CN1186519A

CN1186519A - 利用酵姆slc基因修饰植物脂类和种子油类

Info

Publication number: CN1186519A
Application number: CN96194366A
Authority: CN
Inventors: 邹吉涛; 戴维·C·泰勒; 维斯纳·卡塔维克; 塞缪尔·L·麦克肯尼; 威尔弗雷德·A·凯勒
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1995-05-31
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 1998-07-01

Abstract

本发明涉及通过基因工程技术修饰植物脂类和种子油类以便产生商业价值提高的油料种子。在一个方面,本发明涉及转基因油料种子植物,或具有掺入了可表达的酵母SLC1—1或SL C1基因的基因组的这样一种植物的种子。本发明还提供了生产转基因油料种子植物的方法,该方法包括在植物的基因组中导入可表达的酵母SL C1—1或SL C1基因。本发明还涉及用于本发明的方法的各种质粒和载体。

Description

利用酵母SLC基因修饰植物脂类和种子油类

技术领域

本发明涉及利用基因工程技术修饰植物脂类和种子油类。更具体地说，本发明涉及遗传修饰油料种子植物以便生产商业价值提高的油料种子或完整植物。本发明还涉及被修饰的植物和种子，和用于生产这样的植物和进一步修饰植物的遗传材料和载体。

背景技术

当今存在的一个相当大的需求是用分子遗传手段修饰油类种子的种子油脂肪酸组成和含量，以便提供用作工业原料的超高芥子酸油菜子(SHEAR)油的可靠来源。在传统油类种子作物(如，油菜子、亚麻、向日葵、大豆)中生产其它计划上不食用的油类(如，羟基、环氧基短和中等链脂肪酸等等高的种子油类)也存在着同样的需求。

对于食用油类，存在的相当大的需求是在油类种子作物如Canola和食用油类亚麻(Linola)、大豆和向日葵中改变脂肪酸组成(如，高级的油/低级的聚不饱和酯、低级的饱和酯、，高级的饱和酯)以及提高油含量。

目前，还没有资料证明转基因途径能增加油含量(产量)，虽然传统的育种和连续筛选会增加产量，带来产量提高。

相反，通过在油类种子中导入各种作物脂肪酸生物合成和酰基转移酶基因已经获得一些计划的脂肪酸的比例的增加。下面是这样的方法的一些例子：

1.在芸苔科植物中表达来自加利福尼亚湾的中等链脂肪酰基-ACP硫酯酶以便提高月桂酸(12∶1)含量(Calgene；Voelker etal.，1995；1996-参见“有关本发明的参考文献”所附的参考文献35和36)。

2.在低芥子酸的Brassica napus(Canola)品种中表达Jojoba β-酮酰基-CoA合成酶以便提高芥子酸的水平；高芥子酸品种表达后带来的影响是不可忽视的(Calgene；Lassner etal.，1996-参见参考文献20)。

3.在芸苔科植物中表达硬脂酰-ACPΔ9去饱和酶的反义结构以便提高硬脂酸含量(Calgene；Knutzon et al.，1992-参见参考文献16)。

4.利用编码植物微粒体FAD2(Δ12)去饱和酶通的有义结构，过协同阻遏提高B.napus中油酸的比例(du Pont/Inter MountainCanola；Hitz et al.，1995-参见参考文献12)。

5.通过在油菜子中分别表达椰子或草地塑料溶血-磷脂酸酰基转移酶(LPATs；E.C.2.3.1.51)，在三酰基甘油(TAGs)的sn-2位提高12∶0或22∶1的比例(Calgene；Knutzon et al.，1995a和b；-参见参考文献17和18；Lassner et al.，1995-参见参考文献21)。

虽然植物转基因的利用导致分别在月桂酸Canola和高芥子酸油菜子中改变sn-2月桂酸和芥子酸的比例，但种子油的月桂酸和芥子酸的总比例并不增加，也没有证据表明这些转基因植物中，脂肪酸含量或油产量增加。

因此需要新方法，通过利用基因工程技术增加油类种子植物中的油产量和改进它们的油组成。

发明内容

本发明的一个目的是遗传修饰油类种子植物以便提高这样的植物、这样的植物的种子、和这样的植物产生的油的商业价值。

本发明的另一个目的是提供改变来源于油类种子植物的油的产量和组成的方法。

本发明是基于发现来自酵母(啤酒酵母)的sn-2酰基甘油脂肪酰基转移酶基因(SLC1-1和它的等位基因，SLC1)可以用来改变植物种子和叶子脂类的油含量和油组成。

所以，根据本发明的一个方面，提供了其基因组中掺入了可表达的酵母SLC1-1或SLC1基因的转基因油类种子植物。

根据本发明的另一个方面，提供了其基因组中掺入了可表达的酵母SLC1-1或SLC1基因的转基因油类种子植物的种子。

根据本发明的另一个方面，提供了生产转基因油类种子植物的方法，该方法包括在所说植物的基因组中导入可表达的酵母SLC1-1或SLC1基因。

本发明还涉及用于本发明的方法的各种质粒和载体，和在经修饰含有SLC1-1和SLC1基因的植物中共同导入其它基因。

本发明的优点包括可以利用酵母SLC1-1和SLC1基因，在各种油类种子植物如Arabidopsis thaliana、在Brassicanapus的高芥子酸和canola品种和在Brassicacarinata中提高油含量和改变总脂肪酸组成，以及改变包括sn-2位点的TAG的酰基组成，和改变TAG种类的相对比例这样的事实。

另外，在高芥子酸的芸苔科植物中可以利用酵母sn-2酰基转移酶(SLC1-1和SLCl基因)增加油含量和生产极长链的脂肪酸(VLCFAs)和TAGs含量增加的种子油类，对于极长链的脂肪酸，其立体特异性组成改变了。所以，与前面利用植物转基因(如上面提到)的结果相反，本发明利用酵母转化基因完成了种子油含量、种子芥子酸含量和种子油类中芥子酸的总比例的联合增加。

在芸苔科的食用油品种(Canola-优质品种)也可以利用酵母sn-2酰基转移酶(SLC1-1和SLC1基因)，增加油含量和生产油酸、聚不饱和脂肪酸和极长链的饱和脂肪酸的比例改变了的种子油。

以同样的方法可以利用有关的酵母SLC1-1和SLC1等位基因。两个等位基因编码sn-2酰基转移酶；SLC1与SLC1-1的区别仅在于位置44的氨基酸(谷氨酸，Q)，而SLC1-1的位置44的氨基酸是亮氨酸(L)。

可以利用SLC1-1和SLC1转基因植物作为寄主种质，进一步负调节内源性的植物酰基转移酶。

为了完成TAG生物合成的直接组装以便产生立体特异性地设计的TAGs，需要协调地表达许多生化反应，包括LPAT介导的。使外源LPAT的转基因表达最佳以便合成具有新酰基组成的TAG(如，在sn-2位置增加极长链脂肪酸)的明显的可能性之一是可能需要同时负调节已经存在于转基因寄主中的内源性的LPAT(如，通常优先在sn-2位置插入聚不饱和C₁₈脂肪酰基基团的LPAT)。酵母sn-2酰基转移酶和已公开的植物sn-2酰基转移酶(LPATs)之间的总的同源性是低的，并大部分局限于蛋白质的C-末端。相反，植物酰基转移酶互相之间的总同源性大得多，同源区扩展到整个序列。所以，利用酵母SLC基因获得本文叙述的效果，是以用植物酰基转移酶进行最初的转化时不可能的方式进一步改进这些特性的唯一机会。实际上，在植物和酵母的sn-2酰基转移酶之间的有限的同源性相当低，足以允许用没有对酵母转化基因的表达或植物种子发育形成负影响的常规方法负调节寄主植物LPAT(例如，反义RNA技术或共同阻遏现象；Mol et al.，1990；Van Bloklandet al.，1993；De Lange et al.，1995)。所以，酵母转基因计划的明显优于点是在存在高同源性的、原有LPAT的寄主植物中导入另一个植物转化基因的计划。

