HU218415B - Nagy kéntartalmú magfehérje-gén és eljárás növények kéntartalmú aminosavtartalmának növelésére - Google Patents

Abstract

A találmány kéntartalmú aminosavak mennyiségének növelésére alkalmasizolált és tisztított nukleinsavfragmen- sekre, ezeket hordozó kimérgénekre, és a kimér génnel transzformált növényekre ésmikroorganizmusokra vonatkozik. A találmány kiterjed a fentinukleinsavfragmensek kifejezésével kapott polipeptidekre, valamintnövények kéntartalmú aminosavmennyiségének növelésére, amelynek sorána növényi sejtet fenti kimér génnel transzformálják, a növényttermesztik, a kéntartalmú aminosavak fokozott mennyisége alapjánszelektálják. ŕ

Description

KIVONAT

A találmány kéntartalmú aminosavak mennyiségének növelésére alkalmas izolált és tisztított nukleinsavfragmensekre, ezeket hordozó kimér génekre, és a kimér génnel transzformált növényekre és mikroorganizmusokra vonatkozik. A találmány kiteljed a fenti nukleinsavfragmensek kifejezésével kapott polipeptidekre, valamint növények kéntartalmú aminosavmennyiségének növelésére, amelynek során a növényi sejtet fenti kimér génnel transzformálják, a növényt termesztik, a kéntartalmú aminosavak fokozott mennyisége alapján szelektálják.

A leírás terjedelme 44 oldal (ezen belül 4 lap ábra)

HU 218 415 B

HU 218 415 Β

A találmány nagy kéntartalmú magfehérjegénre és a kéntartalmú aminosavak mennyiségének növényben történő növelésére vonatkozik.

A világ állatitakarmány-forgalma, amely kiterjed a haszonállatokra, baromfiakra, vízben élő állatokra és kedvtelésből tartott háziállatokra, eléri a 475 millió tonnát. Az Egyesült Államokban az összre vonatkoztatva mintegy 67%-ot kitevő kukorica (Zea mays L.) és a mintegy 10%-ot kitevő szójabab (Glycine max L.) lisztforgalma 180 millió tonna. A kukorica- és szójabab termékek a külkereskedelem fontos komponensét jelentik. Ez a két haszonnövény jól adaptálható az Egyesült Államok különböző mezőgazdasági övezeteihez, és a betakarításhoz, tároláshoz és feldolgozáshoz szükséges berendezések és eszközök széles körben hozzáférhetők. Mivel a kukoricát, szójababot és más haszonnövényeket takarmányozási célból árucikként értékesítik, kiváló lehetőség adódik a fehérje táplálkozástani minőségének fokozására, és így a felhasználói és kereskedelmi érték növelésére.

A különböző növényi magokból származó emberi élelmiszerekben és állati takarmányokban hiányoznak a kéntartalmú aminosavak, a metionin és a cisztein, amelyek szükségesek a megfelelő táplálkozáshoz. A kukoricában a legtöbb állat takarmányigénye szempontjából a lizin és triptofán után a harmadik legfontosabb aminosav a kéntartalmú aminosavak csoportja. A lizinben és triptofánban dús szójababliszt kukorica mellett történő kiegészítő alkalmazását korlátozza a kéntartalmú aminosavak kis mennyisége. Ezért a kéntartalmú aminosavak mennyiségének növelése akár a kukorica, akár a szójabab esetében fokozná a keverék takarmány tápértékét, és csökkentené a külön adagolandó költséges metionin szükséges mennyiségét.

A kéntartalmú aminosavak mennyisége kukorica esetében növénynemesítési eszközökkel laboratóriumi méretekben csak korlátozott sikerrel valósítható meg, és kereskedelmi mértékben sikertelen maradt. A teljes magra vonatkoztatva fokozott metioninkoncentrációval rendelkező mutáns kukoricavonal izolálható a kukorica-sejttenyészet inhibitorkoncentrációjú lizin és treonin jelenlétében történő szelektálása alapján [Phillips és munkatársai: Cereal Chem. 62, 213-218, (1985)]. Ebből a vonalból azonban mezőgazdaságilag alkalmazható kultúrát még nem fejlesztettek ki. Fokozott intracelluláris metioninkoncentrációt mutató szójababsejtvonalat szelektáltak etionin jelenlétében történő tenyésztéssel [Madison és Thompson: Plánt Cell Reports 7, 472-476 (1988)], de ebből a vonalból növényt nem regeneráltak.

A mag aminosavtartalmát elsősorban a tárolófehérjék határozzák meg, amelyek a mag fejlődése során szintetizálódnak, és amelyek a csírázás után az egyik fő tápanyagtartalékot képezik. A fehéije mennyisége gabonamag esetén a száraz tömeg mintegy 10%-a, hüvelyesek esetén a száraz tömeg mintegy 20-40%-a. Több mag vonatkozásában a tárolófehéqék mennyisége az össz-fehérjetartalomra vonatkoztatva meghaladhatja az 50 tömeg%-ot. Nagy mennyiségük következtében a növénymag-tárolófehérjék voltak az első izolált fehérjék.

Néhány ilyen fehérje aminosavszekvenciáját azonban csak a legutóbbi időkben határozták meg a biotechnológiai módszerek segítségével. Ezek a módszerek információt szolgáltattak azokról a genetikus jelekről is, amelyek szabályozzák a magspecifikus kifejeződést és a fehérjék intracelluláris feldolgozását.

Több, kéntartalmú növényimag-tárolófehérjét azonosítottak, és meghatározták a megfelelő géneket. így például a kukoricában azonosították egy 15 kD zein fehérje génjét, ahol a fehérje 11% metionint és 5% ciszteint tartalmaz [Pedersen és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 6279-6284 (1986)], és egy 10 kD zein fehérje génjét, ahol a fehérje 23% metionint és 3 g ciszteint tartalmaz [Kirihara és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 21, 477-484 (1988); Kirihara és munkatársai: Gene, 71, 359-370 (1988)]. A borsóból izoláltak továbbá két gént, amelyek 8%, illetve 16% ciszteint tartalmazó magalbumint kódolnak [Higgins és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 11 124-11 130 (1986)]. Egy brazil diófajtából 18% metionint és 8% ciszteint tartalmazó mag 2S albumint kódoló gént izoláltak [Altenbach és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 8, 239-250 (1987)]. Végül megemlítjük, hogy a rizsből egy 10 kD magprolamint kódoló gént izoláltak, ahol a prolamin 19% metionint és 10% ciszteint tartalmaz [Masumura és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 12, 123-130(1989)].

Több irodalom beszámol a mag-tárolófehérjegének transzgén növényekben történő kifejezéséről. A brazil diófajtából izolált nagy kéntartalmú 2S albumint transzformáit dohány magjában fejezték ki bab fazeolin tárolófehérjegénből származó szabályozószekvencia szabályozása alatt. A 17 kD prekurzorból hatékonyan feldolgozták az érett természetes fehérje 9 kD és 3 kD alegységeit. A metioninban dús fehérjének a dohánymagban történő felhalmozódása összességében 30%-ban növelte a mag metionintartalmát [Altenbach és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 13, 513-522 (1989)]. A 19 kD és 23 kD zeinre vonatkozó kukoricamag-tárolófehérje gén kódolószakaszait és a karfiol-mozaikvírus 35S promotert tartalmazó kimér gének transzformált dohányban csak nagyon alacsony szinten fejezhetők ki a magban, a gyökerekben és a levelekben [Schemthaner és munkatársai: EMBO J. 7, 1249-1255 (1988)]. Az egyszikű szabályozószakaszok (promoter és transzkripciós terminátor) kétszikű magspecifikus szabályozószakaszokkal történő helyettesítésével egy 19 kD zein alacsony szinten és magspecifikus módon kifejezhető transzformált petúniában [Williamson és munkatársai: Plánt Physiol. 88, 1002-1007 (1988)] és dohányban [Ohtani és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 16, 117-128 (1991)]. Más esetekben nagy mennyiségű magspecifikus kifejezés érhető el a 15 kD kénben gazdag zein vonatkozásában transzformált dohányban, ahol az egyszikű prekurzor szignálszekvenciája is megfelelően feldolgozódik [Hoffinann és munkatársai: EMBO J. 6, 3213-3221 (1987)].

A magban található kéntartalmú aminosavak mennyiségének növelése érdekében szükség van a kéntartalmú aminosavakban, így metioninban és ciszteinben dús mag-tárolófehérjéket kódoló gének izolálására. A me2

HU 218 415 Β tionin előnyösebb a ciszteinnél, mivel a metionin ciszteinné alakítható, de a ciszteint a legtöbb állat nem képes metioninná alakítani. Előnyös továbbá, ha a tárolófehéije kompatibilis a kívánt kultúrnövénnyel. Előnyös továbbá, ha a fehérjét állatok biztonságos takarmányozására alkalmazható forrásból nyerjük ki.

Olyan megoldást találtunk, amely lehetővé teszi a magban a kéntartalmú aminosavak mennyiségének növelését. A magas kéntartalmú zein (az angol High Sulfur Zein megjelölésből rövidítve HSZ) génjének alkalmazásával kimér géneket állítottunk elő, és különböző kultúrnövényekbe transzformáltuk a kéntartalmú aminosavak mennyiségének a magban vagy levélben történő növelése érdekében.

A találmány tárgya ezért olyan nukleinsavfragmens, amely HSZ kukorica-tárolófehérje prekurzort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, és a 2. számú szekvenciának vagy ezzel lényegében homológ nukleotidszekvenciának felel meg. A találmány tárgya továbbá olyan nukleinsavfragmens, amely érett HSZ fehérjét kódol (3. számú szekvencia), és a HSZ kukorica-tárolófehéqe nagy metionintartalmú doménjét (az angol High Methionine Domain megjelölésből rövidítve HMD) kódol (4. számú szekvencia).

A találmány tárgya továbbá transzformált növényben kifejezhető kimér gén, amely valamely fenti nukleinsavfragmenst tartalmaz működőképesen szabályozószekvenciákhoz kapcsolódva. Előnyösek azok a kimér gének, amelyekben a nukleinsavfragmensek magspecifikus promoterekhez vagy kukorica vagy szójabab leveleiben aktív promoterekhez kapcsolódnak.

A találmány tárgya továbbá olyan kimér gén, amely transzformált mikroorganizmusban, előnyösen E. coliban kifejezhető és nagy kéntartalmú fehérjét termel.

A találmány tárgyát képezik továbbá a nagy kéntartalmú fehérjéket termelő kimér génekkel transzformált gazdasejtek.

A találmány szerinti megoldás további megvalósítási módjait képezik azok a transzformált növények és ezekből nyert magok, amelyek valamely fenti nukleinsavfragmenst tartalmaznak. Növényként előnyös a kukorica, szójabab, repce, dohány és rizs.

A találmány tárgya továbbá az olyan mikroorganizmus, ami a fent említett kimér génnel van transzformálva.

A találmány tárgya továbbá eljárás a kéntartalmú aminosavak mennyiségének növelésére növényben és Agrobacterium tumefaciens által közvetített eljárás nagy kéntartalmú fehérjék termelésére alkalmas növények előállítására. A találmány tárgya végül eljárás kéntartalmú aminosavakban gazdag fehérjék mikroorganizmusban történő előállítására.

A találmány szerinti megoldás jobban megérthető a következő részletes leírásból és az ehhez csatlakozó rajzokból és szekvencialistából. A szekvenciák ábrázolása során az aminosavak hárombetűs kódját alkalmazzuk.

Az 1. számú szekvencia a kukorica HSZ-gén nukleotidszekvenciáját (2123 bp) és a primer transzlációs termék feltételezett aminosavszekvenciáját mutatja.

A 753-755 nukleotidok képezik a feltételezett transzlációs iniciátorkodont, és az 1386-1388 nukleotidok képezik a feltételezett transzlációs terminátorkodont. Az

1-752 és 1389-2123 nukleotidok tartalmazzák a feltételezett 5’- és 3’-szabályozószekvenciákat.

A 2. számú szekvencia a találmány szerinti előnyös nukleotidszekvenciát mutatja. Ez egy 635 bp DNS-fragmens, amely csak a HSZ kódolószakaszt tartalmazza, amely Ncol (5’-CCATGG)-XbaI (5’-TCTAGA) restrikciós endonukleázos emésztéssel izolálható. A természetes HSZ kódolószakaszban található két Ncol helyet helyspecifíkus mutációval kiiktattuk a kódolt aminosavszekvencia megváltozása nélkül.

A 3. számú szekvencia előnyös találmány szerinti nukleotidszekvenciát mutat. Ez egy 579 bp DNS-fragmens, amely csak az érett HSZ-fehérje kódolószakaszát tartalmazza, amely BspHI (5’-TCATGA)-XbaI (5’-TCTAGA) restrikciós endonukleázos emésztéssel izolálható. A természetes HSZ kódolószakaszában megtalálható két Ncol helyet helyspecifikus mutációval kiiktattuk a kódolt aminosavszekvencia megváltozása nélkül.

A 4. számú szekvencia a HMD-gén nukleotidszekvenciáját és az ebből származó aminosavszekvenciát mutatja.

Az 5. számú szekvencia kukorica 10 kd zein gén DNS-szekvenciáját mutatja [Kirihara és munkatársai: Mól. Gene Génét. 21, 477-484 (1988); Kirihara és munkatársai: Gene 71, 359-370(1988)].

A 6. és 7. számú szekvenciák az 1. példában a kukoricatár magas metionintartalmú 10 kd zein génre történő vizsgálatához alkalmazott szekvenciákat mutatják.

A 8. és 9. számú szekvenciák a 2. példában a HSZgén mutációjához alkalmazott szekvenciákat mutatják.

A 10. és 11. számú szekvenciák a 2. példában a HSZ-gén alternatív egyedi endonukleázhelyekkel rendelkező formájának előállításához alkalmazott szekvenciákat mutatják.

A 12. és 13. számú szekvenciák a 2. példában a HSZ érett formáját kódoló gén előállításához alkalmazott szekvenciákat mutatják.

A 14. és 15. számú szekvenciák az 5. példában a HSZ-ből származó HMD-t kódoló gén előállításához alkalmazott szekvenciákat mutatják.

A 16-21. számú szekvenciák a 6. példában a HSZ növényben történő kifejezésére alkalmas kimér gének előállításához alkalmazott szekvenciákat mutatják.

A 22. számú szekvencia a 7. példában a fazeolinHSZ kimér génekkel transzformált dohány analíziséhez alkalmazott szekvenciát mutatja.

A 23., 24. és 25. szekvenciák a 10. példában a HND növényben történő kifejezésére alkalmas kimér gének előállításához használt szekvenciákat mutatják.

A 26. számú szekvencia egy kimér gén szekvenciáját mutatja, amelyet a karfiol-mozaikvírusból származó 35S promoterből (Odell és munkatársai: Natúré 313, 810-812 (1985)], a pJR225 plazmidból (E. coliból) származó higromicin-foszfotranszferáz génből (Gritz és munkatársai: Gene 25, 179-188 (1983)], és szelektálható markerként az Agrobacterium tumefaciensbeli

HU 218 415 Β

Ti plazmid T-DNS-éből származó nopalin-szintáz gén 3’-szakaszából állítottunk elő a szójabab 11. példa szerinti transzformálásához.

A 27. számú szekvencia a HSZ-fehérje központi szakaszát mutatja.

A 28. számú szekvencia a fehérjéknek az endoplazmatikus retikulum üregében történő visszatartására alkalmas aminosavszekvenciát mutatja.

Az 1. ábrán összehasonlítjuk a 10 kd zein aminosavszekvenciáját (5. számú szekvencia) és a HSZ aminosavszekvenciáját (2. számú szekvencia). Ennek során az aminosavak egybetűs kódját használjuk. A két fehéije magas metionintartalmú doménjét aláhúzással jelöljük. Az 1. ábrán szereplő függőleges vonalak a két fehérjében előforduló azonos aminosavmaradékokat jelölik.

A 2. ábra a HSZ transzgén növényekben történő kifejezésére alkalmas kimér génben használható magspecifikus génkifejező kazetta sematikus ábrázolása.

A 3. ábra a pZS97K bináris plazmidvektor hasítási térképe.

A 4. ábra a pZS97 bináris plazmidvektor hasítási térképe.

A jelen találmányban tehát olyan nukleinsavfragmenseket ismertetünk, amelyek kukorica magas kéntartalmú zein (HSZ) mag-tárolófehérjét vagy a HSZ-ből származó magas metionintartalmú domént (HMD) kódolják, amelyek közül mindkettő rendkívül gazdag a metionin nevű aminosavban.

A HSZ-fehérje egy központi, metioninban nagyon gazdag szakaszból (mintegy 48% metioninmaradék) áll, amelyhez kisebb metionintartalmú aminoterminális és karboxiterminális szakaszok (10% metionintartalom, illetve 7% metionintartalom) kapcsolódnak. A központi szakasz az ismétlődő Met-Met-Met-Pro motívum (27. számú szekvencia) variációiból áll. A rokon 10 kd zein fehérje hasonló, de ettől eltérő szerkezettel rendelkezik (lásd az 1. ábrát). A HSZ fokozott metionintartalma miatt azonban a HSZ-fehérje központi szakasza mintegy kétszer olyan kiterjedt, mint a 10 kd zein megfelelő szakasza. A HSZ központi magas metionintartalmú doménjének HMD a 10 kd zeinhez viszonyított látszólagos megduplázódása arra utal, hogy a központi magas metionintartalmú dómén stabil szerkezettel rendelkezik, és önmagában kifejezhető, amelynek során metioninban nagyon gazdag tárolófehérjét kapunk.

Mag-tárolófehérje szabályozószekvenciákat és metioninban gazdag mag-tárolófehéqét kódoló szekvenciát tartalmazó kimér gén alkalmazása lehetővé teszi a kultúrnövények magjaiban megtestesülő tápérték fokozását. A mag metionintartalmának növelését a következő tényezők határozzák meg:

a) a kimér génnek a transzformált kultúrnövényben történő kifejeződésének mértéke, ami részben az alkalmazott magspecifikus kifejező szignáloktól függ;

b) a mag-tárolófehérjét kódoló szakaszban található metioninmaradékok százalékos mennyisége;

c) a bevitt fehérje stabilitása a transzformált kultúrnövény magjában, ami részben a megfelelő feldolgozástól, intracelluláris folyamatoktól, bizonyos esetekben magasabb rendű szerkezetekké történő összekapcsolódástól és a kiszáradással szembeni ellenállástól függ; és

d) a bevitt fehérjének a transzformált kultúrnövény természetes magfehérjével szemben mutatott kompatibilitása.

Megfelelő szabályozószekvenciákkal ellátott, találmány szerinti nukleinsavfragmensek élő sejtbe történő transzformálásával kiválthatjuk a fehérje termelését, illetve túltermelését. A találmány szerinti nukleinsavfragmensek növénybe, elsősorban kukoricába, szójababba vagy olajrepcébe történő transzformálásához a fehérje magban történő kifejezését szabályozó megfelelő szekvenciákat alkalmazunk, és így fokozhatjuk a kéntartalmú aminosavak, elsősorban a metionin mennyiségét, ami javítja a magfehéije tápértékét.

A leírás keretén belül több szakkifejezést alkalmazunk, amelyek magyarázatát az alábbiakban adjuk meg.

A „nukleinsav” kifejezés olyan nagyméretű molekulát jelöl, amely lehet egyszálú vagy kétszálú, és cukrot, foszfátot és purint vagy pirimidint tartalmazó monomerekből (nukleotidokból) áll. A nukleinsavfragmens egy adott nukleinsavmolekula egy darabja. Magasabb rendű növényeknél a genetikai anyag dezoxiribonukleinsav (DNS), míg a ribonukleinsav (RNS) a DNS-ben tárolt információnak a fehérjéhez történő szállításában vesz részt. A genom a szervezet minden sejtjében fellelhető genetikai anyag összességét jelenti. A nukleotidszekvencia polimer DNS-re vagy RNS-re vonatkozik, amely lehet egyszálú vagy kétszálú, és adott esetben a DNS- vagy RNS-polimerbe beépíthető szintetikus, nem természetes vagy megváltoztatott nukleotidbázisokat tartalmaz.

A „homológ” kifejezés arra utal, hogy két nukleinsavmolekula nukleotidszekvenciája vagy két fehéijemolekula aminosavszekvenciája bizonyos mértékben komplementer. A homológ jelleg megbecsülhető DNSDNS vagy DNS-RNS hibridizálással, amit szakember számára ismert körülmények között végzünk (Hames és Higgins: Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, Nagy-Britannia); vagy a két nukleinsav vagy fehérje szekvenciája között található azonosságok összehasonlításával.

A „lényegében homológ” kifejezés olyan nukleinsavmolekulák esetében alkalmazható, amelyek kevésbé szigorú körülmények között hibridizálódnak, mint a homológ szekvenciák, de jelenthet olyan kódoló DNSszekvenciát is, amely eltérő bázist tartalmazhat, de nem váltja ki a kódolt aminosav cseréjét, vagy egy vagy több aminosavban változást okoz, de nem befolyásolja a DNS-szekvencia által kódolt fehérje fúnkciós tulajdonságait. Ennek megfelelően az ismertetett nukleinsavfragmensek olyan molekulákat jelentenek, amelyekben a nukleotidbázisok kiiktatás, átrendezés, véletlenszerű vagy szabályozott mutáció következtében változhatnak, vagy a nukleotidszekvencia hibát mutat, amenynyiben az említett DNS-szekvenciák lényegében homológ szekvenciáknak minősülnek.

HU 218 415 Β

A „gén” kifejezés olyan nukleinsavfragmenst jelent, amely speciális fehérjét fejez ki, és tartalmazza a kódolószakaszt megelőző (5’ nem kódoló) és követő (3’ nem kódoló) szabályozószekvenciákat.

