SK87893A3 - A high sulfur seed protein gene and method for increasing the sulfur amino acid content of plants - Google Patents

Description

Oblast techniky í

Vynález sa týka chimerického génu schopného zaistil zvýšenú-hladinu aminokyselín s obsahom síry^sv transformovaných rastlinách a mikroorganizmoch. Ďalej sa vynález týka · ^: najmä spôsobu zvyšovania obsahu sírnych aminokyselín v rastlinách.

Doterajší stav techniky • 4

Svetový obrat s krmivami, ktoré zahŕňajú krmivá pre dobytok, hydinu, vodné živočíchy a zvieratá chované pre potešenie, činí asi 475 miliónov ton. V samotných USA sa spotrebuje 180 miliónov ton, pričom asi 67 % z tohto množstva tvorí kukurica /Zea mays L»/ a asi 10 % sója /Glycine max L./. Kukuričné a sójové produkty; sú tiež hlavným prvkom zahraničného , obchodu. Tieto dve plodiny sú agronomický dobre prispôsobené mnohým častiam USA a v USA je v Širokom rozsahu k dispozícii strojové vybavenie a zariadenie pre ich zber, skladovanie a spracovanie. Vzhiadom k tomu, že kukurica, sója a iné plodiny, ktoré sa používajú ako krmivá, sú v súčasnej dobe predávané ako komodity, existuje výborná príležitosl zvýšil • t nutričnú kvalitu ich proteínov, a tak zvýši.t ich hodnotu pre amerického farmára a povzbudil zahraničný obchod.

tudská potrava a krmivá pre zvieratá, ktoré sú získané z mnohých zrnín, majú nízky obsah sírnych aminokyselín; t.j. metionínu a cysteínu, ktoré sú potrebné pre výživu živočíchov. V kukurici sú sírne aminokyseliny na trelom mieste, po lyzíne a tryptofáne, ako faktor obmedzujúci ich použitie í ' .

' - 2 Í!

í r

í ' . ·.

1* · h;.

| v krmivách, s ohladom na diétne požiadavky mnohých zvierat.

I Použitie sójovej múky, ktorá je bohatá na lyzín a tryptofán, ž' ' ako; prísady ku kukurici v krmivách, je obmedzené nízkym ob| sahom sírnych.aminokyselí v tejto strukovine. Zvýšenie obsa| ' hu sírnych aminokyselín budv kukurici alebo v.sóji by zlepšilo

4'·

J nutričnú.kvalitu výsledných zmesí a znížilo nutnosi používal ví ďalšie krmivové prísady pre dodanie nákladnéjšieho metionínu.

IS‘ : f ’ . .

$ ¹ : Pokusy zlepšit obsah sírnych aminokyselín v plodinách ich krížením sa stretli v laboratórnom meradle, a nezaI ' znamenali žiadny obchodný úspech. Mutantná kukuričná línia so zvýšenou koncentráciou metionínu v celom jadre bola izolovaná z kukuričných buniek pestovaných v kultúre prostredníctvom

I selekcie na rast za prítomnosti inhibičných koncentrácií ly;·] ’ zínú plus treónínu /Phillips a ďalší /1985/ Ceréal Chem. 62:

’j 213^ až 218/. Z tejto línie však až doteraz neboli odvodené '?[ žiadne agronomický vhodné kultivary pre obchodné uplatnenie, q sójové buníové.; línie so zvýšenou intracelulárnou koncentrá:’j ciou metionínu boli izolované selekciou na rast za prítomnos_; j ' ti metionínu /Madison and Thomson /1988/ Plánt Celí Reports ,¹· 7: 472 až 276/, ale z týchto línií neboli regenerované rast/ . liny.

í Obsah aminokyselín v semenách je určovaný predovšetkým zásobnými prdteínmi, ktorých syntéza prebieha počas vývo- ja semena. Tieto proteíny slúžia ako hlavná nutričná rezerva počas klíčenia. Množstvo proteínu v semenách kolíše v rozmed · dzí: od asi 10 % /vzhladom na sušinu/ v obilninách do asi 20 •í až 40 % /vzhladom na sušinu/ v strukovinách. V mnohých serne; 1 j náchčiní celkový obsah zásobného proteínu 50 % alebo viac.

J Vzhladomk ich velkému výskytu, boli to práve zásobné proteíny v semenách, ktoré boli ako prvé proteíny izolované. Iba neV. dávno však boli za použitia techník-miolekulovej genetiky sta>· novené sekvencie aminokyselín niektorých z týchto proteínov.

fd Tieto techniky tiež poskytli .informácie o genetických signá1och, ktoré kontrolujú expresiu, špecifickú vzhladom k semenu a intracelulárne zacielenie týchto proteínov.

z

Bol identifikovaný rad rastlinných zásobných proteínov, ktoré sú bohaté na síru a boli izolované zodpovedajúce gény,, riadiace ich tvorbu. Z kukurice bol izolovaný gén pre .

ý proteíny 15kD zeín, ktorý obsahuje 11 % metionínu a 5 % cysteínu /Pedersen a další /1986/ J· Biol. uhem. 261: 6279 až 6284/ a gén pre proteín 10kD zeín, ktorý obsahuje 23 % metionínu a 3 % cysteínu /kirihara a další /1988/ Mol. Gen.

až 484} Kirihara a další /1988/ Gene 71: 359 až * tiež izolované dva gény z hrachu pre albumíny v júce jednak 8 % a jednak 16 % cysteínu /Higgins 'J. Biol. chem. 261: 11124 až 11130./· Ďalej bol izolovaný gén z . para orechov pre albumín 2S v semene, Ictorý obsahuje 18 % metionínu a 8 % cysteínu /Altenbach a další /1987/ Plánt Mol.

Biol. 8: 239 až 2507· A nakoniec, z ryže bol izolovaný gén kódujúci lOkD prolamín v semene, ktorý obsahuje 19 % metionínu á 1C % cysteínu /Masumura a další /1989/ Plánt Mol. Biol. 12: 123 až 130/. · '

Gene't. 21: 477 370/. Boli semene obsahua další /1986/ •J

J ľ Existuje mnoho správ o exoresii génov pre zásobné proteíny v semenách transgénnych rastlín. Albumín 2S z vysokým obsahom síry, ktorý pochádza z para orechov, bol exprimovaný v semenách transformovaného tabaku pod kontrolou regulačných sekvencií génu pre zásobný proteín, fazeolín, vo fazuli. Proteín. bol účinne vyrobený od 17kD prekurzora k 9kD a 3kD podjednotkám maturovaného natívneho proteínu. Akumulácia proteínu, bohatého na metionín v semenách tabaku sa prejavila až 30 % zvýšením obsahu metionínu v semenách /Altenbach a další /1989/ Plánt Mol. Biol. 13: 513 až 522/· Chimerické gény pripájajúce kódujúce oblasti génov pre zásobný proteín semena kukurice, a to pre 19kD a 23kD zeíri k promótoru 35S mozaikového vírusu karfiolu boli exprimované vo velmi nízkej koncentrácii v semenách, ako aj koreňoch a listoch transformovaného tabaku /Schernthaner a další /1988/ EMBC J; 7: 1249 až 1255?· ?^Tahrae i; : · - 4 V - .

^denie regulačných oblastí jednoklíčnych rastlín /promótora a j- terminátora transkripcie/ regulačnými oblasťami, ktoré sú špecifické pre semená dvojklíčnych rastlín/ malo za následok níz;ί' ku hladinu expresie, špecifickej vzhladom k: semenám, l?kD zeínu v transformovanej petúnii /Williamson a další /1988/ Plánt ť Physiol. 88: 1002 až 1007/ a tabaku /Ohtani a další /1991/ j Plánt Mol. Biol. 16: 117 až 128/· V inom prípade bola v trans7 formovanom tabaku zistená pre semená špecifická expresia 15kB

H· •f zeínu bohatého na síru a signálna sekvencia jednoklíčneho ;;.j , prekurzora bola tiež správne vyrobená /Hoffman a další /1987/ ä ’ ’ EMBO J- 6: 3213 až 3221/» ’ ή: '* >·' pre zvýšenie obsahu sírnych aminokyselín v semenách íj .‘v ' , í ,-] je dôležité izolovat gén alebo gény kódujúce zásobné proteíny v semenách, ktoré sú bohaté na sírne aminokyseliny, metionín a ?í cysteín. Metionínu; sa dáva prednosť pred cysteínom, pretože j väčšina zvierat je schopná premeniť metionín na cysteín, ale nie cysteín na metionín. Je žiadúce, aby bol zásobný proteín íl kompatibilný so zásobnými proteínmi cieľovej plodiny. Ďalej je :í žiadúce, aby proteín pochádzal zo zdroja, ktorý je všeobecne považovaný za bezpečný v krmivách.

/·; ϊ ' :

• / podstata vynálezu ' V; · I'^-’·· ’ ' Bol objavený spôsob, ako zvýšiť obsah sírnych amino/ ' kyselín v semenách. Za použitia génu pre zeín s vysokým obsa’ hom síry /HSZ/ je možné vytvoril chimerické gény, ktoré ša dajú použiť na transformáciu rôznych plodín, za účelom zvýšenia obsahu sírnych aminokyselín v ich semenách alebo listoch. Kon?í krétne, jedným aspektom tohto vynálezu je fragment nukleovej / kyseliny obsahujúci nukletidovú sekvenciu kódujúcu HSZ zásobný i . I

J ií ú

ď proteín kukurice, ktorý zodpovedá sekvencii označenej SEQ ID .j NO:2 alebo akúkolvek nukleotidovú sekvenciu, ktorá je s ňou v j podstate homológna. Inými aspektami vynálezu sú fragmenty | nukleovej kyseliny kódujúce maturovaný HSZ proteín /SEQ ID

Í, NO:3/ a doménu s vysokým obsahom metionínu /HMD/ HSZ zásobné/1 ho proteínu kukurice /SEQ ID MO:4/.

j ' ^; <

/·] predmetom vynálezu sú tiež chimerické gény, ktoré sú schopné expresie v transformovaných rastlinách a ktoré obsaϊ·| hujú ktorékoívek z vyššie uvedených fragmentov nukleovej kyseliny operabilne pripojené k regulačným sekvenciám. Prednost sa dáva chimerickým génom, ktoré operabilne pripájajú frag.N , menty nukleovej kyseliny k promótorom špecifickým pre semená

-•j * / .

/j alebo promotorom -aktívnym v listoch kukurice alebo so je.

' 7 λΛ*}

Predmetom vynálezu sú äalej chimerické gény, ktoré 'sú schopné expresie v transformovaných mikroorganizmoch, prednostne E· coli, za účelom produkcie proteínov s vysokým ú ' obsahom síry. ;

v Ešte dalším predmetom vynálezu sú hostiteíské bunky y transformované chimerickými génmi, za'účelom produkcie proteínov s vysokým obsahom síry.

'Λ· ’ ? Ešte dalším predmetom vynálezu sú transformované * rastliny a semená, ktoré sú z nich získané a ktoré obsahujú •J ktorékolvek z vyššie uvedených fragmentov nukleovej kyseliny.

’Ί prednost sa dáva rastlinám a semenám z nich získaným, ktoré sú zvolené zo súboru zahŕňajúceho kukuricu, sóju, repku, tabak a ryžu.

Ďalším aspektom vynálezu sú mikroorganizmy transformované vyššie .uvedenými chimerickými génmi..

ľ

Do rozsahu vynálezu tiež spadajú spôsoby zvyšovania obsahu sírnych aminokyselín v rastlinách a pomocou Agrobacterium tumefaciens sprostredkované spôsoby získavania rastlín, ktoré sú schopné produkoval proteíny s vysokým obsahom síry. Nakoniec sú predmetom vynálezu tiež spôsoby získavania proteínu bohatého na sírne aminokyseliny v mikroorganizmoch.

Vynález je bližšie objasnený . v nasledujúcom podrobnom popise, v ktorm sa požívajú odkazy na pripojené obrázky a popisy sekvencií. Popis sekvencií obsahuje trojpísmenôvé kódy pre aminokyseliny, v zmysle definície uvedenej v 37 C·F·R* 1.822· Uvedená citácia predstavuje náhradu za prenesenie celého jej obsahu do popisu tohto vynálezu.

SEQ ID MO:1 ukazuje nukleotidovú sekvenciu /2123 bp/ HSZ génu v kukurici a predvídanú sekvenciu aminokyselín primárneho translačného produktu, Nukleotidy 753 až 755 predstavujú predpokladaný translačný iniciačný kodón a nukleotidy 1386 až 1388 predstavujú predpokladaný kodón terminácie translácie. Nukleotidy 1 až 752 zahŕňajú predpokladanú 5 regulačnú sekvenciu a nukleotidy 1389 až 2123 zahŕňajú predpokladanú 3'regulačnú sekvenciu.

- Λ

SEQ ID NO: 2 ukazuje prednostnú nukleotidovú sekvenciu podlá tohto vynálezu. Táto sekvencie zahŕňa fragment DNA /635 bp/ zahŕňajúci iba kódujúcu oblasl HSZ, ktorá môže byt ’ izolovaná štiepením reštrikčnou endonuleázou za ,použitia Nco I /S'Í-UCATGG/ až Xba I /5'-TCTAGA/· Dve miesta Nco I, ktoré boli prítomné v natívnej kódujúpej oblasti HSZ, boli eliminované miestne orientovanou mutágenézou bež toho, aby bola zmenená kódovaná sekvencia aminokyselín.

SEQ ID NO:3 ukazuje prednostnú nukleotidovú sekvenciu podlá tohto vynálezu. Táto sekvencia zahŕňa fragment DNA

- 7 - . A · /579 bp/ zahŕňajúci iba kódujúcu, oblasť maturovaného HSZ proteínu, ktorá môže byť izolovaná štiepením reštrikčnou endonukleázou za použitia BspH I /5'-TCATGA/ až Xba I /5'-TCTAGA/· Dve miesta nco I, ktoré boli prítomné v natívnej kódujúcej oblasti.HSZ, boli eliminované miestne orientovanou mutagenézou bez toho, aby bola zmenená kódovaná sekvencia aminokyselín.

SEQ ID NO:4 predstavuje nukleotidovú a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu génu HMD.

SEQ ID N0:5 predstavuje DNA sekvenciu kukuričného génu pre lOkD zeín /Kirihara a ďalší /1988/ Mol. Gen. Genet. 21: 477 až 484; Kirihara.a ďalší /1988/ Gene 71; 359 až 370/

SEQ ID NO:6 a 7 boli použité v príklade 1 pre skríning knižnice kukurice na gén pre lOkd zeín s vysokým obsahom metionínu.

SEQ ID N0:8 a 9 boli použité v príklade 2 pre mutagenézu génu HSZ·

SEQ ID N0:10 a 11 boli použité v príklade 2 pre vytvorenie formy HSZ génu s alternatívnymi jedinými endonukleázovými miestami.

SEQ ID NO:12 a 13 boli použité v príklade 2 pre vytvorenie génu kódujúceho maturovanú formu HSZ·

SEQ ID N0-.14 a 15 boli použité v príklade 5 ore konštrukciu génu kódujúceho HMD z HSZ·

SEQ ID NO:16 až 21 boli použité v príklade 6 ore konštrukciu chimerických génov pre expresiu HSZ v rastlinách.

’>· . SEQ ID NO: 22 boli neužité v príklade 7 pre analýzu transformantov tabaku s chimerickými génmi pre fazeolín-HSZ.

SEQ ID NO:23 j 24 3 25 boli použité v príklade 10 pre konštrukciu chimerických génov pre expresiu HMD v rastlinách.

SEQ ID NC:26 predstavuje chimerický*gén, ktorý sa skladá z promótora 35S z mozaikového vírusu karfiolu /Odeli a ďalší /1985/ Náture 3I3: 810 až 812.A génu pre hygromycín fosfotransferázu z plazmidu pJP225^,’/z E·, coli/ /Gritz a ďalší /1983/ Gene 25*. 179 až 188/ a 3 oblast génu pre nopalín . syntetázu z T-DNA Ti plazmidu z Agrobacteri.um tumefaciens, ktorý sa používa ako selekčný genetický marker ore transformáciu sóje v príklade 11. / ‘ SEQ ID NC:27 predstavuje centrálnu oblasí HSZ oroteínu.

r

SEQ ID NC:28 predstavuje aminokyselinovú sekvenciu Dre retenciu nroteínov v lumene endoplastického retikula.

Prehlad obr. na výkresoch

Na obr'. 1 je uvedené porovnanie aminokyselinových sekvencii 10kD zeínu /SEQ ID N0:5/ a ^T'SZ /SEQ ID N0:2/. Používajú sa v nom jednopísmenové kódy pre aminokyseliny. Domény s vysokým obsahom metionínu v obidvoch Droteínoch sú podčiarknuté. Vertikálne Čiary na obr. 1 ukazujú totožné aminokyselinové zvyšky v obidvoch proteínoch.

i 'W t•i

Na obr. 2 ktorý je špecifický vzhladom pre konštrukciu chimerických je znázornená pre gén, užitočné v transgénnych rastlinách.

schéma k

génov ore i

exprimačných kaziet semenu, ktoré sú éxoresiu HSZ . Ma obr, 3 vektora pZS97K· je znázornená mapa binárneho plazmidového

Na obr. 4 je znázornená mapa binárneho plazmidového vektora pZS97·

Predmetom vynálezu sú teda fragmenty nukleovej kyseliny kódujúce kukuričný zeín s; vysokým obsahom síry /HSZ/ ako zásobný proteín v semenách, áČLWo doménu s vysokým obsahom metionínu odvodenú od HSZ· Obidva tieto elementy sú neobvykle bohaté na aminokyselinu metionín.

HSZ proteín sa skladá z centrálnej oblasti, ktorá je velmi bohatá na metionín /približne 48 % metionínových zvyškov/, lemovanej aminoterminálnou a karboxyterminálnou oblastou. posledné uvedené lemovacie oblasti majú nízky obsah metionínu /aminoterminálne oblast - 10 karboxyterminálna oblasí - 7 % metionínu/. Centrálna oblast sa skladá z variácií opakujúceho sa motívu Met-Met-Met-Pro /SEQ ID NO: 27/· Príbuzný proteín, lCkD zeín, má podobnú, ale odlišnú štruktúru /viä obr. 1/. Centrálna oblasí HSZ proteínu je asi 2x tak velká než zodpovedajúca oblast lCkD zeínu, čo má za následok zvýšenie obsahu metionínu v HSZ· Zjavná duplikácia centrálnej domény s vysokým obsahom metionínu /FMD/ v HSZ, v Dorovnaní s 10kD zeínom naznačuje, ža by mohla mal centrálna doména s vysokým obsahom metionínu stabilnú štruktúru a mohla by sa sama exprimovať, za vzniku zásobného Droteínu s vysokým obsahom metionínu.

i

1C -

,4<:’ ’ ’’

ľ.>'

Zavedenie chimerického génu obsahujúceho regulačné sekvencie pre zásobný proteín semena a sekvenciu kódujúcu zásobný proteín bohatý na metionín predstavuje prostriedok pre zlepšenie nutričnej kvality semien plodín. Zvýšenie obsahu metionínu v semenách bude určované »a/ úrovňou exoresie chimerického génu v ,transformovanej plodine, ktorá sčasti závisí nod použitých éxprimačných signálov špecifických pre semená, b/ od obsahu metionínovych zvyškov v oblasti kódujúcej zásobný proteín semena, c/ od stability zavedeného proteínu v semene transformovanej^; plodiny, ktorá sčasti závisí od jeho vhodnej výroby, intracelulárneho zacielenia, niekedy od zabudovania do štruktúr vyššieho rádu a od schoDnosti vzdoroval desikácii a d/ od kompatibility zavedeného proteínu s natívnymi proteínmi semena transformovanej Dlodiny.

Prenos fragmentov nukleovej kyseliny nodla vynálezu s vhodnými regulačnými sekvenciami do živej bunky bude mat za následok produkciu alebo nadprodukciu proteínu. Prenos _r

V · fragmentov nukleovej kyseliny podlá vynálezu do rastliny, najmä kukurice, sóje alebo repky olejnej, s vhodnými regulačnými sekvenciami pre orientáciu expresie proteínu do semien, môže maí. za následok zvýšenie koncentrácie sírnych aminokyselín, najmä metionínu a môže tak prispieť k zlepšeniu nutričnej kvality proteínu semien pre zvieratá.

V kontexte tohto popisu sa používa rad termínov, ktoré budú teraz vysvetlené. Termín nukleová kyselina sa používa pre velkú molekulu, ktorá môže byi jednoretazcová alebo dvojreiazcová a skladá sa z mcnomérov /nukleotidov/, obsahujúcich cukor,, fosfát a bud purín alebo pyrimidín. Termínom fragment nukleovej kyseliny sa označuje čast danej molekuly nukleovej kyseliny. U vyšších rastlín predstavuje deo'xyribonukleová kyselina /TMA/ genetický materiál, zatial čo ribonukleová kyselina /RNA/ sa podiele na prenose informácií v DNA do proteínov. Termín genóm «označuje celý gene11 ' tický materiál obsiahnutý v každej bunke organizmu. Termínom nukleotidová sekvencia sa označuje polymér DNA, alebo RNA, ktorý môže byl jednorelazcový alebo dvojrelazcový a ktorý . prípadne obsahuje syntetické, neprirodzené alebo pozmenené nukleotidové bázy, ktoré môžu byl zabudované do polymérov DNA alebo KNA· i Termínom homológny s sa označuje komplementarita j medzi nukletidovými sekvenciami dvoch molekúl nukleovej· ky| seliny alebo medzi aminokyselinovými sekvenciami dvoch rnolej * kúl proteínu. Odhady takej homológie poskytuje bučí DNA-DNA j , .

alebo DNA-PNA· hybridizácia za podmienok vysokej strigencie, ako je to dobre známe ^odborníkom v tomto obore /vid napríklad Hames a Higgins /red./ Nucleic Acid Hybridisation, IRL· j Press, Oxford, Velká tjritánia/ alebo porovnanie podobnosti i sekvencií medzi dvoma nukleovými kyselinami alebo proteínmi.

Termín v podstate homológny sa vztahuje k molekuj lám nukleovej kyseliny, ktoré na hybridizáciu vyžadujú menej

J . ' · ' strigentné podmienky,' nežj’sú podmienky potrebné u homológ:.j nych sekvencií a tiež sa vztahuje ku kódujúcej DNA sekvencií ktorá môže zahŕňal zmeny báz,, ktoré nespôsobujú zmenu v kódovanej aminokyseline alebo ktorá zahŕňa zmeny báz, ktoré môžu pozmeňoval jednu alebo viac aminokyselín, ale ktoré ne. . ovplyvňujú funkčné vlastnosti proteínu kódovaného sekvenciou

DNA· Fragmenty nukleovej kyseliny charakterizované v tomto popise teda zahŕňajú molekuly/ v ktorých sú. obsiahnuté možné i variácie nukleotidových báz, ku ktorým dochádza deléciou, í prešmykom, štatistickou alebo regulovanou mutagenézou frag. < mentu nukleovej kyseliny a dokonca i príležitostnými omylmi

Ί T.

•j v nukletidovéj sekvencií, za predpokladu, že sú tieto sekve, cie v podstate homológne.

j .

•j Pod označením génsa rozumie fragment nukleovej í kyseliny, ktorý exprimuje špecifický proteín. Kódujúca oblast tohto génu predchádza nekódujúce 5'regulačné sekvencie a nasleduje nekodujúce 3'regulačné sekvencie. Pod označením gén sa rozumie gén, tak ako sa nachádza v prírode, so svojimi vlastnými regulačnými oblasťami. Pod označením chimerický gén sa rozúmie gén, ktorý obsahuje heterogénne re-.. gulačné a kódujúce sekvencie. Pod označením endogénny gén sa rozumie natívny gén, ktorý sa normálne nachádza v genóme na svojom prirodzenom mieste. Pod označením cudzí gén sa rozumie gén, ktorý sa normálne v hostitelskom organizme nevyskytuje, ale ktorý je zavedený génovým prenosom /transfe.-. rom/.

Pod označením kódujúca sekvencia sa rozumie sekvencia DNA, ktorá kóduje špecifický proteín a vylučuje nekódujúce sekvencie. Môže tvorit neprerušovanú kódujúcu sekvenciu t. j. sekvenciu,neobsahujúcu intron, ako je to u cDNA, alebo môže obsahoval jeden alebo viac intronov viazaných vhodnými spojmi zostrihu, intron je sekvencia RNA, ktorá je transkribovaná v primárnom transkripte, ale ktorá «sa odstráni odštiepením a re-ligáciou RNA do bunky, za vzniku maturovanej mRNA, ktorá Sa môže preložil dp proteínu.