可以利用酵母sn-2酰基转移酶(SLC1-1和SLC1基因)在包括琉璃苣(Borago spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、可可豆(Theobromacacao)、玉米(Zeamays)、棉花(Gossypiumspp)、两芦荠、萼距花、亚麻(Linum spp.)、类斯克懒勒和池花、田芥属(Tropaeolum spp.)、月见草、橄榄(木樨榄属spp.)、棕榈(Elaeis spp.)、花生(Arachis spp)、红花(Carthamusspp.)、大豆(Glycine和Soja spp.)、向日葵(Helianthusspp.)、烟草(烟草属spp.)和斑鸠菊的所有其它油类种子中增加油含量和改变TAG的酰基组成。

酵母sn-2酰基转移酶(SLC1-1和SLC1基因)油类种子转化体可用所有其它加价的脂肪酸生物合成基因(如，来自蓖麻或类斯克懒勒属spp.的羟化酶基因)第二次转化，或与已经含有这样的加价基因的有关的油类种子转化体杂交，以便生产加价脂肪酸的量增加(如，对于那些含有羟基脂肪酸的增加羟基脂肪酸含量和改变TAG组成)的种子油。

可以利用SLC1-1基因和有关的SLC1等位基因修饰蔬菜组织中脂肪酸和脂类的分布，以便改进对生命的和无生命的植物应力的耐受性(如，增加根和叶组织中的膜的流动性以便改进对冰冻的耐受性)。

以前没有公开或证明：(缺乏实践)在植物中利用酵母SLC1-1基因和SLC1等位基因带来总脂类含量和组成改变，这可作为控制脂肪酸(如，极长链脂肪酸)的相对比例或量以及用于增加生产食用或工业油的作物的油含量的方法。

以前，还没有转基因途径引起油产量增加的证据。更具体地说，过去还没有证据表明植物中已经表达了酵母酰基转移酶(负责合成三酰基甘油的酶)能改变油组成或含量。

相反，在突变的Arabidopsis thaliana中，二酰基甘油酰基转移酶活性的下降导致油产量的下降和酰基组成的改变(Katavic etal.，(1995)植物生理，108：399-409-参见参考文献15)。

附图的简要说明

图1显示了用于本发明的酵母SLC1-1基因的编码区的核苷酸(SEQ ID NO：1)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，终止密码子被标定为“β”，在细菌和酵母sn-2酰基转移酶之间高度保守的同源序列的底下划线；

图2显示了用于本发明的酵母SLC1基因的编码区的核苷酸(SEQID NO：3)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，终止密码子被标定为“β”，底下划线部分为细菌和酵母sn-2细菌转移酶之间高度保守的同源序列；

图3显示了在后面提供的实验细节中解释的构建SLC1-1植物转化载体的计划，显著的特征没有按比例绘制；和

图4-7以及下面的表1-20，显示了后面提供的实验细节解释的实验结果。

实施本发明的最好方式

图1和2分别显示了SLC1-1基因(SEQ ID NO：1)和SLC1等位基因(SEQ ID NO：3)的序列和它们衍生的肽结构(SEQ IDNO：2和4)。

在两个出版物中已经如下鉴定了酵母SLC1基因(和相关的SLC1-1阻遏物等位基因)(它的公开内容引入本文作为参考)：

1.Lester，R.L.，Wells，G.B.，Oxford，G.和Dickson，R.C.(1993)缺失鞘脂类的啤酒酵母突变菌株合成模拟鞘脂类结构的新肌醇甘油酯。J.Biol.Chem.268：845-856-参考文献22；和

2.Nagiec，M.M.，Wells，G.B.，Lester，R.L.，和Dickson，R.C.(1993)能使啤酒酵母不制造鞘脂类也生长的阻遏基因编码类似于大肠杆菌脂肪酰基转移酶的蛋白质。J.Biol.Chem.268：22156-22163-参考文献25。

SLC1-1基因的编码区的DNA和氨基酸序列以登记号Ll3282保存于Gen Bank/EMBL(保存序列包括本申请未公开的5′非翻译区)。

SLC1基因是最初从缺失制造鞘脂类能力的酵母突变体中克降的。SLC1的突变等位基因显示出编码阻遏鞘脂类长链碱基生物合成的遗传缺陷的蛋白质。SLC1的基因序列与大肠杆菌PLSC基因同源，已经有人声明它编码溶血-磷脂酸酰基转移酶(LPAT；使溶血-磷脂酸(LPA)的sn-2位置酰基化得到磷脂酸(PA)的酰基转移酶)。SLC1基因能补偿JC201(PLSC突变的大肠杆菌菌株)的生长缺陷。根据在缺少长链碱基时生长的SLC菌株能制造新的磷脂酰肌醇衍生物的发现(Lesteret al.，(1993)J.Biol Chem.268：845-856.)，本作者的可能的结论是SLC1编码能够将含肌醇的甘油酯的sn-2位置酰基化的蛋白质(即，可能是溶血-磷脂酰肌醇酰基转移酶，LPIT)。根据这些发现，有人报道SLC1编码酵母sn-2酰基转移酶。但是，该论文的作者(Dickson，Lester et al.)未能在互补的大肠杆菌JC201突变体中检到LPAT的活性。

在Nagiec等人的论文中，作者也报道了命名为SLC1-1的阻遏等位基因的基因序列，其中核苷酸131是T而不是A，导致44位置的氨基酸从谷氨酸变为亮氨酸。该工作的假设是SLC1-1阻遏物等位基因编码改变了底物特异性的突变的酰基转移酶，这样的特性使该酶能利用极长链脂肪酸(26∶1)，将含肌醇的甘油酯的sn-2位置酰基化。作者至今还没有提供SLC1-1或SLC1编码的活性的最后证据。

根据本发明的发明人在改变芸苔科植物的极长链脂肪酸(VLCFA)含量上的需要，本发明人从肯德基大学(Lexington，肯德基，USA)的Dr.Dickson处得到含有SLC1-1阻遏物等位基因的质粒p411ΔB/C。本发明人还确信在植物中表达该外源基因带来更多的SLC1-1和SLC1编码的特征信息。本发明人进行的工作首次利用典型油类种子Arabidopsis thaliana鉴定了种子油含量增加、含极长链脂肪酸(VLCFAs＝＞C₁₈)的TAGs的比例增加的转化体。另外，存在在TAGs的sn-2位置的VLCFAs的比例增加，并伴随着在该位置酯化的聚不饱和脂肪酸的比例下降。B.napus品种Hero和B.carinata的SLC1-1转化体(两个高芥子酸品种)显示了每增加mg种子干重(DW)的油含量和芥子酸含量/增加。B.napus品种Westar(Canola优质品种)SLC1-1转化体显示油酸(18∶1)的比例增加并且聚不饱和脂肪酸(18∶2和18∶3)的比例下降。

利用常规基因工程技术可以将SLC1-1和SLC1基因导入油类种子植物的基因组并表达。例如，转化可以包括利用以土壤杆菌Ti质粒为中介的转化(如，植物内、真空渗透、子叶或下胚轴叶柄受伤感染、或粒子轰击，等等)。如本领域技术人员已知的，基本组成型的或组织特异性的启动子可以驱动该构建体。

