöslichen Niederschlag festgestellt, der leicht durch Niedriggeschwindigkeitszentrifugation des Zellextrakts gesammelt werden kann. Die Mehrheit der zellulären Proteine werden in dem Überstand entfernt. HSZ wird dann selektiv in einer beinahe (> 90%) reinen Form aus den Zentrifugationspellets durch Extraktion mit 70% Isopropanol, enthaltend 10 mM β- Mercaptoethanol, solubilisiert. Zwischen 10 und 100 mg HSZ Protein wurden aus einem Liter Zellkultur erhalten. Weil jetzt bestimmt worden ist, daß Herstellung des HSZ Proteins in E. coli nicht toxisch gegenüber den Zellen ist, können höhere Expressionsspiegel unter Verwenden von Stamm BL21(DE3) [Studier et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 60-89] erzielt werden.
  • EXPRESSION VON HSZ IN PFLANZEN
  • Eine bevorzugte Klasse von Wirten für die Expression der Codienzngssequenz von HSZ oder HMD sind eukaryontische Wirte, insbesondere die Zellen höherer Pflanzen. Besonders bevorzugt unter den höheren Pflanzen und den von ihnen abstammenden Samen sind Sojabohne, Rapssamen (Brassica napus, B. campestris), Sonnenblume (Helianthus annus), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Mais, Tabak (Nicotiana Tubacum), Luzernenart (Medicago sativa), Weizen (Triticum sp), Gerste (Hordeum vulgare), Hafer (Avena sativa, L), Sorghum (sorghum bicolor), Reis (Oryza sativa) und Futtergräser. Expression in Pflanzen wird Regulationssequenzen, funktionell in derartigen Pflanzen, verwenden.
  • Die Expression von Fremdgenen in Pflanzen ist gut begründet [De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 153: 277-291]. Der Ursprung von gewähltem Promotor zum Antreiben der Expression der Codierungssequenz ist nicht kritisch, so lange, wie sie ausreichende Transcriptionsaktivität zum Durchführen der Erfindung durch Erhöhen des Spiegels von translatierbarer mRNA für HSZ oder HMD in dem gewünschten Wirtsgewebe hat. Bevorzugte Promotoren für Expression in allen Pflanzenorganen und insbesondere fur Expression in Blättem schließen diejenigen ein, die die 19S und 35S Transcripte in. Blumenkohlmosaikvirus lenken [Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Hull et al. (1987) Virology 86: 482-493], kleine Untereinheit von Ribulose 1,5-Biphosphatcarboxylase [MorelE et al. (1985) Nature 315: 200; Broglie et al. (1984) Science 224: 838; Hererra-Estrella et al. (1984) Nature 310: 115; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671; Faciotti et al. (1985) Bio/Technology 3: 241], Maiszeinprotein [Matzke et al. (1984) EMBO J. 3: 1525] und Chlorophyll a/b Bindungsprotein [Lampa et al. (1986) Nature 316: 750-752].
  • In Abhängigkeit von der Anwendung kann es wünschenswert sein, Promotoren auszuwählen, die spezifisch in Bezug auf Expression in einem oder mehreren Organen der Pflanze sind. Beispiele umfassen die Licht-induzierbaren Promotoren der kleinen Untereinheit von Ribulose 1,5-Biphosphatcarboxylase, wenn die Expression in photosynthetischen Organen gewünscht ist, oder Promotoren, aktiv spezifisch in Samen.
  • Bevorzugte Promotoren sind diejenigen, die Expression des Proteins spezifisch in Samen erlauben. Dieses kann besonders geeignet sein, weil Samen die Primärquelle von Pflanzenprotein sind, und auch, weil samenspezifische Expression irgendeine potentielle schädliche Wirkung in Nicht-Samenorganen vermeidet. Beispiele von samenspezifischen Promotoren schließen ein, sind aber nicht darauf beschränkt, die Promotoren von Samenlagerproteinen, welche mehr als 50% von Gesamtsamenprotein in vielen Pflanzen darstellen. Die Samenlagerproteine werden streng reguliert, werden beinahe ausschließlich in Samen in einer hoch organspezifischen und stufenspezifischen Weise exprimiert [Higgins et al. (1984) Ann. Rev. Plant Physiol. 35: 191-221; Goldberg et al. (1989) Cell 56: 149-160; Thompson et al. (1989) BioEssays 10: 108-113]. Ferner können verschiedene Lagerproteine bei verschiedenen Stufen von Samenentwicklung exprimiert werden.
  • Es gibt gegenwärtig zahkeiche Beispiele für samenspezifische Expression von Samenlagerproteingenen in transgenen zweikeimblättrigen Pflanzen. Diese schließen Gene von zweikeimblättrigen Pflanzen für Bohnen β-Phaseolin [Sengupta-Gopalan et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3320-3324; Hoffman et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 717-729], Bohnenlectin [Voelker et al. (1987) EMBO J. 6: 3571-3577], Sojabohnenlectin [Okamuro et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8240-8244], Sojabohnenkunitztrypsininhibitor [Perez-Grau et al. (1989) Plant Cell 1: 095-1109], Sojabohnen β-Conglycinin [Beachy et al. (1985) EMBO J. 4: 3047-3053; Barker et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 458-462; Chen et al. (1988) EMBO J. 7: 297-302; Chen et al. (1989) Dev. Genet. 10: 112-122; Naito et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 109-123], Erbsenvicilin [Higgins et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 683-695], Erbsenconvicilin [Newbigin et al. (1990) Planta 180: 461], Erbsenlegumin [Shirsat et al. (1989) Mol. Gen. Genetics 215: 326]; Rapssamennapin [Radke et al. (1988) Theor. Appl. Genet. 75: 685-694] wie auch Gene von einkeimblättrigen Pflanzen, wie beispielsweise für Mais 15 kD Zein [Hoffinan et al. (1987) EMBO J. 6: 3213-3221]; Schernthaner et al. (1988) EMBO J. 7: 1249-1253; Williamson et al. (1988) Plant Physiol. 88: 1002-1007], Gersten β-Hordein [Marris et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10: 359-366] und Weizenglutenin [Colot et al. (1987) EMBO J. 6: 3559-3564] ein. Darüber hinaus behalten Promotoren von samenspezifischen Genen, operabel an heterologe Codierungssequenzen in chimären Genkonstruktionen gekoppelt, auch ihr zeitliches und räumliches Expressionsmuster in transgenen Pflanzen bei. Derartige Beispiele schließen ein Arabidopsis thaliana 25 Samenlagerproteingenpromotor zum Exprimieren von Enkephalinpeptiden in Arabidopsis und B. napus Samen [Vandekerckhove et al. (1989) Bio/Technology 7: 929-932], Bohnenlectin und Bohnen β-Phaseolin Promotoren zum Exprimieren von Luciferase [Riggs et al. (1989) Plant Sci. 63: 47-57] und Weizengluteninpromotoren zum Exprimieren von Chloramphenicolacetyltransferase [Colot et al. (1987) EMBO J. 6: 3559-3564].
  • Von besonderer Verwendung bei der Expression des Nucleinsäurefragments der Erfindung werden die heterologen Promotoren von verschiedenen, umfassend charakterisierten Sojabohnensamenlagerproteingenen sein, wie beispielsweise diejenigen für den Kunitz Trypsininhibitor [Jofuku et al. (1989) Plant Cell 1: 1079-1093; Perez-Grau et al. (1989) Plant Cell 1: 1095-1109], Glycinin [Nielson et al. (1989) Plant Cell 1: 313-328], β-Conglycinin [Harada et al. (1989) Plant Cell 1: 415425]. Promotoren von Genen für α'- und β-Untereinheiten von Sojabohnen β-Conglycininlagerprotein sind besonders geeignet beim Exprimieren der HSZ mRNA in den Keimblättem bei Mittel- bis Spätstufen von Sojabohnensamenentwicklung [Beachy et al. (1985) EMBO J. 4: 3047-3053; Barker et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 458-462; Chen et al. (1988) EMBO J. 7: 297-302; Chen et al. (1989) Dev. Genet. 10: 112-122; Naito et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 109-123] in transgenen Pflanzen, weil: a) es wenig Positionswirkung auf ihre Expression in transgenen Samen gibt, und b) die zwei Promotoren unterschiedliche zeitliche Regulierung zeigen: der Promotor für das α'-Untereinheitsgen wird einige wenige Tage vor demjenigen für das β-Untereinheitsgen exprimiert.
  • Auch von besonderer Verwendung bei der Expression der Nucleinsäurefragmente der Erfindung werden die heterologen Promotoren von verschiedenen umfassend charakterisierten Maissamenlagerproteingenen, wie beispielsweise denjenigen von dem 10 kD Zein [Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359-370], dem 27 kD Zein [Prat et al. (1987) Gene 52: 51-49; Gallardo et al. (1988) Plant Sci. 54: 211-281] und dem 19 kD Zein [Marks et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 16451-16459] sein. Die relativen Transcriptionsaktivitäten dieser Promotoren in Mais sind berichtet worden [Kodrzyck et al. (1989) Plant Cell 1: 105-114], die eine Basis zum Wählen eines Promotors für Verwendung in chimären Genkonstruktionen für Mais zur Verfügung stellen.
  • Richtige Expressionsspiegel von HSZ oder HMD mRNA können die Verwendung von unterschiedlichen chimären Genen unter Verwenden unterschiedlicher Promotoren erfordern. Derartige chimäre Gene können in Wirtspflanzen entweder zusammen in einem einzelnen Expressionsvektor oder aufeinanderfolgend unter Verwenden von mehr als einem Vektor übertragen werden.
  • Es wird in Betracht gezogen, daß die Einführung von Enhancern oder Enhancer-ähnlichen Elementen in entweder den nativen HSZ Promotor oder in andere Promotorkonstruktionen auch erhöhte Spiegel von primärer Transcription für HSZ oder HMD zum Durchführen der Erfindung liefern wird. Dieses würde virale Enhancer, wie beispielsweise den in dem 35S Promotor festgestellten [Odell et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10: 263-272], Enhancer von den Opingenen [Fromm et al. (1989) Plant Cell 1: 977- 984] oder Enhancer von irgendeiner anderen Quelle einschließen, die zu erhöhter Transcription führen, wenn in einen Promotor, operabel an das Nucleinsäurefragment der Erfindung gekoppelt, plaziert.
  • Von besonderer Bedeutung ist das DNA Sequenzelement, isoliert aus dem Gen für die α'- Untereinheit von β-Conglycinin, das 40-fache samenspezifische Verstärkung einem konstitutiven Promotor verleihen kann [Chen et al. (1988) EMBO J. 7: 297-302; Chen et al. (1989) Dev. Genet. 10: 112-122]. Ein Fachmann kann leicht dieses Element isolieren, und es innerhalb der Promotorregion von irgendeinem Gen einfügen, um samenspezifische verstärkte Expression mit dem Promotor in transgenen Pflanzen zu erhalten. Insertion eines derartigen Elements in irgendein samenspezifisches Gen, das zu unterschiedlichen Zeiten als das β-Conglyciningen exprimiert wird, führt zu Expression in transgenen Pflanzen für eine längere Periode während Samenentwicklung.
  • Die Erfindung kann auch durch eine Mannigfaltigkeit von anderen Verfahren unter Erhalten des gewünschten Endes durchgeführt werden. Bei einer Form basiert die Erfindung auf Modifizieren von Pflanzen unter Herstellen von erhöhten HSZ Proteinspiegeln vermöge des Besitzens signifikant größerer Zahlen von Kopien der HSZ.
  • Irgendeine 3' Nichtcodierungsregion, fähig, ein Transcriptionstenninatorsignal, ein Polyadenylierungssignal und andere Regulationssequenzen zu liefern, die für die richtige Expression der HSZ Codierungsregion benötigt werden, können verwendet werden, die Erfindung durchzuführen. Dieses würde das native 3' Ende des (der) HSZ Gens (e), das 3' Ende von einem heterologen Zeingen, das 3' Ende von irgendeinem Lagerprotein, wie beispielsweise das 3' Ende des Sojabohnen-β-Conglyciningens, das 3' Ende von viralen Genen, wie beispielsweise das 3' Ende des 35S oder des 19S Blumenkohhnosaikvirustranscripts, das 3' Ende von den Opinsynthesegenen, die 3' Enden von Ribulose 1,5-Biphosphatcarboxylase oder Chlorophyll a/b Bindungsprotein oder 3' Endsequenzen von irgendeiner Quelle einschließen, so daß die verwendete Sequenz die notwendige Regulationsinformation innerhalb ihrer Nucleinsäurensequenz liefert, zur richtigen Expression der Promotor/HSZ oder der Promotor/HMD Codierungsregionkombination zu führen, an die sie operabel gekoppelt ist. Es gibt zahkeiche Beispiele in der Technik, die die Geeignetheit von verschiedenen 3' Nicht-Codierungsregionen lehren [beispielsweise siehe Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1: 671-680].