Iniciačný kodón a terminačný kodón sú jednotky troch susedných nukleotidov v kódujúcej sekvencii, ktoré charakterizujú iniciáciu a termináciu reťazca pri syntéze proteínu /translácia mRNA/· otvorený čítací rámec predstavuje aminokyselinovú sekvenciu kódovanú medzi kodonom iniciácie translácie a kodónom términácie translácie kódujúcej sekvencie.

Transkritp RNA” predstavuje produkt, ktorý sa získa transkripciou sekvencie DNA, ktorá je katalyzovaná RNA polymerázou. Ak je transkript RNA dokonalou komplementárnou kópiou sekvencie DNA, označuje sa ako primárny transkript; alebo sa môže jednal o sekvenciu RNA získanú posttranskripčnou úpravou primárneho transkriptu a v tomto prípade sa

- 13 i , jedná o tzv. maturovanú RNA. Yediátorová HNA /mRNA/ predstavuje- RNA neobsahujúcu introny, ktorú je možné preložil do proteinu bunkou. Termínom cDNA sa označuje dvojreťazcová

i. DNA, ktorá je komplementárna k mRNA a je od nej odvodená.

Pod pojmom regulačné sekvencie sa rozumejú nukleotidové sekvencie umiestnené pre /5'/, vnútri a/alebo za /3'/ kódujúcou sekvencou, ktoré kontrolujú transkriDciu a/alebo expresiu kódujúcich sekvencií, potenciálne v súčinnosti s biosyntetickým aparátom bunky pre syntézu proteinu. Tieto nukleotidové sekvencie zahŕňajú sekvenciu promotora, vedúcu sekvenciu translácie, terminačnú sekvenciu transkripcie a poly-’ adenylačnú sekvenciu.

·> . ·) í

Pod pojmom promótor sa rozumie sekvencia DNA v gé- tne, obvykle umiestnená pred /?'/ kódujúcou sekvenciou, ktorá kontroluje expresiu kódujúce sekvencie tým, že umožňuje rozpoznanei pre RNA polymerázu a, iné faktory potrebné pre správnu transkripciu. Promótor môže tiež obsahoval sekvencie DNA, ktoré sa podielajú na väzbe faktorov proteinu kontrolujúcich účinnosl iniciácie transkripcie v odpovedi na fyziologické ^! podmienky alebo podmienky vývoja. Tiež môže obsahoval prvky enhaceru /zosilňovača transkripcie/.

* Enhacer /zosilňovač transkripcie/ predstavuje sekvenciu DNA, ktorá môže stimuloval aktivitu promótora. Môže sa • jednal o vlastný prvok promotora alebo o heterblógny prvok, ktorý je inzertovaný za účelom zosilnenia aktivity promótora a/alebo zvýšenie špecifickosti voči tkanivu. Konštitutívne promótory sú promotóry, ktoré riadia expresiu génu vo všetkých tkanivách a v každom čase. Promotory špecifické voči orgánu alebo špecifické voči vývoju sú oromótory, ktoré riadia expresiu génu takmer výlučne v špecifických orgánoch, ako sú listy alebo semená alebo v špecifickom vývojovom

- 14 ý · : _t i ' V i' *' Í t štádiu orgánu, ako pri skorej alebo neskorej embryogenéze, f ···')·

A ’ v •J i _ .|\· « -t

Pod pojmom expresia sa rozumie produkcia prdteínoV vého produktu kódovaného génom. Nadexpresia sa vztahuje k í produkcii génového produktu v transgénnych organizmoch, ktorá prevyšuje úroveň produkcie v normálnych alebo netransformovaných organizmoch.

Pod označením 3 nekódujúce sekvencie sa rozumie časí sekvencie DNA génu, ktorá obsahuje terminačný signál ŕ- pre transkripciu, polyadenyiačný signál a akýkolvek iný régufí lačný signál, ktorý je schopný ovplyvniť tvorbu mRNA alebo

Ϊ] expresiu génu. Polyadenyiačný signál je obvykle charakterisj tický tým, že ovplyvňuje adíciu traktov polyadenylovej kyse•.j , liny ku 3 koncu prekurzora mRNA·

Pod označením 5 nekódujúca sekvencia sa rozumie časí sekvencie DNA génu, ktorá obsahuje promótorovu sekvenciu a vedúcu sekvenciu translácie.

: í t- \ ’ j , Vedúca sekvencia translácie predstavuje Čast sekĹ vencie DNA génu medzi promótorom a kódujúcou sekvenciou, ktoJ rá je transkribovaná do RN'A a je prítomná v úolne vyrobenej

J nRMA‘ pred koncom a' koaónu pre začiatok translácie. Vedúca

/.H · sekvencia translácie môže ovplyvňoval úpravu primárneho transkriptu na mRNA, stabilitu alebo účiňnost translácie.

ľ · 'ý Saturovaný 'proteín predstavuje polypeptid uuraveL. ný po translácii bez jeho signálneho..peptidu. prekurzorový proteín označuje primárny produkt translácie mRNA. Signálny < peptiď' predstavuje aminoterminálnu extenziu polypeptidu, ktoL rá sa prekladá v spojitosti s tvorbou polypeptidu a ktorá je ý, potrebná pre jeho vstup na sekretorickú dráhu. Pod označením ' ¹ < u'·’.· ife- äwŕ s .

• r.

signálna sekvencia sa rozumie nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje signálny peptid.

; ' ľ ·

Pod označením intracelulárna lokalizačná sekvencia sa rozumie nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje intracelulárny cieľový /recipientný/ signál. Pod označením intracelulárny cieíový signál sa rozumie sekvencia aminokyselín, ktorá sa prekladá v spojení s proteínom a orientuje ho do konkrétneho subcelulárneho kompartmentu. Pod označením ER /endoplazmické retikulum/ stop tranzit' signál sa'.rozumie karboxyterminálna extenzia polypeptidu, ktorá sa prekladá v soojení s polypeptidom a spôsobuje, že proteín vstupujúci na sekretoŕovú dráhu zostáva zachovaný v ER. ER stop tranzit sekvencia predstavuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje ER cielový signál. Iné intracelulárne sekvencie kódujú čielové signály aktívne v semenách a/alebo listoch a vakuolové cielové signáp iy. ·.„ »·,.·.

-Ϊ f i ^:· . '^!

Pod označením*transformácia sa tu rozumie Drenos /transfer/ cudzieho génu do genómu hostiteľského organizmu a zaistenie jeho geneticky stálej dedičnosti. Ako príklady metód transformácie rastlín je možné uviest transformáciu surostredkovan.ú Agrobacterium a tŕansformačnú techniku, pri ktorej sa používajú urýchlené častice alebo tzv. génová puška .

. . Rekombinačné techniky ^rNA ponúkajú možnosí ‘zvýšenia obsahu sírnych aminokyselín v clodinách. Ako najmä užitočné techniky je možné uviesí: a/ metódy molekulového klonovania a in vitro manipulácia génov /vid Sambrook ä další /1989/ Molecular Cloning: A. Laboratory Manuel, Cold Spring Harbor Latíoraťory Press/, b/ zavádzanie transformácií do nolnohospodársky dôležitých plodín, ako jé^sója /Chee a další /1989/. Plánt Physiol. 91: 1212 až 1218} Ohristou a další /1989/ Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 75CO až 7504; Finchee a další /1989/ Biotechnology 6: 915 až 922; EP 0 3C1 749 A27, reoka e

olejná /De Block a další /1989/ Plánt Physiol. 91: .694 až 701/ a kukurica /Gordon-Eamm a další/1990/ Plánt Celí 2: 603 až 618; Fromm a další /1990/ Biotecnology 8:· 833 až 839/ a c/ vzhladom k semenám špecifickú expresiu zavedených génov v v transgénnych rastlinách /vid Goldberg a další /1989/ Celí 56: 149 až 160; Thompson a Larkins /1989/ BioEssays 10: 108 až 113/· Aby bolo možné použiť tieto technológie pre vyvinutie plodín so zvýšeným obsahom sírnych aminokyselín, je dôležité identifikovať a izolovať obchodne dôležité gény.

Rôzne roztoky, ktoré sa používajú pri experimentálnych manipuláciách, sú označované ich bežnými názvami, ako je SSC, SSPE, Denhartov roztok atd. Zloženie týchto roztokov je možné nájsť v dodatku B príručky Sambrook a ďalší /Molecular Cloning: Ä Laboratory Manual, druhé vydanie /1989/, Cold Spring Harbor Laboratory Press/.

Klonovanie kukuričného génu HSZ

Na základe znalosti publikovanej sekvencie DNA /SEQ ID NO:5/ génu pre lOkD zeín kukurice /Kirihara a další /1988/ Mol. Gen. Genet. 21: 477 až 484; Kirihera a další /1988/ Gene, 71: 359 až 370/ boli zostrojené oligonukleoťidy /SEQ ID NC:6 a ?/ pre použitie ako prímery pri reťazovej reakcii iniciovaz nej polymerázou /PCR/ za použitia genomcvej kukuričnej DMA

t. ' ako templátu. Produkt PCR reakcie sa izoluje z agarozového gélu a rádioaktívne označí nick transláciou /posunom jednoreťazcového zlomu/ pre použitie ako hybridizačnej próby. Genómová knižnica DNA kukurice vo vektore lambda-EMBL-3 bola zakúpená od firmy Clontech a plaky boli podrobené skríningu pomocou FCR-vytvorene j próby. Očakávalo sa, že sa tak izoluje celá dĺžka génu pre lCkD zeín, včítane jeho 5'a 3'regulačných oblastí.

- 17'. η . * ¹

Vyčistia sa dva hybridizačné lambda plaky a klonovaný fragment DNA kukurice sa dalej charakterizuje. Štiepenie reštrikčnou endonukleázou a elektroforéza na agarózovom géle ukazuje, že tieto dva klony sú identické. Fragmenty DNA z agarózového gélu sa prenesú technikou Southern blot na membránové filtre z nitrocelulózy a skúšajú sa rádioaktívne označenou DNA pre lOkD zeín, vyrobenou Nick-transláciou. Jediný 7,5 kb fragment BamH I a jediný l,4kb fragment Xba I sa hybridizujú k próbe. Tieto fragmenty sa subklonujú do fragmentu pTZlSR /pharmacia/ za účelom analýzy sekvencie DNA.

S prekvapením sa zo sekvencie zistilo, že izolovaný gén.je príbuzný, ale odlišný od génu pre lOkD zeín. Tento gén bol označený ako gén HSZ /zeínu s vysokým obsahom síry/. Fragment DNA obsahuje Otvorený čítací rámec 633 nukleotidov, v porovnaní so 453 nukleotidmi génu pre lCkD zeín. Proteín HSZ vykazuje 76% identitu aminokyselinovej sekvencie s lCkD zeínom. Dlhší čítací; rámec génu HSZ však kóô.uje doménu bohatú na metionín, k.torá nie je prítomná v géne pre lOkD zeín, čo .sa prejavuje obsahom sírnych aminokyselín 29% /28 % metionínu/ u maturovaného HSZ proteínu, v porovnaní s 26 % /22 % metionínu/ u lCkD zeínu. Gén HSZ·. teda kóduje zásobný proteín semien s najvyšším obsahom metionínu, aký je doteraz známy, Dobre známe signály expresie génu, ako je TATA box a polyadenylačný signál, šú umiestnené v podobných polohách v géne HSZ i v géne pre lOkD zeín. Predpokladaná signálna sekvencia obsahujúca 21 aminokyselín je kódovaná génom HSZ na aminokonci prekurzorového polypeptidu, podobne ako je to u génu pre lOkD zeín.

Fragment DNA pódia vynálezu sa môže používal ore izoláciu v podstate homológnych cDNA a génov kódujúcich zásobné· proteíny v semenách kukurice a iných rastlinných druhov, najmá jednoklíčnych rastlín. Izolácia príbuzných druhov, f

- 18 - ;

i najmä jednoklíčnych rastlín. Izolácia príbuzných génov je v tomto obore dobre známa.

f.

Použitie markerov na báze polymorfizmu dĺžky reštrikčného fragmentu /RFLP/ pri pestovaní rastlín je dobre známe a v tomto obore dokumentované /vid Tanksley a další /1989/ Biotechnology 1: 257 až 264/· Fragment nukleovej ky-_; seliny podlá'vynálezu je možné zamapoval na RFLP mape kukurice. Môže sa teda použil ako RFLP marker pre charakteri-. stick^ znaky viazané k mapovanému lokusu.

Modifikácia génu HSZ ^v

I

Fragment nukleovej kyseliny podlá tohto vynálezu kódujúci zásobný proteín semien, ktorý je bohatý na síru, môže byt pripojený k vhodným regulačným sekvenciám a použitý pre nadprodukciu /nadexpresiu/ proteínu v mikróboch, ako je Escherichia coli, kvasinkách alebo transgénnych rastlinách, ako je kukurica, sója a iné: plodiny. Taký rekombinačný DMA konštrukt môže obsahoval bud natívny HSZ gén alebo chimerický gén. Odborníci v tomto obore sú schoDní izolovat kódujúce sekvencie fragmentu podlá vynálezu za použitia a/alebo za vytvorenia reštrikčných endonukleázových miest /vid Sambropk a další, /1989/ Molecular Cloning: A Laboratory, Manuál, Qold Spring Harbor Laboratory Press/·

Obzvlášl užitočné sú prirodzene sa vyskytujúce miesta pre mco I /5'-CCATGG/ a Xba I /5 -TCTAGA/, ktoré umožňujú presné vybratie kódujúcej sekvencie počínajúc iniciačným kodonom translácie ATG a končiac translačným stop kodónom TAG· V HSZ kódujúcej oblasti sú však prítomné tri miesta Nco 1. Bolo žiaduce eliminoval dve z týchto miest a zachoval iba jedno miesto /nukleotidy 751 až 756 v SEQ ID MO:1/, ktorý obsahuje štart kodón pre transláciu.

- 19 Prednostný fragment DNA podlá vynálezu /SEQ ID

NO:2/ bol vytvorený in vitro miestne orientovanou mutagenézou tak, že boli dve miesta Nco I v kódujúcej sekvencii odstránené bez zmeny aminokyselinovej sekvencie kódovanej génom. Úplným štiepením DNA pomocou Ncp I a Xba I sa získa jediný 637bp fragment obsahujúci celú kódujúcu sekvenciu prekurzorového HSZ polypeptidu. Pre ďalšie ulahčenie konštrukcie chimerických génov bola ihneď po translačnom stop signále HSZ pridané prídavné jediné reštrikčné endonukleázové miesta. Na Xba I miesta boli vložené oligonukleotidy /SEQ ID NO:10 a 11/, pomocou ktorých boli zavedené dve nové reštrikčné miesta, Sma I a Κρη I a miesto Xba I bolo zničené. Nové jediné miesto xba I z nukleotidov 1 až 6 v SEQ ID NO’.l a Ssp I miesto z z nukleotidov 1823 až 1828 v SEQ ID N0:l bolo použité pre získanie fragmentu obsahujúceho HSZ kódujúcu oblasť plus jej 5'a 3'regulačné oblasti. Tento fragment bol klonovaný do obchodne dostupríého vektora pTZ19H /Pharmacia/ štiepeného Xba a Sma I, za vzniku plazmidu pCClO· Plazmid pCClO bol uložený 7· decembra 1990 v zbierke ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, v zhode s Budapeštianskou dohodou, a dostal prírastkové číslo 68490.

Aby bolo možné exprimovať maturovanú formu proteínu HSZ, bolo žiadúce vytvoriť pozmenenú formu génu HSZ s jediným miestom pre reštrikčnú endonukleázu na začiatku matu i / rovaného proteínu. K tomuto účelu bol vytvorený _:fragment DNA za použitia PCR? ‘Boli skonštruované oligonukleotidové prímery /SEQ ID NO:12 a 13/, aby PCR-vytvorený fragment /SEQ ID NC:3/ obsahoval miesto 3spH I, čo malo za následok vznik rovnakého lepivého konca, aký sa získa štiepením nco I. Toto _e x miesto bolo umiestnené na spojke signálnej sekvencie a kódujúcej sekvencie pre maturovaný HSZ· Fragment vytvorený PCR tiež obsahoval miesto:Xba I u translačného konca HSZ génu.

Pomocou PCR ;bol skonštruovaný gén tak, aby kodoval doménu s vysokým obsáhom· metionínu /HMD/ HSZ· Boli skonštruované oligonukleotidy /SEQ ID N0;14 a 15/ pre pripojenie Nde I miesta, ktoré obsahovali translačný iniciačný kodón a EcoR I miesto, práve za translačným terminaičným kodónom /vid SEO. IDNO:4/· Tieto miesta umožňujú ^ahko inzerciu ’-'MD.do ex, , · ··,., · ¹ presných vektorov. í ’ . ·

Expresia HSZ v E. coli

HSZ kódujúca sekvencia bola exprimovaná v E. coli za použitia systému baktériofágová T7 RNA polymeráza/T7 promótor /Studier a další /1990/ Methods in Enzymology 135’. 60 až 89/. Fragment Nco I-Xba I obsahujúci sekvenciu kódujúcu HSZ bol inzertovaný do expresného vektora. U tohto plazmidu, označeného skratkou pcCll bola očakávaná expresia prekurzcrového proteínu HSZ· Tiež bol skonštruovaný plazmid pre expresiu proetínu HSZ bez jeho signálnej sekvencie, ktorý bol označený skratkou pCC12· Fragment DNA kódujúci maturovaný HSZ pre túto konštrukciu bol získaný PCR postupom pónísaným vyššie a vložený do expersného vektora.

’ (Pre detekciu expresie oolypeptidov HSZ boli plazmidy pudí :a pCC12 transformované do kmeňa E· coli HMS174 a bol vykonaný in vivo značený experiment za použitia Smetionínu spôsobom popísaným v Studier a Moffatt /1986/, J· Mol. Biol. 189: 113 až 130. Vzhladom na vysoký obsah metionínu v tomto TISZ proteíne sa jedná o špecifický a citlivý prostriedok na detekciu expresie. Bunkové extrakty spracovávané na SDS polyakrylamidových géloch, ktoré boli po vysušení autorádiografované. U obidvoch extraktov'· z pCCll a uCC12 boli pozorované silné pásy označeného proteínu s molekulovou hmotnostou asi 20 kD. Táto velkosť približne zodpovedá veíkosti očakávanej u polypeptidov HSZ s maturo-wnou dĺžkou a — η 1 _ á χ ·*

-½ <

í .

í 'i'.' naznačuje, že prekurzorový proteín, vyrobený v pCCll trans formáte bol v E· coli spracovaný. Ked boli pomocou farbenia briliantovou modrou Coomasie zviditeľnené celkové proteíny po indukcii a elektroforéze na SDS polyakrylamidovom géle, / bol v lyzátoch pCC 12 /ale nie v lyzátoch pCC 11/ zistený

I prominentný indukovaný 2OkD proteín, čo ukazuje na vysokú úi roveň expresie maturovanej formy proteínu.) • i : ' ·.

t < <

j Fragmenty nukleovej kyseliny podľa vynálezu je mož'J né používal na produkciu veľkých množstiev HSZ, HMD alebo • ’·* ‘ ·· í celkového proteínu obohateného o sírne aminokyseliny, najme · I í \ ···] \ . metionín, fermentáciou E. coli alebo iných mikroorganizmov.

J Za týmto účelom ša môže fragment nukleovej kyseliny podlá ^; vynálezu ooerabilňe pripojit k vhodnej regulačnej sekveneii _v.

•i obsahujúcej promotorovú sekvenciu, vedúcu sekvenciu translácie a 3 nekódujúcu sekvenciu. Chimerický gén je potom možné .j zaviesl do mikroorganizmu transformáciou a transformovaný . mikroorganizmus je možné pestoval za nodmienok, Dri ktorých / sa dosiahne vysoká expresia chimerického génu. Bunky obsahujúce proteín obohatený o sírne aminokyseliny je možné zhromaždit a obohatený proteín je možné extrahoval. Potom je / možné HSZ proteín prečistil. ^;

Ma výrobu veľkých množstiev HSZ proteínu v E· coli bol použitý kmeň BL21/DE3/PLysE /studier a Salší /1990/ Me/1 thods in Enzymology 185: 60 až 89/‘ transformovaný pCC 12.

•I HSZ proteín bol prečistený z extraktov IPTG /izopropyltiobeta-galaktozidom/-indukovaných kultúr. HSZ proteín sa nachádza v nerozpustnej zrazenine, ktorú je možné ľahko oddelil nízkorýchlostným odstreďovaním b.unkového extraktu. Vač/ šina bunkových proteínov sa odstráni v supernatante. Fotorn

B sa HSZ selektívne solubilizuje v takmer /nad 90 %/ čistej

V.'í forme z centrifugačnej oelety pomocou extrakcie 70* izopropylalkoholom obsahujúcim beta-merkaotoetanol v koncentrácii \· Ί · ' - . .

mM· Z jedného litra bunkovej kultúry bolo získané približr .

ne 10 aží10 mg HSZ proteínu. Pretože bolo teraz zistené, že produkcia HSZ proteínu v E. coli'nie je voči bunkám toxická, môže sa dosiahnuť vyššia úroveň expresie za použitia kmeňa BL21/DE3/ /Studier a ďalší /1990/ Methods in Enzymology 125: 60 až 89/·

Expresia HSZ v rastlinách

Prednostnou triedou hostiteľov pre exoresiu kódujúcej sekvencie HSZ alebo HMD sú eukaryotickí hostitelia, najmä bunky vyšších rastlín. Obzvláštna prednosť sa z vyšších rastlín a semien z nich získaných dáva sóji, repke /Brassi-_t ca napus, Brassica campestris/, slnečnici /Helianthus annus/, bavlníku /Gossypium hirsutum/, kukurici, tabaku /Nicotiana tabacum/, lucerne /Medicago sativa/, pšenici /Triticum sp./, jačmeni /Hordeum vulgare/, ovsu /Avena sativa, L./, ciroku /Sorghum bicolor/, ryži /Oryza sativa/ a kŕmnym trávam. Pri iexpresii v rastlinách sa používajú regulačné sekvencie, ktoré sú v týchto rastlinách funkčné.

Expresia cudzích génov v rastlinách je dobre zavedená /De Blaere a další /1987/ Methods. Enzymol. 153: 277 až 291/· Pôvod promótora zvoleného pre povzbudzovanie expresie. kódujúcej sekvencie nie je kritický, ak má promótor dostatočnú transkripčnú aktivitu, aby podlá vynálezu zvýšil hladinu translatovatéľnej mRNA pre HSZ alebo HMD v požadovanom tkanive hostiteía. Prednostnými promótormi pre expresiu vo všetkých orgánoch rastliny a najmä pre exoresiu v listoch sú promótory orientujúce 19S a 35S transkrooty v mozaikovom víruse karfiolu /Odeli a další /1985/ Náture 313: 810 až 812; Hull a další /1987/ Virology 86: 482 až 4937» malú pod jednotku ribulóza-l,5-bifofátkarboxylázy /Morelli a další /1985/ Náture 315: 200; Broglie a další /1984/ Science 224:

I'· ··..: - 23. '·< ; . . ’( · !% J: ,

838; Hererra-Estrella a další /1984/ Náture, 310: 115; Coruz/ zi a äalší /1984/ E’ÄBO J. 3: 1671» Faciotti a další /1985/ f Bio/Technology 3: 241/» kukuričný proteín, zeín /Matzke a äalší /1984/ EMBO-J· 3: 1525-7 a chlorofyl a/b viažuci prote- . ín /Lampa a další /1986/ Natuer 316: 750 až 752/· | V závislosti od aplikácie môže byt žiadúce volit pro/ motory, ktoré sú špecifické pre expresiu v jednom alebo via. . y / cerých orgánoch rastliny. Ako príklady je možné uviest lahko / indukovatelné promótory malej podjednotky ribulóza-1,5-bifos,j ’ fátkarboxylázy,.ak je expresia požadovaná vo fotosyntetických .í orgánoch, alebo promótory, ktoré sú špecificky účinné v semenách.