可以预期本发明可在各种油类种子植物广泛应用，因为在所有这些植物中的同样的或密切相关的生化途径之后是油的合成(参见参考文献29、30、37、38、39和40)。

参考下面提供特别说明的实验细节，详细叙述本发明，但是，应该记住的是本发明不限于下面提供的详细叙述。

详细实验

构建用于SLC1-1转化的载体

根据附图的图3说明的克隆计划，将分别根据SLC1基因(SEQID NO：3)的5′和3′末端序列设计的带有5′BamHI限制位点的延伸区的OM087(AGAGAGAGGGATCCATGAGTGTGATAGGTAGG)(SEQ ID NO：5)和OM088(GAGGAAGAAGGATCCGGGTCTATATACTACTCT)(SEQ ID NO：6)作为引物，将含有SLC基因的阻遏物等位基因(SLC1-1)的质粒p411ΔB/C(从肯德基大学，Lexington，肯德基，USA的Dr.Dickson处得到)作为模板用于聚合酶链式反应(PCR)，以便产生两个末端都带有BamHI位点的SLC1-1PCR片段。所以，(SLC1-1)PCR片段代表了SLC1基因的阻遏物等位基因，该基因131位置上核苷酸T代替了核苷酸A，导致44残基的氨基酸从谷氨酸变成亮氨酸。用BamHI消化该片段并连接进位于载体pBI524(从NRC植物生物技术研究所(110体育馆场，Saskatoon，Saskatchewan，加拿大，S7N OW9)的Dr.Raju S.S.Datla处得到，由Datla et al.公开，1993-参见参考文献9)的串联35S启动子和NOS终止子之间的BamHI克隆位点，从而得到载体SLC1-1-pBI-524。BglII的限制消化证实了SLC1-1在载体SLC1-1-pBI-524中的方向，该酶从5′末端在nt377处切割SLC1-1并在紧接35S启动子的下游切割载体pBI524。SLC1-1的翻译起始密码子保留了，所以该构建体是转录融合体。将含有串联35S启动子、AMV增强子、SLC1-1编码序列和NOS终止子的HindIII和EcoRI片段从SLC1-1-pBI-524中游离出来，克隆进载体RD400(也是从Dr.R.Datla处得到；由Datla等公开，1992-参见参考文献8)的EcoRI-HindIII位点。通过电穿孔将最后的载体pSLC1-1/pRD400(于1996年5月9日根据布达佩斯条约以保藏号ATCC97545保藏于美国类型培养物保藏中心，12301 Parklawn大道， Rockville，MD.20852，美国)导入根癌上壤杆菌菌株GV3101(含有辅助质粒pMP90；Koncz和Schell，1986)。

分子生物学技术

除非另有说明，所有分子生物学技术通过一般按Ausubel等(1995)预先给定的方法进行。

植物生长条件

如Katavic等(1995)所述，在同一时间，在控制的生长室内，在连续的荧光照明度(150-200μEm^-2sec^-1)下，在22℃让所有A.thaliana对照和转基因植物生长。所有其它芸苔科(B.napus，B.carinata)对照和转基因植物在同一时间内，在用高压钠灯(HPS灯)提供的自然光光期为16小时(16小时光/8小时暗)的P.B.I.转基因植物中心温室中于22℃和25-30％的相对湿度下生长。

植物转化

用植物内转化技术在A.thaliana、两个高和低芥子酸B.napus品种和B.carinata(通过带有含SLC1-1构建体的根癌土壤杆菌的子叶叶柄和下胚轴外植体的共同培养转化)中测验了SLC1-1/RD400。

在A.thaliana中测验SLC1-1构建体

让Columbia生态型的野生型(WT)A.thaliana植物在上壤中生长。通过含有辅助蓝曙红质粒pMP90(具有以反式作用的完整的vir区域、庆大霉素和卡那霉素选择标记的去除保护的Ti质粒；Koncz和Schell(1986))和双元载体pSLC1-1/pRD400的根癌土壤杆菌菌株GV3101的细菌悬浮液伤口接种过夜(Katavicetal.1994)或真空侵染过夜(Bechtold et al.1993)进行植物内的转化。

在接种和浸染后，让植物生长产生种子(T₁)。大量收获干种子(T₁)并在含有50mg/l卡那霉素的选择培养基上筛选。在选择培养基上选择2-3星期后将幼苗转移到土壤中。从抗卡那霉素T₁植物上分离叶子DNA并用SLC1-1片段的PCR扩增分析。将来自T₁植物的正在发育的叶子以及来自SLC1-1转基因系的T₂成熟的种子用于脂类和生化分析。在分析种子脂类时，将来自未转化的野生型(WT)Columbia植物和pBI121转基因植物(双元载体pBI121，只含有卡那霉素选择标记和GUS报告基因；Jefferson et al.，1987)的正在发育的叶子和成熟的种子用作对照。根据这些分析，让展示改变了的酰基组成和/或脂类含量的品系的T₂种子生长在选择培养基上(为了消除纯合的WT分离体)并且然后转移到土壤中生产T₃种子群。

在Brassica napus和Brassica carinata中测试SLC1-1构建体：

用含有SLC1-1/RD400构建体的根癌土壤杆菌共同培养子叶叶柄和下胚轴外植体，对芸苔属napus品种Westar(Canola变种，低芥子酸)、芸苔属napus品种Hero、Reston和Argentine(都是高芥子酸变种)和芸苔属carinata(育种系C90-1163，一个高芥子酸系)进行转化实验。改变Moloney等人(1989)和DeBlock等人(1989)的转化方法使转化条件最佳。

子叶叶柄转化方法(Moloney等人1989)的修改包括在共同培养后在含有激素苯甲基腺嘌呤(BA)和抗生素替卡西林钠-克拉维酸钾的MS培养基上引入7天的外植体恢复期以去除土壤杆菌。

下胚轴外植体转化方法(DeBlock et al.；1989)的修改包括：(1)在含有激素2，4-二氯苯乙酸(2，4-D)和激动素(K)的用琼脂固化的MS培养基上预培养外植体；(2)在含有与预培养相同的培养基的培养皿中，在无菌滤纸上将下胚轴外植体与土壤杆菌共同培养；(3)共同培养后，在含有激素(2，4-D和K)、和替卡西林钠-克拉维酸钾的培养基上给予7天的外植体恢复期以去除土壤杆菌；(4)在含有激素苯甲基腺嘌呤(BA)和玉米素(Z)、乙烯抑制剂硝酸银(AgNO₃)和抗生素替卡西林钠-克拉维酸钾(为了去除土壤杆菌)和卡那霉素(为了转化细胞/幼芽的筛选)的MS培养基上再生转基因幼芽。

使绿色幼芽长根并转移到土壤中。从止在发育的叶子中分离基因组DNA并进行PCR分析和Southern分析(Southern，1975)。收获来自转基因植物的种子(T₁)并在土壤上生长来自每个转基因系的各10株T₁植株。收获来自这些植物的突变种子(T₂)并进行脂类和生化分析。

脂类分析和酰基转移酶(LPAT)测定

来自SLC1-1和WT/pBI121转基因的和未转化的WT植物的叶子和种子脂类的分析

如前所述(Tayloret al.，1992；Katavic et al.，1995)，从成熟的种子和正在发育的叶子中分离脂类并用GC分析总脂肪酸含量和脂肪酸组成。如Katavic et al.，1995所述用高温GC分析三酰基甘油的种类。如Taylor et al(1994，1995a和b)所述对完整种子脂类(主要是TAGs)进行TAG的立体特异性分析。

LPAT测定

对于叶子测定，从对照和SLC1-1转基因植物中选择中度伸展的叶子，并用软木钻具从几片叶子上取下叶子组织样品。对于正在发育的种子的测定，在A.thaliana中从对照(未转化的WT和pBI121转化)和选定的SLC1-1转基因植物上收获中度发育的种子的25-30个长角果得到正在发育的T₃种子样品。从对照和选定的SLC1-1转基因植物的3个长角果收获中等子叶发育时期的芸苔属napus和芸苔属carinata T₂胚。马上在液氮中冰冻所有植物材料并储存于-70℃直到匀浆化。如Taylor et al.，(1995b)所述制备植物叶子和正在发育的种子组织的匀浆和进行LPAT测定。

如Ausubel et al.(1995，13.1单元，酵母遗传学的基本技术)所述进行有关酵母菌株的所有测定。以28℃，在270r.p.m.，在YPD培养基中培养野生型啤酒酵母和粟酒裂殖糖酵母菌株，过夜。在对数生长中期，取细胞样，在5000r.p.m.离心沉淀5分钟，并重悬浮于100mM Hepes-NaOH(pH7.4)中。如Ausubel et al.(1995，单元13.1，13.13.4部分)所述用酸洗玻璃珠制备细胞溶菌物。