  • DNA Sequenzen, die intrazelluläre Lokalisierungssequenzen codieren, können zu der HSZ oder HMD Codierungssequenz hinzugegeben werden, wenn für die richtige Expression der Proteine zum Durchfuhren der Erfindung benötigt. Somit könnte die native Signalsequenz von HSZ durch eine Signalsequenz entfernt oder ersetzt werden, von der bekannt ist, in der Zielzelle zu wirken. Wenn die Signalsequenz entfernt wäre, würde von dem HSZ Protein erwartet werden, in dem Cytoplasma der Zelle zurückzubleiben. Alternativ könnte die Einkeimblatt-(moncot)Signalsequenz von HSZ durch die Signalsequenz von der β Untereinheit von Phaseolin aus dem Bohnen Phoseolus vulgaris oder die Signalsequenz aus der α' Untereinheit von β-Conglycinin aus Sojabohe ersetzt werden [Doyle et al. 1986) J. Biol. Chem. 261: 9228-9238], welche in Zweikeimblatt-(dicot)Pflanzen wirken. Hoffinan et al. [(1987) EMBO J. 6: 3213-3221] zeigte, daß die Signalsequenz des Einkeimblatt(moncot)Vorläufers eines 15 kD Zeins das Protein in den Ausscheidungsweg lenkte und wurde auch korrekt in transgenen Tabaksamen verarbeitet. Jedoch verblieb das Protein nicht in dem endoplasmatischen Retikulum, wie es bei Mais der Fall ist. Um das Protein in dem endoplasmatischen Retikulum zurückzuhalten, kann es notwendig sein, Stoptransitsequenzen hinzuzufügen. Es ist in der Technik bekannt, daß die Zugabe von DNA Sequenzen, die die Aminosäurensequenz [Lys-Asp-Glu-Leu] (SEQ ID NR: 28) an dem Carboxylende des Proteins codieren, Proteine in dem Lumen des endoplasmatischen Retikulums zurückhält [Munro et al. (1987) Cell 48: 899-907; Pelham (1988) EMBO J. 7: 913-918; Pelham et al. (1988) EMBO J. 7: 1757-1762; Inohara et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 3564-3568; Hesse et al. (1989) EMBO J. 8: 2453-2461]. In einigen Pflanzen sind Samenlagerproteine in den Vakuolen der Zelle lokalisiert. Um die Erfindung durchzuführen, kann es notwendig sein, das HSZ oder HMD Protein zu der Vakuole dieser Pflanzen durch Hinzugeben einer vakuolären Zielsequenz zu lenken. Eine kurze Aminosäurendomäne, die als eine vakuoläre Zielsequenz dient, ist aus Bohnenphytohemagglutinin identifiziert worden, welches sich in Proteinlagervakuolen von Keimblättern anreichert [Tague et al. (1990) Plant Cell 2: 533-546]. In einem anderen Bericht wurde eine carboxylterminale Aminosäurensequenz, notwendig zum Lenken von Gerstenlectin zu Vakuolen in transgenem Tabak, beschieben [Bednarek et al. (1990) Plant Cell 2: 1145- 1155].
  • KONSTRUKTION VON CHIMÄREN GENEN FÜR EXPRESSION VON HSZ IN PFLANZEN
  • Drei samenspezifische Genexpressionskassetten wurden für Konstruktion von chimären Genen für Expression von HSZ in Pflanzen verwendet. Die Expressionskassettten enthielten die Regulationsregionen von drei hoch exprimierten Samenlagerproteingenen:
  • 1) die β Untereinheit von Phaseolin aus dem Bohnen Phaseolus vulgaris,
  • 2) die α' Untereinheit von β-Conglycinin aus Sojabohne und
  • 3) das 10 kD Zein aus Mais.
  • Die Kassetten sind schematisch in Fig. 2 gezeigt. Sie haben jede eine einzigartige Nco I Stelle, unmittelbar der 5' Regulationsregion folgend, und zusätzlich einige oder alle der Stellen Xba I, Sma I und Kpn I, unmittelbar der 3' Regulationsregion vorangehend.
  • Das Nco I-Xba I Fragment, welches die gesamte HSZ Codierungsregion (SEQ ID NR: 2) enthielt, und das BspH I-Xba I Fragment, das das Gen ohne die Signalsequenz, d. h. die reife Proteincodierungssequenz (SEQ ID NR: 3), enthielt, wurden in die Phaseolin und β- Conglycininexpressionskassetten (Fig. 2) eingeführt, welche mit Nco I und Xba I verdaut worden waren. Für Einfügung in die 10 kD Zeinkassette wurde das die HSZ Codienmgsregion enthaltende Nco I-Sma I Fragment in Nco I-Sma I verdaute 10 kd Zeinkassette eingeführt.
  • Verschiedene Verfahren zum Transformieren von Zellen von höheren Pflanzen gemäß der gegenwärtigen Erfindung sind den Fachleuten zugänglich (siehe EPO Veröffentlichungen 0295959 A2 und 0138341 Al). Derartige Verfahren umfassen diejenigen, die auf Transformationsvektoren, basierend auf den Ti und Ri Plasmiden von Agrobacterium spp., basieren. Es wird besonders bevorzugt, den binären Typ dieser Vektoren zu verwenden. Ti-abstammende Vektoren transformierten eine umfassende Mannigfaltigkeit von höheren Pflanzen, einschließlich einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Pflanzen, wie beispielsweise Sojabohne, Baumwolle und Raps [Pacciotti et al. (1985) Bio/Technology 3: 241; Byrne et al. (1987) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 8: 3; Sukhapinda et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 209-216; Lorz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199 178; Potrykus (1985) Mol. Gen. Genet. 199 : 183].
  • Die Phaseolin-HSZ chimären Genkassetten wurden in den Vektor pZS97K (Fig. 3) eingeführt, welcher Teil eines binären Ti Plasmidvektorsystems [Bevan (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711-8720] von Agrobacterium tumefaciens ist. Der Vektor enthält: (1) das chimäre Gen Nopalinsynthase/Neomycinphosphotransferase (nos: NPT II) als einen selektierbaren Marker für transformierte Pflanzenzellen [Bevan et al. (1983) Nature 304: 184-186], (2) die linken und rechten Grenzen der T-DNA des Ti Plasmids [Bevan (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711-8720], (3) das E. coli lacZ αkomplementierende Segment [Vieria und Messing (1982) Gene 19: 259-267] mit einzigartigen Restriktionsendonucleasestellen für EcoR I, Kpn I, BamH I und Sal I, (4) den bakteriellen Replikationsursprung von dem Pseudomonas Plasmid pVSI [Itoh et al. (1984) Plasmid 11: 206-220] und 5) das Bakterienneomycinphosphotransferasegen von Tn5 [Berg et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72: 3628-3632] als einen selektierbaren Marker für transformiertes A. tumefaciens.
  • Die binären Vektoren, die die chimären HSZ Gene enthalten, wurden durch triparenterale Paarungen [Ruvkin et al. (1981) Nature 289: 85-88] auf Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 übertragen [Hockema et al (1983) Nature 303: 179-180]. Die Agrobacterium-Transformanten wurden verwendet, Tabakblattscheiben anzuimpfen [Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231]. Pflanzen wurden in selektivem, Kanamycin enthaltendem Medium wiedergewonnen.
  • Andere Transformantenverfahren sind den Fachleuten zugänglich, so wie direkte Aufnahme von Fremd DNA Konstruktionen [siehe EPO Veröffentlichung 0295959 A2], Elektroporationstechniken [siehe Fromm et al. (1986) Nature (London) 319: 791] oder ballistisches Hochgeschwindigkeitsbombardement mit Metallteilchen, die mit den Nucleinsäurekonstruktionen überzogen waren [siehe Kline et al. (1987) Nature (London) 327 : 70 und siehe U. S. Pat. Nr. 4945050]. Sowie einmal transformiert, können die Zellen von den Fachleuten wiedergewonnen werden.
  • Von besonderer Relevanz sind die kürzlich beschriebenen Verfahren zum Transformieren von Fremdgenen in kommerziell wichtige Feldfrüchte, wie beispielsweise Rapssamen [siehe De Block et al. (1989) Plant Physiol. 91: 694-701], Sonnenblume [Everitt et al. (1987) Bio/Technology 5 : 1201], Sojabohne [McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6 : 923; Hinchee et al. (1988)Bio/Technology 6 : 915; Chee et al. (1989) Plant Physiol. 91 : 1212-1218; Christou et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 7500-7504; EPO Veröffentlichung 0301749 A2] und Mais [Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618; Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839].
  • BEISPIELE
  • Die gegenwärtige Erfindung wird ferner in den folgenden BEISPIELEN definiert, in denen alle Teile und Prozentsätze sich auf das Gewicht beziehen, und Grade Celsius sind, sofern nicht anders festgestellt. Es sollte verstanden werden, daß diese BEISPIELE, während bevorzugte Ausfbhrungsformen der Erfindung angebend, nur mittels Veranschaulichung gegeben sind. Aus der zuvor angegeben Diskussion und diesen Beispielen kann ein Fachmann die wesentlichen Eigenschaften dieser Erfindung ermitteln, und kann, ohne vom Wesen und Umfang davon abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifikationen der Erfindung machen, sie an verschiedene Verwendungen und Bedingungen anzupassen.
  • BEISPIEL 1 MOLEKULARES KLONIEREN DES HSZ GENS
  • Eine genomische Bibliothek von Mais in Bakteriophage lambda wurde von Clontech (Palo Alto, Kalifornien) gekauft. Datenblätter von dem Lieferer zeigten, daß die Mais DNA von sieben Tage alten in der Dunkelheit gezüchteten Keimlingen war. Der Vektor war λ-EMBL-3 tragende BamHl Fragmente, 15 kb an Durchschnittsgröße. Ein Titer von 1 bis 9 · 10&sup9; Plaque bildenden Einheiten (pbe)/ml war von dem Lieferer angegeben. Bei seiner Ankunft wurde die Bibliothek getitert und enthielt 2,5 · 10&sup9; pbe/ml.
  • Das Protokoll zum Screenen der Bibliothek durch DNA Hybridisierung wurde von dem Verkäufer zur Verfügung gestellt. Etwa 30 000 pbE wurden pro 150-mm Platte auf insgesamt 15 Luria Broth (LB) Agarplatten plattiert, was 450 000 Plaques ergab. Plattieren wurde unter Verwenden von E. coli LE392, gezüchtet in LB + 0,2% Maltose als dem Wirt und LB-7,2% Agarose als dem Plattierungsmedium, durchgeführt. Die Plaques wurden auf Nitrocelluloseflhtern (Millipore HATF, 0,45 mM Porengröße) absorbiert, in 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-Cl pH 7,5 denaturiert und in 3XSSC [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press] gespült. Die Filter wurden auf Whatman 3MM Papier geblottet und in einem Vakuumofen bei 80ºC zwei Stunden lang erhitzt, feste Verankenmg von Phagen DNA in den Membranen zu erlauben.
