CZ167993A3 - Chimeric gene capable of assuring increased level of amino acids containing sulfur in transformed plants and micro-organisms - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká chimérického genu schopného zajistit zvýšenou hladinu aminokyselin s obsahem síry v transformovaných rostlinách a mikroorganismech. Dále se vynález týká zejména způsobu zvyšování obsahu sirných aminokyselin v rostlinách.

Dosavadní stav techniky spotřebuje 180 množství tvoří

Světový obrat s krmivý, která zahrnují krmivá pro dobytek, drůbež, vodní živočichy a zvířata chovaná pro potěšení, činí asi 475 milionů tun. V samotných USA se milionů tun, přičemž asi 67 % z tohoto kukuřice (Zea mays L.) a asi 10 % sója (Glycine max L.). Kukuřičné a sojové produkty jsou také hlavním prvkem zahraničního obchodu. Tyto dvě plodiny jsou agronomicky dobře přizpůsobené mnoha částem USA a v USA je v širokém rozsahu k dispozici strojní vybavení a zařízení pro jejich sklizeň, skladování a zpracování. Vzhledem k tomu, že kukuřice, sója a jiné plodiny, kterých se používá jak krmiv, jsou v současné době prodávány jako komodity, existuje výborná příležitost zvýšit nutriční kvalitu jejich proteinů a tak zvýšit jejich hodnotu pro amerického farmáře a povzbudit zahraniční obchod.

Lidská potrava a krmivá pro zvířata, které jsou získány z mnoha zrnin, mají nízký obsah sirných aminokyselin, t.j. methionínu a cysteinu, které jsou potřebné pro výživu živočichů. V kukuřici jsou sirné aminokyseliny na třetím místě, po lysinu a tryptofanu, jakožto faktor omezující její použití v krmivech, s ohledem na dietní požadavky mnoha zvířat. Použití sojové mouky, která je bohatá na lysin a tryptofan, jakožto přísady ke kukuřici v krmivech, je omezeno nízkým obsahem sirných aminokyselin v této luskovině. Zvýšení obsahu sirných aminokyselin bud v kukuřici nebo v sóji, by zlepšilo nutriční kvalitu výsledných směsí a snížilo nutnost používat dalších krmivových přísad pro dodání nákladnějšího methioninu.

Pokusy zlepšit obsah sirných aminokyselin v plodinách jejich křížením se setkaly v laboratorním měřítku s omezeným úspěchem a nezaznamenaly žádný obchodní úspěch. Mutantní kukuřičná linie se zvýšenou koncentrací methioninu v celém jádře byla izolována z kukuřičných buněk pěstovaných v kultuře prostřednictvím selekce na růst za přítomnosti inhibičních koncentrací lysinu plus threoninu [Phillips a další (1985) Cereal Chem. 62: 213 až 218], Z této linie však až dosud nebyly odvozeny žádné agronomicky vhodné kultivary pro obchodní uplatnění. Sojové buněčné linie se zvýšenou intracelulární koncentrací methioninu byly izolovány selekcí na růst za přítomnosti methioninu [Madison and Thomson (1988) Plant Cell Reports 7: 472 až 276], ale z těchto linií nebyly regenerovány rostliny.

Obsah aminokyselin v semenech je určován především zásobními proteiny, jejichž syntéza probíhá během vývoje semene. Tyto proteiny slouží jako hlavní nutriční rezerva během klíčení. Množství proteinu v semenech kolísá v rozmezí od asi 10 % (vztaženo na sušinu) v obilninách do asi 20 až 40 % (vztaženo na sušinu) v luskovinách. V mnohých semenech činí celkový obsah zásobního proteinu 50 % nebo více. Vzhledem k jejich velkému výskytu, byly to právě zásobní proteiny v semenech, které byly jako první proteiny izolovány. Teprve nedávno však byly za použití technik molekulární genetiky stanoveny sekvence aminokyselin některých z těchto proteinů. Tyto techniky také poskytly informace o genetických signálech, které kontrolují expresi, specifickou vzhledem k semenu a intracelulární zacílení těchto proteinů.

Byla identifikována řada rostlinných zásobních proteinů, které jsou bohaté na síru a byly izolovány odpovídající geny, řídící jejich tvorbu. Z kukuřice byl izolován gen pro proteiny 15kD zein, který obsahuje ll % methioninu a 5 % cysteinu [Pedersen a další (1986) J. Biol. Chem. 261: 6279 až 6284] a gen pro protein lOkD zein, který obsahuje 23 % methioninu a 3 % cysteinu [Kirihara a další (1988) Mol. Gen. Genet. 21: 477 až 484; Kirihara a další (1988) Gene 71: 359 až 370]. Byly též izolovány dva geny z hrachu pro albuminy v semeni obsahující jednak 8 % a jednak 16 % cysteinu [Higgins a další (1986) J. Biol. Chem. 261: 11124 až 11130]. Dále byl izolován gen z para ořechů pro albumin 2S v semeni, který obsahuje 18 % methioninu a 8 % cysteinu [Altenbach a další (1987) Plant Mol. Biol. 8: 239 až 250]. Konečně, z rýže byl izolován gen kódující lOkD prolamin v semeni, který obsahuje 19 % methioninu a 10 % cysteinu [Masumura a další (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123 až 130].

Existuje mnoho zpráv o expresi genů pro zásobní proteiny v semenech transgenních rostlin. Albumin 2S z vysokým obsahem síry, který pochází z para ořechů, byl exprimován v semenech transformovaného tabáku pod kontrolou regulačních sekvencí genu pro zásobní protein, faseolin, ve fazolu. Protein byl účinně vyroben od 17kD prekursoru k 9kD a 3kD podjednotkám maturovaného nativního proteinu. Akumulace proteinu, bohatého na methionin v semenech tabáku se projevila až 30% zvýšením obsahu methioninu v semenech (Altenbach a další (1989) Plant Mol. Biol. 13: 513 až 522].

Chimérické geny připojující kódující oblasti genů pro zásobní protein semene kukuřice a to pro 19kD a 23kD zein k promotoru 35S mozaikového viru květáku byly exprimovány ve velmi nízké koncentraci v semenech, jakož i kořenech a listech transformovaného tabáku [Schernthaner a další (1988) EMBO J. 7: 1249 až 1255]. Nahrazení regulačních oblastí jednoděložných rostlin (promotoru a terminátoru transkripce) regulačními oblastmi, které jsou specifické pro semena dvojděložných rostlin, mělo za následek nízkou hladinu exprese, specifické vzhledem k semenům, 19kD zeinu v transformované petúnii (Williamson a další (1988) Plant Physiol. 88: 1002 až 1007] a tabáku [Ohtani a další (1991) 16: 117 až 128]. V jiném případě byla tabáku zjištěna pro semena specifická bohatého na síru a signální sekvence

Plant Mol. Biol. v transformovaném exprese 15kD zeinu jednoděložného prekursoru byla také správně vyrobena [Hoffman a další (1987) EMBO J. 6: 3213 až 3221].

Pro zvýšení obsahu sirných aminokyselin v semenech je důležité izolovat gen nebo geny kódující zásobní proteiny v semenech, které jsou bohaté na sirné aminokyseliny, methionin a cystein. Methioninu se dává přednost před cysteinem, poněvadž většina zvířat je schopna převést methionin na cystein, ale nikoliv cystein na methionin. Je žádoucí, aby byl zásobní protein kompatibilní se zásobními proteiny cílové plodiny. Dále je žádoucí, aby protein pocházel ze zdroje, který je obecně považován za bezpečný v krmivěch.

Podstata vvnálezu kyselin obsahem kterých

Byl objeven v semenech síry (HSZ) lze použít způsob, jak zvýšit obsah sirných aminoZa použití genu pro zein s vysokým je možno vytvořit chimérické geny, pro transformaci různých plodin, za účelem zvýšení obsahu sirných aminokyselin v jejich semenech nebo listech. Konkrétně, jedním aspektem tohoto vynálezu je fragment nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující HSZ zásobní protein kukuřice, který odpovídá sekvenci označené SEQ ID NO;2 nebo jakoukoliv nukleotidovou sekvenci, která je s ní v podstatě homologní. Jinými aspekty vynálezu jscu fragmenty nukleové kyseliny kódující maturovaný HSZ protein (SEQ ID NO;3) a doménu s vysokým obsahem methioninu (HMD) HSZ zásobního proteinu kukuřice (SEQ ID NO:4).

Předmětem vynálezu jsou také chimérické geny, které jsou schopny exprese v transformovaných rostlinách a které obsahují kterékoliv z výše uvedených fragmentů nukleové kyseliny operabilně připojené Přednost se dává chimérickým připojují fragmenty nukleové k regulačním genům, které kyseliny k sekvencím.

operabilně promotorům specifickým pro semena kukuřice nebo sóji.

nebo promotorům aktivním v listech

Předmětem vynálezu jsou dále chimérické geny, které jsou schopny exprese v transformovaných mikroorganismech, přednostně E. coli, za účelem produkce proteinů s vysokým obsahem síry.

Ještě dalším předmětem vynálezu jsou hostitelské buňky transformované chimérickými geny, za účelem produkce proteinů s vysokým obsahem síry.

rostliny obsahuj i kyseliny, získaným, kukuřici,

Ještě dalším předmětem vynálezu jsou transformované a semena, která jsou z nich získána a která kterékoliv z výše uvedených fragmentů nukleové dává rostlinám a semenům z nich zvoleny ze souboru zahrnujícího

Přednost se které jsou sóju, řepku, tabák a rýži.

Dalším aspektem vynálezu jsou mikroorganismy transformované výše uvedenými chimérickými geny.

Do rozsahu vynálezu také spadají způsoby zvyšování obsahu sirných aminokyselin v rostlinách a pomocí Agrobacterium tumefaciens zprostředkované způsoby získávání rostlin, které jsou schopny produkovat proteiny s vysokým obsahem síry. Konečně jsou předmětem vynálezu také způsoby získávání proteinu bohatého na sirné aminokyseliny v mikroorganismech.

Vynález je blíže objasněn v následujícím podrobném popisu, v němž se používá odkazů na připojené obrázky a popisy sekvencí. Popis sekvencí obsahuje třípísmenové kódy pro aminokyseliny, ve smyslu definice uvedené v 37 C.F.R. 1.822. Uvedená citace představuje náhradu za přenesení celého jejího obsahu do popisu tohoto vynálezu.

SEQ ID NO:1 ukazuje nukleotidovou sekvenci (2123 bp) HSZ genu v kukuřici a předvídanou sekvenci aminokyselin primárního translačního produktu. Nukleotidy 753 až 755 představují předpokládaný translační iniciační kodon a nukleotidy 1386 až 1388 představují předpokládaný kodon terminace translace. Nukleotidy 1 až 752 zahrnují předpokládanou 5’ regulační sekvenci a nukleotidy 1389 až 2123 zahrnují předpokládanou 3' regulační sekvenci.

SEQ ID NO:2 ukazuje přednostní nukleotidovou sekvenci podle tohoto vynálezu. Tato sekvence zahrnuje fragment DNA (635 bp) zahrnující pouze kódující oblast HSZ, která může být izolována štěpením restrikční endonukleasou za použití Nco I (5' -CCATGG) až Xba I (5'-TCTAGA). Dvě místa Nco I, která byla přítomna v nativní kódující oblasti HSZ, byla eliminována místně orientovanou mutagenesí, aniž by byla změněna kódovaná sekvence aminokyselin.

SEQ ID NO: 3 ukazuje přednostní nukleotidovou sekvenci podle tohoto vynálezu. Tato sekvence zahrnuje fragment DNA (579 bp) zahrnující pouze kódující oblast maturovaného HSZ proteinu, která může být izolována štěpením restrikční endonukleasou za použití BspH I (5'-TCATGA) až Xba I (5'-TCTAGA). Dvě místa Nco I, která byla přítomna v nativní kódující oblasti HSZ, byla eliminována místně orientovanou mutagenesí, aniž by byla změněna kódovaná sekvence aminokyselin.

SEQ ID NO:4 představuje nukleotidovou amnokyselinovou sekvenci genu HMD.

a odvozenou

SEQ ID NO:5 představuje DNA sekvenci kukuřičného genu pro lOkD zein [Kirihara a další (1988) Mol. Gen. Genet. 21: 477 až 484; Kirihara a další (1988) Gene 71: 359 až 370] .

SEQ ID NO:6 a 7 bylo použito v příkladu 1 pro skríning knihovny kukuřice na gen pro lOkd zein s vysokým obsahem methioninu.

SEQ ID NO:8 mutagenesi genu HSZ.

a 9 bylo použito v příkladu 2 pro

SEQ ID NO:10 a 11 vytvoření formy HSZ genu s nukleasovými místy.

bylo použito v příkladu 2 pro alternativními jedinými endoSEQ ID NO:12 a 13 bylo použito v příkladu 2 pro vytvoření genu kódujícího maturovanou formu HSZ.

SEQ ID NO:14 a 15 bylo použito v příkladu 5 pro konstrukci genu kódujícího HMD z HSZ.

SEQ ID NO:26 až 21 bylo použito v příkladu 6 pro konstrukci chimérických genů pro expresi HS2 v rostlinách.

SEQ ID NO:22 bylo použito v příkladu 7 pro analýzu transformantů tabáku s chimérickými geny pro faseolin-HSZ.

SEQ ID NO:23, 24 a 25 bylo použito v příkladu 10 pro konstrukci chimérických genů pro expresi HMD v rostlinách.

SEQ ID NO:26 představuje chimérický gen, který se skládá z promotoru 35S z mozaikového viru květáku [Oděli a další (1985) Nátuře 313: 810 až 812], genu pro hygromycin fosfotranferasu z plasmidu pJR225 (z E. coli) [Gritz a další (1983) Gene 25: 179 až 188] a 3'oblast genu pro nopalin synthasu z T-DNA Ti plasmidu z Agrobacterium tumefaciens, kterého se používá jako selekčního genetického markéru pro transformaci sóji v příkladu 11.

SEQ ID NO:27 představuje centrální oblast HSZ proteinu.

SEQ ID NO:28 představuje aminokyselinovou sekvenci pro retenci proteinů v lumeni endoplastického retrikula.

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je uvedeno srovnání aminokyselinových sekvencí lOkD zeinu (SEQ ID NO:5) a HSZ (SEQ ID NO:2). Používá se v něm jednopísmenových kódů pro aminokyseliny. Domény s vysokým obsahem methioninu v obou proteinech jsou podtrženy. Vertikální čáry na obr. 1 ukazují totožné aminokyselinové zbytky v obou proteinech.

Na obr. 2 je znázorněno schéma exprimačních kazet pro gen, který je specifický vzhledem k semeni, které jsou užitečné pro konstrukci chimérických genů pro expresi HSZ v transgenních rostlinách.

Na obr. 3 je znázorněna mapa binárního plasmidového vektoru pZS97K.

Na obr. 4 je znárzorněna mapa binárního plasmidového vektoru pZS97.

Předmětem vynálezu jsou tedy fragmenty nukleové kyseliny kódující kukuřičný zein s vysokým obsahem síry (HSZ), jakožto zásobní protein v semenech, nebo doménu s vysokým obsahem methioninu (HMD), odvozenou od HSZ. Oba tyto elementy jsou neobvykle bohaté na aminokyselinu methionin.

HSZ protein se skládá z centrální oblasti, která je velice bohatá na methionin (přibližně 48 % methioninových zbytků), lemované aminoterminální a karboxyterminální oblastí. Posledně uvedené lemovací oblasti mají nízký obsah methioninu (aminoterminální oblast - 10 %; karboxyterminální oblast - 7 % methioninu). Centrální oblast se skládá z variací opakujícího se motivu Met-Met-Met-Pro (SEQ ID NO: 27). Příbuzný protein, lOkD zein, má podobnou, ale odlišnou strukturu (viz obr. 1). Centrální oblast HSZ proteinu je asi 2x tak velká než odpovídající oblast 10kD zeinu, což má za následek zvýšení obsahu methioninu v HSZ. Zjevná duplikace centrální domény s vysokým obsahem methioninu (HMD) v HSZ, ve srovnání s lOkD zeinem naznačuje, že by mohla mít centrální doména s vysokým obsahem methioninu stabilní strukturu a mohla by se sama exprimovat, za vzniku zásobního proteinu s výsokým obsahem methioninu.

Zavedení chimérického genu obsahujícího regulační sekvence pro zásobní protein semene a sekvenci kódující zásobní protein bohatý na methionin představuje prostředek pro zlepšení nutriční kvality semen plodin. Zvýšení obsahu methioninu v semenech bude určováno a) úrovní exprese chimérického genu v transformované plodině, která zčásti závisí na použitých exprimačních signálech specifických pro semena, b) na obsahu methioninových zbytků v oblasti kódující zásobní protein semene, c) na stabilitě zavedeného proteinu v semeni, transformované plodiny, která zčásti závisí na jeho vhodné výrobě, intracelulárním zacílení, někdy na zabudování do struktur vyššího řádu a na schopnosti vzdorovat desikaci a d) na kompatibilitě zavedeného proteinu s nativními proteiny semene transformované plodiny.

Přenos fragmentů nukleové kyseliny podle vynálezu s vhodnými regulačními sekvencemi do živé buňky bude mít za následek produkci nabo nadprodukci proteinu. Přenos fragmentů nukleové kyseliny podle vynálezu do rostliny, zejména kukuřice, sóji nebo řepky olejky, s vhodnými regulačními sekvencemi pro orientaci exprese proteinu do semen, může mít za následek zvýšení koncentrace sirných aminokyselin, zejména methioninu a může tak přispět ke zlepšení nutriční kvality proteinu semen pro zvířata.

V kontextu tohoto popisu se používá řady termínů, které budou nyní vysvětleny. Termínu nukleová kyselina se používá pro velkou molekulu, která může být jednořetězcová nebo dvouřetězcová a skládá se z monomerů (nukleotidů), obsahujících cukr, fosfát a bud purin nebo pyrimidin. Termínem fragment nukleové kyseliny se označuje část dané molekuly nukleové kyseliny. U vyšších rostlin představuje deoxyribonukleová kyselina (DNA) genetický materiál, zatímco ribonukleová kyselina (RNA) se podílí na přenosu informací v DNA do proteinů. Termínem genom se označuje celý genetický materiál obsažený v každé buňce organismu. Termínem nukleotidová sekvence se označuje polymer DNA nebo RNA, kterým může být jednořetézcový nebo dvouřetězcový a který popřípadě obsahuje syntetické, nepřirozené nebo pozměněné nukleotidové báze, které mohou být zabudovány do polymerů DNA nebo RNA.

Termínem homologní s se označuje komplementarita mezi nukleotidovými sekvencemi dvou molekul nukleové kyseliny nebo mezi aminokyselinovými sekvencemi dvou molekul proteinu. Odhady takové homologie poskatuje bud DNA-DNA nebo DNA-RNA hybridizace za podmínek vysoké stringence, jak je to dobře známo odborníkům v tomto oboru [viz například Hames a Higgins (red.) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, Velká Británie] nebo porovnání podobnosti sekvencí mezi dvěma nukleovými kyselinami nebo proteiny.

Termín v podstatě homologní se vztahuje k molekulám nukleové kyseliny, které pro hybridizaci vyžadují méně stringentní podmínky, než jsou podmínky potřebné u homologní ch sekvencí a také se vztahuje ke kódující DNA sekvenci, která může zahrnovat změny bází, které nezpůsobují změnu v kódované aminokyselině nebo která zahrnuje změny bází, které mohou pozměňovat jednu nebo více aminokyselin, ale které neovlivňují funkční vlastnosti proteinu kódovaného sekvencí DNA. Fragmenty nukleové kyseliny charakterizovné v tomto popisu tedy zahrnují molekuly, v nichž jsou obsaženy možné variace nukleotidových bází, k nimž dochází delecí, přesmykem, statistickou nebo regulovanou mutagenesí fragmentu nukleové kyseliny a dokonce i příležitostnými omyly v nukleotidové sekvenci, za předpokladu, že jsou tyto sekvence DNA v podstatě homologní.

Pod označením gen še rozumí fragment nukleové kyseliny, který exprimuje specifický protein. Kódující oblast tohoto genu předchází nekódující 5'regulační sekvence a následuje nekódující 3' regulační sekvence. Pod označením nativní gen se rozumí gen, tak jak se nalézá v přírodě, se svými vlastními regulačními oblastmi. Pod označením chimérický gen se rozumí gen, který obsahuje heterogenní regulační a kódující sekvence. Po označením endogenní gen se rozumí nativní gen, který se normálně nalézá v genomu na svém přirozeném místě. Pod označením cizí gen se rozumí gen, který se normálně v hostitelském organismu nevyskytuje, nýbrž, který je zaveden genovým přenosem (transferem).

Pod označením kódující sekvence se rozumí sekvence DNA, která kóduje specifický protein a vylučuje nekódující sekvence. Může tvořit nepřerušovanou kódující sekvenci t.j. sekvenci neobsahující intron, jako je tomu u cDNA, nebo může obsahovat jeden nebo více intronů vázaných vhodnými spoji sestřihu. Intron je sekvence RNA, která je transkribována v primárním transkriptu, ale která se odstraní odštěpením a re-ligací RNA · do buňky, za vzniku maturované mRNA, která se může přeložit do proteinu.