,·ϊ prednostnými promótormi sú tie, ktoré umožňujú exexpresiu proteinu špecificky v semenách.,TÔ môže byí obzvláši / užitočné, pretože semená sú hlavným zdrojom rastlinného pro/j teínu a tiež preto, lebo v semenách.-špecif ická expresia za/ bráni akémukolvek potenciálnemu škodlivému účinku v nesemenných orgánoch. Ako neobmedzujúce príklady promótorov, ktoré / sú špecifické vzhíadom k semenám, je možné uviest promotôry

J/. ’ · zásobných proteínov semien, ktoré v mnohých rastlinách tvoiľ ria viac než 50 % celkového proteinu semien. Zásobné proteíny «j semien sú striktne regulované a sú exprimované takmer výluč/ · ne v semenách spôsobom, ktorý je vysoko špecifický vzhíadom k orgánu a vzhíadom k vývojovému štádiu /Higgins a další /1984/ /i ’ Ann. Hev. Plánt Physiol. 35: 191 až 221; Goldberg a další / /1989/ Celí 56: 149 až 160; ľhompson a další /1989/ BioEssa/. ys 10: 108 až 113/. Okrem toho rôzne zásobné proteíny semien , je možné exprimovaí v rôznych štádiách vývoja semena.

I

H V súčasnej dobe existujú Dočetné príklady génov nre •J , . ·.

· • r

-í i

vzhladom k semenám špecifickú expresiu zásobných proetínov v semenách transgénnych dvojklíčnych rastlín. Tieto príklady zahŕňajú gény z dvojklíčnych rastlín pre p-fazeolín fazule ZSengupta-Gopolan a další /1985/ Proc. Mati. Acad. Sci. USA 82: _; 3320-3324; Hoffman a další /1988/ Plánt Mol. Biol. 11: 717729/> fazuľový lektín /Voelker a další /1987/ EMBO J. c: 35713577/, sójový lektín /Okamuro a další /1986/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8240 až 8244/ sójový Kunitzov inhĺbitor trypsínu /Perez-Grau a další. /1989/ Plánt Celí 1-.095-HQV sójový ρ-konglycinín ZBeachy a další /1985/ EMBC J- 4:3047-3053; Barker a. další /1988/ Proc. natl. Acad. Sci USA 85: 458-462; Chen a další /1988/ EMBO J* 7: 297 až 302; Chen a další /1989/ Dev. Genet. 10; 112 až 122; Naito a další /1988/ Plánt Mol. Biol. 11:109 sž 123/> hrachový vicilín /Uiggins a další /1988/ Plánt MCl. Biol. 11: 683 až 695/» hrachový konvicilín /Newbigin a další /1990/ Planta 180: 461/ hrachový legumín /Shirsat a další /1989/. Mol. Gen. Genetics 215 : 326/; repkový napín /Radke a další /1988/ Theor. Appl. Genet. 75: 685 až 694/ ako i gény z jednoklíčnych rastlín, ako 'pre 15kD zeín z kukurice /Hóffman a další /1987/ EMBO J. 6: 3213-3221; Schenthaher a další /1988/ EMBO J. 7: 1249 až 1253;..„'ľillisimson a další /1988/ . Plánt Physiol. 88: 1002 až 1007 / jačmeňový ^-hordeín zMarri’s a další /1988/ Plánt Mol. Biol. 10: 359 až 366/ a pšeničný ^? ' glutenín /Colot a další /1987/ EMBO J. 6: 3559 až 3564/·' Okrem toho, promótory voči semenám špecifických génov, ktoré sú operabilne pripojené k heterolognym kódujúcim sekvenciám v konštruktoch chimerického génu, si tiež zachovávajú svoj časoyý a priestorový profil expresie v transgénnych rastli.nách. Také príklady zahŕňajú promótor génu pre zásobný proteín semien Arabidopsis thaliana 2S pre expresiu eňkefalínových peptidov v semenách Arabidopsis a B« napus /Vandekerckho-? ve a další /1989/ Bio/Technology 7: 929 až 932/, promótory fazulového lektínu a fazulového ŕ-fazeolínu pre expresiu luciferázy ZRiggs a další /1989/ Plánt Sci. 63: 47 až 577 a promóto ry pšeničného glutenínu nre· exDresiu chloramfenikol’acetyltransferázy /Collot á ďalší /1987/ EMBO J. 6: 3559 až 3564/·

Obzvláštne použitie pri expresii 'fragmentov nukleI ovej kyseliny podlá ^ynálezu budú nachádzal hetrológne promótory z niekoíkých dôkladne charakterizovaných génov pre zásobné proteíny semien sóje, ako sú gény pre Kunitzov inhibí¹ s tor trypsínu /Jofuku a ďalší /1989/ Plánt Celí 1: 1079 až 1093; Perez-Grau a ďalší /1989/ Plánt Celí 1: 1095 až!109/, glycinín /Nielson a ďalší /1989/ plánt Celí 1: 313 až 328/, 0-konglycinín /Harada a ďalší /1989/ Plánt Celí 1: 415 až 425/· Promótory génov ä- a β- podjednotky zásobného prote·. ínu sóje, β-konglycinínu, budú obzvlášt užitočné pri expresii IISZ mRNA v kotyledonoch v strednom až neskorom štádiu vývoja sójového semena /Beachy a ďalší /1985/ EMBO J. 4: 3047 až 3053» Barker a ďalší /1988/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 458 až 462} Chen a ďalší /1988/ EMBO J. 7: 297 až 302; Chen a ďalší /1989/ Dev. Genet. 10: 112 až 122; Naito a ďalší /1988/ Plánt Mol. Biol. 11;109 až 123/ v transgénnych rastlinách, pretože a/ dochádza len k velmi malému polohovému účinku na expresiu v transgénnych semenách a b/ tieto dva promótory vykazujú rôznu reguláciu v priebehu doby, t.j. Dromótor pre gén </ -podjednotky je exprimovaný niekolko dní pred tým, než promótor pre gén β-podjednotky.

Pri expresii fragmentov nukleovej kyseliny nodía vy-^; nálezu budú mal tiež obzvláštny význam hetejjpológne promótory z niekolkých dôkladne charakterizovaných génov pre proetín semien kukurice, ako sú gény pre lCkD zeín /Kirihara a ďalší /1988/ Gene 71: 359-370/, pre 27kD zeín/Prat a ďalší /1987/ Gnen 52:51 až 49; Gallardo a ďalší /1988/ Plánt Sci. 54· 211281/ a 19kD zeín /Marks a ďalší /1985/ J· Biol. Chem. 260: 16451 až 16459/· Boli.publikované relatívne transkripčné aktivity týchto promotorov v kukurici /kodrzýck a ďalší /1989/

Plánt Celí. 1: 1C5 až 114/» čo poskytuje základ pre voľbu promótora vhodného pre použitie v chimerickom génovom konštrúkte pre kukuricu.

Správna úroveň expresie HSZ alebo HMD^;'mRNA môže vyžadoval použitie rožných chimeric&ých génov, ktoré využívajú rôzne promootry. Také chimerické’gény je možné preniesť do hostiteľských rastlín buď spoločne, v jedinom expresnom vektore, alebo postupne, za použitia viac než jedného vektora. Predpokladá sa,, že zavedenie enhacerov /zosilňovačov transkripcie/ alebo prvkov typu enhacerov, do natívneho HSZ promótora i do iného promotorového konštruktu, rovnako zaistí, v súlade s vynálezom·, zvýšenie úrovne primárnej transkripcie pre HSZ.· alebo HMD· Ako enhacery je možné použiť vírusové enhacery, ako sú enhacery, ktoré sa vyskytujú v 35S promótore /Odeli a další /1988/ Plánt Mol. Biol. 10: 263 až 272/» enhacery z opínových génov /Fromm a další /1989/ Plánt Celí 1: 977 až 984/ alebo enhacery z akéhokoľvek iného zdroja, ktoré posilňujú transkripciu, keď sú umiestnené v promótore, ktorý je operabilne pripojený k (fragmentu nukleovej kyseliny podlá vynálezu.

Obzvláštnu dôležitosť má Drvok sekvencie SNA, ktorý bol izolovaný z génu pre </-ood jednotku p-kong]y cínu a ktorý je schopný poskytnúť konštitutívnemu promótoru štyridsaťnásobné zosilnenie, špecifické vzhladom k semenám /*Chen a další /1988/ EMBO J.· 7: 297 až 302; Chen a další /1989/ Dev. Genet. 10: 112 až 122/· Odborník v tomto obore môže tento prvok lahko izolovať a vložiť dp promótorovej oblasti aké-' ' hokoívek génu, za účelom získania vzhladom k semenám špecifickej expresie promótora v transgénnych rastlinách. Inzercia takého elementu do akéhokoľvek génu, ktorý je špecifický vzhladom k semenám a ktorý je exprimovaný v iný čas než gén pre (J-konglycinín, bude mať za následok expresiu v transgénnych rastlinách prebiehajúcu dlhší čas v priebehu vývoja se mena .

J Na dosiahnutie požadovaného ciela je možné vynález

J; realizoval i radom iných metód. Podlá jednej formy uskutočni ₍ nenia je vynález založený na modifikácii rastlín za účelom produkcie· zvýšenej úrovne HSZ proteínu tým, že obsahuje podstatne väčší počet kópií HSZ· r

Na realizáciu vynálezu sa môže použil akákblvek 3' J nekódujúca oblasl, ktorá je schopná poskytnúl signál pre •z _ transkripciu, polyadenylačný signál a iné regulačné sekvencie_y ktoré môžu byl potrebné pri riadnej expresii kódujúcej obj lasti pre HSZ· Tieto 3 nekodujúce oblasti zahŕňajú natívny

3'koniec génu alebo génov HSZ» 3 koniec heterológneho génu Ý; pre zeín, 3'koniec génu pre akýkolvek zásobný proteín, ako je f 3'koniec génu pre sójový ji-konglycinín, 3' koniec ' vírusového j .génu, ako je 3'koniec transkriptov vírusu karfiolu 353 alebo

19Sj 3 koniec génov zo syntézy ooinov, 3 konce génov pre ribulóza-1,5~bifosfát karboxylázu alebo proteín viažuci, chloro< . fyl a/b alebo 3'koncové sekvencie z akéhokolvek zdroja, ktoj. ré pri Doužití zaistujú potrebnú regulačnú informáciu vo svo1 ·' jej sekvencii nukleovej kyseliny, pre riadnu exuresiu kombiJ nácie promótor/HSZ alebo promótor/HMD kódujúci oblasl, ku ktorej je operabilne pripojený. 7 tomto obore existuje rad príkladov, ktoré '‘ukazujú užitočnost rôznych 3'nekódujúcich oblastí /napríklad vid ingelbrecht a äalší /1989/ Plánt Celí ’·! - 1: 671 až.680/.

i ‘ A.k je to potrebné pre riadnu expresiu proteínov podlá vynálezu, môžu sa k sekvencii kódujúcej HSZ alebo HMD prií‘ dal sekvencie DNA kódujúce intracelulárne lokalizačné sekvencie. Natívna signálna sekvencia HSZ sa teda môže odstránil t alebo nahradil signálnou sekvenciou, o ktorej je známe, že íP funguje v cielovej rastline. Ak by bola signálna sekvencia j odstránená, bolo by možné očakával, že proteín HSZ zostane d . .

íá .

Í<» ^: .

' v cytoplazme bunky. Alternatívne by bolo možné jednoklíčnu signálnu sekvenciu HSZ nahradil signálnou sekvenciou p-podjednotky fazeolínu z fazule Phaseolus vulgaris alebo signálnou sekvenciou z ä'podjednotky β-konglycinínu zo sóje /Doyle a daläí /1986/ J· Biol. Chem. 261: 9228 až 9238/, ktoré fungujú v dvojklíčnych rastlinách. Hoffman a další //1987/ EMBO J. 6: 3213 až 3221/ ukázali, že signálna sekvencia.prekurzora l^kD zeínu, z jednoklíčnej rastliny, nasmeruje proteín na sekretornu dráhu a rovnako správne sa prejavuje v semenách transgénneho tabaku. Proteín však nezostane v endoplazmickom reťikule, ako je to v prípade kukurice. Aby proteín zostal v endoplazmickom retikule, môže mal potrebné pridanie stop tranzit sekvencií. Je známe v tomto obore, že prídavok sekvencií DNA kódujúcich aminokyselinovú sekvenciu /Lys-Asp-GluLeu/ /SEQ ID NO:28/ na karboxylovom konci proteínu má za následok zachovanie proteínov v lumene endoplazmického retikula /Munro a další /1987/ Celí 48:899 až 907; Pelham /1988/ EMBO J. 7: 913 až. 913; Pelham a další /1988/ EMBO J. 7: 1757 až 1762; Inohára a další /1989/ Proc. Natl. Acad. '-ci. USA 86: 3564 až 3568Hesse a další /1989/ EMBO J. 8: 2453 až 2461/. V semenách niektorých rastlín sú zásobné proteíny umiestnené v bunkových vakuolách. Pri uskutočňovaní vynálezu môže byl nutné nasmeroval proteín HSZ alebo HMD do vákuol týchto rastlín pridaním vakuolovej smerovacej sekvencie. Krátka aminokyselinová doména, ktorá slúži ako smerovacia sekvencia do vákuol, bola identifikovaná vo fytohemaglutiníne fazule, ktorý sa akumuluje vo vakuolách pre zásobné proteíny kotyledonov /Tague a další /1990/ Plánt celí 2: 533 až 546/· V inej správe bola popísaná karboxy-terminálna aminokyselinová sekvencia, ktorá je potrebná pre nasmerovanie jačmeňového lektínu do vákuol v·transgénnom tabaku /Bednarek a další /1990/ Plánt celí 2: 1145 až 1155/· e

Konštrukcia chimerických génov pre expresiu HSZ v rastlinách

Pre konštrukcie chimerických génov pre expresiu HSZ v rastlinách boli použité tri, vzhladom k semenám špecifické, expresné kazety. Expresné kazety obsahujú regulačné oblasti z troch vysoko exprimovaných génov pre zásobný proteín v semenách: ¹

1/ jJpodjednotku fazeolínu z fazule Phaseolus vulgaris; _z

2/ λ podjednotku p-konglycinínu zo sóje;

3/ 10kD zeín z kukurice.

' Ϊ.

Kazety sú schematicky , znázornené na obr.· 2. Každá z nich obsahuje jédíné'Ncq I miesto, 'ktoré bezprostredne na ¹ sleduje’za /regulačnou oblastou a okrem toho niektoré miesto alebo všetky miesta zvolené zo súboru zahŕňajúceho xba, I, Srna I a Kpn^% I, ktoré bezprostredne predchádzajú 3 regulačnú oblá st.

j , . Fragment Nco -xba I, ktorý obsahuje celú kódujúcu oblasl pre HSZ /SEQ ID NO:2/ a fragment SspH .1 - xba I, ktorý obsahuje gén signálnej sekvencie, t.j. kódujúcu sekvenciu pre matur.ovaný proteín ./SEQ ID N0:3/> aa vloží do fazeolínovej a p-konglycinínovej expresnej kazety /obr. 2/, ktorá bola štiepená nco'I a Xba I. Pre inzerciu do lCkD zeínovej kazety sa fragment nco I-Sma I obsahujúci kódujúcu oblasí pre HSZ vloží do nco I -Srna I štiepenej lOkD zeínovej kazety.

Odborníkom v tomto obore sú k dispozícii rôzne metódy transformácie buniek vyšších rastlín podlá vynálezu /vid publikácie EP 0 295 959 A.2 a 0 138 341 ;A1/· Tieto metódy zahŕňajú metódy založené na transformačných vektoroch na i :

ί ^!Λ ..

' , - 30--/ ·» . · t . ’ r ♦ . y ¹4 i

báze ΤΙ alebo Ri plazmidov Agrobacterium spp. Obzvláštna prednosť sa dáva použitiu binárneho typu týchto vektorov. Ti-odvodené vektory boli použité na transformáciu celého radu vyšších rastlín, včítane jednoklíčnych a dvojklíčnych rastlín, ako je sója, bavlník a repka /Pacciotti a další /1985/ Bio/Technology 3: 2 41; Byrne a další /1987/ Plánt Celí., Tissue and Organ Culture 8: 3; Sukhapinda a další /1987/ Plánt Mol. Biol. 8: 209 až 206; Lorz a další /1985/ Mol. Gen. Genet. 199: 178; Potrykus a další /1985/ Mol. Gen. Genet. 199: 183/.

j Kazety pre chimerický gén fazeolín-ESZ sa vložia do

Ý . , f ' j ’ vektora pZS97K /obr. 3/, ktorý je súčasťou binárneho Ti 'i '

J plazmidového vektorového systému /Bevan /1984/ Nucl. Acids.

^!;Res. 12: 811 až 8720/ Agrobacterium tumefaciens. Tento vektor obsahuje 1/ nopalínsyntetázu/neomyfínfpsfotransferázu chimerického génu /číslo: NPT II/, ako selekčný marker pre .f transformované rastlinné bunky /Bevan a další /1883/ Náture

304: 184 až 186/, 2/ lavú a pravú hraničnú oblast T-DNA Ti , i

J / plazmidu /Bevan /1984/ Nucl. Acid. Res. 12: 8711 až 8720/, 'j 3/ E. coli lacZ <*-komplementačný segment /Vierija a Messing / /1982/ Gene 19: 259 až 267/ s jedinými miestami pre reštrikčné endonukleázy EcoR I, ?ľpn I, BamE I a Sal I, 4/ počiatok i bakteriálnej replikácie z plazmidu z Pseudomonas pVSl /Itoh a další /1984/ Plazmid 11: 206 až 220/ a 5/ bakteriálny gén pre neuomycínfosfotransferázu z Tn5 /Berg a další /1975/ ·! - Proc. natl. Acad. Sci USA, 72: 3628 až.3632/, ako selekčný

Ί .

marker pre transformovaný Agrobacterium tumefaciens.

;! Binárne vektory obsahujúce chimerické HSZ gény sa ” prenášajú triparentálnym spojovaním /mating/ /Ruvkin a další •’í /1981/ Náture' 289: 85 až 88/ do Agrobacterium kmeňa LBA4404/

J- PA14404 /HOckema a další /1983/ Náture 303: 179 až 180/.

.¹ Transformanty Agrobacterium sa použijú pre inokuláciu terčíkov z tabakových listov /Horsch a další /1985/ Science

J .

. I ; I « í

| . ·

- 31 .· η

277: 1229 až 1231/· Rastliny sa regenerujú v selektívnom médiu obsahujúcom kanamycín.

j Odborníkom v tomto obore sú k disoozícii i iné .

'· transformačné metódy, ako je priame prijímanie konštruktov j cudzej DNA /vid EP 0 295 959 A2/> elektropqpačné techniky /vid Fromm a další /1956/ Náture /Londýn/ 319: 791/ alebo balistické bombardovanie velmi rýchlymi kovovými časticami J potiahnutými konštruktami nukleovej kyseliny, /vid Kline a ý , další /1987/ Náture /Londýn/ 327:70 a U. S- patent 4 945 '•i 050/. Po transformácii možno obvyklými metódami bunky rege’J . nerovaí.

íj Obzvlášť vhodné sú nedávno popísané metódy transformácie cudzích génov do obchodne dôležitých plodín, ako je j ' repka /vid De Block a další /1989/ Plánt physiol. 91: 694 až

701/, slnečnica /Everett a další /1987/ Bio/Technology 5:

’.j 1201/, sója /mcCabe a další /1988/ Bio/technology 56: 923 ;

ή Hinchee a další /1988/ Bio/Technology 6: 915; Chee a další /1989/ plánt Physiol. 91; 1212 až 1213; Christou a další

I /1989/ Proc. rjatl. Acad. Sci. USA 86: 7500 až 7504; EP C 301 ,:í 749 A2/ a kukurica /Gordon-Kamm a další /1990/ Tiant Oell

J 1 .

íí 2: 603 až 618; Fromm a další /1990/ Biotechnology S: 833 až || 8397· '1 ' ' v· Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich prid . kladoch uskutočnenia, v ktorých sa .pod všetkými údajmi v dieloch a percentách rozumejú údaje hmotnostné, ak nie je J uvedené inak. Tieto príklady ukazujú prednstné uskutočnenie

Γΐ tohto vynálezu, majú výhradne ilustratívny charakter a rozý sah vynálezu v žiadnom ohlade neobmedzujú, wa základe vyššie ý, uvedeného popisu a týchto príkladov môže odborník spoznat hlavné charakteristiky tohto vynálezu a bez toho, aby sa odý chýlil od ducha a rozsahu vynálezu, môže v nom vykonal rôz/ ne zmeny a modifikácie, aby ho nrispôsobil rôznym aolikáciám ý a podmienkam.

! t’ ' < *

Príklady predvedenia vynálezu

P rí k 1 a d 1

Molekulové klonovanie HSZ génu

Od firmy Clontech /Palo Alto, Kalifornia, USA/ bola ·. zakúpená genómová knižnica kukurice v bakteriofágu lambda.

y Frehlad dát, ktoré boli získané od dodávateľa, ukazuje, že j DNA z kukurice pochádza zo sedem dní starých semenáčikov, pestovaných v tme. Vektor je lambda-EMBL~3, „nesúci BamHl fragmenty s priemernou velkoslou 15 kb. Dodávatel uvádza titer 1 až 9.10^ jednotiek tvoriacich plaky /pfu/ml/. Po dodaQ ní bola knižnica titrovaná a bol zistený obsah 2,5x10' pfu/

H ml.

i i u y j Protokol pre skríning knižnice DNA hybridizácií bol ý ' získaný od dodávateľa. na každú misku s Driemerom 150 mm sa < prenesie asi 30000 ofu /celkom 15 misiek s agarovým médiom ŕ

Luria Broth /LB// čím sa získa 45CCCO plakov. Ako hosti- li tel sa používa E· coli LE 392 pestovaná v LB + 0,2 % maltózy a ako médium v miskách sa používa LB - 7,2 % agarózy. Plaky í sa absorbujú na nitrocelulózové filtre /Millipore HATF, 0,45 •f mM - velkosí porov/, denaturujú v 1,5M chloride sodnom, C,5M

Trist-Cl·. pH 7,5 a opláchnu 3XSSC /Sambrook a další /1939/ Moí, lecular jloning: K Laboratory Manual, Uold Gpring Harbor La' ‘‘•í / ' boratory press/. Filtre sa blotujú na papier Whatman 3MM a zahrievajú vo vákuovej sušiarni na 30 °C 2 hodiny, aby sa < fágová DNA pevne zakotvila v membránach.

.'i 7

J Zhotoví sa hybridizačná próba pre skríning knižnice j na gén lOkD zeínu s vysokým obsahom metionínu /Kirihara a ' další /1988/ Mol. Gen. Genet. 211: 477 až 484/, soolu s je ; ho 5'a 3'lemujúcimi oblasťami. P,va oligoriukleotid.y s dĺžkou

V. 30 báz, ktoré lemujú tento gén sa syntetizujú za použitia

!. syntezátora DNA Applied Biosystems. Oligomér SM56 /SEQ ID

N0:6/ kóduje pozitívny reťazec zahŕňajúci prvých desať amiz nokyselín.

SM56 5 ’-ATG GCA GCC AAG ATG CTT GCA TTG TTC GCT-3' (SEQ ID NO:6).

Met Ala Ala Lys Met Leu Ala Leu Phe Ala (aminokyseliny

-21 až -12 ·

SEQ ID NO:5) 5 Oligomér CFC77 /SEQ ID NO:7/ kóduje negatívny reťazec za·§ hŕnajúci posledných desať aminokyselín:

. CFC77 3*-AAT GTC GTT GGG AAA CAA CCA CGA CGT AAG-5' (SEQ ID NO:7)

Leu Gin Gin Pro Phe Val Gly Ala Ala Phe (aminokyseliny , 120 až 129

SEQ ID NO:5)

Tieto oligonukleotidy sa použijú pre polymerázovú reťazovú reakciu /PCR/, za účelom vytvorenia lOkD kódujúcej TJ oblasti za použitia genomovej DNA z kukurice /kmeň 285/, ako

7; templátu. PCR sa vykonáva za použitia súpravy Perkin/Elmer z, Cetus kit v súlade s inštrukciami dodávatela za použitia termocyklovača; co je výrobok rovnakej snosločnosti· Kea sa ^!: , reakčný produkt analyzuje na 1% agarózovom géle a farbí etif diumbromidom, je badatelný silný pás DNA s velkoslou, ktorá

J je očakávaná pre lOkD gén zeínu, 450 bp, so slabým pásom pri asi 650 bp. Pás 450 bp sa elektroeluuje na celuLózovú membrá’ . nu DE.AE /Schleicher S, schuell/ a potom eluuje z membrány pri °C pomocou IM NaCl, 0,1 mM EDTA, 20mM Tris-Cl s pH 8,0.