A „természetes gén” kifejezés saját szabályozószekvenciákkal rendelkező természetben talált géneket jelent. A kimér gén heterogén szabályozó- és kódolószekvenciákat tartalmaz. Az endogén gén olyan természetes gént jelent, amelyet általában a genomon belül a természetes helyzetben találunk. Az idegen gén olyan gén, amely a gazdaszervezetben általában nem fordul elő, de géntranszformációval bevihető.

A „kódolószekvencia” kifejezés olyan DNS-szekvenciát jelent, amely speciális fehérjét kódol, de nem tartalmaz nem kódoló szekvenciákat. Ez lehet folyamatos kódolószekvencia, amely intront nem tartalmaz, ilyen a cDNS, de lehet olyan kódolószekvencia is, amely megfelelő kapcsolással egy vagy több intront tartalmaz. Az intron olyan RNS-szekvencia, amely a primer transzkriptumba átíródik, de az RNS sejten belüli hasítása és újra-összekapcsolása következtében eltávozik, és így érett mRNS képződik, amely fehérjévé lefordítható.

Az „iniciátorkodon” és „terminátorkodon” a kódolószekvenciában található három szomszédos nukleotidból álló egységet jelent, amelyek a fehérjeszintézis (mRNS-transzláció) során a lánc megindítását és lezárását irányítják.

A „nyílt leolvasókeret” kifejezés olyan aminosavszekvenciára utal, amit a kódolószekvencia a transzlációs iniciátorkodon és terminátorkodon közötti része kódol.

Az „RNS-transzkriptum” kifejezés azt a terméket jelenti, amely a DNS-szekvencia RNS-polimerázzal katalizált átírása során keletkezik. Ha az RNS-transzkriptum a DNS-szekvencia tökéletes komplementer másolata, akkor primer transzkriptumnak nevezzük, míg a primer transzkriptum átírás utáni feldolgozása során keletkező RNS-szekvenciát érett RNS-nek nevezzük.

A „messenger RNS” (mRNS) egy intron nélküli RNS-molekula, amely a sejtben fehérjévé fordítódik le. A cDNS olyan kétszálú DNS-molekula, amely az mRNS-ből származik, és azzal komplementer.

A „szabályozószekvencia” kifejezés olyan nukleotidszekvenciákat jelöl, amelyek a kódolószekvencia felett (5’), közben és/vagy alatt (3’) találhatók, és a kódolószekvencia átírását és/vagy kifejezését szabályozzák, adott esetben a sejtfehérje szintetizáló részeivel együttműködve. Az ilyen nukleotidszekvenciákra példaként említhető a promoterszekvencia, transzlációs leaderszekvencia, transzkripciós terminátorszekvencia és poliadenilező szekvencia.

A „promoter” kifejezés olyan DNS-szekvenciára utal, amely a génben általában a kódolószekvencia felett (5’) található, és az RNS-polimeráz és a megfelelő transzkripcióhoz szükséges más faktorok felismerő folyamatában közreműködve szabályozza a kódolószekvencia kifejezését. A promoter olyan DNS-szekvenciát is tartalmazhat, amely részt vesz azon fehérjefaktorok megkötésében, amelyek a fiziológiai vagy fejlődéstani kondíciók válaszaként szabályozzák a transzkripció iniciálásának hatékonyságát. Emellett tartalmazhat még hatásfokozó elemeket is.

A „hatásfokozó” olyan DNS-szekvencia, amely stimulálja a promoter aktivitását. A hatásfokozó lehet a promoter saját eleme, vagy olyan heterológ elem, amely a promoterbe beépülve fokozza annak szintjét és/vagy szövetspecifikusságát.

„Konstitúciós promotemek” nevezzük az olyan promotert, amely a gén kifejeződést bármely szövetben és bármely időpontban képes irányítani. Szervspecifikus vagy fejlődésspecifikus promoter az olyan promoter, amely a két kifejezést gyakorlatilag csak egy specifikus szervben, így a levélben vagy magban, illetve a szerv egy speciális fejlődési szintjén, így a korai vagy késői embriógenezis fázisában képes irányítani.

A „kifejezés” alatt a gén által kódolt fehérjetermék termelésére szolgáló folyamatot értjük. A „túlzott” kifejezés azt jelenti, hogy a transzgenikus szervezet a gén termékét olyan mennyiségben termeli, amely meghaladja a normális vagy nem transzformált szervezet termelési szintjét.

A „3’ nem kódoló szekvencia” a génen belül olyan DNS-szekvenciaszakaszt jelöl, amely egy transzkripciós terminátorszignált, poliadenilező szignált és az mRNS feldolgozására vagy a gén kifejezésére alkalmas valamely más szabályozószignált tartalmaz. A poliadenilező szignál általában poliadenilsavszakaszt kapcsol az mRNS prekurzor 3’-végéhez.

Az „5’ nem kódoló szekvencia” a génen belül olyan DNS-szekvenciaszakaszra utal, amely egy promoterszekvenciát és transzlációs leaderszekvenciát tartalmaz.

A „transzlációs leaderszekvencia” a génen belül olyan DNS-szekvenciaszakasz, amely a promoter és a kódolószekvencia között helyezkedik el, RNS-sé átíródik, és a teljesen feldolgozott mRNS-ben a transzlációs startkodon felett (5’) helyezkedik el. A transzlációs leaderszekvencia befolyásolja az mRNS-primer átírását, stabilitását vagy transzlációjának hatékonyságát.

Az „érett fehérje” a transzláció után feldolgozott polipeptidre utal, amely nem tartalmazza a hozzá tartozó szignálpeptidet.

A „prekurzorfehérje” az mRNS transzlációja során keletkező primer termék. A szignálpeptid a polipeptid aminoterminális meghosszabbítása, amely a transzláció során a polipeptiddel összekapcsolódva prekurzor peptidet képez, és amely biztosítja a kiválasztási útvonalba történő bejutást. A „szignálszekvencia” a szignálpeptidet kódoló nukleotidszekvenciát jelenti.

Az „intracelluláris lokalizációs szekvencia” olyan nukleotidszekvenciát jelent, amely intracelluláris feldolgozó szignált kódol. Az „intracelluláris feldolgozó szignál” olyan aminosavszekvencia, amely a lefordítás során a fehérjéhez kapcsolódik, és azt egy adott sejten belüli részecskéhez irányítja. Az endoplazmatikus retikulum (ER) stop tranzitszignál a polipeptid karboxiterminális meghosszabbítása, amely a transzláció során a polipeptidhez kapcsolódik, és a kiválasztási útvonalba lépő fehérjét visszatartja az ER-ben. Az „ER stop tranzitszekvencia” az ER feldolgozó szignált kódoló nukleotidszekvenciát jelenti. Más intracelluláris feldol5

HU 218 415 Β gozó szekvenciák olyan feldolgozó szignálokat kódolnak, amelyek a magban és/vagy levélben, illetve a vakuolában aktívak.

A „transzformáció” kifejezés egy idegen génnek a gazdaszervezet genomjába történő bejuttatását és genetikailag stabil beépítését jelenti. A növényi transzformációs módszerekre példaként említhető az Agrobacteriummal közvetített transzformáció, és a gyorsított részecskevagy „génágyúzás” transzformációs technológia.

A rekombináns DNS-technológia lehetővé teszi a kultúrnövényekben a kéntartalmú aminosavak mennyiségének növelését. Az előnyösen alkalmazható módszerekre a következő példák említhetők:

a) molekulaklónozás és gének in vitro manipulálása [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning; A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)];

b) gének mezőgazdaságilag fontos kultúrnövényekbe történő bejuttatása transzformáció segítségével, ahol a kultúrnövény lehet például szójabab [Chee és munkatársai: Plánt Physiol. 91, 1212-1218 (1989); Christou és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 7500-7504 (1989); Hinchee és munkatársai: Biotechnology, 6, 915-922 (1989); 301 749 számú európai közrebocsátási irat]; repce [De Block és munkatársai: Plánt Physiol. 91, 694-701 (1989)] és kukorica (Gordon-Kamm és munkatársai: Plánt Cell, 2, 603-618 (1990); Fromm és munkatársai: Biotechnology, 8, 833-839 (1990)] és

c) a bevitt gén magspecifikus kifejezése a transzgenikus növényben [Goldberg és munkatársai: Cell 56, 149-160 (1989); Thompson és Larkins: BioEssays 10, 108-113(1989)].

Ahhoz, hogy ezeket a módszereket kéntartalmú aminosavakban gazdag kultúrnövények kifejlesztéséhez alkalmazzuk, szükség van kereskedelmi fontosságú gének azonosítására és izolálására.

A kísérleti műveleteknél alkalmazott különböző oldatokat a szokott néven jelöljük, például SSC, SSPE és Denhardt-oldat, ezek összetétele megtalálható Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), B függelékben.

Kukorica HSZ-gén klónozása

A kukorica 10 kd zein gén [Kirihara és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 21, 477-484 (1988); Kirihara és munkatársai: Gene, 71, 359-370(1988)] ismert DNSszekvenciája (5. számú szekvencia) alapján oligonukleotidokat (6. és 7. számú szekvencia) állítunk elő, amelyeket primerként alkalmazzuk a templátként genomiális kukorica DNS-t használó polimeráz-láncreakcióban (PCR). A PCR-reakció termékét agarózgélen izoláljuk, és nick-transzlációval radioaktívan jelöljük, és hibridizációs próbaként használjuk. A PCR-reakció val kapott próbával lambda-EMBL-3 vektorban felvett kukorica genomiális DNS-tárat (Clontech) és plakkokat vizsgálunk. Ennek során teljes hosszúságú 10 kd zein gént izolálunk, amely tartalmazza az 5’ és 3’ szabályozószakaszokat.

Két hibridizálódó lambda-plakkot tisztítunk, és a klónozott kukorica DNS-fragmenst tovább jellemezzük. Restrikciós endonukleázzal végzett emésztés és agarózgélen végzett elektroforézis szerint a két klón azonos. A DNS-fragmenseket az agarózgélről Southern folthibridizálással nitro-cellulóz membránszűrőre visszük, és próbaként nick-transzlációval radioaktívan jelölt 10 kd zein DNS-sel hibridizáljuk. Egy egyetlen 7,5 kb BamHI fragmens, és egy egyetlen 1,4 kb Xbal fragmens hibridizál a próbával. Ezeket a fragmenseket a DNS-szekvenciaanalízishez pTZ18R fagmidbe (Pharmacia) szubklónozzuk.

A szekvenciából meglepő módon az következik, hogy az izolált gén rokonságban van a 10 kD zein génnel, de attól eltér. Ezt nagy kéntartalmú zein (HSZ) génnek neveztük. A DNS-fragmens 633 nukleotidból álló két leolvasókeretet tartalmaz a 10 kD zein gén 453 nukleotidjához viszonyítva. A HSZ-fehérje aminosavszekvenciája 76%-ban azonos a 10 kD zein szekvenciájával. A HSZ-gén hosszabb nyílt leolvasókerete azonban egy olyan metioninban gazdag domént kódol, amely nincs jelen a 10 kD zein génben, ezért az érett HSZfehérje 29% kéntartalmú aminosavat (28% metionint) tartalmaz a 10 kD zeinnél található 26%-kal (22% metioninnal) szemben. Ezért a HSZ-gén a pillanatnyilag ismert legmagasabb metionintartalmú mag-tárolófehérjét kódolja. A közismert génkifejező szignálok, így a TATA box és a poliadenilező szignál a HSZ-génben ugyanabban a pozícióban található meg, mint a 10 kD zein génben. A HSZ-gén a prekurzor polipeptid aminoterminális részén feltételezhetően 21 aminosavból álló szignálszekvenciát kódol a 10 kD génhez hasonlóan.

A találmány szerinti DNS-fragmens alkalmas arra, hogy kukoricából és más növényekből, elsősorban egyszikű növényekből lényegében homológ cDNS-molekulákat és magtároló fehérjéket kódoló géneket izoláljuk. A megfelelő gének izolálását a szokásos módon végezzük.

A növénynemesítésben közismert a restrikciós fragmens hosszúsági polimorfját (RFLP) okozó markerek alkalmazása [Tanksley és munkatársai : Bio. Technology 7, 257-264 (1989)]. A találmány szerinti nukleinsavfragmens kukorica RFLP-térképen térképezhető. Ezért a feltérképezett helyekhez kapcsolódó jellemzők vonatkozásában RFLP-markerként alkalmazhatók.

A HSZ-gén módosítása

A magas kéntartalmú mag-tárolófehérjét kódoló találmány szerinti nukleinsavffagmens megfelelő szabályozószekvenciákhoz kapcsolható, és felhasználható a fehéije mikroorganizmusokban, így Escherichia coliban vagy élesztőben, illetve transzgenikus növényekben, így kukoricában, szójababban vagy más kultúrnövényben történő túltermelésére. Az ilyen rekombináns DNS-szerkezet a természetes HSZ-gént vagy kimér gént tartalmaz. A találmány szerinti fragmens kódolószekvenciáját restrikciós endonukleázhelyek alkalmazásával és/vagy előállításával a szokásos módon izoláljuk [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].

HU 218 415 Β

Különösen előnyösen alkalmazhatók a természetes eredetű helyek, így az Ncol (5’-CCATGG) és Xbal (5’TCTAGA), amelyek lehetővé teszik a kódolószekvencia pontos eltávolítását az ATG transzlációs iniciátorkodonnal indulva és a TAG transzlációs stopkodonnal bezárva. A HSZ kódolószakaszban azonban három Ncol hely található. Szükség volt két hely kiiktatására, és csak egy hely fenntartására (1. számú nukleotidszekvenciában a 751-756 számú nukleotidok), amely magában foglalja a transzlációs startkodont. Egy előnyös találmány szerinti DNS-fragmens (2. számú szekvencia) előállításához in vitro helyspecifikus mutációt végzünk, amelynek során a kódolószekvenciában található két Ncol helyet eltávolítjuk a gén által kódolt aminosavszekvencia megváltozása nélkül. így a DNS Ncol és Xbal enzimekkel végzett teljes emésztése során egyetlen 637 bp fragmenst kapunk, amely tartalmazza a prekurzor HSZ polipeptid teljes kódolószekvenciáját. A kimér gén előállításának további elősegítéséhez további egyedi restrikciós endonukleázhelyeket alakítunk ki közvetlenül a HSZ transzlációs stopszignálját követően. Az Xbal helyre oligonukleotidokat (10. és 11. számú szekvencia) inszertálunk, amelyek két új Smal és KpnI restrikciós helyet tartalmaznak, és ezáltal elroncsoljuk az Xbal helyet. Ezután az 1. számú szekvenciában található egyedi Xbal helyet (1-6 számú nukleotid) és Sspl helyet (1823-1828 számú nukleotid) alkalmazva olyan fragmenst állítunk elő, amely tartalmazza a HSZ kódolószakaszt, és a hozzá tartozó 5’- és 3-szabályozószakaszokat. Ezt a fragmenst Xbal és Smal enzimekkel emésztett kereskedelmi pTZ19R vektorba (Pharmacia) klónozzuk, amelynek során pCCIO plazmidot kapunk. A pCCIO plazmidot 1990. december 7-én ATCC 68490 számon deponáltuk a Budapesti Szerződés előírásai szerint.

A HSZ-fehérje érett formájának kifejezéséhez szükség van egy olyan módosított HSZ-génre, amely egyedi restrikciós endonukleázhelyet tartalmaz az érett fehérje kiindulási pontjánál. Ehhez PCR segítségével DNSfragmenst állítunk elő. Oligonukleotid primereket (12. és 13. számú szekvencia) állítunk elő úgy, hogy a PCRmódszerrel kapott fragmens (3. számú szekvencia) BspHI helyet tartalmazzon, amelynek során Ncol enzimmel végzett emésztéssel azonos tapadó véget kapunk. Ez a hely a szignálszekvencia és az érett HSZ-t kódoló szekvencia kapcsolódási pontjánál helyezkedik el. A PCR-módszerrel kapott fragmens Xbal helyet is tartalmaz a HSZ-gén transzlációs terminálján.

PCR-módszerrel olyan gént állítunk elő, amely a HSZ nagy metionintartalmú doménjét (HMD) kódolja. Az oligonukleotidokat (14. és 15. számú szekvencia) emésztve Ndel helyet alakítunk ki, amely tartalmazza a transzlációs iniciátorkodont, és egy EcoRI helyet alakítunk ki közvetlen a transzlációs terminátorkodon után (lásd a 4. számú szekvenciát). Ezek a helyek lehetővé teszik a HMD könnyű inszertálását a kifejező vektorba.

HSZ kifezezése E. coliban

A HSZ kódolószekvenciát E. coliban fejezzük ki bakteriofág T7 RNS polimeráz/T7 promoter rendszer [Studier és munkatársai: Methods in Enzymology 185, 60-89 (1990)] alkalmazásával. A HSZ kódolószekvenciát tartalmazó Ncol-Xbal fragmenst kifejező vektorba inszertáljuk. A kapott pCCll plazmid a prekurzor HSZ-fehérjét fejezi ki. Emellett előállítunk egy pCC12 plazmidot, amely a szignálszekvencia nélküli HSZ-fehérjét fejezi ki. Az érett HSZ-t kódoló DNSfragmenst ehhez a szerkezethez PCR-reakcióval állítjuk elő a fent ismertetett módon, és kifejezővektorba inszertáljuk.

A HSZ polipeptid kifejezésének kimutatásához a pCCl 1 és pCC12 plazmidokat HMS 174 E. coli törzsbe transzformáljuk, és 35S metioninnal in vivő jelöljük [Studier és Moffatt: J. Mól. Bioi. 189, 113-130 (1986)]. A HSZ-fehérje nagy metionintartalma miatt ez egy speciális és érzékeny eszközt jelent a kifejezés detektálására. A sejtextraktumokat SDS- poliakrilamidgélen futtatjuk, majd szárítjuk és autoradiográfiás módszerrel vizsgáljuk. Mind a pCCll, mind a pCC12 extraktumában megjelenik egy prominens, jelölt fehérjesáv mintegy 20 kD móltömegértéknél. Ez összhangban van az érett hosszúságú HSZ-polipeptid feltételezett méretével, ami arra utal, hogy a pCCll transzformánsban előállított prekurzor fehérjét az E. coli sejt feldolgozza. Ha az összes sejtfehérjét Coomassie Brilliant Blue megfestéssel feltárjuk, majd indukáljuk, és SDS-poliakrilamidgél elektroforézisen vizsgáljuk, 20 kD fehérjének megfelelő sáv található a pCC12 lizátumban (ami hiányzik a pCCll lizátumban), ami arra utal, hogy a fehérje érett formája nagy mennyiségben termelődik.

A találmány szerinti nukleinsavfragmensek felhasználhatók nagy mennyiségű HSZ, HMD vagy kéntartalmú aminosavakban dús, elsősorban metioninban dús összfehérje E. coli vagy más mikroorganizmus fermentálásával történő előállítására. Ehhez a találmány szerinti nukleinsavfragmenst működőképes módon megfelelő szabályozószekvenciához kapcsoljuk, ami promoter szekvenciát, transzlációs leaderszekvenciát, és 3’ nem kódoló szekvenciát tartalmaz. A kimér gén ezután a mikroorganizmusba transzformációval bevihető és a transzformált mikroorganizmus a kimér gén nagymértékű kifejezését biztosító körülmények között tenyészthető. A kéntartalmú aminosavakban gazdag fehérjét tartalmazó sejtek összegyűjthetők, és a dúsított fehérje extrahálható. A HSZ-fehérje ezután tisztítható.

Nagy mennyiségű HSZ-fehérje E. coliban történő előállításához pCC12 plazmiddal transzformált BL21(DE3)pLysE törzset [Studier és munkatársai: Methods in Enzymology 185, 60-89 (1990)] alkalmazunk. A HSZ-fehérjét az IPTG-vel (izopropil-tio-P-galaktozid) indukált tenyészet extraktumából tisztítjuk. A HSZ-fehétje oldhatatlan csapadékban található, ami a sejtextraktum kis sebességű centrifugálásával könnyen elválasztható. A celluláris fehérjék fő tömege a felülúszóban eltávozik. A HSZ-t ezután a centrifugálás során kapott pelletből 10 mmol/1 β-merkapto-etanolt tartalmazó 70%-os izopropanollal extraháljuk, és szelektív szolubilizálás után közel tiszta (90% feletti tisztaságú) formában kapjuk. 1 liter sejttenyészetből 10-100 mg HSZ-fehérjét kapunk. Mindebből következik, hogy a

HU 218 415 Β

HSZ-fehérje termelése az E. coliban a sejtre nézve nem toxikus, ezért nagy mennyiségű kifejezés végezhető a BL21(DE3) törzzsel [Studier és munkatársai: Methods in Enzymology 185, 60-89 (1990)].

HSZ kifejezése növényben

A HSZ vagy HMD kódolószekvenciájának kifejezéséhez gazdaként előnyösen alkalmazhatók az eukarióta szervezetek, elsősorban magasabb rendű növények sejtjei. Magasabb rendű növényként előnyösen alkalmazható a szójabab, repce (Brassica napus, B. campestris), napraforgó (Helianthus annus), gyapot (Gossypium hirsutum), kukorica, dohány (Nicotiana Tubacum), lucerna (Medicago sativa), búza (Triticum sp.), árpa (Hordeum vulgare), zab (Avena sativa L.), cirok (Sorghum bicolor), rizs (Oryza sativa) és takarmányfiivek. Növényben történő kifejezéshez az adott növényben funkcióképes szabályozószekvenciát használunk.