Iniciační kodon a terminační kodon jsou jednotky tří sousedních nukleotidů v kódující sekvenci, které charakterizují iniciaci a terminaci řetězce při syntéze proteinu (translace mRNA). Otevřený čtecí rámec představuje aminokyselinovou sekvenci kódovanou mezi kodonem iniciace translace a kodonem terminace translace kódující sekvence.

Transkript RNA představuje produkt, který se získá transkripcí sekvence DNA, která je katalyzována RNA polymerasou. Pokud je transkript RNA dokonalou komplementární kopií sekvence DNA, označuje se jako primární transkript; nebo se může jednat o sekvence RNA získanou posttranskripční úpravou primárního transkriptu a v tomto případě se jedná o tzv. maturovanou RNA. Mediátorová RNA (mRNA) představuje RNA neobsahující introny, kterou lze přeložit do proteinu buňkou. Termínem cDNA se označuje dvouřetězcová DNA, která je komplementární k mRNA a je od ní odvozena.

Pod pojmem · regulační sekvence se rozumí nukleotidové sekvence umístěné před (5 ' ), uvnitř a/nebo za (3') kódující sekvencí, které kontrolují transkripci a/nebo expresi kódujících, sekvencí, potenciálně v součinnosti s biosyntetickým aparátem buňky pro syntézu proteinu. Tyto nukleotidové sekvence zahrnují sekvenci promotoru, vedoucí sekvenci translace, terminační sekvenci transkripce a polyadenylační sekvenci.

Pod pojmem promotor se rozumí sekvence DNA v genu, obvykle umístěná před (5') kódující sekvencí, která kontroluje expresi kódující sekvence tím, že umožňje rozpoznání pro RNA polymerasu a jiné faktory potřebné pro správnou transkripci. Promotor může také obsahovat sekvence DNA, které se podílejí na vazbě faktorů proteinu kontrolujících účinnost iniciace transkripce v odpovědi na fyziologické podmínky nebo podmínky vývoje. Také může obsahovat prvky enhanceru (zesilovače transkripce).

Enhancer (zesilovač transkripce) představuje sekvenci DNA, která může stimulovat aktivitu promotoru. Může se jednat o vlastní prvek prvek, který je insertován promotoru a/nebo zvýšení promotoru nebo o heterologní za účelem zesílení aktivity specifičnosti vůči tkáni.

Konstitutivní promotory jsou promotory, které řídí expresi genu ve všech tkáních a v každé době. Promotory specifické vůči orgánu nebo specifické vůči vývoji jsou promotory, které řídí expresi genu téměř výlučně ve specifických orgánech, jako jsou listy nebo semena nebo ve specifickém vývojovém stadiu orgánu, jako při časné nebo pozdní embryogenesi.

Pod pojmem exprese se rozumí produkce proteinového produktu kódovaného genem. Nadexprese se vztahuje k produkci genového produktu v transgenních organismech, kerá převyšuje úroveň produkce v normálních nebo netransformovaných organismech.

Pod označením 3' nekódující sekvence se rozumí část sekvence DNA genu, která obsahuje terminační signál pro transkripci, polyadenylační signál a jakýkoliv jiný regulační signál, který je schopen ovlivnit tvorbu mRNA nebo expresi genu. Polyadenylační signál je obvykle charakteristický tím, že ovlivňuje adici traktů polyadenylové kyseliny ke 3 ¹ konci prekursoru mRNA.

Pod označením ”5’ nekódující sekvence se rozumí část sekvence DNA genu, která obsahuje promotorovou sekvenci a vedoucí sekvenci translace.

Vedoucí sekvence translace představuje část sekvence DNA genu mezi promotorem a kódující sekvencí, která je transkribována do RNA a je přítomna v úplně vyrobené nRNA před koncem 5' kodonu pro začátek translace. Vedoucí sekvence translace může ovlivňovat úpravu primárního transkriptu na mRNA, stabilitu mRNA nebo účinnost translace.

představuje polypeptid jeho signálního peptidu. primární produkt translace představuje aminoterminální extensi překládá ve spojitosti s tvorbou

Maturovaný protein upravený po translaci bez Prekursorový protein označuje mRNA. Signální peptid polypeptidu, která se polypeptidu a prekursorového peptidu a které je zapotřebí pro jeho vstup na sekretorickou dráhu. Pod označením signální sekvence se rozumí nukleotidové sekvence, která kóduje signální peptid.

Pod označením intracelulární lokalizační sekvence se rozumí nukleotidové sekvence, která kóduje intracelulární cílový (recipientní) signál. Pod označením intracelulární cílový signál se rozumí sekvence aminokyselin, která se překládá ve spojení s proteinem a orientuje ho do konkrétního subcelulárního kompartmentu. Pod označením ER (endoplasmické retikulum) stop transit signál se rozumí karboxyreminální extense polypeptidu, která se překládá ve spojení se polypeptidem a způsobuje, že protein vstupující na sekretorovou dráhu zůstává zachován v ER. ER stop transit sekvence představuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje ER cílový signál. Jiné intracelulární cílové sekvence kódují cílové signály aktivní v semenech a/nebo listech a vakuolové cílové signály.

Pod označením transformace se zde rozumí přenos (transfer) cizího genu do genomu hostitelského organismu a zajištění jeho geneticky stálé dědičnosti. Jako příklady metod transformace rostlin je možno uvést transformaci zprostředkovanou Agrobacterium a transformační techniku, při níž se používá urychlených částic nebo tzv. genové pušky.

Rekombinační techniky DNA nabízejí možnost zvýšení obsahu sirných aminokyselin v plodinách. Jako zejména užitečné techniky je možno uvést: a)· metody molekulárního klonování a in vitro manipulace genů [viz Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press], b) zavádění genů transformací do zemědělsky důležitých plodin, jak je sója [Chee a další (1989) Plant Physiol. 91: 1212 až 1218; Christou a další (1989) Proč. Nati. Acad. Sci USA 86: 7500 až 7504; Hinchee a další (1989) Biotechnology 6: 915 až 922; EP 0 301 749

A2], řepka olejka [De Block a další (1989) Plant Physiol. 91: 694 až 701] a kukuřice [Gordon-Kamm a další (1990) Plant Cell 2: 603 až 618; Fromm a další (1990) Biotechnology 8: 833 až 839] ac) vzhledem k semenům specifickou expresi zavedených genů v transgenních rostlinách [viz Goldberg a další (1989) Cell 56: 149 až 160; Thompson a Larkins (1989) BioEssays 10: 108 až 113]. Aby bylo možno použít těchto technologií pro vyvinutí plodin se zvýšeným obsahem sirných aminokyselin, je důležité identifikovat a izolovat obchodně důležité geny.

Různé roztoky, kterých se používá při experimentálních manipulacích, jsou označovány jejich běžnými názvy, jako je SSC, SSPE, Denhardtův roztok atd. Složení těchto roztoků je možno nalézt v dodatku B příručky Sambrook a další (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Klonování kukuřičného genu HSZ

Na základě znalosti publikované sekvence DNA (SEQ ID NO:5) genu pro lOkD zein kukuřice [Kirihara a další (1988) Mol. Gen. Genet. 21: 477 až 484; Kirihara a další (1988) Gene, 71: 359 až 370] byly sestrojeny oligonukleotidy (SEQ ID NO:6 a 7) pro použití jako primerů při řetězové reakci iniciované polymerasou (PCR) za použití genomové kukuřičné DNA jako templátu. Produkt PCR reakce se izoluje z agarosového gelu a radioaktivně označí nick translací (posunem jednořetězcového zlomu) pro použití jako hybridizačni próby. Genomová knihovna DNA kukuřice ve vektoru lambda-EMBL-3 byla zakoupena od firmy Clontech a plaky byly podrobeny skríningu pomocí PCR-vytvořené próby. Očekávalo se, že se tak izoluje celá délka genu pro lOkD zein, včetně jeho 5' a 3' regulačních oblastí.

Vyčistí se dva hybridizační lambda plaky a klonovaný fragment DNA kukuřice se dále charakterizuje. Štěpení restrikční endonukleasou a elektroforéza na agarosovém gelu ukazuje, že tyto dva klony jsou identické. Fragmenty DNA z agarosového gelu se přenesou technikou Southern blot na membránové filtry z nitrocelulozy a zkoušejí se radioaktivně značenou DNA pro lOkD zein, vyrobenou Nick-translací. Jediný 7,5kb fragment BamH I a jediný l,4kb fragment Xba I se hybridizují k próbě. Tyto fragmenty se subklonují do fragmentu pTZ18R (Pharmacia) za účelem analýzy sekvence DNA.

S překvapením se ze sekvence zjistilo, že izolovaný gen je příbuzný, ale odlišný od genu pro lOkD zein. Tento gen byl označen jako gen HSZ (zeinu s vysokým obsahem síry). Fragment DNA obsahuje otevřený čtecí rámec 633 nukleotidů, ve srovnání s 453 nukleotidy genu pro lOkD zein. Protein HSZ vykazuje 76% identitu aminokyselinové sekvence s lOkD zeinem. Delší čtecí rámec genu HSZ však kóduje doménu bohatou na methionin, která není přítomna v genu pro lOkD zein, což se projevuje obsahem sirných aminokyselin 29 % (28 % methioninu) u maturovaného HSZ proteinu, ve srovnání s 26 % (22 % methioninu) u lOkD zeinu. Gen HSZ tedy kóduje zásobní protein semen s nejvyšším obsahem methioninu, jaký je dosud znám. Dobře známé signály exprese genu, jako je TATA box a polyadenylační signál, jsou umístěny v podobných polohách v genu HSZ i v genu pro lOkD zein. Předpokládaná signální sekvence obsahující 21 aminokyselin je kódována genem HSZ na aminokonci prekursorového polypeptidu, podobně jako je tomu u genu pro lOkD zein.

Fragmentu DNA podle vynálezu se může používat pro izolaci v podstatě homologních cDNA a genů kódujících zásobní proteiny v semenech kukuřice a jiných rostlinných druhů, zejména jednoděložných rostlin. Izolace příbuzných druhů, zejména jednoděložných rostlin. Izolace příbuzných genů je v tomto oboru dobře známa.

Použití markérů na bázi polymorfismu délky restrikčního fragmentu (RFLP) při pěstování rostlin je dobře známo a v tomto oboru dokumentováno [viz Tanksley a další (1989) Biotechnology 7: 257 až 264]. Fragment nukleové kyseliny podle vynálezu je možno zamapovat na RFLP mapě kukuřice. Může se ho tedy použít jako RFLP markéru pro charakteristické znaky vázané k mapovanému lokusu.

Modifikace genu HSZ

Fragment nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu kódující zásobní protein semen, který je bohatý na síru, může být připojen k vhodným regulačním sekvencím a použit pro nadprodukci (nadexpresi) proteinu v mikrobech, jako je Escherechia coli, kvasinkách nebo transgenních rostlinách, jako je kukuřice, sója a jiné plodiny. Takový rekombinantní DNA konstrukt může obsahovat bud nativní HSZ gen nebo chimérický gen. Odborníci v tomto oboru jsou schopni izolovat kódující sekvence fragmentu podle vynálezu za použití a/nebo za vytvoření restrikčních endonukleasových míst [viz Sambrook a další, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press].

Obzvláště užitečná jsou přirozené se vyskytující místa pro Nco I (5'-CCATGG) a Xba I (5'-TCTAGA), které umožňují přesné vyjmutí kódující sekvence počínaje iniciačním kodonem translaace ATG a konče translačním stop kodonem TAG. V HSZ kódující oblasti jsou však přítomny tří místa Nco I. Bylo žádoucí eliminovat dvě z těchto míst a zachovat pouze jedno místo (nukleotidy 751 až 756 v SEQ ID NO:1), který obsahuje start kodon pro translaci.

Přednostní fragment DNA podle vynálezu (SEQ ID NO:2) byl vytvořen in vitro místně orientovanou mutagenesí tak, že byla dvě místa Nco I v kódující sekvenci odstraněna beze změny aminokyselinové sekvence kódované genem. Úplným štěpením DNA pomocí Nco I a Xba I se získá jediný 637bp fragment obsahující celou kódující sekvenci prekursorového HSZ polypeptidu. Pro další usnadnění konstrukce chimérických genů byla ihned po translačním stop signálu HSZ přidána přídavná jediná restrikční endonukleasová místa. Na Xba I místo byly vloženy, oligonukleotidy (SEQ ID NO:10 a 11), pomocí nichž byla zavedena dvě nová restrikční místa, Srna I a Κρη I a místo Xba I bylo zničeno. Nového jediného místa Xba I z nukleotidů 1 až 6 v SEQ ID NO:1 a Ssp I místa z nukleotidů 1823 až 1828 v SEQ ID NO:1 bylo použito pro získání fragmentu obsahujícího HSZ kódující oblast plus její 5’ a 3'regulační oblasti. Tento fragment byl klonován do obchodně dostupného vektoru pTZ19R (Pharmacia) štěpeného Xba I a Sma I, za vzniku plasmidu pCCIO. Plasmid pCCIO byl uložen 7. prosince 1990 ve sbírce ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ve shodě s Budapešťskou dohodou, a obdržel přírůstkové číslo 68490.

Aby bylo možno exprimovat maturovanou formu proteinu HSZ, bylo žádoucí vytvořit pozměněnou formu genu HSZ s jediným místem pro restrikční endonukleasu na začátku maturovaného proteinu. K tomuto účelu byl vytvořen fragment DNA za použití PCR. Byly zkonstruovány oligonukleotidové primery (SEQ ID NO:12 a 13), aby PCR-vytvořený fragment (SEQ ID NO:3) obsahoval místo BspH I, což mělo za následek vznik stejného lepivého konce, jaký se získá štěpením Nco I. Toto místo bylo umístěno na spojce signální sekvence a kódující sekvence pro maturovaný HSZ. Fragment vytvořený PCR také obsahoval místo Xba I u translačního konce HSZ genu.

Pomocí PCR byl zkonstruován gen, tak aby kódoval doménu s vysokým obsahem methioninu (HMD) HSZ. Byly zkonstruovány oligonukleotidy (SEQ ID NO; 14 a 15) pro připojení Nde I místa, které obsahovaly translační iniciační kodon a EcoR I místo, právě za translačním terminačním kodonem (viz SEQ ID NO:4). Tato místa umožňují snadno inserci HMD do expresních vektorů.

Exprese HSZ v E. coli

HSZ kódující sekvence byla exprimována v E. coli za použití systému bakteriofágová T7 RNA polymerasa/T7 promotor (Studier a další (1990) Methods in Enzymology 185: 60 až 89]. Fragment Nco I-Xba I obsahující sekvenci kódující HSZ byl insertován do expresního vektoru. U tohoto plasmidu, označeného zkratkou pCCll byla očekávána exprese prekursorového proteinu HSZ. Také byl zkonstruován plasmid pro expresi proteinu HSZ bez jeho signální sekvence, který byl označen zkratkou pCC12. Fragment DNA kódující maturovaný HSZ pro tuto konstrukci byl získán PCR postupem popsaným výše a vložen do expresního vektoru.

Pro detekci exprese polypeptidů HSZ byly plasmidy pCCll a pCC12 transformovány do kmene E. coli HMS174 a byl proveden in vivo značený experiment za použití ³⁵S-methioninu způsobem popsaným v Studier a Moffatt (1986), J. Mol. Biol. 189: 113 až 130. Vzhledem k vysokému obsahu methioninu v tomto HSZ proteinu se jedná o specifický a citlivý prostředek pro detekci exprese. Buněčné extrakty byly zpracovávány na SDS polyakrylamidových gelech, které byly po vysušení autoradiografovány. U obou extraktů z pCCll a pCC12 byly pozorovány silné pásy značeného proteinu o molekulové hmonotnosti asi 20 ,kD. Tato velikost přibližně odpovídá velikosti očekávané u polypeptidů HSZ s maturovanou délkou a naznačuje, že prekursorový protein, vyrobený v pCCll transf ormantů byl v E. coli zpracován. Když byly pomocí barvení briliantovou modří Coomassie zviditelněny celkové proteiny po indukci a elektroforéze na SDS polyakrylamidovém gelu, byl v lysátech pCC 12 (ale nikoliv v lysátech pCC 11) zjištěn prominentní indukovaný 20kD protein, což ukazuje na vysokou úroveň exprese maturované formy proteinu.

Fragmentů nukleové kyseliny podle vynálezu je možno používat pro produkci velkých celkového proteinu obohaceného zejména methionin, fermentací mikroorganismů.

kyseliny podle množství HSZ, HMD nebo o sirné aminokyseliny, E. coli nebo jiných

Za tímto účelem se může fragment nukleové vynálezu operabilně připojit ke vhodné regulační sekvenci obsahující promotorovou sekvenci, vedoucí sekvenci translace a 3' nekódující sekvenci. Chimérický gen je potom zavést do mikroorganismu transformací a transformovaný mikroorganismus je možno pěstovat za podmínek, při nichž se dosáhne vysoké exprese chimérického obsahující protein obohacený o sirné je možno shromáždit a obohacený protein je genu. Buňky aminokyseliny možno extrahovat. Potom je možno HSZ protein přečistit.

Pro výrobu velkých množství HSZ proteinu v E. coli bylo použito kmene BL21(DE3)pLysE [Studier a další (1990) Methods in Enzymology 185: 60 až 89] transformovaného pCC 12. HSZ protein byl přečištěn z extraktů IPTG (isopropylthio-beta-galaktosidem)-indukovaných kultur. HSZ protein se nalézá v nerozpustné sraženině, kterou lze snadno oddělit nízkorychlostním odstřelováním buněčného extraktu. Většina buněčných proteinů se odstraní v supernatantu. Potom se HSZ selektivně solubilizuje v téměř (nad 90 %) čisté formě z centrifugační pelety pomocí extrakce 70% isopropylalkoholem obsahujícím beta-merkaptoethanol v koncentraci 10 mM. Z jednoho litru buněčné kultury bylo získáno přibližné 10 až 10 mg HSZ proteinu. Poněvadž bylo nyní zjištěno, že produkce HSZ proteinu v E. coli není vůči buňkám toxická, může se dosáhnout vyšší úrovně exprese za použití kmene BL21(DE3) [Studier a další (1990) Methods in Enzymology 185: 60 až 89].

Exprese HSZ v rostlinách

Přednostní třídou hostitelů pro expresi kódující sekvence HSZ nebo HMD jsou eukaryotičtí hostitelé, zejména buňky vyšších rostlin. Obzvláštní přednost se z vyšších rostlin a semen z nich získaných dává sóje, řepce (Brassica napus, Brassica campestris), slunečnici (Helianthus annus), bavlníku (Gossypium hirsutum), kukuřici, tabáku (Nicotiana tabacum), vojtěšce (Medicago sativa), pšenici (Triticum sp·), ječmeni (Hordeum vulgare), ovsu (Avena sativa, L.), čiroku (Sorghum bicolor), rýži (Oryza sativa) a krmným travám. Při expresi v rostlinách se používá regulačních sekvencí, které jsou v těchto rostlinách funkční.

Exprese cizích genů v rostlinách je dobře zavedena [De Blaere a další (1987) Methods Enzymol. 153: 277 až 291]. Původ promotoru zvoleného pro povzbuzování exprese kódující sekvence není kritický, pokud má promotor dostatečnou transkripční aktivitu, aby podle vynálezu zvýšil hladinu translatovatelné mRNA pro HSZ nebo HMD v požadované tkáni hostitele. Přednostními promotory pro expresi ve všech orgánech rostliny a zejména pro expresi v listech jsou promotory orientující 19S a 35S transkripty v mozaikovém viru květáku [Oděli a další (1985) Nátuře 313: 810 až 812; Hulí a další (1987) Virology 86: 482 až 493], malou pod jednotku ribulosa-1,5-bifósfátkarboxylasy [Morelli a další (1985) Nátuře 315: 200; Broglie a další (1984)

Science 224: 838; Hererra-Estrella a další (1984) Nátuře, 310: 115; Coruzzi a další (1984) EMBO J. 3: 1671; Faciotti a další (1985) Bio/Technology 3: 241], kukuřičný protein, zein [Matzke a další (1984) EMBO J. 3: 1525] a chlorofyl a/b vázající protein (Lampa a další (1986) Nátuře 316: 750 až 752].

V závislosti na aplikaci může být žádoucí volit promotory, které jsou specifické pro expresi v jednom nebo více orgánech rostliny. Jako příklady je možno uvést lehce indukovatelné promotory malé podjednotky ribulosa1,5-bifosfát karboxylasy, pokud je exprese požadována ve fotosyntetických orgánech, nebo promotory, které jsou specificky účinné v semenech.

Přednostními promotory jsou ty, které umožňují expresi proteinu specificky v semenech. To může být obzvláště užitečné, poněvadž semena jsou hlavním zdrojem rostlinného proteinu a také proto, poněvadž v semenech specifická exprese zabrání jakémukoliv potenciálnímu škodlivému účinku v nesemenných orgánech. Jako neomezující příklady promotorů, které jsou specifické vzhledem k semenům, je možno uvést promotory zásobních proteinů semen, které v mnoha rostlinách tvoří více než 50 % celkového proteinu semen. Zásobní proteiny semen jsou striktně regulovány a jsou exprimovány téměř výlučně v semenech způsobem, který je vysoce specifický vzhledem k orgánu a vzhledem k vývojovému stadiu [Higgins a další (1984) Ann. Rev. Plant Physiol. 35: 191 až 221; Goldberg a další (1989) Cell 56: 149 až 160; Thompson a další (1989) BioEssays 10: 108 až 113]. Kromě toho, různé zásobní proteiny semen je možno exprimovat v různých stádiích vývoje semene.