‘ DNA sa vyzráža etanolom a premyje 70% etanolom a vysuší. Vyý sušená peleta sa resuspenduje v 10 |il vody a alikvotná vzorl . ka /obvykle s objemom 1 μΐ/ sa použije pre dalšiu sériu PCR '

H reakcií za účelom vytvorenia asymetrických prímerových jedno/ reťazcových DNA. Na tento účel sú priméry SM56 a·. CFC7⁷ orí/ tomné v molovom pomere 1:20 a 20:1. Produkty, pozitívny aj negatívny reťazec génu pre 10kD zeín, sa extrahujú fenolom,, vyzrážajú etanolom a nechajú prejsť stĺpcom nAVS /Behesda Research Laboratories/, aby sa odstránil nadbytok oligomérov. Eluáty sa 2x .prezrážajú etanolom, premyjú 70% etanolom a vysušia. Sekvenovanie DNA sa vykonáva za použitia vhodných komplementárnych prímerov a sekvenačnej súpravy od firmy United States siochemicals company podlá inštrukcie dodávatela. Sekvencia Droduktu PCR je identická s publikovanou sekvenciou génu pre 10kD zeín. Rádioaktívna próba sa vyrobí posunom jednoreťazcového zlomu génu . prglOkD zeín, zhotoveného PCR» za použitia ^p-dCTP a súpravy pre posun jednoreťazcového zlomu, ktorú dodáva firma.Bethj&sda Research Laboratories.

150mm nitrocelulózových filtrov nesúcich lambda fágové plaky sa podrobia skríningu za použitia rádioaktívz nych prób génu ICkD . po 4 hodinách nredbežnej hybridizácie pri 60 °C v 50XSSPE, 5X Denhart /viď Sambrook a ďalší /1989/ Molecular cloning: A Laboratory Manual, uold Spring Harbor Laboratory Press/, 0,1% SDS, 100 g/ml DNA z.telacieho týmusu., sa filtre prenesú do čerstvej hybridizačnej zmesi obsahujúcej denaturovaný rádioaktívne značený gén pre lGkp zeínl /cpm/ml/ a nechajú sa v ňom uložené cez noc pri 60 °C. Nasledujúci deň sa premývajú za podmienok vysokej strigeňcie: Jednu hodinu pri teplote miestnosti v 2XSSC-C,O5% S^S a 1 hodinu pri 68 °C v 1XSSC-C,1% .SDS· Nasleduje blotovanie na papier Whatman 3MM, sušenie na vzduchu a autorádiografia pri -70 °C na filmy Kodak XAR-5 za použitia intenzifikačných mriežok Du Pont cronex Lightning Plus. V tých autorádiogramoch sa identifikuje 20 hybridizačných plakov. Tieto nlaky sa doberú z Dôvodnej Petriho misky a nanesú na misku v zriedenom stave, aby sa získalo asi 100 plakov na 8Cmm misku. Plaky sa absorbujú na nitrocelulózové filter a vykoná sa nový skríning s próbami rovnakým spôsobom. Po autografii iba jeden z pôvodných plakov, číslo 10, vykazuje dva hybridizač. né plaky. Tieto plaky sa skúšajú s próbou tretí raz. všetky ŕ

plaky potomstva hybridizujú, Čo ukazuje, že boli izolované čisté klony.

DNA savyrobí z týchto dvoch fágových klonov lambda 1C-1 a lambda 1C-2, za použitia protokolu pre izoláciu DNA, z kvapalných,lyzátov lambda fágov v malom meradle /Ansul a· ďalší /1987/ Current protocols in Molecular Siology, protokoly 1.12.2 a 1.13.5-6/· Štiepením reštrikčnou endonukleázou a elektroforézou na agarozovom géle sa zistí, že dva klony sú totožné.; Fragmenty DNA z agarózového gélu sa blotujú technikou Southern Blot /viď Sambrook a ďalší /1989/ Molecular cloning: A Laboratory Manual, 'Jold SDring Harbor Laboratory press/ na nitrocelulózové membránové filtre a < skúšajú sa rádioaktívne značenou 1Q&D zeínovou DNA získanou posunom .jednoreťazcovéhc zlomu. ’’ próbe hybridizuje jedi-

7,5 kb fragment BamH I a jediný l,45kb’fragment Xba I.

7,5 kb fragment BamH I sa izoluje z produktu štiepenia BamH I lambda DNA vzorky na 0,5% agarozovom géle s nízkou teplotou topenia /LMP/· Pás 7,5 kb sa vyreže, roztaví zriedi C,5M chloridom sodným a nanesie na stĺpec NACS, ktorý sa potom premýva C,5M chloridom sodným, lOmM Tris-31 s pH 7,2 a lmw EDTA· Fragment sa eluuje 2M chlorodom sodným lCmM Tris-Cl s pH 7,2 a lmivi EDTA· Tento fragment sa liguje k fagemidu pTZ18R /fharmacia/, ktorý bol štiepený BamH I a spracovaný telacou intestinálnou alkalickou fosfatázou. /viď Sambrook a ďalší /1989/ Molecular uloning: A Laborator ry Manual, 3old Spring Harbor Laboratory Press/, aby sa zabránilo ligácii fagemidu k eebe samému. Subklony s týmito fragmentárni s obidvomi orientáciami vzhladom k pTZ18P DNA sa získajú po transformácii E· coli.

Produkt štiepenia Xba I klonovanej lambda fágovej

DNA sa spracováva na 0,8%agarozovom géle.a izoluje sa 1,4 kb fragment za použitia celulózovej membrány DEAE /rovnaký ŕ

λ ϊ .

' - 36 í' : ‘ postup ako v prípade DNA fragmentu pre 10kD zeín, získaného PCR, popísaný vyššie/. Tento fragment sa liguje k pTZlBR rozštiepenému Xba I rovnakým spôsobom, aký je pooísaný vyš- šie. subklony s týmito fragmentárni s obidvomi orientáciami vzhíadom na pTZ18R DNA, ktoré sú označené pX8 a pXlO, sa získajú po transformácii E..coli. Z týchto subklonov sa zíkajú jednoreíazcové ^NA za použitia protokolu dodávaného firmou Pharmacia. Celé l,4kb Xba I fragmenty sa Dodrobia sekvenácii. Ďalších 700 báz prilehajúcich k Xba fragmentu sa sekvenuje z BamH I fragmentu v klone oB3 /fragment oB3 je v rovnaké j orientácii ako.pXS/, čím .sa získa celkom 2123 í báz sekvencie /SEQ-ID M0:l/· * Á £

Príklad 2 *' _r

Modifikácia HSZ génu miestne orientovanou mutagenézou l,4kD Xba I fragmentu nesúcom HSZ gén sú pritom** né tri Nco I miesta, všetky v HSZ kódujúcej oblasti. Žiaduce je, zachoval tu len jedno z týchto miest /nukleotidy 751 až ^56 v SEQ ID NC;1/, ktoré zahŕňa štart kodón translácie. Ž toho dôvodu sa miesta Nco I v polohách S70 až 9.1^ e 1333 až 1338 eliminujú miestna špecifickou mutagenézou oriento; vaňou na oligopeptid /vid Sambrook a další /198-9/ Moleculer Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Ha rbor Laboratory Press/. Oligonukleotidy syntetizované pre mutagenézu sú:

CFC99 ATGAACCCTT GGATGCA (SEQ ID NO: 8)

CFC98 CCCACAGCAA TGGCGAT · (SEQ ID NO: 9)

Mutagenéza sa uskutočňuje za použitia súpravy zakúpenej od firmy Bio-Rad /Richmond, CA/ podlá Drotokolu, kto37 rý prikladá predávajúci.

Pri tomto postupe dôjde k zmene A na T v nolohe

372 a C na A v oolohe 1334· Obidve sú na tretej pozícii orísz ' lušného kodonu a nemá to za následok žiadnu zmenu aininokyselinovej sekvencie kódovanej génom, pričom do zmene OCA na CCT je stále kódovaný pro a po zmene C-CC na GCA je stále kódovaný Ala. Plažmidový kloň obsahujúci modifikovaný HSZ gén s jedným Nco-I miestom pri ATG štart kodóne sa označí pX8m. pretože natívny HSZ gén má jediné miesto Xba I ori stop kodóne génu /13,84 až 1389» SEQ ID NC;1/ poskytuje produkt úplného štiepenia ^NA pomocou Nco I a Xba I 637ôd fragment /

obsahujúci celú kódujúcu sekvenciu prekurzora HSZ polypeDti^ du /SEQ ID NO:2/.

•Je žiaduce vytvorit formu HSZ génu s alternatívny mi jedinými miestami pre reštrikčné endonukleázy Dráve za koncom kódujúcej oblasti. Na tento účel sa oligonukleotidy UFC1O4 /SEQ ID NC;1C/ a CFC1C5 /SEQJD NC:11/:

CFC104

5’-CTAGCCCGGGTAC

CFC105

-3' (SEQ ID NO:10)

\ anelujú a ligujú do miesta Xba I, pričom dôjde k zavedeniu • dvoch nových miest Sma I a Kpn lak zničeniu niista Xba I.

^;; Teraz sa jediné miesto Xba I z nukletidov 1 až 6 v SEQ ID N N0:l a jediné miesto Ssp I z nukleotidov 1823 až 1828 v SEQ ID NO:1 použijú pre získanie fragmentu, ktorý zahŕňa HSZ kódujúcu oblast plus jej 5' a 3'regulačné oblasti. Tento fragment sa klonuje do obchodne dostupného vektora pTZlR /pharmacia/ štiépeného Xba I a Srna I, ,za vzniku plazmidu podo. x.··..

Je žiaduce vytvorit pozmenenú formu HSZ génu s jediným miestom pre reštrikčnú endonukleázu na začiatku maturovaného proteínu, t.j. s odstránenou aminoterminálnou , signálnou.·sekvenciou. Za tým účelom sa pomocou FCR zhotoví fragment DNA spôsobom popísaným v príklade 1. Templátovou DNA ore PCR je plazmid pX°m. Ako oligonukletidové prímery. pre reakciu sa použijú*

CFC106 5'-CCACTKAISňCCCATATCCCAGGGCACTT-3' (SEQ IĎ NO:12) • z ' ' ‘

CFC88 S'-TTfťTATCTAGAATGCAGCACCAACAAAGGG-3¹ (SEQ ID NO:13)

Oligonukleotid CFC1O6 /SEQ ID NO :12/ Doskytuje fragment zhotovený PCR s miestom pre BspH I /je podčiarknuté/, ktorý po štiepení BspH I poskytuje lepivý koniec, ktorý je totžný skoncom vytvoreným štiepením Nco I. Toto miesto je lokalizované na spojke signálnej sekvencie s., kódujúcou sek- • venciou pre maturovaný HSZ· Oligonukleotid CFC88 /SEQ ID NO: 13/ poskytuje fragment zhotovený ^rCR s miestom pre Xba I /je podčiarknuté/ nakonci trabslácie génu pre HSZ· Fragment BspH I -Xba I /SEQ ID NO:3/, získaný štiepením fragmentu získaného PCR, kóduje maturovanú formu HSZ s prídavkom metionínového zvyšku pri aminokonci proteínu, aby sa^tak umožnila ini ciácie translácie.

Príklad 3 ‘ i . . !

Expresia HSZ génu v E·· coli a

Na expresiu HSZ kódujúcej sekvencie v E. coli sa co užije bakteriálny expresný vektor pBT43O· Tento vektor je derivátom ρΕΤ-3θ /Rosenberg a další /1987/ Gene 56: 125 až 135/, ktorý používa systém baktériofágová T7 RNA Dolymeráza/ T7 promótor, plazmid pBT43O sa skonštruuje tak, že sa najskôr zničia miesta Ecor I a HIND III v pET-3a v ich pôvod- • ných polohách. Potom sa v mieste BamH I ρΕΤ3θ vloží oligo- ’ ' -39.- j -, '·; ι ŕ

i nukletidový adaptor obsahujúci miesta EcoF! I a HIND III. Tým j- sa získa pET-3aM s prídavnými jedinými klonovacími miestami pre inzerciu génov do expresného vektora. Potom sa Ndé I ? miesto v polohe iniciácie translácie prevedie na Mco I miesto í

Í . za použitia mutagenézy orientovanej na oligonukleotid. Sek-.

..venčia DNA v tejto oblasti pET-3^aM> 5* -CATATGG /miesto Nde I.

ä. je podčiarknuté/ sa prevedie na 5 -CCCATGG /miesto Nco I je fi * a podčiarknuté v pBT 430· ♦j Fragment Nco I-Xba pX8m /SEQ ID NO:2/, viá príklad 2, í sa izoluje z agarózového gélu po elektroforéze za použitia ; DEAE celulózovej membrány, !ako je to popísané v príklade 1.

í Tento fragment sa liguje k dvom anelovanýn /teplotné hybridizovaným/ oligonukleotidom CFC104 /SEQ ID NO:10/ a OFClC’5 í /SEO ID NO:11/. T

J CFC104 5’-CTAGCCCGGGTAC -3’ (SEQ ID NO:10)

CFC105 3'!- GGGCCCATGGATC-5' (SEQ ID NO: 11)

J· •j čím sa zavedú dve nové reštrikčné miesta Srna I a Κρη I na · ' · \

Xba I konci fragmentu. Ligácia sa terminuje lCminútovým zohriatím na 65 °C · Ligačné produkty sa štiepia Sma I, čím sa i ó * , ·-.

Ί I. získa fragment s tupým koncom 3 . Expresný vektcr OBT43O .^:j ' sa štiepi EcoR I a lepivé konce sa zaplnia prídavkom dATP a j . dTTP a Klenowovým fragmentom z E. gqIí DNA polymerázy. Vekή tor DNA s tupým koncom sa potom štiepi ncola reakčná zmes sa * . dvakrát extrahuje fenolom a vyzráža etanolom. 640bp fragment.

Nco Ι-Sma I obsahujúci kódujúcu oblasť pre HSZ sa liguje k Nco I utpému vektoru pBT43Ó· Kloň, ktorý obsahuje olazmid ; označený pCCH, sa identifikuje skríningom transformantov E.

í; coli na požadovaný rekombinačný produkt. Cd tohto olazmidu íi f sä dčakáva, že bude exorimovaí Drekurzor proteínu HSZ· í

J '

Tiež sa skonštruuje plazmid určený.pre expresiu proteínu HSZ bez jeho signálnej sekvencie v E. coli. Fragment DNA kódujúci maturovaný HSZ pre túto konštrukciu sa zostrojí za použitia PCR» plazmidového pXgm, ako templátu a oligonukleotidov CFC1O6 /SEQ ID?N0:12/ a CFC88 /SEQ ID NO :13/, ako prímerov spóssobom popásaným v príklade 2.

j

H

H .· i . i í

J

CFC106	S ’ -cr.ACTTQAIGACCCAŤATCCCAGGGCACTT-3'	(SEQ ID NO:12)
MetThrHisIleProGlyHisLeu	(aminokyseliny
—		1 až 8

SEQ ID NO:3)

CFC88	3 ’ -GGGAAACAACCACGACGTAáSAI£ZATCTT-5'	(SEQ ID N0:13)
4	ProPheValGlyAlaAlaPheEnd	(aminokyseliny
	t	105 až 191
		SEQ ID NO:3)

Oligonukleótid CFC1O6 /SEQ ID NC¹:12/ poskytuje fragment PCR s miestom BspH I /hore je podčiarkňtué/, ktorý vytvára lepivé konce, ktoré sú totožné, ako v príklade použitia Nco I. Sekvencia ATG v tomto mieste predstavuje iniciačný kodón translácie a sekvencia ACC, ktoár za ňou nasleduje, kóduje treonínový zvyšok na aminokonci maturovaného proteinu. Miesto Xba I v oligónukle.otide UFC88 /SEQ ID NO:13/ /vo vyššie uvedenom vzorci je podčiarknuté/ poskytuje vhodné klonovacie miesto na konci kódujúcej sekvencie. Reakčný produkt z

PCR sa 2* vyzráža v 2M octane amonnom a 70% etanole, aby sa odstránil nadbytok oligonukleotidových prímerov. Konce fragmentov DNA sa otupia reakciou s Klenowovým fragmentom E. coli DNA polymerázy za prítomnosti všetkých štyroch deoxyribonukleotidtrifosfátov. Reačkné produkty sa oddelia elektroforézou na agarózovom .géle a zafarbia sa etidiumbromidom. Prevažujúci 570 bp pás sa eluuje za použitia DEAE celulózovej membrány postupom popísaným vyššie. DNA sa potom štiepi BspH I, 2x prezráža etanolom a liguje k rovnakému fjco I-tupému fragmentu expresného vektora pBT43O, popísanému vyššie. Kloň obsahujúci plazmid označený puC12 sa identifikuje skríninI gom transf ormant,pv E·^colina .požadovaný rekombinačný Drodukt. Klonovaný fragment vytvorený PCR sa sekvenuje; jeho sekvencia je totožná so SEQ ID NO:3·

Pre detekciu expresie HSZ polypeptidov sa olazmidy PCC11 a PCC12 transformujú do E. coli kmeňa HMS174· a vykoná sa in vivo zna^^ý experiment spôsobom, ktorý popísali Studier a Moffat /^86/ J· Mol. Biol. 189: 113 a 130. Proteíny sá značia jednu- hodinu pred indukciou /prostredníctvom infekcie lambda fágom CE6 nesúcim gén pre T7RN.A polymerázu/ za použitia ^^S-metionínu, o ktororm sa predpokladá, že bude intenzívne značiť tieto polypeptidy bohaté na metionín. Bunkové extrakty sa analyzujú na SDS polyakrylamidovom géle a po usušení sa vykoná autofádiografia . V oboch extraktoch PCC11 a PCC1.2 je zrejmý výrazný pás s molekulovou hmotnosťou približne 20 kD. To je približná veíkosť, ktorá, je očakávaná u polypeptidu HSZ s maturovanou dĺžkou a naznačuje to, že prekurzorový proteín vytvorený v pCCll transformante bol E. coli sDracovaný. ked bol celkový bunkový proteín zviditelnený farbením briliantovou modrou uoomasie, po indukcii a elektroforéze SDS na pólyakrylamidovom géle, bol výrazný indukovaný 20 kD proteín zrejmý v lyzátoch pCC12, ale nie v lyzátoch PUCH.

A ' ·

Príklad!

Purifikácia HSZ proteínu vyrobeného v E· coli

Jednolitrová kultúra E· coli kmeňa BL21/DE3/PLysE /Studier a další /1990/ Methods in Enzymology 185: 6 až 897» transformovaná PCC12, sa pestuje v LB médiu obsahujúcom ampicilín /100mg/l/ a chloramfenikol /10mg/l·/ pri teolote 37 °C. Po dosiahnutí optickej hustoty pri 600 nm 1,08 sa pridá 1,2 ml O, IM IPTG /izopropyltio-ŕ»-galaktozidu, ako inducer/ a v inkubácii sa pokračuje 3 hodiny Dri 37 °C. Potom sa bunky zhromaždia centrifúgáciou, premyjú sa' 50mM chloridu sodného;;

50mM Tris-Cl s pH 7,5; ImM EDTA, resuspendujú sa v 10 ml rov* i -O nakeho pufra a zmrazia pri -20 C.

;] ; . ·

Suspenzia sa nechá roztopiť, pridá sa povrchovo akJ tívna látka Triton X-100 až do koncentrácie 0,1 % a potom ,’ί i 3000 jednotiek deoxyribonukleázy I /Boehringer-Mannheim/. Po | 60 minútach inkubácie pri teplote miestnosti sa suspenzia ; spracuje ultrazvukom na lade, aby sa znížila jej viskozita, u Zmes sa centrifuguje a supernatant vyleje. Peleta sa 2x ex.1 · trahuje 5 ml 70 % izopropylalkoholu; 10mM jJ-merkaptoetanolu.

V tomto rozpúäladle je HSZ, na rozdiel od väčšiny proteínov, :$ rozpustný. Slektroforézou na polyakryloamidovom géle /SOS/ i a vyfarbením briliantovou modrou j’oomassie 3a zistí, že HSZ proteín je hlavným oroteínom pri prvej extrakcii /nad 90 %/ a jediným pozorovateľným proteínom pri druhej extrakcii. Z 1 litra bunkovej kultúry sa získa 1C až 10C mg proteínu HSZ.

' Purifikovaný proteín HSZ bol zaslaný do ústavu Hazelton Research Facility, 310 Swampridge Road, Denver, PA 17517, USA, za účelom získania králičích protilátok vypestovaných proti tomutc proteínu.

i,'.

•i · .

·*! ·

P r í k 1 a d 5

J

J

Konštrukcia génu· kódujúceho domény s vysokým obsahom ) . · ! metionínu v HSZ 'J Proteín HSZ sa skladá z centrálnej oblasti, ktorá je ^r i ; velmi bohatá na metionín /približne 48 % metionínových zvyší kov/ a ktorá je lemovaná aminoterminálnou sekvenciou a karboí : ‘j .... · .

J xyterminálnou sekvenciou, v ktorých je obsah metionínu nízky /10 % metionínu a 7 % metionínu /. Cenrtálna oblasí sa skladá

- 43 ; · i s z opakujúceho sa motívu Met-Met-Met-Pro /SEQ ID NO:27/· Príbuzný proteín, lOkDzeín, má podobnú štruktúru /vid obr. 3/.

) Centrálna oblast proteínu HSZ je však približne 2x tak velká ? než zodpovedajúca oblasí lCkD zeínu, čo sa prejevuje zvýšeným ; obsahom metionínu v HSZ· Zrejmá duplikácia centrálnej domény s vysokým obsahom metionínu v HSZ oproti lCkD zeínu naznačuje , . žp by centrálna doména s vysokým obsahom metionínu mohla mat stabilnú štruktúru a mohla by sa sama exprimovaí za vzniku zá’i sobného proteínu s vysokým obsahom metionínu.

Skonštruuje sa gén pre kódovanie domény s vysokým obsahom metionínu /HMD/ HSZ· Na to sa použije PCR, pooísaná ' i' : v príklade 1, za použitia pX8 ako templátovej -DNA a oligonukleotidovAJR5 /SEQ ID N0:14/> JR6 /SEQ ID NC-.15/, ako príme.·! rov pre syntézu DNA·

J

.) ’i jr5 5’-TCACCGCTTCAGCAGTGC£ÄlAIfiCCAATG-3’ (SEQ ID NO: 14) ' í . ...

JR6 c,»-TrTTAnAATTCTATGGCATCATCATTGGTGACÄCCATGCT-3¹ (SEQ ID NO:15) /

M '

J .· .

' ? ’ , ’j

Prímer JR5 /SEQ ID NO :14/ spôsobuje zavedenie miesta ή Nde I /hore Dodčiarknuté/ do produktu PCR. Prímer JP.6 /SEQ / f!. _a ID NC:15/ spôsobuje zavedeinie miesta Ecor I /ho re je p.od/ čiarknuté/ do produktu PCR. Tieto miesta umožňujú ligáciu ' ‘i ·· HMD k pET“3aM expresnému vektoru /Rosenberg a další /1987/ ''' Gene 56: 125 až 135 a príklad j/. Nukleotidy ATG v mieste Nde / I predstavujú kodón iniciácie translácie v expresnom vektore

·.! a miesto EcoR I bezprostredne nasleduje za terminačným kodonom translácie. ^:

·. /

H produkt PCR sa štiepi Nde I a EcoR I a liguje k pETzj -3aM, ktorý bol-štiepený Nde I a EcoR I. po transformácii E.

* · i η coli sa identifikújú klony obsahujúce požadovaný rekombinač.W ný plazmid a overí sa sekvenáciou DNA vloženého fragmentu

DNA· Nukleotidová sekvencie a odvodená aminokyselinová sekvencia génu pŕe.HMD je znázornená v SEQ ID N0:4·

Príklad 6

Konštrukcia chimerických génov pre expresiu HSZ v rastlinách '•í- x . V

Pre konštrukcie chimerických génov nre expresiu HSZ v rastlinách boli použité tri, vzhladom k semenám špecifické, expresné kazety. Expresné kazety obsahujú regulačné oblasti z troch vysoko exprimovaných génov pre zásobný proteín v semenách:

1/ £úodjednotkp fazeolínu z fazule Fhaseolus vulgaris;

2/ λ podjednotku β-konglycimnu zo sóje;

3/ lCkD zeín z kukurice.

Kazety sú schematicky znázornené na obr. 2.