Idegen gének növényben történő kifejezése közismert folyamat [De Blaere és munkatársai: Meth. Enzymol. 153, 277-291 (1987)]. A kódolószekvencia kifejezését irányító promoterként tetszőleges eredetű promotert alkalmazhatunk, amennyiben transzkripciós aktivitása elegendő ahhoz, hogy a kívánt gazdaszövetben a találmány szerint fokozza a HSZ-hez vagy HMDhez vezető transzlációképes mRNS mennyiségét. Valamennyi növényszövetben, elsősorban a levelekben előnyös promoterként alkalmazhatók azok, amelyek a karfiol-mozaikvírus 19S és 35S transzkriptjét szabályozzák (Odell és munkatársai: Natúré, 313, 810-812 (1985); Hull és munkatársai: Virology, 86, 482-493 (1987)], valamint azok, amelyek a ribulóz-l,5-biszfoszfátkarboxiláz kis alegységéhez vezetnek [Morelli és munkatársai: Natúré, 315, 200 (1985); Broglie és munkatársai: Science 224, 838 (1984); Hererra-Estrella és munkatársai: Nautre 310, 115 (1984); Coruzzi és munkatársai: EMBO J. 3, 1671 (1984); Faciotti és munkatársai: Bio/Technology 3, 241 (1985)], azok, amelyek kukorica zein fehérjéhez vezetnek [Matzke és munkatársai: EMBO J. 3, 1525 (1984)], és azok, amelyek klorofill A/B kötőfehérjéhez vezetnek [Lampa és munkatársai: Natúré 316, 750-752 (1986)].

A találmány értelmében előnyösen olyan promotert választunk, amely specifikusan a növény egy vagy több szervében fejeződik ki. Példaként említhető a ribulóz1,5-biszfoszfát-karboxiláz kis alegységének könnyen indukálható promotere, ha az expressziót a fotoszintetikus szervekben kívánjuk megvalósítani, valamint a specifikusan a magokban hatékony promoterek.

Előnyösek azok a promoterek, amelyek specifikusan a magban teszik lehetővé az expressziót. Az ilyen promoter elsősorban azért előnyös, mivel a magok képezik az emészthető fehérjék primer forrását, és emellett a magspecifikus expresszió kiküszöböli az egyéb szervekben jelentkező potenciális káros hatásokat. A magspecifikus promoterekre példaként említhetők a mag-tárolófehérjék promoterei, mivel ezek a fehérjék teszik ki a magban található összfehérjék több mint 50%-át. A mag-tárolófehérjéket pontosan szabályozzák, és szinte kizárólag a magban fejeződnek ki, vagyis erősen szervspecifikusak, és kifejeződésük a növény fejlődésének meghatározott szakaszára korlátozódik [Higgins és munkatársai: Ann. Rév. Plánt Physiol. 35, 191-221 (1984); Goldberg és munkatársai: Cell 56, 149-160 (1989); Thompson és munkatársai: BioEssays 10, 108-113 (1989)]. Emellett különböző magtároló fehérjék a mag fejlődésének különböző fázisaiban fejezhetők ki.

Az utóbbi időkből számos példa ismert mag-tárolófehérje gének különböző transzgén kétszikű növényekben végzett magspecifikus kifejezésére. Az ilyen kétszikű növényekből származó génekre példaként említhetők a következő termékeket kódoló gének: bab-P-fazeolin [Sengupta-Gopalan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3320-3324 (1985); Hoffman és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 11, 717-729 (1988)] bablecitin (Voelker és munkatársai: EMBO J. 6, 3571-3577 (1987)], szójabablecitin (Okamuro és munkatársai: Proc. Natl. Acad Sci. USA 83, 8240-8244 (1986)], szójababkunitz tripszininhibitor [Perez-Grau és munktársai: Plánt Cell 1, 095-1109 (1989)], szójabab-P-konglicinin [Beachy és munkatársai: EMBO J. 4, 3047-3053 (1985); Barker és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 458-462 (1988); Chen és munkatársai: EMBO J. 7, 297-302 (1988); Chen és munkatársai: Dev. Génét. 10, 112-122 (1989); Naito és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 11, 109-123 (1988)], borsóvicilin (Higgins és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 11, 683-695 (1988)], borsókonvicilin [Newbigin és munkatársai: Planta 180, 461 (1990)], borsólegumin [Shirsat és munkatársai: Mól. Gén. Genetics 215, 326 (1989)], repce napin (Radke és munkatársai: Theor. Appl. Génét. 75, 685-694 (1988)], valamint az egyszikű növényekből származó olyan gének, amelyek az alábbi termékeket kódolják: kukorica 15 kD zein [Hoffman és munkatársai: EMBO J. 6, 3213-3221 (1987); Schernthaner és munkatársai: EMBO J. 7, 1249-1253 (1988); Williamson és munkatársai: Plánt Physiol. 88, 1002-1007 (1988)], árpa βhordein [Marris és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 10, 359-366 (1988)], és búza glutenin [Colot és munkatársai: EMBO J. 6, 3559-3564 (1987)]. Emellett a kimér génszerkezetekben működőképesen heterológ kódolószekvenciákhoz kapcsolt magspecifikus gének promoterei megtartják a transzgén növényben a megfelelő időbeli és térbeli kifejezési mintát. Az ilyenre példaként említhető az Arabidopsis thaliana 2S mag-tárolófehérje génpromoter, amely enkefalin peptideket fejez ki Arabidopsis és B. napus magokban [Vandekerckhove és munkatársai: Bio/Technology 7, 929-932 (1989)], a bab lecitin és bab β-fazeolin promoter, amely luciferázt fejez ki [Riggs és munkatársai: Plánt Sci. 63, 47-57 (1989)], és a búza glutenin promoter, amely klóramfenikol-acetil-transzferázt fejez ki [Colot és munkatársai: EMBO J. 6, 3559-3564 (1987)].

A találmány szerinti nukleinsavffagmensek kifejezésére előnyösen alkalmazhatók a jól ismert szójababmagtárolófehéqe gének heterológ promoteijei, ezekre példaként említhető a Kunitz tripszin inhibitor [Jofuku és munkatársai: Plánt Cell 1, 1079-1093 (1989); Perez8

HU 218 415 Β

Grau és munkatársai: Plánt Cell 1, 1095-1109 (1989)], a glicinin [Nielson és munkatársai: Plánt Cell 1, 313-328 (1989)], a β-konglicinin [Harada és munkatársai: Plánt Cell 1, 415-425 (1989)]. A szójabab-β-konglicinin tárolófehéije a’- és β-alegységeit kódoló gének promoterei különösen előnyösen alkalmazhatók a HSZ mRNS kifejezése során a közepes vagy késői fejlődési stádiumban lévő szójababmag sziklevelében [Beachy és munkatársai: EMBO J. 4, 3047-3053 (1985); Barker és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 458-462 (1988); Chen és munkatársai: EMBO J. 7, 297-302 (1988); Chen és munkatársai: Dev. Génét 10, 112-122 (1989); Naito és munkatársai: Plánt Mól Bioi., 11, 109-123 (1988)]. Ennek oka, hogy

a) a transzgén magokban történő kifejezés során nagyon kicsi a pozíciós hatás, és

b) a két promoter eltérő időbeli szabályozást mutat, vagyis az α-alegység génpromotere néhány nappal korábban fejeződik ki, mint a β-alegység génpromotere.

A találmány szerinti nukleinsavfragmensek kifejezéséhez előnyösen alkalmazhatók továbbá egyes, jól ismert kukoricamag-tárolófehérje gének heterológ promoterei. Az ilyen génekre példaként említhetők a 10 kD zein [Kirihara és munkatársai: Gene 71, 359-370 (1988)], a 27 kD zein [Prat és munkatársai: Gene 52, 49-51 (1987); Gallardo és munkatársai: Plánt Sci. 54, 211-281 (1988)] és a 19 kD zein [Marks és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 16 451-16 459 (1985)] fehéqék génjei. Az ilyen promoterek kukoricában mérhető relatív transzkripciós aktivitása [Kodrzyck és munkatársai: Plánt Cell 1, 105-114 (1989)] megfelelő alapot nyújt a kukoricában alkalmazható kimér génszerkezethez felhasználható promoter kiválasztásához.

A HSZ vagy HMD mRNS megfelelő szintű kifejezéséhez különböző promotereket tartalmazó különböző kimér génekre lehet szükség. Az ilyen kimér gének a gazdanövénybe bejuttathatok együtt egy expressziós vektorban vagy egymás után több vektor alkalmazásával. A HSZ vagy HMD kimer transzkripciójának szintje növelhető hatásfokozó vagy hatásfokozóhoz hasonló elem alkalmazásával a természetes HSZ promoterben vagy más promoterszerkezetben. Hatásfokozóként alkalmazható vírusos hatásfokozó, így a 35S promoterben található hatásfokozó [Odell és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 10, 263-272 (1988)], az opin génekben található hatásfokozó [Fromm és munkatársai: Plánt Cell 1, 977-984 (1989)], valamint bármely olyan más eredetű hatásfokozó, amely a találmány szerinti nukleinsavfragmenshez működőképesen hozzákapcsolt promoterbe beépítve elősegíti a transzkripciót.

Különösen előnyös a β-konglicinin a-alegységéből származó génből izolált DNS-szekvencia, amely magspecifikus módon 40-szeresre fokozza a promoter hatását [Chen és munkatársai: EMBO J. 7, 297-302 (1988); Chen és munkatársai: Dev. Génét. 10, 112-122 (1989)]. Az ilyen elem a szokásos módon izolálható és a gén promoterszakaszába bevihető, és így biztosítjuk a transzgén növényben a promoter által irányított magspecifikus fokozott szintű kifejeződést. Ha az ilyen elemet olyan magspecifikus génbe építjük be, amely a β-konglicinin géntől eltérő időpontban fejeződik ki, akkor a transzgén növényben a mag fejlődésében hosszabb periódusú kifejeződést érünk el.

A találmány szerinti megoldás a kívánt cél elérése érdekében más módszerekkel is megvalósítható. Ennek egyik formájában a találmány növények módosításán alapszik, amelynek során a HSZ-fehérje fokozott mértékben termelődik, vagyis lényegesen nagyobb számú másolat képződik.

A találmány értelmében a HSZ kódolószakasz megfelelő kifejezéséhez olyan 3’ nem kódoló szakaszokat alkalmazunk, amelyek transzkripciós terminátorszignálként, poliadenilező szignálként vagy más szabályozószekvenciaként szolgálnak. Ilyen lehet a HSZ-gén természetes 3’-vége, heterológ zein gén 3’-vége, valamely tárolófehérje 3’-vége, így szójabab^-kongliciningén 3’-vége, vírusgén 3’-vége, így 35S vagy 19S karfiolmozaikvírus transzkriptum 3’-vége, opinszintetizáló gén 3’-vége, ribulóz-l,5-biszfoszfát-karboxiláz vagy klorofill A/B kötöfehérje 3’-vége, vagy tetszőleges eredetű 3’-végi szekvencia, amely nukleinsavszekvenciájában tartalmazza a megfelelő szabályozóinformációkat, és így biztosítja a promoter/HSZ vagy promoter/HMD kódolószakasz-kombináció megfelelő kifejezését. A különböző 3’ nem kódoló szakaszok alkalmazása az irodalomból közismert (például Ingelbrecht és munkatársai: Plánt Cell 1, 671-680 (1989)].

A HSZ vagy HMD kódolószekvenciája a találmány szerinti fehétjék megfelelő kifejezéséhez kívánt esetben intracelluláris lokalizálószekvenciákat kódoló DNSszekvenciákkal is kiegészíthető. Ennek megfelelően a HSZ természetes szignálszekvenciáját eltávolítjuk, vagy olyan szignálszekvenciával helyettesítjük, amelyről ismert, hogy a kívánt növényben fiinkcióképes. A szignálszekvencia eltávolítása esetén a HSZ-fehérje feltételezhetően a sejt citoplazmájában marad. Alternatív módon, a HSZ egyszikű szignálszekvenciája babból (Phaseolus vulgáris) származó fazeolin β-alegységére vonatkozó szignálszekvenciával vagy szójababból származó β-konglicinin α-alegységére vonatkozó szignálszekvenciával [Doyle és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 9228-9238 (1986)] helyettesíthető, amelyek kétszikű növényekben funkcióképesek. Hoffinan és munkatársai [EMBO J. 6, 3213-3221 (1987)] kimutatták, hogy a 15 kD zein egyszikű prekurzorának szignálszekvenciája a fehérjét a kiválasztó útvonalra irányította, és a fehérje transzgén dohánymagban megfelelő módon feldolgozódik. A fehérje azonban a kukoricától eltérően nem marad az endoplazmatikus retikulumban. Ahhoz, hogy a fehéqét visszatartsuk az endoplazmatikus retikulumban, stop tranzitszekvenciát kell alkalmazni. Ismert, hogy a fehéije karboxiterminális részén Lys-Asp-Glu-Leu aminosavszekvenciát (28. számú szekvencia) kódoló DNSszekvencia alkalmazása esetén a fehéije az endoplazmatikus retikulum üregeiben marad [Munro és munkatársai: Cell 48, 899-907 (1987); Pelham: EMBO J. 7, 913-918 (1988); Pelham és munkatársai: EMBO J. 7, 1757-1762 (1988); Inohara és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3564-3568 (1989); Hesse és mun9

HU 218 415 Β katársai: EMBO J. 8, 2453-2461 (1989)]. Bizonyos növényi magoknál a tárolófehéqe a sejt vakuólumában helyezkedik el. A találmány megvalósításához a HSZvagy HMD-fehérjét az ilyen növény vakuólumába kell irányítani, és ehhez vakuólum-célszekvenciát kell használni. Vakuólum-célszekvenciaként szolgáló rövid aminosavdomén található a bab fitohemaglutininben, amelynek hatására a fehéije a sziklevél tároló vakuólumában halmozódik fel [Tagúé és munkatársai : Plánt Cell 2, 533-546 (1990)]. Ismert olyan karboxiterminális aminosavszekvencia is, amely a zablecitint transzgén dohányvakuólumába irányítja [Bednarek és munkatársai: Plánt Cell 2, 1145-1155 (1990)].

HSZ növényben történő kifejezésére alkalmas kimér gén előállítása

A HSZ növényben történő kifejezésére alkalmas kimér gének előállításához három magspecifikus génkifejező kazettát alkalmazunk. A kifejezőkazetták olyan szabályozószakaszokat tartalmaznak, amelyek három magas szinten kifejeződő mag-tárolófehérje génből származnak:

1) bab (Phaseolus vulgáris) növényből származó fazeolin β-alegysége,

2) szójabab növényből származó β-konglicinin a’alegysége, és

3) kukorica növényből származó 10 kD zein.

A kazettákat vázlatosan a 2. ábra mutatja. Ezek mindegyike egyetlen Ncol hellyel rendelkezik a közvetlenül az 5’ szabályozó szakaszt követően, és emellett az Xbal, Smal és KpnI helyek közül legalább kettővel rendelkeznek közvetlenül a 3’-szabályozószakaszt megelőzően.

A teljes HSZ kódolószakaszt tartalmazó Ncol-Xbal fragmenst (2. számú szekvencia) és a gént a szignálszekvencia nélkül tartalmazó BspHI-Xbal fragmenst, vagyis az érett fehéijét kódoló szekvenciát (3. számú szekvencia) Ncol és Xbal enzimekkel emésztett fazeolin- és β-konglicininkifejező kazettába (2. ábra) inszertáljuk. A 10 kD zein kazettába történő inszertáláshoz a HSZ kódolószakaszt tartalmazó Ncol-Smal fragmenst Ncol és Smal enzimekkel emésztett 10 kD zein kazettába inszertáljuk.

A magasabb rendű növények sejtjeinek transzformálását különböző eljárásokkal végezhetjük (295 959 számú európai szabadalmi leírás és 138 341 számú európai közrebocsátási irat). Az egyik ilyen módszernél a transzformálást Agrobacterium spp. Ti és Ri plazmidján alapuló vektorral végezzük. Előnyösen alkalmazhatók ezen vektorok bináris típusa. A Ti eredetű vektorok különböző magasrendű növények, így egyszikűek és kétszikűek, például szójabab, gyapot és repce transzformálására alkalmasak (Pacciotti és munkatársai: Bio/Technology 3, 241 (1985); Bime és munkatásai: Plánt Cell, Tissue and Organ Culture 8, 3, (1987); Sukhapinda és munkatársai: Plánt Mól Bioi. 8, 209-216 (1987); Lorz és munkatásai: Mól. Gén. Génét. 199, 178 (1985); Potrykus: Mól. Gén. Génét. 199, 183 (1985)].

A fazeolin-HSZ kimér gén kazettát pZS97K vektorba (3. ábra) inszertáljuk, amely egy biner Ti plazmidvektor-rendszer [Bevan: Nucl. Acids. Rés. 12,

8711-8720 (1984)] részét képezi, amely vektorrendszer Agrobacterium tumefaciensből származik. A vektor az alábbi komponenseket tartalmazza:

1) nopalin-szintáz/neomidin foszfotranszferáz kimér gén (nos:NPT II), amely a transzformált növényi sejtben szelektálható markerként működik [Bevan és munkatársai: Natúré 304, 184-186 (1983)],

2) a Ti plazmidból származó tDNS bal és jobb szegélye [Bevan: Nucl Acids. Rés. 12, 8711-8720(1984)],

3) E. coli lacZ a komplementer szegmens [Vieria és Messing: Gene 19, 259-267 (1982)], amely egyedi restrikciós endonukleázhelyekkel rendelkezik az EcoRI, KpnI, BamHl és Sáli enzimek vonatkozásában,

4) bakteriális replikációs origó a pVSl Pseudomonas plazmidból [Itoh és munkatársai: Plasmid 11, 206-220, 1984)], és

5) bakteriális neomicin foszfotranszferáz gén a Tn5-ből [Berg és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3628-3632 (1975)], amely szelektálható markerként működik transzformáit A. tumefaciensben.

A kimér HSZ-gént tartalmazó biner vektort háromszülős párosítással [Ruvkin és munkatársai: Natúré 289, 85-88 (1981)] LBA4404/pAL4404 Agrobacterium törzsbe [Hockema és munkatársai: Natúré 303, 179-180 (1983)] transzformáljuk. Az Agrobacterium transzformánsokkal dohánylevél-darabkákat [Horsch és munkatársai: Science 227, 1229-1231 (1985)] inokulálunk. A növényeket kanamicint tartalmazó szelektív közegen regeneráljuk.

A transzformálás megvalósítható más ismert módszerekkel is, így az idegen DNS-szerkezet közvetlen felvételével (295 959 számú európai szabadalmi leírás), elektroporációs módszerrel [Fromm és munkatársai: Natúré (London) 319, 791 (1986)] vagy nagy sebességű ballisztikus bombázással, amit nukleinsavszerkezettel bevont fémrészecskékkel végzünk [Kline és munkatársai: Natúré (London) 327, 70 (1987) és 4 945 050 számú USA-beli szabadalmi leírás]. A transzformált sejteket a szokásos módon regeneráljuk.

Az ismertetett transzformációs módszerek előnyösen alkalmazhatók kereskedelmi fontosságú kultúrnövények esetében, amelyekre példaként említhető a repce [De Block és munkatársai: Plánt Physiol. 91, 694-701 (1989)], napraforgó [Everett és munkatársai: Bio/Technology 5, 1201 (1987)], szójabab [McCabe és munkatársai: Bio/Technology, 6, 923 (1988); Hinche és munkatársai: Bio/Technology 6, 915 (1988); Chee és munkatársai: Plánt Physiol. 91, 1212-1218 (1989); Christou és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7500-7504 (1989); 301 749 számú európai szabadalmi leírás és kukorica (Gordon-Kamm és munkatársai: Plánt Cell 2, 603-618 (1990); Fromm és munkatársai: Biotechnology 8, 833-839(1990)].

A találmányt közelebbről az alábbi példákkal világítjuk meg anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra kor10

HU 218 415 Β látozódna. A példák a találmány szerinti megoldás előnyös megvalósítási módjainak illusztrálására szolgálnak. A leírás és a példák alapján szakember számára más megvalósítási módok is nyilvánvalóak.

1. példa

HSZ-gén molekuláris klónozása

Genomtárként lambda-bakteriofágban felvett kukoricatárat alkalmazunk (Clontech, Palo Alto, Califomia, USA). Ennél a tárnál a kukorica DNS-t 7 napos nővé- 10 nyékből sötétben távolították el. Vektorként 15 kb átlagos méretű BamHl fragmenseket hordozó lambdaEMBL-3 vektor szolgál. A plakk-képző titer a tájékoztató szerint i-9xl0⁹ egység/ml, méréseink szerint 2,5 xlO⁹ egység/ml.

A DNS-hibridizációs mintavizsgálathoz mintegy 30 000 plakk-képző egységet viszünk fel 15 darab 150 mm-es Luria-közegű (LB) agarlemezre, amely összesen 450 000 plakkot jelent. A lemezre történő felvitel során gazdaként LB+0,2% maltózközegben te- 20 nyésztett E. coli LE392 törzset és közegként LB-7,2% agarózközeget alkalmazunk. A plakkokat nitro-cellulóz-szűrőn (Millipore HATF, 0,45 mm pórusméret) abszorbeáljuk, 1,5 mol/1 NaCl és 0,5 mol/1 Trisz-HCl 5 (pH=7,5) elegyben denaturáljuk, és 3xSSC közeggel [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] öblítjük. A szűrőn lévő foltokat Whatman 3MM papírra visszük, és vákuumban 2 órán keresztül 80 °C hőmérsékleten melegítjük, amelynek során a fágDNS a membránokban fixen rögzítődik.

