CN1836045B - 用于早期种子发育的新型植物启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码转录调节区域的DNA分子。进一步说，本发明涉及编码转录调节区域的核苷酸序列，此调节区域促使早期种子或种皮毗连核苷酸序列的转录增强。

Description

用于早期种子发育的新型植物启动子
本申请要求保护2003年3月28日申请的美国临时申请60/458,828号的权益，其通过引用结合到本文中。 
发明领域
本发明涉及植物遗传学领域。更详细的说，本发明涉及种子早期发育基因表达。本发明提供了在种子中能够转录异源核酸序列的启动子，和修饰、生产、应用这种启动子的方法。本组合物包含植物启动子的新型核苷酸序列，尤其是来自拟南芥(Arabidopsis)pBAN的种皮启动子；和来自拟南芥p26、p63、p63tr的早期的种子启动子，它们有助于农作物中农学上重要的转基因的表达。 
发明背景 
已知大量基因只在正在发育种子中表达，或者在正在发育的种子中比在其它组织或器官类型中有更高水平的表达。关于种子特异性基因表达的大量信息从编码贮存蛋白质的基因的研究中获得(见Bevan等综述，Phil.Trans.Royal Soc.Lond.Biol.Sci.，342：209-215页(1993))。例如，转基因植物大豆conglycinin启动子旁边的赋予胚胎特异性表达的DNA序列已经被鉴定(Chen等，EMBO J.，6：3559-3564页(1988))。类似地，贮存蛋白油菜籽蛋白是欧洲油菜(Brassica napusL.)(油籽油菜)种子的主要蛋白组分之一。来自油菜籽蛋白的5′调节区已经公布(Kridi等.，Seed Sci.Res.，1：209-219(1991))。从油菜籽蛋白启动子获得的152bp的片段指导β-葡糖醛酸糖苷酶报告基因在成熟烟草种子中强表达(Stalberg等，Trarasgenic Researca，7(3)：165-172(1998))。油菜籽蛋白启动子被用于控制转基因植物的基因表达，这种植物被设计生产新型脂肪酸(例如Voelker等，Plant journal，9：229-241(1996))。然而，由于在油菜籽蛋白基因或其它贮存蛋白基因到达最高水平表达之前贮存脂肪基本开始积聚(Post-Beittenmiller等，Control of Plant Gene Expression，Verma，D.P.(ed.)Telford Press，pp.157-174(1992))，贮存蛋白基因启动子可能不总适于控制与植物种子中油类积聚相关的基因的表达。 
目前的技术允许用异源基因转化植物。如果启动子是组成型的，则这些基因的表达随时随地进行，如果启动子是阶段特异性或组织特异性的，则这些基因以时间性或空间性方式调节。持续表达排除了特定阶段或具体组织的生产，相反它们对产率有不利影响，这是因为产物合成的延长需要的能量也增加。组织或阶段特异性表达能够严格控制所需产物的时间和空间积聚。因此，迫切需要以组织特异性和阶段特异性方式用于重组构建体以转化植物的控制所需基因表达的启动子序列，以及使引入基因的表达地点、时间和过程更容易控制并且减少对总体植物生长的不利影响的可能性的启动子序列。 
为了生产具有多种所需特性的转基因植物，最好用不同的启动子提供基因表达，以使基因以产生所需效果的必要量有效转录。基因改良种质的商业开发也进入到向农作物中引入多重特性的阶段，常常称为基因堆积法。用这种方法，可把提供不同的有益的特性的多基因引入一种植物中。通常期望在将多基因引入一种植物中时调节或者控制每一基因至最佳表达，达到不同调节元件的要求。基于这些或其他考虑，很明显，基因表达的最优控制和调节元件的多样性在植物的生物技术中是重要的。 
发明概述 
在本发明中，我们提供编码转录调节区的DNA分子，用于驱动所选的多肽分子在植物细胞中在特定时间和特定组织中表达。 
本发明提供和描述了调节植物中异源多核苷酸分子表达的组合物和方法。本组合物包含植物启动子的新型核苷酸序列，更详细的 说，来自拟南芥pBAN的种皮启动子，和来自拟南芥p26、p63和p63tr的早期种子启动子。 
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含多核苷酸序列的启动子，所述多核苷酸序列选自：来自基本由SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：4组成的多核苷酸序列组的核苷酸序列；与SEQ ID NO：2或其任何片段或区域基本同源的多核苷酸序列；和包含SEQ ID NO：3的多核苷酸序列。 
在另一实施方案中，本发明提供了一种包含含有一种多核苷酸序列的启动子的植物表达构建体，所述多核苷酸序列选自：来自基本由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4组成的多核苷酸序列组的多核苷酸序列；与SEQ ID NO：2或其任何片段或区域基本同源的多核苷酸序列；和包含SEQ ID NO：3的多核苷酸序列，其中所述的启动子操作性连接到转录性多核苷酸分子上。在一个优选的实施方案中，这个转录性多核苷酸分子是农学感兴趣的基因。在一个优选的实施方案中，这个转录性多核苷酸分子是标记基因。 
在又一实施方案中，本发明提供了一种转基因产种子的双子叶植物，用包含含有一种多核苷酸序列的启动子的一种植物表达构建体稳定转化而成，所述多核苷酸序列选自：来自基本由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4组成的多核苷酸序列组的多核苷酸序列；与SEQ ID NO：2或其任何片段或区域基本同源的多核苷酸序列；和包含SEQ ID NO：3的多核苷酸序列，其中所述的启动子操作性连接到转录性多核苷酸分子上，该分子又操作性连接在一个3′转录末端多核苷酸分子上。在一个优选的实施方案中，这种双子叶植物选自烟草、番茄、马铃薯、花生、大豆、棉花、双低油菜(canola)、油菜(rapeseed)、红花、亚麻、甜菜、拟南芥、芸苔(Brassica)、向日葵和苜蓿。在一个更优选的实施方案中，该转基因双子叶植物种子的蛋白质含量有改变。在一个更优选的实施方案中，该转基因双子叶植物种子的油类含量有改变。在一个更优选的实施方案中，该转基因双子叶植物种子的微量营养素含量有改变。在一个更优选的实施方案中，本发明提供了转基因双子叶植物的种子、油类或者粗粉。     
在另一实施方案中，本发明提供了一种生产植物油和粗粉方法，包括以下步骤：将操作性连接到改变油类含量的转录性多核苷酸分子的本发明的启动子引入到产种子的双子叶植物基因组中，培育此双子叶植物以生产种子，并从种子中提取油类以生产油类和粗粉。 
以下的具体描述和相关图片可以使得本发明的上述的和其他的方面更为清楚。 
序列表简述 
SEQ ID：1代表编码pBAN启动子的核酸分子。 
SEQ ID：2代表编码p26启动子的核酸分子。 
SEQ ID：3代表编码p63启动子的核酸分子。 
SEQ ID：4代表编码p63tr启动子的核酸分子。 
SEQ ID：5代表来自拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)5号染色体的p1克隆：MQL5gi|3702735|dbj|AB018117.1|。 
SEQ ID：6代表BAC克隆T13M11。 
SEQ ID：7为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为克隆26 GSP1。 
SEQ ID：8为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为克隆26GSP2。 
SEQ ID：9为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为BAN+1500。 
SEQ ID：10为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为pBANGSP1。 
SEQ ID：11为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为BAN-Nco。 
SEQ ID：12为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为p63-Nco。 
SEQ ID：13为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为p63-fwd3。 
SEQ ID：14为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为GUS 5′。 
SEQ ID：15为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为GUS 3’。 
SEQ ID：16为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为CP4-Dra。 
SEQ ID：17为用于PCR扩增的引物序列，被鉴定为CP4-Kpn。 
附图简述 
图1是pMON69802的图解。 
图2是pMON69804的图解。 
图3是pMON69815的图解。 
图4是pMON69812的图解。 
图5是pMON82350的图解。 
图6是pMON65422的图解。 
图7是pMON65428的图解。 
发明详述 
提供下列定义和方法以更好地定义本发明和引导本领域的普通技术人员对本发明的实践。除非另有说明，根据相关技术领域的技术人员的常规用法来理解术语。 
本文所用的短语“多核苷酸分子”是指基因组的或人工合成的单链或双链的DNA或RNA分子，即，脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的多聚物，各自从5′端(上游)到3′端(下游)阅读。 
本文所用的短语“多核苷酸序列”指的是多核苷酸分子的序列。使用37 CFR§1.822中所示的DNA碱基命名。 
本文所用的“异源”DNA是任何在自然界不存在于邻近的DNA旁边的多核苷酸序列。在用于转化的DNA构建体中经常发现有异源DNA。由于p26启动子在自然界存在并通常与p26基因结合，可与报告基因操作性连接的p26启动子是异源DNA的实例。 
启动子