在pH7.4，以100r.p.m.摇动，在30℃水浴10-30分钟进行LPAT测定。测定混合物(最后体积为0.5ml)含有蛋白质(10-200μg取决于组织/提取物)90mM的Hepe-NaOH、0.5mMATP、0.5mM CoASH、2mM亚精铵、45μM 18∶1-LPA和作为酰基供体的18μM[1-¹⁴C]-18∶1-CoA、[1-¹⁴C]-20∶1-CoA，或[1-¹⁴C]-22∶1-CoA(每种的比活性为10nCi/nmol)。Taylor et al(1995b)详细叙述了测量LPAT活性的所有其它条件。

成熟种子的¹H-NMR

用Bruker AM宽径分光计，在360MHz对对照和SLC1-1转化芸苔属napus品种Hero以及芸苔属carinata的全部种子进行相关的油产量(Alexander et al.，1967；Rutar，1989)的¹H-NMR分析。为了减少重折光线的扩展，将种子(35/样品)在与磁场方向为54.7°的锆转子中以1kHz旋转(磁性角样品转子，MASS)。

结果

酵母(啤酒酵母；粟酒裂殖糖酵母)sn-2酰基转移酶(LPAT)的酰基-CoA特异性

利用18∶1的LPA作为酰基受体和各种放射性标记的酰基-CoA测定来自啤酒酵母和粟酒裂殖糖酵母的酵母细胞溶菌物的相对sn-2酰基活性。体外酵母LPAT的酰基-CoA特异性十分广泛，LPAT能将内源的(16∶0、18∶1)和非内源的(18∶2、18∶3、20∶1、22∶1和蓖麻油酰)酰基基团插入18∶1的LPA的sn-2位置，如下面的表1所示：

表1利用45μM的18∶1-L1PA作为酰基受体，测定啤酒酵母

和粟酒裂殖糖酵母酰基-CoA：LPAT查相对活性

供应的 LPAT活性相对于18∶1-CoA¹⁴C-酰基-CoA nmol/min/mg蛋白的LPAT活性(％)(18μM)啤酒酵母18∶1-CoA 3.75 10018∶2-CoA 3.54 94.518∶1-Δ12- 1.90 50.7OH-CoA20∶1-CoA 1.92 51.322∶1-CoA 0.33 8.9
	粟酒裂殖糖酵母18∶1-CoA 1.50 10018∶2-CoA 1.27 84.718∶1-Δ12- 0.85 56.7OH-CoA20∶1-CoA 0.38 25.322∶1-CoA 0.60 40.0

由于酵母LPAT(sn-2酰基转移酶)相对具有广泛的特异性，可以预测用酵母SLC1-1基因转化的富含极长链脂肪酸的油类种子(A.thaliana，B.napus)将导致包括sn-2位置的VLCFA含量富集。另外，可以预测酵母SLC1和SLC1-1转化体是用来自蓖麻(R.communis)和雷斯克懒勒的羟化酶基因转化以便生产富含羟基脂肪酸的种子油的良好寄主。另一种可选的方法，羟化酶转化体可以与SLC1-1或SLC1转化体有性杂交。

A.thaliana SLC1-1转化体种子脂类分析：

来自A.thaliana转化体的数据表明，该基因对种子总脂类含量和TAG的sn-2组成有显著影响。许多SLC1-1T₂转基因系(48个中有21个)明显显示比未转化的对照和pBI121(没有SLC1-1插入)对照油产量增加显著，如下面表2所示：

表2未转化的野生型(u-WT)A.thaliana、pBI121(-SLC1-1)A.thaliana转化体(对照)和选定的用酵母SLC1-1基因转化的

A.thaliana的T₂转基因系的种子脂肪酸含量品系 16∶0 18∶0 18∶1 18∶1cl 18∶2 18∶3 20∶0 20∶1 20∶2 22∶0 22∶1 24∶0 + Total

c9 1 24∶1u-WT 28.2 12.2 50.5 5.7 101.1 71.9 7.7 74.8 8.7 1.9 8.3 1.3 372.5对照pBI121 28.4 12.4 54.2 4.1 99.9 66.2 6.7 74.0 7.1 tr* 7.2 tr^* 360.2对照3 28.8 12.3 57.4 5.7 114.1 78.8 7.7 82.5 9.6 5.7 8.6 1.7 412.37 37.1 18.4 102.9 5.9 111.6 84.4 7.6 71.8 8.0 2.9 7.7 2.7 461.016 33.0 12.5 62.0 6.2 131.7 95.0 9.0 96.4 12.6 1.7 11.0 2.0 473.020 36.3 16.1 87.7 7.6 153.3 95.9 10.7 118.8 11.6 2.5 12.4 3.3 556.421 32.1 14.6 62.5 6.2 121.3 89.1 9.4 89.3 9.9 2.2 9.7 2.4 449.522 31.9 13.0 57.3 5.9 113.9 86.7 8.6 85.8 10.2 1.7 9.6 2.0 426.523 35.4 15.7 72.5 7.5 139.7 95.6 10.5 106.9 12.5 2.3 11.7 2.6 512.726 32.6 14.5 67.2 6.4 124.1 87.6 9.7 94.4 10.3 2.3 9.7 2.3 461.129 29.3 13.5 57.7 6.4 114.0 81.6 9.4 89.5 10.6 1.9 11.0 2.0 426.739 32.2 13.7 72.8 6.3 129.3 82.0 8.9 100.2 9.7 2.3 10.3 2.1 469.742 24.4 11.7 58.6 5.2 123.0 83.0 11.8 103.6 11.8 2.6 17.4 3.3 456.252 33.4 15.1 78.3 6.5 116.9 57.8 11.2 110.0 9.0 2.5 12.6 3.0 456.254 33.0 14.0 73.1 6.8 131.3 91.2 10.1 119.5 11.5 3.0 11.6 1.3 506.3tr^*＝痕量＜0.2wt％

在某些SLC1-1T₂系中，含VLCFA的TAG的比例(如表3和4)、和由此产生的种子总VLCFA、特别是二十烷基酸和芥子酸含量急剧增加(表5)。在某些情况下，VLCFA的总比例也增加(表6)。

选择那些显示油含量和含VLCFA的TAG比例增加的SLC1-1转化T₂系，并种植各个种子得到T₃子代系。来自几个独立的SLC1-1转基因T₃系的TAG的脂类分析指出，与pBI121对照T₃转化体相比，与增加的TAG含量(nmol TAG/100个种子；表8)有关的总脂类含量(以μg脂肪酸/100个种子报告；表7)明显增加。具体地说，在几个SLC1-1转化体中，VLCFA(μg/100个种子；表7)的量和含VLCFA的C₅₈和C₆₀TAG的水平(表8)比pBI121对照植物大大增强。

对来自选定的独立的T₃SLC1-1转基因植物的TAG的立体特异性分析表明，它含有的sn-2位置的VLCFA(如，二十烷基酸，20∶1)的比例增加。这一趋势是相符的，不管数据是以二十烷基酸代表的所有sn-2位置脂肪酸之间的比例还是以sn-2位置发现的TAG中的二十烷基酸的总比例(表9)表示。另外在SLC1-1转基因植物中，与pBI121对照植物相比，在TAG的sn-2位置的VLCFA(如，二十烷基酸)比例的增加与伴随着的该位置聚不饱和脂肪酸的比例下降(图4)有关。

表3

在未转化的WT对照A.thaliana和SLC1-1

转化体#42的T₂种子中积累的TAG的种类

(nmol/50粒种子±SD)品系 TAG#→ C₅₀ C₅₂ C₅₄ C₅₆ C₅₈ C₆₀ 总数WT nmol 5.9 44.3 115.3 163.3 56.9 5.9 391.6对照 ±S D 0.3 3.2 10.3 16.3 7.3 1.4 37.3(n＝5) mol％ 1.5 11.3 29.5 41.7 14.5 15 100.0