Hibridizációs próbát állítunk elő, amellyel a tárat magas metionintartalmú 20 kD zein génre [Kirihara és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 211, 477-484 (1988)] vizsgáljuk a hozzá tartozó 5’- és 3’-farkazó szakaszokkal együtt. Applied Biosystems DNS-szintetizátorral a fenti gént farkazó 30 bázis hosszúságú két oligonukleotidot állítunk elő. Az SM56 oligomer (6. számú szekvencia) az első tíz aminosavon keresztül a pozitív szálat kódolja:

SM56 5’-ATG GCA GCC AAG ATG CTT GCA TTG TTC GCT-3’ (6. számú szekvencia)

Met Ala Ala Lys Met Leu Ala Leu Phe Ala A CFC77 oligomer (7. számú szekvencia) az utolsó (-21 és -12 helyzetű aminosavak az 5. számú szék- tíz aminosavra kiterjedően a negatív szálat kódolja:

venciából)

CFC77 3’-AAT GTC GTT GGG AAA CAA CCA CGA CGT AAG-5’ (7. számú szekvencia)

Leu Gin Gin Pro Phe Val Gly Ala Ala Phe (120 és 129 helyzetű aminosavak az 5. számú szekvenciából)

Ezeket alkalmazva polimeráz-láncreakcióban (PCR) 10 kD kódolószakaszt állítunk elő templátként kukorica genomiális DNS-t (B85 törzs) alkalmazva. A PCR-reakció megvalósításához Perkin-Elmer Cetus készletet alkalmazunk a gyártó előírásai szerint egy termosztált ciklikus üzemű berendezésben. A reakcióterméket 1 tömeg%-os agarózgélen futtatjuk, és etidium-bromid festékkel színezzük. Egy erős DNS-sávot kapunk a 10 kD zein génnél elvárt 450 bp méretnél, és egy gyenge sávot kapunk mintegy 650 bp méretnél. A 450 bp sávot elektroeluálással DEAE cellulózmembránra (Schleicher és Schuell) visszük, és a membránról 65 °C hőmérsékleten 1 mol/1 NaCl, 0,1 mmol/1 EDTA és 20 mmol/1 Trisz-HCl (pH=8,0) eleggyel eluáljuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk, és 70 tömeg%-os etanollal öblítjük és szárítjuk. A száraz pelletet 10 μΐ vízben szuszpendáljuk, és ennek egy részét (mintegy 1 μΐ) a következő PCR-reakcióhoz használjuk, amelynek során aszimmetrikus feltöltéssel egyszálú, lineáris DNS-t állítunk elő. Ehhez SM56 és CFC77 primereket alkalmazunk 1:20 mólarányban és 20:1 mólarányban. A termékeket, vagyis a 10 kD zein gén pozitív és negatív szálait fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és NACSoszlopon (Bethesda Research Laboratories) áthajtva megszabadítjuk a felesleges oligomerektől. Az eluátumot etanollal kétszer kicsapjuk, 70 tömeg%-os etanollal öblítjük, és szárítjuk. A DNS-szekvenálást megfelelő komplementer primerrel és szekvenálókészlettel (United States Biochemicals Company) végezzük a gyártó előírásai szerint. A PCR-termék szekvenciája azonos a 10 kD zein gén publikált szekvenciájával. Radioaktív mintát állítunk elő a PCR-reakcióval nyert 10 kD zein gén nick-transzlációjával, amelyhez ³²P-dCTP-t és nick-transzlációs készletet (Bethesda Research Laboratories) használunk.

A lambda-fág plakkokat hordozó 15 db 150 mm-es nitro-cellulóz-szűrőt radioaktív 10 kD génmintával vizsgáljuk. Egy órán keresztül 60 °C hőmérsékleten 50xSSPE, 5x Denhardt-oldat [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], 0,1 tömeg% SDS és 100 g/ml borjú-csecsemőmirigy-DNS elegyben előhibridizáljuk, majd denaturált radiojelölésű 10 kD zein gént (CPM/ml) tartalmazó friss hibridizációs elegyre visszük, és egy éjszakán keresztül 60 °C hőmérsékleten tároljuk. Következő nap szigorú körülmények között öblítjük: 1 órán keresztül szobahőmérsékleten 2xSSC-0,05 tömeg% SDS elegyben és 1 órán keresztül 68 °C hőmérsékleten lxSSC-0,1 tömeg% SDS elegyben. A foltokat 3M Whatman-papírra visszük, majd levegőn szárítjuk, és -70 °C hőmérsékleten autoradiográfíásan Kodak XAR-5 filmen DuPont Cronex Lightning Plus intenzifikáló ernyőn vizsgáljuk. Az autoradiogramból 20 hibridizáló plakkot azonosítottunk. Ezeket a plakkokat az eredeti Petri-csészéről eltávolítjuk, és hígítva mintegy 100 plakk/80 mm lemezarány mellett szélesztjük. A plakkokat nitro-cellulóz-szűrőn

HU 218 415 Β adszorbeáljuk, és ugyanezzel az eljárással ismét vizsgáljuk. Autoradiográfiásan az eredeti plakkok közül csak a 10 számú mutat két hibridizáló plakkot. Ezeket a plakkokat a mintával harmadszor is vizsgáljuk, amelynek során valamennyi utódplakk hibridizál, ami arra utal, hogy a tiszta kiónt izoláltuk.

A két fágklónból (lambda 10-1 és lambda 10-2 kiónból) DNS-t állítunk elő a kis léptékű folyékony lambda-fág lizátum módszenei [Ansul és munkatársai: Current Protocols in Molecular Biology, 1122, 1135-6 (1987)]. Restrikciós endonukleáz emésztés és agarózgél-elektroforézis szerint a két klón azonos. Az agarózgélról származó DNS-fragmenseket Southern folthibridizálással [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] nitro-cellulóz membránszűrőre visszük, és nick transzlációval előállított radioaktív jelölésű 10 kD zein DNS-sel vizsgáljuk. A mintával egyetlen 7,5 kb BamHI ffagmens és egyetlen 1,4 kb Xbal ffagmens hibridizál.

A 7,5 kb BamHI fragmenst 0,5 tömeg% alacsony olvadáspontú (LMP) agarózgélen futtatott lambdaDNS-BamHI enzimmel végzett emésztésével izoláljuk. A 7,5 kb sávot kivágjuk, megolvasztjuk, és 0,5 mol/1 nátrium-kloridban hígítva NACS-oszlopra visszük, amit 0,5 mol/1 nátrium-klorid, 10 mmol/1 Trisz-HCl (pH=7,2) és 1 mmol/1 EDTA elegyével mosunk, és a fragmenst 2 mol/1 nátrium-klorid, 10 mmol/1 Trisz-HCl (pH=7,2) és 1 mmol/1 EDTA elegyével eluáljuk. Ezt a fragmenst pTZ18R fagmiddel (Pharmacia) ligáljuk, amit előzetesen BamHI enzimmel emésztünk, és borjúbél lúgos foszfatázzal [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] kezelünk a fagmid önmagával történő ligálásának elkerülése érdekében. A fenti fragmensek szubklónjait, a pTZ18R DNS vonatkozásában mindkét irányban, E. coli-transzformálás után állítjuk elő.

A klónozott lambda-fág DNS-t Xbal emésztés után 0,8 tömeg%-os agarózgélen futtatjuk, és az 1,4 kb ffagmenst DEAE cellulózmembránon izoláljuk (a PCRreakcióval előállított 10 kD zein DNS-fragmensnél alkalmazott módszerrel). Ezt a fragmenst Xbal enzimmel emésztett pTZ18R plazmidba ligáljuk a fent leírt módon. A fragmensek mindkét irányú szubklónjait, jelölésük pX8 és ρΧΙΟ, E. coliba történő transzformálás után kapjuk. Egyszálú DNS-t állítunk elő a szubklónokból a Pharmacia előírásai szerint. A teljes 1,4 kb Xbal ffagmenst szekvenáljuk. Az Xbal fragmenssel szomszédos további 700 bázist a BamHI fragmensen szekvenáljuk a pB3 kiónban (a pB3 fragmens ugyanabban az orientációban van, mint a pX8 fragmens), amelynek során összesen 2123 bázisból álló szekvenciát kapunk (1. számú szekvencia).

2. példa

A HSZ-gén módosítása helyspecifikus mutációval

A HSZ-gént hordozó 1,4 kD Xbal ffagmensben három Ncol hely található, valamennyi a HSZ kódolószakaszban. A három hely közül csak egyet kívánunk fenntartani (az 1. számú szekvenciában 751-756 nukleotid), amely tartalmazza a transzlációs startkodont. Ezért a 870-875 és 1333-1338 pozíciókban található Ncol helyeket oligonukleotiddal irányított helyspecifikus mutációval [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] kiiktatjuk. A mutációhoz a következő oligonukleotidokat állítjuk elő:

CFC99 ATGAACCCTT GGATGCA CFC98 CCCACAGCAA TGGCGAT (8. száma szekvencia) (9. száma szekvencia)

A mutációt BioRad készlettel (Richmond, CA, USA) végezzük a gyártó előírásai szerint. 40

Az eljárás során a 872 pozíciójú A-t T-re és az 1334 pozíciójú C-t A-ra cseréljük. Mindkét csere a megfelelő kodon harmadik pozíciójában található, és a gén által kódolt aminosavszekvenciában változást nem okoz, mivel a C C A-ról megváltoztatott CCT továbbra is 45 Pro-t, illetve a G C C-ről megváltoztatott GCA továbbra is Ala-t kódol. Az ATG startkodonnál egyetlen Ncol hellyel rendelkező módosított HSZ-gént tartalmazó plazmidgén a pXBm jelet kapja. Mivel a természetes

HSZ-gén egyetlen Xbal helyet hordoz a gén stopkodonjánál (1. számú szekvenciánál 1384-1389 hely), a DNS-NcoI és Xbal enzimekkel végzett teljes emésztése során 637 bp fragmens keletkezik, amely tartalmazza a prekurzor HSZ polipeptid teljes kódolószekvenciáját (2. számú szekvencia).

Szükség van a HSZ-gén olyan formájának előállítására, amely alternatív egyedi restrikciós endonukleázhelyekkel rendelkezik közvetlen a kódolószakasz után. Ehhez CFC104 oligonukleotidot (10. számú szekvencia) és CFC105 oligonukleotidot (11. számú szekvencia)

CFC104 5 ’ - CTAGCCCGGGTAC - 3 ’ (10. számú szekvencia)

CFC10 5 3 ’ - GGGCCCATGGATC - 5 ’ (11. számú szekvencia) az Xbal helyre ligálunk, és ezzel két új, Sma I és Κρη I restrikciós helyet viszünk be, és kiiktatjuk az Xbal he- 55 lyet. Az 1. számú szekvencia 1-6 nukleotidjából származó egyedi Xbal helyet és az 1. számú szekvencia 1823-1828 nukleotidjából származó Sspl helyet felhasználva a HSZ kódolószakaszt és a hozzá tartozó 5’és 3’-szabályozószakaszokat tartalmazó fragmenst állí- 60 tünk elő. Ezt a fragmenst Xbal és Sma I enzimekkel emésztett kereskedelmi pTZ19R vektorba (Pharmacia) klónozva pCCIO plazmidot kapunk.

Szükség volt a HSZ-gén olyan formájának előállítására, amely egyedi restrikciós endonukleázhelyet tartalmaz az érett fehérje startjánál, vagyis hiányzik az aminoterminális szignálszekvencia. Ehhez DNS-ffag12

HU 218 415 Β menst állítunk elő az 1. példában leírt PCR-eljárással. midot használjuk. Az alkalmazott két oligonukleotid A PCR-reakcióhoz templát DNS-ént a pX8m plaz- primer:

CFC106 5 ’-CC ACTTCATGACCC AT ATCCC AGGGC ACTT-3 ’ (12. számú szekvencia)

CFC88 5’-TTCTATCTAGAATGCAGCACCAACAAAGGG-3’ (13. számú szekvencia)

A CFC106 oligonukleotid (12. számú szekvencia) BspHI hellyel (aláhúzva) rendelkező PCR-eljárással ka- 10 pott fragmenst eredményez, amit BspHI enzimmel emésztve az Ncol emésztéssel azonos tapadó véget kapunk. Ez a hely a szignálszekvencia és az érett HSZ kódolószekvencia kapcsolódásánál helyezkedik el. Az CFC88 oligonukleotid (13. számú szekvencia) Xbal 15 hellyel (aláhúzva) rendelkező PCR-eljárással kapott fragmenst eredményez, a HSZ-gén transzlációs terminális részén. A PCR-eljárással kapott fragmens BspHI és Xbal enzimmel kapott fragmense (3. számú szekvencia) a HSZ érett formáját kódolja a fehérje aminoterminális részén található metioninmaradékkal együtt, amely lehetővé teszi a transzláció indítását.

3. példa

HSZ-gén kifejezése E. coliban

A HSZ kódolószekvencia E. coliban történő kifejezéséhez a pBT430 bakteriális kifejezővektort használjuk. Ez a vektor a pET-3a [Rosenberg és munkatársai: Gene, 56, 125-135 (1987)] származéka, amely bakteriofág T7 RNS polimeráz/T7 promoter rendszert tartalmaz. A pBT430 plazmid előállításához először eredeti pozíciójukban elroncsoljuk a pET-3a Eco Rí és HindlII helyeit. Ezután Eco Rí és HindlII helyeket tartalmazó oligonukleotid adaptert inszertálunk a pET-3a BamHI helyére, így pET-3aM plazmidot kapunk, amely további egyedi klónozóhelyeket tartalmaz géneknek a kifejezővektorba történő inszertálásához. Ezután a transzláció kezdetén található Ndel helyet Ncol helyre változtatjuk oligonukleotidspecifikus mutációval. A pET-3aM DNS-szekvenciája ebben a szakaszban 5’-CATATGG (ahol az 20 Ndel helyet aláhúzás jelöli), és ezt 5’-CCCATGG szakaszra változtatjuk (ahol az Ncol helyet aláhúzás jelöli) a pBT430 plazmidban.

A pX8m (2. számú szekvencia, lásd 2. példa) Ncol-Xbal fragmensét agarózgélről izoláljuk DEAE 25 cellulózmembránon végzett elektroforézis után, amit az 1. példában leírt módon végzünk. A fragmenst CFC104 oligonukleotidhoz (10. számú szekvencia) és CFC 105 oligonukleotidhoz (11. számú szekvencia) kapcsoljuk,

CFC104 5’-CTAGCCCGGGTAC -3’ CFC105 3’- GGGCCCATGGATC-5’ (10. számú szekvencia) (11. számú szekvencia) amellyel két új, Sma I és KpnI restrikciós helyet viszünk be a fragmens Xbal végénél. A ligálás lezárásához az 35 elegyet 10 percen keresztül 65 °C hőmérsékleten melegítjük. A ligáit terméket Sma I enzimmel emésztve 3’ tompa végű fragmenst kapunk. A pBT430 kifejezővektort Eco Rí enzimmel emésztjük, és a tapadó végeket dATP, dTTP és az E. coli DNS-polimeráz Klenow-frag- 40 mensének segítségével feltöltjük. A tompa végű vektor-DNS-t ezután Ncol enzimmel emésztjük, és a reakcióelegyet kétszer fenollal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A 640 bp Ncol-Sma I fragmenst, amely a HSZ kódolószakaszt tartalmazza, a pBT430 vektor Ncol tóm- 45 pa végéhez ligáljuk. A pCCll plazmidot tartalmazó kiónt E. coli-transzformánsoknak a kívánt rekombináns termékre történő vizsgálatával azonosítjuk. Ez a plazmid a prekurzor HSZ-fehérjét fejezi ki.

Előállítunk egy olyan plazmidot is, amely a HSZfehérjét szignálszekvencia nélkül fejezi ki E. coliban. Az érett HSZ-fehérjét kódoló DNS-fragmenst PCRmódszerrel állítjuk elő templátként pX8m plazmidot és primerként CFC106 oligonukleotidot (12. számú szekvencia), és CFC88 oligonukleotidot (13. számú szekvencia) alkalmazva a 2. példában leírt módon.

CFC106 5 ’-CCACTTCATGACCCATATCCCAGGGCACTT-3 ’ (12. számú szekvencia)

MetThrHisIleProGlyHisLeu 50 (1-8 aminosavak a 3. számú szekvenciából)

CFC88 3’-GGGAAACAACCACGACGTAAGATCTATCCTT-5’ (13. számú szekvencia)

ProPhe V alGlyAlaAlaPheEnd (185-191 aminosavak a 3. számú szekvenciából)

A CFC106 oligonukleotid (12. számú szekvencia)

BspHI hellyel (aláhúzással jelölve) rendelkező PCRfragmens, amely az Ncol enzim hasítási helyével azo- 60 nos tapadó végeket eredményez. A helyen belüli ATGszekvencia transzlációs iniciátorkodon, és az ezt követő ACC-szekvencia az érett fehérje aminoterminális treoninmaradékát kódolja. A CFC88 oligonukleotid (13. számú szekvencia) Xbal helye (aláhúzással jelöl13

HU 218 415 Β ve) megfelelő klónozási hellyel rendelkezik a kódolószekvencia végénél. A PCR-reakció termékét 2 mol/1 ammónium-acetátban és 70 tömeg% etanolban kétszer kicsapjuk a felesleges oligonukleotid primer eltávolítása érdekében. A DNS-fragmens végeit E. coli DNSpolimeráz Klenow-fragmensével tompa végekké alakítjuk a négy dezoxiribonukleotid-trifoszfát jelenlétében. A reakciótermékeket agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk, és etidium-bromiddal megfestjük. A domináns 570 bp sávot a fent leírt módon DEAE cellulózmembrán alkalmazásával eluáljuk. A DNS-t ezután BspHI enzimmel emésztjük, etanollal kétszer kicsapjuk és a fent leírt Ncol tompa végű pBT430 kifejezővektorhoz ligáljuk. A pCC12 plazmidot tartalmazó kiónt E. coli transzformánsoknak a kívánt rekombináns termékre történő vizsgálatával azonosítjuk. A klónozott PCR-módszerrel előállított fragmenst szekvenáljuk (3. számú szekvencia).

A HSZ polipeptid kifejezésének detektálására pCCll és pCC12 plazmidokat transzformálunk HMS174 E. coli törzsekbe, és in vivő jelölési kísérletet végzünk [Studier és Moffatt: J. Mól. Bioi. 189, 113-130 (1986)]. A fehérjéket egy órával az indukció után (T7 RNS polimeráz gént hordozó CE6 lambda fággal végzett fertőzés) 1 órával ³⁵S metioninnal jelöljük, amelyről feltételezhető, hogy megfelelő módon jelöli ezeket a metioninban gazdag polipeptideket. A sejtextraktumot SDS-poliakrilamidgélen futtatjuk, majd szárítjuk, és autoradiográfiásan vizsgáljuk. A mintegy 20 kD móltömegnek megfelelő prominens sáv a pCCll és a pCC12 extraktumban is megjelenik. Ez a méret megfelel az érett hosszúságú HSZ-polipeptid feltételezett méretének, ami arra utal, hogy a pCCll transzformánsokban előállított prekurzorfehérjét az E. coli sejt feldolgozza. Ha az indukció és SDS-poliakrilamidgél elektroforézis után Coomassie Brilliant Blue festékkel az össz-sejtfehérjét megfestjük, akkor a prominens 20 kD fehéije csak a pCC12 lizátumban jelenik meg, de hiányzik a pCCl 1 lizátumban.

4. példa

E. coliban előállított HSZ-fehérje tisztítása

BL21(DE3)pLysE E. coli törzs [Studier és munkatársai: Methods in Enzymology, 185, 60-89 (1990)] 1-L tenyészetét pCC12 plazmiddal transzformáljuk, és 37 °C hőmérsékleten 100 mg/1 ampicillinnel és 10 mg/1 klóramfenikollal kiegészített LB közegen tenyésztjük. A tenyészethez 600 nm-en mért 1,08 optikai sűrűségnél 1,2 ml 0,1 mol/1 IPTG-t (izopropil-tio-βgalaktozid) adunk, és 3 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A sejteket centrifügálással összegyűjtjük, 50 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 Trisz-HCl (pH=7,5) és 1 mmol/1 EDTA elegyével mossuk, 10 ml fenti pufferben szuszpendáljuk, és -20 °C hőmérsékleten fagyasztjuk.

A szuszpenziót megolvasztjuk, és 0,1 tömeg% koncentrációig Triton X-100 adalékanyagot adunk hozzá, majd 3000 egység dezoxiribonukleáz I enzimmel (Boehringer Mannheim) elegyítjük. Szobahőmérsékleten 60 percen keresztül inkubáljuk, majd a szuszpenziót jégen ultrahanggal besugározzuk, és így csökkentjük a viszkozitást. Az elegyet centrifugáljuk, és a felülúszót eldobjuk. A pelletet kétszer 5 ml 70 tömeg% izopropanol és 10 mmol/1 β-merkapto-etanol elegyével extraháljuk. A HSZ a legtöbb fehérjétől eltérően oldódik ebben az oldószerben. SDS-poliakrilamidgél elektroforézis és Coomassie Brilliant Blue festékkel végzett színezés szerint a HSZ-fehérje az első extraktum fő fehérjéje (90% felett), és a második extraktum egyetlen fehérjéje. 1 liter sejttenyészetből 10-100 mg HSZfehérjét nyerünk. A tisztított HSZ-fehérjével szemben nyúl-antitesteket fejlesztünk ki (Hazelton Research Fecility, 310 Swampridge Road, Denver, PA 17517, USA).