本文所用的术语“启动子”指的是一种多核苷酸分子，在天然状态下位于开放阅读框(或蛋白质编码区)的翻译起始密码子的上游或5′端，并且参与鉴别和结合RNA聚合酶II和其它蛋白质(反式作用转录因子)以启动转录。“植物启动子”是植物细胞中有功能的天 然或非天然启动子。结构性植物启动子在大多数或所有植物组织的植物发育全过程中起作用。任何植物启动子都可作5′调节元件以调节特定基因或与其操作性连接的基因的表达。当与转录性多核苷酸分子操作性连接时，启动子典型地引起该转录性多核苷酸分子以一种与该启动子正常结合的方式转录。植物启动子可包括通过操纵已知启动子生产的人造的、嵌合的或者杂交的启动子制造的启动子。这样的启动子的也可合并来自一个或几个启动子的顺式元件，例如，通过给活性启动子增加与其自身部分或者完全异源的调节元件。这样，本发明包括嵌合或者杂交启动子的设计、构建及应用，该嵌合或者杂交的启动子至少包括调节操作性连接的多核苷酸序列表达的顺式元件SEQ ID NO：1、2、3或4中的一个。 
本文所用的术语“顺式元件”是指赋予基因表达整体控制性质的顺式作用转录调节元件。顺式元件可以发挥作用与转录因子和调节转录的反式作用蛋白因子结合。一些顺式元件不只结合一个转录因子，而转录因子可以不同的亲和力与不只一个顺式元件相互作用。本发明所需的启动子包含能够赋予或者调节基因表达的顺式元件。顺式元件可以通过许多技术来鉴别，包括从启动子的5′端或者内部去掉一个或者多个核苷酸的缺失分析法(deletion analysis)；应用DNA酶I足迹分析(DNase I footprinting assay)的DNA结合蛋白分析、甲基化干扰、电泳流动迁移分析、利用连接反应介导的PCR(ligation-mediated PCR)的体内基因组足迹法以及其它常规方法；或者利用常规DNA序列比对分析方法与已知的顺式元件基序进行DNA序列相似性分析。通过一个或者多个核苷酸分子的突变(或置换)或者其它常规方法可以进一步研究顺式元件的细微结构。顺式元件可以通过化学合成或者从含有这类元件的启动子中分离得到，并且该顺式元件能够与附加的含有有用的限制性酶切位点的侧翼核苷酸合成在一起促进序列操纵。 
在一个实施方案中，本发明的启动子包括多种赋予基因表达整体控制不同性质的顺式元件。在一个优选的实施方案中，应用为鉴 别序列中的顺式元件、域以及基序而特别设计的计算机程序，来鉴别SEQ ID NO：1、2、3和4多核苷酸分子中的顺式元件。根据具体情况，顺式元件可正向或者负向调节基因的表达。因此本发明包括已公布启动子的顺式元件。 
本文中所用的术语“基本同源”指的是通常表现出与本文所述的启动子百分序列同一性相当大的多核苷酸序列。特别感兴趣的是在植物中发挥作用指导转录的多核苷酸分子，与本文所述启动子的多核苷酸序列有至少约70％序列同一性，至少约80％序列同一性，至少约90％序列同一性，甚至更高的序列同一性，比如98％、99％的序列同一性。本发明范围内的多核苷酸分子是能够调节操作性连接转录性多核苷酸分子的转录的多核苷酸分子和与本文所述的启动子多核苷酸序列基本同源的多核苷酸分子。 
本文所用的短语“百分序列同一性”指的是，两序列进行最佳对比时(带有合适的核苷酸插入、缺失或间隔，总量少于参照序列对比窗的20％)，参照多核苷酸分子(或其互补链)线形序列与测试的多核苷酸分子(或其互补链)比较时相同核苷酸的百分率。对于本领域的技术人员来说对比窗中序列的最佳对比是众所周知的，而且有许多方法可以指导序列的最佳对比，比如Smith和Waterman的局部同源算法，Needleman和Wunsch的同源对比算法，Pearson和Lipman的寻找相似性法，和优选的这些算法的计算机程序化，比如作为GCGWisconsin Package(Accelrys Inc.，San Diego，CA)一部分的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA算法。测试序列与参照序列对比片段的“同一性分数”是所述两个序列相同成分的数量除以参照序列片段成分总的数量，即整个参照序列或参照序列中更小的已经明确的部分。百分序列同一性用同一性分数乘100来表示。一个或更多多核苷酸序列可以和全长多核苷酸的序列，或者其中的一部分，或者是更长的多核苷酸序列进行比较。 
本文所用的术语“同源”指的是根据百分核苷酸位置同一性，即序列相似性或者同一性，多核苷酸序列之间的相似性或序列同一 性的水平。本文所用的术语“同源”也指不同的多核苷酸分子之间相似的功能特征，比如相似功能的启动子可有同源的顺式元件。当在特定的条件下特异性杂交形成双链分子时，多核苷酸分子是同源的。在这些条件下，称为严格条件，多核苷酸分子可用作分子探针或引物来鉴别其它同源的多核苷酸分子。短语“严格条件”是功能方面定义，与通过特异的杂交过程使核酸探针与靶核酸分子(即感兴趣的特定核酸序列)的杂交有关，(比如：感兴趣的特定核酸序列)，所述过程见《分子克隆》-Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版，卷1、2和3.J.F.Sambrook，D.W.Russell，和N.Irwin，冷泉港实验室出版，2000(本文称为Sambrook等)。因此，本发明的核苷酸序列可有助于使它们能够与多核苷酸分子片段的互补链选择性形成双螺旋。依据不同的应用，需要应用不同的杂交条件以获得针对目标序列的具有不同程度选择性的探针。就要求高选择性的应用而言，典型地需要用相对高严格的条件形成杂交，比如选择相对低盐和/或高温的条件，例如在约50℃-70℃温度℃下以约0.02M-0.15M的NaCl溶液提供。高严格性的条件诸如用高严格性洗涤缓冲溶液(0.2X SSC，0.1％SDS，65℃)冲洗杂交过滤装置至少两遍。本领域技术人员知道，适宜的中严格性条件促进DNA的杂交，比如约45℃的6.0x氯化钠/柠檬酸钠溶液(SSC)，接着用约50℃的2.0X SSC冲洗。此外，冲洗过程中盐浓度的选择可以从低严格要求的50℃的2.0X SSC到高严格要求的50℃的0.2x SSC。另外，冲洗过程中的温度可以从低严格要求的约22℃的室温到高严格要求的65℃左右。室温和盐的浓度都可以变，或者当一个条件变化时，另一个可以保持不变。这类选择性条件几乎不容许在探针与模板或目标链之间有错配。本领域的技术人员非常熟悉通过杂交检测多核苷酸分子，而且美国专利4,965,188和5,176,995所述就是杂交分析的示例性方法。 
同源也可由计算机程序对比多核苷酸序列和估计多核苷酸分子在某些严格性条件下形成双螺旋分子的能力来测定。共有高度同源的不同来源的多核苷酸分子称为同源。 
本领域的技术人员非常熟悉的方法可以用来鉴别具有本文所述启动子相似活性的感兴趣的启动子。例如，可以利用感兴趣的细胞或组织构建cDNA文库，筛选鉴别具有与本文所述启动子相似表达方式的基因。鉴别基因的cDNA序列可以用来分离该基因的启动子以进一步鉴定。例如参见美国专利号6,096,950；5,589,583；和5,898,096；通过引用而结合到本文中。同样的，转录概况分析(transcriptionalprofiling)或者electronic northern能用于鉴别具有与本文所述启动子相似表达模式的基因，一旦鉴别了这些基因，就可以分离它们的启动子以进一步的鉴定，例如参见美国专利6,506,565和6,448,387，通过引用而结合到本文中。Electronic northern技术指的是基于电脑的序列分析，其容许多个cDNA文库来源的序列在基于研究者确定了的参数下进行电子对比，包括在多个cDNA文库中富含EST种群或者在一个文库或者融合组合文库中完全不含EST组。转录概况分析技术是用来系统监测数以千计基因表达图的一种高通量方法。DNA芯片技术可以分析支持物表面的数以千计的cDNA序列。这些阵列与从不同细胞或组织类型的RNA样品制备的标记的cDNA探针同时杂交，可以直接进行表达的对比分析。该方法可以用来分离调节序列比如与那些基因结合的启动子。 
在另一实施方案中，可修改本文公开的启动子。本领域的技术人员能够创建出多核苷酸序列有变化的启动子。如SEQ ID NO：1、2、3或4所示的本发明的启动子的多核苷酸序列能够修改或改变以提高他们的控制特性。改变多核苷酸序列的优选方法是应用PCR技术修改序列的选定的核苷酸或者区域。这些方法是本领域的技术人员熟知的。例如，在以PCR为基础的的DNA修饰中，可通过模板序列的插入、缺失、置换修饰序列。“变异体”是指一个包含变化的启动子，其中原始启动子的一个或多个核苷酸有缺失、增加和/或替换，优选同时基本保留启动子的功能。例如，从一个启动子的5′端或者3′端删除一个或多个碱基对以产生“截短的”启动子。启动子内也可插入、缺失或置换一个或多个碱基对。在这个启动子片段的 例子中，变异体启动子包括影响与其操作性连接的最小启动子转录的变化。一个最小的或者基本的启动子是指能够募集和结合基本的转录结构的多核苷酸分子。在真核细胞中基本转录结构的一个实例是RNA聚合酶II复合体及附属蛋白。例如，可通过标准的DNA诱变技术产生或者通过化学合成变异体启动子或者其中一部分生产变异体启动子。 
新型的嵌合启动子能够通过许多方法来设计和制造。许多启动子包含激活、提高或限制启动子的强度和/或特异性的顺式元件。例如，启动子可包含限定转录起始位点的“TATA”盒和其他定位于转录起始位点上游的调节转录水平的顺式元件。比如，嵌合启动子可以通过把包含一个启动子的激活剂顺式元件的第一启动子片段和包含另一个启动子的激活剂顺式元件的第二启动子片段融合而产生；所得嵌合启动子可以促进操作性连接的转录性多核苷酸分子的表达增加。构建启动子以使启动子片段或元件操作性连接，例如通过将该片段置于最小启动子的上游进行。本发明的顺式元件和片段可用于构建这种嵌合启动子。本发明的嵌合启动子变异体启动子的构建方法包括但不限于合并不同启动子的控制元件或者复制一个启动子部分或区域(例如参见美国专利4,990,607；5,110,732和5,097,025，全部通过引用而结合到本文中)。本领域技术人员熟悉那些描述构建、操作和分离高分子(例如，多核苷酸分子，质粒等)的特定条件和程序以及产生重组有机体和筛选和分离多核苷酸分子的标准来源材料。 
在另一个实施方案中，含有SEQ ID NO：2所示的多核苷酸序列的启动子包括任何长度的所述能够调节操作性连接的转录性多核苷酸分子的多核苷酸序列。例如，SEQ ID NO：2公开的的启动子，可以被截短或者部分删除并仍然能够调节操作性连接的多核苷酸分子的转录。在相关的实施方案中，公开的启动子的顺式元件可以赋予特定的特异性比如在某些组织中使操作性连接的多核苷酸分子的表达增强，因此也能够调节操作性连接的多核苷酸分子的转录。因 此，包含SEQ ID NO：2所示的多核苷酸序列的启动子的任何片段、部分或区域能作为调节性多核苷酸分子，包括不限于公开的多核苷酸分子的顺式元件或基序。置换、缺失、插入或者其任何组合都能结合产生最后的构建体。 