Fazeolínová kazeta obsahuje asi 500 nukleotidov pred /5/ iniciačným kodónom translácie a asi 1650 nukleotidov za /3'/ stop kodónom translácie fazeolínu. Medzi oblasťami 5a 3'existuje jediné miesto pre reštrikčnú endonukleázu Nco I /ktorá zahŕňa iniciačný kodón translácie ATG/ a jediné miesta pre reštrikčné eridonukleázy Srna I, Κρη I a Xba I. Celá kazeta je lemovaná miestami Hind III. Sekvencie DNA týchto regulečných oblastí boli popísané v literatúre /Tloyle a další /1986/ J· Biol. chem. 261; 9228 až 9238/· Nedávna práca /Bustos a další /199L- EMBO 10:1469 až 1479/* ukazuje, že oblasť promótora tejto kazety nezahŕňa všetky prvky sekvencie DNA, ktoré sú potrebné na dosiahnutie úplnej úrovne exoresie j

- 45 fazeolínového promótora, ale dá sa očakával len dosiahnutie 20 až 30 % úplnej úrovne expresie.

p-konglycinínová kazeta zahŕňa asi 610 nukleotidov pred /5 / iniciačným kodónom trasnlácie β-konglycinínu a asi 16$0 nukleotidov za /3 / stop kodonom translácie fazeolínu. Medzi oblastami 5'a 3 existuje jediné miesto pre reštrikčnú endonukleázu Nco I /ktoré zahŕňa iniciačný kodón translácie ATG/ a jediné miesta pre reštrikčné endonukleázy Sma I, Kpn I a Xba I. Celá kazeta je lemovaná miestami Hind III. Sekvencie DNA týchto Oblastí boli poDÍsané v literatúre /Doylea ďalší /1986/ J. Biol. Chem. 261: 9228 až 9238/.

10kD zeínová kazeta zahŕňa asi 925 nukletidov pred /5 ' / iniciačným kodónom translácie a asi 945 nukleotidov za /3' / stop kodónom translácie fazeolínu. Medzi oblastami 5'a 3'existuje jediné miesto pre reštrikčnú endopukleázu Nco I /ktoré zahŕňa iniciačný kodón translácie ATG/ a jediné miesto pre reštrikčnú endonukleázu Sma 1. Celá kazeta je lemovaná miestom EcoH I na konci 5 a mistami BarnF I, Sal I s Hind III na 3'konci, -ekvencie DNA týchto regulaných oblastí boli popísané v literatúre /Kirihara a ďalší /1988/ Gene 71: 359 až 37.C/· · ΐ ζ ^v * ; · · / /·

Fragment nco Ι-Xba I obsahujúci celú kódujúcu oblasl pre HSZ /viď príklad 2/ sa izoluje z agpóžového gélu po' eleltroforéze za použitia DEAE celulózovej membrányspôsobom popísaným v príklade 1. Fragment Bs5>H ΙτΧΒΑ' I obsahujúci gén bez signálnej sekvencie, t.j. kódujúcej sekvencie pre rnaturovaný proteín, sa izoluje spôsobom pouísaným v príklade 3· Tieto fragmenty DNA sa vložia do fazeolínovej aβ-konglyciníno novej expresnej kazety, ktoré boli:, štieoené Nco Ι-Xba ±. Tým boli vytvorené 4 chimerické. gény:

1) fazeolínová 5' óblasť/natívny HSZ/fazeolinová 3'oblasť

2) fazeolínová 5' oblasť/maturovaný HSZ/fazeolínová 3'oblast

3) β-konglycinínová 5/ oblasť/natívpy HSZ/fazeolínová 3'oblasť

4) β-konglycinínová 5’ oblasť/maturovaný HŠZ/fazeolínová

3'oblasť.

Skonštruujú sa dalšie chimerické gény pre nahradenie natívnej jednoklíčnej signálnej sekvencie ESZ dvojklíčnou signálnou sekvenciou z fazeolínu. ?: tomuto účelu sa syntetizuje oligonukelotid CFC112 /SEQ IP NO:16/ a CFC113 /SEQ ID NO: 17/. Tepelne hybridizované „oligonukleotidv .vytvoria Nco I kompatibilný koniec a Nhe I/Spe I-kompatibilný koniec /vid dalej/.

CFC112 5'-CATGATGAGAGCAAGGGTTCCACTCCTGTŤGCTGGGAATTCTT CFC113 3' tactctcgttcccaaggtgaggacaacgacccttaagaa MetMetArgAlaArgValProLeuLeuLeuLeuGlylleLeu

CFC112 TTCCTGGCATCACTTTCTGCTAGCTTTG 3

CFC113 AAGGACCGTAGTGAAAGACGATCGAAACGATC-5'

PheLeuAlaSerLeuSerAlaSerPhe (SEQ ID NO:16) (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:16)

Plazmid pCC13 obsahujúci gén pre HSZ lemovaný 5'a 3* regulačnou oblasťou fazeolínu sa štiepi Nco I a SDe I, čím sa odstráni väčšina natívnej signálnej sekvencie HSZ· K rozštiepenému pCC13 sa ligujú tepelne hybridizované oligonukleotidy 'JFC112 /SEQ ID NO:16/ a CFC113 /SEQ ID NO:!?/. Takto vytvorený plazmid sa označí ako pCClS a sekvencia chimerického génu obsahujúca maturovený proteín HSZ fúziovaný s fazeolínovou signálnou sekvenciou sa potvrdí sekvenovaním DNA /SEQ ID NC: 18/.

í

Pretože Spe I miesto /nukleotidy 57 až 62 v SEQ ID NO:2/ nie presne na spojovacom článku signálnej sekvencie

HSZ/maturovaný proteín, vloží sa medzi .koniec fazeolínovej signálnej sekvencie a maturovaný HSZ proteín týmto spôsobom dalšie aminokyseliny. Pre ich odstránenie sa vytvorí pomocou PCR HSZ fragment za použitia olígonukleotidov CFC114 /SEQ ID NO;19/> vid Šalej a UFC88 /SEQ ID NC;13/, vid príklad 2, ktoré slúžia ako priméry, pričom pCC18 slúži ako DNA templát.

CFC114

TTCTGCTAGČ ŤTÍGOTACCC ATAŤCCCAGG G (SEQ ID NO:19) \ · s -í í

Produkt PCR sa štiepi Nhe I a Xba I a Drečistí elektroforézou na géle. Plazmid PCC1S sa štepí rovnakými enzýmami, aby sa odstránil fragment DNA kódujúci fúzionovaný croteín obsahujúci dve aminokyseliny naviac a poton sa vloží fragment DNA vytvorený FCR· Štruktúra výsledného plazmidu, ktorý nesie označenie pCC24> sa potvrdí sekvenovaním DNA /SEQ ID NC:2O/.

j Pre nahradenie natívnej signálnej sekvencie HSZ fáze· olínovou signálnou sekvenciou v chimerlckom géne obsahujúcom fr-konglycinínovú 5. oblasi sa syntetizuje nomocou PCR fragment za použitia CFC123 /SEQ ID NO:21/, vid dalej a CFC88 ,/SEQ ID NO:.137» vid príklad 2, ako prímerov a PCC24, ako templátu.

, . CFC123 ' _t ;

ACTAATCATG ATGAGAGCAA GGGTTCCACT (SEQ ID NO:21)

Fragment DNA vytvorený PCR sa .štiepi SspH I a Xba I a prečistí elekroforézou na géle. Tento fragment DNA sa vloží do 3-konglycinínovej expresnej kazety, ktorá bola štiepená Nco Ι-Xba I. Štruktúra vloženého fragmentu sa’potvrdí sekvenovaním DNA /SEQ ID NO :20/. Tento plazmid nesie označenie PCC30.

Oligonukleotidy CFC1C4 /SEQ ID NO ::10/ a 0FC1O5 /SEQ ID;NO:11/, vid príklad 13, sa vložia do kazety lOkD zeínu v mieste xba I pri karboxy'-kcnci, čím sa zavedie jediné miesto Srna I. fragment Nco I-Sma I obsahujúci kódujúcu oblast pre HSZ sa izoluje z píazmidu pcdO /vid príklad 2-/ a vloží do kazety s lCkD zeínóm, ktorá je štiepená Nco I-Sma I.

Príklad 7

Transformácia tabaku chimerickými génmi fazeolín-HSZ

Kazety chimerického génu fazeolín-HSZ·, fazeolínová 5' oblasl/natívny 7SZ/fazeolínová 3 oblast a fazeolínová 5' oblast/maturovaný HSZ/fazeolínová 3' oblast /príklad 6/ sa izolujú vo forme oribližne 2,3 kb Hind III fragmentov. K týmito. fragmentom sa pridajú Hind III-BamH I adantorové nukleotidy za účelom inzercie do jediného BamH I miesta vektora PZ98K /obr. 3/, ktorý je častou binárneho Ti plazmidového vektrového systému /Bevan /1984/ Nucl. Acids. Bes..12: 8711 až 8720/ Agrobacterium túmefaciens. Tento vektor obsahuje 1/ nopalín syntetázu/neomycín fosfotransferázu chimerického génu /číslo: NPT II/ ako selekčný marker pre transformované rastlinné bunky /Bevan a další /1983/ Náture 304: 184 až 186/» 2/ ľavú a pravú hraničnú oblast T-DNA TI plazmidu /Bevan /1984/ Nucl. Acid. Kes. 12:8711 až 8720/, 3/ E. coli lacz <*~komplementačný segment /Vierija a Messing /1982/ Gene 19: 259 až 267/ s jedinými miestami pre reštrikčné endonukleázy Ecor í, Κρη I, BamH I,Sal I, 4/ počiatok bakteriálnej replikácie z plazmidu z Fseudomonas pVSl /itoh a další /1984/ Plasmid 11: 206 až 220/. a 5/ baKteriálby gén pre neuomycín fosfotransferázu z Tn*5 /Berg a další /1975/ Proc.Natl. Acad_; Sci USA, 72: 3628 až 3632/, ako selekčný marker ore transformovaný Agrobacterium túmefaciens.

Kazeta chimerickeho génu pre fazeolín-HSZ, fazeolínová 5 oblasť/fazeolínová signálna sekvencia/ maturovaný HSZ/fazeolínová 3'oblasť /príklad 6/ sa izoluje vo forme približne 2,3 kb Hind III fragmentu. Tento frágment sa vloží do jediného Ilind III miesta binárneho vektora pZS97 /obr. 4/. Tento vektor sa podobá vektoru pZS97K, ktorý je popísaný vyššie, s výnimkou prítomnosti dvoch prídavných klonôvacích miest, jediného miesta Sma I a jediného miesta Hind II a génu pre β-laktamázu, ktorý zaisťuje rezistenciu voči ampicilínu,; ako je selekčný marker pre transformovaný kmeň A. tumefaciens a ktorý je prítomný miesto bakteriálneho génu pre neo. mycín fosfotransferázu.

/ .j

V' ··.

Binárne vektory obsahujúce chimerické HSZ gény sa prenesú triparentálnym spojením /rnating/ /Ruvkin a ďalší /1981/ Náture 289: .89 až 88/ do kmeňa Agrobacterium LBA44O4/ PAL44C4 /Hockema a ďalší /1983/ Náture 303: 179 až 180/. Transformanty Agrobacterium sa použijú na inokuláciu terčíkov z tabakových listov /Horsch a ďalší /1989/ science 227: 122'9 sž 123'V·j Transgénne rastliny sa regenerujú v selektívnom médiu obsahujúcom kanamycín.

y .

í ’¹ '

Z mladých listov sa extrahuje genómová DNA a analyzuje sa pomocov PCR? aby sa zistila prítomnosť chimerických génov pre HSZ v transformovanom tabaku. Ako prímery ore PCR reakciu sa použijú pligonukleotidy CFC93 /SEQ'ID NO:22/, viď ďalej a 0FC77 /SEQ 'ID NO:7/, vid príklad. 1» :· . . U : . .

CFC93 .?

GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA (SEQ ID NO:22)

Od týchto rpímerov sa očakáva vytvorenie 429 bp frag mentov DNA, ktorý bude vzhladom ku génu HSZ interný. Šestnásť z dvadsiatich skúšaných transformantov je ori tejto skúške Dozitívnych /viď tabulky 1 a 2/· ŕ

í • · 1 · &

-^0Na zistenie -expresie chimerických génov sa transformované rastliny nechajú Vykvitnúť, sammoopeliť a vytvoriť semená. Zo zrelých semien sa nasledujúcim sposobom extrahuje všetok proteín: ’ - • Λ

Približne 200 mg semien sa umiestni do l,5ml plastovej mikrocentrifugačnej skúmavky pre jedno použitie a rozdrtí v 0,25 ml 50mM Tris-Cl o pH 6,8, 2mM EDTA 1% SDS 1% β-merkaptoetanolu. Drvenie sa prevádza pomocou motorového drviča za použitia plastových hriadeľov pre jedno použitie ktoré sú upravené tak, aby sa hodili do mikrocehtiifugačné?j skúmavky. Výsledné suspenzie sa 5 minút centrifúgujú pri teplote miestnosti v mikrocentrifugačnej skúmavke, aby sa odstránili pevné častice. Celkový obsah proteínu v supernatante sa stanoví . pomocou, proteínového stanovenia BioPAD za použitia hovädzieho sérového albumínu, ako štandardu.

Z každého extraktu sa 10 |ig proteínu analyzuje v jednej dráhe polyakrýlamidového gélu SDS, pričom ako pozitívneho kontrolného vzorku sa používa maturovaného HSZ vyrobeného bakteriálnym postupom a ako negatívneho kontrolného vzorky sa používa proteín extrahovaný z netransformovaných tabakových semien. Potom sa proteíny elektroforeticky blotujú na nitrocelulózovú membránu. Membrány sa exponujú protilátkam proti HSZ /viď pr. 4/ v zriedení 1:1700/ z králičieho séra, za použitia štandardného protokolu, ktorý firma BioRad poskytuje spolu so súpravou Immun-Blot. Po premytí, za účelom odstránenia naviazaných primárnych protilátok sa mambrány exponujú sekundárnej protilátke, osliemu protikráličiemu.Ig konjugovanému ku chrenovej paroxidáze /Amersham/ v zriedení 1:1300. Po premytí, ktorým-sa odstraňuj e nenaviazaná sekundárna protilátka_? sa mambrány spracujú chemiluminiscenčným reakčným činidlom Amersham a exponujú na.rontgenografický film.

< - 51 - · _t

Väčšina transformantov, ktoré obsahujú gén pre HSZ na základe analýzy PCR tiež produkuje HSZ.proteín podlá imunologického skríningu /tabuľky 1 až 3/· Vo všetkých prípadoch je veľkosť produkovaného proteínu približne rovnaká ako veľkosť maturovaného HSZ produkovaného v j

S.coli, čo ukazuje, že došlo k odstráneniu natívnej- aj) fazeolínovej signálnej sekvencie, čo naznačuje, že proteín vstúpil do endoplazmického retikula. 1.

Semená sa tiež extrahujú zmesou 76¹% izopropylalkohoi/l % jí-merkaptoetanolu, čo jé rozpúšťadlo, v ktorom je rozpustných málo proteínov okrem HSZ. Proteíny sa potom analyzujú SDS-PAGE, blotovaním Western ä imunologickou skúškou, popísanou vyššie. Za týchto podmienok sa zistí onäť, že veľkosť proteínu zoduovadá maturovanému HSZ, čo potvrauje identitu detegovaneho proteínu ako HSZ.

úroveň expresie HSZ v transformovaných líniách sa odhadne na základe citlivosti na protilátky proti HSZ a množstva proteínu naviazaného na gél SDS-PAGE. HSZ tvorí približne 0,05 až 0,5 % celkového proteínu semien.

Za účelom stanovenia zloženia aminokyselín v semenách zo šiestich semien hyčLrolyzuje v 6N kyseline chlorovodíkovej s 0,4 % p-merkaptoetanolu pod atmosférou dusíka počas '24 hodín pri 110 až 120 °C. Jedna de’satina vzorky sa analyzujevanalyzátore aminokyselín Beckman model 6300 za použitia ninhydrínovej detekcie za stĺpcom. I-ielatívna koncentrácia metionínu v semenách sa porovnáva formou pomeru metioníníleucín, takže sa leucín používa ako interný štandard. Štandardná.odchýlka pomeru metioníníleucín činí približné φ%. Pri'najväčšej úrovni expresie HSZ podľa stanovenia analýzou Western-Blot by bolo možné očakávať nárast í koncentrácie.metionínu prostredníctvom HSZ αγ semenách o asi

10%. Vzhľadom k tomu, že táto hodnota ,je· tak blízka štandardnej odchýlke, nie je pozorovaný žiadny účinok expresie HSZ na celkový obsah metionínu'v semenách /tabulky 1 až 3/.

Tabuíka 1 pCC15 transformanty fazeolínová 5' oblasť/maturovaný HSZ/fazeolínová 3’ oblasť

i.

línia	PCR	Western	Met:Leu
15-17A	+	+
15-29A	+	-
15-34A	+	+
15-40A	+	+	0,19
15-50Λ		+++	0,19
15-55A	+	++
15-27B	+	+	•
15-49B	-	+
15-54B	+	-	•
15-38A	+	+

e

Tabulka 2 ppGlp transformanty fazeolínová 5' oblasť/natívna

HSZ/fazeolínová 3' oblasť

línia	PCR	Western	Met:
16-7A	+	+++	0,20
16-16A	+	+
16-24A	-	- f
16-48A	-	-
16-6B	+	-
16-11B	-	-	0,19
16-33B	+	+
Í6-ŕ49B	+ ,	-
16-54B	+
16-55B	+	Tabulka	3

pCC15 transfonty fazeolínová 5 * oblasť/fazeolínová signálna sekvencia/maturovaný HSZ/fazeolínová 5' oblasť línia

PCR

Western

Met:Leu

36-1B ^:+

36-4B+

36-5A+

36-20A+++

36-23C+

36-35B ‘++

36-39A+

36-46B++

36-47D

36-55D

0,20

- 54 PríkladS

J ·, ·

Expresia proteínu HMD v E. coli

Kultúra E. coli kmeňa BL21 /DE3/ pLysE' /Studier a ďalší /1990/ Methods in Enzymology 185: 6.0 až 89/ transformovaná pla-zmidom pX8M-18 sa pestuje v Ϊ0 litroch média LB obsahujúceho ampicilin /100 mg/1/ pri 37 °C· Pi'i dosiahnutí optickej hustoty pri 600 nm asi 1 se pridá IPTG /izopropyltio-^-galaktozid, ako induktor/ do výslednej koncentrácie lmM a v inkubácii sa pokračuje 8 hodín pri 37 **0 Bunky sa centrifigujú, premyjú 50nM chloridom sodným, 50nM Tris-Cl o pH 7,5, ImM.EDTA /pufer A/ a zmrazia sa pri -30 ¾.

Zmrazené bunky sa nechajú roztopil na lade v 5 ml pufra A na grám buniek. Pridáj sa’ doexyribonukleáza I /Sigma/ do koncentrácie 0,1 mg/1. Po 60 minútach inkubácie pri teplote miestnosti sa suspenzia spracuje na lade ultrazvukom, aby sa znížila jej viskozita. Zmes sa odstredí a supernatant sa vyleje. Peleta sa 2x extrahuje 25 al f>7O% izopropylalkohoíu, 10 mM ^-mérkaotoetanolu. Hl®, podobne , _w 's ’i ako HSZ, je v tomto rozpúšťadle rozpustná. Pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géle ”šds a vyfarbenia briliantovou modrou Cóomassie sa zistí, že HMD nroteím^Äe hlavným proteínom tri extrakcii. Analýzou Western Boltí/sa^

W4-; zistí, že HMD proteín krížov© zareagoval s králičou pŕhťD·. látkou vypestovanou proti HSZ·. . d-.'

Príklad 9

Transformácia tabaku chimerickými génmi β-konglýcinín-HSZ

Kazety ,ô-konglycinínového chimerického génu t, p-konglycinínová 5' oblast/natívna HSZ/fazeolínová 3' • - 55 - oblasť, ^-konglycinínová 5' oblasť/maturovaný HSZ/faseólínová 3' oblasť a β-konglycinínová, oblasť/faze.olínová signálna sekvencia/matúrovaný HSZ/fazeolínpvá·; 3' oblasť /príklad 6/ sa izolujú vo forme približne 2,4kb Hind m fragmentov. Tieto fragmenty, sa vložia do jediného Hind III miesta binárneho vektoru pZS97 /obr. 4/. Tento vektor sa podobá vektoru pZS97K, popísanému v príklade 7, s výnimkou toho, že obsahuje dve prídavné klonovacie miesta. Jediné miesto Sma I a jediné miesto Hind III a gén pre bakteriálnu p-laktamázu /spôsobujúci! rezistenciu voči ampicilínu/, ako selekčný markeŕ, pre transformovaný kmeň A. tumefaciens, . namiesto bakteriálneho génu pre neomycín fosfotranferázu.

h

Binárne vektory obsahujúce chimerické HSZ gény sa prenesú triparentálnym spojením /mating/ ,/Puvkin a ďalší /1981/ Náture 289: 8> až 88/ do konca Agrobacterium

LBA44O4/pAL44O4 /Hockema a ďalší /1^83/ Náture 303: 179 až 180/. Transf ormant.y Agrobacterium sa použijúpre^ínokuláciu terčíkóv z tabakových listov /H or s ďalší /1985/. Science 227: 1229 až 1251/. Trensgénne rastliny sa regenerujú v selektívnom médiu obsahujúcom kanamycín.

Na zistenie, expresie chimerických génov sa transformované rastliny nechajú vykvitnúť, sammoopeliť a vytvoriť semená. Zo zrelých semien sa nasledujúcim spôsobom extrahuje všetok proteín:

Približne 200 mg semien sa umiestni _;do l,5ml plastovej mikrocentrifugačnej skúmavky pre jedno použitie a rozdrtí v n,25 ml ' 50mM Tris-01 o pH 6,8, 2mM EDTA 1% SDS 1% β-merkaptoetanolu. Drvenie sa prevádza pomocou motorového drviča za použitia plastových hriadeíov pre jedno použitie ktoré sú upravené tak, aby sa hodili do mikrocentiifugačnej skúmavky. Výsledné suspenzie sa 3 minút centrifugu.jú pri teplote miestnosti v mikrocentrifugačnej skúmavke, aby sa i

odstránili pevné častice. Celkový obsah proteínu V super_z ’í natante sa stanoví pomocou proteínového stanovenia BioRAD za použitia hovädzieho sérového albumínu, ako štandardu.

Z každého extraktu sa 10 jxg proteínu analyzuje v jednej dráhe polyakrylamidového gélu SDS, pričom ako pozitívneho kontrolného vzorku sa používa maturovaného HSZ vyrobeného, bakteriálnym postupom a ako negatívneho kontrolného vzorky sa používa proteín extrahovaný z netransformovaných tabakových semien. Potom sa proteíny elektroforeticky blotujú .na nitrocelulózovú membránu. Membrány sa exponujú'protilátkam proti HSZ /vlčí pr. 4/ v zriedení 1:1700/ z.králičieho^séra, za použitia štandardného protokolu, ktorý firma BioBad poskytuje.spolu so súpravou Immun-Blot. Po premytí, za účelom odstránenia naviazaných primárnych protilátok sa mambrány exponujú sekundárnej protilátke, osliemu protikráličiemu Ig konjugovanému ku chrenovej pajroxidáze /Amersham/ v zriedení 1:1300. Po premytí,ktorým sa odstranujenenaviazanásekundárna protilátka, sa mambrány spracujú chemiluminiscenčným reakčným činidlon Amersham a exponujú na rontgenografický film.

Jeden transformant obsahujúci chimeričký gén ŕ-konglycinínová 5* oblasl/maturovaný .HSZ/fazeolínová 3* oblast a dva transformanty obsahujúce chimerické. gény β-konglyciníndvá 5‘ oblast/natívna HSZ/fazeolínová 3' oblast', všetky produkujú proteín HSZ. Štyri; zo siedmich transformantov obsahujúcich chimerický gén β-konglycinínová 5' oblasl/fazeolínová signálna sekvencia/maturovaný HSZ/ fazeolínová 3' oblasú produkujú HSZ proteín /taoulka 4/. Vo všetkých prípadoch zodpovedá veíkost produkovaného proteínu približne velkosti maturovaného HSZ produkovaného v B. coli, čo ukazuje, že natívna aj fazeolínová signálna .sekvencia bola oaštepená dôsledkom čoho prcJtein vstúpil do endoplazmického retikula.