5. példa

HSZ-fehérje nagy metionintartalmú doménjét kódoló gén előállítása

A HSZ-fehérje egy metioninban nagyon gazdag központi szakaszból (mintegy 48% metionintartalom) és ehhez kapcsolódó kevesebb metionint tartalmazó aminoterminális és karboxiterminális részből (10% metionintartalom és 7% metionintartalom) áll. A központi szakasz ismétlődő Met-Met-Met-Pro szakaszokból (27. számú szekvencia) áll. A rokon 10 kD zein fehérje hasonló szerkezettel rendelkezik (lásd a 3. ábrát). A HSZfehérje központi szakasza azonban mintegy kétszer olyan nagy, mint a 10 kD zein megfelelő szakasza, ami összhangban van a HSZ megnövelt metionintartalmával. A HSZ-ben található közel dupla nagyságú központi nagy metionintartalmú dómén arra utal, hogy ennek stabil szerkezete van, és önmagában kifejezhető, amelynek során metioninban nagyon gazdag tárolófehérjét kapunk.

A HSZ nagy metionintartalmú doménjét (HMD) kódoló gén előállításához PCR-reakciót végzünk az 1. példában leírt módon templát DNS-ként pX8 plazmidot és primerként JR5 oligonukleotidot (14. számú szekvencia) és JR6 oligonukleotidot (15. számú szekvencia) alkalmazva.

JR5 5 ’-TCACCGCTTC AGC AGTGCCATATGCCAATG-3 ’ (14. számú szekvencia)

JR6 5’-TCTTAGAATTCTATGGCATCATCATTGGTGACACCATGCT-3’ (15. számú szekvencia)

A JR5 oligonukleotid (14. számú szekvencia) egy Ndel helyet (aláhúzással jelölve) visz be a PCR-termékbe. A JR6 oligonukleotid (15. számú szekvencia) egy EcoRI helyet (aláhúzással jelölve) visz be a PCR- 60 termékbe. Ezek a helyek lehetővé teszik a HMD pET-3aM kifejezővektorba (Rosenberg és munkatársai: Gene 56, 125-135 (1987) és 3. példa) történő ligálását. Az Ndel helyen található ATG nukleotidok

HU 218 415 Β transzlációs iniciátorkodont képeznek a vektor kifejezése során, és az EcoRl hely közvetlenül követi a transzlációs terminátorkodont.

A PCR-terméket Ndel és EcoRl enzimekkel emésztjük, és ugyanezekkel emésztett pET-3aM plazmidba ligáljuk. E. coliba történő transzformálás után a kívánt rekombináns plazmidot tartalmazó kiónokat azonosítjuk, és az inszertált DNS-fragmens szekvenálásával ellenőrizzük. A HMD-gén nukleotidszekvenciáját és az ebből származó aminosavszekvenciát a 4. számú szekvencia mutatja.

6. példa

HSZ növényben történő kifejezésére alkalmas kimér gén előállítása

Három, magspecifikus génkifejező kazettát alkalmazunk a HSZ növényben történő kifejezésére alkalmas kimér gének előállításához. Az expressziós kazetták három, jól kifejezett mag-tárolófehéije gén szabályozószakaszait tartalmazzák:

1) babból származó fazeolin β-alegysége;

2) szójababból származó β-konglicinin a’-alegysége,

3) kukoricából származó 10 kD zein.

A kazettákat vázlatosan a 2. ábra mutatja.

A fazeolinkazetta mintegy 500 nukleotidot tartalmaz a transzlációs iniciátorkodon felett (5’), és mintegy 1650 nukleotidot tartalmaz a fazeolin transzlációs stopkodonja alatt (3’). Az 5’- és 3’-szakaszok között egyedi restrikciós endonukleázhelyek találhatók a következő enzimekre: Ncol (amely az ATG transzlációs iniciátorkodont tartalmazza), Smal, KpnI és Xbal. A teljes kazettát Hindlll helyek farkazzák. Az említett szabályozószakaszok DNS-szekvenciája ismert (Doyle és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 9228-9238 (1986)]. Újabban kimutatták, hogy a kazetta promoterszakasza nem tartalmazza a fazeolin promoter teljes szintű kifejezéséhez szükséges DNS-szekvenciaelemeket, és ezért a várt kifejezési szintnek mintegy 20-30%-a érhető el [Bustos és munkatársai: EMBO J. 10, 1469-1479(1991)].

A β-konglicininkazetta mintegy 610 nukleotidot tartalmaz a transzlációs iniciátorkodon felett (5’), és mintegy 1650 nukleotidot tartalmaz a fazeolin transzlációs stopkodonja alatt (3’). Az 5’- és 3’-szakaszok között

CFC1125’-CATGATGAGAGCAAGGGTTCCACTCCTGTTGCTGGGAATTCTT CFC113 3’- TACTCTCGTTCCCAAGGTGAGGACAACGACCCTTAAGAA

Me tMe tAr gAlaArgValProLeuLeuLeuLeuGlylleLeu CFC112 TTCCTGGCATCACTTTCTGCTAGCTTTG 3’ (16. számú szekvencia)

CFC113 AAGGACCGTAGTGAAAGACGATCGAAACGATC-5’ (17. számú szekvencia) eLeuAiaderLeuserAia

A fazeolin 5’- és 3’-szabályozószakaszokkal farkazott HSZ-gént tartalmazó pCC13 plazmidot Ncol és Spel enzimekkel emésztve eltávolítjuk a HSZ természetes szignálszekvenciájának legnagyobb részét. A CFC112 oligonukleotidot (16. számú szekvencia) és a CFC113 oligonukleotidot (17. számú szekvencia) az emésztett egyedi restrikciós endonukleázhelyek találhatók a következő enzimekre : Ncol (amely tartalmazza az ATG transzlációs iniciátorkodont), Smal, KpnI és Xbal. A teljes kazettát Hindlll helyen farkazzák. A szabályozószakaszok DNS-szekvenciája ismert [Doyle és munkatársai: J. Bioi. Chem. 261, 9228-9238 (1986)].

A 10 kD zein kazetta mintegy 925 nukleotidot tartalmaz a transzlációs iniciátorkodon felett (5’), és mintegy 945 nukleotidot tartalmaz a fazeolin transzlációs stopkodonja alatt (3’). Az 5’- és 3’-szakaszok között egyedi, restrikciós endonukleázhelyek találhatók az alábbi enzimekre: Ncol (amely tartalmazza az ATG transzlációs iniciátorkodont) és Smal. A teljes kazettát EcoRl hely farkazza az 5’-végen, és BamHI, Sáli és Hindlll helyek farkazzák a 3’-végen. A szabályozószakaszok DNS-szekvenciája ismert [Kirihara és munkatársai: Gene 71, 359-370(1988)].

A teljes HSZ kódolószakaszt tartalmazó Ncol-Xbal fragmenst (lásd a 2. példát) agarózgélről izoláljuk DEAE cellulózmembrán alkalmazásával végzett 1. példa szerinti elektroforézis után. A szignálszekvencia nélküli gént tartalmazó BspHI-Xbal fragmenst, vagyis az érett fehérjét kódoló szekvenciát a 3. példában leírt módon izoláljuk. Ezeket a DNS-fragmenseket Ncol és Xbal enzimekkel emésztett fazeolin- és β-konglicininkifejező kazettákba inszertáljuk. így a következő négy kimér gént állítjuk elő:

1) fazeolin 5’-szakasz/természetes HSZ/fazeolin 3’-szakasz;

2) fazeolin 5’-szakasz/érett HSZ/fazeolin 3’-szakasz;

3) β-konglicinin 5’-szakasz/természetes HSZ/fazeolin 3’-szakasz;

4) β-konglicinin 5’-szakasz/érett HSZ/fazeolin 3’szakasz.

További kimér géneket állítunk elő a HSZ természetes, egyszikű szignálszekvenciájának fazeolinból származó, kétszikű szignálszekvenciával történő helyettesítésével. Ehhez CFC112 oligonukleotidot (16. számú szekvencia) és CFC113 oligonukleotidot (17. számú szekvencia) szintetizálunk. Az oligonukleotidok egy Ncol kompatibilis véggel és egy Nhel/Spel kompatibilis véggel rendelkeznek:

errne (16. számú szekvencia) pCC13 plazmiddal ligáljuk. A kapott pCC18 plazmid szekvenciája tartalmazza az érett HSZ-fehérjét, és a fazeolin szignálszekvenciát. A kapott plazmidot DNS-szekvenálással (18. számú szekvencia) ellenőrizzük.

Mivel az Spel hely (a 2. számú szekvencia ) 57-62 nukleotidja) nem biztosít pontos illeszkedést a

HU 218 415 Β

HSZ szignálszekvencia/érett fehérje között, két extra aminosavat illesztünk a fazeolin szignálszekvencia végéhez, és az érett HSZ-fehérjéhez. Ezek eltávolításához HSZ-fragmenst állítunk elő a PCR-módszerrel, amelynek során primerként CFC114 oligonukleotidot (19. számú szekvencia) és CFC88 oligonukleotidot (13. számú szekvencia, lásd a 2. példát) és templátként pCC18 plazmidot alkalmazunk.

CFC114 TTCTGCTAGC TTTGCTACCC ATATCCCAGG G (19. számú szekvencia)

A PCR-terméket Nhel és Xba I enzimmel emésztjük, és gélelektroforézissel tisztítjuk. A pCC18 plazmidot ugyanezekkel az enzimekkel emésztjük, és eltávolítjuk a két extra aminosavat tartalmazó fúziós fehérjét kódoló DNS-fragmenst, és a PCR-módszerrel előállított DNS-ffagmenst inszertáljuk. A kapott pCC24 plazmid szerkezetét DNS-szekvenálással (20. számú szekvencia) ellenőrizzük.

A HSZ természetes szignálszekvenciájának fazeolin szignálszekvenciával történő helyettesítéséhez PCR-módszerrel egy fragmenst állítunk elő primerként CFC123 oligonukleotidot (21. számú szekvencia) és CFC88 oligonukleotidot (13. számú szekvencia, lásd a

2. példát) és templátként pCC24 plazmidot alkalmazunk.

CFC123 ACTAATCATG ATGAGAGCAA GGGTTCCACT (21. számú szekvencia)

A PCR-módszerrel kapott DNS-fragmenst BspHI és Xba I enzimmel emésztjük, és gélelektroforézissel tisztítjuk. A kapott DNS-fragmenst Nco I és Xba I enzimekkel emésztett β-konglicininkifejező kazettába inszertáljuk, és a kapott pCC30 plazmid szerkezetét DNS-szekvenálással (20. számú szekvencia) ellenőrizzük.

A CFC104 oligonukleotidot (10. számú szekvencia) és a cFC105 oligonukleotidot (11. számú szekvencia, lásd a 3. példát) a 10 kD zein kazetta Xba I helyére inszertáljuk a karboxiterminális végen, amellyel egyedi Smal helyet alakítunk ki. A pCCIO plazmidból (2. példa) HSZ kódolószakaszt tartalmazó Nco I-Smal fragmenst izolálunk, és Nco I-Smal enzimekkel emésztett 10 kD zein kazettába inszertáljuk.

7. példa

Dohány transzformálása fazeolin-HSZ kimér génnel

Fazeolin 5’-szakasz/természetes HSZ/fazeolin 3’-szakasz és fazeolin 5’-szakasz/érett HSZ/fazeolin 3’szakasz összetételű fazeolin-HSZ kimér gén kazettákat (6. példa) izolálunk mintegy 2,3 kb Hindlll fragmensek formájában. Ezekhez a fragmensekhez HindlII/BamHI adapter oligonukleotidot adunk, és az Agrobacterium tumefaciens binér Ti plazmid vektorrendszerének [Bevan: Nucl. Acids Rés. 12, 8711-8720 (1984)] részét képező pZS97K vektor (3. ábra) egyedi BamHI helyére inszertáljuk. A vektor összetétele:

1) kimér nopalin-szintáz/neomidin foszfotranszferáz gén (nos:NPT II), amely a transzformált növényi sejtben szelektálható markerként működik [Bevan és munkatársai: Natúré 304, 184-186(1983)];

2) a Ti plazmid [Bevan: Nucl. Acids Rés. 12, 8711-8720 (1984)] tDNS-ének bal és jobb szegélye;

3) E. coli lacZ α-komplementer szegmens (Vierie és Messing: Gene 19, 259-267 (1982)], amely egyedi EcoRI, KpnI, BamHI és Sáli restrikciós endonukleázhelyekkel rendelkezik;

4) a Pseudomonasból származó pVSl plazmid [Itoh és munkatársai: Plasmid 11, 206-220 (1984)] bakteriális replikációs origója; és

5) a Tn5 [Berg és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3628-3632 (1975)] bakteriális neomicin-foszfotranszferáz génje, amely szelektálható markerként működik a transzformált A. tumefaciens esetében.

Fazeolin 5’-szakasz/fazeolin szignálszekvencia/ érett HSZ/fazeolin 3’-szakasz összetételű fazeolin-HSZ kimér gén kazettát (6. példa) izolálunk mintegy 2,3 kb Hindlll fragmens formájában. Ezt a fragmenst a pZS97 binér vektor (4. ábra) egyedi Hindlll helyére inszertáljuk. Ez a vektor azonos a fent ismertetett pZS97K vektorral, azzal a különbséggel, hogy két további, egyedi Smal és Hindlll klónozóhellyel rendelkezik, és a bakteriális neomicin-foszfotranszferáz gén helyett az A. tumefaciensben történő transzformáláshoz szelektálható markerként bakteriális β-laktamáz gént tartalmaz, amely ampicillinrezisztenciát okoz.

A kimér HSZ-géneket tartalmazó binér vektorokat háromszülős párosítással [Ruvkin és munkatársai: Natúré 289, 85-88 (1981)] LBA4404/pAL4404 Agrobacterium törzsbe [Hockema és munkatársai: Natúré 303, 179-180 (1983)] transzformáljuk. Az Agrobacterium-transzformánsokkal dohánylevéllemezeket [Horsch és munkatársai: Science 227, 1229-1231 (1985)] inokulálunk. A transzgén növényeket kanamicinnel kiegészített szelektív közegen regeneráljuk.

Fiatal levelekről genomiális DNS-t extrahálunk, és PCR-módszerrel analizálva kimutatjuk a kimér HSZ-gének jelenlétét. A PCR-reakcióban primerként CFC93 oligonukleotidot (22. számú szekvencia) és CFC77 oligonukleotidot (7. számú szekvencia, lásd az 1. példát) alkalmazunk.

CFC93 GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA (22. számú szekvencia)

HU 218 415 Β

Ezek a primerek 425 bp DNS-fragmenst generálnak a HSZ-génen belül. A 20 transzformáns közül 16 pozitív eredményt ad (1. és 2. táblázat).

A kimér gének kifejeződésének vizsgálatához a transzformált növényeket hagyjuk virágozni, önmaguktól beporzódni, és magot fejleszteni. Az érett magokból az összes fehérjét extraháljuk. Ehhez mintegy 200 mg magot 1,5 ml-es, eldobható, műanyag mikrocentrifugálócsőbe töltünk, és 0,25 ml 50 mmol/1 Trisz-HCl (pH=6,8), 2 mmol/1 EDTA, 1 tömeg% SDS és 1 tömeg% β-merkapto-etanol elegyében megőröljük. Az őrlést a mikrocentrifiigálócsőhöz illesztett, eldobható műanyag nyéllel ellátott, motoros őrlővel végezzük. A kapott szuszpenziót 5 percen keresztül szobahőmérsékleten centrifugálva eltávolítjuk a szemcsés részeket. A felülúszó össz-fehérjetartalmát Bio-Rad fehérjevizsgáló módszerrel vizsgáljuk, amelynek során standardként boíjúszérum-albumint használunk.

Minden extraktumból 10 pg fehérjét SDS-poliakrilamidgélen futtatunk pozitív kontrollként bakteriálisán előállított, érett HSZ és negatív kontrollként transzformálatlan dohánymagokból extrahált fehérje alkalmazásával. A fehérjéket ezután elektroforetikusan nitrocellulóz-membránra visszük. A membránokat HSZ antitestekkel (lásd a 4. példát) kezeljük a nyúlszérum 1:700 hígítása mellett, amelynek során Immun-Biot készletet (BioRad) használunk a gyártó előírásai szerint. A meg nem kötött primer antitestek leöblítése után a membránt szekunder antitestként torma-peroxidázzal konjugált szamár-antinyúl Ig-vel (Amersham) kezeljük 1:3000 hígítás mellett. A meg nem kötött szekunder antitestek leöblítése után a membránt Amersham kemilumineszcensz reagenssel és röntgenfilmmel vizsgáljuk.

A legtöbb olyan transzformáns, amely a PCR-analízis szerint tartalmazza a HSZ-gént, HSZ-fehérjét termel az immunológiai vizsgálat szerint (1-3. táblázat). A termelt fehérje mérete minden esetben közel megegyezik az E. coliban előállított, érett HSZ méretével, ami arra utal, hogy mind a természetes, mind a fazeolin szignálszekvenciát eltávolítottuk, és így a fehérje belépett az endoplazmatikus retikulumba.

A magokat 70 tömeg% izopropanol/1 tömeg% βmerkapto-etanol elegyével is extraháljuk, amelyben a HSZ mellett csak kevés fehérje oldódik. Ezeket a fehérjéket ezután a fent leírt módon SDS-PAGE, Westemfolthibridizálás és immunológiai próba vizsgálatnak vetjük alá. Ilyen körülmények között is az érett HSZ-fehérjének megfelelő méretű fehérje mutatható ki, amely igazolja, hogy a detektált fehérjék azonosak a HSZfehérjével.

A HSZ kifejeződésének mértéke a transzformált vonalakban a HSZ antitesttel szemben mutatott érzékenység és az SDS-PAGE gélre felvitt fehérje mennyisége alapján becsülhető. A HSZ az összmagfehétje mintegy 0,05-0,5%-át teszi ki.

A mag aminosav-összetételének méréséhez 6 darab magot 6n sósav és 0,4 tömeg% β-merkapto-etanol elegyében hidrolizálunk nitrogénatmoszférában 110-120 °C közötti hőmérsékleten 24 órán keresztül. A minta egytizedét Beckman Model 6300 típusú aminosavanalizátoron vizsgáljuk az oszlop utáni ninhidrines detektálással. A magban mérhető relatív metioninszintet metionin/leucin arányban fejezzük ki, és ehhez belső standardként leucint használunk. A metionin/leucin arányban mintegy 6% standard deviáció figyelhető meg. A Westem-foltanalízis szerinti legnagyobb szintű HSZ-kifejeződés esetén a HSZ a metionin mennyiségét a magban mintegy 10%-ra növeli. Mivel ez túl közel van a standard deviációhoz, nem tekinthetjük úgy, hogy a HSZ kifejeződése befolyásolná a mag össz-metionintartalmát (1-3. táblázatok).

1. táblázat pCC15 transzformáns Fazeolin 5’/érett HSZ/fazeolin 3’

Voaal	PCR	Western	Met: Leu
15-17A	+	+
15-29A	+	-
15-34A	+	+
15-40A		+	0,19
15-50A	+	+ + +	0,19
15-55A	+	+ +
15-27B	+	+
15-49B	-	+
15-54B	+	-
15-38A	+	+

2. táblázat pCC16 transzformáns Fazeolin 5’/természetes HSZ/fazeolin 3’

Voaal	PCR	Western	Met: Leu
16-7A	+	+ + +	0,20
16-16A	+	+
16-24A	-	-
16-48A	-	-
16-6B	+	-
16-11B	-	-	0,19
16 33B	+	+
16 49B	+	-
16-54B	+	-
16-55B	+	-

3. táblázat pCC36 transzformáns

Fazeolin 5’/fazeolin szignálszekvencia/érett HSZ/fazeolin 3’

Vonal	PCR	Western	Met: Leu
36-1B		+
36-4B		+

HU 218 415 Β

3. táblázat (folytatás)

Vonal	PCR	Western	Met: Leu
36-5A		+
36-20A		+ + +	0,20
36-23C		+
36 35B		+ +
36-39A		4-
36-46B		+ +
36-47D		-
36-55D		-

8. példa

HMD-fehérje E. coliban történő kifejezése

A BL21(DE3)pLysE E. coli törzset [Studier és munkatársai: Methods in Enzymology 185, 60-89 (1990)] pXBM-18 plazmiddal transzformáljuk, és 100 mg/1 ampicillinnel kiegészített 10 L LB közegben tenyésztjük 37 °C hőmérsékleten. 600 nm hullámhosszon mért mintegy 1 optikai sűrűség elérése esetén 1 mmol/1 IPTG-t (izopropil-tio-P-galaktozid) adunk az elegyhez, és 8 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, 50 mmol/1 nátrium-klorid, 50 mmol/1 Trisz-HCl (pH = 7,5) és 1 mmol/1 EDTA elegyével (A puffer) mossuk, és -80 °C hőmérsékleten fagyasztjuk.

A sejteket jégen 1 g sejtre számolva 5 ml A pufferben felolvasztjuk, és 0,1 mg/ml dezoxiribonukleáz I enzimet (Sigma) adunk hozzá. Szobahőmérsékleten 60 percen keresztül inkubáljuk, majd a viszkozitás csökkentése érdekében jégen ultrahanggal besugározzuk. Az elegyet centrifugáljuk, és a felülúszót eldobjuk. A pelletet kétszer 25 ml 70 tömeg% izopropanol és 10 mmol/1 β-merkapto-etanol elegyével extraháljuk. A HMD a HSZ-hez hasonlóan oldódik ebben az oldószerben. SDS-poliakrilamidgél elektroforézis és Coomassie Brilliant Blue festékkel végzett színezés szerint az extraktum fő fehérjéje a HMD-fehéije. A Western foltanalízis kimutatja, hogy a HMD-fehérje keresztreakcióba lép a HSZ-fehérjével szemben kifejlesztett nyúlantitesttel.