多核苷酸构建体
本文所用术语“构建体”是指任何重组多核苷酸分子，例如任何来源的质粒、粘粒、病毒、自动复制的多核苷酸分子、噬菌体、或线形或环状的单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，能够基因整合或者自动复制，包含其中一个或多核苷酸分子以功能性操作模式连接的多核苷酸分子。 
本文所用术语“操作性连接”是指第一多核苷酸分子，比如说启动子，与第二转录性多核苷酸分子比如说感兴趣的基因连接，其中多核苷酸分子的排列方式为使第一多核苷酸分子影响第二多核苷酸分子的功能。优选的此两个多核苷酸分子是单链邻接多核苷酸分子的一部分，更优选是相邻的两个多核苷酸分子。例如，如果启动子调节和介导细胞中的感兴趣的基因的转录，则这个启动子与感兴趣的基因操作性连接。 
本文所用术语“转录性多核苷酸分子”是指任何能够转录成RNA分子的多核苷酸分子。已知在细胞中引入构建体的方法，方式为转录性多核苷酸分子转录成功能mRNA分子，再翻译并因而表达为蛋白质产物。也可以构建构建体以转录反义RNA分子的或者其他类似抑制性RNA，从而抑制靶宿主细胞里感兴趣的特定RNA分子的表达。本领域的技术人员非常了解实施本发明的制备和应用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法，例如参见Sambrook等。 
本发明的构建体典型包含启动子，该启动子操作性连接到转录性多核苷酸分子上，该分子又操作性连接到3′转录终止多核苷酸分子上。此外，构建体可以包括但不限于附加的来自于植物基因的3′非翻译区(3′UTR)的调节性多核苷酸分子(例如，增加mRNA的稳定性的3′UTR，比如说马铃薯的PI-II终止区或章鱼碱、胭脂碱合成酶的3′端终止区)。构建体可以包括但不限于mRNA多核苷酸分子的5′非翻译区，这个mRNA多核苷酸分子在转录起始中有重要作用，在植物表达构建体中也是遗传成分。例如，来自于热应激蛋白基因的非翻译的5′引导多核苷酸分子表现出提高植物的基因表达，(例如参见，美国专利5,659,122和5,362,865，其通过引用结合到本文中)。这些增加的上游和下游调节性多核苷酸分子可以来自于与启动子构建体中的其他元件同源或异源的元件。 
因此，本发明的构建体包括诸如上述可以被修饰的SEQ ID NO：1、2、3或4提供的启动子，操作性连接到转录性多核苷酸分子以便于在植物细胞中引入所述的构建体后指导所述转录性多核苷酸分子在所需水平或所需组织中转录，或者指导发育图示。在一些方案中，转录性多核苷酸分子包括基因的蛋白质编码区，而启动子提供功能mRNA分子的转录，后者被翻译并表达为蛋白质产物。也可以构建构建体以转录反义RNA分子或者其他相似的抑制性RNA分子目的是抑制靶宿主细胞中感兴趣的特定RNA分子的表达。 
结合到本发明构建体的示例性转录性多核苷酸分子包括如除了靶基因物种外的物种的DNA分子或基因，甚至来源于或者出现在相同物种的基因，但是使用基因工程方法而非常规的生殖或饲养技术引入受体细胞。外源基因或基因元件指引入到受体细胞的任何基因或DNA分子。外源基因包括的DNA类型可包括已出现在植物细胞中的DNA，另一植物来源的DNA，不同有机体来源的DNA，或者外部产生的DNA，比如说含有基因反义信息的DNA分子，或者编码人工合成的或者修饰的基因的DNA分子。 
应用稳定植物系统中提供基因表达指示的在瞬时分析中描述和测试过的标记基因，可以将本发明的启动子引入到构建体中。本文所用术语“标记基因”指的是任何可以某种方式来筛选或者评价其表达的转录性多核苷酸分子。瞬时分析中标记基因表达的检测方法是本领域的技术人员已知的。已经报道了利用多种植物、组织和DNA传递系统的标记基因的瞬时表达。例如，瞬时分析的类型可包括但 不限于应用任何感兴趣的植物物种在任何瞬时植物分析中通过电穿孔或者粒子轰击组织的方法指导基因传递。这种瞬时系统包括但不限于各种组织来源的原生质体电穿孔或者感兴趣的特定组织的粒子轰击。本发明包括应用任何瞬时表达系统评价操作性连接到任何转录性多核苷酸分子上的启动子或启动子片段，包括但不限于选定的报告基因、标记基因或有农学意义的基因。设想通过合适的传递系统在瞬时分析中检测的植物组织实例包括但不限于叶子的基本组织、愈伤组织、子叶、根、胚乳、胚、花的组织、花粉和表皮组织。 
任何可评价或筛选的标记基因可用于瞬时分析。优选的用于本发明启动子或启动子片段瞬时分析的标记基因包括GUS基因(美国专利5,599,670，通过引用结合到本文中)或者GFP基因(美国专利5,491,084，通过引用结合到本文中)。包含操作性连接到标记基因的启动子或启动子片段的构建体被导入到组织中，而组织依靠标记通过合适的机制分析。当操作性连接到稳定植物中有农学意义的基因时，定性或定量分析用作工具评价启动子或启动子片段的潜在的表达图。 
因此，在一个优选的实施方案中，如SEQ ID NO：1、2、3或4所示的本发明多核苷酸分子或其片段、变异体或衍生物并入到构建体中以便于本发明的启动子操作性连接到提供能选择、筛选或评价的标记的转录性多核苷酸分子上。本发明中应用的标记物包括但不限于编码β-葡萄糖苷酸酶(GUS)的转录性多核苷酸分子、绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶(LUC)和具有抗体抗性的蛋白，或者具有除草剂耐受性的蛋白。本领域中已知的有用的抗体抗性标记物包括编码赋予抗卡那霉素(npt II)、潮霉素B(apb IV)、链霉素或壮观霉素(aad，spec/strep)和庆大霉素(aac3和aacC4)抗性的蛋白。可以使用已经证明了的转基因植物耐受的除草剂和本发明适用的方法，包括但不限于草甘霖、草铵磷、磺酰脲、咪唑啉酮、溴草腈、delapon、cyclohezanedione、protoporphyrionogen oxidase inhibitors和异噁氟草除草剂(isoxasflutole herbicides)。本领域已知的编码涉及耐受除草剂 的蛋白质的多核苷酸分子包括但不限于美国专利5,627,061；5,633,435；和6,040,497所述的编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸分子；编码美国专利5,094,945所述的耐受草甘霖的aroA；编码美国专利4,810,648所述的耐受溴草腈的溴草腈腈水解酶(Bxn)多核苷酸分子；编码耐受达草灭的八氢番茄红素(phytoene)脱氢酶(crtI)的多核苷酸分子，如在Misawa等，Plant J.，4：833-840(1993)和Misawa等，Plant J.，6：481-489(1994)所述；编码耐受磺酰脲除草剂的乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacid synthase)(AHAS，aka ALS)的多核苷酸分子，如在Sathasiivan等，Nucl.Acids Res.，18：2188-2193(1990)的所述；以及耐受草铵磷和双丙胺酰磷的如DeBlock等，EMBOJ.，6：2513-2519(1987)所述的bar基因。 
在一个优选的实施方案中，如SEQ ID NO：1、2、3或4所示的本发明多核苷酸分子或其片段、变异体或衍生物并入到构建体中以便于本发明的启动子操作性连接到有农学意义的基因即转录性多核苷酸分子上。本文中所用术语“有农学意义的基因”指的是转录性多核苷酸分子，其包括但不限于提供与植物形态、生理、生长发育、产量、营养提高、抵抗疾病或虫害，或耐受环境或化学试剂有关的所需特性的基因。期望表达有农学意义的基因，以赋予农学上重要的特征。例如，给农作物提供了有益农学特征的有农学意义的基因可以包括但不限于基因元件，其包含除草剂抗性(美国专利5,633,435和5,463,175)、提高产量(美国专利5,716,837)、害虫控制(美国专利6,063,597；6,063,756；6,093,695；5,942,664；和6,110,464)、抵抗真菌病(美国专利5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407；和6,506,962)、抵抗病毒(美国专利5,304,730和6,013,864)、抵抗线虫(美国专利6,228,992)、抵抗细菌疾病(美国专利5,516,671)，淀粉生产(美国专利5,750,876和6,476,295)、改良油的生产(美国专利6,444,876)、高油类生产(美国专利5,608,149和6,476,295)、改良脂肪酸生产(美国专利6,537,750)、高蛋白质生产(美国专利6,380,466)、果实成熟(美国专利5,512,466)、提高动物和人类的营养(美国专利5,985,605和 6,171,640)、生物高聚物(美国专利5,958,745和美国专利公开号2003/0028917)、环境应激抗性(美国专利6,072,103)、药用多肽(美国专利6,080,560)、改良的加工特性(美国专利6,476,295)、改良的消化性(美国专利6,53 1,648)、低棉子糖(美国专利6,166,292)、工业酶生产(美国专利5,543,576)、改良的风味(美国专利6,011,199)、固氮作用(美国专利5,229,114)、杂交种子生产(美国专利5,689,041)、生物燃料生产(美国专利5,998,700)，以上专利中列出的基因元件和转基因通过引用结合到本文中。 
能与本发明启动子核苷酸序列相结合的有用的核苷酸序列和提供改良的终产物特征的有用的核苷酸序列包括但不限于编码种子贮存蛋白、脂肪酸途径的酶、维生素E生物合成酶、氨基酸生物合成酶和淀粉分支酶的核苷酸序列。有助于植物表型修饰的示范性的异源DNA的讨论可以在例如美国专利6,194,636；6,207,879；6,232,526；6,426,446；6,429,357；6,433,252；6,437,217；6,515,201和6,583,338及PCT公开号WO 02/057471中找到，它们均通过引用而结合到本文中。 