±SD 0.1 0.4 0.7 0.4 0.8 0.3

mol％C₅₆-C₆₀ 57.542 nmol 3.5 32.7 108.1 194.3 95.6 16.6 450.8(n＝2) ±SD 0.1 0.2 0.9 0.4 1.2 0.8 3.5

mol％ 0.8 7.2 24.0 43.1 21.2 3.7 100.0

±SD 0.01 0.01 0.004 0.3 0.1 0.2

mol％C₅₆-C₆₀ 68.0

表4

在未转化的WT对照A.thaliana和SLC1-1

转化体#16的T₂种子中积累的TAG的种类

(nmol/50粒种子±SD)品系 TAG#→ C₅₀ C₅₂ C₅₄ C₅₆ C₅₈ C₆₀ 总数WT nmol 5.9 44.3 115.3 163.3 56.9 5.9 391.6对照 SD 0.3 3.2 10.3 16.3 7.3 1.4 37.3(n＝5) mol％ 1.5 11.3 29.5 41.7 14.5 1.5 100.0

SD 0.1 0.4 0.7 0.4 0.8 0.3

mol％C₅₆-C₆₀ 57.716 nmol 6.5 51.3 144.1 214.9 82.7 10.6 510.1(n＝2) SD 0.1 0.3 1.4 2.9 2.0 0.6 7.1

mol％ 1.3 10.1 28.3 42.1 16.2 2.1 100.0

SD 0.04 0.1 0.1 0.02 0.2 0.1

mol％C₅₆-C₆₀ 60.4

表5在未转化的WT对照A.thaliana、pB1121对照和SLC1-1转基因品系的T₂种子中花生酸(20∶1)、芥子酸(22∶1)和总的极长链脂肪酸(VLCFA)含量(微克/50粒种子)品系 20∶1 22∶1 总VLCFAsWT对照 74.8 8.3 102.8SD(n＝5) 6.4 0.7 10.0pB1121对照 73.8 7.0 96.7SD(n＝2) 2.3 0.3 3.416 96.4 11.0 132.620 118.8 12.4 159.223 106.9 11.7 146.442 103.6 17.4 150.352 110.0 12.6 148.254 119.5 11.6 156.8

表6在未转化的WT对照(u-WT)、pB1121对照和选定的A.thaliana的SLC1-1转基因品系的T₂种子中花生酸(20∶1)、芥子酸(22∶1)和总VLCFAs的比例

(在50粒种子样品中wt％)品系 20∶1 所有VLCFAsu-WT对照 20.0 27.6pB1121对照 20.5 26.342 22.7 33.052 24.1 32.554 23.6 31.0

表7pB1121对照(pB1121Con)和选定的A.thaliana的SLC1-转基因品系的成熟的T₃种子的总脂类含量(总FA的微克/100粒种子)和VLCFA含量(微克/100粒种子)品系总脂类含量 VLCFA含量pB1121Cona 483.5 119.7pB1121Conb 568.5 127.2pB1121Conc 519.7 125.1pB1121Cond 511.3 122.3pB1121Con平均值 520.7 123.6±SE(n＝4) 15.3 1.442-1 1137.9 315.542-4 851.7 218.642-5 984.6 268.023-8 1056.1 287.752-2 1109.2 307.552-5 870.0 253.352-6 1039.1 281.616-5 1955.3 227.0

表8

pB1121对照(pB1121Con)和选定的A.thaliana

的SLC1-1转基因品系的成熟的T₃种子的总TAG含量

和C₅₈和C₆₀TAG含量(nmol/100粒种子样品)TAG C#→ C₅₀ C₅₂ C₅₄ C₅₆ C₅₈ C₆₀ 总数pB1121Con 8.5 55.3 130.9 145.3 30.9 nd^* 371.0±SD(n＝2) 0.4 2.6 7.8 9.0 2.7 21.616-5 12.4 88.2 214.7 251.6 70.5 5.6 642.923-8 17.7 130.8 333.6 409.0 106.8 8.0 1005.924-4 11.4 90.7 259.6 366.4 127.7 14.3 870.052-6 15.2 106.1 252.1 322.7 85.5 6.0 787.0^*nd＝未检测

表9

在pB1121对照(pB1121Con)和选定的A.thaliana的SLC1-1转基因品系的成熟的T₃种子中，在TAGs的sn-2位置20∶1的比例(sn-220∶1的wt％)和在TAGs的sn-2位置

总的20∶1的比例(在sn-2位置总20∶1的wt％)

(wt％/100粒种子的样品)品系 sn-220∶1的wt％在sn-2位置总20∶1的wt％^*pB1121Cona 1.7 3.6pB1121Conb 0.6 1.1pB1121Conc 0.5 0.9pB1121Cond 1.6 3.016-5 4.2 16.342-1 5.1 8.542-4 7.9 12.842-5 5.3 8.723-8 7.5 12.052-2 6.2 10.052-5 5.8 9.752-6 7.5 12.0

^*在sn-2位置总20∶1的wt％＝([sn-2/[3×％总20∶1]]％×100)

B.napus和B.carinata SLC1-1转化体种子脂类分析：

几个B.napus品种Hero、品种Reston和B.carinataSLC1-1T₂转化体种子品系显示油含量提高(表10)和芥子酸含量增高，以微克/毫克DW、或以微克/种子表示(表11)。对于B.napus品种Hero、品种Reston，与非转化对照植物中相应水平相比，几个SLC1-1转基因品系的种子显示芥子酸比例增高(表12)。选定的平均转化Hero植物(植物4)和具有预测高油产量和高芥子酸表现型的SLC1-1转化品系(品系8，植物6)的单个种子分析表明，对于单个插入物，这些特性的分布在种子群体中按照典型的孟德尔方式分离(表13)++++。对于这三个(高油含量、芥子酸含量提高、芥子酸比例提高)特性，Hero品系8植物6的一些种子(例如8-6K和8-6H品系的种子)显示可能纯合的WT(例如，种子8-6I)或纯合的SLC1-1表现型，而对于这三个特性，其它品系显示具有中间值的杂合WT/SLC1-1分布(例如，种子8-6B)。

表10在未转化的对照和选定的B.napus品种Hero和Reston的SLC1-1转基因品系的T₂种子中，和在B.carinata

可育系C90-1163的T₂种子中的油含量

(％干重量)(+SE，如果需要)品系油含量(％DW)B.napus品种Hero

对照 40.1±+1.7

5-1 46.7

5-4 48.7

7-3 45.3

7-6 46.4

7-9 44.9

8-4 45.9

8-6 50.9

8-7 44.9

8-10 45.1B.napus品种Reston

对照 33.4±2.2

1-7 41.9

1-8 40.5

2-8 42.1

2-9 42.2B.carinata C90-1163品系

对照 35.9±1.1

B.car 10-1-7 42.8

B.car 2-3-6 39.9

表11在未转化的对照和选定的B.napus品种Hero的SLC1-1转基因品系的成熟T₂种子中，和在B.carinata可

育系C90-1163的成熟T₂种子中的芥子酸含量(以微克/毫克或微克/种子表示)(±SE，对于对照)品系 22∶1 22∶1

(微克/毫克DW) (微克/种子)B.carinata品系C90-1163对照 156.4±5.610-1-7 180.4B.napus品种Hero

对照 195.5+11.7 596.7±40.6

5-1 247.9 900.6

5-4 249.4 818.8

7-3 236.1 -

7-6 244.8 912

7-9 229.2 857.6

8-4 235.7 923.2

8-6 270.9 1020.3

8-7 238.5 888.23

8-10 232.7 900.4

3-1 - --未测定

表12在未转化的对照和选定的B.napus品种Hero和Reston的SLC1-1转基因品系的成熟T₂种子中芥子酸的比例(以wt％表示)(+SE，对于对照)品系 wt％ 22∶1B.napus品种Hero对照 48.6+0.65-1 53.15-4 --7-3 52.17-6 52.87-9 --8-4 51.48-6 53.38-7 51.88-10 53.63-1 58.3B.napus品种Reston对照 34.7±0.21-10 36.41-7 35.81-8 37.42-3 36.62-7 41.1-未测定

表13在未转化的对照植株和B.napus品种Hero的SLC1-1转基因品系8植株6的成熟T₂单个种子中脂类含量的变化(以微克总脂肪酸/种子表示)和芥子酸的含量的变化(以微克22∶1/种子或wt％22∶1表示)