9. példa

Dohány transzformálása $-konglicinin-HSZ kimér génnel

Mintegy 2,4 kb HindlII fragmensek formájában βkonglicinin 5’-szakasz/természetes HSZ/fazeolin 3’-szakasz, β-konglicinin 5’-szakasz/érett HSZ/fazeolin 3’-szakasz és β-konglicinin 5’-szakasz/fazeolin szignál szekvencia/érett HSZ/fazeolin 3’-szakasz (6. példa) összetételű β-konglicinin kimér génkazettákat állítunk elő. Ezeket a fragmenseket a pZS97 binér vektor (4. ábra) egyedi HindlII helyére inszertáljuk. Ez a vektor azonos a 7. példa szerinti pZS97K vektorral, azzal az eltéréssel, hogy két további egyedi klónozóhelyet tartalmaz az Smal és HindlII enzimek vonatkozásában, és a bakteriális neomicin-foszfotranszferáz gén helyett A. tumefaciensben történő transzformáláshoz szelektálható markerként bakteriális β-laktamáz gént tartalmaz, ami ampicillinrezisztenciát okoz.

A kimér HSZ-géneket tartalmazó binér vektorokat háromszülős párosítással [Ruvkin és munkatársai: Natúré 289, 85-88 (1981)] LBA 4404/pAL4404 Agrobacterium törzsbe [Hockema és munkatársai: Natúré 303, 179-180 (1983)] transzformáljuk. Az Agrobacterium transzformánsokkal dohánylevéllemezeket [Horsch és munkatársai: Science 227, 1229-1231 (1985)] inokulálunk. A transzgén növényeket kanamicint tartalmazó szelektív közegen regeneráljuk.

A kimér gén jelenlétének vizsgálatához a transzformáit növényeket hagyjuk virágozni, önmagától beporzódni és magokat fejleszteni. Az érett magok összfehérjetartalmának extrahálásához mintegy 200 mg magot 1,5 ml-es eldobható műanyag mikrocentrifugálócsőbe helyezzük, és 0,25 ml 50 mmol/1 Trisz-HCl (pH=6,8), 2 mmol/1 EDTA, 1 tömeg% SDS és 1 tömeg% β-merkapto-etanol elegyben őröljük. Az őrlést a mikrocentrifugálócsőhöz illeszkedő, eldobható műanyag nyéllel ellátott motorizált őrlőkészülékkel végezzük. A kapott szuszpenziót 5 percen keresztül szobahőmérsékleten centrifugálva eltávolítjuk a szemcséket. A felülúszó összfehérjetartalmát BioRad fehéqevizsgáló készlettel, belső standardként borjúszérum-albumin alkalmazásával határozzuk meg.

Minden extraktumból 10 pg fehérjét SDS-poliakrilamidgélen futtatunk, amelynek során pozitív kontrollként bakteriálisán előállított, érett HSZ-fehérjét és negatív kontrollként transzformálatlan dohánymagokból extrahált fehérjét használunk. A fehérjét ezután elektroforetikusan nitro-cellulóz-membránra visszük. A membránokat HSZ-antitestekkel (4. példa) kezeljük a nyúlszérum 1:700 hígításával, amelynek során Immun-Biot készletet (BioRad) alkalmazunk a gyártó előírásai szerint. A meg nem kötött primer antitestek leöblítése után a membránt szekunder antitestként torma-peroxidázzal konjugált szamár-antinyúl Ig-vel (Amersham) kezeljük 1:3000 hígítás mellett. A meg nem kötött szekunder antitestek leöblítése után a membránt Amersham kemilumineszcensz reagenssel és röntgenfilmmel vizsgáljuk.

A β-konglicinin 5’-szakasz/érett HSZ/fazeolin 3’szakasz összetételű kimér gént tartalmazó egy transzformáns és a β-konglicinin 5’-szakasz/természetes HSZ/fazeolin 3’-szakasz összetételű kimér gént tartalmazó két transzformáns HSZ-fehéijét termel. A β-konglicinin 5’szakasz/fazeolin szignálszekvencia/érett HSZ/fazeolin 3’-szakasz összetételű kimér gént tartalmazó hét transzformánsból három HSZ-fehéijét termel (4. táblázat). A kapott fehérje mérete minden esetben közel megegyezik az E. coliban előállított, érett HSZ-fehérje méretével, ami arra utal, hogy mind a természetes, mind a fazeolin szignálszekvencia lehasad, és így a fehéije az endoplazmatikus retikulumba kerül.

A mag aminosav-összetételének méréséhez hat magot 6n sósav és 0,4 tömeg% β-merkapto-etanol elegyében hidrolizálunk nitrogénatmoszféra alatt 110-120 °C

HU 218 415 Β hőmérsékleten 24 órán keresztül. A minta 1/10-ét Beckman Model 6300 aminosavanalizáló berendzésen vizsgáljuk oszlop utáni ninhidrines detektálással. A magok relatív metioninszintjét metionin/leucin arányként fejezzük ki, amelynek során belső standardként leucint használunk. A metionin/leucin arány mintegy 5% standard deviációt mutat. A Westem-foltanalízis szerint a legnagyobb szintű HSZ-kifejezést mutató vonal eredményezi a legnagyobb összmag-metioninmennyiséget (4. táblázat), de az csak mintegy 7%-kal haladja meg az átlagot. Mivel ez túl közel van a mért hibához, ezért feltételezhető, hogy ez a magas metioninszint a HSZ-kifejezés eredménye.

4. táblázat pCC39 transzformáns β-konglicinin 5’/fazeolin szignálszekvencia/érett HSZ/fazeolin 3’

Vonal	Western	Met: Leu
39-1C		0,20
39 9C	-	0,20
39-13A	-	0,21

Vonal	Western	Met: Leu
39-14C	+	0,20
39-15C	-	0,20
39-28A	+ +	0,21
39-36A	+	0,20

10. példa

HMD növényben történő kifejezésére alkalmas kimér gén előállítása

A 6. példában leírt módon magspecifikus génkifejező kazettát alkalmazunk a HMD növényben történő kifejezésére szolgáló kimér gén előállítására. Az exp15 ressziós kazetta babfazeolin β-alegységének szabályozószakaszát tartalmazza. Az előállított kimér gén tartalmaz továbbá egy kétszikű szignálszekvenciát a fazeolinból, ennek megfelelően összetétele: fazeolin 5’-szakasz/fazeolin szignálszekvencia/HMD/fazeolin

3’-szakasz.

PCR-primerként CLM oligonukleotidot (23. számú szekvencia) és CLM2 oligonukleotidot (24. számú szekvencia) állítunk elő,

CLM 1 Nhe I

5’ TGCTTGCTAGCTTTGCTATGCCAATGATGATGCCGGGT 3’ (23. számú szekvencia)

Al a Se r PheAl aMe t Pr oMe tMe tMe t Pr oGl y CLM 2 Xba I

5’ TGCTTTCTAGACTATGGCATCATCATTGGTGACACC 3’ (24. számú szekvencia) és templátként a fazeolin szignálszekvencia 3’-végéhez kapcsolódó és Nhel és Xba I helyekkel farkazott HMDszekvenciát tartalmazó DNS-ffagmenst állítunk elő. A pCC24 plazmidot (6. példa) Nhel enzimmel emésztjük, amely a fazeolin szignálszekvencián belül hasít, és Xba I enzimmel emésztjük, majd agarózgél-elektroforézissel tisztítjuk. A tisztított vektort a CLM 1 és CLM 2 oligonukleotidból és pJRHMDl plazmidból képzett PCR-termékkel ligáljuk, és így megkapjuk a HMD-hez kapcsolt teljes fazeolin szignálszekvenciát. A kapott pJRHMD2 termékben a kimér gén szekvenciáját (25. számú szekvencia) DNS-szekvenálással ellenőrizzük.

11. példa

Szójabab transzformálása fazeolin-HSZ kimér génnel

Szomatikus embriók előállításához XP3015 fajtájú szójabab sterilizált, éretlen magjának felületéből 4-5 mm sziklevelet kivágunk, és sötétben 25 °C hőmérsékleten agarközegen (SB1 vagy SB2) 8-10 héten keresztül tenyésztjük. A szekunder embriókat termelő szomatikus embriókat kivágjuk, és folyékony közegre (SB55) helyezzük. A korai globuláris fokozatú embriók formájában szaporodó szomatikus embriók ismételt szelektálása után a szuszpenziót az alábbiak szerint fenntartjuk.

A szójabab embriogén szuszpenziós tenyészetet 35 ml folyékony közegben (SB55) tartjuk fenn egy forgó reakcióedényben, amit 28 °C hőmérsékleten 150 fordulat/perc értéken forgatunk, és 16:8 órás váltakozó nappali/éjszakai periódusban vegyes fluoreszcens és izzó fénnyel világítjuk meg. A tenyészetekből minden négy héten altenyészetet képzünk mintgy 35 mg szövetnek 35 ml folyékony közegbe történő inokulálásával.

A szójabab embriogén szuszpenziós tenyészeteket részecskebombázás módszerével [Kline és munkatársai: Natúré (London) 327, 70 (1987); 4 945 050 számú USA-beli szabadalmi leírás] transzformáljuk DuPont Biolistic PDS1000/HE készülék segítségével.

A transzformáláshoz alkalmazott plazmidvektor a pGEM9Z plazmidból (Promega Biological Research Products) származik. Szelektálható markerként karfiol-mozaikvírusból származó 35S promoterből (Odell és munkatársai: Natúré 313, 810-812 (1985)], pJR225 plazmidból (E. coliból) származó higromicinfoszfotranszferáz génből [Gritz és munkatársai: Gene 25, 179-188 (1983)] és Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidjának T-DNS-éből származó nopalin-szintáz gén 3’-szakaszából (26. számú szekvencia) előállított kimér gént használunk a vektor Sáli helyére beépítve. A fazeolin 5’-szakasz/fazeolin szignálszekvencia/érett HSZ/fazeolin 3’-szakasz összetételű fazeolin-HSZ kimér génkazettát (6. példa) mintegy 2,3 kb HindlII fragmens formájában izoláljuk. Ezt a fragmenst a vektor egyedi HindlII helyére inszertáljuk.

HU 218 415 Β

Egy 60 mg/ml koncentrációjú, 1 pm-es szemcsékből készített aranyszuszpenzió 50 μΐ-es részletéhez egymás után 5 μΐ DNS-t (1 μg/ml), 20 μΐ spermidint (0,1 mol/1) és 501 CaCl₂-ot (2,5 mol/1) adunk. A készítményt 3 percen keresztül kevertetjük, mikrocentrifugálócsőben 10 másodpercen keresztül ülepítjük, majd a felülúszót eltávolítjuk. A DNS-sel bevont részecskéket egyszer 400 μΐ 70%-os etanollal mossuk, és 40 μΐ vízmentes etanolban szuszpendáljuk. A DNS/szemcse szuszpenziót háromszor 1 másodperces periódusban ultrahanggal besugározzuk. A DNS-sel bevont aranyszemcsék 5 μΐ-ét makrohordozólemezekre visszük.

Mintegy 300-400 mg négyhetes, szuszpenziós tenyészetet helyezünk egy üres, 60x15 mm-es Petri-lemezre, és a maradék folyadékot pipettával eltávolítjuk a szövetről. Minden transzformációs kísérlethez általában mintegy 5-10 szövetlemezt bombázunk. A membrán roncsoló nyomást 6,9 χ 10⁶ Pa értékre állítjuk, és a kamrát 9,5 χ 10⁴ Pa vákuumra állítjuk. A szövetet mintegy 9 cm távolságra helyezzük az ernyőtől és háromszor bombázzuk. Ezután a szövetet visszahelyezzük a folyékony közegbe, és fent leirt módon tenyésztjük.

Hét nap elteltével a folyékony közeget 50 mg/ml higromicinnel kiegészített friss SB55 közegre cseréljük. A szelektív közeget hetenként frissítjük. Hét hét elteltével zöld, transzformált szövet figyelhető meg a transzformálatlan, nekrotikus embriogéncsomók között. Az izolált, zöld szövetet eltávolítjuk, és külön üvegekbe inokulálva, új, klónosan szaporított, transzformált embriogén szuszpenziótenyészetet állítunk elő. így minden vonalat független transzformációval kezelünk. A szuszpenziókból altenyészetet készítünk, és érett embriók csomójában fenntartjuk, vagy a teljes növényt érleléssel és az egyedi szomatikus embriók csíráztatásával regeneráljuk.

A transzformált embriogéncsomókat eltávolítjuk a folyékony közegből, és szilárd agarközegre (SB103) helyezzük, amely hormonokat vagy antibiotikumokat nem tartalmaz. Az embriókat 8 héten keresztül 26 °C hőmérsékleten tenyésztjük 16:8 órás változó nappali/éjszakai fluoreszcens és izzófényes megvilágítás mellett. Ez idő alatt az egyedi embriókat eltávolítjuk a csomókból, és a HSZ-fehérje termelésére vizsgáljuk. 8 hét elteltével az embriók csírázásra képesek.

Az egyedi embriókat folyékony nitrogénben megfagyasztjuk, és folyékony nitrogénben előre lehűtött mozsárban finom porrá törjük. A port Eppendorf-centrifugálócsőbe helyezzük, és szobahőmérsékleten hexánnal kétszer extraháljuk. A maradékot 60 °C hőmérsékleten 30 percen keresztül inkubálva a maradék hexánt eltávolítjuk. Ezután 100 μΐ 50 mmol/1 Trisz-HCl (pH=6,7), 2 mmol/1 EDTA, 1 tömeg% SDS és 1 tömeg% β-merkapto-etanol (ΤΕ8β) elegyét adjuk a pellethez, és a mikrocentrifugálócsőhöz illeszkedő eldobható műanyag nyéllel ellátott motoros őrlőkészülékkel alacsony sebesség mellett mintegy 10 másodpercen keresztül őröljük. A kapott szuszpenziót 5 percen keresztül szobahőmérsékleten centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk, és félretesszük. A pelletet 50 μΐ 70 tömeg% izopropanol és 10 mmol/1 β-merkapto-etanol elegyében a fenti módon őrölve szuszpendáljuk. A csövet 60 °C hőmérsékleten percen keresztül inkubáljuk, majd ismét centrifugáljuk. A felülúszót félretesszük, és a pelletet 50 μΐ 70 tömeg% izopropanol és 10 mmol/1 β-merkapto-etanol elegyével extraháljuk. Az alkoholos extraktumokat egyesítjük, és liofilizáljuk. A maradékot 50 μΐ ΤΕ8β oldószerben szuszpendáljuk. Ezt a mintát és az első TES6 extraktumot HSZ-fehéqe jelenlétére vizsgáljuk a 9. példában leírt Westem-foltanalízissel. A három vizsgált, transzformált vonal közül kettő kifejezi a HSZ-fehéijét.

Alkalmazott közegek összetétele

SB55 törzsoldatok (g/1): MS-szulfát 100% törzsoldat
MgSO4x7H2O	37,0
MnSO4 χ H2O	1,69
ZnSO4 χ 7H2O	0,86 és
CuSO4 χ 5H2O	0,0025.
MS-halogenid 100% törzsoldat
CaCl2x2H2O	44,0
KI	0,083
CoCl2 χ 6H2O	0,00125
MS, P, B, Mo 100% törzsoldat
KH2PO4	17,0
H3BO3	0,62
Na2MoO4x2H2O	0,025
MS, FeEDTA 100% törzsoldat
Na2EDTA	3,724
FeSO4x7H2O B5-vitamin-törzsoldat	2,784

g m-inozitol

100 mg nikotinsav

100 mg piridoxin-HCl 1 g tiamin

SB55 (1 literre számolva) minden MS-törzsoldatból 10 ml ml B5-vitamin-törzsoldat

0,8 g NH4NO3

3,033 g KNO₃ ml 1,4-D (10 mg/ml törzsoldat) g szacharóz

0,667 g aszparagin (pH=5,7).

SB103 (1 literre számolva)

MS-sók tömeg% maltóz

750 mg MgCl₂ 0,2 tömeg% gelrit (pH=5,7)

SB1 (1 literre számolva)

MS-sók

B5-vitaminok

0,175 mol/1 glükóz mg 2,4-D

0,8 tömeg% agar (pH=5,8)

SB2 lásd SB1, azzal a különbséggel, hogy mg/1 2,4-D.

12. példa

Kukorica transzformálása nagy kéntartalmú tárolófehérje génnel

Az A188 és B73 genotípusok keresztezésével kapott magokból 10-12 nappal a beporzás után kimetsszük az

HU 218 415 Β éretlen embriót (mintegy 1,5-2,0 mm), és ebből kallusztenyészetet indítunk. Az embriókat az axisz oldallal lefelé megszilárdított agaróz N6 közegre helyezzük. Az embriókat 27 °C hőmérsékleten sötétben tartjuk. Az éretlen embriók szkutellumából szomatikus proembrioidokat és szuszpenzorszerkezetet mutató embrioidokat tartalmazó differenciálatlan sejtmasszából álló morzsalékos embriogén kallusz keletkezik. Az izolált embriogén kalluszt N6 közegen tenyésztjük, és ebből ugyanezen a közegen 2-3 hetenként altenyészetet képzünk.

A tenyésztett kalluszsejtek génekkel történő transzformálását részecskebombázásos módszerrel végezzük. Ehhez Biolistic PDS-1000/He (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA) alkalmazunk.

A transzformációhoz szelektálható markergént tartalmazó plazmidvektort használunk. A pALSLUC plazmid [Fromm és munkatársai: Biotechnology, 8, 833-839 (1990)] a kukorica acetolaktát-szintáz [ALS gén cDNS-ét tartalmazza. Az ALS cDNS-t in vitro módosítottuk úgy, hogy a gén által kódolt enzim klórszulfuron-rezisztens legyen. A változáshoz a cDNS 1626 helyzetében található triptofánkodont leucin kodonra kell változtatni. Az ALS gént karfiol-mozaikvírus 35S promoter [Odell és munkatársai: Natúré 313, 810-812 (1985)] és az Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidjából származó T-DNS nopalin-szintáz génjének 3U szakasza szabályozza. Ez a plazmid olyan gént is tartalmaz, amely a karfiol-mozaikvírus 35S promoterét és a nopalin-szintáz-gén 3U szakaszát a szentjánosbogár luciferázkódoló szakaszának (de Wet és munkatársai: Molec. Cell Bioi. 7, 725-737 (1987)] kifejezéséhez alkalmazza. A kimér HSZ-gént egy második plazmid szállítja. Ez a pCC21 plazmid (6. példa) tartalmazza a HSZ kódolószakaszát, amit a promoterszakasz és a kukorica 10 kD tárolófehéije gént kódoló génből származó 3U vég [Kirihara és munkatársai: Gene 71, 359-370 (1988)] szabályoz.

A pALSLUC és pCC21 plazmidokat együtt aranyszemcsék felületére csapjuk ki. Ehhez 5 pg pALSLUC plazmidot és 2 pg pCC21 plazmidot (mindkettő TriszEDTA pufferben mintegy 1 pg/ml koncentrációban) adagolunk 50 pl, vízben szuszpendált aranyszemcsére (átlagos átmérő 1-5 pm, 60 mg/ml arany). Az arany-DNS szuszpenzióhoz kevertetés közben 50 pl 2,5 mol/1 kalcium-klorid-oldatot és 20 pl 1,0 mol/1 spermidinoldatot adunk. A szemcséket ezután a mikrocentrifugálócsőben 10 másodpercen keresztül centrifugáljuk, és a felülúszót elválasztjuk. A szemcséket 200 pl abszolút etanolban szuszpendáljuk, majd ismét centrifugáljuk, és a felülúszót elválasztjuk. A szemcséket ezután 30 pl etanolban szuszpendáljuk. Minden makrohordozólemezre 5 pl DNS-sel bevont aranyszemcsét adagolunk.

Az embriogén kalluszt kis csomókban (2-3 mm átmérő) elrendezzük az agaróz szilárd N6 közeggel bevont 12 cm átmérőjű Petri-csésze felületén. A szövetet mintegy 6 cm átmérőjű körben lefedjük. A szövetet tartalmazó Petri-csészét PDS-1000/He kamrájába helyezzük. A levegőt eltávolítva 9,5 xlO⁴ Pa vákuumot állítunk be. A makrokarriert héliumsokkal gyorsítjuk, amelyhez a nyomást 6,9 χ 10⁶ Pa értékre állítjuk. A szövetet mintegy 8 cm távolságra helyezzük a stopemyőtől. Tíz lemezt bombázunk a DNS-sel bevont aranyszemcsékkel.

Hét nappal a bombázás után a szöveteket N6 közegre visszük, amely 50 nmol/1 klór-szulfuront tartalmaz, de kazeintől vagy prolintól mentes. A szövetminta ebben a közegben lassan fejlődik. További két hét elteltével a szövetet klór-szulfuront tartalmazó friss N6 közegre visszük át. Nyolc hét elteltével mintegy 1 cm átmérőjű aktívan növekvő kallusz azonosítható a klór-szulfuronnal kiegészített közeget tartalmazó lemezek egyikén. Ezt a kalluszt szelektív közegen végzett altenyészetben tovább tenyésztjük. A kallusz egy részét növényregeneráló közegre visszük át.

A luciferáz aktivitását ebben a kalluszban mérjük. A transzformálatlan kalluszszövet luciferázaktivitása 1 mg friss szövetre számolva mintegy 500 fényegység. A klór-szulfuronon növekvő kallusz luciferázaktivitása 1 mg friss szövetre számolva mintegy 20 000 fényegység. Az eredmény arra utal, hogy a pALSLUC plazmid génje kifejeződik ebben a kalluszvonalban. A bevitt ALS gén és kimér tárolófehéije gén jelenlétét Southern analízissel ellenőrizzük, amely szerint mindkét bevitt gén kimutatható.