V současné době existují četné příklady genů pro, vzhledem k semenům specifickou expresi zásobních proteinů v semenech transgenních dvojděložných rostlin. Tyto příklady zahrnují geny z dvojděložných rostlin pro β-faseolin fazolu [Sengupta-Gopalan a další. (1985) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 3320-3324; Hoffman a další (1988) Plant Mol. Biol. 11:717-729], fazolový lektin [Voelker a další (1987) EMBO J. 6: 3571-3577], sojový lektin [Okamuro a další (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 8240 až 8244] sojový Kunitzův inhibitor trypsinu [Perez-Grau a další. (1989) Plant Cell 1:095-1109] sojový β-konglycinin [Beachy a další (1985) EMBO J. 4:3047-3053; Barker a další (1988) Proč. Nati. Acad. Sci USA 85: 458-462; Chen a další (1988) EMBO J. 7: 297 až 302; Chen a další (1989) Dev. Genet. 10: 112 až 122; Naito a další (1988) Plant Mol. Biol. 11:109 áž 123], hrachový vicilin [Higgins a další (1988) Plant Mol. Biol. 11: 683 až 695], hrachový konvicilin [Newbigin a další (1990) Planta 180: 461] hrachový legumin [Shirsat a další (1989) Mol. Gen. Genetics 215: 326]; řepkový napin [Radke a další (1988) Theor. Appl. Genet. 75: 685 až 694] jakož i geny z jednoděložných rostlin, jako pro 15kD zein z kukuřice [Hoffman a další (1987) EMBO J. 6: 3213-3221; Schernthaner a další (1988) EMBO J. 7: 1249 ažl253; Williamson a další (1988) Plant Physiol. 88: 1002 až 1007] ječmenový β-hordein [Marris a další (1988) Plant Mol. Biol. 10: 359 až 366] a pšeničný glutenin [Colot a další (1987) EMBO J. 6: 3559 až 3564], Kromě toho, promotory vůči semenům spcifických genů, které jsou operabilně připojeny k heterologním kódujícím sekvencím v konstruktech chimérického genu, si také zachovávají svůj časový a prostorový profil exprese v transgenních rostlinách. Takové příklady zahrnují promotor genu pro zásobní protein semen Arabidopsis thaliana 2S pro expresi enkefalinových peptidů v semenech Arabidopsis a B. napus [Vandekerckhove a další (1989) Bio/Technology 7: 929 až 932], promotory fazolového lektinu a fazolového β-faseolinu pro expresi luciferasy [Riggs a další (1989) Plant Sci. 63:

až 57] a promotory pšeničného gluteninu pro expresi chloramfenikol acetyltransferasy [Collot a další (1987) EMBO J. 6: 3559 až 3564].

Obzvláštní použití při expresi fragmentu nukleové kyseliny podle vynálezu budou nalézat heterologní promotory z několika důkladně charakterizovaných genů pro zásobní proteiny semen sóji, jako jsou geny pro Kunitzův inhibitor trypsinu [Jofuku a další (1989) Plant Cell 1: 1079 až 1093; Perez-Grau a další (1989) Plant Cell 1: 1095 až 1109], glycinin [Nielson a další (1989) Plant Cell 1; 313 až 328], β-konglycinin [Harada a další (1989) Plant Cell 1: 415 až 425]. Promotory genů pro a'- a β- podjednotky zásobního proteinu sóji, β-konglycininu, budou obzvláště užitečné při expresi HSZ mRNA v kotyledonech ve středním až pozdním stadiu vývoje sojového semene [Beachy a další (1985) EMBO J. 4: 3047 až 3053; Barker a další (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 458 až 462; Chen a další (1988) EMBO J. 7: 297 až 302; Chen a další (1989) Dev. Genet. 10: 112 až 122; Naito a další (1988) Plant Mol. Biol. 11: 109 až 123] v transgenních rostlinách, poněvadž a) dochází pouze k velmi malému polohovému účinku na expresi v transgenních semenech a b) tyto dva promotory vykazují různou regulaci v průběhu doby, tj. promotor pro gen a'-podjednotky je exprimován několik dnů před tím než promotor pro gen β-podjednotky.

Při expresi vynálezu budou mít promotory z několika fragmentů nukleové kyseliny podle také obzvláštní význam heterolgní důkladně charakterizovaných genů pro zásobní protein semen kukuřice, jako jsou geny pro lOkD zein [Kirihara a další (1988) Gene 71: 359-370], pro 27kD zein [Prát a další (1987) Gene 52:51 až 49; Gallardo a další (1988) Plant Sci. 54. 211-281] a 19kD zein [Marks a další (1985) J. Biol. Chem. 260: 16451 až 16459]. Byly publikovány relativní transkripční aktivity těchto promotorů v kukuřici [Kodrzyck a další (1989) Plant Cell. 1: 105 až 114], což poskytuje základ pro volbu promotoru vhodného pro použití v chimérickém genovém konstruktu pro kukuřici.

Správná úroveň exprese HSZ nebo HMD mRNA může vyžadovat použití různých chimérických genů, které využívají různých promotorů. Takové chimérické geny je možno přenést do hostitelských rostlin bud společné, v jediném expresním vektoru, nebo postupně, za použití více než jednoho vektoru. Předpokládá se, ..že zavedení enhancerů (zesilovačů transkripce) nebo prvků typu enhancerů, jak do nativního HSZ promotoru, tak do jiného promotorového konstruktu, rovněž zajistí, v souladu s vynálezem, zvýšení úrovně primární transkripce pro HSZ nebo HMD. Jako enhancerů je možno použít virových enhancerů, jako jsou enhancery, které se vyskytují v 35S promotoru [Oděli a další (1988) Plant Mol. Biol. 10: 263 až 272], enhancery z opinových genů [Fromm a další (1989) Plant Cell 1: 977 až 984] nebo enhancery z jakéhokoliv jiného zdroje, které posilují transkripci, když jsou umístěny v promotoru, který je operabilně připojen k fragmentu nukleové kyseliny podle vynálezu.

Obzvláštní důležitost má prvek sekvence DNA, který byl izolován z genu pro a'-podjednotku β-konglycinu a který je schopen poskytnout konstitutivnímu promotoru čtyřicetinásobné zesílení, specifické vzhledem k semenům [Chen a další (1988) EMBO J. 7: 297 až 302; Chen a další (1989) Dev. Genet. 10: 112 až 122]. Odborník v tomto oboru může tento prvek snadno izolovat a vložit do promotorové oblasti jakéhokoliv genu, za účelem získání vzhledem k semenům specifické exprese promotoru v transgenních rostlinách. Inserce takového elementu do jakéhokoliv genu, který je specifický vzhledem k semenům a který je exprimován v jinou dobu než gen pro β-konglycinyn, bude mít za následek expresi v transgenních rostlinách probíhající delší dobu v průběhu vývoje semene.

Pro dosažení požadovaného cíle je možno vynález realizovat i řadou jiných metod. Podle jedné formy provedení je vynález založen na modifikaci rostlin za účelem produkce zvýšené úrovně HSZ proteinu tím, že obsahuje podstatně větší počet kopií HSZ.

Pro realizaci vynálezu se může použít jakékoliv 3’ nekódující oblasti,, která je schopna poskytnout terminální signál pro transkripci, polyadenylační signál a jiné regulační sekvence, kterých může být zapotřebí při řádné expresi kódující oblasti pro HSZ. Tyto 3' nekódující oblasti zahrnují nativní 3'konec genu nebo genů HSZ, 3' konec heterologního genu pro zein, 3' konec genu pro jakýkoliv zásobní protein, jako je 3' konec genu pro sojový β-konglycinyn, 3' konec virového genu, jako je 3' konec transkriptů mozaikového viru květáku 35S nebo 19S, 3' konec genů ze syntézy opinů, 3'konce genů pro ribulosa-1,5-bifosfát karboxylasu nebo protein vázající chlorofyl a/b nebo 3' koncové sekvence z jakéhokoliv zdroje, které při použití zajišůují potřebnou regulační informaci ve své sekvenci nukleové kyseliny, pro řádnou expresi kombinace promotor/HSZ nebo promotor/HMD kódující oblast, k níž je operabilně připojen. V tomto oboru existuje řada příkladů, které ukazují užitečnost různých 3' nekódujících oblasti [například viz Ingelbrecht a další (1989) Plant Cell 1: 671 až 680].

Je-li to zapotřebí pro řádnou expresi proteinů podle vynálezu, mohou se k sekvenci kódující HSZ nebo HMD přidat sekvence DNA kódující intracelulární lokalizační sekvence. Nativní signální sekvence HSZ se tedy může odstranit nebo nahradit signální sekvencí, o níž je známo, že funguje v cílové rostlině.· Pokud by byla signální sekvence odstraněna, bylo by možno očekávat že protein HSZ

15kD zeinu, z jednodéložné sekretorní dráhu a rovněž se zůstane v cytoplasmě buňky. Alternativně by bylo možno jednoděložnou signální sekvenci HSZ nahradit signální sekvencí β-podjednotky faseolinu z fazolu Phaseolus vulgaris nebo signální sekvencí z a' podjednotky β-konglycinynu ze sóji [Doyle a další (1986) J. Biol. Chem. 261; 9228 až 9238], které fungují ve dvoudéložných rostlinách. Hoffman a další [(1987) EMBO J. 6: 3213 až 3221] ukázali, že signální sekvence prekursoru rostliny, nasměruje protein na správně projevuje.v semenech transgenního tabáku. Protein však nezůstane v endoplasmickém retikulu, jako je tomu v případě kukuřice. Aby protein zůstal v endoplasmickém retikulu, může mít zapotřebí přidání stop transit sekvencí. Je známo v tomto oboru, že přídavek sekvencí DNA kódujících aminokyselinovou sekvenci [Lys-Asp-Glu-Leu] (SEQ ID NO: 28) na karboxylovém konci proteinu má za následek zachování proteinů v lumeni endoplasmického retikula [Munro a další (1987) Cell 48; 899 až 907; Pelham (1988) EMBO J. 7: 913 až 918; Pelham a další (1988) EMBO J. 7: 1757 až 1762; Inohara a další (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3564 až 3568; Hesse a další (1989) EMBO J. 8:2453 až 2461]. V semenech některých rostlin jsou zásobní proteiny umístěny v buněčných vakuolách. Při provádění vynálezu může být nutné nasměrovat protein HSZ nebo HMD do vakuol těchto rostlin přidáním vakuolové směrovací sekvence. Krátká aminokyselinová doména, která slouží jako směrovací sekvence do vakuol, byla identifikována v fytohemaglutininu fazolu, který se akumuluje ve vakuolách pro zásobní proteiny kotyledonů [Tague a další (1990) Plant. Cell 2: 533 až 546]. V jiné zprávě byla popsána karboxy-terminální aminokyselinová sekvence, které je zapotřebí pro nasměrování ječmenového lektinu do vakuol v transgenním tabáku [Bednarek a další (1990) Plant Cell 2: 1145 až 1155].

Konstrukce chimérických genů pro expresi HSZ v rostlinách

Pro konstrukce chimérických genů pro expresi HSZ v rostlinách byly použity tři, vzhledem k semenům specifické, expresní kazety. Expresní kazety obsahují regulační oblasti ze tří vysoce exprimovaných genů pro zásobní protein v semenech:

1) β podjednotku faseolinu z fazolu Phaseolus vulgaris;

2) a' podjednotku β-konglycininu ze sóji;

3) lOkD zein z kukuřice.

Kazety jsou schematicky znázorněny na obr. 2. Každá z nich obsahuje jediné Nco I místo, které bezprostředně následuje za 5' regulační oblastí a kromě toho některé místo nebo všechna místa zvolená ze souboru zahrnujícího Xba I, Srna I a Κρη I, která bezprostředně předcházejí 3' regulační oblast.

Fragment Nco - Xba I, který obsahuje celou kódující oblast pro HSZ (SEQ ID NO:2) a fragment BspH I Xba I, který obsahuje gen bez signální sekvence, t.j. kódující sekvenci pro maturovaný protein (SEQ ID N0:3), se vloží do faseolinové a β-konglycininové expresní kazety (obr. 2), která byla štěpena Nco I a Xba I. Pro inserci do lOkD zeinové kazety se fragment Nco I-Sma I obsahující kódující oblast pro HSZ vloží do Nco I - Srna I štěpené lOkD zeinové kazety.

Odborníkům v tomto oboru jsou k dispozici různé metody transformace buněk vyšších rostlin podle vynálezu (viz publikace EP 0 295 959 A2 a 0 138 341 Al). Tyto metody zahrnují metody založené na transformačních vektorech na bázi Ti nebo Ri plasmidů Agrobacterium spp. Obzvláštní přednost se dává použití binárního typu těchto vektorů. Tiodvozené vektory byly použity k transformaci celé řady vyšších rostlin, včetně jednoděložných a dvouděložných rostlin, jako je sója, bavlník a řepka [Pacciotti a další (1985) Bio/Technology 3: 241; Byrne a další (1987) Plant Cell., Tissue and Organ Culture 8: 3; Sukhapinda a další (1987) Plant Mol. Biol. 8: 209 až 206; Lorz a další (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 178; Potrykus (1985) Mol. Gen. Genet. 199; 183].

Kazety pro chimérický gen faseolin-HSZ se vloží do vektoru pZS97K (obr. 3), který je součástí binárního Ti plasmidového vektorového systému (Bevan (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 811 až 8720] Agrobacterium tumefaciens. Tento vektor obsahuje 1) nopalinsynthasu/neomycinfosfotransferasu chimérického genu (číslo: NPT II), jako selekční markér pro transformované rostllinné buňky [Bevan a další (1983) Nátuře 304: 184 až 186], 2) levou a pravou hraniční oblast T-DNA Ti plasmidů [Bevan (1984) Nucl. Acid. Res. 12: 8711 až 8720], 3) E. coli lacZ α-komplementační segment [Vierija a Messing (1982) Gene 19:259 až 267] s jedinými místy pro restrikční endonukleasy EcoR I, Κρη I, BamH I a Sal I, 4) počátek bakteriální replikace z plasmidů z Pseudomonas pVSl [Itoh a další (1984) Plasmid 11: 206 až 220] a 5) bakteriální gen pro neuomycin fosfotransferasu z Tn5 [Berg a další (1975) Proč. Nati. Acad. Sci USA, 72: 3628 až 3632], jako selekční markér pro transformovaný Agrobacterium tumefaciens.

Binární vektory obsahující chimérické HSZ geny se přenášejí triparentálním spojováním (mating) [Ruvkin a další (1981) Nátuře 289: 85 až 88] do Agrobacterium kmene LBA4404/pAl4404 [Hockema a další (1983) Nátuře 303: 179 až 180]. Transformantů Agrobacterium se použije pro inokulaci terčíků z tabákových listů [Horsch a další (1985) Science

227: 1229 až 1231]. Rostliny se regenerují v selektivním mediu obsahující kanamycin.

Odborníkům v tomto oboru jsou k dispozici i jiné transformační metody, jako je přímé příjímání konstruktů cizí DNA [viz EP 0 295 959 A2], elektroporační techniky [viz Fromm a další (1986) Nátuře (Londýn) 319: 791] nebo balistické bombardování velmi rychlými kovovými částicemi povlečenými konstrukty nukleové kyseliny [viz Kline a další (1987) Nátuře (Londýn) 327:70 a U.S. patent 4 945 050]. Po tranformaci lze obvyklými metodami buňky regenerovat.

Obzvláště vhodné jsou nedávno popsané metody transformace cizích genů do obchodně důležitých plodin, jako je řepka [viz De Block a další (19989) Plant Physiol. 91: 694 až 701], slunečnice [Everett a další (1987) Bio/Technology 5: 1201], sóji [McCabe a další (1988) Bio/Technology 6: 923; Hinchee a další (1988) Bio/Technology 6: 915; Chee a další (1989) Plant Physiol. 91: 1212 až 1218; Christou a další (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 7500 až 7504; EP 0 301 749 A2] a kukuřice [Gordon-Kamm a další (1990) Plant Cell 2: 603 až 618; Fromm a další (1990) Biotechnology 8: 833 až 839.

Vynález je příkladech provedení, a procentech rozumějí blíže objasněn v následujících v nichž se pod všemi údaji v dílech údaje hmotnostní, pokud není uvedeno jinak. Tyto příklady ukazují přednostní provedení tohoto vynálezu, mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. Na základě výše uvedeného popisu a těchto příkladů může odborník seznat hlavní charakteristiky tohoto vynálezu a, aniž by se odchýlil od duchu a rozsahu vynálezu, může v něm učinit různé změny a modifikace, aby jej přizpůsobil různým aplikacím a podmínkám.

Příklady provedení vvnálezu

Příklad 1

Molekulární klonování HSZ genu

Od firmy Clontech (Palo Alto, Kalifornie, USA) byla zakoupena genomová knihovna kukuřice v bakteriofágu lambda. Přehled dat, která byla získána od dodavatele, ukazuje, že DNA z kukuřice pochází ze sedm dní starých semenáčků, pěstovaných ve tmě. Vektor je lambda-EMBL-3, nesoucí BamHI fragmenty o průměrné velikosti 15 kb. Dodavatel uvádí titr 1 až 9.10⁹ jednotek tvořících plaky (pfu/ml). Po dodání byla knihovna titrována a byl zjištěn obsah 2,5xio⁹ pfu/ml.

Protokol pro skríning knihovny DNA hybridizaci byl získán od dodavatele. Na každou misku o průměru 150 mm se přenese asi 30000 pfu (celkem 15 misek s agarovým mediem 15 Luria Broth (LB)), čímž se získá 450000 plaků. Jako hostitele se používá E. coli LE 392 pěstované v LB + 0,2 % maltózy a jako media v miskách se používá LB - 7,2 % agarosy. Plaky se absorbují na nitrocelulózové filtry (Millipore HATF, 0,45 mM - velikost pórů), denaturují v 1,5M chloridu sodném, 0,5M Tris-Cl, pH 7,5 a opláchnou 3XSSC [Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Filtry se blotují na papír Whatman 3MM a zahřívají ve vakuové sušárně na 80 °C po dobu 2 hodin, aby se fágová DNA pevně zakotvila v membránách.

Zhotoví se hybridizačni próba pro skríning knihovny na gen lOkD zeinu s vysokým obsahem methioninu [Kirihara a další (1988) Mol. Gen. Genet. 211: 477 až 484], spolu s jeho 5' a 3' lemujícími oblastmi. Dva oligonukleotidy o délce 30 bází, které lemují tento gen se syntetizují za použití syntezátoru DNA Applied Biosystems. Oligomer SM56 (SEQ ID NO:6) kóduje pozitivní řetězec zarnující prvních deset aminokyselin.

SM56 5 ' -ATG GCA GCC AAG ATG CTT GCA TTG TTC GCT-3' (SEQ ID NO: 6)

Met Ala Ala Lys Met Leu Ala Leu Phe Ala (aminokyseliny

-21 až -12 SEQ ID NO:5)

Oligomer CFC77 (SEQ ID NO:7) kóduje negativní řetězec zahrnující posledních deset aminokyselin:

CFC77 3' -AAT GTC GTT GGG AAA CAA CCA CGA CGT AAG-5' (SEQ ID.NO:7)

Leu Gin Gin Pro Phe Val Gly Ala Ala Phe (aminokyseliny 120 až 129 SEQ ID NO:5)

Těchto oligonukleotidů se použije pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR), za účelem vytvoření lOkD kódující oblasti za použití genomové DNA z kukuřice (kmen B85), jako templátu. PCR se provádí za použití soupravy Perkin-Elmer Cetus kit v souladu s instrukcemi prodejce za použití termocyklovače, což je výrobek stejné společnosti. Když se reakční produkt analýzuje na 1% agarosovém gelu a barví ethidiumbromidem, je patrný silný pás DNA o velikosti, která je očekávána pro lOkD gen zeinu, 450 bp, se slabým pásem při asi 650 bp. Pás 450 bp se elektroeluuje na celulozovou membránu DEAE (Schleicher & Schuell) a potom eluuje z membrány při 65 °C pomocí IM NaCl, 0,lmM EDTA, 20mM Tris-Cl o pH 8,0. DNA se srazí ethanolem a promyje 70% ethanolem a vysuší. Vysušená peleta se resuspenduje v 10 μΐ vody a alikvotního vzorku (obvykle o objemu 1 μΐ) se použije pro další sérii PCR reakcí, za účelem vytvoření asymetrických příměrových jednořetězcových lineárních DNA. K tomuto účelu jsou primery SM56. a CFC77 přítomny v molárním poměru 1:20 a 20:1. Produkty, jak pozitivní, tak negativní řetězec genu pro lOkD zein, se extrahují fenolem, srazí ethanolem a nechají projít sloupcem NACS (Bethesda Research Laboratories), aby se odstranil nadbytek oligomerů. Eluáty se 2x přesrážejí ethanolem, promyjí 70% ethanolem a vysuší. Sekvenování DNA se provádí za použití vhodných komplementárních primerů a sekvenační soupravy od firmy United States Biochemicals Company podle instrukce prodejce. Sekvence produktu PCR je identická s publikovanou sekvencí genu pro lOkD zein. Radioaktivní próba se vyrobí posunem jednořetězcového zlomu genu pro lOkD zein, zhotoveného PCR, za použití ³²P-dCTP a soupravy pro posun jednořetězcového zlomu, kterou prodává firma Bethesda Research Laboratories.