  • Eine Hybridisierungssonde wurde erzeugt, die Bibliothek in Bezug auf ein Hochmethionin 10 kD Zeingen [Kirihara et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 211: 477-484] neben seinen 5' und 3' Flankierungsregionen zu sieben. Zwei Oligonucleotide, 30 Basen lang, dieses Gen flankierend, wurden unter Verwenden eines Applied Biosystems DNA Synthesizers synthetisiert. Oligomer SM 56 (SEQ ID NR: 6) codiert den positiven Strang, der die ersten 10 Aminosäuren überspannt:
  • Oligomer CFC77 (SEQ ID NR: 7) codiert den negativen Strang, der die letzten 10 Aminosäuren überspannt:
  • Diese wurden verwendet, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) die 10 kD Codierungsregion unter Verwenden von Mais genomischer DNA (B85 Stamm) als der Matrize zu erzeugen. PCR wurde unter Verwenden eines Perkin-Elmer Cetus Kits gemäß den Instruktionen des Verkäufers auf einem Temperaturwechsler, hergestellt von der gleichen Gesellschaft, durchgeführt. Das Reaktionsprodukt, wenn auf einem 1% Agarosegel laufengelassen und mit Ethidiumbromid gefärbt, zeigte eine starke DNA Bande der erwarteten Größe für das 10 kD Zeingen, 450 bp, mit einer schwachen Bande bei etwa 650 bp. Die 450 bp Bande wurde auf DEAE Cellulosemembran (Schleicher & Schuell) elektroeluiert und anschließend von der Membran bei 65ºC mit 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0 eluiert. Die DNA wurde Ethanol gefällt und mit 70% Ethanol gespült und getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde in 10 ul Wasser resuspendiert, und ein Aliquot (üblicherweise 1 ul) wurde für einen anderen Satz von PCR Reaktionen verwendet, wodurch durch asymmetrisches Primem einzelsträngige lineare DNAs erzeugt wurden. Dafür waren die Primer SM56 und CFC77 in einem 1 : 20 Molverhältnis und 20 : 1 Molverhältnis vorhanden. Die Produkte, sowohl positive wie negative Stränge des 10 kD Zein Gens, wurden Phenol extrahiert, Ethanol gefüllt und durch NACS (Bethesda Research Laboratories) Säulen unter Entfernen der Überschußoligomere geleitet. Die Eluate wurden zweimal Ethanol gefüllt, mit 70% Ethanol gespült und getrocknet. DNA Sequenzieren wurde unter Verwenden der angemessenen Komplementärprimer und eines Sequenase Kits von United States Biochemicals Company gemäß den Instruktionen des Verkäufers durchgeführt. Die Sequenz des PCR Produkts war identisch zu der veröffentlichten Sequenz des 10 kD Zein Gens. Eine radioaktive Sonde wurde durch Verwenden von Nick-Translation des PCR-erzeugten 10 kD Zeingens unter Verwenden von ³²P-dCTP durchgeführt, und ein Nick-Translationskit von Bethesda Research Laboratories gekauft.
  • Die fünfzehn 150-mm Nitrocellulosefllter, die die X Phagen Plaques trugen, wurden unter Verwenden von radioaktiver 10 10 Gensonde gescreent. Nach vier Stunden Vorhybridisieren bei 60ºC in 5OXSSPE, 5X Denhardt's [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 0,1% SDS, 100 gIml Kalbsthymus DNA wurden die Filter auf frischen Hybridisierungsmix übertragen, der das denaturierte radioaktiv markierte 10 kD Zein Gen (m/ml) enthielt, und über Nacht bei 60ºC gelagert. Sie wurden den folgenden Tag unter stringenten Bedingungen gespült: eine Stunde bei Raumtemperatur in 2XSSC - 0,05% 5DS und eine Stunde bei 68ºC in 1XSSC - 0,1% SDS. Blotten auf 3MM Whatman Papier folgte, dann Lufttrocknen und Autoradiographie bei -70ºC mit Kodak XAR-5 Filmen mit Du Pont Cronex® intensivierenden Abschirmungen. Aus diesen Autoradiogrammen wurden 20 Hybridisierungsplaques identifiziert. Diese Plaques wurden von der ursprünglichen Petriplatte aufgehoben und bei einer Verdünnung herausplattiert, etwa 100 Plaques pro 80- mm Platte zu ergeben. Diese Plaques wurden auf Nitrocellulosefiltern absorbiert und unter Verwenden des gleichen Verfahrens resondiert. Nach Autoradiographie zeigte nur einer der ursprünglichen Plaques, Nummer 10, zwei hybridisierende Plaques. Diese Plaques wurden mit der Sonde ein drittes Mal getestet; alle Nachkommenplaques hybridisierten, was angab, daß reine Klone isoliert worden waren.
  • DNA wurde aus diesen zwei Phagenklonen, λ 10-1, λ 10-2, unter Verwenden des Protokolls für DNA Isolierung aus flüssigen %-Phagen Lysaten von kleinem Maßstab hergestellt (Ansul et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Seite 1.12.2, 1.13.5-6). Restriktionsendonucleaseverdauungen und Agarosegelelektrophorese zeigten, daß die zwei Klone identisch waren. Die DNA Fragmente aus dem Agarosegel wurden "Southern-geblottet" [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press] auf Nitrocellulosemembranflltern und mit radioaktivmarkierter 10 kD Zein DNA, erzeugt durch Nick Translation, sondiert. Ein einzelnes 7,5 kb BamH I Fragment und ein einzelnes 1,4 kb Xba I Fragment hybridisierten an die Sonde.
  • Das 7,5 kb BamH I Fragment wurde aus einer BamH I Verdauung des λ DNA Laufs auf einem 0,5% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) isoliert. Die 7,5 kb Bande wurde herausgeschnitten, geschmolzen und in 0,5 M NaCl verdünnt und auf eine NACS Säule geladen, welche dann mit 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, pH 7,2, 1 mM EDTA gewaschen wurde, und das Fragment mit 2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, pH 7,2, 1 mM EDTA eluiert. Dieses Fragment wurde an das Phagemid pTZ18R (Pharmacia) ligasiert, welches mit BamH I gespalten worden war, und mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase behandelt [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press], wodurch Ligasierung des Phagemids an sich selbst verhindert wurde. Subklone mit diesen Fragmenten in beiden Orientierungen im Hinblick auf die pTZ18R DNA wurden unter Verfolgen von Transformation von E. coli erhalten.
  • Ein Xba I Verdautes der klonierten λ Phagen DNA wurde auf einem 0,8% Agarosegel laufengelassen, und ein 1,4 kb Fragment wurde unter Verwenden von DEAE Cellulosemembran (gleiches Verfahren wie für das zuvor beschriebene PCR-erzeugte 10 kD Zein DNA Fragment) isoliert. Dieses Fragment wurde an pTZ18R Schnitt mit Xba I in der gleichen Weise, wie zuvor beschrieben, ligasiert. Subklone mit diesen Fragmenten in beiden Orientierungen im Hinblick auf die gTZ18R DNA, als pX8 und pX10 bezeichnet, wurden unter Verfolgen von Transformation von E. coli erhalten. Einzelsträngige DNAs wurden aus den Subklonen unter Verwenden des von Pharmacia zur Verfügung gestellten Protokolls hergestellt. Die gesamten 1,4 kb Xba I Fragmente wurden sequenziert. Zusätzliche 700 Basen, benachbart zu dem Xba I Fragment, wurden aus dem BamH I Fragment in Klon pB3 (Fragment pB3 ist in der gleichen Orientierung wie pX8) sequenziert, wobei insgesamt 2123 Basen von Sequenz (SEQ ID NR: 1) erhalten wurden.
  • BEISPIEL 2 MODIFIZIERUNG DES HSZ GENS DURCH MUTATIONSORT-GERICHTETE MUTAGENESE
  • Drei Nco I Stellen waren in dem 1,4 kD Xba I Fragment vorhanden, das das HSZ Gen trug, alle in der HSZ Codierungsregion. Es war wünschenswert, nur eine dieser Stellen (Nucleotide 751-756 in SEQ ID NR: 1) beizubehalten, die das Translationsstartcodon einschloß. Deshalb wurden die Nco I Stellen an Positionen 870-875 und 1333-1338 durch Oligonucleotid-gerichtete Mutationsort-spezifische Mutagenese eliminiert [siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Die für die Mutagenese synthetisierten Oligonucleotide waren:
  • CFC99 ATGAACCCTT GGATGCA (SEQ ID NR: 8)
  • CFC98 CCCACAGCAA TGGCGAT (SEQ ID NR: 9)
  • Mutagenese wurde unter Verwenden eines Kits, gekauft von Bio-Rad (Richmond, CA), unter Verfolgen des von dem Verkäufer zur Verfügung gestellten Protokolls durchgeführt.
  • Das Verfahren änderte das A zu T bei 872 und das C zu A bei 1334. Diese waren beide an der dritten Position ihrer entsprechenden Codons und führten zu keiner Änderung in der durch das Gen codierten Aminosäurensequenz, wobei C C A zu C C T noch für Pro codierte, und G C C zu G C A noch für Ala codierte. Der Plasmidklon, der das modifizierte HSZ Gen mit einer einzelnen Nco I Stelle an dem ATG Startcodon enthielt, wurde als pX8 m genannt. Weil das native HSZ Gen eine einzigartige Xba I Stelle an dem Stopcodon des Gens (1384-1389, SEQ ID NR: 1) hat, ergibt eine vollständige Verdauung der DNA mit Nco I und Xba I ein 637 bp Fragment, das die gesamte Codierungssequenz des Vorläufer HSZ Polypeptids (SEQ ID NR: 2) enthält.
  • Es war wünschenswert, eine Form des HSZ Gens mit alternativen einzigartigen Restriktionsendonucleasestellen gerade nach dem Ende der Codiemngsregion zu erzeugen. Um dieses durchzuführen, wurden Oligonucleotide CFC104 (SEQ ID NR: 10) und CFC105 (SEQ ID NR: 11):
  • CFC104 5'-CTAG CCCGGGTAC -3' (SEQ ID NR: 10)
  • CFC 105 3'- GGGCCCATGGATC -5' (SEQ ID NR: 11)
  • reassozüeren gelassen und in die Xba I Stelle ligasiert, wobei zwei neue Restriktionsstellen, Sma I und Kpn I, eingeführt wurden, und die Xba I Stelle zerstört wurde. Die jetzt einzigartige Xba I Stelle von Nucleotid 1-6 in SEQ ID NR: 1 und die Ssp I Stelle von Nucleotid 1823-1828 in SEQ ID NR: 1 wurden verwendet, ein Fragment zu erhalten, das die HSZ Codierungsregion plus ihre 5' und 3' Regulationsregionen einschloß. Dieses Fragment wurde in den kommerziell verfügbaren Vektor pTZ19R (Pharmacia), verdaut mit Xba I und Sma I, kloniert, was das Plasmid pCC10 ergab.
  • Es war wünschenswert, eine geänderte Form des HSZ Gens mit einer einzigartigen Restriktionsendonucleasestelle an dem Start des reifen Proteins zu erzeugen, d. h. mit der entfernten Aminoendsignalsequenz. Um dieses durchzuführen, wurde ein DNA Fragment unter Verwenden von PCR erzeugt, wie in BEISPIEL 1 beschrieben. Matrizen DNA für die pCR Reaktion war Plasmid pX8m.
  • Oligonucleotidprimer für die Reaktion waren:
  • CFC106 5'-CCACTTCATGACCCATATCCCAGGGCACTT-3' (SEQ ID NR: 12)
  • CFC88 5'-TTCTATCTAGAATGCAGCACCAACAAAGGG-3' (SEQ ID NR: 13)
  • Das CFC106 (SEQ ID NR: 12) Oligonucleotid lieferte das PCR-erzeugte Fragment mit einer BspH I Stelle (unterstrichen), welche, wenn mit BspH I verdaut, zu einem kohäsiven Ende fuhrt, identisch zu demjenigen, das durch eine Nco I Verdauung erzeugt wurde. Diese Stelle war an der Verbindung der Signalsequenz und der reifen HSZ Codierungssequenz lokalisiert. Das CFC88 (SEQ ID NR: 13) Oligonucleotid lieferte das PCR-erzeugte Fragment mit einer Xba I Stelle (unterstrichen) an dem Translationsende des HSZ Gens. Das durch Verdauung des pCR-erzeugten Fragments erhaltene BspH I- Xba I Fragment (SEQ ID NR: 3) codiert die reife Fonn des HSZ bei der Zugabe eines Methioninrestes an dem Aminoende des Proteins, wodurch Initijerung der Translation erlaubt wird.