优选的种子贮存蛋白包括玉米蛋白(美国专利4,886,878；4,885,357；5,215,912；5,589,616；5,508,468；5,939,599；5,633,436；和5,990,384；PCT公开号WO 90/01869，WO 91/13993，WO 92/14822，WO93/08682，WO 94/20628，WO 97/28247，WO 98/26064，和WO99/40209)、7S蛋白质(美国专利5,003,045和5,576,203)、巴西坚果蛋白(美国专利5,850,024)、苯基丙氨酸游离蛋白(PCT公开号WO 96/17064)、清蛋白(PCT公开号WO 97/35023)、b-conglycinin(PCT公开号WO 00/19839)、11S(美国专利6,107,051)、alpha-hordothionin(美国专利5,885,802和5,88,5801)、arcelin种子贮存蛋白(美国发明专利5,270,200)、凝集素(美国专利6,110,891)、麦谷蛋白(美国专利5,990,389和5,914,450)，它们均通过引用结合到本文中。 
优选的脂肪酸途径酶包括硫脂酶(美国专利5,512,482；5,530,186；5,945,585；5,639,790；5,807,893；5,955,650；5,955,329；5,759,829；5,147,792；5,304,481；5,298,421；5,344,771；和5,760,206)、二酰甘油酰基转移酶(美国专利公开号20030115632A1和20030028923A1)、和去饱和酶(美国专利5,689,050；5,663,068；5,614,393；5,856,157；6,117,677；6,043,411；6,194,167；5,705,391；5,663,068；5,552,306；6,075,183；6,051,754；5,689,050；5,789,220；5,057,419；5,654,402；5,659,645；6,100,091；5,760,206；6,172,106；5,952,544；5,866,789；5,443,974；和5,093,249)，它们均通过引用而结合到本文中。 
优选的维生素E生物合成酶包括tyrA、slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、GMT、MT1、tMT2、AANT1、slr1737和尿黑酸双加氧酶的反义构建体(Kridl等，Seed Sci.Res.，1：209：219(1991)；Keegstra，Cell，56(2)：247-53(1989)；Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，91：12760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbial.，138：1309-1316(1992)；Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，95(5)：2105-2110(1998)； Takahashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，95(17)：9879-9884(1998)；Norris等，Plant Plzysiol.，117：1317-1323(1998)；Bartley和Scolnik，PlantPhysiol.，104：1469-1470(1994)；Smith等，Plant J.，11：83-92(1997)；WO 00/32757；WO 00/10380；Saint Guily等，Plant Physio.，100(2)：1069-1071(1992)；Sato等，J.DNA Res.，7(1)：31-63(2000))，它们均通过引用而结合到本文中。 
优选的氨基酸生物合成酶包括邻氨基苯甲酸酯合酶(美国专利5,965,727和PCT公开号WO 97/26366、WO 99/11800和WO99/49058)、色氨酸脱羧酶(PCT公开号WO 99/06581)、苏氨酸脱羧酶(美国专利5,534,421和5,942,660；PCT公开号WO 95/19442)、苏氨酸脱氨酶(PCT公开号WO 99/02656和WO 98/55601)、二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinic acid)合酶(美国专利5,258,300)和天冬氨酸激酶(美国专利5,367,110；5,858,749；和6,040,160)，它们均通过引用而结合到本文中。 
优选的淀粉分支酶包括发表在美国专利6,232,122和6,147,279；和PCT公开号WO 97/22703中列出的酶，它们均通过引用而结合到本文中。 
可选择的，转录性多核苷酸分子可设计用来下调特定核苷酸序列。典型的通过与启动子的操作性连接而完成，例如与本发明的启动子，反义定向的外源DNA或者为了通过转录产生发卡结构RNA分子而设计的DNA连接。基因抑制可有效对抗具有一定特征的固有的植物基因，例如，给植物提供固有基因编码的低水平的蛋白质，或者提供高水平或低水平的受影响的代谢的特征。例如，本发明的启动子可以操作性连接到设计好的异源DNA以形成发卡结构RNA从而抑制双子叶种子内固有基因。RNA也可是起催化作用的RNA分子(比如核酶)，设计出来以裂解所需的内源mRNA产物。这样，任何编码蛋白质的多核苷酸分子或表达感兴趣的表型或形态变化的mRNA有助于本发明的实践。 
本文中所用的“基因抑制”是指对于抑制RNA转录或抑制RNA转录或产生由RNA转录物翻译的蛋白质产物的任何熟知方法，包括转录后基因抑制和转录抑制。转录后基因抑制由与靶抑制基因同源的双链RNA介导。包含至少部分转录单元的反向重复的外源DNA构建体转录的RNA引起的基因抑制，是基因抑制方法的共同特征，称为反义抑制、协同抑制和RNA干扰。转录抑制可由与启动子DNA序列同源的转录双链RNA介导，产生所谓的启动子反向抑制。 
更详细的，转录后基因抑制通过用反义定向的DNA插入外源DNA构建体以调节植物细胞中基因表达，公开于美国专利5,107,065和5,759,829，它们均通过引用而结合到本文中。用这种为基因抑制反义定向的DNA构建体转化的转基因植物可包含作为反向重复排列的DNA，公开于Redenbaugh等，“Safety Assessment of GeneticallyEngineered Flavr SavrTM Tamato，CRC Press，Inc.(1992)。反向重复插入可包含T-DNA构建体的一部分或全部，例如，反向重复的转录终止子序列。 
转录后基因抑制通过插入带有有义定向DNA的外源DNA构建体调节植物中基因表达，公开于美国专利5,283,184和5,231,020，它们通过引用结合到本文中。 
导致基因抑制的不同类型的外源DNA排列是本领域技术人员已知的，包括但不限于以下。PCT公开号WO94/01550公开了DNA构建体，其中反义RNA以自身互补3′端片段稳定。转录RNA中其它双链发夹形成元件在PCT公开号98/05770号公开，其中反义RNA通过发夹形成重复的聚(CG)核苷酸而稳定，并且，美国申请公开号2002/0048814A1描述了有义或反义RNA通过聚(T)-聚(A)尾稳定。美国申请公开号2003/0018993A1公布有义或反义RNA通过反向重复的NOS基因的3′端非翻译区的亚序列而稳定。美国申请公开号2003/0036197A1描述RNA通过与靶序列同源的两个互补RNA区域而稳定。 
从有义定向和无义定向DNA转录RNA也能导致基因沉默，如美国专利5,107,065和以下实例。美国专利6,326,193公开了操作性连接到反启动子(opposing promoter)的基因靶DNA。Sijen等，ThePlant Cell，8：2277-2294(1996)公开了使用转基因植物中携带反向重复的豇豆花叶病毒(CPMV)基因的构建体来介导病毒抗性。植物中通过双链RNA转录后基因抑制的构建体公开于PCT公开号WO99/53050，WO 99/49029，和美国申请公开号2003/0175965A1，美国申请公开号10/465,800，和美国专利6,506,559。又见于，美国申请号10/393,347公开了在转基因植物中抑制一个或多个固有基因同时表达一个或多个重组基因的构建体和方法。又见于，美国专利6,448,473公开了用于植物中的多基因抑制载体。所有上面所述的公开了植物中转录后基因抑制的材料与方法的专利、申请和国际公开号通过引用而结合到本文中。 
表达DNA构建体可导致转录抑制例如启动子反(trans)抑制。此构建体包含操作性连接到靶基因反向重复的启动子DNA上的启动子。有助于启动子反抑制介导的这种基因抑制的构建体公开于Mette 等，the EMBO Journal，18(1)：241-248，1999和Mette等，the EMBOJournal，19(19)：5194-5201，2000，它们均通过引用结合到本文中。 
本发明的构建体一般是双Ti质粒边缘DNA构建体，具有从包含T-DNA的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分离的Ti质粒的右边缘(RB或AGRtu.RB)区域和左边缘(LB或AGRtu.LB)区域，伴随土壤杆菌属细胞提供的转移分子，允许T-DNA整合进植物细胞的基因组中。构建体也包含在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择性的质粒骨架DNA片段，例如，大肠杆菌(E.coli)复制起始点如ori322，很宽的宿主范围复制起始区如oriV或oriRi，和一个如Spec/Strp选择性标记的编码区，编码Tn7氨基糖苷腺嘌呤转移酶(aadA)以赋予对壮观霉素或链霉素的抗性，或庆大霉素(Gm，Gent)的选择性标记基因。对于植物转化，宿主细菌的菌株常是根瘤土壤杆菌ABI，C58或LBA4404，但是，本领域技术人员所知的植物转化的其它菌株在本发明中能起作用。 
转化的植物和植物细胞
本文中所用的术语“转化”涉及细胞、组织、器官或生物体，其引入外来的多核苷酸分子，例如一种构建体。引入的多核苷酸分子可被整合入受体细胞、组织、器官或生物体基因组DNA中，以致引入的多核苷酸分子可以遗传到子代。一个“转基因的”或“转化的”细胞或生物体也包括这个细胞或生物体的子代，还包括使用这种转基因植物作为杂交中的母代并展示出由外源多核苷酸分子的存在导致的表型改变的育种程序产生的子代。可用任何植物转化方法在植物中引入包含本发明启动子的植物转化构建体。在本发明实践中向植物基因组中引入植物表达构建体转化植物的方法和材料，可包括任一已熟知的方法，也包括实例证实的方法包括电穿孔如美国专利5,384,253所述；微粒轰击如美国专利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861和6,403,865所述；土壤杆菌属介导的转化如美国专利5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301所述；和原生质体转化如美国专利5,508,184所述，它们均通过引用而结合到本文 中。 