(平均值±SE，AVG)品系/种子微克FAs/种子微克22∶1/种子 wt％22∶1AVG Con4 1076.4±61.5 507.1±33.7 46.9±0.8AVG-6 1441.7±67.3 735.4±36.5 51.0±0.686G 1324.8 710. 54.186H 1704.3 877.1 52.586I 1175.4 557.3 47.486J 1206.8 629.4 52.286K 1694.7 911.1 53.886A 1351.6 658.6 48.786B 1304.5 670.6 51.486C 1221.1 639.1 52.386D 1449.0 714.3 49.386E 1678.2 844.6 50.386F 1748.0 876.8 50.2

在Hero的几个转基因品系中，sn-2位置的花生酸的比例和总VLCFAs的比例有可检测的增加(表14)。酵母转基因对提高B.napus的sn-2位置的花生酸含量的效果明显低于改变A.thaliana中sn-2位置的花生酸含量的能力(参见.表9)。但是，基于啤酒酵母sn-2位置酰基转移酶对花生酰vs芥子酸酰-CoA的相对特异性(c.f.表1)，这一点可能预料不到。

表14在未转化的对照和选定的B.napus品种Hero的SLC1-1转基因品系的成熟T₂种子中sn-2芥子酸和VLCFA含量品系/种子 sn-2 22∶1 sn-2 VLCFAsHero 对照 1.5 3Hero 8-6 2.8 4.6Hero 8-6G 3.6 4.44(单个种子)Hero 3-1 4.12 4.12^*Hero 8-10 2.22 3.7芥子酸(22∶1)是唯一的VLCFA缺失。

由GC分析TAG种类的组成显示，Hero的几个SLC1-1转化体品系的C₅₂TAGs的比例提高，并且C₅₄和C₅₆TAGs降低到最小(表15)。在Hero SLC1-1转基因品系中，含有2或多种C₂₂脂肪酸的C₆₂-C₆₆的TAGs的比例迅速增加(表15)，主要消耗含有两个(C₅₆)或三个(C₅₄)C₁₈脂肪酸的TAG(数据未列出)。在一些B.napus品种RestonSLC1-1转基因品系中观察到C₆₂TAG的比例增加(表15)。

表15在未转化的对照和选定的B.napus品种Hero和Reston的SLC1-1转基因品系的成熟的T₂种子中C₆₂、C₆₄、C₆₆

TAGs的比例(mol％)(±SE，对于对照)品系 C₆₂ C₆₄ C₆₆ 总C₆₂-C₆₆对照 36.72±1.42 1.32±0.02 0.10±0.01 38.14±1.45Hero 5-2 51.44 1.81 0.12 53.37Hero 5-4 48.92 1.95 0.25 51.12Hero 5-10 56.48 1.46 0.08 58.02Hero 7-1 57.25 2.19 0.14 59.58Hero 7-5 55.61 1.98 0.09 57.68Hero 8-4 44.78 2.14 0.25 47.16Hero 8-6 53.35 2.22 0.22 55.79Reston对照 18.32 0.94 0.06 19.321-8 23.88 1.06 0.07 25.012-7 31.67 1.42 0.11 33.20

关于种子对种子的C₆₂TAG的比例变异，典型对照和SLC1-1B.napus品种Hero转基因品系的分析显示，SLC1-1T₂种子的群体发生分离，但是与未转化的对照相比，许多单个种子具有相当高比例的C₆₂TAGs(表16)。

表16在未转化的对照和B.napus品种Hero的SLC1-1转基因品系的成熟T₂种子中，分析单个种子测定C₆₂TAGs

的比例(mol％)(平均值+SE，AVG)品系/种子 C₆₂TAGsHero 对照4d 38.544e 40.294b 36.884f 38.814g 30.054i 35.954h 42.844l 40.814k 43.28Hero对照AVG 38.6+1.35Hero 8-68-6d 36.368-6a 47.638-6b 54.068-6c 54.818-6f 44.48-6g 56.278-6h 53.118-6l 42.198-6j 51.448-6k 58.4Hero8-6AVG 51.35±1.82

SLC1-1转基因品系相对于对照而言，油产量提高的评估与以“每克干重”或以“每粒种子”的表示直接相关，如由非破坏性的¹H-NMR方法测定的相对油含量(表6)。的确，在SLC1-1转基因品系中NMR测定的相对油产量提高的结果也与种子重量的提高正相关(表7)，并且表明种子干重量的增加是和油产量提高直接相关的，种子水份可忽视(在CH₂OCO-和CHOCH-化学变换之间没有较宽的水共振)。来自对照种子样品和B.napus品种Hero和B.carinata的“高油”SLC1-1转基因品系典型的¹H-NMR应答描述于表17。

表17

在未转化的对照和选定的B.napus品种Hero和Reston的SLC1-1转基因品系的T₂种子和在B.carinata可育系C90-1163的T₂种子中，对Liquidlike油(由Rutar；1989)进行的磁共振产生的¹H-NMR掺入应答(35粒种子样品；相对于对照掺入的应答，设定在1.000)品系 NMR掺入应答B.napus品种Hero对照 1.0000Hero 5-1 1.5175Hero 7-3 1.2721Hero 7-6 1.3875Hero 7-9 1.3245Hero 8-4 1.5667Hero 8-6 1.5297Hero 8-7 1.4825Hero 8-10 1.6302B.carinata品种C90-1163对照 1.0000B.carinata10-1-7 1.5977B.carinata2-3-6 1.7548

一些B.napus变种Westar(Canola)SLC1-1T₂转化种子品系显示油酸的相对比例提高，聚不饱和脂肪酸(18∶2和18∶3)的相对比例相应降低(表18)。这与在Kentucky大学的专利申请中记载的预测效果相反。由此，由于SLC1-1的表达，在食用油中单不饱和脂肪酸的比例提高。此外，在这些Canola品系中，极长链饱和脂肪酸的比例显著提高(表18)。

表18在未转化的对照和选定的B.napus品种WESTAR的

SLC1-1转基因品系(n＝2或3)中油酸、亚油酸

和饱和VLCFA组合物(n＝2或3)品系油酸亚油酸亚油酸花生酸山榆酸二十四酸

18∶1c9 18∶2c9，12 18∶3c9， 20∶0 22∶0 24∶0

12，15B.napus品种WESTAR对照 61.03 17.55 11.07 0.55 0.31 0.27WS-13 70.03 14.80 3.41 0.76 0.49 0.56WS-15 71.92 12.33 3.71 0.78 0.53 0.48WS-16 71.06 12.29 3.87 0.97 0.59 0.56WS-15a 72.71 9.69 3.09 0.94 0.65 0.68

转化体品系的LPAT分析：

与未转化对照相比B.napus品种WESTAR和品种Argentine的SLC1-1的T₁转化体品系的样品显示在快速扩展的叶片匀浆制剂中，18∶1-CoA∶LPAT活性提高(表19)。

未转化的对照和选定的B.napus品种Hero和B.carinata品种的SLC1-1的转基因品系的发育种子LPAT活性显示在SLC1-1转基因品系中18∶1-CoA∶LPAT和22∶1-CoA∶LPAT(表19)比活性急剧提高。

未转化的对照和A.thaliana的SLC1-1转基因品系中发育种子LPAT活性显示在几个SLC1-1转基因品系中20∶1-CoA∶LPAT活性提高(表19)。

因此，在我们的证明中，第一次提供了直接证据，酵母SLC1-1基因产物编码具有sn-2酰基转移酶活性的酶，并且体外可以显示LPAT(EC 2.3.1.51)活性。

表19从未转化的对照和选定的B.napus品种WESTAR、Argentine和Hero，B.carinata品种C90-1163和A.thaliana哥伦比亚变种的SLC1-1的转基因品系的T₁叶片和T₂或T₃发育种子制备的匀浆的相对LPAT