  • BEISPIEL 3 EXPRESSION DES HSZ GENS IN E. COLI
  • Um die HSZ Codierungssequenz in E. coli zu exprimieren, wurde der Bakterienexpressionsvektor pBT430 verwendet. Dieser Vektor ist ein Derivat von pET-3a [Rosenberg et al. (1987) Gene 56: 125-135], welches das Bakteriophagen T7 RNA Polymerase/T7 Promotorsystem verwendet. Plasmid pBT430 wurde konstruiert durch erstes Zerstören der EcoR I und Hind III Stellen in pET-3a an ihren ursprünglichen Positionen. Ein Oligonucleotidadaptor, welcher EcoR I und Hind III Stellen enthielt, wurde dann an der BamH I Stelle von pET3a eingeführt. Dieses erzeugte pET-3aM mit zusätzlichen einzigartigen Klonierungsstellen für Insertion von Genen in den Expressionsvektor. Dann wurde die Nde I Stelle an der Position der Translationsinitiierung in eine Nco I Stelle unter Verwenden von Oligonucleotid-gerichteter Mutagenese umgewandelt. Die DNA Sequenz von pET-3aM in dieser Region, 5'-CATATGG (Nde I Stelle unterstrichen) wurde zu 5'-CCCATGG (Nco I Stelle unterstrichen) in pBT430 umgewandelt.
  • Das Nco I-Xba I Fragment von pX8 m (SEQ ID NR: 2, siehe Beispiel 2) wurde aus einem Agarosegel unter Durchführen von Elektrophorese unter Verwenden von DEAE Cellulosemembran, wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Dieses Fragment wurde an zwei reassozüerte Oligonucleotide, CFC104 (SEQ ID NR: 10) und CFC105 (SEQ ID NR: 11), ligasiert
  • CFC104 5'-CTAGCCCGGGTAC -3' (SEQ ID NR: 10)
  • CFC105 3'- GGGCCCATGGATC -5' (SEQ ID NR: 11)
  • wobei zwei neue Restriktionsstellen, Sma I und Kpn I an dem Xba I Ende des Fragments eingeführt wurden. Ligasierung wurde durch 10 Minuten Erhitzen bei 65ºC beendet. Die Ligasierungsprodukte wurden mit Sma I verdaut, wobei ein 3' glattendiges Fragment belassen wurde. Expressionsvektor pBT430 wurde mit EcoR I verdaut, und die kohäsiven Enden wurden durch Zugabe von dATP, dTTP und dem Klenowfragment von E. coli DNA Polymerase aufgefüllt. Die glattendige Vektor DNA wurde dann mit Nco I verdaut, und die Reaktionsmischung wurde Phenol-extrahiert und zweimal Ethanol gefällt. Das 640 bp Nco I-Sma I Fragment, das die HSZ Codierungsregion enthielt, wurde an den Nco I-glatten pBT430 Vektor ligasiert. Ein Klon, der ein als pCC11 bezeichnetes Plasmid enthielt, wurde durch Screenen von E. coli Transformanten in Bezug auf das gewünschte rekombinante Produkt identifiziert. Man erwartete, das dieses Plasmid das Vorläufer HSZ Protein exprimierte.
  • Ein Plasmid, konstruiert, das HSZ Protein ohne dessen Signalsequenz in E. coli zu exprimieren, wurde auch konstruiert. Das reife HSZ codierende DNA Fragment fir diese Konstruktion wurde unter Verwenden von PCR mit Plasmid pX8m als Matrize und Oligonucleotiden CFC106 (SEQ ID NR: 12) und CFC88 (SEQ ID NR: 13) als Primer, wie in Beispiel 2 beschrieben, erzeugt:
  • Das CFC106 (SEQ ID NR: 12) Oligonucleotid lieferte das PCR Fragment mit einer BspH I Stelle (zuvor unterstrichen), welche kohäsive Enden identisch zu Nco I erzeugt. Die ATG Sequenz innerhalb der Stelle ist der Translationsinitijerungscodon, und die ihm folgende ACC Sequenz codiert den Threoninrest an dem Aminoende des reifen Proteins. Die Xba I Stelle in dem CFC88 (SEQ ID NR: 13) Oligonucleotid (zuvor unterstrichen) lieferte eine passende Klonierungsstelle an dem Ende der Codierungssequenz. Das PCR Reaktionsprodukt wurde in 2 M Ammoniumacetat, 70% Ethanol zweimal unter Entfernen von Überschußoligonucleotidprimem gefällt. Die Enden des DNA Fragments wurden durch Reaktion mit dem Klenow Fragment von E. coli DNA Polymerase in der Anwesenheit aller vier Deoxyribonucleotidtriphosphate glatt gemacht. Die Reaktionsprodukte wurden mittels Agarosegelelektrophorese getrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Die vorherrschende 570 bp Bande wurde unter Verwenden von DEAE Cellulosemembran, wie zuvor beschrieben, eluiert. Die DNA wurde dann mit BspH I verdaut, zweimal Ethanol gefällt und an das gleiche, wie zuvor beschrieben, Nco I-glatte pBT430 Expressionsvektorfragment ligasiert. Ein Klon, der ein als pCC12 bezeichnetes Plasmid enthielt, wurde durch Screenen von E, coli Transformanten in Bezug auf das gewünschte Rekombinationsprodukt identifiziert. Das klonierte PCR-erzeugte Fragment wurde sequenziert; die Sequenz war identisch zu SEQ ID NR: 3.
  • Zum Nachweisen von Expression der HSZ Polypeptide wurden Plasmide pCC11 und pCC12 in E. coli Stamm HMS 174 transformiert, und ein in vivo Markierungsexperiment wurde durchgeführt, wie von Studier und Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130 beschrieben. Proteine wurden eine Stunde nach Induktion (durch Infektion mit λ Phage CE6, der das T7 RNA Polymerasegen trug) mit ³&sup5;S-Methionin markiert, von dem erwartet wurde, das es sehr hervorragend diese Methionin reichen Polypeptide markierte. Zellextrakte wurden auf SDS Polyacrylamidgelen laufengelassen, welche getrocknet und autoradiographiert wurden. Eine hervorragende Bande von Molekulargewicht von etwa 20 kD war in sowohl pCC11 wie pCC12 Extrakten offenkundig. Dieses ist die angenäherte Größe, die für das reife Längen HSZ Polypeptid erwartet wurde und schlug vor, daß das Vorläuferprotein, hergestellt in der pCC11 Transformante, durch E. coli verarbeitet wurde. Als die gesamten Zellproteine durch Coomassie brilliant blue Färben unter Verfolgen von Induktion und SDS Polyacrylamidgelelektrophorese entfaltet wurden, war ein hervorragendes induziertes 20 kD Protein in den pCC12 Lysaten, aber nicht in den pCC11 Lysaten, offenkundig.
  • BEISPIEL 4 REIGUNG DES IN E. COLI HERGESTELLTEN HSZ PROTEINS
  • Eine 1-L Kultur von E. coli Stamm BL21(DE3)pLysE [Studier et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 60-89], transformiert mit pCC12, wurde in LB Medium gezüchtet, das Ampicillin (100 mg/l) und Chloramphenicol (10 mg/l) bei 37ºC enthielt. Bei einer optischen Dichte bei 600 nm von 1,08 wurden 1,2 ml von 0,1M IPTG (Isopropylthio-β-galactosid, der Induktor) hinzugegeben, und Inkubation wurde 3 h bei 37ºC fortgesetzt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt, mit 50 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA gewaschen, mit 10 ml des gleichen Puffers resuspendiert und bei -20ºC gefroren.
  • Die Suspension wurde aufgetaut, und Triton X-100 wurde zu einer Konzentration von 0,1% hinzugegeben, gefolgt von 3000 Einheiten Deoxyribonuclease I (Boehringer-Mannheim). Nach Inkubation bei Raumtemperatur 60 Minuten lang wurde die Suspension auf Eis unter Reduzieren von Viskosität beschallt. Die Mischung wurde zentrifugiert, und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde zweimal mit 5 ml 70% Isopropanol, 10 mM β-Mercaptoethanol extrahiert. HSZ, unähnlich den meisten Proteinen, ist in diesem Lösungsmittel löslich. SDS Polyacrylamidgelelektrophorese und Coomassie brilliant blue Färben zeigten, daß das HSZ Protein das Hauptprotein der ersten Extraktion (> 90%) war, und das einzige offenkundige Protein bei der zweiten Extraktion. Zwischen 10 und 100 mg HSZ Protein wurden aus 1 l Zellkultur erhalten. Gereinigtes HSZ Protein wurde zu Hazelton Research Facility, 310 Swampridge Road, Denver, PA 17517 geschickt, um gegen das Protein gerichtete Kaninchenantikörper zu haben.
  • BEISPIEL 5 KONSTRUKTION EINES GENS, DAS DIE HOCHMETHIONINDOMÄNEN VON HSZ CODIERT
  • Das HSZ Protein wird gebildet aus einer zentralen, sehr Methionin reichen Region (annähernd 48% Methioninreste), flankiert durch Aminoend- und Carboxyendregionen mit geringerem Methioningehalt (10% Methionin bzw. 7% Methionin). Die zentrale Region wird aus dem sich wiederholenden Motif Met- Met-Met-Pro (SEQ ID NR: 27) gebildet. Das verwandte 10 kD Zeinprotein hat eine ähnliche Struktur (siehe Fig. 3). Jedoch ist die zentrale Region des HSZ Proteins etwa zweimal so groß wie die entsprechende Region in dem 10 kD Zein, was den erhöhten Methioningehalt von HSZ erklärt. Die offensichtliche Verdopplung der zentralen Hochmethionindomäne in HSZ, verglichen zu 10 kD Zein, schlug vor, daß die zentrale Hochmethionindomäne eine stabile Struktur haben könnte und durch sich selbst exprimiert werden könnte, was ein Lagerprotein mit einem sehr hohen Methioningehalt ergibt.
  • Ein Gen wurde konstruiert, die Hochmethionindomäne (HMD) von HSZ zu codieren. Zum Durchführen dieses wurde PCR verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit pX8 als der Matrizen DNA und den Oligonucleotiden JR 5 (SEQ ID NR: 14) und JR6 (SEQ ID NR: 15) als Primer für die DNA Synthese.
  • JR5 5'-TCACCGCTTCAGCAGTGCCATATGCCAATG-3' (SEQ ID NR: 14)
  • JR6 5'-TCTTAGAATTCTATGGCATCATCATTGGTGACACCATGCT-3' (SEQ ID NR: 15)
  • Primer JR5 (SEQ ID NR: 14) erzeugt die Zugabe einer Nde I Stelle (zuvor unterstrichen) in dem PCR Produkt. Primer JR6 (SEQ ID NR: 15) fügt eine EcoR I Stelle (zuvor unterstrichen) in das PCR Produkt. Diese Stellen erlauben Ligasierung des HMD zu dem pET-3aM Expressionsvektor [Rosenberg et al. (1987) Gene 56: 125-135 und Beispiel 3]. Die ATG Nucleotide der Nde I Stelle ist das Translationsinitiationscodon in dem Expressionsvektor, und die EcoR I Stelle folgt unmittelbar dem Translationsterminatorcodon.
  • Das PCR Produkt wurde mit Nde I und EcoR I verdaut und an pET-3aM ligasiert, welches mit Nde I und EcoR I verdaut worden war. Im Anschluß an Transformation von E. coli wurden Klone, die das gewünschte rekombinante Plasmid enthielten, identifiziert und durch DNA Sequenzieren des eingefugten DNA Fragments verifiziert. Das Nucleotid und abgeleitete Aminosäurensequenz des HMD Gens ist in SEQ ID NR: 4 gezeigt.
  • BEISPIEL 6 KONSTRUKTION VON CHIMÄREN GENEN FÜR EXPRESSION VON HSZ IN PFLANZEN
  • Drei samenspezifische Genexpressionskassetten wurden für Konstruktion von chimären Genen für Expression von HSZ in Pflanzen verwendet. Die Expressionskassetten enthielten die Regulationsregionen von drei hoch exprimierten Samenlagerproteingenen:
  • 1) die β Untereinheit von Phaseolin aus dem Bohnen Phaseolus vulgaris,
  • 2) die α' Untereinheit von β-Conglycinin aus Sojabohne und
  • 3) das 10 kD ein aus Mais.
  • Die Kassetten sind schematisch in Fig. 2 gezeigt.
  • Die Phaseolinkassette umfaßt etwa 500 Nucleotide stromaufwärts (5') von dem Translationsinitiationscodon und etwa 1650 Nucleotide stromabwärts (3') von dem Translationsstopcodon von Phaseolin. Zwischen den 5' und 3' Regionen sind die einzigartigen Restriktionsendonucleasestellen Nco I (welche das ATG Translationsinitiationscodon einschließt), Sma I, Kpn I und Xba I. Die gesamte Kassette ist durch Hind III Stellen flankiert. Die DNA Sequenz dieser Regulationsregionen sind in der Literatur beschrieben worden [Doyle et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228-9238]. Kürzliche Arbeit von Bustos et al. [(1991) EMBO J. 10: 1469-1479] zeigt, daß die Promotorregion dieser Kassette nicht alle der DNA Sequenzelemente, die für den vollständigen Expressionsspiegel des Phaseolinpromotors benötigt werden, einschließt, sondern eher 20-30% des vollständigen Expressionsspiegels würden erwartet werden.