本领域技术人员已知特异的转化双子叶(dicots)的方法。已经描述了用这些方法的转化和植物再生用于许多植物，包括但不限于棉花(Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、花生(Arachishypogaea)和芸苔属的成员。 
分析转化植物的感兴趣基因的存在和本发明启动子赋予的表达水平和/或概况。本领域技术人员已知许多适用于转化植物的分析方法。例如，植物分析方法包括但不限于Southern印迹或northern印迹、基于PCR的方法、生化分析、表型筛选方法、现场评估和免疫诊断分析。 
本发明种子可自能结果实的转基因植物收获，并用于培育本发明的转基因植物的子代，包括含有本发明构建体和表达有农学意义基因的杂交植物系。 
本发明也提供了本发明的植物部分。植物部分，包括但不限于种子、胚乳、胚珠和花粉。在一个本发明特别优选的实施方案中，植物部分是种子。可以理解，即使从其它植物部分分开或分离后，其它植物部分可能污染分离或分开的植物部分。在一个优选方面，分开的植物部分超过分离材料的50％(w/w)，更优选的超过分离材料的75％(w/w)，甚至更优选的超过分离材料的90％(w/w)。用这种方法产生的本发明的植物或植物部分可用已知的方法加工成产物。优选的产物是粗粉、原种和油类。 
在另一实施方案中，本发明提供了生产植物油的方法，包含本发明启动子整合入油料种子植物的基因组的步骤，本启动子操作性连接到赋予变化的油类含量的转录性多核苷酸分子上，培育油料种子植物生产油料种子，并自油料种子中提取油类。 
在另一个实施方案中，本发明提供了生产粗粉的方法，包含本发明启动子整合入油料种子植物的基因组的步骤，本启动子操作性连接到赋予变化的蛋白质含量和/或微量营养素含量的转录性多核苷酸分子上，培育油料种子植物生产油料种子，并自油料种子生产粗 粉。 
生产饲料、粗粉、蛋白质和油类制品的方法是本领域已知的。例如，见美国专利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669和6,156,227。在一个优选的实施方案中，蛋白质制品是高蛋白制品。这种高蛋白制品优选的蛋白含量大于约5％w/v，更优选大于约10％w/v，甚至更优选大于约15％w/v。在一个优选的实施方案中，油类制品是高油制品，来源于本发明植物或其部分的油含量大于约5％w/v，更优选大于约10％w/v，甚至更优选大于约15％w/v。在一个优选的实施方案中，油类制品是液体，并且体积大于1、5、10或50升。本发明提供了自本发明植物生产的或用本发明的方法生产的油类。这种油类可是任何所得产品的次要的或主要组分。而且，这种油类可和其它油类混合。在一个优选的实施方案中，自本发明植物生产的或用本发明的方法生产的油类，其占任何产物的油类组分按体积或重量计大于约0.5％、约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或约90％。在另一个实施方案中，油类制品可是混合的，并且占混合物体积大于约10％、约25％、约35％、约50％或约75％。从本发明的植物中得到的油类可以和一种或多种有机溶剂或石油馏分混合。 
在又一个实施方案中，本发明的粗粉可以与其它粗粉混合。在一个优选的实施方案中，本发明的植物生产的粗粉或者由本发明的方法产生的粗粉占任何产品的粗粉组分按体积或重量计大于约0.5％、约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或者约90％。在另一实施方案中，粗粉制品可以是混合的，所占混合物体积可大于约10％、约25％、约35％、约50％或者约75％。 
术语“微量营养素含量”是指种子中微量营养素的量，以重量为分母的分数表示，所述微量营养素如维生素A、E、K、生育酚类、生育三烯酚类、或胡萝卜素类。 
术语“油类含量”指可以测定的油类水平，例如，其可由低分辨的1H核磁共振(NMR)测定(Tiwari等，JAOCS，51：104-109，1974 或Rubel，JAOCS，71：1057-1062，1994)，或者由近红外的透射比(NIT)光谱测定(Orman等，JAOCS，69(10)：1036-1038，1992和Patrick等，JAOCS，74(3)：273-276，1997)。 
短语“蛋白质量”指一种或多种必需的氨基酸的水平，可以是游离的或结合在蛋白质中的氨基酸，即组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。 
将以下的实施例包括进来以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应能领会实施例中公开的技术，遵循由发明者发现的良好地应用于本发明实践中的代表技术。然而，按照本发明的公开，本领域的技术人员应能领会可以在公开的特定实施方案中进行许多变化，而仍得到没有背离本发明的精神和范围的同样的或相似的结果，因此，所有所描述的物质或附图所示的物质应解释为对本发明的说明而不是对本发明的限制。 
实施例1 
本实施例描述了植物启动子p26、p63、p63tr和pBAN的核酸序列的分离和鉴定。 
p26
使用cDNA-AFLP方法从拟南芥菜中鉴别出cDNA克隆，即指定的克隆26。简言之，根据制造商的说明书分离的拟南芥mRNA建立SMART cDNA库(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)。此mRNA分离自开放的花(花序)、茎、完整的籽苗，和开花之后4、7、10、13或18天收获的发育中的种子(DAF)。按照制造商的说明书，使用Gibco-BRL小基因组AFLP II试剂盒对500微克的扩增的SMART cDNA进行AFLP分析(Invitrogen，Carlsbad，CA)。所得谱带经过6％丙烯酰胺/8M尿素测序凝胶电泳后显色。单一的谱带，称为谱带26，从4 DAF发育中的种子组织得到cDNA的电泳泳道唯一可见的条带，可从凝胶中提取。把丙烯酰胺谱带放入50μl的TE(10mM Tris-HCl(pH 8.0)；1mM EDTA)洗脱DNA并在周围环境 温度下过夜夜洗脱谱带。短暂的离心之后，0.75μl上清液用作模板进行PCR扩增。将20微升的扩增前引物混合物2(Gibco-BRL小基因组AFLP II试剂盒，Invitrogen)、含有15mM MgCl的2.5μl10XPCR缓冲液(PE Applied Biosystems Foster City，CA)、2.5单位AmpliTaq DNA聚合酶(PE Applied Biosystems)和2μl水加入到DNA模板中。扩增条件如下：25循环的94℃持续30秒，56℃持续60秒和72℃持续2分钟，然后是一循环的72℃持续2分钟。根据制造商的说明书将所得DNA片段亚克隆入pCR2.1 Topo(Invitrogen)。根据制造商的说明书，使用SMART PCR cDNA合成试剂盒(BD Biosciences，Clontech，Palo Alto，CA)，将此cDNA克隆26与制备自SMART cDNA库的有效(virtual)Northerns杂交。克隆26被描述成在种子发育的早期阶段表达。用PE Applied BiosystemsBigDye terminator V.3.0所述的标准测序方法测定了克隆26序列(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)。 
然后用克隆6的全部序列作为BLAST的查询序列检索公共的和私有的基因组的DNA数据库。单一的EST克隆，LD33176-P1-K1-C12，即通过此检索鉴别。此克隆与拟南芥菜中十六酰蛋白质硫酯酶同源(GenBank protein_id BAA97167；gi：8809616)。克隆26的全部基因组的序列包含在P1克隆MQL5(SEQ ID NO：5，GenBankAccession AB018117；gi：3702735)中。 
为制备拟南芥基因组文库，使用修改的基因组DNA分离方案分离基因组DNA(Dellaporta等，Pla7lt Molecular Biology Reporte7；1：19-21，1983)。收获土壤或盆中长大的拟南芥籽苗并冻存于液态氮中直到提取。用液氮保存组织冰冻的同时使用乳钵与研棒研磨组织成细粉末。研碎的组织转移至Waring混合器，包含200ml的冷(0℃)DNA提取缓冲液(350mM山梨醇；100mM Tris；5mM EDTA；用HCl调pH至7.5；临使用前加入亚硫酸氢钠(3.8mg/ml)并高速匀化30-60秒。经过干酪包布层过滤匀浆并收集入离心瓶。2500xg离心样品20分钟。弃去上清液和任何松散的绿色物质。然后将沉淀 重悬于1.25ml DNA提取缓冲液中并转移到50ml聚丙烯管中。然后加入1.75ml核裂解缓冲液(200mM Tris；50mM EDTA；2MNaCl；2％CTAB(溴化十六烷基三甲铵，Sigma，St.Louis，MO)；用盐酸调PH值至7.5)和0.6ml的5％(w/v)肌氨酰(sarkosyl)。管子轻轻地混合，样品65℃孵育20分钟。加入等体积的三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)溶液并将管轻摇混合。管子2500xg离心15分钟，把上清液转移至清洁地管子。样品中倒入等体积的冰冷的异丙醇，样品反转几次直至沉淀形成。用玻璃移液管把沉淀自溶液中移出，残余的乙醇通过使沉淀空气干燥2-5分钟而除去。然后将沉淀重悬于400μlTE缓冲液中(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)。 
根据制造商的说明书，如上所述制备的拟南芥基因组DNA用于建造Genome Walker文库(Clontech)。根据制造商的说明书，从此基因文库中分离出p26启动子序列(SEQ ID NO：2)。引物基于P1克隆MQL5(SEQ ID NO：5)序列而设计。用作PCR反应的引物如下： 
克隆26 GSP1 
5′-ATCGGCAACTCCATTTCCAATTTCTC-3′(SEQ ID NO：7) 
和克隆26 GSP2 
5′-TAGCATCCCTAGCATTAGAACATTGAG-3′(SEQ ID NO：8). 