A HSZ-gén analíziséhez a transzformált kalluszvonal (Tx-X8A) vagy ugyanabból a genotípusból származó, de transzformálatlan kallusz (AB91) genomiális DNS-ét Xbal vagy EcoRI enzimmel emésztjük. Az emésztett DNS-t gélelektroforézissel agarózgélen frakcionáljuk, és a szokásos módon műanyag membránra visszük át. A műanyagon található folt a HSZ kódolószakasz egy részéből előállított mintával hibridizál. Az AB91 kallusz egy domináns sávot mutat, amely a természetes HSZ-génnek felel meg. A Tx-X8A kalluszban egy további sáv figyelhető meg nagyobb móltömeg értéknél. Ez a sáv a bevitt kimér HSZ-génnek felel meg. N6 közeg:

I oldat	10,0 ml/1
1 mol/1 CaCl2	1,25 ml/1
III oldat	10,0 ml/1
1 mol/1 MgSO4	0,75 ml/1
V oldat	1,0 ml/1
vitamintörzsoldat	1,0 ml/1
kazin-hidrolizátum	0,1 g/1
szacharóz	60,0 g/1
Myo-inozitol	0,1 g/1
2 mg/ml 2,4-D
törzsoldat	0,5 ml/1 (pH
I oldat:
(NH4)2SO4	23,0 g/1
KNOj	141,5 g/1
KH2PO4	20,0 g/1
h2o	500,0 ml.
III oldat:
Na2EDTA	1,85 g
FeSO4.7H2O	1,35 g
h2o	500,0 ml
V oldat:
H3BO3	0,16 g
MnSO4. H2O	0,33 g

HU 218 415 Β

ZnSO₄.7H₂O 0,15 g

KI 0,08 g

Na₂MoO₄.2H₂O 0,025 g

CuSO₄.5H₂O 0,0025 g

CoCl₂.2H₂O 0,0025 g

H₂O 100,0 ml

Vitamintörzsoldat:

(B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: genomiális DNS 5 (iii) hipotetikus: nem (iv) antiszenz: nem (vi) eredeti forrás

niacin	0,13 g	(A) szervezet: Zea mays L
tiamin	0,025 g	(B) törzs: ismeretlen
piridoxin	0,025 g	10 (C) sejt típusa: ismeretlen
kalcium-pan-		(vii) közvetlen forrás:
totenát	0,025 g	(A) tár: kukorica genomtár (Clontech)
H2O	100,0 ml.	(B)klón: X8

Szekvencialista

1. számú szekvencia 15 (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 2123 nukleotid (viii) pozíció a genomban: ismeretlen (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

TCTAGAGCCT ATTACCATCT

GGCTACAGCT GGTGACAATC

TACGCGTAGT TAATTGGTTA

TGGGCTTGGT TATACCTGCT

GTGCTTGATC AAACATTGCA

ATATATATAT TTTTGGGCAG

AATCATTTGT TAAAAAAGGT

GTTTTCACAT TAGATTTTCT

TCAGTTGCAG TAGTCTCTTA

AGCAAATTAC ACAAATCTAG

GTCATGTTTT ACTAAAAGTA

CAGTTAGGGA AGTCTCCAAA

TATCAGCATC CAACTTTCAG

TACATGGCCA TTGTTGACTG

AATCGCAATC GCATATCCAC

CC 752

CTACTCACGG GTCGTAGAGG

CTACTCACCC TTTGTAATCC

GATGTCAACC CCCTCTCTAA

AGTGCCTGGG GATGTTCTAT

TAGTTTGACT TGGGACAAAC

AGGGAGCAGT AAGAACTTAT

TTAATTTTGC TGCTTTCTTT

TTGTGTTATA TACACTGGAT

ATCCACATCA GCTAGGCATA

TGTGCCTGTC GTCACATTCT

CCTTTTCGAA GCATCATATT

TGCCAAGTCA TGCCAAGTCA

TTTCGCATGT GCTAGAAATT

CATGCATCTA TAAATAGGAC

TATTCTCTAG GAAGCAAGGG

TGGTGAGGTA	50
TCTACGGCTC	100
GTGGCAGTAG	150
TTTTCTAGTA	200
TGTCTGATAT	250
TTAGAAATGT	300
CGTTAATGTT	350
ACATACAAAT	400
CTTTAGCAAA	450
CAATAAACTC	500
AATCCGAAAA	550
TCGTCCAGCT	600
GTTTTTCATC	650
CTAGACGATC	700
AATCACATCG	750

ATG GCA GCC AAG ATG TTT GCA TTG TTT GCG CTC CTA GCT CTT TGT 797

Met Alá Alá Lys Met Phe Alá Leu Phe Alá Leu Leu Alá Leu Cys

-20 -15 -10

HU 218 415 Β

GCA

ACC

GCC

ACT

AGT

GCT

ACC

CAT

ATC

CCA

GGG

CAC

TTG

TCA

CCA

Alá

Thr

Alá

Thr

Ser

Alá

Thr

His

Ile

Pro

Gly

His

Leu

Ser

Pro

-5

1

5

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

AAC

ATG

AAC

CCA

TGG

ATG

CAG

TAC

TGC

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Alá

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

Gin

Tyr

Cys

10

15

20

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Val

Alá

Asn

Leu

Leu

Alá

Trp

Pro

Thr

Leu

25

30

35

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Alá

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

40

45

50

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

55

60

65

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

val

Pro

Thr

Met

Met

Ser

70

75

80

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

Pro

Met

Thr

Met

Alá

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

85

90

95

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

Met

Ile

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

100

105

110

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

Met

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

Ile

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

115

120

125

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

842

887

932

977

1022

1067

1112

1157

1202

130

135

140

1247

HU 218 415 Β

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

1292

Met

Met

Thr

Val

Pro

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

Ile

Ser

His

He

145

150

155

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCC

ATG

1337

He

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Alá

Met

160

165

170

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

1382

Alá

Ile

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Alá

Alá

175

180

185

TTC

TAG

ATCTAGATAT

AA

1400

Phe

190

GCATTTGTGT	AGTACCCAAT	AATGAAGTCG	GCATGCCATC	GCATACGACT	1450
CATTGTTTAG	GAATAAAACA	AGCTAATAAT	GACTTTTCTC	TCATTATAAC	1500
TTATATCTCT	CCATGTCTGT	TTGTGTGTTT	GTAATGTCTG	TTAATCTTAG	1550
TAGATTATAT	TGTATATATA	ACCATGTATT	CTCTCCATTC	CAAATTATAG	1600
GTCTTGCATT	TCAAGATAAA	TAGTTTTAAC	CATACCTAGA	CATTATGTAT	1650
ATATAGGCGG	CTTAACAAAA	GCTATGTACT	CAGTAAAATC	AAAACGACTT	1700
ACAATTTAAA	ATTTAGAAAG	TACATTTTTA	TTAATAGACT	AGGTGAGTAC	1750
TTGTGCGTTG	CAACGGGAAC	ATATAATAAC	ATAATAACTT	ATATACAAAA	1800
TGTATCTTAT	ATTGTTATAA	AAAATATTTC	ATAATCCATT	TGTAATCCTA	1850
GTCATACATA	AATTTTGTTA	TTTTAATTTA	GTTGTTTCAC	TACTACATTG	1900
CAACAATTAG	TATCATGCAG	ACTTCGATAT	ATGCCAAGAT	TTGCATGGTC	1950
TCATCATTGA	AGAGCACATG	TCACACCTGC	CGGTAGAAGT	TCTCTCGTAC	2000
ATTGTCAGTC	ATCAGGTACG	CACCACCATA	CACGCTTGCT	TAAACAAAAA	2050
AACAAGTGTA	TGTGTTTGCG	AAGAGAATTA	AGACAGGCAG	ACACAAAGCT	2100
ACCCGACGAT	GGCGAGTCGG	TCA			2123

2. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 639 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú 60 (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro mutált genomiális DNS (x) irodalmi, információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

HU 218 415 Β

CC ΑΤΟ GCA GCC AAG ATG ITT QCA TTG TTT GCG CTC CTA GCT CTT TŰT 47

Mse Alá Alá Lye Mec Phe Alá Leu Phe Alá Leu Leu Alá Leu cys

-20

-15

-10

GCA ACC

GCC

ACT AGT

GCT ACC

CAT

ATC

CCA

GGG

CAC

TTG

TCA

CCA

92

Alá

Thr

Ale

Thr

Ser

Alá

Thr

Hit

Ile

Pro

Gly

His

Leu

Ser

Pro

-5

1

5

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

CAG

TAC

TGC

137

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Alá

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

Gin

Tyr

Cye

10

15

20

ATG

AAG

CAA

CAG

GCG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

1S2

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Val

Alá

Asn

Leu

Leu

Alá

Trp

Pro

Thr

Leu

25

20

-

35

ATG

CTG

CAG

CAA

CTC

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

227

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Alá

Ser

pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Mse

40

45

50

CCA ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

272

Pro

Met

Mec

»et

Pro

Gly Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Mec

Met

Pro

55

60-

•

65

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

317

Met

Pro

Ser

Met

Mec

Pro

Ser

Met

Mec

Val

Pro

Thr

Met

Met

Ser

70

75

Θ0

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

362

Pro

Met

Thr

Met

Alá

ser

Met

Mac

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

35

50

95

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

407

Met

Ile

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

100

105

110

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

452

Met

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

Ile

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

115 120 125

HU 218 415 Β

CCA	ATG	ATG	ATG	CCG	AGC	ATG	GTG
Pro	Met	Met	Met	Pro	Ser	Met	Val
130					135
ATG	ATG	ACA	GTG	CCA	CAA	TGT	TAC
Met	Met	Thr	Val	Pro	Gin	Cys	Tyr
145					150
ATA	CAA	CAA	CAA	CAA	TTA	CCA	TTC
Ile	Gin	Gin	Gin	Gin	Leu	Pro	Phe
160					165
GCG	ATC	CCA	CCC	ATG	TTC	TTA	CAG
Alá	Ile	Pro	Pro	Met	Phe	Leu	Gin
175					180
TTC	TAG	A	639
Phe
190

TCA	CCA	ATG	ATG	ATG	CCA	AAC	497
Ser	Pro	Met	Met	Met	Pro	Asn
		140
TCT	GGT	TCT	ATC	TCA	CAC	ATT	542
Ser	Gly	Ser	Ile	Ser	His	Ile
		155
ATG	TTC	AGC	CCC	ACA	GCA	ATG	587
Met	Phe	Ser	Pro	Thr	Alá	Met
		170
CAG	CCC	TTT	GTT	GGT	GCT	GCA	632
Gin	Pro	Phe	Val	Gly	Alá	Alá

185

3. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 579 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro mutált genomiális DNS (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia 35 (xi) szekvencia

TC ATG ACC CAT ATC CCA GGG CAC TTG TCA CCA CTA CTG ATG CCA TTG 47

Met Thr His Ile Pro Gly His Leu Ser Pro Leu Leu Met Pro Leu

10 15

GCT

ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

CAG

TAC

TGC

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

92

Alá

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

Gin

Tyr

Cys

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

20

25

30

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

137

Val

Alá

Asn

Leu

Leu

Alá

Trp

Pro

Thr

Leu

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

35

40

45

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

182

Leu

Alá

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

Pro

Met

Met

Met

Pro

55 60

HU 218 415 Β

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

227

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Met

Pro

Ser

Met

Met

65

70

75

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

272

Pro

Ser

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Alá

80

85

90

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

317

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

Ser

Pro

Met

95

100

105

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

362

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

Met

Pro

Thr

Met

Met

110

115

120

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

407

Ser

Pro

Met

He

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

MEt

Pro

125

130

135

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

452

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

Met

Met

Thr

Val

Pro

140

145

150

CCA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

497

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

Ile

Ser

His

Ile

Ile

Gin

Gin

Gin

Gin

155

160

165

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

542

Leu

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Alá

Met

Alá

He

Pro

Pro

Met

170

175

180

TTC

TTA

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAG

A 579

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Alá

Alá

Phe

185 190

4. számú szekvencia (D) topológia: lineáris (i) szekvenciajellemzők (ii) molekula típusa: in vitro mutált (A) hossz: 281 nukleotid genomiális DNS (B) típus: DNS (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (C) szál: egyszálú 60 (χϊ) szekvencia

HU 218 415 Β

CAT ATG CCA	ATG	ATG	ATG	CCG
Met Pro	Met	Met	Met	Pro
			5
ATG CCG ATG	CCG	AGT	ATG	ATG
Met Pro Met	Pro	Ser	Met	Met
15			20
ATG TCA CCA	ATG	ACG	ATG	GCT
Met Ser Pro	Met	Thr	Met	Alá
30			35
CCA AGC ATG	ATT	TCA	CCA	ATG
Pro Ser Met	Ile	Ser	Pro	Met
45			50
ATG ATA ATG	CCG	ACC	ATG	ATG
Met Ile Met	Pro	Thr	Met	Met
60			65
ATG CCA CCA	ATG	ATG	ATG	CCG
Met Pro Pro	Met	Met	Met	Pro
75			80
CCA TAG AATTC 281
Pro
90
5. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 453 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: cDNS (x) irodalmi információ: (A) szerzők: Kirihara, J. A. Hunsperger, J. P. Mahonney, W. C. Messing, J. W. ATG GCA GCC AAG ATG	CTT	GCA
Met Alá Alá	Lys Met	Leu	Alá
-20				-15

GGT	ATG	ATG	CCA	CCG	ATG	ACG	ATG	45
Gly	Met	Met	Pro	Pro	Met	Thr	Met
			10
CCA	TCG	ATG	ATG	GTG	CCG	ACT	ATG	90
Pro	Ser	Met	Met	Val	Pro	Thr	Met
			25
AGT	ATG	ATG	CCG	CCG	ATG	ATG	ATG	135
Ser	Met	Met	Pro	Pro	Met	Met	Met
			40
ACG	ATG	CCG	AGT	ATG	ATG	CCT	TCG	180
Thr	Met	Pro	Ser	Met	Met	Pro	Ser
			55
TCA	CCA	ATG	ATT	ATG	CCG	AGT	ATG	225
Ser	Pro	Met	He	Met	Pro	Ser	Met
			70
AGC	ATG	GTG	TCA	CCA	ATG	ATG	ATG	270
Ser	Met	Val	Ser	Pro	Met	Met	Met

(B) cím: Differential expression of a gene fór a methionine rich storage protein in maize (C) folyóirat: Mól. Gén. Génét.

(D) kötetszám: 211 (F) oldal: 477-484 (G) dátum: 1988 (K) releváns maradékok az

5. számú szekvenciában:

22-474 (xi) szekvencia

TTG TTC GCT CTC CTA GCT CTT TGT 45

Leu Phe Alá Leu Leu Alá Leu Cys

HU 218 415 Β

GCA

AGC

GCC

ACT

AGT

GCG

ACC

CAT

ATT

CCA

GGG

CAC

TTG

CCA

CCA

90

Alá

Ser

Alá

Thr

Ser

Alá

Thr

His

Ile

Pro

Gly

His

Leu

Pro

Pro

-5

1

5

GTC

ATG

CCA

TTG

GGT

ACC

ATG

AAC

CCA

TGC

ATG

CAG

TAC

TGC

ATG

135

Val

Met

Pro

Leu

Gly

Thr

Met

Asn

Pro

Cys

Met

Gin

Tyr

Cys

Met

10

15

20

ATG

CAA

CAG

GGG

CTT

GCC

AGC

TTG

ATG

GCG

TGT

CCG

TCC

CTG

ATG

180

Met

Gin

Gin

Gly

Leu

Alá

Ser

Leu

Met

Alá

Cys

Pro

Ser

Leu

Met

25

30

35

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TTA

CCG

CTT

CAG

ACG

ATG

CCA

GTG

ATG

225

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Alá

Leu

Pro

Leu

Gin

Thr

Met

Pro

Val

Met

40

45

50

ATG

CCA

CAG

ATG

ATG

ACG

CCT

AAC

ATG

ATG

TCA

CCA

TTG

ATG

ATG

270

Met

Pro

Gin

Met

Met

Thr

Pro

Asn

Met

Met

Ser

Pro

Leu

Met

Met

55

60

65

CCG

AGC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

GTC

TTG

CCG

AGC

ATG

ATG

TCG

CCA

315

Pro

Ser

Met

Met

Ser

Pro

Met

Val

Leu

Pro

Ser

Met

Met

Ser

Gin

70

75

80

ATG

ATG

ATG

CCA

CAA

TGT

CAC

TGC

GAC

GCC

GTC

TCG

CAG

ATT

ATG

360

Met

Met

Met

Pro

Gin

Cys

His

Cys

Asp

Alá

Val

Ser

Gin

Ile

Met

85

90

95

CTG

CAA

CAG

CAG

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AAC

CCA

ATG

GCC

ATG

ACG

405

Leu

Gin

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe

Met

Phe

Asn

Pro

Met

Alá

Met

Thr

100

105

110

ATT

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CCA

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

450

He

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Alá

Alá

Phe

115	120	125
TAG 453
6. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 30 nukleotid		60	(B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris

HU 218 415 Β (ii) molekula típusa: in viro szintetizált DNS (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

ATGGCAGCCA AGATGCTTGC ATTGTTCGCT 30

7. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 30 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA 30

8. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 17 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

ATGAACCCTT GGATGCA 17

9. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 17 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

CCC ACAGC AA TGGCGAT 17

10. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 13 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia CTAGCCCGGG TAC 13

11. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 13 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS 5 (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

CTAGGTACCC GGG 13

12. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 30 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

CCACTTCATG ACCCATATCC CAGGGCACTT 30

13. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 30 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

TTCTATCTAG AATGCAGCAC CAACAAAGGG 30

14. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 30 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (x) irodalmi információ: publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

TCACCGCTTC AGCAGTGCCA TATGCCAATG 30

15. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 40 nukleotid (B) típus: DNS (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS 45 (x) irodalmi információ:

publikálatlan szekvencia (xi) szekvencia

TCTTAGAATT CTATGGCATC ATCATTGGTG ACACCATGCT 40

16. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 71 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (ix) jelleg (A) név/kulcs: CDS 55 (B)lokáció: 2-70 (xi) szekvencia

HU 218 415 Β

C ATG

ATG

AGA

GCA

AGG

GTT

CCA

CTC

CTG

TTG

CTG

GGA

ATT

CTT

TTC

Met

Met

Arg

Alá

Arg

Val

Pro

Leu

Leu

Leu

Leu

Gly

Ile

Leu

Phe

1

5

10

15

CTG

GCA

TCA

CTT

TCT

GCT

AGC

TTT

G

Leu

Alá

Ser

Leu

Ser

Alá

Ser

Phe

17. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 71 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (xi) szekvencia

CTAGCAAAGC TAGCAGAAAG TGATGCCAGG AAAAGAATTC CCAGCAACAG

GAGTGGAACC

CTTGCTCTCA T

18. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 653 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: genomiális DNS

C ATG ATG AGA GCA AGG GTT CCA (vii) közvetlen forrás:

(B)klón: pCC18 (ix) jelleg (A) név/kulcs: CDS 25 (B) lokáció: 2-652 (xi) szekvencia

CTC CTG TTG CTG GGA ATT CTT TTC

Met Met Arg Alá Arg Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Ile Leu Phe

CTG

GCA

TCA

CTT

TCT

GCT

AGC

TTT

GCT

AGT

GCT

ACC

CAT

ATC

CCA

GGG

94

Leu

Alá

Ser

Leu

Ser

Alá

Ser

Phe

Alá

Ser

Alá

Thr

His

Ile

Pro

Gly

20

25

30

CAC

TTG

TCA

CCA

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

142

His

Leu

Ser

Pro

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Alá

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

35

40

45

CAG

TAC

TGC

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

190

Gin

Tyr

Cys

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Val

Alá

Asn

Leu

Leu

Alá

Trp

Pro

50

55

60

ACC

CTG

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

238

Thr

Leu

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Alá

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

70 75

HU 218 415 Β

ATG

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

286

Met

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

80

85

90

95

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

334

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

MEt

Ser

Pro

100

105

110

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT

382

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

115

120

125

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

ATG

CCG

ACC

430

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

Met

Pro

Thr

130

135

140

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

478

Met

Met

Ser

Pro

Met

Ile

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

145

150

155

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

526

Pro

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

Met

Met

Thr

Val

Pro

160

165

170

175

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

574

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

Ile

Ser

His

Ile

Ile

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

180

185

190

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

622

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

Ala

Ile

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

195

200

205

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAGA

653

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

Phe

210

215

HU 218 415 Β

19. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 31 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (xi) szekvencia

TTCTGCTAGC TTTGCTACCC ATATCCCAGG G 31

20. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 647 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: genomiális DNS (ix) jelleg (A) név/kulcs: CDS (B) lokáció: 2-646 (xi) szekvencia

C ATG ATG AGA GCA AGG GTT CCA CTC CTG TTG CTG GGA ATT CTT TTC

Met Met Arg Alá Arg Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Ile Leu Phe