  • Die β-Conglycininkassette schließt etwa 610 Nucleotide stromaufwärts (5') von dem Translationsinitiationscodon von β-Conglycinin und etwa 1650 Nucleotide stromabwärts (3') von dem Translationsstopcodon von Phaseolin ein. Zwischen den 5' und 3' Regionen sind die einzigartigen Restriktionsendonucleasestellen Nco I (welche das ATG Translationsinitiationscodon einschließt), Sma I, Kpn I und Xba I. Die gesamte Kassette ist durch Hind III Stellen flankiert. Die DNA Sequenz dieser Regulationsregionen ist in der Literatur beschrieben worden [Doyle et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228- 9238].
  • Die 10 kD Zein Kassettte schließt etwa 925 Nucleotide stromaufwärts (5') von dem Translationsinitiationscodon und etwa 945 Nucleotide stromabwärts (3') von dem Translationsstopcodon von Phaseolin ein Zwischen den 5' und 3' Regionen sind die einzigartigen Restriktionsendonucleasestellen Nco I (welche das ATG Translationsinitiationscodon einschließt) und Sma I. Die gesamte Kassette wird flankiert durch eine EcoR I Stelle an dem 5' Ende und BamH I, Sal I und Hind III Stellen an dem 3' Ende. Die DNA Sequenz dieser Regulationsregionen ist in der Literatur beschrieben worden [Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359-370].
  • Das Nco I-Xba I Fragment, das die gesamte HSZ Codierungsregion (siehe Beispiel 2) enthält, wurde aus einem Agarosegel unter Verfolgen von Elektrophorese unter Verwenden von DEAE Cellulosemembran, wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Das BspH I-Xba I Fragment, das das Gen ohne die Siganlsequenz enthielt, d. h. die reife Proteincodierungssequenz, wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, isoliert. Diese DNA Fragmente wurden in die Phaseolin- und β-Conglycininexpressionskassetten eingefügt, die mit Nco I-Xba I verdaut worden waren. Somit wurden vier chimäre Gene erzeugt:
  • 1) Phaseolin 5' Region/natives HSZlPhaseolin 3' Region
  • 2) Phaseolin 5' Region/reifes HSZ/Phaseolin 3' Region
  • 3) β-Conglycinin 5' Region/natives HSZ/Phaseolin 3' Region
  • 4) β-Conglycinin 5' Region/reifes HSZ/Phaseolin 3' Region.
  • Zusätzliche chimäre Gene wurden konstruiert, die native Einkeimblatt-(monocot) Signalsequenz von HSZ durch eine Zweikeimblatt-(dicot) Signalsequenz aus Phaseolin zu ersetzen. Um dieses durchzuführen, wurden Oligonucleotide CFC 112 (SEQ ID NR: 16) und CFC 113 (SEQ ID NR: 17) synthetisiert. Die reassozüerten Oligonucleotide bilden ein Nco I kompatibles Ende und ein Nhe I/Spe I kompatibles Ende (siehe unten).
  • Ein Plasmid, pCC13, enthaltend das HSZ Gen, flankiert von den Phaseolin 5' und 3' Regulationsregionen, wurde mit Nco I und Spe I verdaut, wobei das meiste der nativen Signalsequenz von HSZ entfernt wurde. Die reassozüerten Oligonucleotide, CFC112 (SEQ ID NR: 16) und CFC113 (SEQ ID NR: 17), wurden an das verdaute pCC13 ligasiert. Dieses auf diese Weise erzeugte Plasmid wurde als pCC18 bezeichnet, und die Sequenz des chimären Gens, enthaltend das reife HSZ Protein, fusioniert an die Phaseolinsignalsequenz, wurde durch DNA Sequenzieren bestätigt (SEQ ID NR: 18).
  • Weil die Spe I Stelle (Nucleotide 57-62 in SEQ ID NR: 2) nicht an der genauen Verbindung der HSZ Signalsequenzlreifes Protein war, wurden zwei extra Aminosäuren zwischen dem Ende der Phaseolinsignalsequenz und dem reifen HSZ Protein durch dieses Verfahren hinzugegeben. Um diese zu entfernen, wurde ein HSZ Fragment über PCR unter Verwenden der Oligonucleotide CFC114 (SEQ ID NR: 19, siehe unten) und CFC 88 (SEQ ID NR: 13, siehe BEISPIEL 2) erzeugt, als Primer dienend und mit pCC18 als der DNA Matrize.
  • CFC114
  • TTCTGCTAGC TTTGCTACCC ATATCCCAGG G (SEQ ID NR: 19)
  • Das PCR Produkt wurde mit Nhe I und Xba I verdaut und mittels Gelelektrophorese gereinigt. Das Plasmid pCC1B wurde mit den gleichen Enzymen unter Entfernen des DNA Fragments, das das Fusionsprotein codiert, das die zwei extra Aminosäuren enthält, verdaut, und das PCR-erzeugte DNA Fragment wurde dann eingefügt. Die Struktur des sich ergebenden Plasmids, als pCC24 bezeichnet, wurde mittels DNA Sequenzieren bestätigt (SEQ ID NR: 20).
  • Um die native Signalsequenz von HSZ durch die Phaseolinsignalsequenz in dem chimären Gen zu ersetzen, das die β-Conglycinin S' Region enthält, wurde ein PCR-erzeugtes Fragment unter Verwenden von CFC123 (SEQ ID NR: 21, siehe unten) und CFC88 (SEQ ID NR: 13, siehe BEISPIEL 2) als Primer und pCC24 als Matrize synthetisiert.
  • CFC123
  • ACTAATCATG ATGAGAGCAA GGGTTCCACT (SEQ ID NR: 21)
  • Das PCR-erzeugte DNA Fragment wurde mir BspH I und Xba I verdaut und mittels Gelelektrophorse gereinigt. Dieses DNA Fragment wurde in die β-Conglycininexpressionskassette eingefügt, welche mit Nco I-Xba I verdaut worden war, und die Struktur des eingefügten Fragments wurde mittels DNA Sequenzieren (SEQ ID NR: 20) bestätigt. Dieses Plasmid wurde als pCC30 bezeichnet.
  • Die Oligonucleotide CFC104 (SEQ ID NR: 10) und CFC105 (SEQ ID NR: 11) (siehe Beispiel 3) wurden in die 10 kD Zein Kassette an der Xba I Stelle an dem Carboxyende unter Hinzufügen einer einzigartigen Sma I Stelle eingefügt. Das Nco I-Sma I Fragment, das die HSZ Codierungsregion enthält, wurde aus Plasmid pCC 10 (siehe Beispiel 2) isoliert und in die Nco I-Sma I verdaute 10 kD Zein Kassette eingefügt.
  • BEISPIEL 7 TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEN PHASEOLIN-HSZ CHIMÄREN GENEN
  • Die Phaseolin-HSZ chimären Genkassetten, Phaseolin 5' Region/natives HSZ/Phaseolin 3' Region und Phaseolin 5' Region/reifes HSZ/Phaseolin 3' Region (Beispiel 6) wurden als annähernd 2,3 kb Hind III Fragmente isoliert. Hind III-BamH I Adaptoroligonucleotide wurden zu diesen Fragmenten für Insertion in die einzigartige BamH I Stelle des Vektors pZS97K (Fig. 3) hinzugegeben, welcher Teil eines binären Ti Plasmidvektorsystems [Bevan, (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711-8720] von Agrobacterium tumefaciens ist. Der Vektor enthält: (1) das chimäre Gen Nopalinsynthase/Neomycinphosphotransferase (nos: NPT II) als einen selektierbaren Marker für transformierte Pflanzenzellen [Bevan et al. (1983) Nature 304: 184-186], (2) die linken und rechten Grenzen der T-DNA des Ti Plasmids [Bevan (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711- 8720], (3) das E. coli lacZ α-Complemetierungssegment [Vieria and Messing (1982) Gene 19: 259-267] mit einzigartigen Restriktionsendonucleasestellen für EcoR I, Kpn I, BamH I und Sal I, (4) den Bakterienreplikationsursprung aus dem Pseudomonas Plasmid pVS1 [Itoh et al. (1984) Plasmid 11: 206- 220] und (5) das bakterielle Neomycinphosphotransferasegen aus Tn5 [Berg et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72: 3628-3632] als einen selektierbaren Marker für transformiertes A. tumefaciens.
  • Die Phaseolin-HSZ chimäre Genkassette, Phaseolin 5' Region/Phaseolinsignalsequenz/reifes HSZ/Phaseolin 3' Region, (Beispiel 6) wurde als ein annähernd 2,3 kb Hind III Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in die einzigartige Hind III Stelle des binären Vektors pZS97 (Fig. 4) eingefügt. Dieser Vektor ist ähnlich zum zuvor beschriebenen pZS97K, ausgenommen in Bezug auf das Vorhandensein von zwei zusätzlichen einzigartigen Klonierungsstellen, Sma I und Hind III, und dem Bakterien β- Lactamasegen (welches Ampicillinresistenz erzeugt) als einen selektierbaren Marker für transformiertes A. tumefaciens anstelle des bakteriellen Neomycinphosphotransferasegens.
  • Die binären Vektoren, die die chimären HSZ Gene enthalten, wurden durch triparenterale Paarungen [Ruvkin et al. (1981) Nature 289: 85-88] auf Agrobacterium-Stamm LBA4404/pAL4404 übertragen [Hockema et al. (1983) Nature 303: 179-180]. Die Agrobacterium-Transformanten wurden verwendet, Tabakblartscheiben anzuimpfen [Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231]. Transgene Pflanzen wurden in selektivem, Kanamycin enthaltendem Medium wiedergewonnen.
  • Genomische DNA wurde aus jungen Blättern extrahiert und unter Verwenden von PCR zum Nachweisen des Vorhandenseins der chimären HSZ Gene in dem transformiertem Tabak analysiert. Die Oligonucleotide CFC93 (SEQ ID NR: 22, siehe unten) und CFC77 (SEQ ID NR: 7, siehe BEISPIEL 1) wurden als Primer für die PCR Reaktion verwendet.
  • CFC93
  • GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA (SEQ ID NR: 22)
  • Von diesen Primern würde erwartet werden, ein 425 bp DNA Fragment intern zu dem HSZ Gen zu erzeugen. Sechzehn von zwanzig untersuchten Transformanten waren in diesem Assay positiv (siehe Tabellen 1 und 2).
  • Zum Untersuchen in Bezug auf Expression der chimären Gene ließ man die transformierten Pflanzen blühen, sich selbst bestäuben und zu Samen werden. Gesamtproteine wurden aus reifen Samen wie folgt extrahiert. Annähernd 200 mg Samen wurden in ein verfügbares 1,5 ml Kunststoffmikrofugenröhrchen gebracht und in 0,25 ml 50 mM Tris-Cl pH 6,8, 2 mM EDTA, 1% SDS, 1% β-Mercaptoethanol gemahlen. Das Mahlen wurden unter Verwenden einer Motor getriebenen Mühle mit verfügbaren Kunststoffwellen, konstruiert, in die Mikrofugenröhre zu passen, durchgeführt. Die sich ergebenden Suspensionen wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Mikrofuge unter Entfernen von aus Teilchen bestehendem Material zentrifugiert. Gesamtproteingehalte der Überstände wurden unter Verwenden des BioRad Protein Assays mit Rinderserumalbumin als einem Standard untersucht.