在以Genome Walker libraries为模板和引物GSP1和AP1(制造商供应)进行最初的PCR后，第二次扩增用第一循环扩增产物为模板和引物GSP2和AP2(制造商供应)来进行。 
PCR反应产物依本领域熟知的标准方法提纯并按制造商的说明书克隆入pCR2.1 Topo(Invitrogen)。所得质粒命名为pMON69803，其含有启动子p26(SEQ ID NO：2)的序列。用PE Applied Biosystems所述的标准测序方法测定了本克隆的序列，(Foster City，CA)。 
pBAN
针对GenBank的拟南芥数据库，对BANYULS基因的编码区(GenBank AF092912，Devic等，THe Plant Journal，19(4)：387-398，1999)进行BLAST检索，从中鉴别出pBAN的启动子序列，NIH基因序列数据库包含一大批带注释的公共可利用的DNA序列 (Nucleic Acids Research，30(1)：17-20，2002)。检索鉴别的BAC克隆T13M11(GenBank AC005882，[SEQ ID NO：6])包含反义定向的BANYULS编码区。下列的引物是设计用于扩增与T12M11碱基对44629-45570相应的序列，此碱基对来自如上所述制备的拟南芥基因组。 
BAN+1500 
5′-GTTTGATAACTCGTCTCTTG-3′(SEQ ID NO：9) 
和BAN GSP1 
5′-GGTGTGTGTAAGAGTCTGGTCC-3′(SEQ ID NO：10) 
PCR的反应条件遵循酶制造商(PE Applied Biosystems，FosterCity，CA)的推荐方案。使用各为30纳摩尔的引物Ban+1500和BanGSP1，各为10微摩尔的dATP、dCTP、dGTP和TTP，1X Opti-PrimeTM Buffer 3中的2.5单位的AmpliTaq Gold自拟南芥基因组DNA分离Banyuls启动子(Stratagene，La Jolla，CA)。开始95℃孵育10分钟后，进行30循环的PCR，92℃持续30秒，56℃持续30秒和72℃持续2分钟，然后进行一循环的72℃持续7分钟。 
PCR反应产物依本领域熟知的标准方法提纯并按制造商的说明书克隆入pCR2.1 Topo(Invitrogen)。所得质粒命名为pBAN1。 
为把NcoI位点加到Banyuls基因的预测ATG起始密码子，要执行一附加的PCR反应。pBAN1作为模板DNA，引物如下： 
Ban-Nco 
5′-CCATGGTTGTACTTTTGAAATTACAGAG-3′(SEQ ID NO：11) 
和Ban+1500 
5′-GTTTGATAACTCGTCTCTTG-3′(SEQ ID NO：9) 
第二次PCR的反应条件遵循酶制造商的推荐方案(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)。大约10纳克的pBAN1的扩增使用30纳摩尔的引物Ban+1500和30纳摩尔的引物Ban-Nco，各为10微摩尔的dATP、dCTP、dGTP、TTP和1X Opti-PrimeTM Buffer 3中的2.5单位的AmpliTaq Gold(Stratagene)。开始孵育于95℃持续10分 钟后，进行30循环的PCR，92℃持续30秒，56℃持续30秒和72℃持续2分钟然后进行一循环的72℃持续7分钟。 
PCR反应产物依本领域熟知的标准方法提纯并按制造商的说明书克隆入pCR2.1 Topo(Invitrogen)。所得质粒命名为pMON69809，其含有启动子pBAN(SEQ ID NO：1)的序列。用PE AppliedBiosystems所述的标准测序方法测定了本克隆的序列。 
p63
一个cDNA克隆，指定为克隆63，应用cDNA-AFLP自拟南芥菜中鉴别出。根据制造商的说明书(Clontech)，拟南芥开花4、7、10、13天(DAP)后收获开放的花(花序)、茎、全籽苗和发育中的种子，分离出mRNA制备SMART cDNA文库。使用Gibco-BRL小型基因组APLP II试剂盒和下列制造商的说明书(Invitrogen)，将500微克扩增的SMART cDNA用于AFLP分析。所得谱带通过6％丙烯酰胺/8M尿素测序凝胶电泳后显色。从凝胶提取的一条单一的谱带，即称为谱带63，仅仅可见于4 DAF发育中的种子组织的cDNA泳道。把丙烯酰胺谱带放入50μl TE(10mM Tris-HCl(pH 8.0)；1mMEDTA)洗脱DNA，并使谱带在周围环境温度过夜洗脱。短暂的离心后，0.75μl的上清液作为模板源用于PCR扩增。20微升的扩增前引物混合物2(来自Gibco-BRL小基因组AFLP II试剂盒)，含有15mM MgCl2的2.5μl 10XPCR缓冲液(PE Applied Biosystems)，2.5单位AmpliTaq DNA聚合酶(PE Applied Biosystems)，和2μl水加入到DNA模板中。扩增条件如下：25循环的94℃持续30秒，56℃持续60秒，和72℃持续2分钟接着为一循环的72℃持续2分钟。根据制造商的说明书，所得DNA片段亚克隆入pCR2.1 Topo(Invitrogen)。根据制造商的说明书，使用SMART PCR cDNA合成试剂盒，将本cDNA克隆63与得自SMART cDNA文库的有效Northerns杂交(BD Biosciences，Clontech，Palo Alto，CA)。克隆63被描述为在种子发育的早期阶段表达。使用PE Applied Biosystems BigDye terminator v.3.0所述的标准测序方法测定了克隆63的序列(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)。 
然后用克隆63的全部序列作为BLAST的查询序列检索公共的和私有的数据库。公共的数据库检索指出克隆63注释为推定蛋白质。克隆63的全部基因组序列包含在BAC克隆T25N20(Choi等，Weeds World，2：17-20，1995)中，T25N20又得自拟南芥生物资源中心(Columbus，OH)。 
将含有BAC克隆T25N20的大肠杆菌单一的菌落的过夜培养物在LB肉汤(10％细菌蛋白胨，5％酵母菌提取物，和含有卡那霉素(25mg/L)和氨苄青霉素(100mg/L)的10％NaCl)中培养，其含有12.5mg/升氯霉素，37℃下剧烈振摇直到晚期指数期或早期静止期阶段。然后将克隆63(p63)从BAC克隆T25N20分离出。细胞经由离心所得的沉淀收集，重悬于0.2ml缓冲液(50mM葡萄糖；10mM EDTA；25mM Tris pH 8.0；5mg/ml溶菌酶)并在冰上孵育5分钟，然后加入0.4ml的0.2N NaOH；1％SDS溶液。管子轻轻混合并冰上孵育5分钟，再加入0.3ml的3M醋酸钾。管子轻轻混合然后在-80℃冰冻15分钟。碎片20,000xg离心15分钟沉淀下来，把0.75ml所得上清液转移到新管子。加入异丙醇(0.45ml)，80℃孵育混合物15分钟。DNA经20,000xg离心5分钟沉淀下来。沉淀用1毫升冷的70％乙醇清洗，然后台上干燥至少15分钟，然后重悬于40μl TE缓冲液中。 
下列引物用于自BAC T25N20 PCR扩增p63： 
p63-Nco 
5′-CCATGGTTATTCAAGTGACCACAG-3′(SEQ ID NO：12) 
知p63-fwd3 
5′-CGTGTTGAGGTGAGAGG-3′(SEQ ID NO：13) 
PCR的反应条件遵循酶制造商推荐的方案(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)。p63序列扩增使用1.5μl的T25N20为模板，30纳摩尔的引物p63-Nco和30纳摩尔的引物p63-fwd3，10 微摩尔的dATP，各10微摩尔的dCTP、dGTP和TTP，1X Opti-PrimeTM 缓冲液3(Stratagene)中的2.5单位的AmpliTaq Gold(PE AppliedBiosystems)。初步的95℃孵育10分钟后，进行28循环的PCR，94℃持续15秒，62℃持续10秒，52℃持续10秒，和72℃持续3分钟紧接着一循环的72℃持续7分钟。 
PCR反应产物依本领域熟知的标准方法提纯并按制造商的说明书克隆入pCR2.1 Topo(Invitrogen)。所得的质粒命名为pMON69811，其含有启动子p63(SEQ ID NO：3)的序列。使用PEApplied Biosystems所述的标准测序方法测定了本克隆的序列。 
实施例2 
本实施例描述了用作拟南芥转化的载体的构建。 
PMON69802
一个包含E.coli uidA gene(GUS)的1861个碱基对(bp)的片段经过消化EcoRI自供体质粒pCGN10906而移出。根据制造商的说明书，本片段使用QiaGel提纯试剂盒从琼脂凝胶中分离(Qiagen)。用30μl的缓冲液EB(10mM Tris-Cl pH 8.5)从柱上洗脱提纯的DNA。新型限制性内切核酸酶位点用以下引物加到E.coli uidA基因： 
Gus 5′ 
5′-AGGCGGCGCCTAAACCATGGTCCGTCCTGTAGAAACCCC-3 ′ 
(SEQ ID NO：14) 
和Gus 3′ 
5′-AGTCGACTCATTGTTTGCCTCCCTGCTGCGGTTTTTCAC-3′ 
(SEQ ID NO：15). 