150mm nitrocelulózových filtrů nesoucích lambda fágové plaky se podrobí skríningu za použiti radioaktivních prób genu 10 kD. Po 4 hodinách předběžné hybridizace při 60 °C v 50XSSPE, 5X Denhardt [viz Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 0,1% SDS, 100 g/ml DNA z telecího thymu se filtry přenesou do čerstvé hybridizační směsi obsahující denaturovaný radioaktivně značený gen pro lOkD zein (cpm/ml) a nechají se v něm uloženy přes noc při 60 °C. Následujícího dne se promývají za podmínek vysoké stringence; Jednu hodinu při teplotě místnosti v 2XSSC-0,05% SDS a 1 hodinu při 68°C v lXSSC-0,1% SDS. Následuje blotování na papír Whatman 3MM, sušení na vzduchu a autoradiografie při -70 °C na filmy Kodak XAR-5 za použití intenzifikačních mřížek Du Pont Cronex^^R^ Lightning Plus. V těchto autoradiogramech se identifikuje 20 hybridizačních plaků. Tyto plaky se odeberou z původní petri misky a nanesou na misku ve zředěném stavu, aby se získalo asi 100 plaků na 80mm misku. Plaky se absorbují na nitrocelulózové filtry a provede se nový skríning s próbami stejným způsobem. Po autoradiografii pouze jeden z původních plaků, číslo 10, vykazuje dva hybridizační plaky. Tyto plaky se zkoušejí s próbou potřetí. Všechny plaky potomstva hybridizují, což ukazuje, že byly izolovány čisté klony.

DNA se vyrobí z těchto dvou fágových klonů lambda 10-1 a lambda 10-2, za použití protokolu pro izolaci DNA z kapalných lyzátů lambda fágů v malém měřítku (Ansul a další (1987) Current Protocols in Molecular Biology, protokoly

1.12.2 a 1.13.5-6). Štěpením restrikční endonukleasou a elektroforézou na agarosovém gelu se zjistí, že dva klony jsou totožné. Fragmenty DNA z agarosového genu se blotují technikou Southern Blot [viz Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press] na nitrocelulózové membránové filtry a zkoušejí se radioaktivně značenou lOkD zeinovou DNA získanou posunem jednořetězcového zlomu. K próbě hybridizuje jediný 7,5kb fragment BamH I a jediný l,45kb fragment Xba I.

7,5 kb fragment BamH I se izoluje z produktu štěpení BamH I lambda DNA vzorku na 0,5% agarosovém gelu o nízké teplotě tání (LMP). Pás 7,5 kb se vyřízne, roztaví, zředí 0,5M chloridem sodným a nanese na sloupec NACS, který se potom promývá 0,5M chloridem sodným, lOmM Tris-Cl o pH

7.2 a lmM EDTA. Fragment se eluuje 2M chloridem sodným, lOmM Tris-Cl o pH 7,2 a lmM EDTA. Tento fragment se liguje k fagemidu pTZ18R (Pharmacia), který byl štěpen BamH I a zpracován telecí intestinální alkalickou fosfatasou. [viz Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press], aby se zabránilo ligaci fagemidu k sobě samému. Subklony s těmito fragmenty s oběma orientacemi vzhledem k pTZ18R DNA se získají po transformaci E. coli.

Produkt štěpení Xba I klonované lambda fágové DNA se zpracovává na 0,8% agarosovém gelu a izoluje se l,4kb fragment za použití celulózové membrány DEAE (stejný postup jako v případě DNA fragmentu pro lOkD zein, získaného PCR, popsaný výše). Tento fragment se liguje k pTZ18R rozštěpenému Xba I stejným způsobem, jaký je popsán výše. Subklony s těmito fragmenty s oběma orientacemi vzhledem k pTZ18R DNA, kteréjsou označeny pX8 a pXlO, se získají po transformaci E. coli. Z těchto subklonů se získají jednořetězcové DNA za použití protokolu dodávaného firmou Pharmacia. Celé l,4kB Xba I fragmenty se podrobí sekvenaci. Dalších 700 bází přiléhajících k Xba I fragmentu se sekvenuje z BamH I fragmentu v klonu pB3 (fragment pB3 je ve stejné orientaci jako pX8), čímž se získá celkem 2123 bází sekvence (SEQ ID N0:l).

Příklad 2

Modifikace HSZ genu místně orientovanou mutagenesí

V l,4kD Xba I fragmentu nesoucím HSZ gen jsou přítomna tři Nco I místa, všechna v HSZ kódující oblasti. Žádoucí je, zachovat zde pouze jedno z těchto míst (nukleotidy 751 až 756 v SEQ ID N0:l), které zahrnuje start kodon translace. Z toho důvodu se místa Nco I v polohách 870 až 875 a 1333 až 1338 eliminují místně specifickou mutagenesí orientovanou na oligonukleotid [viz Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Oligonukleotidy syntetizované pro mutagensi jsou:

CFC99 ATGAACCCTT GGATGCA (SEQ ID NO: 8)

CFC98 CCCACAGCAA TGGCGAT (SEQ ID NO: 9)

Mutagense se provádí za' použití soupravy zakoupené od firmy Bio-Rad (Richmond, CA) podle protokolu, který

- 37 přikládá prodejce.

Při tomto postupu dojde ke změně A na T v poloze 872 a C na A v poloze 1334. Obě jsou na třetí pozici příslušného kodonu a nemá to za následek žádnou změnu aminokyselinové sekvence kódované genem, přičemž po změně CCA na CCT je stále kódován Pro a po změně GCC na GCA je stále kódován Ala. Plasmidový klon obsahující modifikovaný HSZ gen s jediným NCO-I místem u ATG start kodonu se označí pX8m. Jelikož nativní HSZ gen má jediné místo Xba I u stop kodonu genu (1384 až 1389, SEQ ID NO:1) poskytuje produkt úplného štěpení DNA pomocí Nco I a Xba I 637bp fragment obsahující celou kódující sekvenci prekursoru HSZ polypeptidů (SEQ ID NO:2).

Je žádoucí vytvořit formu HSZ genu s alternativními jedinými místy pro restrikční endonukleasy právě za koncem kódující oblasti. K tomuto účelu se oligonukleotidy CFC104 (SEQ ID NO:10) a CFC105 (SEQ ID NO:11):

CFC104 5'-CTAGCCCGGGTAC -3’ (SEQ ID NO:10)

CFC105 3'- GGGCCCATGGATC-5' (SEQ ID NO:11) anelují a ligují do místa Xba I, přičemž dojde k zavedení dvou nových restrikčních míst Sma I a Κρη I a ke zničení místa Xba I. Nyní jediného místa Xba I z nukleotidů 1 až 6 v SEQ ID NO:l a jediného místa Ssp I z nukleotidů 1823 až 1828 v SEQ ID NO:1 se použije pro získání fragmentu, který zahrnuje HSZ kódující oblast plus její 5' a 3' regulační oblasti. Tento fragment se klonuje do obchodně dostupného vektoru pTZÍR (Pharmacia) štěpeného Xba I a Sma I, za vzniku plasmidu pCCIO.

Je žádoucí vytvořit pozměněnou formu HSZ genu s jediným místem pro restrikční endonukleasu na začátku maturovaného proteinu, t.j. s odstraněnou aminoterminální signální sekvencí. Za tím účelem se pomocí PCR zhotoví fragment DNA způsobem popsaným v příkladu 1. Templátovou DNA pro PCR je plasmid pX8m. Jako oligonukleotidových primerů pro reakci se použije

CFC106 ' s'-GCACTTCATGACCCATATCCCAGGGCACTT-3* (SEQ ID NO:12)

CFC88 5'-TTCTAICIAGAATGCAGCACCAACAAAGGG-3' (SEQ ID NO:13)

Oligonukleotid CFC106 (SEQ ID NO:12) poskytuje fragment zhotovený PCR s místem pro BspH I (je podtrženo), který po štěpení BspH I poskytuje lepivý konec, který je totožný s koncem vytvořeným štěpením Nco I. Toto místo je lokalizováno na spojce signální sekvence s kódující sekvencí pro maturovaný HSZ. Oligonukleotid CFC88 (SEQ ID NO: 13) poskytuje fragment zhotovený PCR s místem pro Xba I (je podtrženo) na konci translace genu pro HSZ. Fragment BspH I - Xba I (SEQ ID NO:3), získaný štěpením fragmentu získaného PCR, kóduje maturovanou formu HSZ s přídavkem methioninového zbytku u aminokonce proteinu, aby se tak umožnila iniciace translace.

Příklad 3

Exprese HSZ genu v E. coli

Pro expresi HSZ kódující sekvence v E.coli se použije bakteriálního expresního vektoru pBT430. Tento vektor je derivátem pET-3a [Rosenberg a další (1987) Gene 56: 125 až 135], který používá systému bakteriofágová T7 RNA polymerasa/T7 promotor. Plasmid pBT430 se zkonstruuje tak, že se nejprve zničí místa EcoR I a Hind III v pET-3a v jejich původních polohách. Potom se v místě BamH I pET3a vloží oligonukleotidový adaptor obsahující místa EcoR I a Hind III. Tím se získá pET-3aM s přídavnými jedinými klonovacími místy pro inserci genů do expresního vektoru. Potom se Nde I místo v poloze iniciace translace převede na Nco I místo za použití mutagenese orientované na oligonukleotid. Sekvence DNA v této oblasti pET-3aM, 5¹-CATATGG (místo Nde I je podtrženo) se převede na 5'-cccatgg (místo Nco I je podtrženo) v pBT 430.

Fragment Nco I-Xba I pX8m (SEQ ID NO:2), viz příklad 2, se izoluje z agarosového gelu po elektroforéze za použití DEAE celulosové membrány, jak je to popsáno v příkladu 1. Tento fragment se liguje ke dvěma anelovaným (teplotně hybridizovaným) oligonukleotidům CFC104 (SEQ ID NO:10) a CFC105 (SEQ ID NO:ll).

CFC104 5'-CTAGCCCGGGTAC -3’ (SEQ ID NO:10)

CFC105 3’- GGGCCCATGGATC-5’ (SEQ ID NO:11) čímž se zavedou dvě nová restrikční místa Sma I a Κρη I na Xba I konci fragmentu. Ligace se terminuje lOminutovým zahřátím na 65 °C. Ligačni produkty se štěpi Sma I, čímž se získá fragment s tupým 3' koncem. Expresní vektor pBT430 se štěpí EcoR I a lepivé konce se zaplní přídavkem dATP, dTTP a Klenowovým fragmentem z E. coli DNA polymerasy. Vektor DNA s tupým koncem se potom štěpí Nco I a reakční směs se dvakrát extrahuje fenolem a vysráží ethanolem. 640bp fragment Nco I -Sma I obsahující kódující oblast pro HSZ se liguje k Nco I - tupému vektoru pBT430. Klon, který obsahuje plasmid označený pCCll, se identifikuje skríningem transformantů E. coli na požadovaný rekombinantní produkt. Od tohoto plasmidu se očekává, že bude exprimovat prekursor proteinu HSZ.

Také se zkonstruuje plasmid určený pro expresi proteinu HSZ bez jeho signální sekvence v E. coli. Fragment DNA kódující maturovaný HSZ pro tuto konstrukci se sestrojí za použití PCR, plasmidového pX8m, jako templátu a oligonukleotidů CFC106 (SEQ ID NO:12) a CFC88 (SEQ ID NO:13), jako primerů, způsobem popsaným v příkladu 2.

CFC106 5'-CCACTICAISáCCCATATCCCAGGGCACTT-3' (SEQ ID NO: 12)

MetThxHis I leř xoGlyHis Leu (aminokyseliny až 8

SEQ ID NO:3)

CFC88

3'-GGGAAACAACCACGACGTAAfiAICIATCTT-5' (SEQ ID NO:13)

PxořheValGlyAlaAlařheEnd (aminokyseliny

185 až 191 ‘

SEQ ID NO:3)

Oligonukleotid CFC106 (SEQ ID NO:12) poskytuje fragment PCR s místem BspH I (nahoře je podtrženo), který vytváří lepivé konce, které jsou totožné, jako v případě použití Nco I. Sekvence ATG v tomto místě představuje iniciační kodon translace a sekvence ACC, která za ní následuje, kóduje threoninový zbytek na amino-konci maturovaného proteinu. Místo Xba I v oligonukleotidu CFC88 (SEQ ID NO:13) (ve výše uvedeném vzorci je podtrženo) poskytuje vhodné klonovací místo na konci kódující sekvence. Reakční produkt PCR se dvakrát vysráží v 2M octanu amonném a 70% ethanolu, aby se odstranil nadbytek oligonukleotidových primerů. Konce fragmentů DNA se otupí reakcí s Klenowovým fragmentem E. coli DNA polymerasy za přítomnosti všech čtyř deoxyribonukleotidtrifosfátů. Reakční produkty se oddělí elektroforézou na agarosovém gelu a obarví se ethidiumbromidem. Převažující 570 bp pás se eluuje za použití DEAE celulózové membrány postupem popsaným výše. DNA se potom štěpí BspH I, dvakrát přesráží ethanolem a liguje ke stejnému Nco I-tupému fragmentu expresního vektoru pBT430, popsanému výše. Klon obsahující plasmid označený pCC12 se identifikuje skríningem transformantů E. coli na požadovaný rekombinační produkt. Klonovaný fragment vytvořený PCR se sekvenuje; jeho sekvence je totožná se SEQ ID NO:3.

Pro detekci exprese HSZ polypeptidů se plasmidy pCCll a pCC12 transformují do E. coli kmene HMS174 a provede se in vivo značený experiment způsobem, kerý popsali Studier a Moffat (1986) J. Mol Biol 189: 113 až 130. Proteiny se značí jednu hodinu před indukcí (prostřednictvím infekce lambda fágem CE6 nesoucím gen pro T7RNA polymerasu) za použití ³⁵S-methioninu, o němž se předpokládá, že bude intenzivně značit tyto polypeptidy bohaté na methionin. Buněčné extrakty se analyzují na SDS polyakrylamidovém gelu a po usušení se provede autoradiografie. V obou extraktech PCCll a PCC12 je zřejmý výrazný pás o molekulové hmotnosti přibližně 20 kD. To je přibližná velikost, která je očekávána u polypeptidů HSZ s maturovanou délkou a naznačuje to, že prekursorový protein vytvořený v pCCll transformantu byl E. coli zpracován. Když byl celkový buněčný protein zviditelněn barvením briliantovou modři Coomassie, po indukci a elektroforéze SDS na polyakrylamidovém gelu, byl výrazný indukovaný 20kD protein zřejmý v lysátech pCC12, ale nikoliv v lysátech pCCll.

Příklad 4

Purifikace HSZ proteinu vyrobeného v E. coli

Jednolitrová kultura E. coli kmene BL21(DE3)pLysE [Studier a další (1990) Methods in Enzymology 185: 6 až 89], transformovaná pCC12, se pěstuje v LB mediu obsahujícím ampicilin (100 mg/1) a chloramfenikol (10 mg/1) při teplotě 37 °C. Po dosažení optické hustoty při 600 nm 1,08 se přidá

1,2 ml O , IM IPTG (isopropylthio-p-galaktosidu, jako inducer) a v inkubaci se pokračuje 3 hodiny při 37 °C. Potom se buňky shromáždí centrifugací, promyjí se 50mM chloridu sodného; 50 mM Tris-Cl o pH 7,5; lmM EDTA, resuspendují se v 10 ml stejného pufru a zmrazí při -20 °c.

Suspenze se nechá roztát, přidá se povrchově aktivní látka Triton X-100 až do koncentrace 0,1 % a potom 3000 jednotek deoxyribonukleasy I (Boehringer-Mannheim). Po 60 minutách inkubace při teplotě místnosti se suspenze zpracuje ultrazvukem na ledu, aby se snížila její viskozita. Směs se centrifuguje a supernatant se vylije. Peleta se dvakrát extrahuje 5 ml 70% isopropylalkoholu; lOmM β-merkaptoethanolu. V tomto rozpouštědle je HSZ, narozdíl od většiny proteinů, rozpustný. Elektroforézou na polyakrylamidovém gelu (SDS) a vybarvením briliantovou modří Coomassie se zjistí, že HSZ protein je hlavním proteinem při první extrakci (nad 90 %) a jediným pozorovatelným proteinem při druhé extrakci. Z jednoho litru buněčné kultury se získá 10 až 100 mg proteinu HSZ. Purifikovaný protein HSZ byl zaslán do ústavu Hazelton Research Facility, 310 Swampridge Road, Denver, PA 17517, USA, za účelem získání králičích protilátek vypěstovaných proti tomuto proteinu.

Příklad 5

Konstrukce genu kódujícího domény s vysokým obsahem methioninu v HSZ

Protein HSZ se skládá z centrální oblasti, která je velmi bohatá na methionin (přibližně 48 % methioninových zbytků) a která je lemována aminoterminální sekvencí a karboxyterminální sekvencí, v -nichž je obsah methioninu nízký (10 % methioninu a 7 % methioninu). Centrální oblast se skládá z opakujícího se motivu Met-Met-Met-Pro (SEQ ID NO:27). Příbuzný protein, lOkD zein, má podobnou strukturu (viz obr. 3). Centrální oblast proteinu HSZ je však přibližně 2x tak velká než odpovídající oblast lOkD zeinu, což se projevuje zvýšeným obsahem methioninu v HSZ. Zřejmá duplikace centrální domény s vysokým obsahem methioninu v HSZ oproti lOkD zeinu naznačuje, že by centrální doména s vysokým obsahem methioninu mohla mít stabilní strukturu a mohla by se sama exprimovat za vzniku zásobního proteinu s vsokým obsahem methioninu.

Zkonstruuje se gen obsahem methioninu (HMD) HSZ. v příkladě 1, za použití pro kódování domény s vysokým K tomu se použije PCR, popsané pX8 jako templátové DNA a oligonukleotidů JR5 (SEQ ID N0:14) a JR6 (SEQ ID NO:15),jako primerů pro syntézu DNA.

JR5 5 ' -TCACCGCTTCAGCAGTGCCATATGCCAATG-3 ’ (SEQ ID NO:14)

JR6 s ' -TCTTAGAATTCTATGGCATCATCATTGGTGACACCATGCT-3 ' (SEQ ID NO: 15)

Primer JR5 (SEQ ID NO:14) způsobuje zavedení místa Nde I (nahoře je podtrženo) do produktu PCR. Primer JR6 (SEQ ID NO:15) způsobuje zavedení místa EcoR I (nahoře je podtrženo) do produktu PCR. Tato místa umožňují ligaci HMD k pET-3aM expresnímu vektoru [Rosenberg a další (1987) Gene 56: 125 až 135 a příklad 3], Nukleotidy ATG v místě Nde I představují kodon iniciace translace v expresním vektoru a místo EcoR I bezprostřdně následuje za terminačním kodonera translace.

Produkt PCR se štěpí Nde I a EcoR I a ligu je k pET-3aM, který byl štěpen Nde I a EcoR I. Po transformaci

E.coli se identifikují klony obsahující požadovaný rekombinantní plasmid a ověří se sekvenací DNA vloženého fragmentu DNA. Nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence genu pro HMD je znázorněna v SEQ ID NO: 4.

Příklad 6

Konstrukce chimérických genů pro expresi HSZ v rostlinách

Pro konstrukce chimérických genů pro expresi HSZ v rostlinách byly použity tři, vzhledem k semenům specifické, expresní kazety. Expresní kazety obsahují regulační oblasti ze tří vysoce exprimovaných genů pro zásobní protein v semenech:

1) β podjednotku faseolinu z fazolu Phaseolus vulgaris;

2) a' podjednotku β-konglycininu ze sóji;

3) lOkD zein z kukuřice.

Kazety jsou schematicky znázorněny na obr. 2.

Faseolinová kazeta obsahje asi 500 nukleotidů před (5') iniciačním kodonem translace a asi 1650 nukleotidů za (3') stop kodonem translace faseolinu. Mezi oblastmi 5' a 3' existuje jediné místo pro restrikční endonukleasu Nco I (které zahrnuje iniciační kodon translace ATG) a jediná místa pro restrikční endonukleasy Srna I, Κρη I a Xba I. Celá kazeta je lemována místy Hind III. Sekvence DNA těchto regulačních oblastí byla popsána v literatuře [Doyle a další (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228 až 9238], Nedávná práce [Bustos a další (1991) EMBO J. 10: 1469 až 1479] ukazuje, že oblast promotoru této kazety· nezahrnuje všechny prvky sekvence DNA, kterých je zapotřebí pro dosažení úplné úrovně exprese faseolinového promotoru, ale lze očekávat jen dosažení 20 až 30 % úplné úrovně exprese.