  • Aus jedem Extrakt wurden 10 ug Protein pro Bahn auf einem SDS Polyacrylamidgel laufengelassen, wobei bakteriell hergestelltes reifes HSZ als eine positive Kontrolle diente, und aus nicht transformierten Tabaksamen extrahiertes Protein als eine negative Kontrolle diente. Die Proteine wurden dann elektrophoretisch auf einer Nitrocellulosemembran geblottet. Die Membranen wurden HSZ Antikörpern (siehe BEISPIEL 4) bei einer 1 : 700 Verdünnung des Kaninchenserums unter Verwenden von Standardprotokoll, zur Verfügung gestellt von BioRad, mit ihrem Immun-Blot Kit ausgesetzt. Im Anschluß an Spülen unter Entfernen von ungebundenem primären Antikörper wurden die Membranen dem sekundären Antikörper, Esel Anti-Kaninchen Ig, konjugiert an Meerettichperoxidase (Amersham), bei einer 1 : 3000 Verdünnung ausgesetzt. Im Anschluß an Spülen unter Entfernen von ungebundenem sekundärem Antikörper wurden die Membranen Amersham Chemilumineszenzreagens und Röntgenstrahlfilm ausgesetzt.
  • Die meisten der Transformanten, die das HSZ Gen, basierend auf der PCR Analyse, enthielten, erzeugten auch HSZ Protein, basierend auf dem immunologischen Sieben (Tabellen 1-3). In allen Fällen war die Größe des erzeugten Proteins annähernd gleich zu reifem HSZ, hergestellt in E. coli, was angab, daß sowohl die native wie die Phaseolinsignalsequenz entfernt worden waren, und somit vorschlug, daß das Protein in das endoplasmatische Retikulum eingetreten war.
  • Samen wurden auch mit 70% Isopropanol/1% β-Mercaptoethanol, einem Lösungsmittel, in dem wenige Proteine anders als HSZ löslich sind, extrahiert. Die Proteine wurden dann SDS-PAGE, Western Blotten und immunologischem Sondieren, wie zuvor beschrieben, ausgesetzt. Unter diesen Bedingungen wurde ein Protein der Größe von reifem HSZ wieder beobachtet, was die Identität der nachgewiesenen Proteine als HSZ bestätigte.
  • Der Expressionsspiegel von HSZ in den transformierten Linien wurde, basierend auf der Empfindlichkeit des HSZ Antikörpers und der Menge von auf das SDS-PAGE Gel beladenem Protein, geschätzt. HSZ lag im Bereich von etwa 0,05-0,5% des Gesamtsamenproteins.
  • Zum Messen der Aminosäurenzusammensetzung der Samen wurden 6 Samen in 6 N Salzsäure, 0,4% β-Mercaptoethanol unter Stickstoff 24 Stunden lang bei 110-120ºC hydrolysiert; 1/10 der Probe wurde auf einem Beckmann Modell 6300 Aminosäurenanalysiergerät unter Verwenden von Post-Säulen Ninhydrinnachweis laufengelassen. Relative Methioninspiegel in den Samen wurden als ein Methionin : Leucin Verhältnis verglichen, wodurch somit Leucin als ein interner Standard verwendet wurde. Es gab etwa 6% Standardabweichung bei dem Methionin : Leucin Verhältnis. Bei dem höchsten Expressionsspiegel von HSZ, bestimmt durch die Western Blot Analyse, würde erwartet werden, daß HSZ den Methioninspiegel in dem Samen um etwa 10% erhöht. Weil dieses so nahe zu der Standardabweichung war, wurde keine Expressionswirkung von HSZ auf das Gesamtsamenmethionin beobachtet (Tabellen 1-3). TABELLE 1 pCC15 Transformanten Phaseolin 5'/reifes HSZ/Phaseolin 3 TABELLE 2 pCC16 Transformanten Phaseolin 5'/natives HSZ/Phaseolin 3' TABELLE 3 pCC36 Transformanten Phaseolin 5'/Phaseolin ss/reifes HSZ/Phaseolin 3'
  • BEISPIEL 8
  • EXPRESSION DES HMD PROTEiNS IN E. COLI
  • Eine Kultur von E. coli Stamm BL21(DE3)pLysE [Studier et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 60-89], transformiert mit Plasmid pXBM-18, wurde in Ampicillin enthaltendem (100 mg/l) 101 LB Medium bei 37ºC gezüchtet. Bei einer optischen Dichte bei 600 nm von etwa 1 wurde IPTG (Isopropylthioβ-galactosid, der Induktor) zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben, und Inkubation wurde 8 h bei 37ºC fortgefiibrt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt, mit 50 mM NaCl, 50 mM Tris- Cl, (pH 7,5), 1 mM EDTA (Puffer A) gewaschen und bei -80ºC gefroren.
  • Die gefrorenen Zellen wurden auf Eis in 5 ml Puffer A/gramm Zellen getaut. Deoxyribonuclease I (Sigma) wurde zu einer Konzentration von 0,1 mg/ml hinzugegeben. Nach Inkubation bei Raumtemperatur 60 Minuten lang wurde die Suspension auf Eis unter Reduzieren von Viskosität beschallt. Die Mischung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde zweimal mit 25 ml 70% Isopropanol, 10 mM β-Mercaptoethanol extrahiert. HMD, ähnlich HSZ, ist in diesem Lösungsmittel löslich. SDS Polyacrylamidgelelektrophorese und Coomassie brilliant blue Färben zeigten, daß das HMD Protein das Hauptprotein der Extraktion war. Western Blot Analyse zeigte, daß HMD Protein mit gegen HSZ gerichtetem Kaninchenantikörper kreuzreagierte.
  • BEISPIEL 9 TRANSFORMATION VON TABAK MIT DEM β-CONGLYCIMN-HSZ CHIMÄREN GENEN
  • Die β-Conglycinin chimären Genkassetten, β-Conglycinin 5' Regionlnatives HSZ/Phaseolin 3' Region, β-Conglycinin 5' Region/reifes HSZ/Phaseolin 3' Region und β-Conglycinin 5'Region/Phaseolin signalsequenz/reifes HSZ/Phaseolin 3' Region (Beispiel 6) wurden als annähernd 2,4 kb Hind III Fragmente isoliert. Diese Fragmente wurden in die einzigartige Hind III Stelle des binären Vektors pZS97 (Fig. 4) eingefügt. Dieser Vektor ist ähnlich zu in BEISPIEL 7 beschriebenem pZS97K, ausgenommen im Hinblick auf das Vorhandensein von zwei zusätzlichen einzigartigen Klonierungsstellen, Sma I und Hind III, und dem bakteriellen β-Lactamase Gen (welches Ampicillinresistenz erzeugt) als einen selektierbaren Marker für transformiertes A. tumefaciens anstelle des bakteriellen Neomycinphosphotransferasegens.
  • Die binären Vektoren, die die chimären HSZ Gene enthalten, wurden durch triparenterale Paarungen [Ruvkin et al. (1981) Nature 289: 85-88] auf Agrobacterium-Starnm LBA4404/pAL4404 übertragen [Hockema et al (1983), Nature 303: 179-180]. Die Agrobacterium-Transformanten wurden verwendet, Tabakblattscheiben zu beimpfen [Horch et al. (1985) Science 227: 1229-1231]. Transgene Pflanzen wurden in selektivem Medium, Kanamycin enthaltend, wiedergewonnen.
  • Um im Hinblick auf Expression der chimären Gene zu prüfen, ließ man die transformierten Pflanzen blühen, sich selbst bestäuben und zu Samen zu werden. Gesamtproteine wurden aus reifen Samen wie folgt extrahiert. Annähernd 200 mg Samen wurden in eine 1,5 ml verfügbare Kunststofflnikrofugenröhre gebracht und in 0,25 ml 50 mM Tris-Cl pH 6,8, 2 mM EDTA, 1% SDS, 1% β- Mercaptoethanol gemahlen. Das Mahlen wurde unter Verwenden einer Motor getriebenen Mühle mit verfügbaren Kunststoffwellen, konstruiert, in die Mikrofugenröhre zu passen, durchgeführt. Die sich ergebenden Suspensionen wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Mikrofuge unter Entfernen von aus Teilchen bestehendem Material zentrifugiert. Gesamtproteingehalte der Überstände wurden unter Verwenden des BioRad Proteinassays mit Rinderserumalbumin als einem Standard geprüft.
  • Aus jedem Extrakt wurden 10 ug Protein pro Bahn auf einem SDS Polyacrylamidgel laufengelassen, wobei bakteriell hergestelltes reifes HSZ als eine positive Kontrolle diente, und Protein, extrahiert aus nicht transformierten Tabaksamen, als eine negative Kontrolle diente. Die Proteine wurden dann elektophoretisch auf einer Nitrocellulosemembran geblottet. Die Membranen wurden HSZ Antikörpern (siehe BEISPIEL 4) bei einer 1 : 700 Verdünnung des Kaninchensenuns unter Verwenden von Standardprotokoll, geliefert von BioRad, mit ihrem Immun-Blot Kit ausgesetzt. Im Anschluß an Spülen unter Entfernen von ungebundenem primären Antikörper wurden die Membranen dem sekundären Antikörper, Esel Anti-Kaninchen Ig, konjugiert an Meerettichperoxidase (Amersham), bei einer 1 : 3000 Verdünnung ausgesetzt. Im Anschluß an Spülen unter Entfernen von ungebundenem sekundären Antikörper wurden die Membranen Amersham Chemilumineszenzreagenz und Röntgenstrahlfilm ausgesetzt.
  • Eine Transformante, die das chimäre Gen β-Conglycinin 5' Region/reifes HSZ/Phaseolin 3' Region enthielt, und zwei Transformanten, die das chimäre Gen β-Conglycinin 5' Region/natives HSZ/Phaseolin 3' Region enthielten, erzeugten jedes HSZ Protein. Vier von sieben Transfomianten, die das chimäre Gen β-Conglycinin 5' Region/Phaseolinsignalsequenz-reifes HSZ/Phaseolin 3' Region enthielten, erzeugten HSZ Protein (Tabelle 4). In allen Fällen war die Größe des hergestellten Proteins annähernd gleich zu reifem HSZ, hergestellt in E. coli, was anzeigt, daß sowohl die native wie die Phaseolinsignalsequenz entfernt worden waren, und somit vorschlug, daß das Protein in das endoplasmatische Retikulum eingetreten war.
  • Um die Aininosäurenzusannnensetzung der Samen zu messen, wurden 6 Samen in 6 N Salzsäure, 0,4% β-Mercaptoethanol unter Stickstoff 24 Stunden lang bei 110º-120ºC hydrolysiert; 1/10 der Probe wurde auf einem Beckman Model 6300 Aminosäurenanalysator unter Verwenden von Post-Säulen Ninhydrinnachweis laufengelassen. Relative Methioninspiegel in den Samen wurden als ein Methionin : Leucin Verhältnis verglichen, wodurch somit Leucin als ein interner Standard verwendet wurde. Es gab eine etwa 5% Standardabweichung in dem Methionin : Leucin Verhältnis. Die Linie mit dem höchsten Spiegel von HSZ Expression, basierend auf der Western Blot Analyse, hatte das höchste beobachtete Gesamtsamenmethionin (Tabelle 4), aber dieses war nur etwa 7% oberhalb des Durchschnitts. Während dieses zu nahe zu dem Meßirrtum ist, um sicher zu sein, ist es wahrscheinlich, daß dieser hohe Methioninspiegel auf der Expression von HSZ beruht. TABELLE 4 pCC39 Transfonnanten β-Conglycinin 5'/Phaseolin Signalsequenz-reifes HSZ/Phaseolin 3'
  • BEISPIEL 10 KONSTRUKTION DES CHIMÄREN GENS FÜR EXPRESSION VON HMD IN PFLANZEN
  • Wie in BEISPIEL 6 wurde eine samenspezifische Genexpressionskassette für Konstruktion eines chimären Gens für Expression von HMD in Pflanzen verwendet. Die Expressionskassette enthielt die Regulationsregion aus der β-Untereinheit von Phaseolin aus dem Bohnen Phaseolus vulgaris. Das chimäre Gen erzeugte auch eine Zweikeimblatt- (dicot) Signalsequenz aus Phaseolin: Phaseolin 5' Region/Phaseolinsignalsequenz/RMD/Phaseolin 3' Region.
  • PCR Primer, CLM 1 (SEQ ID NR: 23) und CLM 2 (SEQ ID NR: 24) (siehe unten) wurden synthetisiert und mit dem Plasmid pJRIViD 1 als Matrize unter Erzeugen eines DNA Fragments, enthaltend die HMD Sequenz, fusioniert an das 3' Ende der Phaseolinsignalsequenz und flankiert von NheI und XbaI Stellen, verwendet. Das Plasmid pCC24, diskutiert in BEISPIEL 6, wurde mit NheI, weches in der Phaseolinsignalsequenz schneidet, und XbaI verdaut und mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt. Der gereinigte Vektor wurde an das PCR Produkt, gebildet aus CLM 1 (SEQ ID NR: 23), CLM 2 (SEQ ID NR: 24) und pJRHIvIDI ligasiert, somit die vollständige Phaseolinsignalsequenz, gekoppelt an HMD, erzeugend. Das Ligasierungsprodukt wurde als pJRHMD2 bezeichnet, und die Sequenz des chimären Gens (SEQ ID NR: 25) wurde mittels DNA Sequenzieren bestätigt.