纯化的片段(0.5μl)作为模板进行下列PCR扩增。各30纳摩尔的引物Gus 5′(SEQ ID NO：14)和GUS 3′(SEQ ID NO：15)，各10微摩尔的dATP、dCTP、dGTP和TTP，1X Opti-PrimeTM Buffer 3(Stratagene)中的2.5单位的AmpliTaq Gold(PE Applied Biosystems)加入DNA模板。扩增条件如下：25循环的94℃持续30秒，56℃持续60秒，和72℃持续2分钟紧接着一个循环的72℃持续2分钟。PCR反应产物依本领域熟知的标准方法提纯并按制造商的说明书克隆入 pCR2.1 Topo(Invitrogen)。所得质粒命名为pMON65400。用PEApplied Biosystems所述的标准测序方法测定了本克隆的序列。 
一个包含油菜籽蛋白3′UTR的1278个碱基对(bp)的片段通过用SalI和Asp718I消化，从载体pCGN 7770移出。包含E.coli uidA基因的1861个碱基对(bp)的片段先后经过BstXI和SalI的消化从载体pMON65400移出。根据制造商的说明书，在Sal1消化和凝胶纯化之前，使用Pfu聚合酶(Stratagene)使BstXI突出端成为平端。两个片段都连接到经Asp718I和SwaI消化的载体中。所得包含E.coli uidA基因和油菜籽蛋白3′UTR的质粒，命名为pMON69802(图1)。使用已知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。 
PMON69804(p26::GUS)
一个包含p26序列的1007个碱基对(bp)的片段经过HindIII和NcoI消化，从pMON69803移出。本片段连接到经HindIII and NcoI消化的pMON69802中。所得包含p26启动子操纵the E.coli uidA基因并有油菜籽蛋白3′UTR的质粒，命名为pMON69804(图2)。使用已知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。本载体可用于随后的拟南芥的转化。 
PMON69815(PBAN::GUS)
一个包含pBAN启动子序列的947bp的BstXI-NcoI片段先后经过BstXI和NcoI的消化，从pMON69809移出。根据制造商的说明书，在NcoI消化和凝胶纯化之前，使用Pfu聚合酶(Stratagene)使BstXI突出端成为平端。本片段连接到先后经HindIII和NcoI消化的pMON69802。根据制造商的说明书，在Ncol消化和凝胶纯化之前，使用Pfu聚合酶(Stratagene)使来自pMON69802的HindIII突出部份成为平端。所得质粒包含pBAN启动子操纵E.coli uidA基因并有油菜籽蛋白3′UTR，被命名为pMON69815(图3)。使用已知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。本载体可用于随后的拟南芥的转化。 
DMON69812(p63::GUS)
一个包含p63序列的2031个碱基对(bp)的片段先后经过BstXI和NcoI的消化，从pMON69811切掉。根据制造商的说明书，在NcoI消化和凝胶纯化之前，使用Pfu聚合酶(Stratagene)使BstXI突出部份成为平端。本片段连接到经HindIII消化并用Pfu聚合酶使突出部份成为平端的pMON69802中。所得质粒包含p63启动子操纵E.coliuidA基因并有油菜籽蛋白3′UTR，其命名为pMON6981(图4)。使用已知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。本载体可用于随后的拟南芥的转化。 
实施例3 
本实施例描述了表达感兴趣的异源基因的转基因拟南芥的转化和随后的再生。 
把拟南芥种子播种在含有反渗透水(ROW)饱和的MetroMix200(The Scotts Company，Columbus，OH)的4英寸盆中培养植物。把盆放进一个有盖的平板以人工方法促进植物发育，放进4-7℃的生长室中，8小时光照/天，持续4-7天。然后此平板转移到温度22℃，55％相对湿度的生长室，16小时光照/天，强度平均为160-200μEinstein/s/m2。发芽后抬高盖子并向后滑动1英寸，然后当形成真叶后去除盖子。按需要，在植物底部洒ROW直到发芽后的2-3周。然后按需要，在植物底部洒50ppm N2的Plantex 15-15-18溶液(Plantex Corporation Ottawa，Canada)。(在盆中)间苗以达到发芽后2-3周每盆中有1株植物。一旦植物开始抽苔，修剪初期的花序以助长腋生花苔的生长。 
按Bent等，Science，265：1856-1860，1994或Bechtold等，C.R.Acad.Sci，Life Sciences，316：1194-1199，1993.的描述，获得转基因的拟南芥菜植株。含有转化载体pMON69804、pMON69812或pMOT69815之一的根瘤土壤杆菌菌株ABI的培养物，在LB(10％细菌用胰酶解胨，5％酵母提取物，和10％NaCl与卡那霉素(75mg/L)，氯霉素(25mg/L)，和壮观霉素(100mg/L))中生长过夜。将细菌培养物离心，重悬于5％蔗糖+.05％Silwet-77溶液。将全拟南芥菜植株(约 5-7周龄)的空气中部分浸入所得溶液2-3秒。用纸巾吸去植物上多余的溶液。浸过的植物侧放进有盖的平板，转移到19℃的生长室。16-24小时后去掉盖子，放直植物。当植物成熟时，收获种子前停水2-7天。收获的种子通过不绣钢的网筛(40孔/英寸)以去除碎屑。收获的种子室温贮藏于纸币信封中供分析使用。 
如上所述收获的种子播种在含有ROW饱和的MetroMix200(The Scotts Company)的平板上。如上所述植物以人工方法促进发育和发芽。真叶出现后，籽苗的空中部分喷淋含有Finale除莠剂的1∶200稀释的溶液(The Scotts Company)。第一次应用大约1周后，植物喷淋第二次。将16株之多的Finale抗性的籽苗移植到2又1/4英寸盆中，每盆一株籽苗，盆中含有MetroMix 200，在前述的条件下生长，直到初期形成的长角果开始变干。从每个T1植物去除组织(莲座叶、茎生叶、茎、花、花蕾和发育中的长角果)供随后的组织化学染色。 
实施例4 
在用pMON69815、pMON69812或pMON69804转化的拟南芥菜植物中使用组织化学染色的方法分析β-葡萄糖醛酸酶的表达。如实施例3所述制备的组织，在37℃溶液中孵育约24小时，此溶液包含50mM NaPO4(pH 7.2)；100μM高铁氰化钾；100μM亚铁氰化钾，0.03％Triton X-100；20％甲醇和2.5mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖醛酸(X-gluc)。在一些情况下，高铁氰化钾、亚铁氰化钾和甲醇可在染色液中省略。染色的组织通过在37℃的70％乙醇/30％H2O中孵育过夜清除叶绿素。染色的组织立刻照相或转移至70％乙醇/30％甘油(v/v)的溶液并4℃保存直至照相。结果如下列表1所示，显示出11个T1植物的4个检到pMON69804，(p26::GUS)，显示GUS在种子中表达。对于pMON69812，(p63::GUS)，15个株系中检到13个在种子中有表达，对于pMON69815，(pBAN::GUS)，12个株系中的12个在种子中有表达。 
表1 
构建体     启动子    待检株系# 种子表达株系数
pMON69804     p26    11 4
pMON69815     pBan    12 12
pMON69812     p63    15 13
为了调查哪个发展阶段中启动子有活性，将T1代(同上述)中GUS表达阳性的独立的系取得的种子播种在含有ROW饱和的MetroMix 200的盆上。植物在生长室内以人工方法促进发育，4-7℃和8小时光照/天，4-7天。然后转移植物到22℃，55％相对湿度的生长室，16小时光照/天，平均强度为160-200μEinstein/s/m2。按需要，植物的底部洒ROW直至良好的建植，通常发芽后2-3周。按需要，植物的底部洒50ppm N2的Plantex 15-15-18。发芽后2-3周，(在盆中)间苗以使每2又1/4英寸盆保留1株植物。如上所述，每一时间点每系至少10株植物被染色。记录下GUS表达模型的肉眼观察结果。将定性的表达与包含pNapin::GUS构建体(标注为10908)的阳性对照植物和作为阴性对照植物的无效分离体相比。结果如表2所示。 
油菜籽蛋白启动子驱动的表达在开花(daf)后7-18天检测到。p26启动子、pBAN启动子和p63启动子驱动的表达分别在5-10、1-14和4-14daf检测到。因此，所有的这三个启动子的表达早于油菜籽蛋白启动子的表达被检测到。 
表2 
Figure G04814287819960328D000321
Figure 394844DEST_PATH_G04814287820060405D000051
ND：未检测到 
实施例5 
本实施例描述了带有本发明的启动子驱动的报告基因的大豆植物的载体构建和转化。 
载体构建
pMON82350(p63::GUS) 
一个含p63(SEQ ID NO：3)，大肠杆菌uidA基因和油菜籽蛋白3UTR的3859-碱基对片段经NotI和Sse8387I消化，从载体pMON65415移出。将此用NotI和Sse8387I消化的片段连接到下列两片段间，即豌豆rbsc E9基因的3′UTR和载体pMON65448内章鱼碱T-DNA的左缘序列间。载体pMON65448含有胭脂碱T-DNA右缘序列和章鱼碱T-DNA左缘序列，二者间是启动子，5′UTR和驱动包含CTP的CP4 EPSP合酶基因表达的拟南芥act7基因的第一内含子，此内含子与合成的EPSP合酶编码区和豌豆rbsc E9基因的3′UTR相连。所得质粒命名为pMON82350(图5)。使用标准的测序方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。 
如Martinell等，美国专利6,384,301所述，pMON82350经由土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化转化入大豆。转化的植物组织按实施例4的描述收集和染色。Gus的表达在种子中检测。 
实施例6 
本实施例描述了带有感兴趣的异源基因的油菜植物的转化和再生。 
载体构建
a.pMON65422 
为分析油菜中p63的表达，构建了二元载体。一个包含p63启动子(p63tr)(SEQ ID NO：4)703碱基对，E.coli uidA基因和油菜籽蛋白3′非翻译区(UTR)的3796碱基对片段经HindIII和Asp718I消化，从pMON69812移出。在凝胶纯化前，使用Pfu聚合酶(Stratagene)把HindIII和Asp718I突出部份补成平端。本片段连接到Pmel消化的pMON70650骨架上。载体pMON70650含有胭脂碱的T-DNA右缘序列和章鱼碱T-DNA左缘序列，此载体带有在两个T-DNA缘之间的玄参镶嵌型病毒(FMV)的35S启动子，驱动包含拟南芥EPSP合酶基因(GenBank identifier number gi：16272)叶绿粒靶序列的嵌合EPSP合酶基因的表达，拟南芥EPSP合酶基因又连接到合成的EPSP编码区(美国专利5,633,435)和来自豌豆rbcS E9基因的3′非翻译区。另外，pMON70650含有cre重组酶识别位点。此重组酶位点是FMV启动子的5′端和E93′的3′端。所得质粒称为pMON65422。DNA序列分析证实克隆连接的完整性。 
b.pMON65428 
为分析油菜中p26的表达，从载体pCGN11123中制备一种二元载体。载体pCGN11123含有胭脂碱T-DNA右缘序列和章鱼碱T-DNA左缘序列，在这两个T-DNA边缘带有FMV-35S启动子，驱动嵌合EPSP合酶基因的表达，该基因包含与合成的EPSP合酶编码区(美国专利5,633,435)连接的拟南芥EPSP合酶基因(gi：16272)的叶绿体靶序列，来自豌豆rbcS E9基因的3′UTR，cre重组酶的识别位点。 
使用下列的引物，从pMON70650扩增745碱基对片段的DNA： 
CP4-Dra 
5′-ACTTCACTTGAGCGGAAGCCATAG-3′(SEQ ID NO：16) 
和CP4-Kpn 
5′-TTTAAAACAATGGCGCAAGTTAGCAG-3′(SEQ ID NO：17). 