β-konglycininová kazeta zahrnuje asi 610 nukleotidů před (5') iniciačním kodonem translace β-konglycininu a asi 1650 nukleotidů za (3') stop kodonem translace faseolinu. Mezi oblstmi 5' a 3' existuje jediné místo pro restrikční endonukleasu Nco I (které zahrnuje iniciační kodon translace ATG) a jediná místa pro restrikční endonukleasy Srna I, Κρη I a Xba I. Celá kazeta je lemována místy Hind III. Sekvence DNA těchto regulačních oblastí byla popsána v literatuře [Doyle a další (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228 až 9238].

lOkD zeinová kazeta zahrnuje asi 925 nukleotidů před (5') iniciačním kodonem translace a asi 945 nukleotidů za (3') stop kodonem translace faseolinu. Mezi oblastmi 5' a 3' existuje jediné místo pro restrikční endonukleasu Nco I (které zahrnuje iniciační kodon translace ATG) a jediné místo pro restrikční endonukleasu Srna I. Celá kazeta je lemována místem EcoR I na konci 5' a místy BamH I, Sal I a Hind III na 3'konci. Sekvence DNA těchto regulačních oblastí byla popsána v literatuře [Kirihara a další (1988) Gene 71: 359 až 370].

Fragment Nco Ι-Xba I obsahující celou kódující oblast pro HSZ (viz příklad 2) se izoluje z agarosového gelu po elektroforéze za použití DEAE celulozové membrány způsobem popsaným v příkladu 1. Fragment BspH I-XBA I obsahující gen bez signální sekvence, t.j. kódující sekvenci pro maturovaný protein, se izoluje způsobem popsaným v příkladu 3. Tyto fragmenty DNA se vloží do faseolinové a β-konglycininové expresní kazety, které byly štěpeny Nco Ι-Xba I. Tím byly vytvořeny 4 chimérické geny:

1) faseolinová 5' oblast/nativní HSZ/faseolinová 3'oblast

2) faseolinová 5' oblast/maturovaný HSZ/faseolinová 3‘oblast

3) β-konglycininová 5' oblast/nativní HSZ/f aseolinová 3'oblast

4) β-konglycininová 5' oblast/maturovaný HSZ/faseolinová 3'oblast.

Zkonstruují se další chimérické geny pro nahrazení nativní jednoděložné signální sekvence HSZ dvojděložnou signální sekvencí z faseolinu. K tomuto účelu se syntetizuje oligonukleotid CFC112 (SEQ ID NO: 16) a CFC113 (SEQ ID NO:17). Tepelně hybridizované oligonukleotidy vytvoří Nco I kompatibilní konec a Nhe I/Spe I-kompatibilní konec /viz dá Ί ο Ί

CFC112 5' -CATGATGAGAGCAAGGGTTCCACTCCTGTTGCTGGGAATTCTT CFCX13 3' TACTCTCGTTCCCAAGGTGAGGACAACGACCCTTAAGAA

MetMetArgAlaArgValProLeuLeuLeuLeuGlylleLeu

CFC112

CFC113

TTCCTGGCATCACTTTCTGCTAGCTTTG 3 * AAGGACCGTAGTGAAAGACGATCGAAACGATC-5’ PheLeuAiaSerLeuSerAlaSerPhe (SEQ ID NO:16) (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:16)

Plasmid pCC13 obsahující gen pro HSZ lemovaný 5' a 3' regulační oblastí faseolinu se štěpí Nco I a Spe I, čímž se odstraní většina nativní signální sekvence HSZ. K rozštěpenému pCC13 se ligují tepelně hybridizované oligonukleotidy CFC112 (SEQ ID NO: 16) a CFC113 (SEQ ID NO:17). Takto vytvořený plasmid se označí jako pCC18 a sekvence chimérického genu obsahující maturovaný protein HSZ fúzovaný s faseolinovou signální sekvencí se potvrdí sekvenováním DNA (SEQ ID NO: 18).

Jelikož Spe I místo (nukleotidy 57 až 62 v SEQ ID NO:2) není přesně na spojovacím článku signální sekvence &.Ί

HSZ/maturovaný protein, vloží se mezi konec faseolinové signální sekvence a maturovaný HSZ protein tímto způsobem dvě další aminokyseliny. Pro jejich odstranění se vytvoří pomocí PCR HSz fragment za použití oligonukleotidů CFC114 (SEQ ID NO:19), viz dále a CFC88 (SEQ ID NO:13), viz příklad 2, které slouží jako primery, přičemž pCC18 slouží jako DNA templát.

CFC114

TTCTGCTAGC TTTGCTACCC ATATCCCAGG G (SEQ ID NO:19)

Produkt PCR se štěpí Nhe I a Xba I a přečistí elektroforézou na gelu. Plasmid pCC18 se štěpí stejnými enzymy, aby se odstranil fragment DNA kódující fúzovaný protein obsahující dvě aminokyseliny navíc a potom se vloží fragment DNA vytvořený PCR. Struktura výsledného plasmidu, který nese označení pCC24, se potvrdí sekvenováním DNA (SEQ ID NO:20).

signální sekvence HSZ v chimérickém genu oblast se syntetizuje

Pro nahrazení nativní faseolinovou signální sekvencí obsahujícím β-konglycininovou 5' pomocí PCR fragment za použití CFC123 (SEQ ID NO:21), viz dále a CFC88 (SEQ ID NO:13), viz příklad 2, jako primerů a pCC24, jako templátu.

CFC123

ACTAATCATG ATGAGAGCAA GGGTTCCACT (SEQ ID NO:21)

Fragment DNA vytvořený PCR se štěpí BspH I a Xba I a přečistí elektroforézou na gelu. Tento fragment DNA se vloží do β-konglycininové expresní kazety, který byla štěpena Nco Ι-Xba I. Struktura vloženého fragmentu se potvrdí sekvenováním DNA (SEQ ID NO:20). Tento plasmid nese označení pCC30.

Oligonukleotidy CFC104 (SEQ ID NO;10) a CFC1O5 (SEQ ID NO:11), viz příklad 13, se vloží do kazety lOkD zeinu v místě Xba I u karboxy-konce, čímž se zavede jediné místo Srna I. fragment Nco I-Sma I obsahující kódující oblast pro HSZ se izoluje z plasmidu pCCIO (viz příklad 2) a vloží do kazety s lOkD zeinem, která je štěpena Nco I-Sma I.

Příklad 7

Transformace tabáku chimérickými geny faseolin-HSZ

Kazety chimérického genu faseolin-HSZ, faseolinová 5' oblast/nativní HSZ/faseolinová 3' oblast a faseolinová 5' oblast/maturovaný HSZ/f aseolinová 3' oblast (příklad 6) se izolují ve formě přibližné 2,3 kb Hind III fargmentů. K těmto fragmentům se přidají Hind III-BamH I adaptorové nukleotidy, za účelem inserce do jediného BamH I místa vektoru pZS98K (obr. 3), který je částí binárního Ti plasmidového vektorového systému [Bevan (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 8711 až 8720] Agrobacterium tumefaciens. Tento vektor obsahuje 1) nopalin synthasu/neomycin fosfotransferasu chimérického genu (číslo: NPT II), jako selekční markér pro transformované rostlinné buňky [Bevan a další (1983) Nátuře 304: 184 až 186], 2) levou a pravou hraniční oblast T-DNA Ti plasmidu [Bevan (1984) Nucl. Acid. Res. 12: 8711 až 8720], 3) E. coli lacZ α-komplementační segment [Vierija a Messing (1982) Gene 19:259 až 267] s jedinými místy pro restrikční endonukleasy EcoR I, Κρη I, BamH I a Sal I, 4) počátek bakteriální replikace z plasmidu z Pseudomonas pVSl [Itoh a další (1984) Plasmid 11: 206 až 220] a 5) bakteriální gen pro neuomycin fosfotransferasu z Tn5 [Berg a další (1975) Proč. Nati. Acad. Sci USA, 72: 3628 až 3632], jako selekční, markér pro transformovaný Agrobacterium tumefaciens.

Kazeta chimérického genu pro faseolin-HSZ, faseolinová 5' oblast/faseolinová · signální sekvence/ maturovaný HSZ/faseolinová 3' oblast (příklad 6) se izoluje ve formě přibližně 2,3kb Hind III fragmentu. Tento fragment se vloží do jediného Hind III místa binárního vektoru pZS97 (obr. 4). Tento vektor se podobá vektoru pZS97K, který je popsán výše, s výjimkou přítomnosti dvou přídavných klonovacích míst, jediného místa Srna I a jediného místa Hind III a genu pro β-laktamasu, který zajišťuje rezistenci vůči ampicilinu),..jako selekční markér pro transformovaný kmen A. tumefaciens a který je přítomen místo bakteriálního genu pro neomycin fosfotransferasu.

Binární vektory obsahující chimérické HSZ geny se přenesou triparentálním spojením (mating) [Ruvkin a další (1981) Nátuře 289: 85 až 88] do kmene Agrobacterium LBA4404/pAL4404 [Hockema a další (1983) Nátuře 303: 179 až 180]. Transformantů Agrobacterium se použije pro inokulaci terčíků z tabákových listů [Horsch a další (1985) Science 227: 1229 až 1231]. Transgenní rostliny se regenerují v selektivním mediu obsahujícím kanamycin.

Z mladých listů se extrahuje genomová DNA a nalýzuje se pomocí PCR, aby se zjistila přítomnost chimérických genů pro HSZ v transformovaném tabáku. Jako primerů pro PCR reakci se použije oligonukleotidů CFC93 (SEQ ID NO:22), viz dále a CFC77 (SEQ ID NO:7), viz příklad 1.

CFC93

GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA (SEQ ID NO:22)

Od těchto primerů se očekává vytvoření 425 bp fragmentů DNA, který bude vzhledem ke genu HSZ interní. Šestnáct z dvaceti zkoušených. transformantů je při této zkoušce pozitivní (viz tabulky 1 a 2).

- 50 Pro zjištění exprese transformované rostliny nechají vytvořit semena. Ze zralých semen extrahuje veškerý protein:

chimérických genů se vykvést, samoopylit a se následujícím způsobem

Přibližně 200 mg semen se umístí do l,5ml plastové mikrocentrifugační zkumavky pro jedno použití a rozdrtí v 0,25 ml 50mM Tris-Cl o pH 6,8, 2mM EDTA, 1% SDS 1% β-merkaptoethanolu. Drcení se provádí pomocí motorového drtiče za použití, plastových hřídelů pro jedno použití, které jsou upraveny tak, aby se hodily do mikrocentrifugační zkumavky. Výsledné suspenze se 5 minut centrifugují při teplotě místnosti v mikrocentrifugační zkumavce, aby se odstranily pevné částice. Celkový obsah proteinu v supernatantu se stanoví pomocí proteinového stanovení BioRAD za použití hovězího sérového albuminu, jako standardu.

Z každého extraktu se 10 p.g proteinu analýzu je v jedné dráze polyakrylamidového gelu SDS, přičemž jako pozitivního kontrolního vzorku se používá maturovaného HSZ vyrobeného bakteriálním postupem a jako negativního kontrolního vzorku se používá proteinu extrahovaného z netransformovaných tabákových semen. Potom se proteiny elektroforeticky blotují na nitrocelulózovou membránu. Membrány se exponují protilátkám proti HSZ (viz příklad 4) ve zředění 1:700) z králičího séra, za použití standardního protokolu, který firma BioRad poskytuje spolu se soupravou Immun-Blot. Po promytí, za účelem odstranění nevázaných primárních protilátek se membrány exponují sekundární protilátce, oslímu protikráličímu Ig konjugovanému ke křenové peroxidase (Amersham) ve zředění 1:3000. Po promytí, kterým se odstraňuje nenavázaná sekundární protilátka, se membrány zpracují chemiluminiscenčním reakčním činidlem Amersham a exponují narentgenografický film.

Většina transformantů, které obsahují gen pro HSZ na základě analýzy PCR také produkuje HSZ protein podle imunologického skríningu (tabulky 1 až 3). Ve všech případech je velikost produkovaného proteinu přibližně stejná jako velikost maturovaného HSZ produkovaného v E.coli, což ukazuje, že došlo k odstranění jak nativní, tak faseolinové signální sekvence, což naznačuje, že protein vstoupil do endoplasmického retikula.

Semena se. také extrahují směsí 70% isopropylalkohol/1 % β-merkaptoethanolu, což je rozpouštědlo, v němž je rozpustných málo proteinů kromě HSZ. Proteiny se potom analýzují SDS-PAGE, blotováním Western a imunologickou zkouškou, popsanou výše. Za těchto podmínek se zjistí opět že velikost proteinu odpovídá maturovanému HSZ, což potvrzuje identitu detegovaného proteinu jako HSZ.

Úroveň exprese HSZ v transformovaných liniích se odhadne na základě citlivosti na protilátky proti HSZ a množství proteinu navázaného na gel SDS-PAGE. HSZ tvoří přibližně 0,05 až 0,5 % celkového proteinu semen.

Za účelem stanovení složení aminokyselin v semenech se šest semen hydrolýzuje v 6N kyselině chlorovodíkové s 0,4 % β-merkaptoethanolu pod atmosférou dusíku po dobu 24 hodin při 110 až 120 °C. Jedna desetina vzorku se analýzuje v analyzátoru aminokyselin Beckman model 6300 za použití ninhydrinové detekce za sloupcem. Relativní koncentrace methioninu v semenech se srovnává formou poměru methionin : leucin, takže se leucinu používá jako interního standardu. Standardní odchylka poměru methionin:leucin činí přibližně exprese HSZ podle stanovení bylo možno

%. Při nejvyšší úrovni analýzou Western-Blot by koncentrace methioninu prostřednictvím HSZ 10 %. Vzhledem k tomu, že tato hodnota očekávat nárůst v semenech o asi je tak blízká standardní odchylce, není pozorován žádný účinek exprese HSZ na celkový obsah methioninu v semenech (tabulky 1 až 3).

Tabulka 1 pCC15 transformanty faseolinová 5' oblast/maturovaný HSZ/faseolinová 3' oblast linie PCR Western Met:Leu

15-17A + 15-29A + 15-34A + 15-40A + 15-50A + 15-55A + 15-27B + 15-49B

15-54B + 15-38A + +

+ + 0,19 +++ 0,19 ++ +

+ +

Tabulka 2 pCC15 transformanty faseolinová 5' oblast/nativní HSZ/faseolinová 3' oblast linie PCR Western Met:Leu

16-7A	+	+++
16-16A	+	+
16-24A	-	-
16-48A	-	-
16-6B	+	-
16-11B	-	-
16-33B	+	+
16-49B	+	-
16-54B	+	-
16-55B	+	—

Tabulka 3 pCC15 transformanty faseolinová 5'oblast/faseolinová signální sekvence/maturovaný HSZ/faseolinová 3' oblast linie

PCR

Western

Met:Leu

36-1B	+
36-4B	+
36-5A	+
36-20A	++-?·
36-23C	+
36-35B	++
36-39A	+
36-46B	++
36-47D	-
36-55D	—

Příklad 8

Exprese proteinu HMD v E.' coli

Kultura E. coli kmene BL21(DE3) pLysE [Studier a další (1990) Methods in Enzymology 185: 60 až 89] transformovaná plasmidem pX8M-18 se pěstuje v 10 litrech média LB obsahujícího ampicilin (100 mg/1) při 37 °c. Při dosažení optické hustoty při 600 nm asi 1 se přidá IPTG (isopropylthio-p-galaktosid, jako induktor) do výsledné koncentrace lmM a v inkubaci se pokračuje 8 hodin při 37 °C. Buňky se centrifuguji, promyjí 50mM chloridem sodným, 50mM Tris-Cl o pH 7,5, lmM EDTA (pufr A) a zmrazí při -80 °C.

Zmrazené buňky se nachají roztát na ledu v 5 ml pufru A na gram buněk. Přidá se deoxyribonukleasa I (Sigma) do koncentrace 0,1 mg/ml. Po 60 minutách inkubace při teplotě místnosti se suspenze zpracuje na ledu ultrazvukem, aby se snížila její viskozita. Směs se odstředí a supernatant se vyleje. Peleta se 2x extrahuje 25 ml 70% isopropylalkoholu, lOmM β-merkaptoethanolu. HMD, podobně jako HSZ, je v tomto rozpouštědla rozpustná. Pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu SDS a vybarvení briliantovou modří Coomassie se zjistí, že HMD protein je hlavním proteinem při extrakci. Analýzou Western Blot se zjistí, že HMD protein křížově zreagoval s králičí protilátkou vypěstovanou proti HSZ.

Příklad 9

Transformace tabáku chimérickými geny β-konglycinin-HSZ

Kazety β-konglycininového chimérického genu, β-konglycininová 5' oblast/nativní HSZ/faseolinová 3' oblast, β-konglycininová 5' oblast/maturovaný HSZ/faseolinová 3' oblast a β-konglycininová 5' oblast/faseolinová signální sekvence/maturovaný HSZ/faseolinová 3' oblast (příklad 6) se izolují ve formě přibližně 2,4kb Hind III fargmentů. Tyto fragmenty se vloží do jediného Hind III místa binárního vektoru pZS97 (obr. '4). Tento vektor se podobá vektoru pZS97K, popsanému v příkladu 7, s výjimkou toho, že obsahuje dvě přídavná klonovací místa, jediné místo Sma I a jediné místo Hind III a gen pro bakteriální β-laktamasu (způsobující resistenci vůči ampicilinu), jako selekční markér, pro transformovaný kmen A. tumefaciens, namísto bakteriálního genu pro neomycin fosfotransferasu.

Binární vektory obsahující chimérické HSZ geny se přenesou triparentálním spojením (mating) (Ruvkin a další (1981) Nátuře 289: 85 až 88] do kmene Agrobacterium LBA4404/pAL4404 [Hockema a další (1983) Nátuře 303: 179 až 180]. Transformantů Agrobacterium se použije pro inokulaci terčíků z tabákových listů [Horsch a další (1985) Science 227: 1229 až 1231]. Transgenní rostliny se regenerují v selektivním mediu obsahujícím kanamycin.

Pro zjištění exprese chimérických genů se transformované rostliny nechají vykvést, samoopylit a vytvořit semena. Ze zralých semen se následujícím způsobem extrahuje veškerý protein:

Přibližně 200 mg semen se umístí do l,5ml plastové mikrocentrifugační zkumavky pro jedno použití a rozdrtí v 0,25 ml 50mM Tris-Cl o pH 6,8, 2mM EDTA, 1% SDS 1% β-merkaptoethanolu. Drcení se provádí pomocí motorového drtiče za použití plastových hřídelů pro jedno použití, které jsou upraveny tak, aby se hodily do mikrocentrifugační zkumavky. Výsledné suspenze sé 5 minut centrifugují při teplotě místnosti v mikrocentrifugační zkumavce, aby se odstranily pevné částice. Celkový obsah proteinu v supernatantu se stanoví pomocí proteinového stanovení BioRAD za použití hovězího sérového albuminu, jak standardu.

Z každého extraktu se 10 ug proteinu analýzuje v jedné dráze polyakrylamidového gelu SDS, přičemž jako pozitivního kontrolního vzorku se používá maturovaného HSZ vyrobeného bakteriálním postupem a jako negativního kontrolního vzorku se používá proteinu extrahovaného z netransformovaných tabákových semen. Potom se proteiny elektroforeticky blotují na nitrocelulózovou membránu. Membrány se exponují protilátkám proti HSZ (viz příklad 4) ve zředění 1:700) z králičího séra, za použití standardního protokolu, který firma BioRad poskytuje spolu se soupravou Immun-Blot. Po promytí, za účelem odstranění nevázaných primárních protilátek se membrány exponují sekundární protilátce, oslímu protikráličímu Ig konjugovanému ke křenové peroxidase (Amersham) ve zředění 1:3000. Po promytí, kterým se odstraňuje nenavázaná sekundární protilátka, se membrány zpracují chemiluminiscenčním reakčním činidlem Amersham a exponují na rentgenografický film.

Jeden transformant obsahující chimérický gen 0-konglycininová 5' oblast/maturovaný HSZ/faseolinová 3' oblast a dva transformanty obsahující chimérické geny 0-konglycininová 5' oblast/nativní HSZ/faseolinová 3' oblast, všechny produkují protein HSZ. čtyři ze sedmi transformantů obsahujících chimérický gen 0-konglycininová 5' oblast/faseolinová signální sekvence/maturovaný HSZ/ faseolinová 3' oblast produkují HSZ protein (tabulka 4). Ve všech případech odpovídá velikost produkovaného proteinu přibližně velikosti maturovaného HSZ produkovaného v E. coli, což ukazuje, že jak nativní, tak faseolinová signální sekvence byla odštěpena a že tedy protein vstoupil do endoplasmického retikula.

Za účelem stanovení složení aminokyselin v semenech se šest semen hydrolýzuje v 6N kyselině chlorovodíkové s 0,4 % β-merkaptoethanolu pod atmosférou dusíku po dobu 24 hodin při 110 až 120 °C. Jedna desetina vzorku se analýzuje v analyzátoru aminokyselin Beckman model 6300 za použití ninhydrinové detekce za sloupcem. Relativní koncentrace methioninu v semenech se srovnává formou poměru methionin:leucin, takže se leucinu používá jako interního standardu. Standardní odchylka poměru methionin:leucin činí přibližně 5 %. Linie s nejvyšší úrovní exprese HSZ podle analýzy Western Blot vykazuje nejvyšší hodnotu obsahu methioninu v semenech jako celku (tabulka 4). Tato hodnota je sice pouze o 7 % vyšší než hodnota průměrná, nicméně se soudí, že přes její blízkost k chybě měření, je pravděpodobné, že takto vysoká úroveň methioninu je důsledkem exprese HSZ.