活性。所有实验按照实验部分的描述进行。品系分析的组织分析的LPAT活性掺入到PA的

DPM¹⁴C酰基

-CoA/微克prB.napus T₂叶片 18∶1-CoA品种WESTAR对照 307ws 2-5 1008ws 3-8 617ws 6-7 1428B.napus T₂叶片 18∶1-CoA品种Arg.对照 350Arg 2-8 996Arg 3-3 1557B.napus T₂发育种子 18∶1-CoA品种Hero对照 580Hero 3-1 3470Hero 7-6 2035Hero 8-6 1370B.carinata T₂发育种子 18∶1-CoA品种C90-1163对照 720B.carinata10-1-7 1125B.napus T₂发育种子 22∶1-CoA表19续品系分析的组织分析的LPAT活性掺入到PA的

DPM¹⁴C酰基

-CoA/微克pr品种Hero对照 6.4Hero 3-1 68.3Hero 7-6 53.4Hero 8-6 20.2A.thaliana T₂发育种子 20∶1-CoAWTu-对照 23842-1 27042-4 38042-5 503

SLC1-1转化体的遗传分析：

在表20中概括了在该沉积作用中记载的转基因植物的PCR和Southern分析资料。

表20SLC1-1 T₂转基因植物品系的PCR和Southern

数据的概述(nd＝未测定)

油料种子	转化体#(T₂品系)	PCR	Southern	插入(拷贝)#
油料种子	转化体#(T₂品系)	PCR	Southern	插入(拷贝)#	A.thaliana哥伦比亚品种B.napus品种WESTARB.napus品种ArgentineB.napus品种Her.oB.carinata品种C90-1163	162023425254236131516235783102	+++++++++ndndnd++++++++	++++++++++++++++++++	单拷贝单拷贝多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝单拷贝多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝单拷贝单拷贝单拷贝单拷贝单拷贝多拷贝

按照A.thaliana SLC1-1转化体T₂子代的分离方式，将显示油含量提高以及长(C₁₈)和极长链脂肪酸(C₂₀和C₂₂)的量提高的转基因品系(例如，品系16，20)的种子灭菌，在选择性培养基(含50mg/l卡那霉素)上繁殖。两种品系显示相同的3∶1(卡那霉素抗性∶卡那霉素敏感)分离方式，它显示标记物作为一个孟德尔位点分离。Southern杂交分析(Southern，1975)证实每个基因组中存在单个的T-DNA插入物。对于品系23、42、52和54，Southern杂交分析暗示所有品系的各基因组都具有一个以上的T-DNA。

从长角果的A.thaliana品系16、20、23、42、52和54分离的发育中期的种子的Northern杂交分析证实，在所有测试的品系中都表达SLC1-1基因，品系42表达量最高。

从B.napus品种WESTAR转基因品系(2、3、6、13、15、16)分离的基因组DNA的Southern分析显示，只有品系13具有单个插入物。B.napus变种Argentine SLC1-1转基因品系(2、3)具有多个插入物。B.napus品种Hero转基因品系(3、5、7、8)和B.carinata转基因品系10各具有一个个插入物，而B.carinata品系2每个基因组具有多个T-DNA插入物。

序列表(1)总的资料(i)申请人：

(A)名称：加拿大国家研究委员会

(B)街道：Montreal路，1200号

(C)城市：渥太华

(D)州：Ontario

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码(ZIP)：K1A 0R6

(A)名称：Zou，Jitao

(B)街道：#3E-1800大道

(C)城市：Saskatoon

(D)州：Saskatchewan

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码(ZIP)：S7H2Z6

(A)名称：Taylor，David C.

(B)街道：622 Wollaston Bay

(C)城市：Saskatoon

(D)州：Saskatchewan

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码(ZIP)：S7J 4C3

(A)名称：Katavic，Vesna

(B)街道：301 1121 C McKercher Drive

(C)城市：Saskatoon

(D)州： Saskatchewan

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码(ZIP)：S7H 5B8

(A)名称：MacKenzie，Samuel L.

(B)街道：17 Cambridge Crescent

(C)城市：Saskatoon

(D)州：Saskatchewan

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码(ZIP)：S7H 3P9

(A)名称：Keller，Wilfred A

(B)街道：234 Emmeline路

(C)城市：Saskatoon

(D)州：Saskatchewan

(E)国家：加拿大

(F)邮政编码(ZIP)：S7J 5B6

(ii)发明名称：利用酵母SLC基因修饰植物脂类和种子油

(iii)序列数：6

(iv)计算机可读形式：

(A)媒体类型：Floppy软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本

#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的资料

(i)序列特征：

(A)长度：947碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(vi)原始来源：

(A)生物体：啤酒酵母

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)定位：1..909

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1ATG AGT GTG ATA GGT AGG TTC TTG TAT TAC TTG AGG TCC GTG TTG GTC 48Met Ser Val Ile Gly Arg Phe Leu Tyr Tyr Leu Arg Ser Val Leu Val1 5 10 15GTA CTG GCG CTT GCA GGC TGT GGC TTT TAC GGT GTA ATC GCC TCT ATC 96Val Leu Ala Leu Ala Gly Cys Gly Phe Tyr Gly Val Ile Ala Ser Ile

20 25 30CTT TGC ACG TTA ATC GGT AAG CAA CAT TTG GCT CTG TGG ATT ACT GCG 144Leu Cys Thr Leu Ile Gly Lys Gln His Leu Ala Leu Trp Ile Thr Ala

35 40 45CGT TGT TTT TAC CAT GTC ATG AAA TTG ATG CTT GGC CTT GAC GTC AAG 192Arg Cys Phe Tyr His Val Met Lys Leu Met Leu Gly Leu Asp Val Lys

50 55 60GTC GTT GGC GAG GAG AAT TTG GCC AAG AAG CCA TAT ATT ATG ATT GCC 240Val Val Gly Glu Glu Asn Leu Ala Lys Lys Pro Tyr Ile Met Ile Ala65 70 75 80AAT CAC CAA TCC ACC TTG GAT ATC TTC ATG TTA GGT AGG ATT TTC CCC 288Asn His Gln Ser Thr Leu Asp Ile Phe Met Leu Gly Arg Ile Phe Pro

85 90 95CCT GGT TGC ACA GTT ACT GCC AAG AAG TCT TTG AAA TAC GTC CCC TTT 336Pro Gly Cys Thr Val Thr Ala Lys Lys Ser Leu Lys Tyr Val Pro Phe

100 105 110CTG GGT TGG TTC ATG GCT TTG AGT GGT ACA TAT TTC TTA GAC AGA TCT 384Leu Gly Trp Phe Met Ala Leu Ser Gly Thr Tyr Phe Leu Asp Arg Ser

115 120 125AAA AGG CAA GAA GCC ATT GAC ACC TTG AAT AAA GGT TTA GAA AAT GTT 432Lys Arg Gln Glu Ala Ile Asp Thr Leu Asn Lys Gly Leu Glu Asn Val

130 135 140AAG AAA AAC AAG CGT GCT CTA TGG GTT TTT CCT GAG GGT ACC AGG TCT 480Lys Lys Asn Lys Arg Ala Leu Trp Val Phe Pro Glu Gly Thr Arg Ser145 150 155 160TAC ACG AGT GAG CTG ACA ATG TTG CCT TTC AAG AAG GGT GCT TTC CAT 528Tyr Thr Ser Glu Leu Thr Met Leu Pro Phe Lys Lys Gly Ala Phe His

165 170 175TTG GCA CAA CAG GGT AAG ATC CCC ATT GTT CCA GTG GTT GTT TCC AAT 576Leu Ala Gln Gln Gly Lys Ile Pro Ile Val Pro Val Val Val Ser Asn

180 185 190ACC AGT ACT TTA GTA AGT CCT AAA TAT GGG GTC TTC AAC AGA GGC TGT 624Thr Ser Thr Leu Val Ser Pro Lys Tyr Gly Val Phe Asn Arg Gly Cys

195 200 205ATG ATT GTT AGA ATT TTA AAA CCT ATT TCA ACC GAG AAC TTA ACA AAG 672Met Ile Val Arg Ile Leu Lys Pro Ile Ser Thr Glu Asn Leu Thr Lys