CP4-Dra引物引起EPSP合酶的5′UTR中单核苷酸取代，消除了NcoI限制性位点。去除NcoI位点以方便以后的克隆。PCR反应产物根据本领域熟知的标准技术提纯，并根据制造商的说明书 (Invitrogen)克隆进入pCR2.1 Topo。所得的质粒命名为pDMRUEZ033297。用PE Applied Biosystems所述的标准测序方法测定了本克隆的序列。 
一个包含EPSP合酶基因的改变的部分的737碱基对片段经KpnI和DraI消化，从pDMRUEZ033297移出，并且通过置换同样大小片段连接到载体pCGN11123上。所得的质粒命名为pDMRUEZ033298。一个包含E.coli uidA基因和油菜籽蛋白3′UTR的3149碱基对片段经NotI和Asp718I消化自pMON69802移出。在凝胶纯化之前，根据制造商的说明书(Stratagene)，使用Pfu聚合酶使NotI和Asp718I突出部份成为平端。将此片段连接到NotI消化的pDMRUEZ033298载体骨架上。根据制造商的说明书，连接前，使用Pfu聚合酶(Stratagene)使NotI突出部份成为平端。所得的质粒含有胭脂碱T-DNA右缘序列，E.coli uidA基因，和油菜籽蛋白3′UTR，其后是带有FMV-35S启动子的表达盒的，在两个T-DNA边缘之间，驱动嵌合EPSP合酶基因的表达，该基因含有与合成的EPSP编码区(美国专利5,633,435)连接的来自拟南芥EPSP合酶基因(GenBank identifier number gi：16272)的叶绿粒靶序列，来自豌豆rbcSE9基因的3′UTR和cre重组酶识别位点，其后是章鱼碱T-DNA左缘序列。所得的质粒称为pMON65424。DNA序列分析证实克隆连接的完整性。 
一个含有p26启动子序列的820碱基对片段经SmaI和NcoI消化自pMON69804移出(图2，[SEQ ID NO：2])。本片段连接到Pmel-NcoI消化的pMON65424载体骨架上。所得的质粒命名为pMON65428(图7)。用已知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。 
油菜转化 
载体pMON65428和pMON65422引入根瘤土壤杆菌菌株ABI以转化入欧洲油菜中。使用Moloney和Radke在美国专利5,720,871中描述的方案转化油菜植物。扼要地说，将欧洲油菜cv Ebony的种 子植入含有Metro Mix 350(The Scotts Company，Columbus，OH)的2英寸盆中。植物生长在生长室内，24℃，16/8小时光照时间，光强度400μEm-2sec-1(HID lamps)。2-1/2周后，将植物移植入6英寸盆中并生长在生长室内，15/10℃白天/夜晚温度，16/8小时光照时间，光强度800μEm-2sec-1(HID lamps)。 
移去植物抽苔前或抽苔中开花前的四个末端节间，并在70％v/v乙醇中1分钟，2％w/v次氯酸钠20分钟消毒表面，用无菌的去离子水漂洗3次。6-7段茎片段切割成5mm圆盘，保持基底端方向。 
用于转化油菜的土壤根瘤菌培养物在旋转摇床上过夜生长，培养条件：24℃，2ml的Luria肉汤，LB，(10％细菌用胰蛋白胨、5％酵母提取物和10％NaCl)，含有50mg/l卡那霉素、24mg/l氯霉素和100mg/l壮观霉素。在MS培养基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.，15：473-497，1962)中1∶10稀释，得到每毫升大约9×108细胞。用1.0ml的土壤根瘤菌接种茎盘(外植体)，多余的从外植体吸出。 
外植体基底朝下放进培养皿，包含的培养基构成为：1/10MS盐，B5维生素(1％肌醇；0.1％盐酸硫胺素；0.01％烟酸；0.01％盐酸吡哆醇)，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH 5.7，1.0mg/l 6-苄腺嘌呤(BA)。盘子装有1.5ml的培养基，其中含有MS盐，B5维生素，3％蔗糖，pH 5.7，4.0mg/l对氯苯氧基乙酸，0.005mg/l激动素并用无菌滤纸覆盖。 
共同培养2-3天后，外植体转移到深皿培养皿中选择，盘中含有MS盐，B5维生素，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH 5.7，1mg/lBA，500mg/l羧苄青霉素，50mg/l头孢噻肟，200mg/l卡那霉素，或175mg/l庆大霉素。每盘上放入7个外植体。3周后转移至新鲜的培养基，每盘5个外植体。外植体培养在25℃、连续的光照的生长室内(CoolWhite)。 
转化的植物生长在22℃、16-8小时光亮-黑暗周期，光强度220μEm-2s-1的生长室几周，然后转移至温室。标准条件下在温室中保养植物。在授粉后各阶段收获发育中的种子并-70℃贮藏。收集成熟的种子并在受控制的约17℃和30％湿度环境条件下贮藏。 
授粉后在几个时间点从个体R0植物收获多达5个长角果。长角果用18号针刻划，以使染色液接触到发育中的种子。长角果于37℃孵育在溶液里大约24小时，溶液含有50mM NaPO4(pH 7.2)；100μM高铁氰化钾；100μM亚铁氰化钾，0.03％Triton X-100；20％甲醇和2.5mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖醛酸(X-gluc)。染色的组织孵育在70％乙醇/30％H2O，37℃溶液中过夜以清除叶绿素。染色的组织立即照相或转移到70％乙醇/30％甘油(v/v)溶液中，4℃贮藏直到照相。样品以蓝色评价为阳性(+)或阴性(-)。 
用pMON65428转化的10系中的6系至少在一个时间点可检测到种子内的活性水平。用pMON65422转化的10系中的10系至少在一个时间点可检测到种子内的活性水平。非转基因对照植物收获的种子未观察到染色。数据在下列表格阐明。 
发育中油菜种子内p26表达 
Figure G04814287819960328D000371
发育中油菜种子p63表达 
Figure G04814287819960328D000372
已经举例说明并描述了本发明原理，对本领域技术人员显而易见的是，在没有背离这种原理条件下可以对本发明的排列和细节加以修改。我们要求保护所有的在本附加权利要求的精神和范围内的修改。在本说明书中引用的所有出版物和公开的专利文件通过引用结合到本文中，其程度与每个出版物或专利申请具体并单独指明通过引用而结合相同。 
序列表
<110>D.M.鲁辛斯基(Ruezinsky，Diane)
<120>用于早期种子发育的新型植物启动子
<130>REN-00-118
<150>US 60/458,828
<151>2003-03-28
<160>17
<170>PatentIn version  3.1
<210>1
<211>913
<212>DNA
<213>拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)
<400>1
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<210>4
<211>705
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<400>4
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<210>6
<211>87394
<212>DNA
<213>拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)
<400>6
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cacatctcgt ctggccttat catcatcgta atctattgaa gatatatata tggtaagaca    80100
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aaagttatag gattacattt ttggtaaaaa attgttgagt cgtatttttg gtagaaaaca    80460
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tattatttaa ttttacatct tattttattt tacgtattta attatactat tactatattt    80700
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gaaaatactt gacaagaaca atgcagatag agctgtggac caatataatc gatttttggt    82440
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tttttaaaat attgtaatct cataaagtta atgaaaatac ataattgtat caactaatca    82980
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<400>17
tttaaaacaa tggcgcaagt tagcag                       26

Claims (12)

1.一种包含SEQ ID NO：4的启动子。
2.一种包含权利要求1的启动子的构建体，其中所述启动子操作性连接到转录性多核苷酸分子上，该分子又操作性连接到3′转录终止多核苷酸分子上。
3.权利要求2的构建体，其中所述转录性多核苷酸分子是有农学意义的基因。
4.权利要求2的构建体，其中所述转录性多核苷酸分子是标记基因。
5.一种用包含权利要求1启动子的构建体稳定转化的产种子的转基因双子叶植物细胞，其中所述启动子操作性连接到转录性多核苷酸分子上，该分子又操作性连接到3′转录终止多核苷酸分子上。
6.权利要求5的转基因双子叶植物细胞，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞而且来自烟草、番茄、马铃薯、花生、大豆、棉花、双低油菜、油菜、红花、亚麻、甜菜、拟南芥、芸苔属(Biassica)、向日葵和苜蓿。
7.权利要求5的转基因双子叶植物细胞，其中所述转录性多核苷酸分子改变所述转基因植物种子细胞中的油含量。
8.权利要求5的转基因双子叶植物，其中所述转录性多核苷酸分子改变所述转基因植物种子细胞中的蛋白质含量。
9.权利要求5的转基因双子叶植物细胞，其中所述转录性多核苷酸分子改变所述转基因植物种子细胞中的微量营养素含量。
10.权利要求5的所述转基因植物的种子细胞。
11.产自权利要求5的所述转基因植物细胞的粗粉。
12.一种制造植物油和粗粉的方法，包括以下步骤：
a)将权利要求1的启动子加入到含有油类的产种子的双子叶植物的基因组中，所述启动子操作性连接到转录性多核苷酸分子上，从而改变油类含量；
b)培育所述双子叶植物来生产种子；并
c)从种子中提取油类来制造提取油和粗粉。
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