10 15

CTG

GCA

TCA

CTT

TCT

GCT

AGC

TTT

GCT

ACC

CAT

ATC

CCA

GGG

CAC

TTG

94

Leu

Alá

Ser

Leu

Ser

Alá

Ser

Phe

Alá

Thr

His

Ile

Pro

Gly

His

Leu

20

25

30

TCA

CCA

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

CAG

TAC

142

Ser

Pro

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Alá

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

Gin

Tyr

35

40

45

TGC

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

190

Cys

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Val

Alá

Asn

Leu

Leu

Alá

Trp

Pro

Thr

Leu

50

55

60

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

CCA

238

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Alá

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

Pro

65

70

75

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

286

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Met

Pro

80

85

90

95

ATG

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

334

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

Thr

100

105

110

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT

TCA

CCA

382

Met

Alá

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

Ser

Pro

115 120 125

HU 218 415 Β

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

430

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

lle

Met

Pro

Thr

Met

Met

130

135

140

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

AGC

478

Ser

Pro

Met

lle

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

145

150

155

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

CAA

TGT

526

Met

val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

Met

Met

Thr

Val

Pro

Gin

Cys

160

165

170

175

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

CCA

TTC

574

Tyr

Ser

Gly

Ser

lle

Ser

His

lle

lle

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe

180

185

190

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CAG

622

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Alá

Met

Alá

lle

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

195

200

205

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAGA

647

Pro

Phe

Val

Gly

Alá

Alá

Phe

210	215
21. számú szekvencia		(ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS
(i) szekvenciajellemzők	40	(xi) szekvencia
(A) hossz: 30 bázispár		GAATGCAGCA CCAACAAGG GTTGCTGTAA
(B) típus: nukleinsav		23. számú szekvencia
(C) szál: egyszálú		(i) szekvenciajellemzők
(D) topológia: lineáris		(A) hossz: 38 bázispár
(ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS	45	(B) típus: nukleinsav
(xi) szekvencia		(C) szál: egyszálú
ACTAATCATG ATGAGAGCAA GGGTTCCACT 30	(D) topológia: lineáris
22. számú szekvencia		(ii) molekula típusa: in vitro
(i) szekvenciajellemzők		szintetizált DNS
(A) hossz: 30 bázispár	50	(ix) jelleg
(B) típus: nukleinsav		(A) név/kulcs: CDS
(C) szál: egyszálú		(B) lokáció: 6-38
(D) topológia: lineáris		(xi) szekvencia
TGCTT GCT AGC TTT GCT	ATG CCA	ATG ATG ATG CCG GGT 38
Alá Ser Phe Alá	Me t Pro	Me t Me t Me t Pro Gly
1	5	10
24. számú szekvencia		(A) hossz: 36 bázispár
(i) szekvenciajellemzők	60 34	(B) típus: nukleinsav

HU 218 415 Β (ii) molekula típusa: in vitro szintetizált DNS (xi) szekvencia (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris

TGCTTTCTAG ACTATGGCAT CATCATTGGT GACACC

25. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 352 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: genomiális DNS (ix) jelleg (A) név/kulcs: CDS 10 (B) lokáció: 2-346 (xi) szekvencia

C ATG ATG AGA GCA AGG GTT CCA CTC CTG TTG CTG GGA ATT CTT TTC

Met Met Arg Alá Arg Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Ile Leu Phe

10 15

CTG

GCA

TCA

CTT

TCT

GCT

AGC

TTT

GCT

ATG

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

94

Leu

Alá

Ser

Leu

Ser

Alá

Ser

Phe

Alá

Met

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

20

25

30

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

142

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

35

40

45

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

190

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Alá

Ser

Met

Met

50

55

60

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

238

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

MEt

Ile

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

65

70

75

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

286

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

Met

Pro

Thr

MEt

Met

Ser

Pro

Met

Ile

Met

80

85

90

95

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

334

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

MEt

Met

MEt

Pro

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

105

110

100

ATG ATG CCA TAGTCTAGA

Met Met Pro

115

352

HU 218 415 Β

26. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 3237 bázispár (ii) molekula típusa: genomiális DNS (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (ix) jelleg (A) név/kulcs: CDS (D) topológia: lineáris (B) lokáció: 1419-2444 (xi) szekvencia

GTCGACTCTA GAGGATCCAA TTCCAATCCC ACAAAAATCT GAGCTTAACA GCACAGTTGC 60

TCCTCTCAGA GCAGAATCGG GTATTCAACA CCCTCATATC AACTACTACG TTGTGTATAA 120

CGGTCCACAT GCCGGTATAT ACGATGACTG GGGTTGTACA AAGGCGGCAA CAAACGGCGT 180

TCCCGGAGTT GCACACAAGA AATTTGCCAC TATTACAGAG GCAAGAGCAG CAGCTGACGC 240

GTACACAACA AGTCAGCAAA CAGACAGGTT GAACTTCATC CCCAAAGGAG AAGCTCAACT 300

CAAGCCCAAG AGCTTTGCTA AGGCCCTAAC AAGCCCACCA AAGCAAAAAG CCCACTGGCT 360

CACGCTAGGA ACCAAAAGGC CCAGCAGTGA TCCAGCCCCA AAAGAGATCT CCTTTGCCCC 420

GGAGATTACA ATGGACGATT TCCTCTATCT TTACGATCTA GGAAGGAAGT TCGAAGGTGA 480

AGGTGACGAC ACTATGTTCA CCACTGATAA TGAGAAGGTT AGCCTCTTCA ATTTCAGAAA 540

GAATGCTGAC CCACAGATGG TTAGAGAGGC CTACGCAGCA GGTCTCATCA AGACGATCTA 600

CCCGAGTAAC AATCTCCAGG AGATCAAATA CCTTCCCAAG AAGGTTAAAG ATGCAGTCAA 660

AAGATTCAGG ACTAATTGCA TCAAGAACAC AGAGAAAGAC ATATTTCTCA AGATCAGAAG 720

TACTATTCCA GTATGGACGA TTCAAGGCTT GCTTCATAAA CCAAGGCAAG TAATAGAGAT 780

TGGAGTCTCT AAAAAGGTAG TTCCTACTGA ATCTAAGGCC ATGCATGGAG TCTAAGATTC 840

AAATCGAGGA TCTAACAGAA CTCGCCGTGA AGACTGGCGA ACAGTTCATA CAGAGTCTTT 900

TACGACTCAA TGACAAGAAG AAAATCTTCG TCAACATGGT GGAGCACGAC ACTCTGGTCT 960

ACTCCAAAAA TGTCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG GGCTATTGAG ACTTTTCAAC 1020

AAAGGATAAT TTCGGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC AGCTATCTGT CACTTCATCG 1080

AAAGGACAGT AGAAAAGGAA GGTGGCTCCT ACAAATGCCA TCATTGCGAT AAAGGAAAGG 1140

CTATCATTCA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA TGGACCCCCA CCCACGAGGA 1200

GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA GCAAGTGGAT TGATGTGACA 1260

TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC TTCGCAAGAC CCTTCCTCTA 1320

TATAAGGAAG TTCATTTCAT TTGGAGAGGA CACGCTCGAG CTCATTTCTC TATTACTTCA 1380

GCCATAACAA AAGAACTCTT TTCTCTTCTT ATTAAACC ATG AAA AAG CCT GAA 1433

Met Lys Lys Pro Glu

HU 218 415 Β

CTC

ACC

GCG

ACG

TCT

GTC

GAG

AAG

TTT

CTG

ATC

GAA

AAG

TTC

GAC

AGC

1481

Leu

Thr

Alá

Thr

Ser

Val

Glu

Lys

Phe

Leu

Ile

Glu

Lys

Phe

Asp

Ser

10

15

20

GTC

TCC

GAC

CTG

ATG

CAG

CTC

TCG

GAG

GGC

GAA

GAA

TCT

CGT

GCT

TTC

1529

Val

Ser

Asp

Leu

Met

Gin

Leu

Ser

Glu

Gly

Glu

Glu

Ser

Arg

Alá

Phe

25

30

35

AGC

TTC

GAT

GTA

GGA

GGG

CGT

GGA

TAT

GTC

CTG

CGG

GTA

AAT

AGC

TGC

1577

Ser

Phe

Asp

val

Gly

Gly Arg

Gly

Tyr

Val

Leu

Arg

Val

Asn

Ser

Cys

40

45

50

GCC

GAT

GGT

TTC

TAC

AAA

GAT

CGT

TAT

GTT

TAT

CGG

CAC

TTT

GCA

TCG

1625

Alá

Asp

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

Arg

Tyr

Val

Tyr

Arg

His

Phe

Alá

Ser

55

60

65

GCC

GCG

CTC

CCG

ATT

CCG

GAA

GTG

CTT

GAC

ATT

GGG

GAA

TTC

AGC

GAG

1673

Alá

Alá

Leu

Pro

Ile

Pro

Glu

Val

Leu

Asp

Ile

Gly

Glu

Phe

Ser

Glu

70

75

80

85

AGC

CTG

ACC

TAT

TGC

ATC

TCC

CGC

CGT

GCA

CAG

GGT

GTC

ACG

TTG

CAA

1721

Ser

Leu

Thr

Tyr

Cys

Ile

Ser

Arg

Arg

Alá

Gin

Gly

Val

Thr

Leu

Gin

90

95

100

GAC

CTG

CCT

GAA

ACC

GAA

CTG

CCC

GCT

GTT

CTG

CAG

CCG

GTC

GCG

GAG

1769

Asp

Leu

Pro

Glu

Thr

Glu

Leu

Pro

Alá

Val

Leu

Gin

Pro

Val

Alá

Glu

105

110

115

GCC

ATG

GAT

GCG

ATC

GCT

GCG

GCC

GAT

CTT

AGC

CAG

ACG

AGC

GGG

TTC

1817

Alá

Met

Asp

Alá

Ile

Alá

Alá

Alá

Asp

Leu

Ser

Gin

Thr

Ser

Gly

Phe

120

125

130

GGC

CCA

TTC

GGA

CCG

CCA

GGA

ATC

GGT

CAA

TAC

ACT

ACA

TGG

CGT

GAT

1865

Gly

Pro

Phe

Gly

Pro

Gin

Gly

Ile

Gly

Gin

Tyr

Thr

Thr

Trp

Arg

Asp

135

140

145

TTC

ATA

TGC

GCG

ATT

GCT

GAT

CCC

CAT

GTG

TAT

CAC

TGG

CAA

ACT

GTG

1913

Phe

Ile

Cys

Alá

Ile

Alá

Asp

Pro

His

Val

Tyr

His

Trp

Gin

Thr

Val

150

155

160

165

HU 218 415 Β

ATG

GAC

GAC

ACC

GTC

AGT

GCG

TCC

GTC

GCG

CAG

GCT

CTC

GAT

GAG

CTG

1961

Met

Asp

Asp

Thr

Val

Ser

Alá

Ser

Val

Alá

Gin

Alá

Leu

Asp

Glu

Leu

170

175

180

ATG

CTT

TGG

GCC

GAG

GAC

TGC

CCC

GAA

GTC

CGG

CAC

CTC

GTG

CAC

GCG

2009

Met

Leu

Trp

Alá

Glu

Asp

Cys

Pro

Glu

Val

Arg

His

Leu

Val

His

Alá

185

190

195

GAT

TTC

GGC

TCC

AAC

AAT

GTC

CTG

ACG

GAC

AAT

GGC

CGC

ATA

ACA

GCG

2057

Asp

Phe

Gly

Ser

Asn

Asn

Val

Leu

Thr

Asp

Asn

Gly

Arg

Ile

Thr

Alá

200

205

210

GTC

ATT

GAC

TGG

AGC

GAG

GCG

ATG

TTC

GGG

GAT

TCC

CAA

TAC

GAG

GTC

2105

Val

Ile

Asp

Trp

Ser

Glu

Alá

Met

Phe

Gly Asp

Ser

Gin

Tyr

Glu

Val

215

220

225

GCC

AAC

ATC

TTC

TTC

TGG

AGG

CCG

TGG

TTG

GCT

TGT

ATG

GAG

CAG

CAG

2153

Als

Asn

He

Phe

Phe

Trp

Arg

Pro

Trp

Leu

Alá

Cys

Met

Glu

Gin

Gin

230

235

240

245

ACG

CGC

TAC

TTG

GAG

CGG

AGG

CAT

CCG

GAG

CTT

GCA

GGA

TCG

CCG

CGG

2201

Thr

Arg

Tyr

Phe

Glu

Arg

Arg

His

Pro

Glu

Leu

Alá

Gly

Ser

Pro

Arg

250

255

260

CTC

CGG

GCG

TAT

ATG

CTC

CGC

ATT

GGT

CTT

GAC

CAA

CTC

TAT

CAG

AGC

2249

Leu

Arg

Alá

Tyr

Met

Leu

Arg

Ile

Gly

Leu

Asp

Gin

Leu

Tyr

Gin

Ser

265

270

275

TTG

GTT

GAC

GGC

AAT

TTC

GAT

GAT

GCA

GCT

TGG

GCG

CAG

GGT

CGA

TGC

2297

Leu

Val

Asp

Gly

Asn

Phe

Asp

Asp

Alá

Alá

Trp

Alá

Gin

Gly Arg

Cys

280

285

290

GAC

GCA

ATC

GTC

CGA

TCC

GGA

GCC

GGG

ACT

GTC

GGG

CGT

ACA

CAA

ATC

2345

Asp

Alá

Ile

Val

Arg

Ser

Gly

Alá

Gly

Thr

Val

Gly

Arg

Thr

Gin

Ile

295

300

305

GCC

CGC

AGA

AGC

GCG

GCC

GTC

TGG

ACC

GAT

GGC

TGT

GTA

GAA

GTA

CTC

2393

Alá

Arg

Arg

Ser

Alá

Alá

Val

Trp

Thr

Asp

Gly

Cys

Val

Glu

Val

Leu

310

315

320

325

HU 218 415 Β

GCC GAT AGT GGA AAC CGA CGC CCC AGC ACT CGT CCG AGG GCA AAG GAA 2441

Alá Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg Pro Arg Alá Lys Glu

	330		335		340
TAGTGAGGTA	CCTAATAGTG	AGATCCAACA	CTTACGTTTG	CAACGTCCAA	GAGCAAATAG	2501
ACCACGACGC	CGGAAGGTTG	CCGCAGCGTG	TGGATTGCGT	CTCAATTCTC	TCTTGCAGGA	2561
ATGCAATGAT	GAATATGATA	CTGACTATGA	AACTTTGAGG	GAATACTGCC	TAGCACCGTC	2621
ACCTCATAAC	GTGCATCATG	CATGCCCTGA	CAACATGGAA	CATCGCTATT	TTTCTGAAGA	2681
ATTATGCTCG	TTGGAGGATG	TCGCGGCAAT	TGCAGCTATT	GCCAACATCG	AACTACCCCT	2741
CACGCATGCA	TTCATCAATA	TTATTCATGC	GGGGAAAGGC	AAGATTAATC	CAACTGGCAA	2801
ATCATCCAGC	GTGATTGGTA	ACTTCAGTTC	CAGCGACTTG	ATTCGTTTTG	GTGCTACCCA	2861
CGTTTTCAAT	AAGGACGAGA	TGGTGGAGTA	AAGAAGGAGT	GCGTCGAAGC	AGATCGTTCA	2921
AACATTTGGC	AATAAAGTTT	CTTAAGATTG	AATCCTGTTG	CCGGTCTTGC	GATGATTATC	2981
ATATAATTTC	TGTTGAATTA	CGTTAAGCAT	GTAATAATTA	ACATGTAATG	CATGACGTTA	3041
TTTATGAGAT	GGGTTTTTAT	GATTAGAGTC	CCGCAATTAT	ACATTTAATA	CGCGATAGAA	3101
AACAAAATAT	AGCGCGCAAA	CTAGGATAAA	TTATCGCGCG	CGGTGTCATC	TATGTTACTA	3161
GATCGATCAA	ACTTCGGTAC	TGTGTAATGA	CGATGAGCAA	TCGAGAGGCT	GACTAACAAA	3221

AGGTACATCG GTCGAC

27. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 4 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: peptid (xi) szekvencia

Met Met Met Pro 1

3237

28. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 4 aminosav (B) típus: aminosav (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: peptid (xi) szekvencia

Lys Asp Glu Leu

Claims (18)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált és tisztított nukleinsavfragmens, azzal jellemezve, hogy legalább egy olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely a 2. számú szekvenciában megadott, és HSZ kukoricamag-tárolófehérje elnevezésű aminosav szekvenciát vagy azzal lényegében homológ aminosavszekvenciát kódol, amelyben (a) a kódolt fehérje mintegy 93 aminosavból álló központi szakaszt tartalmaz, amely mintegy 45 metioninmaradékot tartalmaz, (b) a kódolt fehérje érett formája mólarányban mintegy 28% metionint tartalmaz, (c) a kódolt fehérje olyan szignálpeptidet tartalmaz, amely lehetővé teszi, hogy a fehérje az endoplazmatikus retikulumba transzportálódjon, ahol a szignálpeptid a kódolt fehérje aminoterminális végén található, (d) a kódolt fehérje tartalmaz egy szekvenciát, amely mintegy 53 aminosavból áll, mintegy 7 kéntartalmú aminosavat, mintegy 6 prolinmaradékot és mintegy 16 aminosavat tartalmaz a glicin, alanin, valin, leucin és izoleucin csoportból, és ahol a szekvencia

   HU 218 415 Β a szignálpeptid és a központi szakasz között helyezkedik el, (e) a kódolt fehérje tartalmaz egy szekvenciát, amely mintegy 44 aminosavból áll, mintegy 4 kéntartalmú aminosavat, mintegy 6 prolinmaradékot és mintegy 14 aminosavat tartalmaz a glicin, alanin, valin, leucin és izoleucin csoportból, és ahol a szekvencia a központi szakasz és a karboxiterminális vég között helyezkedik el.
2. 2. Izolált és tisztított nukleinsavfragmens, azzal jellemezve, hogy legalább egy olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely a 3. számú szekvenciában megadott, és érett HSZ kukoricamag-tárolófehérje elnevezésű aminosavszekvenciát vagy azzal lényegében homológ aminosavszekvenciát kódol, amelyben (a) a kódolt fehéije mintegy 93 aminosavból álló központi szakaszt tartalmaz, amely mintegy 45 metioninmaradékot tartalmaz, (b) a kódolt fehérje érett formája mólarányban mintegy 28% metionint tartalmaz, (c) a kódolt fehéije tartalmaz egy szekvenciát, amely mintegy 53 aminosavból áll, mintegy 7 kéntartalmú aminosavat, mintegy 6 prolinmaradékot és mintegy 16 aminosavat tartalmaz a glicin, alanin, valin, leucin és izoleucin csoportból, és ahol a szekvencia az aminoterminális vég és a központi szakasz között helyezkedik el, (d) a kódolt fehérje tartalmaz egy szekvenciát, amely mintegy 44 aminosavból áll, mintegy 4 kéntartalmú aminosavat, mintegy 6 prolinmaradékot és mintegy 14 aminosavat tartalmaz a glicin, alanin, valin, leucin és izoleucin csoportból, és ahol a szekvencia a központi szakasz és a karboxiterminális vég között helyezkedik el.
3. 3. Izolált és tisztított nukleinsavfragmens, azzal jellemezve, hogy legalább egy olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely a 4. számú szekvenciában megadott, és HMD kukoricamag-tárolófehérje elnevezésű aminosavszekvenciát vagy azzal lényegében homológ aminosavszekvenciát kódol, amelyben (a) a kódolt fehéije mintegy 93 aminosavból áll, és mintegy 45 metioninmaradékot tartalmaz, (b) a kódolt fehérje mólarányban mintegy 28% metionint tartalmaz.
4. 4. A 2. igénypont szerinti nukleinsavfragmens, azzal jellemezve, hogy működőképesen egy kétszikű növényből származó szignálszekvenciához kapcsolódik.
5. 5. A 3. igénypont szerinti nukleinsavfragmens, azzal jellemezve, hogy működőképesen egy növény szignálszekvenciához kapcsolódik.
6. 6. Kimér gén, amely transzformált növényekben megváltoztatja a kéntartalmú aminosavak mennyiségét, azzal jellemezve, hogy 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavfragmenst és ehhez működőképesen hozzákapcsolva intracelluláris lokalizációs szekvenciát és megfelelő szabályozószekvenciát tartalmaz.
7. 7. A 6. igénypont szerinti kimér gén, azzal jellemezve, hogy szabályozószekvenciaként magspecifikus szabályozószekvenciát tartalmaz.
8. 8. Növény, azzal jellemezve, hogy 6. igénypont szerinti kimér génnel van transzformálva.
9. 9. A 8. igénypont szerinti kukorica-, szójabab-, kanola-, dohány- vagy rizsnövény, azzal jellemezve, hogy 6. igénypont szerinti kimér génnel van transzformálva.
10. 10. Mag, azzal jellemezve, hogy 8. igénypont szerinti növényből nyerjük.
11. 11. Kimér gén, amely transzformált mikroorganizmusban megváltoztatja a kéntartalmú aminosavak mennyiségét, azzal jellemezve, hogy 2. vagy 3. igénypont szerinti nukleinsavfragmenst, és ehhez működőképesen hozzákapcsolva megfelelő szabályozószekvenciát tartalmaz.
12. 12. Mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy 11. igénypont szerinti kimér génnel van transzformálva.
13. 13. Polipeptid, azzal jellemezve, hogy valamely 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti nukleinsavfragmens prokarióta vagy eukarióta gazdasejtben történő kifejeződésének terméke.
14. 14. Növény, azzal jellemezve, hogy 13. igénypont szerinti polipeptidet tartalmaz.
15. 15. Mag, azzal jellemezve, hogy 13. igénypont szerinti polipeptidet tartalmaz.
16. 16. Eljárás növényben a kéntartalmú aminosavak mennyiségének növelésére, azzal jellemezve, hogy

    a) növényi sejtet 6. igénypont szerinti kimér génnel transzformálunk,

    b) a transzformált növényi sejtből termőképes, szexuálisan érett növényt nevelünk, és

    c) a termőképes növény magjait a transzformálatlan növényi sejthez viszonyítva fokozott kéntartalmú aminosavmennyiség alapján szelektáljuk.
17. 17. Eljárás kéntartalmú aminosavakban gazdag fehérje mikroorganizmusban történő előállítására, azzal jellemezve, hogy

    a) a mikroorganizmust 11. igénypont szerinti kimér génnel transzformáljuk,

    b) a mikroorganizmust kéntartalmú aminosavakban dús fehéije kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztjük, és

    c) a b) szerinti fehérjét izoláljuk.
18. 18. Lényegében tiszta pCCIO plazmid, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti nukleinsavfragmenst tartalmaz, és az ATCC 68490 deponálási számmal azonosítható.