Tabulka 4 β-konglycinin 5'oblast/faseolinová signální sekvence/ maturovaný HSZ/faseolinová 3'oblast

linie	Western	Met:Leu
39-1C	+	0,20
39-9C	-	0,20
39-13A	-	0,21
39-14C	+	0,20
39-15C	-	0,20
39-28A	++	0,21
39-36A	+	0,20

Příklad 10

Koknstrukce chimérického genu pro expresi HMD v rostlinách

Tak jako v příkladu 6 se pro konstrukce chimérického genu pro expresi HMD v rostlinách použije vůči semenům specifické genové expresní kazety. Expresní kazeta obsahuje regulační oblast z β-podjednotky faseolinu z fazolu Phaseolus vulgaris. Vytvořený chimérický gen také obsahuje dvojděložnou signální sekvenci pro faseolin: faseolinová 5' oblast/faseolinová signální sekvence/HMD/faseolinová 3' oblast.

Syntetizují se PCR primery, CLM 1 (SEQ ID NO:23) a CLM 2 (SEQ ID NO:24), viz dále a použije se jich s plasmidem pJRHMDl, jako templátem, pro vytvoření fragmentu DNA obsahujícího sekvenci HMD fúzovanou ke 3' konci faseolinové signální sekvence a lemovanou místy Nhe I a Xba I. Plasmid pCC24, diskutovaný v příkladu 6, se štěpí Nhe I, který provede štěpení ve faseolinové signální sekvenci a Xba I a přečistí elektroforézou na agarosovém gelu. Přečištěný vektor se liguje k PCR produktu vytvořenému z CLM 1 (SEQ ID NO: 23), CLM 2 (SEQ ID NO: 24) a pJRHMDl, čímž se regeneruje úplná faseolinová signální sekvence, vázaná k HMD. Produkt ligace nese označení pJRHMD2. Sekvence chimérického genu (SEQ ID NO:25) se potvrdí sekvenováním DNA.

CLM 1 Nhel

5' TGCTTGCTAGCTTTGCTATGCCAATGATGATGCCGGGT 3' (SEQ ID NO:23) AlaSerPheAlaMetProMetMetMetProGly

CLM 2 Xbal

5' TGCTTTCTAGACTATGGCATCATCATTGGTGACACC 3' (SEQ ID NO:24)

Příklad 11

Transformace sóji chimérickým genem faseolin-HSZ

Pro indukce somatických embryí se kotyledony o délce 4 až 5 mm, které jsou podélně rozříznuty, z povrchově sterilizovaných nezralých semen sojového kultivaru XP3015, kultivují ve tmě při 25 °C na agarovém mediu (SB1 nebo SB2) po dobu 8 až 10 týdnů. Somatická embrya, která poskytnou sekundární embrya, se odříznou a umístí do kapalného média (SB55). Po opakované selekci na shluky somatických embryí, které tak časnou multiplikací poskytují embrya v globulárním stadiu, se suspenze uchovávají následujícím způsobem.

Sojová embryogenní suspenzní kultura se uchovává ve 35 ml kapalného média (SB55) v rotační třepačce pracující s frekvencí otáčení 150 min¹ při 28 °c osvětlované směsným fluorsecenčním a viditelným světlem ze žhaveného zdroje v režimu 16 hodin den, 8 hodin noc. Každé 4 týdny se kultury převádějí do subkultur inokulací přibližně 35 mg tkáně do 35 ml kapalného média.

Sojové embryogenní suspensní kultury se transformují metodou bombardováním částicovou puškou (Particle Gun Bombardment) [Kline a další (1987) Nátuře (London) 3 27:70; US patent č. 4 945 050). Pro tyto transformace se použije zařízení Du Pont Biolistic^^R^ PDS1000/HE (Helium Retrofit).

Plasmidový vektor, kterého transfomraci, je derivátem pGEM9Z

Research Products). Jako selekčního chimérického genu, který se Skládá mozaikového viru květáku [Oděli a daláí se používá pro (Promega Biological merkeru se použije z 35S promotoru z (1985) Nátuře 313:

810 až 812], genu pro hygromycin fosfotransferasu z plasmidu pJR225 (z E. coli) [Gritz a další (1983) Gene 25: 179 až 188]. 3' oblast genu pro nopalin synthasu z T-DNA Ti plasmidu Agrobacterium tumefaciens (SEQ ID NO:26) je na místě Sal I vektoru. Ve formě přibližně 2,3kb Hind III fragmentu se izoluje kazeta chimérického genu faseolin-HSZ, faseolinová 5' oblast/faseolinová signální sekvence/maturovaný HSZ/faseolinová 3' oblast (příklad 6). Tento fragment se vloží do jediného Hind III místa vektoru.

zlatých částic o koncentraci uvedeném pořadí) 5 μΐ DNA (O,1M) a 50 μΐ chloridu částicemi se 3 minuty míchá,

K 50 μΐ suspenze Ιμιη 60 mg/ml se přidá (v dále (1 μg/μl), 20 μΐ spermidinu vápenatého (2,5M). Přípravek s nechá se 10 s rotovat v mikrocentrifuze a supernatant se oddělí. Částice povlečené DNA se potom jednou promyjí 400 μΐ 80% ethanolu a resuspndují ve 40 μΐ bezvodého ethanolu. Suspenze částic s DNA se 3x zpracovává ultrazvukem, vždy 1 sekundu. Na každý makronosičový disk se potom uloží 5 μΐ zlatých částic povlečených DNA.

Přibližně 300 až 400 mg 4 týdny staré suspensní kultury se umístí do prázdné petri misky o rozměrech 60 x 15 mm a zbytek kapaliny se z tkáně odstraní pipetou. Při každém transformačním pokusu se normálně bombarduje asi 5 až 10 misek s tkání. Tlak, při němž praská membrána, se nastaví na 6,87 MPa a komora se evakuuje na vakuum 94,802 kPa. Tkáň se umístí přibližně 8,9 cm od zachycovací mřížky a bombardování se provádí třikrát. Po bombardování se tkáň umístí zpět do kapaliny a kultivuje se výše popsaným způsobem.

Sedm dní po bombardování se za čerstvé médium SB55 obsahující 50 mg/ml. Selektivní média se každý kapalné médium vymění hygromycin v množství týden dávají čerstvá.

Sedm týdnů po bombardování se pozoruje zelená transformovaná tkáň rostoucí z netransformovaných nekrotických embryogenních shluků. Izolovaná zelená tkáň se odstraní a inokuluje do jednotlivých láhví, čímž se získají nové klonově propagované transformované embryogenní suspenzní kultury. S každou novou linií se tedy zachází jako s nezávislým transformantem. Tyto suspenze je potom možno převést do subkultur a uchovávat ve formě shluků nezralých embryí nebo regenerovat na úplné rostliny maturací a klíčením jednotlivých somatických embryí.

Transformované embryogenní shluky se vyjmou z kapalné kultury a umístí na pevné agarové médium (SB103), které neobsahuje žádné hormony ani antibiotika. Embrya se pěstují po dobu 8 týdnů při 26 °C pod smíšeným fluorescenčním světlem a viditelným světlem ze žhaveného zdroje v režimu 16 hodin den/8 hodin noc. V průběhu této doby se jednotlivá embrya vyjmou ze shluků a dále popsaným způsobem analýzují na produkci HSZ proteinu. Po 8 týdnech jsou embrya vhodná pro klíčení.

Jednotlivá embrya se zmrazí v kapalném dusíku a rozdrtí na jemný prášek ve třecí misce s tloukem, které jsou oba předchlazeny kapalným dusíkem. Prášek se seškrábne do Eppendorfovy centrifugační zkumavky· a dvakrát extrahuje hexanem při teplotě místnosti. Zbytek se 30 minut inkubuje při 60 °C, by se odpařil zbytek hexanu. Potom se k peletě přidá 100 μΐ 50mM Tris-HCl o pH 6,7, 2mM EDTA, 1% SDS a 1% β-merkaptoethanol (ΤΕββ) a směs se drtí nízkou rychlostí po dobu asi 10 s za použití motorového drtiče s plastovou hřídelí pro jedno použití, která je upravena tak, aby pasovala do mikrocentrifugační zkumavky. Vzniklé suspenze se 5 minut odstředují při teplotě místnosti v mikrocentrifuze a supernatant se oddělí a uschová. Peleta se resuspenduje v 50 μΐ 70% isopropylalkoholu, lOmM β-merkaptoethanolu za použití výše uvedeného drcení. Zkumavka se 5 minut inkubuje při 60 °C a potom se centrifuguje výše popsaným způsobem. Supernatant se uschová a peleta se znovu extrahuje 50 μΐ 70% isopropylalkoholu, lOmM β-merkaptoethanolu. Alkoholové extrakty se spojí a lyofilizují. Zbyek se resuspenduje v 50 μ,Ι ΤΕεβ. Tento vzorek a první extrakt ΤΕΞβ se zkoušejí na přítomnost HSZ proteinu metodou Western Blot popsanou v příkladu 9. Dvě ze tří transformovaných linií, které byly podrobeny zkoušení, vykazují expresi proteinu HSZ.

Media:

SB55 zásobní roztoky (g/1)

MS Sulfát 100X	MS Halogenidy 100X
zásobní		zásobní
MgSO4.7H2O	37,0	CaCl2.2H2O	44,0
MnSO4.H2O	1,69	Kl	0,083
ZnSO4.7H2O	0,86	CoCl2.6H20	0,00125
CuSO4.5H2O	0,0025
MS Ρ. B. Mo 100X		MS FeEDTA 100X
zásobní		zásobní
kh2po4	17,0	Na2EDTA	3,724
h3bo3	0,62	FeSO4.7H2O	2,784
Na2Mo04.2H2O	0,025
B5 vitamin zásobní		SB55 (na litr)
10 g m-inositolu		10 ml každého	ze zásobních

roztoků MS

100 mg nikotinové kyseliny · 1 ml B5 vitaminového zásobního roztoku

100 mg pyridoxinu.HCl 1 g thiaminu

SB103 (na litr)

MS soli 6% maltóza 750 mg MgCl₂ 0,2% Gelrite pH 5,7

0,3 g NH₄NO₃ 3,033 g KNO₃ 1 ml 2,4-D (10 mg/ml zásobní roztok) g sacharózy 0,667 g asparaginu pH 5,7

SB1 (na litr)

MS soli

B5 vitaminy

0,175 M glukóza 20 mg 2,4-D 0,8% agaru pH 5,8

SB2 jako SB1, s výjimkou 40 mg/1 2,4-D

Příklad 12

Transformace kukuřice genem pro zásobní protein s vysokým obsahem síry

Callové kultury se iniciují nezralými embryi (asi 1,5 až 2,0 mm) vyříznutými z jader kříženců genotypu A188 a B73, 10 až 12 dnů po opylení. Embrya se umístí výhonovou stranou směrem dolů do styku s agarosovým ztuhlým médiem N6. Embrya se udržují 've trné při 27 °C. Drolivý embryogenní callus, který se skládá z nediferencované hmoty buněk se somatickými proembryoidy a embryoidy nesenými na suspensorových strukturách proliferuje ze scutella těchto nezralých embryí. Embryogenní callus izolovaný z primárního explantu se kultivuje v médiu N6 a každé 2 až 3 týdny se přesadí do subkultur s tímto mediem.

Pro trasfer genů do callu buněk v kultuře se použije metody bombardování částicemi. Při těchto experimentech se používá zařízení Biolistic^^R^ PDS-1000/He (BioRad Laboratories, Hercules, CA).

Při těchto transformacích se používá plasmidového vektoru obsahujícího selekční markerový gen. Plasmid pALSLUC [Fromm a další (1990) Biotechnology 8: 833 až 839] obsahuje cDNA genu pro acetolaktát synthasu (ALS) kukuřice. ALS cDNA byla mutována in vitro tak, aby enzym kódovaný tímto genem byl rezistentní vůči chlorsulfuronu. Změna spočívá v mutaci tryptofanového kodonu v poloze 1626 cDNA na leucinový kodon. Gen ALS je pod kontrolou 35S promotoru z mozaikového viru květáku [Oděli a další (1985) Nátuře 313: 810 až 812] a 3U oblasti nopalin synthasového genu z T-DNA Ti plasmidu Agrobacterium tumefaciens. Tento plasmid také obsahuje gen, který využívá 35S promotoru z mozaikového viru květáku a 3U oblast nopalin synthasového genu pro expresi kódovací oblasti luciferasy světlušky [de Wet a další (1987) Molec. Cell Biol. 7: 725 až 737]. Chimérický gen pro HSZ se dodá druhému plasmidu. Tento plasmid (pCC12, viz příklad 6) obsahuje kódující oblast pro HSZ, která je pod kontrolou promotorové oblasti a 3U konec z genu, který kóduje lOkD zásobní protein kukuřice [Kirihara a další (1988) Gene 71: 359 až 370].

Tyto plasmidy (pALSLUC a pCC21) se společně vysrážejí na povrch zlatých částic. To se provede tak, že se 5 ug pALSLUC a 2 μg pCC21 (každý v Tris-EDTA pufru o koncentraci přibližně 1 ug/^l) přidá k 50 μΐ zlatých částic (o středním průměru 1 5 m) suspendovaných ve vodě (60 mg zlata v 1 ml). K suspenzi zlatých částic povlečených DNA se přidá chlorid vápenatý (50 μΐ 2,5M roztoku) a spermidin (20 μΐ l,0M roztoku) za součsného vířivého pohybu zkumavky. Částice se potom odstředí v mikrocentrifuze v průběhu 10 sekund a supernatant se oddělí. Částice se resuspendují ve 200 μΐ absolutního ethanolu. Po novém odstředění se oddělí supernatant a částice se resuspendují ve 30 μΐ ethanolu.. Na každý makronosičový disk se potom nanese 5 μΐ zlatých částic povlečených DNA.

Malé shluky (o průměru 2 až 3 mm) embryogenního callu se uspořádají na povrchu agarosového ztuhlého média N6 obsaženého v petri misce o průměru 12 cm. Tkáň pokrývá kruhovitou oblast o průměru asi 6 cm. Petri miska obsahující tkáň, se umístí do komory PDS-1000/He. Vzduch v komoře se potom evakuuje na vakuum 94,802 kPa. Makronosič se urychlí heliovou šokovou vlnou za použití membrány, u níž dochází k prasknutí, když tlak helia v šokové trubce dosáhne 6,87 MPa. Tkáň se umístí přibližně 8 cm od stop mřížky. Deset misek s tkání se bombarduje zlatými částicemi povlečenými DNA.

Sedm dnů po bombardování se tkáň přenese do media N6, které obsahuje chlorsulfuron (50nM) a neobsahuje kasein ani prolin. Na tomto médiu tkáň pomalu dále roste. Po dalších dvou týdnech se tkáň přenese do čerstvého média N6 obsahujícího chlorsulfuron. Po 8 týdnech je na jedné z misek s médiem, které je doplněno chlorsulfuronem, identifikována oblast o průměru asi 1 cm s aktivně rostoucím callem. Tento callus pokračuje v růstu po přesazení do subkultur se selektivním médiem. Určité množství tohoto callu se přenese do média, které umožňuje regeneraci rostlin.

U tohoto callu se měří aktivita luciferasy. Tkáň netransformovaného callu vykazuje aktivitu luciferasy asi 500 světelných jednotek na 1 mg čerstvé tkáně. Callus, který vyrostl na chlorsulfuronu, vykazuje aktivitu luciferasy přibližně 20 OOO světelných jednotek na 1 mg čerstvé tkáně. Tento výsledek ukazuje, že v této callové linii byly exprimovány geny z pALSLUC. Provede se analýza Southern na přítomnost obou zavedených genů ALS a zavedeného chimérického genu pro zásobní protein. Oba zavedené geny se sledují analýzou Southern.

genomová DNA nebo callu však nebyl

Za účelem analýzy z transformované callové odvozeného od stejného transformován (AB91) štěpí genu pro HSZ se linie (TX-X8A) genotypu, který bud Xba I nebo EcoR I. Štěpená

DNA se frakcionuje gelovou elektroforézou na agarose, přenese se standardní technikou na nylonovou membránu. Nylonový blot se hybridizuje k próbě vyrobené z části kódující oblasti pro HSZ. Callus AB91 obsahuje jeden dominantní pás, který odpovídá nativnímu genu pro HSZ. V callu Tx-X8A je zřejmý přídavný pás o vyšší molekulové hmotnosti. Tento pás odpovídá zavedenému chimérickému genu pro HSZ.

- 67 N6 medium složka množství na litr složka množství na litr

roztok I	10,0 ml	roztok I
CaCl2 (ÍM)	1,25	(nh4)2so4	23,0	g
roztok III	10,0 ml	kno3	141,5	g
MgSO4 (ÍM)	0,75 ml	kh2po4	20,0	g
roztok V	1,0 ml	h2°	500,0	ml
vitaminový
zásobní roztok	1,0 ml
kaseinový hydrolyzát	0,1 g	vitaminový	zásobní

roztok

sacharóza	60,0 g	niacin	0,13 g
Myo-inositol	0,1 g	thiamin	0,025 g
2,4-D (2 mg/ml
(zás. roztok)	0,5 ml	pyridoxin	0,025 g
pH do 5,8		pantothenát
		vápenatý	0,025 g
Přidej 6 g agarózy	na misky	voda	100,0 ml

roztok III	roztok V
Na2EDTA	1,85 g	h3bo3	0,16 g
FeSO4.7H2O	1,35 g	MnSO4.H20	0,33 g
h2o	500,0 ml	ZnSO4.7H2O	0,15 g
		KI	0,08 g
		Na2Mo04.2H20	0,025 i
		CuSO4.5H2O	0,0025
		CoC12.2H2O	0,0025
		h2o	100,0 ml

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel:

(ii) Název vynálezu:

SAVERIO C. FALCO CHOK-FUN CHUI JANET A. RICE

A HIGH SULFUR SEED PROTEIN GENE AND METHODS FOR INCREASING THE SULFUR AMINO ACID CONTENT OF PLANTS (Gen pro protein •v semenech s vysokým obsahem síry a způsob zvyšování obsahu sirných aminokyselin v rostlinách) (iii) Počet sekvencí:

(iv) Adresa pro korespondenci:

(A)	adresát:	Ε. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
(B)	ulice:	1007 MARKÉT STREET
(C)	město:	WILMINGTON
(D)	stát:	DELAWARE
(E)	země:	USA
(F)	PSČ:	19898

(v) Strojně čitelná forma:

(A) střední typ: diskety, 3,50 inch, 1,0MB

(B) počítač: (C) operační	MACINTOSH MACINTOSH SYSTEM, 6,0 MICROSOFT WORD, 4,0
	(d)	systém: software:
(iv)	Data	o současné přihlášce:
	(A)	číslo
		přilášky:
	(B)	datum podání:
	(C).	zatřídění:
(Vii)	Data	o dřívější přihlášce:
	(A)	datum:	14. února 1991
	(B)	USSN:	0,7/656,687
(viii)	Informace o patentovém zástupci:
	(A)	jméno:	Linda Axamethyl Floyd
	(B)	registrační číslo:	33,692
	(C)	značka spisu:	BB-1027-A
(ix)	Telekomunikační informace:
	(A)	telefon:	(302) 992-4929
	(B)	telefax:	(302) 892-7949
	(C)	telex:	835420

(2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	2123 nukleotidů
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	'lineární

(ii) Typ molekuly:	genomová
(iii) Hypothetická:	ne
(iv) Pozitivní řetězec:	ne
(v) Typ fragmentu:
(vi) Původní zdroj:
(A) organismus:	Zea mays
(B) kmen:	neznámý
(C) typ buňky:	neznámý
(vii) Bezprostřední zdroj
(A) knihovna:	genomová od firmy
(B) klon:	X8
viii) Poloha v genomu:	neznámá

L

DNA knihovna kukuřice Clontech (x) Informace o publikaci:

nepublikovaná sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:l

TCTAGAGCCT ATTACCATCT

GGCTACAGCT GGTGACAATC

TACGCGTAGT TAATTGGTTA tgggcttggt TATACCTGCT

GTGCTTGATC AAACATTGCA

ΑΤΑΤΑΤΑΓΑΤ TTTTGGGCAG

AATCATTTGT TAAAAAAGGT

GTTTTCACAT TAGATTTTCT

CTACTCACGG GTCGTAGAGG

CTACTCACCC TTTGTAATCC

GATGTCAACC CCCTCTCTAA

AGTGCCTGGG GATGTTCTAT

TAGTTTGACT TGGGACAAAC

AGGGAGCAGT AAGAACTTAT

TTAATTTTGC TGCTTTCTTT

TTGTGTTATA TACACTGGAT

TGGTGAGGTA	50
TCTACGGCTC	100
GTGGCAGTAG	150
TTTTCTAGTA	200
TGTCTGATAT	250
TTAGAAATGT	300
CGTTAATGTT	350
ACATACAAAT	400

TCAGTTGCAG	TAGTCTCTTA	ATCCACATCA	GCTAGGCATA	CTTTAGCAAA
AGCAAATTAC	ACAAATCTAG	TGTGCCTGTC	GTCACATTCT	CAATAAACTC
GTCATGTTTT	ACTAAAAGTA	CCTTTTCGAA	GCATCATATT	AATCCGAAAA
CAGTTAGGGA	AGTCTCCAAA	TCTGACCAAA	TGCCAAGTCA	TCGTCCAGCT
TATCAGCATC	CAACTTTCAG	TTTCGCATGT	GCTAGAAATT	GTTTTTCATC
TACATGGCCA	TTGTTGACTG	CATGCATCTA	TAAATAGGAC	CTAGACGATC
AATCGCAATC	GCATATCCAC	TATTCTCTAG	GAAGCAAGGG	AATCACATCG