λ ’ --Λ ŕ 'A t í - 57j ·<

Za účelom stanovenia zloženia aminokyselín v semenách sa šesť semien hydrolyzuje v Sii kyseline chlorovodíkovej s 0,4 % β-merkaptoetanolu pod atmosférou, dusíka počas. 24 hodín pri 110 áž 120 °C. Jedna desatina vzorky sa analyzuje v analyzátore aminokyselín Beckman model 6500 za použitia ninhydríňovej detekcie za stĺpcom. Relatívna koncentrácia metionu v semenách sa porovnáva formou pomeru metionín:leucín, takže sa leucín používa⁵ ako.interný štandard. Štandardná odchýlka pomeiu metionín:leucín činí približne 5%. Línia s najvyššou úrovňou expresie HSZ podlá analýzy Western. Blot vykazuje najvyššiu hodnotu obsahu metionínu v semenách ako celku /tabuíka 4/. Táto hodnota je síce iba o 7% vyššia než hodnota priemerná, avšak sa usudzuje, že napriek jej blízkosti k chybe merania, je pravdepodobné, že takto vysoká úroveň metionínu je dôsledkom expresie HSZ.

T a b u í k a 4 β-konglycinín 5’ oblasť/fozeolínová signálna sekvencia/ maturovaný HSZ/fazeolínová J’ oblasť :

línia í	Wéštern	Met:Leu
39-1C	+	0,20
39-9C	-	0,20
39-13A	-	0,21
39-14C	+	0,20
39-15.C	- }	0,20
39-28A	++	0,21
39-36A	+ <	0,20

'· j / Ί e

. i

P r í k 1 a d 10

I Konštrukcia chimerického génu pre expresiu HMD v rastlinách

Tak ako v príklade 6 sa pre konštrukcie chimerického génu pre expresiu HMD v rastlinách použije voči semenám špecifickej genovej expresnej kazety. Expresná kazeta obsahuje regulačnú oblasť z β-podjednotky fazeolínu z fazule Phaseolus vulgaris. Vytvorený chimerický gén tiež obsahuje dvojklíčnu” signálnu sekvenciu pre fazeolín: fáze-; olínová 5' oblasť/fazeolínová signálna sekvencia/HMD/fazeolínová y oblasť.

Syntetizujú sa PCR priméry, CLM 1 /SEQ ID ŇO:23/ a CLM 2 /SEQ ID N0:24/ viu dalej a použije sa ich s plazmidom pJSHMDl,. ako templátom, pre vytvorenie fragmentu DNA obsahujúceho sekvenciu HMD fúz'ovanú k 5' konci fazeolínovej signálnej sekvencie a lemovanou miestami Nhe 1 a Zba I. Plazmfd pCC24, diskutovaný v príklade 6, sa štepí Nhe I, ktorý .prevedie štepenie vo fazeolínovej signálnej sekvencii a Iba I a prečistí elektroforézou na agarózovom géle.: Prečistený vektor sa liguje k PCR produktu vr/tvorenému z CLM 1 /SEQ ID NO,;23/, CLM 2 /SEQ ID NO:24/ a pJSHMD1, dôsledkom čoho sa regeneruje úplná fazeolínová signálna sekt . >

venčia viazaná k HMD. Produkt ligác^S nesie označenie , pJRHHĽ2. Sekvencia chimerického génu /SEQ ID 1^:25/ sa potvrdí sekvenovaním DNA.

,1 i

i i í

I i i

CLM 1 Nhel

5' TGCTTGCTAGCTTTGCTATGCCAATGATGATGCCGGGT

AlaSerPheAlaMetProMetMetMetProGly

CLM 2 Xbal

TGCTTTCTAGACTATGGCATCATCATTGGTGACACC

3' (SEQ ID NO:23)

3' (SEQ ID NO:24)

5’

- 59 . P r í k 1 a d. 11

Transformácia sóje chimerickým génom fazeolín-HSZ

Pre indukcie somatických embryí sa kotyledony o dĺžke 4 až 5 mm, ktoré sú pozdĺžne rozrezané, z povrchovo sterilizovaných nezrelých semien ..-sójového ' ’ ^-lí ’í ' ' kultivaru XPJO15, . kultivujú v tme pri 25 °0 na agarovom ^f- ' í _v . v médiu./SB1 alebo SB2/ počas 8 až . 10 týždňov·.. Somaticka embryá, ktoré poskytnú sekundárne embryá, sa odrežú a . umiestnia do kvapalného média /SB55/· Po opakovanej selekcii na zhluky somatických embryí, ktoré tak včasnou multiplikáciou poskytujú embryá v globulárnoji štádiu, sa suspenzie' uchovávajú nasledujúcim spôsobom.

Sójová embryogénna suspenzná kultúra s'a uchováva.' v 55 ml kvapalného média /ŠB55/ v rotačnej trepačke pracujúcej s frekvenciou otáčania 150 min“^ pri 28 ^UC osvetľovanej zmesovým fluorescenčným a viditeľným svetlom zo žhavého zdroja v režime-16 hodín deň, 8 hodín’ noc. Každé 4 týždne sa kultúry prevádzajú do subkultúr inkuláciou približne 55 mg tkaniva do 55 ml kvapalného média.

Sójové embryogánné suspenzné kultúry sa transformujú metódou bombardovaním časticovou puškou /Particle C-un Bombardment/ /kline a další /1987/ Náture /Lohdon/527í70; US patent č® 4 99-5 05Q/. Pre tieto transformácie sa použie zariadenie Du Pont Biolistip/// PDS10.00/HE /Hélium¹ Retrofit./.

Plazmidový vektor, ktorý sa používa pre trans-’ formáciu, je derivátom pGEM9Z /Promega Biological Research Products/. Ako selekčný merker sa použije, chimerick.ý gén ., ktorý sa skladá z 55S promótoru z mozaikového vírusu karfiolu /Odeli á další /1985/ Náture 513í ’ i t

- 60 810 až 820/, gén pre hydromycín f osf otransferázu. z plazmidu pJR225 /z E. coli/ /C-ritz a ďalší /1983/ Gene 25: 179 až '.

188y. 3’ oblasť génu pre nopalín syntetázu z T-DNA Ti plazmidu Agrobacterium tumefaciens /SEQ ID NO:26/ je na mieste Sal I vektora; Vo forme približne 2,3kb Hind III j fragmentu sa izoluje kazeta chimerického génu:fazeolín-HSZ, í^: fazeolínová 5’ oblasť/fazeolinová'signálna sekvencia/maturoj vaný HSZ/fazeolínová 3' oblasť /príklad 6/. Tento fragment sa vloží do jediného Hind III miesta vektoru.

í i · . ' ! . K 50 |L1 suspenzie í|»m častíc o koncentrácii 60 j mg/ml sa pridá /v ďalej uvedenom poradí/ 5pil DNA. / 1 pig/pi/,

p.1 spermidínu /O,1M/ a 50 |JL chloridu vápenatého /2,5M/. Prípravok s časticami sa tri minutý mieša, nachá sa 10 s rotovať v mikrocentrifúge a.supernaťant sa oddelí. Častice potiahnuté DNA sa potom raz premyjú 400 μ,Ι 80/ etanolu a resuspendujú sa vo 40 /jlI bezvodného etanolu. Suspenzia častíc s DNA sa 3* sipracovává ultrazvukom, vždy sekundu. Na každý makrpnosičový disk sa potom uloží 5 guL zlatých častíc potiahnutých DNA.

·' Približne 300 až 400 mg . štvortýždňovej suspenznéj , kultúry sa umiestni do prázdnej petri misky ó rozmeroch . 60 x 15 mm a zvyšok kvapaliny z tkaniva odstráni pipetou.

- Pri každom transformacnom pokuse sa normálne/bombarduje asi až 10 misiek s tkanivom. Tlak, pri ktorom praská membrána sa nastaví na 6,37 MPa a komora sa evakuuje va vákuum 94,302 kPa. Tkanivo sa umiestni približne 8,9 cm od zachycovacej mriežky a bombardovanie 'sa deje 3x-»“Po bombardovaní sa tka? nivo umiestni späť do kvapaliny a kultivuja sa vyššie popísaným spôsobom. '

Sedem dní po bombardovaní sa kvapalné médium vymení ' za čerstvé médium SB55 obsahujúce nygromycín v množstve mg/ml. Selektívne médiá sa dávajú kždý týžďen čerstvé.

- 61 Sedem týždňov po bombardovaní sa pozoruje zelene transformované tkanivo rastúce z netransformovaných nekrotických embryogénnych zhlukov, izolované zelené tkanivo sa odstráni a inokuluje do jednotlivých fliaš, Čím sa získajú nové klonovo propagované transformované embryogénne suspenzné kultúry. S každou novou líniou sa teda zachádza ako s nezávislým transformantom. Tiéto suspenzie sa potom, môžu previesť do subkultúr a uchovával vo forme zhlukov nezrelých embryí alebo regenerovať na úplné rastliny maturáciou a klíčením jednotlivých somatických embryí.

Transformované embryogénne zhluky sa vyjmú z kvapalnej kultúry a umiestnia na pevné agarové médium /SB1O3/, ktoré neobsahuje žiadne hormóny ani antibiotiká. Embryá sa pes-: tuju 8 týždňov pri 26 °C pod zmiešaným fluorescenčnýmsvetlom a viditeľným svetlom zo žeraveného zdroja v režime 16 hodín deň/8 hodín noc. v priebehu tejto doby sa jednotlivé embryá vyberú zo zhlukov a dälej popísaným spôsobom analyzujú na produkciu'HSZ proteinu. Po 8 týždňoch sú embryá vhodné na. klíčenie. · í

Jednotlivé embryá sa zmrazia v kvapalnom dusíku a rozdrvia na jemný prášok v roztieracej miske s roztieradlom, ktoré šú predchladené kvapalným dusíkom. Prášok sa zoškriabne do Eppendorfovej centrifugačnej skúmavky a 2x extrahuje hexánom pri teplote miestnosti. Zvyšok sa 30 minút inkubuje pri 60 °C, aby sa odparil zvyšok hexánu. Potom sa k pelete pridá 100 μΐ 5ÓmM Tris-uí s pH 6,7, 2mM EDTA, 1% SDS ' a 1%

4-merkaptotanol /TES /a zmes sa drví nízkou rýchlosťou asi 10 s za použitia motorového drviča s plastovým^hriadelom na jedno použitie, ktorý je upravený tak, aby sa hodila do mikrocentrifugačnej skúmavky, vzniknuté suspenzie sa odstreďujú pri teplote miestnosti v mikrocéntrifúge a suoernatant sa odeli a uschová, peleta sa resuspenduje v 50 μΐ 70% izopropylalkoholu, 10mM b-merkaptoetanolu za použitia vyššie uvedé-

. - 62 - ného drvenia. Skúmavka sa 5 minút inkubuje pri 60 °C a potom sa centrifuguje vyššie popísaným sposobom. Sunernatant sa uschová a peleta¹sa znovu extrahuje 50 μΐ 70% izopropylalkoholu, 10mM β-merkaptoetanolu. Alkoholové extrakty sa spoja a lyofilizujú. Zvyšok sa resuspenduje v 50 pi TESp. Táto vzorka a prvý extrakt sa skúšajú na prítomnosť HSZ proteínu metódou ’.Vestern Blot popísanou v príklade 9· Dve z troch transformovaných línií, ktoré boli expresiu proteínu HSZ·

Médiá

SB55 zásobné roztoky /g/1/

MS Sulfát 100X zásobné podrobené skúšaniu, vykazujú

MS Halogenidy 100X zásobné

CaCl2.2H-,O	44,0
KI	0,083
COC12.6H20	0,00125
MS FeEDTA 100X
zásobné
í ' t
Na2EDTA	3,7 24.
FeSO4.7H2O	2,784

MgSO4.7H2O	37,0
MnSO4.H2O	1,69
ZnSO4.7H2O	0,86
CuSO4.5H2O	0,0025
MS P. B. MOjlOOX
zásobné
kh2po4	17,0
h3bo3	0,62
Na2Mo04.2H2O	0,025

B5 vitamín zásobný mg m-inozitolu

100 mg nikotínové* kyseliny

SB55 / na liter/ ml každého zo zásobných roztokov MS ml B5 vitamínového zásobného roztoku <»

- 63 . Q , 8, g nh₄no₃

3,033 g KN0₃ ml 2,4-D (10 mg/ml zásobný roztok) g sacharózy

0,667 g asparagínu pH 5,7

100 mg pyridoxínu.HCl g thiamínu

SB1O3 /na liter/

SB1 /na liter/ ‘S

-•i j

· j 'J •1

MS soli	MS soli
6% maltóza	B5 vitamíny
750 mg 'MgCl2	0,175 M glukóza
0,2% Gelrite	20 mg 2,,4-D;
pH 5,7	0,8% agaru pH 5,8
SB2
ako 331, s výnimkou 40 mg/1 2i	,4-D

: j •-Ί

•<í •-•i , í

'.· i

Λ

K;?l .'..J '· i s ..

f'

P r í k 1 a d 12

Transformácia kukurice génom pre zásobný proteín s vysokým obsahom síry

Callové kultúry sa iniciujú nezrelými embryami /asi 1,5 až 2,0 mm/ vyrezanými z jadier krížencov genotymi A188 a 373, 10 12 dní po opelení. Embryá ' sá umiestnia výhonovou stranou smerom dolu do styku s agarozovým stuhnutým ¹ o ’ · médiom N6· Embryá äa udržujú v tme ori 2⁷ C. Drobivý embryogénny callus, ktorý sa skladá z nediferencovanej hmoty

;. i ^sy <

ť 1

- 64 buniek so somatickými proembryodmi a embryoidmi nanesenými na λ suspenzorových štruktúrach, proliferuje ,zo scutella týchto nezrelých embryí. Embryogénny callus. izolovaný z primárneho ....

' explantu sa kultivuje v médiu N6 a každé 2 až 3 týždne sa

Dresadí do subkultúr s týmto médiom.

Pre transfer génov, do callu buniek v kultúre sa do?; užije metóda bombardovania časticami. Pru týchto experimentoch sa používa zariadenie Biolistic ' ' PDS-lCOO/He j /SroHad Laboratories, Hercules, uA/.

jj Pri týchto transformáciách sa- používa plazmidový vektor obsahujúci selekčný markerový gén. Plazmid dALSLUC U /Fromm a ďalší /1990/ Biotechnology S: 833 až 3397 obsahuje •í ' i cDNA génu pre acetolaktátsyntetázu /ALS/ kukurice. ALS cDNA / bola mutovaná in vitro tak, aby enzým kódovaný týmto génom / bol rezistentný voči chlórsulfónu. zmena spočíva v mutácii η tryptofánového kodónu v polohe 1626 cfNA na leucínovaný ko.) . *· •j don. Gén AI.S je pod kontrolou 35S promótora z mozaikového vírusu karfiolu /Odeli a ďalší /1985/ Náture 313: 810 až '12/ a 3U oblasti nopalínsyntetázové ho génu z T-DNA Ti plazmidu ^s( ftgrobacterium tumefaciens. Tento plazmid tiež obsahuje gén, íj ktorý využíva 35S promótor z mozaikového vírusu karfiolu a /j 3U oblasť nopalínsyntetázového génu pre expresiu kódovacej

J , á oblasti luciferázy svätojánskej mušky /de Wet a ďalší /1987/ /j · ^: Molec. Celí Biol. 7: 725 až 737/· .Chimerický gén pre ?SŽ sa ·, / s dodá druhému, plazmidu. Tento plazmid / ’pCC12, viď príklad 6/.

·'.] obsahuje kódujúcu oblasť pre HSZ, ktorá je ood kontrolou orod motorovej oblasti a 3U koniec z génu, ktorý kóduje lOkD zá’j . sobný proteín kukurice /Kirihera a ďalší /1988/ Gene ?1: 359 d až 370/.

M ·

Tieto plazmidy /dALSLUC a pCCÓl/· sa spoločne vyzráj žajú na povrch zlatých častíc. To sa vykoná tak, že sa 5 pg / ! -· p.ALSLUC a 2 yg pCC21 /každý v Tris-EDTA pufri s koncentráciou '< ;. .

t ŕ'

i.

; i ...

. ’ i’ · iľ r 65 ' v približne 1 g/pl / pridá k 50 pl zlatých častíc /so stredným priemerom 1 5 m/ suspendovaných vo vode /60 mg zlata v 1 ml/. K suspenzii zlatých častíc Dotiahnutých DNA sa pridá chlorid vápenátý /50 μΐ 2,5M roztoku/ a spermidín /20 μΐ 1,CM roztoku/ za súčasného vírivého pohybu skúmavky. Častice sa potom odstredia v mikrocentrifúge v priebehu 10 s a supernatant oddelí. Častice sa resuspendujuv 200 μΐ absolútneho etanolu. Po novom odstredení sa oddelí supernatant a častice , resuspendujú v 30 μ etanolu. Na každý makronosičový disk sa potom nanesie 5 pl zlatých častíc potiahnutých DNA.

í

Malé zhluky /s priemerom 2 až 3 oam/ embryogénneho callu sa usporiadajú na povrchu agarózového stuhnutého média N6 obsiahnutého v Petriho miske s priemerom 12 cm. Tkanivo pokrýva kruhovitú'oblasť spriemerom asi 6 cm. Petriho miska obsahujúca tkanivo sa umiestni do ko ory PDS-LOOO/He. vzduch i $ v komore sa potom evakuuje na vákuum 94,802 kPa. Makronosič sa urýchli héliovou šokovou vlnou za použitia membrány, u ktorej, dochádza k prasknutiu, keď tlak hélia v šokovej trubici dosiahne 6,87 MPa. Tkanivo sa umiestni oribližne S cm od stop mriežky. Desať misiek.š tkanivom sa bombarduje zlatými časticami Dotiahnutými DNA.

Sedem dní do bombardovaní sa tkanivo nrenesie dc mé♦ · dia N6j ktoré obsahuje chlórsulfón /50nM/ a neobsahuje kazeín ani prolí'n. Na tomťo médiu tkanivo pomaly rastie ďalej. Po ďalších dvoch týždňoch sa tkanivo orenesie do čestvého média N6 obsahujúceho chlórsulfón. Po ?. týždňoch je na jednej z misiek smédiom, ktoré je doplnené chlórsulfónom, identifikovaná oblasť s Driemerom asi 1 cm s aktívne rastúcim callom. Tento callus pokračuje v raste po presadení do sijbkultúr so selektívnym médiom. Určité množstvo tohto callu sa orenesie do média, ktoré umožňuje regeneráciu rastlín.

\ I

U tohto callu sa meria aktivita,' luciferázy. Tkanivo netransformovaného callu vykazuje aktivitu luciferázy asi 500 svetelných jednotiek na 1 mg čerstvého tkaniva. Uallus, ktorý vyrástol na chlórsulfóne, vykazuje aktivitu luciferázy približne 20 000 svetelných jednotiek na 1 mg čerstvého tkaniva. tento výsledok ukazuje, že v tejto callovej línii boli exprimované gény pALSLUC· Vykoná sa analýza Suothern na prítomnosť obidvoch zavedených génov ALS a zavedeného chimerického génu'pre zásobný proteín. Obidva zavedené gény sa sledujú analýzou Southern. í

Za účelom analýzy génu pre HSZ sa genómová DNA z transformovanej callovej línie /Tx-XSA/ alebo callu odvodeného od rovnakého genotypu, ktorý však nebol transformovaný /A391/ štieni bud Xba I alebo EcoR I. Štieoená DNA sa frakcionuje gélovou elektroforézou na agaróze, prenesie so štandardnou technikou na nylonovú membránu. Nylonový blot sa hybridizuje k próbe vyrobenej z časti kódujúcej oblasti pre HSZ· Callus AB91 obsahuje jeden dominantný pás, ktorý zodpovedá natívnemu génu pre HSZ· V calle Tx-X3A je zrejmý prídavný pás s vyššou molekulovou hmotnosťou. Tento pás zodDOvedá zavedenému chimerickému génu pre HSZ.

Ν6 médium zložka množstvo na liter zložka množstvo na liter

roztok I	10,0 ml	roztok I
CaCl2 (IM)	1,25		(nh4)2so4	23,0	g
roztok III	10,0	ml	kno3	141,5	g
MgSO4 (IM)	0,75 ml	KH2PO4	20,0	g
f roztok V i	1,0	ml	h2°	500,0	ml
vitamínový			J
zájsobný roztok	1,0	ml
kažeínový hydrolyzát	0,1	g	vitamínový	zásobr	lÝ

roztok

sacharóza	60,0 g	niacin	l 0,13 g
Myó-inositol	0,1 g	ti amín	0,025 <
2,4-D (2 mg/ml'
(zás. roztok)	0,5 ml	pyridoxín	0,025 i
pH do 5,8		panto t e nát,
		vápenatý	0,025
Pridaj 6 g agarózy	na misky	voda	100,0 ml

roztok III roztok V

Na2EDTA	1,85 g	H3BO3	0,16 g
FeSO4.7H2O	1,35 g	MnSO4.H2O	0,33 g
h2o	500,0 ml	ZnSO4.7H2O	0,15 g
		KI	0,08 g
		Na2Mo04.2H20	0,025 g
		CuSO4.5H2O	0,0025 g
		CoC12.2H?0	0,0025 g
		h2o	100,0 ml

Zoznam sekvencií (1) všeobecné informácie:

(i) Prihlasovateľ:

(ii) Názov vynálezu:

SAVERIO C. FALCO

CHOK-FUN CHUI

JANET A. RICE

A HIGH SULFUR SEED

PROTEÍN GENE AND

METHODS FOR

INCREASING THE SULFUR

AMINO ACID CONTENT

OF PLANTS /Gén pre proteín v semenách s vysokým obsahom síry a spôsob zvyšovania obsahu sírnych aminokyselín v rastlinách/ (iii) Počet sekvencií 28 (iv) Adresa pre korešpondenciu:

(A)	adresát:	E. I. DU PONT DE NEMOURS
		AND COMPANY
(B)	ulica:	1007 MARKET STREET
(C)	mesto:	WILMINGTON
(D)	štát:	DELAWAP.E '
(e)	krajina:	USA
(F)	PSČ:	19898

Strojovo čitateľná forma;

(A) stredný typ: diskety, 3,50 inch, 1,0MB /B počítač:

/0/ operačný systém:

/D/ software:

/iv/ Dáta o súčasnej : MACINTOSH ‘ 1 ! . -Ä

MACINTOSH SYSTÉM, 6,0 MICROSOFT WORD,4,0 prihláške:

/A/ číslo prihlášky:

/B/ dátum podania:

/C/ zatriedenie:

/Vii/ Dáta o predchádzajúcej prihláške:.

14. februára I99I 0,7/656,687 o patentovom zástupcovi: Linda Axamethyl Floyd /B/ registračné

Číslo: . 33,692*” /0/ značka spisu: BB-1027-A /A/ dátum:

/B/ USSN:

/viii/ Informácie /A/ meno:

/ix/ Telekomunikačné informácie:

(A) telefón: (B) telefax: (C) telex: X	(302)1 992-4929 (302) 892-7949 835420
/2/ informácie 0 SEQ ID NO:	1:
/i/ Vlastnosti sekvencie:
Dĺžka:	2123 nukleotidoy
(B) Typ:	DNA
(C) Počet
reťazcov:	jeden
Topológia:	lineárny

i’

(ii)	Typ molekuly:	genómová DNA
(iii)	í Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívny reťazec	: nie
(v)	Typ fragmentu:
(vi)	i Pôvodný zdroj
	(A) organismus:	Zea ir.ays;L
	(B) kmeň:	neznámy
	(C) typ bunky:	neznámy
(vii)	Bezprostredný zdroj
	(A) knižnica :	genómová knižnica kukurice
		od firmy Clontech
	(B) kloň:	X8
(viii)	Poloha v genóme::	neznáma
(X)	Infórmácieo
	puHiikácii:	nepublikovaná sekvencia
(xi)	Popis sekvencie:	SEQ ID NO:1

TCTAGAGCCT	ATTACCATCT	CTACTCACGG	GTCGTAGAGG	TGGTGAGGTA	50
GGCTACAGCT	GGTGACAATC	CTACTCACCC	TTTGTAATCC	TCTACGGCTC	100
TACGCGTAGT	TAATTGGTTA	GATGTCÄACC	CCCTCTCTAA	GTGGCAGTAG	150
TGGGCTTGGT	TATACCTGCT	AGTGCCŤGGG	GATGTTCTAT	TTTTCTAGTA	200
GTGCTTGATC	AAACATTGCA	TAGTTTGACT	TGGGACAAAC	TGTCTGATAT	250
ATATATATAT	TTTTGGGCAG	AGGGAGCAGT	AAGAACTTAT	TTAGAAATGT	300
AATCATTTGT	TAAAAAAGGT	ŤTAATTTTGC	TGCTTTCTTT	CGTTAATGTT	350
GTTTTCACAT	TAGATTTTCT	TTGTGTTATA	TACACTGGAT	ACATACAAAT	400

TCAGTTGCAG TAGTCTCTTA ATCCACATCA GCTAGGCATA CTT-TÄGCAAA 450

AGCAAATTAC ÄCAAATCTAG TGTGCCTGTC GTCACATTCT CAATAAACTC 500 GTCATGTTTT ACTAAAAGTA CCTTTTCGAA GCATCATATT AATCCGAAAA 550 CAGTTAGGGA AGTCTCCAAA TCTGACCAAA TGCCAAGTCA TCGTCCAGCT 600 TATCAGCATC CAACTTTCAG TTTCGCATGT GCTAGAAATT GTTTTTCATC 650 TACATGGCCA TTGTTGACTG CATGCATCTA TAAATAGGAC CTAGACGATC 700 AATCGCAATC GCATATCCAC TATTCTCTAG GAAGCAAGGG AATCACATCG 750 CC 752

CC 752

ATG GCA GCC AAG

ATG Met

TTT GCA TTG TTT GCG CTC CTA GCT

CTT Leu

TGT Cys

797

Met Ala Ala

Lys

Phe

Ala -15

Leu Phe

Ala Leu

Leu -10

Ala.