  • CLM 1 NheI
  • 5' TGCTTGCTAGCTTTGCTATGCCAATGATGATGCCGGGT 3' (SEQ ID NR: 23)
  • AlaSerPheAlaMetProMetMetMetProGly
  • CLM 2 XbaI
  • 5' TGCTTTCTAGACTATGGCATCATCATTGGTGACACC 3' (SEQ ID NR: 24)
  • BEISPIEL 11 TRANSFORMATION VON SOJABOHNE MIT EINEM PHASEOLlN-HSZ CHIMÄRENGEN
  • Um somatische Embryos zu induzieren, wurden Keimblätter, 4-5 mm an Länge, herausgeschnitten aus oberflächensterilisierten, unreifen Samen der Sojabohnenkulturform XP3015, in der Dunkelheit bei 25ºC auf einem Agarmedium (SB1 oder SB2) 8-10 Wochen lang kultiviert. Somatische Embryos, welche sekundäre Embryos erzeugten, wurden herausgeschnitten und in ein Flüssigmedium (SB55) gebracht. Nach wiederholter Selektion in Bezug auf Cluster von somatischen Embryos, welche sich als frühe, globulär gestufte Embryos vervielfältigten, wurden dis Suspensionen, wie im nachfolgenden beschrieben, gehalten. Embryogene Sojabohnensuspensionskulturen wurden in 35 ml flüssigen Medien (SBSS) auf einem Rotationsschüttler, 150 Upm, bei 28ºC mit gemischten fluoreszierenden und weißglühenden Lichtern bei einem 16 : 8 Stunde Tag/Nacht Zeitplan gehalten. Kulturen wurden alle vier Wochen durch Beimpfen von annähernd 35 mg Gewebe in 35 ml flüssiges Medium subkultiviert.
  • Embryogene Sojabohnensuspensionskulturen wurden mittels des Verfahrens von Teilchengewehrbombardement transformiert (Kline et al. (1987) Nature (London) 327 : 70, U. S. Patent Nr. 4945050). Ein Du Pont Biolistic® PDS1000/HE Instrument (Heliumumrüstung) wurde für diese Transformationen verwendet.
  • Der für Transformation verwendete Plasmidvektor war ein Derivat von pGEM9Z (Promega Biological Research Products). Als ein selektierbarer Marker war ein chimäres Gen, gebildet aus dem 35S Promotor von Blumenkohlmosaikvirus [Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812], dem Hygromycinphosphotransferasegen aus Plasmid pJR225 (aus E. coli) [Gritz et al. (1983) Gene 25: 179-188] und der 3' Region des Nopalinsynthasegens aus der T-DNA des Ti Plasmids von Agrobacterium tumefaciens (SEQ ID NR: 26) an der Sal I Stelle des Vektors. Die Phaseolin-HSZ chimäre Genkassette, Phaseolin 5' Region/Phaseolinsignalsequenz/reifes HSZ/Phaseolin 3' Region (Beispiel 6) wurde als ein annähernd 2,3 kb Hind III Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in die einzigartige Hind III Stelle des Vektors eingefügt.
  • Zu 50 ul einer 60 mg/ml 1 um Goldteilchensuspension wurden hinzugegeben (in Reihenfolge): 5 ul DNA (1 ug/ul), 20 ul Spermidin (0,1 M) und 50 ul CaCl&sub2; (2,5 M). Die Teilchenherstellung wurde drei Minuten lang gerührt, in einer Mikrofuge 10 Sekunden lang versponnen, und der Überstand entfernt. Die DNA-überzogenen Teilchen wurden dann einmal in 400 ul 70% Ethanol gewaschen und in 40 ul wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA/Teilchensuspension wurde dreimal jeweils eine Sekunde lang beschallt. Fünf ul der DNA-überzogenen Goldteilchen wurden dann auf jede Makroträgerscheibe geladen.
  • Annähernd 300-400 mg einer vier Wochen alten Suspensionskultur wurden in eine leere 60 · 15 mm Petrischale gebracht, und die restliche Flüssigkeit von dem Gewebe mit einer Pipette entfernt. Für jedes Transformationsexperiment werden annähernd 5-10 Platten von Gewebe normalerweise bombardiert.
  • Membranbruchdruck wurde bei 1000 psi eingestellt, und die Kammer wurde bis zu einem Vakuum von 28 Zoll Quecksilber evakuiert. Das Gewebe wurde annähernd 3,5 Zoll weg von der zurückhaltenden Abschirmung gesetzt und dreimal beschossen. Im Anschluß an Beschuß wurde das Gewebe zurück in Flüssigkeit gebracht und, wie zuvor beschrieben, kultiviert.
  • Sieben Tage nach Beschuß wurden die flüssigen Medien mit frischem SB55, welches 50 mg/ml Hygromycin enthielt, ausgetauscht. Die selektiven Medien wurden wöchentlich aufgefrischt. Sieben Tage nach Beschuß wurde grünes transformiertes Gewebe beobachtet, das aus nicht transformierten nekrotischen embryogenen Clustern wuchs. Isoliertes grünes Gewebe wurde entfernt und in einzelne Kolben unter Erzeugen von neuen, kloniert fortgepflanzten, transformierten embryogenen Suspensionskulturen geimpft. Somit wurde jede neue Linie als ein unabhängiges Transformationsereignis behandelt. Diese Suspensionen konnten dann subkultiviert und als Cluster von unreifen Embryonen gehalten oder in Vollpflanzen durch Reifung und Keimbildung einzelner somatischer Embryos wiedergewonnen werden.
  • Transformierte embryogene Cluster wurden aus flüssiger Kultur entfernt und auf ein festes Agarmedium (SB103) gebracht, welches keine Hormone oder Antibiotika enthielt. Embryos wurden acht Wochen lang bei 26ºC mit gemischten fluoreszierenden und weißglühenden Lichtem bei einem 16 : 8 Stunde Tag/Nacht Zeitplan kultiviert. Während dieser Periode wurden einzelne Embryos aus den Clustern entfernt und in Bezug auf Herstellung des HSZ Proteins, wie im nachfolgenden beschrieben, analysiert. Nach acht Wochen sind die Embryos für Keimung geeignet.
  • Einzelne Embryos wurden in flüssigem Stickstoff gefroren, und zu einem feinen Pulver mit einem Mörtel und Pistill, vorgekühlt in flüssigem Stickstoff, gemahlen. Das Pulver wurde in eine Eppendorf Zentrifugenröhre gekratzt und zweimal mit Hexan bei Raumtemperatur extrahiert. Der Rückstand wurde bei 60ºC 30 Minuten lang inkubiert, wodurch restlichem Hexan erlaubt wurde, zu verdampfen. Dann wurden 100 ul 50 mM Tris-HCl pH 6,7, 2 mM EDTA, 1% SDS, 1% β-Mercaptoethanol (TESß) zu dem Pellet hinzugegeben, und es wurde bei niedriger Geschwindigkeit etwa 10 Sek mit einer Motor getriebenen Mühle mit verfügbaren Kunststoffschaften, konstruiert, in die Mikrofugenröhre zu passen, gemahlen. Die sich ergebenden Suspensionen wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Mikrofuge zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt und sichergestellt. Das Pellet wurde in 50 ul 70% Isopropanol, 10 mM β- Mercaptoethanol durch Mahlen, wie zuvor beschrieben, resuspendiert. Die Röhre wurde bei 60ºC 5 Minuten lang inkubiert und, wie zuvor beschrieben, zentrifugiert. Der Überstand wurde sichergestellt; und das Pellet erneut mit 50 ul 70% Isopropanol, 10 mM β-Mercaptoethanol extrahiert. Die Alkoholextrakte wurden gesammelt und lyophylisiert; der Rückstand wurde dann in 50 ul TESß resuspendiert. Diese Probe und der erste TESß Extrakt wurden im Hinblick auf das Vorhandensein von HSZ Protein durch Western Blot, wie in Beispiel 9 beschrieben, untersucht. Zwei von drei getesteten transformierten Linien zeigten Expression von HSZ Protein. MEDIEN: SB55 Stammlösungen (Gramm pro Liter):
  • BEISPIEL 12 TRANSFORMATION VON MAIS MIT EINEM HOCHSCHWEFELLAGERPROTEINGEN
  • Calluskulturen wurden von unreifen Embryos (etwa 1,5 bis 2,0 mm), zerschnitten aus Körnern, die von Kreuzungen der Genotypen A188 und B73 abstammten, 10 bis 12 Tage nach Bestäubung gestartet. Die Embryos wurden mit der Achsenseite nach unten gerichtet und in Kontakt mit Agarose verfestigtem N6 Medium plaziert. Die Embryos wurden in der Dunkelheit bei 27ºC gehalten. Bröckeliger embryogener Callus, bestehend aus undifferenzierten Massen von Zellen mit somatischen Proembryoiden und Embryoiden, geboren auf Hängerstrukturen, vermehrt sich von dem Scutellum dieser unreifen Embryos. Der aus dem primären Explantat isolierte embryogene Callus wurde auf N6 Medium kultiviert und auf diesem Medium alle 2 bis 3 Wochen subkultiviert.
  • Das Teilchenbeschuß-Verfahren wurde verwendet, Gene auf die Calluskulturzellen zu übertragen. Ein Biolistic® PDS-1000/He (BioRad Laboratories, Hercules, CA) wurde für diese Experimente verwendet.
  • Ein Plasmidvektor, enthaltend ein selektierbares Markergen, wurde bei den Transformationen verwendet. Das Plasmid, pALSLUC [Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839] enthält eine cDNA des Maisacetolactatsynthase-(ALS) Gens. Diese ALS cDNA ist in vitro mutiert worden, so daß das durch das Gen codierte Enzym resistent gegenüber Chlorsuliron sein würde. Die Änderung bestand aus Mutieren eines Tryptophancodons bei Position 1626 der cDNA zu einem Leucincodon. Das ALS Gen ist unter der Kontrolle des 35S Promotors von Blumenkohhnosaikvirus [Odell et al., (1985) Nature 313: 810-812] und der 3U Region des Nopalinsynthasegens von der T-DNA des Ti Plasmids von Agrobacterium tumefaciens. Dieses Plasmid enthält auch ein Gen, das den 35S Promotor von Blumenkohhnosaikvirus verwendet, und die 3U Region des Nopalinsynthasegens zum Exprimieren einer Leuchtkäferluciferasecodienangsregion [de Wet et al. (1987) Molec. Cell Biol. 7: 725-737]. Das chimäre HSZ Gen wurde auf einem zweiten Plamid geliefert. Dieses Plasmid (pCC21, siehe BEISPIEL 6) enthält die HSZ Codierungsregion unter der Kontrolle der Promotorregion und das 3U Ende von dem Gen, das das 10 kd Lagerproteingen aus Mais codiert [Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359-370].
  • Diese Plasmide (pALSLUC und pCC21) wurden auf die Oberfläche von Goldteilchen cogefällt. Um dieses durchzuführen, wurden 5 ug pALSLUC und 2 ug pCC21 (jeweils in Tris-EDTA Puffer bei einer Konzentration von etwa 1 ug/ul) zu 50 ul Goldteilchen (Durchchnittsdurchmesser von 1 5 m), suspendiert in Wasser (60 mg Gold pro ml), hinzugegeben. Calciumchlorid (50 ul einer 2,5 M Lösung) und Spermidin (20 ul einer 1,0 M Lösung) wurden dann zu der Gold-DNA Suspension hinzugegeben, als die Röhre herumwirbelte. Diese Teilchen wurden dann in einer Mikrofuge 10 Sekunden lang zentrifugiert, und der Überstand entfernt. Die Teilchen wurden dann in 200 ul absolutem Ethanol resuspendiert. Die Teilchen wurden erneut zentrifugiert, und der Überstand entfernt. Die Teilchen wurden dann in 30 ul Ethanol resuspendiert. Fünf ul der DNA-überzogenen Goldteilchen wurden dann auf jede Makroträgerscheibe geladen.