CC 752

ATG GCA GCC AAG ATG TTT GCA TTG TTT GCG CTC CTA GCT CTT TGT

Met Ala Ala Lys Met Phe Ala Leu Phe Ala Leu Leu Ala Leu Cys

-20 -15 -10

GCA ACC GCC ACT AGT GCT ACC CAT ATC CCA GGG CAC TTG TCA CCA

Ala Thr Ala Thr Ser Ala Thr His Ile Pro Gly His Leu Ser Pro

-5 15

CTA CTG ATG CCA TTG GCT ACC ATG AAC CCA TGG ATG CAG TAC TGC

Leu Leu Met Pro Leu Ala Thr Met Asn Pro Trp Met Gin Tyr Cys

15 20

ATG AAG CAA CAG GGG GTT GCC AAC TTG TTA GCG TGG CCG ACC CTG

Met Lys Gin Gin Gly Val Ala Asn Leu Leu Ala Trp Pro Thr Leu

30 35

ATG CTG CAG CAA CTG Met Leu Gin Gin Leu 40

TTG GCC TCA CCG CTT Leu Ala Ser Pro Leu 45

CAG CAG TGC CAG ATG Gin Gin Cys Gin Met 50

CCA ATG ATG ATG CCG GGT ATG ATG CCA CCG ATG ACG ATG ATG CCG Pro Met Met Met Pro Giv Met Met Pro Pro Met Thr Met Met Pro 55 60 65

ATG CCG AGT ATG ATG CCA TCG ATG ATG GTG CCG ACT ATG ATG TCA Met Pro Ser Met Met Pro Ser Met Met Val Pro Thr Met Met Ser 70 75 80

CCA ATG ACG ATG GCT AGT ATG ATG CCG CCG ATG ATG ATG CCA AGC Pro Met Thr Met Ala Ser Met Met Pro Pro Met Met Met Pro Ser 85 90 95

ATG ATT Met Xle 100

TCA CCA ATG ACG ATG CCG AGT ATG ATG CCT TCG ATG ATA Ser Pro Met Thr Met Pro Ser Met Met Pro Ser Met Ile

105 110

450

500

550

600

650

700

750

797

842

887

932

977

1022

1067

1112

1157

ATG CCG ACC ATG ATG TCA CCA ATG ATT ATG CCG AGT ATG ATG CCA 1202 Met Pro Thr Met Met Ser Pro Met Ile Met Pro Ser Met Met Pro 115 120 125

CCA Pro 130

ATG ATG

ATG CCG

AGC ATG GTG

TCA CCA ATG ATG ATG CCA AAC

1247

Met

Met

Met

Pro

Ser Met 135

Val

Ser

Pro Met Met 140

Met

Pro

Asn

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

CAA TGT

TAC

TCT

GGT TCT ATC

TCA

CAC

ATT

1292

Met

Met

Thr

Val

Pro

Gin Cys

Tyr

Ser

Gly Ser Zle

Ser

His

Zle

145

150

155

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA CCA

TTC

ATG

TTC AGC CCC

ACA

GCC

ATG

1337

Zle

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu Pro

Phe

Met

Phe Ser Pro

Thr

Ala

Met

160

-

165

170

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC TTA

CAG

CAG

CCC TTT GTT

GGT

GCT

GCA

1382

Ala

Zle

Pro

Pro

Met

Phe Leu

Gin

Gin

Pro Phe Val

Gly

Ala

Ala

175

180

185

TTC TAG ATCTAGATAT AA 1400

Phe

190

GCATTTGTGT	AGTACCCAAT	AATGAAGTCG	GCATGCCATC	GCATACGACT	1450
CATTGTTTAG	GAATAAAACA	AGCTAATAAT	GACTTTTCTC	TCATTATAAC	1500
TTATATCTCT	CCATGTCTGT	TTGTGTGTTT	GTAATGTCTG	TTAATCTTAG	1550
TAGATTATAT	TGTATATATA	ACCATGTATT	CTCTCCATTC	CAAATTATAG	1600
GTCTTGCATT	TCAAGATAAA	TAGTTTTAAC	CATACCTAGA	CATTATGTAT	1650
ATATAGGCGG	CTTAACAAAA	GCTATGTACT	CAGTAAAATC	AAAACGACTT	1700
ACAATTTAAA	ATTTAGAAAG	TACATTTTTA	TTAATAGACT	AGGTGAGTAC	1750
TTGTGCGTTG	CAACGGGAAC	ATATAATAAC	ATAATAACTT	ATATACAAAA	1800
TGTATCTTAT	ATTGTTATAA	AAAATATTTC	ATAATCCATT	TGTAATCCTA	1850
GTCATACATA	AATTTTGTTA	TTTTAATTTA	GTTGTTTCAC	TACTACATTG	900
CAACCATTAG	TATCATGCAG	ACTTCGATAT	ATGCCAAGAT	TTGCATGGTC	1950
TCATCATTGA	AGAGCACATG	TCACACCTGC	CGGTAGAAGT	TCTCTCGTAC	2000
ATTGTCAGTC	ATCAGGTACG	CACCACCATA	CACGCTTGCT	TAAACAAAAA	2050
AACAAGTGTA	TGTGTTTGCG	AAGAGAATTA	AGACAGGCAG	ACACAAAGCT	2100
ACCCGACGAT	GGCGAGTCGG	TCA			2123

(2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: .639 nukleotidů (B) Typ: DNA (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: in vitro mutovaná genomová DNA (x) Informace o publikaci: nepublikovaná sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2

CC ATG GCA GCC AAG ATG TTT GCA TTG TTT GCG CTC CTA GCT CTT TGT 47

Met Ala Ala Lys Met Phe Ala Leu Phe Ala Leu Leu Ala Leu Cys

GCA Ala CTA Leu 10

-20 ACC GCC Thr Ala -5 CTG ATG Leu Met

ACT Thr CCA Pro

AGT Ser TTG Leu

GCT Ala GCT Ala 15

-15 ACC CAT Thr His 1 ACC ATG Thr Met

ATC Ile AAC Asn

CCA Pro CCT Pro

GGG Gly 5 TGG Trp 20

-10

TCA Ser TAC Tyr

CCA Pro TGC Cys

92 137

CAC His ATG Met

TTG Leu CAG Gin

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

182

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Val

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

Thr

Leu

25

30

35

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

227

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

40

45

50

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

272

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

55

60

65

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

317

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

Met

Ser

70

75

80

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

362

Pro

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

85

90

95

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

4C7

Met

Ile

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

100

105

110

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

452

Met

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

Ile

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

115

120

125

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

497

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

130

135

140

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

542

Met

Met

Thr

Val

Pro

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

Ile

Ser

His

Ile

145

150

155

ΊΑ

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

ACA

GCA

ATG

Ile

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

160

165

170

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

Ala

Ile

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

175

180

185

TTC

TAG

A _

639

Phe

190

(2) Informace o

SEQ

ID

NO

:3:

587

632 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 579 nukleotidů (B) Typ: DNA (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly:

in vitro mutovaná genomová DNA (x) Informace o publikaci: nepublikovaná sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3

TC ATG

ACC

CAT

ATC

CCA

GGG

CAC

TTG

TCA

CCA

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG 47

Met

Thr

His

Ile

Pro 5

Gly

His

Leu

Ser

Pro 10

Leu

Leu

Met

Pro

Leu 15

(jk- Λ Ala

ACC ATG AAC CCT

TGG ATG CAG

TAC Tyr

TGC Cys 25

ATG AAG CAA CAG GGG

92

Thr

Met

Asn

Pro 20

Trp

Met

Gin

Met

Lys

Gin

Gin

Gly 30

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

137

Val

Ala

Asn

Leu

Leu 35

Ala

Trp

Pro

Thr

Leu 40

Met

Leu

Gin

Gin

Leu 45

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

182

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu 50

Gin

Gin

Cys

Gin

Met 55

Pro

Met

Met

Met

Pro 60

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

227

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Met

Pro

Ser

Met

Met

70 75

CCA Pro

TCG Ser

ATG Met

ATG Met

GTG Val 80

CCG ACT ATG

ATG TCA

CCA Pro

ATG Met

ACG Thr

ATG Met

GCT Ala 90

272

Pro

Thr

Met

Met

Ser 85

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

317

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

Ser

Pro

Met

95

100

105

ACG Thr

ATG Met

CCG Pro

AGT ATG ATG CCT

TCG ATG

ATA ATG CCG ACC

ATG ATG Met Met 120

362

Ser

Met 110

Met

Pro

Ser

Met

Ile 115

Met

Pro

Thr

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

407

Ser

Pro

Met

Ile

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

125

130

135

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

452

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

'Met

Met

Pro

Asn

Met

Met

Thr

Val

Pro

-

140

145

150

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

497

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

Ile

Ser

HiS

Ile

Ile

Gin

Gin

Gin

Gin

155

160

165

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

542

Leu

Pro

Phe

Met

Phé

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

Ala

Ile

Pro

Pro

Met

170

175

180

TTC

TTA

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAG

A 579

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

Phe

185 190 (2) Informace o SEQ ID NO:4.

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	281 nukleotidů
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly in vitro mutovaná genomová DNA

	(X)	Informace o
publikaci:	nepublikovaná	sekvence
	(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO:4:
CAT	ATG CCA ATG	ATG ATG CCG GGT	ATG ATG CCA CCG ATG ACG	ATG 4 5
	Met Pro Met	Met Met Pro Gly	Met Met Pro Pro Met Thr	Met
		5	10
ATG	CCG ATG CCG	AGT ATG ATG CCA	TCG ATG ATG GTG CCG ACT	ATG 90
Met	Pro Met Pro	Ser Met Met Pro	Ser Met Met Val Pro Thr	Met
15		20	25
ATG	TCA CCA ATG	ACG ATG GCT AGT	ATG ATG CCG CCG ATG ATG	ATG 135
Met	Ser Pro Met	Thr Met Ala Ser	Met Met Pro Pro Met Met	Met
30		35_	40
CCA	AGC ATG ATT	TCA CCA ATG ACG	ATG CCG AGT ATG ATG CCT	TCG 180
Pro	Ser Met Ile	Ser Pro Met Thr	Met Pro Ser Met Met Pro	Ser
45		50	55
ATG	ATA ATG CCG	ACC ATG ATG TCA	CCA ATG ATT ATG CCG AGT	ATG 225
Met	lle Met Pro	Thr Met Met Ser	Pro Met Zle Met Pro Ser	Met
60		65	70
ATG	CCA CCA ATG	ATG ATG CCG AGC	ATG GTG TCA CCA ATG ATG	ATG 270
Met	Pro Pro Met	Met Met Pro Ser	Met Val Ser Pro Met Met	Met

80 85

CCA TAG AATTC 281

Pro (2) Informace o SEQ ID NO:5:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	453 nukleotidů
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: cDNA (x) Informace o publikaci:

(A) Autoři

Kirihara, J.A.

Hunsperger, J. P.

Mahoney, W.C.

Messing, J. W.

(B)	Název:	Differential expression gene for a methioninerich storage protein in maize (Diferenciální exprese genu pro zásobní protein kukuřice bohatý na methionin)
(C)	Časopis:	Mol.Gen. Genet.
(D)	Svazek:	211
(F)	Strana:	477-484
(G)	Datum:	1988
(K)	Relevantní zbytky
	v SEQ ID NO:	5: od 22 do 474
Popis	sekvence:	SEQ ID NO:5

ATG Met

GCA GCC Ala Ala -20

AAG ATG CTT

GCA TTG TTC GCT CTC

CTA Leu -10

GCT Ala

CTT Leu

TGT Cys

45

Lys

Met

Leu

Ala -15

Leu Phe Ala

Leu

GCA

AGC

GCC

ACT

AGT

GCG

ACC

CAT

ATT

CCA

GGG

CAC

TTG

CCA

CCA

90

Ala

Ser

Ala

Thr

Ser

Ala

Thr

His

Ile

Pro

Gly

His

Leu

Pro

Pro

-5

1

5

GTC

ATG

CCA

TTG

GGT

ACC

ATG

AAC

CCA

TGC

ATG

CAG

TAC

TGC

ATG

135

Val

Met

Pro

Leu

Gly

Thr

Met

Asn

Pro

Cys

Met

Gin

Tyr

Cys

Met

10

15

20

ATG

CAA

CAG

GGG

GCC

AGC

TTG

ATG

GCG

TGT

CCG

TCC

CTG

ATG

180

Met

Gin

Gin

Gly

Leu

Ala

Ser

Leu

Met

Ala

Cys

Pro

Ser

Leu

Met

25

30

35

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TTA

CCG

CTT

CAG

ACG

ATG

CCA

GTG

ATG

225

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala

Leu

Pro

Leu

Gin

Thr

Met

Pro

Val

Met

40

45

50

ATG

CCA

CAG

ATG

ATG

ACG

CCT

AAC

ATG

ATG

TCA

CCA

TTG

ATG

ATG

270

Met

Pro

Gin

Met

Met

Thr

Pro

Asn

Met

Met

Ser

Pro

Leu

Met

Met

55

60

65

CCG

AGC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

GTC

TTG

CCG

AGC

ATG

ATG

TCG

CAA

315

Pro

Ser

Met

Met

Ser

Pro

Met

Val

Leu

Pro

Ser

Met

Met

Ser

Gin

, 75 80

ATG ATG ATG CCA CAA

TGT Cys 90

CAC TGC GAC GCC GTC TCG

CAG ATT ATG

360

Met 85

Met Met

Pro

Gin

His

Cys Asp Ala

Val 95

Ser

Gin

Ile

Met

CTG

CAA

CAG

CAG

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AAC

CCA

ATG

GCC

ATG

ACG

405

Leu

Gin

Gin

Gin

Lěu

Pro

Phe

Met

Phe

Asn

Pro

Met

Ala

Met

Thr

100

105

110

ATT

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CAA

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

450

Ile

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

Phe

115 120 125

TAG 4 53(2) Informace o SEQ ID NO:6:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	30 nukleotidů
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: in vitro syntetizovaná

DNA (x) Informace o publikaci: nepublikovaná sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:

ATGGCAGCCA AGATGCTTGC ATTGTTCGCT 30 (2) Informace o SEQ ID NO:7:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	30 nukleotidů
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	řetězců:	•j eden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly:

(x) Informace o publikaci:

in vitro syntetizovaná DNA nepublikovaná sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA 30 (2) Informace o SEQ ID NO:8:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	17 nukleotidů
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: in vitro syntetizovaná

DNA (x) Informace o publikaci: nepublikovaná sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:8:

ATGAACCCTT GGATGCA 17 (2) Informace o SEQ ID NO:9:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 17 nukleotidů (B) Typ: 'DNA (C) Počet řetězců: (D) Topologie:

(ii) Typ molekuly:

(x) Informace o publikaci:

(xi) Popis.sekvence:

jeden lineární in vitro syntetizovaná DNA nepublikovaná sekvence

SEQ ID NO:9:

CCCACAGCAA TGGCGAT 17 (2) Informace o SEQ ID NO:10:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka:	13 nukleotidů
(B) Typ: (C) Počet	DNA
řetězců:	jeden
(D) Topologie:	lineární
Typ molekuly:	in vitro syntetizovaná DNA
Informace o
publikaci:	nepublikovaná sekvence
Popis sekvence:	SEQ ID NO:10:
CTAGCCCGGG TAC	13

(2) Informace o SEQ ID NO:11:

(i) Vlastnosti sekvence:

-	(A) Délka: (B) Typ: (C) Počet	13 nukleotidů DNA jeden lineární
řetězců:
(D) Topologie:
(ii)	Typ molekuly:	in vitro syntetizovaná DNA
(X)	Informace o
	publikaci:	nepublikovaná sekvence
(xi)	Popis sekvence:	SEQ ID NO:11:
	CTAGGTACCC	GGG 13

(2) Informace o SEQ ID NO:12:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	30 nukleotidů
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: in vitro syntetizovaná

DNA (x) Informace o publikaci:

nepublikovaná sekvence (Xi) (2) Informace (i) (ii) (X) (Xi) (2) Informace (i)

Popis sekvence: SEQ ID NO:12:

CCACTTCATG ACCCATATCC CAGGGCACTT 30 o SEQ ID NO:13:

Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	30 nukleotidů
(B)	Typ:	DNA
(C).	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

Typ molekuly: in vitro syntetizovaná

DNA

Informace o publikaci: nepublikovaná sekvence

Popis sekvence: SEQ ID NO:13:

TTCTATCTAG AATGCAGCAC CAACAAAGGG 30 o SEQ ID NO:14:

Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	30 nukleotidů
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly:

in vitro syntetizovaná DNA (x) Informace o publikaci: nepublikovaná sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:14:

TCACCGCTTC AGCAGTGCCA TATGCCAATG 30 (2) Informace o SEQ ID NO:15:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	40 nukleotidů
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: in vitro syntetizovaná

DNA (x) Informace o publikaci: nepublikovaná sekvence (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:15:

TCTTAGAATT CTATGGCATC ATCATTGGTG ACACCATGCT 40 (2) Informace o SEQ ID NO:16:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	71 párů :	bází
(B)	Typ:	nukleová	kyselina
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	'lineární

(ii) Typ molekuly:

in vitro syntetizovaná DNA (ix) znak:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 2..70

	(xi)	Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:16:
C ATG	ATG	AGA GCA.	.AGG GTT CCA	CTC CTG	TTG	CTG GGA	ATT	CTT	TTC
Met	Met	Arg Ala	Acg Val Pco	Leu Leu	Leu	Leu Gly	Ile	Leu	Phe
1			5	10				15

CTG GCA TCA CTT TCT GCT AGC TTT G Leu Ala Ses Leu Sec Ala Sec Phe (2) Informace o SEQ ID NO:17:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	71 párů bází
(B)	Typ:	nukleová kyselina
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly:

in vitro syntetizovaná DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:17

CTAGCAAAGC TAGCAGAAAG TGATGCCAGG AAAAGAATTC CCAGCAACAG GAGTGGAACC 60

CTTGCTCTCA T

(2)	Informace o SEQ ID NO:18:
		(i)	Vlastnosti sekvence:
			(A) Délka:	653 párů bází
			(B) Typ:	nukleová kyselina
			(C) Počet
			řetězců:	jeden
			(D) Topologie:	lineární
		(ii)	Typ molekuly:	genomová DNA
		(vii)	Bezprostřední zdroj:
			(B) Klon:	pCC18
		(ix)	znak:
			(A) Jméno/klíó:	CDS
			(B) Umístění:	2..652
		(xi)	Popis sekvence:	SEQ ID NO:18:
C ATG Met 1	ATG Met	AGA GCA Arg Ala	AGG GTT CCA CTC CTG Arg Val Pro Leu Leu 5	TTG CTG GGA ATT CTT Leu Leu Gly Ile Leu 10	TTC Phe 15

CTG Leu

GCA Ala

TCA CTT TCT GCT AGC TTT GCT AGT GCT ACC CAT ATC CCA GGG

94

Ser

Leu

Ser Ala 20

Ser Phe

Ala

Ser 25

Ala Thr His

Ile

Pro 30

Gly

CAC

TTG

TCA

CCA

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

142

His

Leu

Ser

Pro

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Ala

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

35

40

45

CAG

TAC

TGC

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

190

Gin

Tyr

Cys

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Val

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

55 60

ACC CTG ATG CTG CAG CAA CTG TTG GCC TCA CCG CTT CAG CAG TGC CAG 233 Thr Leu Met Leu Gin Gin Leu Leu Ala Ser Pro Leu Gin Gin Cys Gin

70 75

ATG CCA ATG ATG ATG CCG GGT ATG ATG CCA CCG ATG ACG ATG ATG CCG 286

Met Pro Met Met Met Pro Gly Met Met Pro Pro Met Thr Met Met Pro

85 90 95

ATG CCG AGT ATG ATG CCA TCG ATG ATG GTG CCG ACT ATG ATG TCA CCA 334

Met Pro Ser Met Met Pro Ser Met Met Val Pro Thr Met Met Ser Pro

100 105 110

ATG ACG ATG

GCT Ala 115

AGT ATG ATG

CCG Pro

CCG ATG ATG ATG CCA AGC ATG ATT

382

Met

Thr

Met

Ser

Met Met

Pro 120

Met Met

Met

Pro

Ser Met 125

Ile

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

ATG

CCG

ACC

430

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Ile

Met

Pro

Thr

130

135

140

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

478

Met

Met

Ser

Pro

Met

Ile

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

145

150

155

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

526

Pro

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

Met

Met

Thr

Val

Pro

160

165

170

175

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

574

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

Ile

Ser

His

Ile

Ile

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

180

185

190

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

622

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

Ala

Ile

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

195

200

205

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAGA

653

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

Phe

210

215

(2)

Informace

O .