-20

GCA

ACC

GCC

ACT

AGT

GCT

ACC

CAT

ATC

CCA

GGG

CAC

TTG

TCA

CCA

842

Ala

Thr

Ala

Thr

Ser

Ala

Thr

His

íle

Pro

Gly

His

Leu

Ser

Pro

-5

1

5

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCA

TGG

ATG

CAG

TAC

TGC

887

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Ala

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

Gin

Tyr.

Cys

10

15

20

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

932

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Val

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

Thr

Leu

25

30

35

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

977

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

4 0

45

50

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

1022

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

55

60

65

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

1067

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

Met

Ser

70

75.

80

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

1112

Pro

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

85

90

95

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

1157

Met

íle

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

íle

100

105

110

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

.CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

1202

Met

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

íle

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

115

120

125

í ,r

Tt τζ.

00VYSSX5V3 3Y0YY03V00 0XXW3WYY S3Y003XY3X 3YYY3Y03YX 03YWOSYXO :/.τ:0Ν αι čas _; 8X0U9A5[9S sxdod (XX)

VNd eueAOZTq.94UÄs qj^xa ux :ÁinxaToui

Jáj, (ττ)

ÁuaeauTT usp© C euTxesÄ5( BAoeTxnu aad zeq

•.axSojodoi •.Aooze^au qsood :dAj, :85i3 ja.

(Q)

O) (s) (Y)

ΤΔ :axouôA5ps x^souxsbja (x) :δτ:ον dl Čas O a xo?m.iojul (z) .t i02 aqd aas ®TV ^ag naq s TY naq 3 XXX OSY Χ03 Χ3Χ ΧΧΟ Υθχ γοο siq

9fr

	ςτ				οτ
and	naq	θτι	ÁT3 naq	naq	naq i
oxx	XXO	XXV	Y33 3X0	3X1	310 :
			:9T:ON	dl	čas

OĹZ naq

0X3 ! 8X0U8Á5{9S sxdod (xx) sao

-.axuaúxsaxuín : ρηρϊ/ΟΗθ^ (0) (V) :5(EU:Z (XT)

VNd puaAOZxqaquÁs οα^,τΛ ut :Ä-[nxs-[oui dÄj, (ττ) 'i e

V8 t '•j ··’]

CCA ATG Pro Met 130

ATG ATG

CCG AGC ATG GTG

TCA CCA

ATG ATG ATG CCA AAC

1247

Met

Met

Pro

Ser 135

Met Val

Ser

Pro

Met 140

Met Met

Pro

Asn

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

1292

Met

Met

Thr

Val

Pro

Gin

Cys

Ty r

Ser

Gly

Ser

íle

Ser

His

íle

i 145

150

155

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCC

ATG

1337

j·· ·· ' . íle'

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

j 160

-

165

170

j GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTČ

TTA

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

1382

i Ala

íle

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

l 175

180

185

TTC TAG ATCTAGATAT AA 1400

Phe

190

GCATTTGTGT	AGTACCCAAT	AATGAAGTCG	GCATGCCATC	GCATACGACT	1450
CATTGTTTAG	GAATAAAACA	AGCTAATAAT	GACTTTTCTC	TCATTATAAC	1500
TTATATCTCT	F CCATGTCTGT	TTGTGTGTTT	GTAATGTCTG	TTAATCTTAG	1550
TAGATTATAT	TGTATATATA	ACCATGTATT	CTCTCCATTC	CAAATTATAG	1600
GTCTTGCATT	TCAAGATAAA	TAGTTTTAAC	CATACCTAGA	CATTATGTAT	1650
ATATAGGCGG	CTTAACAAAA	GCTATGTACT	CAGTAAAATC	AAAACGACTT	1700
ACAATTTAAA	ATTTAGAAAG	TACATTTTTA	TTAATAGACT	AGGTGAGTAC	1750
TTGTGCGTTG	ÍCAACGGGAAC	ATATAATAAC	ATAÄTAACTT	ATATACAAAA	1800
TGTATCTTAT	ATTGTTÄ*TAA	AAAATATTTC	ATAATCCATT	TGTAATCCTA .	1850
GTCATACATA	AATTTTGTTA	TTTTAATTTA	GTTGTTTCAC	TACTACATTG	900
CAACCATTAG	TATCATGCAG	ACTTCGATAT	ATGCCAAGAT	TTGCATGGTC	1950
TČATCATTGA	AGAGCACATG	TCACACCTGC	CGGTAGAAGT	TCTCTCGTAC	' 2000
ATTGTCAGTC	ATCAGGTACG	CACCACCATA	CACGCTTGCT	TAAACAAAAA	2050
AACAAGTGTA	TGTGTTTGCG	AAGAGAATTA	AGACAGGCAG	ACACAAAGCT	2100
ACCCGACGAT	GGCGAGTCGG	TCA			2123

(2) Informácie o SEQ ID NO: 2:

' i _s! ' ' ’ (i) Vlastnosti sekvencie: ¹

(A) DÍ žka:	639 nukleotidov
(B) Typ:	DNA

$ ·,

'J

·- 1 ,1 ·ί

i.

·’} ‘I ŕ M

(C)	Počet
•	retezcov;	j eden
(D)	Topológia:	lineárna.
(ii) Typ molekuly:	in vitro mutovaná
		genómová DNA

(x) Informácie o publikácii: nepublikovaná sekvencia (xi) Popis sekvencie; SEQ ID NO:2

CC ATG GCA GCC; AAG ATG TTT GCA TTG TTT GCG CTC CTA GCT CTT TGT 47 Met Ala Ala- Lys Met Phe Ala Leu Phe Ala Leu Leu Ala Leu Cys

' -20

í

-15

10

GCA

ACC

GCC

ACT

AGT

GCT

ACC

CAT

ATC

CCA

GGG

CAC

TTG

TCA

CCA

92

Ala

Thr

Ala

Thr

Ser

Ala

Thr

His

íle

Pro

Gly

His

Leu

Ser

Pro

-5

1

5

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ÁTG

AAC

CCT

TGG

ATG

CAG

TAC

TGC

137

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Ala

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

Gin

Tyr

Cys

10

15

20

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

182

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Val

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

Thr

Leu

25

30

35

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

227

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala-

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

40

45

50

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

272

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

55

60

65

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

317

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

Met

Ser

70

75

80

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG'

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

362

Pro

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

85

90

95

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

407

Met

íle

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

íle

100

105

110

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

CCA ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

452

Met

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

íle

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

115

120

125

r-

CCA

ÁTG

ATG

ATG

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

497

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

130

135

140

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

542

Met

Met

Thr

Val

Pro

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

íle

Ser

Hfs

íle

145

150

155

- 74 . '>'' Ί ' ' .i », - ' j i.

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA CCA

TTC ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

587

íle

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu ?ro

Phe Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

160

’

165

170

GCG

ATC

CCA

ccc

ATG

TTC TTA

CAG CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

632

Ala

íle

Pro

Pro

Met

Phe Leu

Gin Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

175

180

185

¢.:

TTC TAG A 639

Phe

190 (2) informácie SEQ ID NO:3:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A)	DÍžka:	579 nukleotidov
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	reťazcov'.	jeden
(D)	Topológia:	lineárny

(ii) Typ molekuly: in vitro mutovaná genómová DNA (x) Informácie ⁰ publikácii:

nepublikovaná sekvencia •i

/.'i s

(xi) Popis sekvencie

TC ATG ACC CAT ATC Met Thr His íle

SEQ ID NO:3

CCA GGG CAC TTG TCA CCA CTA CTG ATG CCA TTG 47 Pro Gly His Leu Ser Pro Leu Leu Met Pro Leu 5 10 15

C-CT Ala

ACC Thr

ATG Met

AAC Asn

CCŤ Pro 20

TGG Trp

ATG CAG

TAC Tyr

TGC ATG

AAG Lys

CAA Gin

CAG Gin

GGG Gly 30

92

Met

Gin

Cys 25

Met

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG.'

CCG

ACC

CTG

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

137

Val

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

Thr

Leu

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

35

40

45

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

182

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

Pro

Met

Met

Met

Pro

50

55

60

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG^CJG

AGT

ATG

ATG

227

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Met Pro

Ser

tteé

Met

65

70

'75

(^χ) Informácie· ⁰ publikácii: nepublikovaná áekvencia

Popis sekvencie : SEQ ID NO:4:

•q

CAT

ATG CCA

ATG ATG

ATG Met 5

CCG GGT ATG ATG

CCA Pro 10

CCG Pro

ATG Met ,t

ACG ATG

45

Met

Pro

Met

Met

Pro

Gly Met

Met

Thr

Met

ATG

CCG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

90

Met

Pro

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

15

20

25

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

135

Met

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

30

35

40

CCA

AGC

ATG

ATT

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

180

Pro

Ser

Met

íle

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

j

45

50

55

f

ATG

ATA

ATG

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

225

4

Met

íle

Met

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

íle

Met

Pro

Ser

Met

A*

60

65

70

1

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG ATG

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

270

í

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

75

80

85

CCA TAG AATTC 281

Pro (2) Informácie seq ID NO:5:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A)	Dĺžka:	453 nukleotidov
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	reiazcov:	jeden
(D)	Topológia:	lineárny

:(ii) Typ molekuly: 1 i ľ '	cDNA
5 (x) Informácie o i publikácii;
í f (A) Autori:	Kirihara, J.A. Hunsperger, J.P.

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG ACG

ATG

GCT

272

Pro

Ser

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met Thr

Met

Ala

80

85

90

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT TCA

CCA

Λ ATG

317

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

íle Sér

Pro

Met

95

*

>

.·?

100

*

105

J

ACG ATG CCG

AGT ATG ATG CCT TCG ATG ATA ATG CCG ACC ATG ATG

362

Thr Met

Pro

Ser Met 110

Met

Pro

Ser

Met

íle Met 115

Pro

Thr Met

Met 120

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

407

Ser

Pro

Met

íle

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

125

130

135

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

AC!A

GTG

CCA

452

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

Met

Met

Thr

Val

Pro

-

140

. í

145

150

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

497

Gin

Cya

Tyr

Ser

Gly

Ser

íle

Ser

His

íle

íle

Gin

Gin

Gin

Gin

t

155

'i

160

165

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

542

Leu

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

Ala

íle

Pro

Pro

Met

170

175

180

TTC

TTA

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAG

A

579

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

Phe

185 190 (2) Informáciejseq ID no:4.

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A)	DÍžka:	281 nukleotidú
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	reťazcov*.	j eden
(D)	Topológia:	lineárny

(ii) Typ molekuly: in vitro mutovaná genómová DNA (B) Názov:

Mahoney, W.C.

Messing, J. W.

Differential expression of gene for a methioninerich storage proteín in--maize /Diferenciálna expresie génu pre zásobný proteín. kukurice bohatý ne metipnín/

(C)	Časopis:	Mol.Gen
, <D>	Zväzok:	211
(F)	Strana:	477-484
(G)	Dátum:	1988
(K)	Relevantné

zvyšky v SEQ ID NO:5: od 22 do 474

ATG GCA GCC AAG ATG CTT

GCA TTG TTC GCT CTC

CTA GCT

CTT Leu

TGT Cys

45

Met

Ala Ala -20

Lys

Met

Leu

Ala -15

Leu

Phe Ala

Leu

Leu -10

Ala

GCA

AGC

GCC

ACT

AGT

GCG

ACC

CAT

ATT

CCA

GGG

CAC

TTG

CCA

CCA

90

Ala

Ser

Ala

Thr

Ser

Ala

Thr

His

íle

Pro

Gly

His

' Leu

Pro

Pro

-5

1

5

GTC

ATG

CCA

TTG

GGT

ACC

ATG

AAC

CCA

TGC

ATG

CAG

TAC

TGC

ATG

135

Val

Met

Pro

Leu

Gly

Thr

Met

Asn

Pro

Cys

Met

Gin

Tyr

Cys

Met

10

15

20

ATG

CAA

CAG

GGG

CTT

GCC

AGC

TTG

ATG

GCG

TGT

CCG

TCC

CTG

ATG

180

Met

Gin

Gin

Gly

Leu

Ala

Ser

Leu

Met

Ala

Cys

Pro

Ser

Leu

Met

25

30

35

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TTA

CCG

CTT

CAG

ACG

ATG

CCA

GTG

ATG

225

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala

Leu

Pro

Leu

Gin

Thr

Met

Pro

Val

Met

40

45

50

ATG

CCA

CAG

ATG

ATG

ACG

CCT

AAC

ATG

ATG

TCA

CCA

TTG

ATG

ATG

270

Met

Pro

Gin

Met

Met

Thr

Pro

Asn

Met

Met

Ser

Pro

Leu

Met

Met

55

60

65

t

CCG

AGC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

GTC

TTG

CCG

AGC

ATG

ATG

TCG

CAA

315

Pro

Ser

Met

Met

Ser

Pro

Met

Val

Leu

Pro

Ser

Met

Met

Ser

Gin

ATG ATG ATG

CCA CAA TGT

CAC His

TGC GAC GCC GTC

TCG CAG

ATT ATG

360

Met 85

Met Met

Pro

Gin Cys 90

Cys

Asp

Ala

Val 95

Ser

Gin

íle

Met

CTG

CAA

CAG

CAG

TTA

CCA

TTC

ATG

TTC

AAC

CCA

ATG

GCC

ATG

ACG

405

Leu

Gin

Gin

Gin

Leu

Pro

Phe

Met

Phe

Asn

Pro

Met

Ala

Met

Thr

100

105

110

ATT

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG

CAA

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

450

íle

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

Phe

115

120

125

TAG .453 (2) informácie SEQ ID NO:6:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A)	Dĺžka:	30* nukleotidov
(B)	Typ:	DNA
(C)	Počet
	retazcov:	j eden
(D)	Topológia:	’’lineárny

(ii) Typ molekuly:

in vitro syntetizovaná genómová DŇA

(x.)	Informácie 0 publikácii:	nepublikovaná sekvencia
(xi)	Popis sekvencie	SEQ ID NO:6:

ATGGCAGCCA AGATGCTTGC ATTGTTCGCT 30 (2) informácie o seq id no:7:

·· ' .5 (i) Vlastnosti sekvencie:

(A)	Dĺžka:	30 nukleotidov
(B)	Typ:	DNA
(c)	Počet relazcov:	jeden
(D)	Topológia:	lineárny

(ii) Typ molekuly:

(x) Informácie ⁰ , publikácii:

(xi) Popis sekvencie;

in vitro syntetizovaná genómová DNA nepublikovaná sekvencia

SEQ ID NO:7: /

GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA 30

I · (2) Informácie seq ID NO:8:

sekvencie:

’nukleotidov

DNA j eden lineárny .

in vitro syntetizovaná genómová DNA nepublikovaná sekvencia . i'SEQ ID NO:8:

(i) Vlastnosti (A) DÍžka:

(B) Typ:

(C) Počet reťazcov:

(D) Topológia:

(ii) Typ molekuly:

(x) Informácie ⁰ publikácii:

. ! ^! I ; ^! (xi) popis sekvencie

ATGAACCCTT GGATGCA (2) Informácie o SEQ ID NO:9:

(i) Vlastnosti (A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Počet sekvencie:

nukleotidov

DNA i

	reiazcov: (D) Topológia:	jeden lineárny
(ii)	Typ molekuly:	in vitro syntetizovaná genómová DNA
(x)	Informácie 0	nepublikovaná sekvencia
	publikácii:
(xi)	popis sekvencie	SEQ ID NO:9:

CCCACAGCAA TGGCGAT 17
(2) Informácie O SEQ ID NO: 10:
• - r,*»·* * (i) Vlastnosti sekvencie: (A) Dĺžka: 13 nukleotidov (B) Typ: DNA (C) Počet reiazcov: jeden (D) Topológia: lineárny ,
(ii) Typ molekuly:	in vitro · syntetizovaná genómová DNA
(x) Informácie 0 publikácii:	nepublikovaná sekvencia
(xi) Popis sekvencie	SEQ ID NO:10:
CTAGCCCGGG TAC	13 ·

' ·^; ,s (2) informácie o SEQ ID NO:11:

sekvencie:

(i) Vlastnosti (A) DÍžka:

(B) Typ:

(C) Počet reíazcov:

(D) Topológia:

(ii) Typ molekuly:

(x) Informácie publikácii:

(xi) Popis

CTAGGTACCC GGG (2) Informácie oSEQ ID NO:12:

sekvencie SEQ ¹³ nukleotidov

DNA i

jeden lineárny in vitro syntetizovaná genómová DNA ť,-.

nepublikovaná sekvencia

ID NO:11:

.i (i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Počet reiazcov’.

(D) Topológia:

nukleotidov

DNA i j eden lineárny (ii) Typ molekuly:

(x) Informácie o publikácii:

in vitro syntetizovaná

DNA nepublikovaná sekvencia ι · f >

(xi) popis sekvencie: SEQ ID NO: 12:

CCáCTTCATG ACCCATATCC CAGGGCACTT 30 '* ί (2) informácie o. SEQ ID NO:13:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) .Počet reťazcov*.

(D) Topológia:

nukleotidov

DNA jeden lineárny

(ii) Typ molekuly:

(x) Informácie ⁰ publikácii:

(xi) Popis sekvencie

TTCTATCTAG AATGCAGCAC (2) informácie o SEQ ID NO: 14:

(i) Vlastnosti (A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Počet reťazcov*.

(D) Topológia:

(ii). Typ molekuly:

in vitro syntetizovaná genómová DNA

V \ i nepublikovaná sekvencia

SEQ ID NO:13:

CAACAAAGGG 30 sekvencie:

nukleotidov

DNA j eden lineárny in vitro syntetizovaná

DNA

V.' á:

á·

(x) 'Informácie o publikácii: nepublikovaná sekvence (xi) Popis sekvencie · ^SEQ ID NO: 14:

TCACCGCTTC AGCAGTGCCA TATGCCAATG 30 (2) Informácie o. SEQ ID NO:15:

J r,· (i) Vlastnosti (A) Dĺžka:

(B) Typ:

(C) Počet reťazcov.

(D) Topológia: í (ii) Typ molekuly:

(x) informácie o publikácii:

sekvencie:

⁴⁰ nukleotidov

DNA jeden lineárny in vitro syntetizovaná

DNA nepublikovaná sekvencia

(xi) popis sekvencie SEQ ID NO: 15.:

TCTTAGAATT CTATGGCATC ATCATTGGTG ACACCATGCT (2) informácie’eq id NO:16:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A)	DÍ žka:	71 pár báz.
(B)	Typ:	nukleová kyselina
(C)	Počet
	reťazcov.	jeden
(D)	Topológia:	lineárny

(ii) Typ molekuly: F	in vitro syntetizovaná DNA
(ix) znak:
(A) Meno/kíúč :	CDS
(B) Umiestnenie-.	2..70 .
(xi) Popis sekvencie :	SEQ ID NO:: 16:

C ATG ATG AGA GCA AGG GTT CCA CTC	CTG	TTG	CTG	GGA	ATT	CTT	TTC
Met Met Arg Ala Arg Val Pro Leu	Leu	Leu	Leu	Gly	íle	Leu	Phe
1		’l	5	10				15
CTG	GCA	TCA	CTT TCT GCT AGC TTT G
Leu	Ala	Ser’	Leu Ser Ala Ser Phe
			20

(2) informácie o SEQ ID NO :17:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: (B) Typ: (C) Počet	71 pár báz
nukleová j eden lineárny	kyselina
(D)	reťazcov*. Topológia:
(ii) Typ	molekuly:	in vitro	syntetizovaná
		DNA	Λ
xi) Popis	sekvencie:	SEQ ID NO	:17:

CTAGCAAAGC TAGCAGAAAG TGATGCCAGG AAAAGAATTC CCAGCAACAG GAGTGGAACC 60

CŤTGCTCTCA T 'f •i?

i (2) Informácie o SEQ ID NO: 18

C ATG Met 1 (i) vlastnosti, sekvencie:

(A) Dĺžka: 653 párôvbáz (B) Typ: nukleová kyselina (ii) (vii) (ix) (xi)

ATG AGA GCA

Met Arg Ala (D) jeden lineárny

Typ molekuly:

genómová DNA

Bezprostredný zdroj:

(B) Kloň popis

AGG GTT Arg Val 5 sekvencie

CCA CTC CTG

Pro Leu Leu pCC18

CDS

2..652

SEQ ID NO:18

CTG GCA

TCA Ser

CTT Leu •

TCT Ser 20

GCT AGC

TTT GCT

AGT GCT Ser Ala 25

ACC Thr

CAT His

ATC CCA

GGG Gly

94

Leu

Ala

Ala

Ser

Phe

Ala

íle

Pro 30

CAC

TTG

TCA

Č.ČA

CTA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

142

His

Leu

Ser

Pro

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Ala

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

35

40

i

45

CAG

TAC

TGC'

ATG

AAG

i ' CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

190

Gin

Tyr

Cys

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Vai

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

50

55

60

ACC

CTG

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

238

Thr

Leu

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala

Ser

Pró

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

65

70

75

ATG

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

286

Met

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Θ0

85

90

95

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

334

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

ket

Ser

Pro

100

105

110 i

- 86

•

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG

ATG

CCA

AGC

ATG

ATT

·{ 382

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

íle

,·&

115

120

125

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

ATG

CCG

ACC

430

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

íle

Met

Pro

Thr

í

130

135

140

ATG

ATG

TCA

Cca

ATG

ATT

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

478

Met

Met

Ser

Pro

Met

íle

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

145

150

155

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

526

Pro

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

Met

Met

Thr

Val

Pro

160

165

170

175

CAA

TGT

TAC

TCT

GGT

TCT

ATC

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CAA

TTA

574

Gin

Cys

Tyr

Ser

Gly

Ser

íle

Ser

His

íle

íle

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

180

185

190

CCA

TTC

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

622

Pro

Phe

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

Ala

íle

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

195

200

205

CAG

CAG

CCC

TTT

GTT

GGT

GCT

GCA

TTC

TAGA

653

Gin

Gin

Pro

Phe

Val

Gly

Ala

Ala

Phe

v

210 ' 215 (2) Informácie _{o SE}q _id no:19:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A).	Dĺžka:	31 párov báz.
(B)	Typ:	nukleová kyselina
(C)	Počet	'i
	reťazcov:	ď- * j eden
(D)	Topológia:	lineárny

(ii) Typ molekuly:	in vitro syntetizovaná DNA
(xi) Popis sekvencie:	SEQ ID NO:19:

TTCTGCTAGC TTTGCTACCC ATATCCCAGG G (2) informácie o SEQ ID N0:20:

(i) Vlastnosti sekvencie:

* *

	(A) pižka: (B) Typ: (C) Počet	647 párov báz nukleová kysel S jeden lineárny
(D)	relazcov: Topológia:
(ii)	Typ	molekuly:	genómová DNA
(ix)	znak:

(A) Meno/klúč : CDS (B) Umiestnenie-. 2..646 (xi) Popis sekvencie : SEQ ID NO:20:

C ATG ATG AGA GCA AGG GTT CCA CTC CTG TTG CTG GGA ATT CTT TTC

Met Met Arg Ala Arg Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly íle Leu Phe

5 10 15

CTG GCA

TCA Ser

CTT Leu

TCT Ser 20

GCT Ala

AGC Ser

TTT GCT Phe Ala

ACC Thr 25

CAT His

ATC íle

CCA Pro

GGG Gly

CAC His 30

TTG Leu

94

Leu

Ala

TCA

CCA

C TA

CTG

ATG

CCA

TTG

GCT

ACC

ATG

AAC

CCT

TGG

ATG

CAG

TAC

142

Ser

Pro

Leu

Leu

Met

Pro

Leu

Ala

Thr

Met

Asn

Pro

Trp

Met

Gin

Tyr

35

40

4 5

TGC

ATG

AAG

CAA

CAG

GGG

GTT

GCC

AAC

TTG

TTA

GCG

TGG

CCG

ACC

CTG

190

Cys

Met

Lys

Gin

Gin

Gly

Val

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Trp

Pro

Thr

50

55

60

ATG

CTG

CAG

CAA

CTG

TTG

GCC

TCA

CCG

CTT

CAG

CAG

TGC

CAG

ATG

CCA

238

Met

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Ala

Ser

Pro

Leu

Gin

Gin

Cys

Gin

Met

Pro

65

70

75

ATG·.