  • Kleine Cluster (2 bis 3 mm an Durchmesser) von embryogenem Callus wurden auf der Oberfläche von Agarose verfestigtem N6 Medium, enthalten in einer Petrischale 12 cm an Durchmeser, angeordnet. Das Gewebe bedeckte einen kreisförmigen Bereich von etwa 6 cm an Durchmesser. Die das Gewebe enthaltende Petrischale wurde in der Kammer des PDS-1000/He plaziert. Die Luft in der Kammer wurde dann zu einem Vakuum von 28 Zoll Hg evakuiert. Der Makroträger wurde mit einer Heliumschockwelle unter Verwenden einer Bruchmembran, die zerbricht, wenn der He Druck in der Schockröhre 1000 psi erreicht, beschleunigt. Das Gewebe wurde annähernd 8 cm von der Stopabschirmung plaziert. Die Gewebeplatten wurden mit den DNA-überzogenen Goldteilchen beschossen.
  • Sieben Tage nach Beschuß wurde das Gewebe auf N6 Medium übertragen, das Chlorsulfuron (50 nM) enthielt, und dem es an Casein oder Prolin fehlte. Das Gewebe fuhr fort, langsam auf diesem Medium zu wachsen. Nach zusätzlichen zwei Wochen wurde das Gewebe auf frisches N6 Medium, enthaltend Chlorsulfuron, übertragen. Nach 8 Wochen wurde ein Bereich von etwa 1 cm an Durchmesser von aktiv wachsendem Callus auf einer der Platten, die Chlorsulfuron-ergänztes Medium enthielt, identifiziert. Dieser Callus fuhr fort, zu wachsen, wenn auf dem selektiven Medium subkultiviert. Etwas von diesem Callus ist auf Medium übertragen worden, das Pflanzengewinnung erlaubt.
  • Luciferaseaktivität wurde in diesem Callus gemessen. Nicht transformiertes Callusgewebe hat Luciferaseaktivität von etwa 500 Lichteinheiten pro mg frisches Gewebe. Der Callus, der auf Chlorsulfuron wuchs, hatte Luciferaseaktivität von etwa 20 000 Lichteinheiten pro mg frisches Gewebe. Dieses Ergebnis zeigt, daß Gene von pALSLUC in dieser Calluslinie exprimiert werden. Southern Analyse wurde in Bezug auf das Vorhandensein von sowohl dem eingeiuhrten ALS Gen wie dem eingeführten chimären Lagerproteingen durchgeführt. Beide eingeführten Gene wurden mittels Southernanalyse beobachtet.
  • Für Analyse des HSZ Gens wurde genomische DNA aus der transformierten Calluslinie (Tx-X8A) oder Callus, abstammend von dem gleichen Genotyp, der aber nicht transformiert war (AB91), mit entweder Xba I oder EcoR I verdaut. Die verdaute DNA wurde mittels Gelelektrophorese durch Agarose fraktioniert und auf eine Nylonmembran unter Verwenden von Standardtechniken übertragen. Der Nylonblot wurde an eine Sonde, hergestellt von einem Teil der HSZ Codierungsregion, hybridisiert. AB91 Callus zeigte eine vorherrschende Bande, die dem nativen HSZ Gen entspricht. Eine zusätzliche Bande von höherem Molekulargewicht wurde in dem Tx-X8A Callus gefunden. Diese Bande entspricht dem eingeführten chimären HSZ Gen. N6 MEDIUM:
  • SEQUENZLISTEN
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
  • (i) ANMELDER SAVERIO C. FALCO
  • CHOK-FUN CHUI
  • JANET A. RICE
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: A HIGH SULFUR SEED PROTEIN GENE AND METHOD FOR INCREASING THE SULFUR AMINO ACID CONTENT OF PLANTS
  • (iii) ZAHL VON SEQUENZEN: 28
  • (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
  • (A) ADRESSAT: E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
  • (B) STRAßE: 1007 MARKET STREET
  • (C) STADT: WILMINGTON
  • (D) STAAT: DELAWARE
  • (E) LAND: U. S. A.
  • (F) ZIP: 19898
  • (v) COMPUTER LESBARE FORM:
  • (A) MEDIUMTYP: DISKETTE, 3,50 ZOLL, 1,0 MB
  • (B) COMPUTER: MACINTOSH
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: MACINTOSH SYSTEM, 6,0
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  • (vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
  • (A) ANMELDEZAHL:
  • (B) ANMELDEDATUM:
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  • (vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
  • (A) PRIORITÄTSDATUM: 14 FEBRUAR 1991
  • (B) USSN: 07/656687
  • (viii) ANWALT/AGENT INFORMATION:
  • (A) NAME: Linda Axamethy Floyd
  • (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33692
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  • (ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
  • (A) TELEFON: (302) 992-4929
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  • (vi) URSPRUNGSQUELLE:
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  • (A) AUTOREN: Kirihara, J. A.
  • Hunsperger, J. P.
  • Mahoney, W. C.
  • Messing, J. W.
  • (B) TITEL: Differentialexpression eines Gens für ein Methionin reiches Lagerprotein in Mais
  • (C) JOURNAL: Mol. Gen. Genet. (D) Band: 211
  • (F) SEITEN: 477484
  • (G) DATUM: 1988
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  • TCACCGCTTC AGCAGTGCGA TATGCCAATG 30
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  • TCTTAGAATT CTATGGCATC ATCATTGGTG ACACCATGCT 40
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  • (A) LÄNGE: 71 Basenpaare
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  • CTAGCAAAGC TAGCAGAAAG TGATGCCAGG AMAGAATTC CCAGCAACAG GAGTGGAACC 60
  • CTTGCTCTCA T 71
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  • TTCTGCTAGC TTTGCTACCC ATATCCCAGG G 31
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  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 647 Basenpaare
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  • (ix) MERKMAL:
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  • ACTAATCATG ATGAGAGCAA GGGTTCCACT 30
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  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN
  • (A) LÄNGE: 30 Basenpaare
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  • GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA 30
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  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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  • TGCTTTCTAG ACTATGGCAT CATCATTGGT GACACC 36
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  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) ORT: 2..346 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 25:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 26:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 3237 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGART: einzeln
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAMEJSCHLÜSSEL: CDS
  • (B) ORT: 1419..2444 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 26:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 27:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 27:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 28:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 28:

Claims (28)

1. Isoliertes und gereinigtes Nucleinsäurefragment, umfassend mindestens eine Nucleotidsequenz, der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz entsprechend, "Hoch-Schwefel-Zein (HSZ)-Maissamenlagerprotein codierend, oder eine im wesentlichen dazu homologe Nucleotidsequenz, die ein HSZ Protein codiert, dessen funktionelle Eigenschaften unbeeinflußt sind, und welches eine zentrale Domäne reich an Methioninresten hat.
2. Isoliertes und gereinigtes Nucleinsäurefragment, umfassend mindestens eine Nucleotidsequenz, der in SEQ ID Nr. 3 gezeigten Sequenz entsprechend, "reifes Hoch-Schwefel-Zein (HSZ) Maissamenlagerprotein" codierend, oder eine im wesentlichen homologe Nucleotidsequenz dazu, die ein HSZ Protein codiert, dessen funktionelle Eigenschaften unbeeinflußt sind, und welches eine zentrale Domäne reich an Methioninresten hat.
3. Isoliertes und gereinigtes Nucleinsäurefragment, umfassend Nucleotidsequenzen, die die Aminosäurensequenzen von SEQ ID Nr. 1 codieren.
4. Isoliertes und gereinigtes Nucleinsäurefragment, umfassend mindestens eine Nucleotidsequenz, der in SEQ ID Nr. 4 gezeigten Sequenz entsprechend, "Hoch-Methionin-Domänen (HMD)- Maissamenlagerprotein" codierend, oder eine im wesentlichen homologe Nucleotidsequenz dazu, ein HMD Protein codierend, dessen funktionelle Eigenschaften unbeeinflußt sind, und welches eine zentrale Domäne reich an Methioninresten hat.
5. Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die zentrale Domäne reich an Methioninresten das sich wiederholende Motiv Met-Met-Met-Pro (SEQ ID Nr. 27) umfaßt.
6. Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die im wesentlichen homologe Nucleotidsequenz ein Protein codiert, dessen reife Form annähernd 28% Methionin enthält.
7. Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Protein, codiert durch die im wesentlichen homologe Nucleotidsequenz, eine Methionin reiche zentrale Domäne, enthaltend etwa 48% Methionin, umfaßt.
8. Nucleinsäurefragment nach Anspruch 7, wobei das codierte Protein eine zentrale Methionin reiche Domäne von etwa 93 Aminosäuren enthält, wobei die Domäne etwa 45 Methioninreste enthält.
9. Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8, operabel an eine Pflanzensignalsequenz gekoppelt.
10. Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 9, operabel an eine Signalsequenz von einer zweikeimblättrigen Pflanze gekoppelt.
11. Chimäres Gen, fähig geänderte Spiegel von Schwefelaminosäuren in transformierten Pflanzen zu erzeugen, wobei das chimäre Gen das Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10 umfaßt, operabel an eine intrazelluläre Lokalisierungssequenz und eine geeignete Regulationssequenz gekoppelt.
12. Chimäres Gen nach Anspruch 11, wobei die Regulationssequenz aus der Gruppe, bestehend aus samenspezifischen Regulationssequenzen, ausgewählt ist.
13. Pflanzenzelle, transformiert mit dem chimären Gen nach Anspruch 11 oder Anspruch 12.
14. Pflanzenzelle nach Anspruch 13, wobei die Pflanze aus der Gruppe, bestehend aus Mais, Sojabohne, Canola, Tabak und Reis, ausgewählt ist.
15. Pflanze, transformiert mit dem chimären Gen nach Anspruch 11 oder Anspruch 12.
16. Pflanze nach Anspruch 15, wobei die Pflanze aus der Gruppe, bestehend aus Mais, Sojabohne, Canola, Tabak und Reis, ausgewählt ist.
17. Saatgut, kombiniert aus den Pflanzen nach Anspruch 15 oder Anspruch 16.
18. Chimäres Gen, fähig, geänderte Spiegel von Schwefelaminosäuren in transformierten Mikroorganismen zu erzeugen, wobei das chimäre Gen das Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8, operabel an eine geeignete Regulationssequenz gekoppelt, enthält.
19. Mit dem chimären Gen nach Anspruch 18 transformierter Mikroorganismus.
20. Polypeptidprodukt der Expression in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle eines Nucleinsäurefragments nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
21. Pflanzenzelle, enthaltend das Polypeptidprodukt nach Anspruch 20.
22. Pflanze, enthaltend das Polypeptidprodukt nach Anspruch 20.
23. Samen, enthaltend das Polypeptidprodukt nach Anspruch 20.
24. Verfahren zum Erhöhen des Schwefelaminosäurengehalts von Pflanzen, umfassend:
(a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem chimären Gen nach Anspruch 11 oder Anspruch 12;
(b) Züchten fruchtbarer, sexuell reifer Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle; und
(c) Auswählen des Nachkommenschaftssamens von den fruchtbaren Pflanzen für erhöhte Spiegel von Schwefelaminosäuren relativ zu nicht transformierten Pflanzenzellen.
25. Verfahren zum Herstellen einer transformierten Pflanze mit einem erhöhten Schwefelaminosäurengehalt, umfassend Einführen in die Pflanze ein Nucleinsäurefragment, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert.
26. Verfahren zum Herstellen von Protein, reich an Schwefel enthaltenden Aminosäuren, in einem Mikroorganismus, umfassend:
(a) Transformieren eines Mikroorganismus mit dem chimären Gen nach Anspruch 18;
(b) Züchten des Mikroorganismus unter Bedingungen für Expression von Protein, reich an Schwefel enthaltenden Aminosäuren; und
(c) Isolieren des Proteins von Stufe (b).
27. Im wesentlichen reines Plasmid pCC 10, wobei das Plasmid das Nucleinsäurefragment nach Anspruch 1 umfaßt, und identifiziert durch die Hinterlegungsnummer ATCC 68490.
28. Tierfutter, ergänzt mit Samen, erhalten von Pflanzen, transformiert mit dem chimären Gen nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, oder ergänzt mit Samen, enthaltend das Polypeptidprodukt nach Anspruch 20.
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