SEQ

ID

NO:

19:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 31 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (c) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: in vitro syntetizovaná

DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:19:

TTCTGCTAGC TTTGCTACCC ATATCCCAGG G (2)

Informace o SEQ ID NO:20:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: (B) Typ:	647 párů bází nukleová kyselina
(C) Počet
řetězců:	jeden
(D) Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: genomová DNA (ix) znak:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 2..646 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:20:

C ATG ATG AGA GCA AGG GTT CCA CTC CTG TTG CTG GGA ATT CTT TTC 46

Met Met Arg Ala Arg Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Ile Leu Phe 15 10 15

CTG GCA TCA CTT

TCT Ser 20

GCT Ala

AGC Ser

TTT GCT

ACC Thr 25

CAT His

ATC CCA GGG CAC TTG

94

Leu

Ala

Ser

Leu

Phe

Ala

Ile

Pro

Gly

His 30

Leu

TCA

CCA

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

CAG

TAC

142

Ser

Pro

Leu

Leu 35

Met

Pro

Leu

Ala

Thr 40

Met

Asn

Pro

Trp

Met 45

Gin

Tyr

TGC

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

190

Cys

Met

Lys 50

Gin

Gin

Gly

Val

Ala 55

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp 60

Pro

Thr

Leu

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

CCA

238

Met

Leu 65

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala 70

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin 75

Cys

Gin

Met

Pro

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

286

Met 80

Met

Met

Pro

Gly

Met 85

Met

Pro

Pro

Met

Thr 90

Met

Met

Pro

Met

Pro 95

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

334

Ser

Met

Met

Pro

Ser 100

Met

Met

Val

Pro

Thr 105

Met

Met

Ser

Pro

Met 110

Thr

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT

TCA

CCA

382

Met

Ala

Ser

Met 115

Met

Pro

Pro

Met

Met 120

Met

Pro

Ser

Met

Ile 125

Ser

Pro

ATG ACG ATG CCG

AGT ATG

ATG CCT TCG ATG

ATA ATG CCG ACC ATG

ATG Met

430

Met

Thr Met 130

Pro

Ser

Met

Met

Pro 135

Ser

Met

Xle

Met

Pro 140

Thr Met

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

AGC

478

Ser

Pro

Met

Xle

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

145

150

155

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

CAA

TGT

526

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Aan

Met

Met

Thr

Val

Pro

Gin

Cys

160

165

170

175

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

CCA

TTC

574

Tyr

Ser

Gly

Ser

Xle

Ser

His

Xle

Xle

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe

180

185

190

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CAG

622

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

Ala

Xle

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

-

195

200

205

ccc

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAGA

647

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

Phe

210

215

(2) Informace o SEQ ID NO:21:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	31 párů bází
(B)	Typ:	nukleová kyselina
(C)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: in vitro syntetizovaná

DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:21:

ACTAATCATG ATGAGAGCAA GGGTTCCACT (2) Informace o SEQ ID NO:22:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 30 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců:

(D) Topologie:

(ii) Typ molekuly:

(xi) Popis sekvence:

GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA jeden lineární in vitro syntetizovaná DNA

SEQ ID NO:22:

(2) Informace o SEQ ID NO:23:

(i) Vlastnosti sekvence:

	(A) Délka: (B) Typ: (C) Počet	38 párů bází nukleová kyselina jeden lineární
(D)	řetězců: Topologie:
(ii)	Typ molekuly:	in vitro syntetizovaná
			DNA
(ÍX)	znak:
	(A)	Jméno/klíč:	CDS
	(B)	Umístění:	6..38
(xi)	Popis	i sekvence:	SEQ ID NO:23:

TGCTT GCT AGC TTT GCT ATG CCA ATG ATG ATG CCG GGT Ala Ser Phe Ala Met Pro Met Met Met Pro Gly 15 10 '

(2) Informace o SEQ ID NO:24:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	36 párů bází
(B)	Typ:	nukleová kyselina
(c)	Počet
	řetězců:	jeden
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: in vitro syntetizovaná

DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:24:

TGCTTTCTAG ACTATGGCAT CATCATTGGT GACACC ³⁶ (2) Informace o SEQ ID NO:25:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: (B) Typ: (C) Počet	352 párů bází nukleová kyselina
řetězců:	jeden
(D) Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: genomová DNA (ix) znak:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 2..346 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:25:

C ATG ATG AGA GCA AGG GTT CCA CTC CTG TTG CTG GGA ATT CTT TTC Met Met Arg Ala Arg Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Ile Leu Phe 15 10 15

CTG

GCA

TCA

CTT

TCT

GCT

AGC

TTT

GCT

ATG

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

Leu

Ala

Ser

Leu

Ser 20

Ala

Ser

Phe

Ala

Met 25

Pro

Met

Met

Met

Pro 30

Gly

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

Met

Met

Pro

Pro 35

Met

Thr

Met

Met

Pro 40

Met

Pro

Ser

Met

Met 45

Pro

Ser

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

Met

Met

Val 50

P ro

Thr

Met

Met

Ser 55

Pro

Met

Thr

Met

Ala 60

Ser

Met

Met

142

190

CCG	CCG	ATG	ATG	ATG	CCA	AGC	ATG
Pro	Pro 65	Met	Met	Met	Pro	Ser 70	Met
ATG	ATG	CCT	TCG	ATG	ATA	ATG	CCG
Met 80	Met	Pro	Ser	Met	Xle 85	Met	Pro
CCG	AGT	ATG	ATG	CCA	CCA	ATG	ATG
Pro	Ser	Met	Met	Pro	Pro	Met	Met

100

91 ATT Ile	TCA Ser	CCA ATG ACG ATG CCG AGT	238
Pro	Met 75	Thr	Met	Pro	Ser
ACC	ATG	ATG	TCA	CCA	ATG	ATT	ATG	236
Thr	Met	Met 90	Ser	Pro	Met	Ile	Met 95
ATG	CCG	AGC	ATG	GTG	TCA	CCA	ATG	334
Met	Pro 105	Ser	Met	Val	Ser	Pro 110	Met

352

ATG ATG CCA TAGTCTAGA

Met Met Pro

- 115 (2) Informace o SEQ ID NO:26:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) . Délka: (B) Typ: (C) Počet	3237 párů bází nukleová kyselina
řetězců:	j eden
(D) Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: genomová DNA (ix) znak:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1419..2444 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:26:

GTCGACTCTA	GAGGATCCAA	TTCCAATCCC	ACAAAAATCT	GAGCTTAACA	GCACAGTTGC	60
TCCTCTCAGA	GCAGAATCGG	GTATTCAACA	CCCTCATATC	AACTACTACG	TTGTGTATAA	120
CGGTCCACAT	GCCGGTATAT	ACGATGACTG	GGGTTGTACA	AAGGCGGCAA	CAAACGGCGT	180
TCCCGGAGTT	GCACACAAGA	AATTTGCCAC	TATTACAGAG	GCAAGAGCAG	CAGCTGACGC	240
GTACACAACA	AGTCAGCAAA	CAGACAGGTT	GAACTTCATC	CCCAAAGGAG	AAGCTCAACT	300
CAAGCCCAAG	AGCTTTGCTA	AGGCCCTAAC	AAGCCCACCA	AAGCAAAAAG	CCCACTGGCT	360
CACGCTAGGA	ACCAAAAGGC	CCAGCAGTGA	TCCAGCCCCA	AAAGAGATCT	CCTTTGCCCC	420
GGAGATTACA	ATGGACGATT	TCCTCTATCT	TTACGATCTA	GGAAGGAAGT	TCGAAGGTGA	480
AGGTGACGAC	ACTATGTTCA	CCACTGATAA	TGAGAAGGTT	AGCCTCTTCA	ATTTCAGAAA	540
GAATGCTGAC	CCACAGATGG	TTAGAGAGGC	CTACGCAGCA	GGTCTCATCA	AGACGATCTA	600
CCCGAGTAAC	AATCTCCAGG	AGATCAAATA	CCTTCCCAAG	AAGGTTAAAG	ATGCAGTCAA	660

AAGATTCAGG ACTAATTGCA TCAAGAACAC AGAGAAAGAC ATATTTCTCA AGATCAGAAG 720

TACTATTCCA GTATGGACGA	TTCAAGGCTT	GCTTCATAAA	CCAAGGCAAG	TAATAGAGAT	780
TGGAGTCTCT AAAAAGGTAG	TTCCTACTGA	ATCTAAGGCC	ATGCATGGAG	TCTAAGATTC	840
AAATCGAGGA TCTAACAGAA	CTCGCCGTGA	AGACTGGCGA	ACAGTTCATA	CAGAGTCTTT	900
TACGACTCAA TGACAAGAAG	AAAATCTTCG	TCAACATGGT	GGAGCACGAC	ACTCTGGTCT	980
ACTCCAAAAA. TGTCAAAGAT	ACAGTCTCAG	AAGACCAAAG	GGCTATTGAG	ACTTTTCAAC	1020
AAAGGATAAT TTCGGGAAAC	CTCCTCGGAT	TCCATTGCCC	AGCTATCTGT	CACTTCATCG	1080
AAAGGACAGT AGAAAAGGAA	GGTGGCTCCT	ACAAATGCCA	TCATTGCGAT	AAAGGAAAGG	1140
CTATCATTCA AGATGCCTCT	GCCGACAGTG	GTCCCAAAGA	TGGACCCCCA	CCCACGAGGA	1200
GCATCGTGGA AAAAGAAGÁC	GTTCCAACCA	CGTCTTCAAA	GCAAGTGGAT	TGATGTGACA	1260
TCTCCACTGA CGTAAGGGAT	GACGCACAAT	CCCACTATCC	TTCGCAAGAC	CCTTCCTCTA	1320
TATAAGGAAG TTCATTTCAT	TTGGAGAGGA	CACGCTCGAG	CTCATTTCTC	TATTACTTCA	1380
GCCATAACAA AAGAACTCTT	TTCTCTTCTT	ATTAAACC ATG AAA AAG CCT GAA	1433

Met Lys Lys Pro Glu 1 5

CTC Leu

ACC GCG ACG TCT

GTC GAG Val Glu

AAG Lys

TTT CTG

ATC Ile

GAA AAG TTC

GAC Asp 20

AGC Ser

1481

Thr Ala

Thr Ser 10

Phe

Leu 15

Glu

Lys

Phe

GTC

TCC

GAC

CTG

ATG

CAG

CTC

TCG

GAG

GGC

GAA

GAA

TCT

CGT

GCT

TTC

1529

Val

Ser

Asp

Leu

Met

Gin

Leu

Ser

Glu

Gly

Glu

Glu

Ser

Arg

Ala

Phe

25

30

35

AGC

TTC

GAT

GTA

GGA

GGG

CGT

GGA

TAT

GTC

CTG

CGG

GTA

AAT

AGC

TGC

1577

Ser

Phe

Asp

Val

Gly

Gly

Arg

Gly

Tyr

Val

Leu

Arg

Val

Asn

Ser

Cys

40

45

50

GCC

GAT

GGT

TTC

TAC

AAA

GAT

CGT

TAT

GTT

TAT

CGG

CAC

TTT

GCA

TCG

1625

Ala

Asp

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

Arg

Tyr

Val

Tyr

Arg

His

Phe

Ala

Ser

55

60

65

GCC

GCG

CTC

CCG

ATT

CCG

GAA

GTG

CTT

GAC

ATT

GGG

GAA

TTC

AGC

GAG

1673

Ala

Ala

Leu

Pro

Ile

Pro

Glu

Val

Leu

Asp

Ile

Gly

Glu

Phe

Ser

Glu

70

75

80

85

AGC

CTG

ACC

TAT

TGC

ATC

TCC

CGC

CGT

GCA

CAG

GGT

GTC

ACG

TTG

CAA

1721

Ser

Leu

Thr

Tyr

Cys

Ile

Ser

Arg

Arg

Ala

Gin

Gly

Val

Thr

Leu

Gin

90

95

100

GAC

CTG

CCT

GAA

ACC

GAA

CTG

CCC

GCT

GTT

CTG

CAG

CCG

GTC

GCG

GAG

1769

Asp

Leu

Pro

Glu

Thr

Glu

Leu

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Pro

Val

Ala

Glu

105

110

115

GCC Ala

ATG Met

GAT Asp 120

GCG ATC

GCT Ala

GCG GCC GAT

CTT AGC CAG ACG AGC GGG

TTC Phe

1817

Ala

Ile

Ala

Ala 125

Asp

Leu

Ser Gin Thr 130

Ser

Gly

GGC

CCA

TTC

GGA

CCG

CAA

GGA

ATC

GGT

CAA

TAC ACT ACA

TGG

CGT

GAT

1865

Gly

Pro

Phe

Gly

Pro

Gin

Gly

Ile

Gly

Gin

Tyr Thr Thr

Trp

Arg

Asp

135

140

145

TTC

ATA

TGC

GCG

ATT

GCT

GAT

CCC

CAT

GTG

TAT CAC TGG

CAA

ACT

GTG

1913

Phe

Xle

Cys

Ala

Ile

Ala

Asp

Pro

His

Val

Tyr His Trp

Gin

Thr

Val

150

-

155

160

165

ATG

GAC

GAC

ACC

GTC

AGT

GCG

TCC

GTC

GCG

CAG GCT CTC

GAT

GAG

CTG

1961

Met

Asp

Asp

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Val

Ala

Gin Ala Leu

Asp

Glu

Leu

170

175

180

ATG

CTT

TGG

GCC

GAG

GAC

TGC

CCC

GAA

GTC

CGG CAC CTC

GTG

CAC

GCG

2009

Met

Leu

Trp

Ala

Glu

Asp

Cys

Pro

Glu

Val

Arg His Leu

Val

His

Ala

185

190

195

GAT

TTC

GGC

TCC

AAC

AAT

GTC

CTG

ACG

GAC

AAT GGC CGC

ATA

ACA

GCG

2057

Asp

Phe

Gly

Ser

Asn

Asn

Val

Leu

Thr

Asp

Asn Gly Arg

Ile

Thr

Ala

200

205

210

GTC

ATT

GAC

TGG

AGC

GAG

GCG

ATG

TTC

GGG

GAT TCC CAA

TAC

GAG

GTC

2105

Val

Ile

Asp

Trp

Ser

Glu

Ala

Met

Phe

Gly

Asp Ser Gin

Tyr

Glu

Val

215

220

225

GCC

AAC

ATC

TTC

TTC

TGG

AGG

CCG

TGG

TTG

GCT TGT ATG

GAG

CAG

CAG

2153

Ala

Asn

Ile

Phe

Phe

Trp

Arg

Pro

Trp

Leu

Ala Cys Met

Glu

Gin

Gin

230

235

240

245

ACG

CGC

TAC

TTC

GAG

CGG

AGG

CAT

CCG

GAG

CTT GCA GGA

TCG

CCG

CGG

2201

Thr

Arg

Tyr

Phe

Glu

Arg

Arg

His

Pro

Glu

Leu Ala Gly

Ser

Pro

Arg

250

255

260

CTC

CGG

GCG

TAT

ATG

CTC

CGC

ATT

GGT

CTT

GAC CAA CTC

TAT

CAG

AGC

2249

Leu

Arg

Ala

Tyr

Met

Leu

Arg

Ile

Gly

Leu

Asp Gin Leu

Tyr

Gin

Ser

265

270

275

TTG

GTT

GAC

GGC

AAT

TTC

GAT

GAT

GCA

GCT

TGG GCG CAG

GGT

CGA

TGC

2297

Leu

Val

Asp

Gly

Asn

Phe

Asp

Asp

Ala

Ala

Trp Ala Gin

Gly

Arg

Cys

280

285

290

GAC

GCA

ATC

GTC

CGA

TCC

GGA

GCC

GGG

ACT

GTC GGG CGT

ACA

CAA

ATC

2345

Asp

Ala

Ile

Val

Arg

Ser

Gly

Ala

Gly

Thr

Val Gly Arg

Thr

Gin

Ile

295

300

305

GCC

CGC

AGA

AGC

GCG

GCC

GTC

TGG

ACC

GAT

GGC TGT GTA

GAA

GTA

CTC

2393

Ala

Arg

Arg

Ser

Ala

Ala

Val

Trp

Thr

Asp

Gly Cys Val

Glu

Val

Leu

310

315

320

325

GCC

GAT

AGT

GGA

AAC

CGA

CGC

CCC

AGC

ACT

CGT CCG AGG

GCA

AAG

GAA

2441

Ala

Asp

Ser

Gly

Asn

Arg

Arg

Pro

Ser

Thr

Arg Pro Arg

Ala

Lys

Glu

330 335 340

TAGTGAGGTA CCTAATAGTG AGATCCAACA CTTACGTTTG CAACGTCCAA GAGCAAATAG 2501

ACCACGACGC CGGAAGGTTG CCGCAGCGTG TGGATTGCGT CTCAATTCTC TCTTGCAGGA 2561

ATGCAATGAT GAATATGATA CTGACTATGA AACTTTGAGG GAATACTGCC TAGCACCGTC 2621

ACCTCATAAC GTGCATCATG CATGCCCTGA CAACATGGAA CATCGCTATT TTTCTGAAGA 2681 ATTATGCTCG TTGGAGGATG TCGCGGCAAT TGCAGCTATT GCCAACATCG AACTACCCCT 2741 CACGCATGCA TTCATCAATA TTATTCATGC GGGGAAAGGC AAGATTAATC CAACTGGCAA 2801 ATCATCCAGC GTGATTGGTA ACTTCAGTTC CAGCGACTTG ATTCGTTTTG GTGCTACCCA 2861

CGTTTTCAAT AAGGACGAGA TGGTGGAGTA AAGAAGGAGT GCGTCGAAGC AGATCGTTCA 2921

AACATTTGGC AATAAAGTTT CTTAAGATTG AATCCTGTTG CCGGTCTTGC GATGATTATC 2981 ATATAATTTC TGTTGAAŤŤA CGTTAAGCAT GTAATAATTA ACATGTAATG CATGACGTTA 3041 TTTATGAGAT GGGTTTTTAT GATTAGAGTC CCGCAATTAT ACATTTAATA CGCGATAGAA 3101

AACAAAATAT AGCGCGCAAA CTAGGATAAA TTATCGCGCG CGGTGTCATC TATGTTACTA 3161

GATCGATCAA ACTTCGGTAC TGTGTAATGA CGATGAGCAA TCGAGAGGCT GACTAACAAA 3221

AGGTACATCG GTCGAC 3237 (2) Informace o SEQ ID NO:27:

(i)

Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 4 (B) Typ: a (D) Topologie: 1 aminokyseliny aminokyselina lineární (ii)

Typ molekuly:

peptid (xi)

Popis sekvence: SEQ ID NO:27:

Met Met Met Pro 1 (2) Informace o SEQ ID NO:28:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A)	Délka:	4 aminokyseliny
(B)	Typ:	aminokyselina
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:28:

Lys Asp Glu Leu

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný a purifikovaný fragment nukleové kyseliny obsahující přinejmenším jednu nukleotidovou sekvenci, která odpovídá sekvenci SEQ ID NO: 2 kódující zásobní protein HSZ semen kukuřice nebo je s touto sekvencí v podstatě homologní.
2. 2. Izolovaný a purifikovaný fragment nukleové kyseliny obsahující přinejmenším jednu nukleotidovou sekvenci, která odpovídá sekvenci SEQ ID NO: 3 kódující zásobní protein HSZ semen kukuřice nebo je s touto sekvencí v podstatě homologní.
3. 3. Izolovaný a purifikovaný fragment nukleové kyseliny obsahující přinejmenším jednu nukleotidovou sekvenci, která odpovídá sekvenci SEQ ID NO: 4 kódující zásobní protein HMD semen kukuřice nebo je s touto sekvencí v podstatě homologní.
4. 4. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 2 operabilně připojený k signální sekvenci dvojdéložné rostliny.
5. 5. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 3 operabilně připojený k signální sekvenci rostliny.
6. 6. Chimérický gen, schopný způsobovat změněnou úroveň aminokyseliny s obsahem síry v transformovaných rostlinách, obsahující fragment nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 5, operabilně připojený k intracelulární lokalizační sekvenci a vhodné regulační sekvenci.
7. 7. Chimérický gen podle nároku 6, v němž je regulační sekvence zvolena ze souboru zahrnujícího regulační sekvence specifické pro semena.
8. 8. Chimérický gen, schopný způsobovat změněnou úroveň aminokyseliny s obsahem síry v transformovaných mikroorganismech, obsahující fragment nukleové kyseliny podle nároku 2 nebo 3, operabilné připojený ke vhodné regulační sekvenci.
9. 9. Mikroorganismus transformovaný chimérickým genem podle nároku 11.
10. 10. Polypeptidový produkt exprese fragmentu nukleové kyseliny podle nároku 1, 2 nebo 3 v prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buňkách.
11. 11. Způsob zvyšování obsahu aminokyseliny s obsahem síry v rostlinách, vyznačující se tím, že se

    a) rostlinná buňka transformuje chimérickým genem podle nároku 6;

    b) z transformované rostlině buňky se vypěstují fertilní, sexuálně dospělé rostliny; a

    c) u fertilních rostlin se provede selekce produkovaných semen potomstva na zvýšenou hladinu aminokyselin s obsahem síry vzhledem k netransformovaným rostlinných buňkám.
12. 12. Způsob produkce proteinu bohatého na aminokyseliny s obsahem síry v mikroorganismu, čující se tím, že se vyzná

    a) mikroorganismus transformuje chimérickým genem podle nároku 11;

    b) mikroorganismus se pěstuje za opdmínek vhodných pro expresi proteinu bohatého na aminokyseliny s obsahem síry; a

    c) izoluje se protein se stupně b).
13. 13. V podstatě čistý plasmid pCCIO obsahující fragment nukleové kyseliny podle nároku 1 a identifikovaný přírůstkovým číslem sbírky ATCC 68490.