ATG

ATG

CCG

GGT

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

286

Met

Met

Met

Pro

Gly

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Met

Pro

80

85

90

95

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

334

Ser

Met

Met

Pro

Ser

Met

Met

Val

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Het

Thr

100

105

110

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

CCG

CCG

ATG

ATG ATG

'CCA

AGC

ATG

ATT

TCA

CCA

382

Met

Ala

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

íle

Ser

Pro

115

120

125

ATG ACG ATG

CCG AGT ATG ATG CCT TCG ATG ATA ATG CCG ACC ATG ATG

430 478

Met 4ca Ser

Thr CCA Pro 145

Met 130 ATG Met

Pro ATT íle

Ser Met Met

Pro 135 ATG Met

Ser Met

íle Met

Pro Thr Met Met 140

ATG Met

CCG AGT

ATG Met

CCA Pro

CCA Pro

ATG Met 155

ATG Met

ATG Met

CCG AGC

Pro

Ser 150

Pro

Ser

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCA

AAC

ATG

ATG

ACA

GTG

CCA

CAA

TGT

526

Met

Val

Ser

Pro

Met

Met

Met

Pro

Asn

Met

Met

Thr

Val

Pro

Gin

Cys

160

í

165: £

170

175

TAC

TCT

GGT

TCT

ATČ

TCA

CAC

ATT

ATA

CAA

CAA

CAA

CÁÄWÍTA

CCA

TTC

574

Tyr

Ser

Gly

Ser

íle

Ser

His

tie

íle

Gin

Gin

Gin

Gin

Leu

Prof Phe

180

185

190

ATG

TTC

AGC

CCC

ACA

GCA

ATG

GCG

ATC

CCA

CCC

ATG

TTC

TTA

CAG CAG

622

Met

Phe

Ser

Pro

Thr

Ala

Met

Ala

íle

Pro

Pro

Met

Phe

Leu

Gin

Gin

-

1,95

200

205

CCC

TTT

GTT,

GGT

GCT

GCA

TTC

TAGA

•

J

647

Pro

Phe

Val-

Gly

Ala

'Ala

Phe

210

215

I

(2) informácie o SEQ ID NO:21:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka:	31 párov báz
(B) Typ:	nukleová kyselina
(C) Počet
reťazcov:	jeden
(D) Topológia:	lineárny
<1 (ii) Typ molekuly:	in vitro syntetizovaná
r	DNA
(xi) Popis sekvencie;	SEQ ID NO:21:

ACTAATCATG ATGAGAGCAA GGGTTCCACT (2) informácie o SEQ ID NO:22:

³⁰i (i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka: 30 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina ŕ

; ň (C) Počet reíazcov:

(D) Tbpológia (ii) Typ molekuly:

(xi) Popis sekvence:

GAATGCAGCA CCAACAAAGG GTTGCTGTAA (2) informácie oSEQ ID NO:23:

(i) Vlastnosti sekvencie:

jeden lineárny in vitro syntetizovaná

DNA

SEQ ID NO:22:

(A)	Dĺžka:	38 párov báz:
(B)	Typ:	nukleová kyselina
(C)	Počet
	reiazcov'.	j eden- .
(D)	Topológia:	lineárny
(ii) Typ	molekuly:	in vitro syntetizovaná
		DNA

(ix)	znak:
	(A) Meno/klúč :	CDS
	(B) Umiestnenie-.	6..38
(xi)	Fopis sekvencie:	SEQ ID NO:23:

TGCTT GCT AGC TTT GCT ATG CCA ATG ATG ATG CCG GGT	38
Ala Ser Phe Ala Met Pro Met Met Met Pro Gly 15 10

(2) Informácie o SEQ ID NO:24:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A)	Dĺžka:	46 párov báz
(B)	Typ:	nukleová kyselina
(C)	Počet	1
	reťazcov:	» t jeden
(D)	Topológia:	lineárny

(ii) Typ molekuly:

in vitro syntetizovaná

DNA (xi) Popi,s sekvencie :

; V

TGCTTTCTAG ACTATGGCAT CATCÄTTGGT GACACC

SEQ ID NO.: 24:

t (2) Infprmácieo SEQ ID NO:25:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A)	Dĺžka:	352 párov, báz
(B)	Typ:	nukleová kyselina
(C)	Počet
	reťazcov:	jeden
(D)	Topológia:	lineárny

.1 ,|	(ii) Typjmolekuly:	genómová DNA
•i j · 1 -J	(ix) znak: (A) tóeno/klúč :	CDS
1 • í .·	(B) Umiestnenie-.	2..346
•Ί r Ί 4	(xi) Popis sekvence:	SEQ ID NO:25:
C ATG ATG AGA GCA AGG GTT CCA CTC	CTG TTG CTG GGA ATT CTT TTC	46

Mét Met Arg Ala Arg Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly íle Leu Phe

· '*-,1

1

5

10.

15

$

CTG

GCA

TCA

CTT

TCT

GCT

AGC

TTT

GCT

ATG

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

GGT

94

:;-i

Leu

Ala

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Phe

Ala

Met

Pro

Met

Met

Met

Pro

Gly

, ' |

20

25

30

* ·!

ATG

ATG

CCA

CCG

ATG

ACG

ATG

ATG

CCG

ATG

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

TCG

142

Met

Met

Pro

Pro

Met

Thr

Met

Met

Pro

Met

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Ser

‘ J : ’í

35

40

t

45

i-í

ATG

ATG

GTG

CCG

ACT

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ACG

ATG

GCT

AGT

ATG

ATG

190

t \ -;!

Met

Met

Val

Pro

Tht

Met

Met

Ser

Pro

Met

Thr

Met

Ala

Ser

Met

Met

; h ·ί

50

55

60

•J

CCG CCG Pro Pro

ATG Met

ATG Met

ATG Met

CCA Pro

AGC ATG ATT TCA CCA ATG ÄCG ATG

CCG AGT

238

Ser Met 70

íle

Ser Pro

Met 75

Thr

Met

Pro

Ser

65

ATG

ATG

CCT

TCG

ATG

ATA

!atg

CCG

ACC

ATG

ATG

TCA

CCA

ATG

ATT

ATG

286

Met

Met

Pro

Ser

Met

íle

Met

Pro

Thr

Met

Met

Ser

Pro

Met

íle

Met

80

85

90

95

CCG

AGT

ATG

ATG

CCA

CCA

ATG

ATG

ATG

CCG

AGC

ATG

GTG

TCA

CCA

ATG

334

Pro

Ser

Met

Met

Pro

Pro

Met

Met

Met

Pro

Ser

Met

Val

Ser

Pro

Met

100

105

110

ATG

ATG

CCA

TAGTCTAGA

352

Met

Met

Pro

115

(2)

Informácieo

SEQ

ID

NO:

26:

1

f

(i) Vlastnosti sekvencie': ’ · (A) Dĺžka: 3237 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet

ŕetézcu: (D) Topológia:	jeden lineárni ·' í
(ii) Typ molekuly:	y- ’ genómová DNA

(ix) znak:

(A) Jméno/kíúč:

(B) Umísténí:

CDS

1419..2444 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:26:

ýp’ .Ί ;<ϊ^: :^:·Ι *

;· J

'.'i i

;-Ί v ’ΐ é’/ ó’ i •ľ.'· 4

GTCGACTCTA	GAGGATCCAA	TTCCAATCCC	ACAAAAATCT	GAGCTTAACA	GCACAGTTGC	60
TCCTCTCAGA	GCAGAATCGG	GTATTCAACA	CCCTCATATC	AACTACTACG	TTGTGTATAA	120
CGGTCCACAT	GCCGGTATAT	ACGATGACTG	GGGTTGTACA	AÁGGCGGCAA	CAAACGGCGT	180
TCCCGGAGTT	GCACACAAGA	AATTTGCCAC	TATTACAGAG	GCAAGAGCAG	CAGCTGACGC	2 4 0.
GTACACAACA	AGTCAGCAAA	CAGACAGGTT	GAACTTCATC	CCCAAAGGAG	AAGCTCAACT	300
CAAGCCCAAG	AGCTTTGCTA	AGGCCCTAAC	AAGCCCACCA	AAGCAAAAAG	CCCACTGGCT	360
CACGCTAGGA	ACCAAAAGGC	CCAGCAGTGA	TCCAGCČCCA	AAAGAGATCT	CCTTTGCCCC	420
GGAGATTACA	ATGGACGATT	TCCTCTATCT	TTACGATCTA GGAAGGAAGT	TCGAAGGTGA	480
AGGTGACGAC	ACTATGTTCA	CCACTGATAA	ŤGAGAAGGTT	AGCCTCTTCA	ATTTCAGAAA	540
GAATGCTGAC.	CCACAGATGG	TTAGAGAGGC	CTACGCAGCA	GGTCTCATCA	AGACGATCTA	600
CCCGAGTAAC	AATCTCCAGG	AGATCAAATA	CCTTCCCAAG	AAGGTTAAAG	ATGCAGTCAA	660
AAGATTCAGG	ACTAATTGCA	TCAAGAACAC	AGAGAAAGAC	ATATTTCTCA t	AGATCAGAAG	720

TACTATTCCA	GTAT^GACGA	TTCAAGGCTT	GCTTCATAAA	CCAAGGCAAG	TAATAGAGAT	780
TGGAGTCTCT	AAAAAGGTAG	TTCCTACTGA	ATCTAAGGCC ,jh	ATGCATGGAG	TCTAAGATTC	840
AAATCGAGGA	TCTAACAGAA	CTCGCCGTGA	AGACTGGCGA	ACAGTTČATA	CAGAGTCTTT	900
TACGACTCAA	TGACAAGAAG	AAAATCTTCG	TCAACATGGT j	GGAGCACGAC	ACTCTGGTCT	960
ACTCCAAAAA	TGTCAAAGAT	ACAGŤCTCAG	AAGACCAAAG	GGCTATTGAG	ACTTTTCAAC	1020
AAAGGATAAT	TTCGGGAAAC	CTCCTCGGAT’TCCATTGCCC	AGCTATCTGT	CACTTCATCG	1080
AAAGGACAGT	AGAAAAGGAA	GGTGGCTCCT	ACAAATGČCA	TCATTGCGAT	AAAGGAAAGG	1140
CTATCATTCA	AGATGCCTCT	GCCGACAGTG	GTCCCAAAGA	TGGACCCCCA	CCCACGAGGA	1200
GCATCGTGGA	AAAAGAAGÁC	GTTCCAACCA	CGTCTTCAAA	GCAAGTGGAT	TGATGTGACA 1260
TCTCCACTGA	CGTAAGGGAT	GACGCACAAT	CCCACTATCC	TTCGCAAGAC	CCTTCCTCTA	1320
TATAAGGAAG	TTCATTTCAT	TTGGAGAGGA	CACGCTCGAG	CTCATTTCTC	TATTACTTCA	1380
GCCATAACAA	AAGAACTCTT	TTCTGTTCTT	ATTAAACC ATG AAA AAG CCT GAA	1433

Met Lys Lys Pro Glu

1' -5

CTC Leu

ACC GCG Thr Ala

ACG TCT GTC

GAG Glu

AAG Lys

TTT CTG ATC

GAA AAG TTC

GAC Asp 20 ·

AGC Ser

1481

Thr

Ser 10

Val

Phe

Leu 15

íle

Glu

Lys

Phe

GTC

TCC.

GAC

CTG

ATG

CAG

CTC

TCG

GAG

GGC

GAA

GAA

TCT

CGT

GCT

TTC

1529

Val

Ser

Asp

Leu

Met

Gin

Leu

Ser

Glu

Gly

Glu

Glu

Ser

Arg

Ala

Phe

i í

25

30

35

AGC

TTC

GAT

GTA

GGA

GGG

CGT

GGA

TAT

GTC

CTG

CGG

GTA

AAT

AGC

TGC

1577

Ser

Phe

Asp

Val

Gly

Gly

Arg

Gly

Tyr

Val

Leu

Arg

Val

Asn

Ser

Cys

40

45

50

GCC

GAT

GGT

TTC

TAC

AAA

GAT

CGT

TAT

GTT

TAT

CGG

CAC

TTT

GCA

TCG

1625

Ala

Asp

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asp

Arg

Tyr

Val

Tyr

Arg

His

Phe

Ala

Ser

55

60

65,

GCC

GCG

CTC

CCG

ATT

CCG

GAA

GTG

CTT

GAC

ATT

GGG

GAA

TTC

AGC

GAG

1673

. Ala

Ala

Leu

Pro

íle

Pro

Glu

Val

Leu

Asp

íle

Gly

Glu

Phe

Ser

Glu

70

75

80

85

J

AGC

CTG

ACC

TAT

TGC

ATC

TCC

CGC

CGT

GCA

CAG

ľGGT

GTC

ACG

TTG

CAA

1721

Ser

Leu

Thr

Ty r

Cys

íle

Ser

Arg

Arg

Ala

Gin

Gly

Val

Thr

Leu

Gin

í

*

90

95

100

GAC

CTG

CCT

GAA.

ACC

GAA

CTG

CCC

GCT

GTT

CTG

CAG

CCG

GTC

GCG

GAG

1769

Asp

Leu

Pro

Glu

Thr

Glu

Leu

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Pro

Val

Ala

Glu

t

105

110

115

f 4 93 1 v’ p, ’·' s

’V.'-’J

—.·. j _£..r v

-.4 /h

GCC ATG GAT GCG

ATC GCT GCG. GCC GAT CTT

AGC CAG ACG

AGC Ser

GGG Gly

TTC Phe

1817

Ala

Met

Asp Ala 120

íle Ala

Ala

Ala 125

Asp Leu

Ser

Gin

Thr 130

GGC

CCA.

TTC

GGA

CCG

CAA

GGA

ATC

GGT

CAA

TAC

ACT

ACA

TGG

CGT

GAT

18 65

Gly

Pro

Phe·

Gly

Pro

Gin

Gly

íle

Gly

Gin

Tyr

Thr

Thr

Trp

Arg

Asp

135

140

145

TTC

ATA

TGC

GCG

ATT

GCT

GAT

CCC

CAT

GTG

TAT

CAC

TGG

CAA

ACT

GTG

1913

Phe

íle

Cys

Ala

íle

Ala

Asp. Pro

His

Val.

Tyr

His

Trp

Gin

Thr

Val

150

-

155 ' 1

160

165

ATG

GAC

GAC

ACC

GTC

AGT

GCG

TCC

GTC

GCG

CAG

GCT.

CTC

GAT.

GAG

CTG

1961

Met

Asp

Asp

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Val

Ala

Gin

Ala

Leu

Asp

Glu

Leu

170

175

180

ATG

CTT

TGG

GCC

GAG

GAC

TGC

CCC

GAA

GTC

CGG

CAC

CTC

GTG

CAC

GCG

2009

Met

Leu.Trp

Ala

Glú

Asp

Cys

Pro

Glu

Val

Arg

His

Leu

Val

H^S

Ala

•

185

190

K.-*

r·

195

GAT

TTC

GGC

TCC

AAC

AAT

GTC

CTG

ACG

GAC

AAT

GGC

CGC

ATA

ACA

GCG

2057

Asp

Phe

Gly

Ser

Asn

Asn

Val

Leu

Thr

Asp

Asn

Gly

Arg

íle

Thr

Ala

200

205

210

GTC

ATT

GAC

TGG

AGC

GAG

GCG

ATG

TTC

GGG

GAT

TCC

CAA

TAC

GAG

GTC

2105

Val

íle

Asp

Trp

Ser

Glu

Ala

Met

Phe

Gly

Asp

Ser

Gin

Tyr

Glu

Val

215

220

225

GCC

AAC

ATC

TTC

TTC

TGG

AGG

CCG

TGG

TTG

GCT

TGT

ATG

GAG

CAG

CAG

2153

Ala

Asn

íle

Phe

Phe

Trp

Arg

Pro

Trp

Leu

Ala

cys

Met

Glu

Gin

Gin

230

235

í

240

245

ACG

CGC

TAC

TTC

GAG

CGG

AGG

ČAT

CCG

GAG

CTT

GCA

GGA

TCG

CCG

CGG

2201

Thr

Arg

Tyr

Phe

Glu

Arg

Arg

His

Pro

Glu

'Leu

Ala

Gly

Ser

Pro

Arg

250

255

. 260

CTC

CGG

GCG

TAT

ATG

CTC

CGC

ATT

GGT

CTT

GAC

CAA

CTC

TAT

CAG

AGC

2249

Leu

Arg

Ala

Tyr

Met

Leu

Arg

’íle

Gly

Leu

Asp

Gin

Leu

Tyr

Gin

Ser

j

265

‘270

275

TTG

GTT

GAC

GGC

AAT

TTC

GAT

GAT

GCA

GCT

TGG

GCG

CAG

GGT

CGA

TGC

2297

Leu

Val

Asp

Gly

Asn

Phe

Asp

ASp

Ala

Ala

Trp

Ala

Gin

Gly

Arg

Cys

280

285

290

GAC

GCA

ATC

GTC

CGA

TCC

GGA

GCC

GGG

ACT

GTC

GGG

CGT

ACA

CAA

ATC

234 5

Asp

Ala

íle

Val

Arg

Ser

Gly

Ala

Gly

Thr

Val

Gly

Arg

Thr

Gin

íle

295

300

305

GCC

CGC

AGA

AGC

GCG

GCC

GTC

TGG

ACC

GAT

GGC

TGT

GTA

GAA

GTA

CTC

2393

Ala

Arg

Arg

Ser

Ala

Ala

Val

Trp

Thr

Asp

Gly

Cys

Val

Glu

Val

Leu

310

315

320

325

GCC

GAT

AGT

GGA

AAC

CGA

CGC

CCC

AGC

ACT

CGT

CCG

AGG

GCA

AAG

GAA

2441

Ala

Asp

Ser

Gly

Asn

Arg

Arg

Pro

Ser

Thr

Arg

Pro

Arg

Ala

Lys

Glu

330 335 ' 340

TAGTGAGGTA CCTAATAGTG AGATCCAACA CTTACGTTTG CAACGTCCAA GAGCAAATAG 2501

V

ľ.b.

'.‘B

ACCACGACGC	CGGAAGGTTG	CCGCAGCGTG	TGGATTGCGT	CTCAATTCTC	TCTTGCAGGA	2561
ATGCAATGAT	gaatatgata	CTGACTATGA	AACTTTGAGG	GAATACTGCC	TAGCACCGTC	2621
ACCTCATAAC	GTGCATCATG	CATGCCCTGA	CAACATGGAA	CATCGCTATT	TTTCTGAAGA	2681
ATTATGCTCG	TTGGAGGATG	TCGCGGCAAT	TGCAGCTATT	GCCAACATCG	AACTACCCCT	2741
CACGCATGCA	TTCATCAATA	TTATTCATGC	GGGGAAAGGC	AAGATTAATC	CAACTGGCAA	2801
ATCATCCAGC	GTGATTGGTA	ACTTCAGTTC	CAGCGACTTG	ATTCGTTTTG	GTGCTACCCA	2861
CGTTTTCAAT	AAGGACGAGA	TGGTGGAGTA	AAGAAGGAGT	GCGTCGAAGC	AGATCGTTCA	2921
AACATTTGGC	AATAAAGTTT	CTTAAGATTG	AATCCŤGTTG	CCGGTCTTGC	GATGATTATC	2981
ATATAATTTC	TGTTGAAŤŤA	CGTTAAGCAT	GTAATAATTA	ACATGTAATG	CATGACGTTA	3041
TTTATGAGAT	GGGTTTTTAT	GATTAGAGTC	CCGCAATTAT	ACATTTAATA	CGCGATAGAA	3101
AACAAAATAT	AGCGCGCAAA	CTAGGATAAA	TTATCGCGCG	CGGl’GTCATC	TATGTTACTA	3161
GATCGATCAA	ACTTCGGTAC	TGTGTAATGA	CGATGAGCAA	ŤCGAGAGGCT	GACTAACAAÁ	3221
AGGTACATCG	GTCGAC	ŕ				3237

(2) Informácie o SEQ ID NO:27:

(i)	Vlastnosti sekvencie:
(A) DÍžka: (B) Typ: (D) Topológia:	4 aminokyseliny aminokyselina lineárna ,
( ii)	Typ molekuly:	peptid

(xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO:27:

Met Met Met Pro i · (2) Informácieo SEQ ID NO:28:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) DÍžka:

(B) Typ:

(D) Topólógia:

. (ii) Typ molekuly:

(xi) Popis sekvencie:

aminokyseliny aminokyselina ' j lineárna' * _f ' ·.

peptid l

SEQ ID NO:28:

Lys Asp Glu Leu rv í/t- 7j

Claims (15)

1. PATENTOVÉ K Ä R Ό K Y''

   1. Izolovaný a purifikovaný fragment nukleovej kyseliny, obsahujúci prinajmenšom jednu nukleotidovú sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii SEQ ID NO: 2 kódujúci zásobný proteín zŕn kukurice HSZ alebo je s touto sekvenciou v podstate homologný.
2. 2. Izolovaný a purifikovaný fragment nukleovej kyseliny, obsahujúci prinajmenšom jednu nukleotidovú sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii SEQ ID NO: 3 kódujúci zásobný proteín' zrelých zŕn kukurice HSZ alebo je s touto sekvenciou v podstate homologný.
3. 3. Izolovaný a purifikovaný fragment nukleovej kysliny, obsahujúci prinajmenšom jednu nukleotidovú sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii SEQ ID NO: 4 kódujúci zásobný proteín zŕn kukurice HMD alebo je s touto sekvenciou v podstate homologný.
4. 4. Fragment nukleovej kyseliny podlá nároku:3 operabílne pripojený k signálnej sekvencii dvojdelóžnej rastliny.
5. 5. Fragment nukleovej kyseliny podlá nároku 3 operabilne pripojený k signálnej sekvencii rastliny.

   L ’ ' - ·

   Λ
6. 6. Chimerický gén, ktorý je schopný uskutočniť /zmenenú úroveň aminokyseliny s obsahom síry v transformovaných rastlinách, obsahujúci fragment nukleovej kyseliny podlá akéhokoľvek nároku 1 až 5, operabílne pripojéný k intracelulárnej lokalizačnej sekvencii a vhodnej regulačnej sekvencii.

   -2.-
7. 7. Chimérický gén podía nároku 6, v ktorom je regulačná sekvencia zvolená zo súboru zahrňujúceho regulačné sekvencie špecifické pre semená. ^! i
8. 8. Rastlina transformovaná chimerickým génom podlá nároku 6.
9. 9. Rastlina podlá nároku 8, zvolená zo súboru zahrňujúceho kukuricu, sóju; kanolu (nízkoeruková repka olejka), tabak a ryžu.

   ' í ' . i
10. 10. Semená, ktoré pochádzajú z rastlín podlá nároku 8. ’
11. 11. Chimérický gén, ktorý je schopný uskutočniť, zmenenú úroveň aminokyseliny s obsahom síry v transformovaných mikroorganizmoch, obsahujúci fragment nukleovej kyseliny podlá nároku 2 alebo 3, operabílne pripojený k vhodnej regulačnéj^;sekvencii.
12. 12. Mikroorganizmus transformovaný chimerickým génom podía nároku 11.
13. 13. Polypeptidový produkt expresie fragmentu nukleovej kyseliny podía nároku 1,2 alebo 3 v prokaryotických alebo eukaryotických hostitelských bunkách.
14. 14. Rastlina obsahujúca polypeptidový produkt podlá nároku 13.
15. 15. Semená obsahujúce polypeptidový produkt podía nároku 13.