210 215 220GAC AAA ATT GGT GAA TTT GCT GAA AAA GTT AGA GAT CAA ATG GTT GAC 720Asp Lys Ile Gly Glu Phe Ala Glu Lys Val Arg Asp Gln Mer Val Asp225 230 235 240ACT TTG AAG GAG ATT GGC TAC TCT CCC GCC ATC AAC GAT ACA ACC CTC 768Thr Leu Lys Glu Ile Gly Tyr Ser Pro Ala Ile Asn Asp Thr Thr Leu

245 250 255CCA CCA CAA GCT ATT GAG TAT GCC GCT CTT CAA CAT GAC AAG AAA GTG 816Pro Pro Gln Ala Ile Glu Tyr Ala Ala Leu Gln His Asp Lys Lys Val

260 265 270AAC AAG AAA ATC AAG AAT GAG CCT GTG CCT TCT GTC AGC ATT AGC AAC 864Asn Lys Lys Ile Lys Asn Glu Pro Val Pro Ser Val Ser Ile Ser Asn

275 280 285GAT GTC AAT ACC CAT AAC GAA GGT TCA TCT GTA AAA AAG ATG CAT 909Asp Val Asn Thr His Asn Glu Gly Ser Ser Val Lys Lys Met His

290 295 300TAAGCCACCA CCACATTTTT AGAGTAGTAT ATAGACCC 947(2)SEQ ID NO：2的资料

(i)序列特征：

(A)长度：303氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Ser Val Ile Gly Arg Phe Leu Tyr Tyr Leu Arg Ser Val Leu Val1 5 10 15Val Leu Ala Leu Ala Gly Cys Gly Phe Tyr Gly Val Ile Ala Ser Ile

20 25 30Leu Cys Thr Leu Ile Gly Lys Gln His Leu Ala Leu Trp Ile Thr Ala

35 40 45Arg Cys Phe Tyr His Val Met Lys Leu Met Leu Gly Leu Asp Val Lys

50 55 60Val Val Gly Glu Glu Asn Leu Ala Lys Lys Pro Tyr Ile Met Ile Ala65 70 75 80Asn His Gln Ser Thr Leu Asp Ile Phe Met Leu Gly Arg Ile Phe Pro

85 90 95Pro Gly Cys Thr Val Thr Ala Lys Lys Ser Leu Lys Tyr Val Pro Phe

100 105 110Leu Gly Trp Phe Met Ala Leu Ser Gly Thr Tyr Phe Leu Asp Arg Ser

115 120 125Lys Arg Gln Glu Ala Ile Asp Thr Leu Asn Lys Gly Leu Glu Asn Val

130 135 140Lys Lys Asn Lys Arg Ala Leu Trp Val Phe Pro Glu Gly Thr Arg Ser145 150 155 160Tyr Thr Ser Glu Leu Thr Met Leu Pro Phe Lys Lys Gly Ala Phe His

165 170 175Leu Ala Gln Gln Gly Lys Ile Pro Ile Val Pro Val Val Val Ser Asn

180 185 190Thr Ser Thr Leu Val Ser Pro Lys Tyr Gly Val Phe Asn Arg Gly Cys

195 200 205Met Ile Val Arg Ile Leu Lys Pro Ile Ser Thr Glu Asn Leu Thr Lys

210 215 220Asp Lys Ile Gly Glu Phe Ala Glu Lys Val Arg Asp Gln Met Val Asp225 230 235 240Thr Leu Lys Glu Ile Gly Tyr Ser Pro Ala Ile Asn Asp Thr Thr Leu

245 250 255Pro Pro Gln Ala Ile Glu Tyr Ala Ala Leu Gln His Asp Lys Lys Val

260 265 270Asn Lys Lys Ile Lys Asn Glu Pro Val Pro Ser Val Ser Ile Ser Asn

275 280 285Asp Val Asn Thr His Asn Glu Gly Ser Ser Val Lys Lys Met His

290 295 300(2)SEQ ID NO：3的资料

(i)序列特征：

(A)长度：947碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)定位：1..909(xi)序列描述：SEQ ID NO：3ATG AGT GTG ATA GGT AGG TTC TTG TAT TAC TTG AGG TCC GTG TTG GTC 48Met Ser Val Ile Gly Arg Phe Leu Tyr Tyr Leu Arg Ser Val Leu Val1 5 10 15GTA CTG GCG CTT GCA GGC TGT GGC TTT TAC GGT GTA ATC GCC TCT ATC 96Val Leu Ala Leu Ala Gly Cys Gly Phe Tyr Gly Val Ile Ala Ser Ile

20 25 30CTT TGC ACG TTA ATC GGT AAG CAA CAT TTG GCT CAG TGG ATT ACT GCG 144Leu Cys Thr Leu Ile Gly Lys Gln His Leu Ala Gln Trp Ile Thr Ala

50 55 60GTC GTT GGC GAG GAG AAT TTG GCC AAG AAG CCA TAT ATT ATG ATT GCC 240Val Val Gly Glu Glu Asn Leu Ala Lys Lys Pro Tyr Ile Mer Ile Ala65 70 75 80AAT CAC CAA TCC ACC TTG GAT ATC TTC ATG TTA GGT AGG ATT TTC CCC 288Asn His Gln Ser Thr Leu Asp Ile Phe Met Leu Gly Arg Ile Phe Pro

210 215 220GAC AAA ATT GGT GAA TTT GCT GAA AAA GTT AGA GAT CAA ATG GTT GAC 720Asp Lys Ile Gly Glu Phe Ala Glu Lys Val Arg Asp Gln Met Val Asp225 230 235 240ACT TTG AAG GAG ATT GGC TAC TCT CCC GCC ATC AAC GAT ACA ACC CTC 768Thr Leu Lys Glu Ile Gly Tyr Ser Pro Ala Ile Asn Asp Thr Thr Leu

290 295 300TAAGCCACCA CCACATTTTT AGAGTAGTAT ATAGACCC 967(2)SEQ ID NO：4的资料

(i)序列特征：

(A)长度：303氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4Met Ser Val Ile Gly Arg Phe Leu Tyr Tyr Leu Arg Ser Val Leu Val1 5 10 15Val Leu Ala Leu Ala Gly Cys Gly Phe Tyr Gly Val Ile Ala Ser Ile

20 25 30Leu Cys Thr Leu Ile Gly Lys Gln His Leu Ala Gln Trp Ile Thr Ala

35 40 45Arg Cys Phe Tyr His Val Met Lys Leu Met Leu Gly Leu Asp Val Lys

50 55 60Val Val Gly Glu Glu Asn Leu Ala Lys Lys Pro Tyr Ile Mer Ile Ala65 70 75 80Asn His Gln Ser Thr Leu Asp Ile Phe Met Leu Gly Arg Ile Phe Pro

85 90 95Pro Gly Cys Thr Val Thr Ala Lys Lys Ser Leu Lys Tyr Val Pro Phe

100 105 110Leu Gly Trp Phe Met Ala Leu Ser Gly Thr Tyr Phe Leu Asp Arg Ser

115 120 125Lys Arg Gln Glu Ala Ile Asp Thr Leu Asn Lys Gly Leu Glu Asn Val

165 170 175Leu Ala Gln Gln Gly Lys Ile Pro Ile Val Pro Val Val Val Ser Asn

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195 200 205Met Ile Val Arg Ile Leu Lys Pro Ile Ser Thr Glu Asn Leu Thr Lys

245 250 255Pro Pro Gln Ala Ile Glu Tyr Ala Ala Leu Gln His Asp Lys Lys Val

260 265 270Asn Lys Lys Ile Lys Asn Glu Pro Val Pro Ser Val Ser Ile Ser Asn

275 280 285Asp Val Asn Thr His Asn Glu Gly Ser Ser Val Lys Lys Met His

290 295 300(2)SEQ ID NO：5的资料

(i)序列特征：

(A)长度：32碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5AGAGAGAGGG ATCCATGAGT GTGATAGGTA GG(2)SEQ ID NO：6的资料

(i)序列特征：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6GAGGAAGAAG GATCCGGGTC TATATACTAC TCT

本发明涉及的参考文献

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与本申请有关的专利

1.Calgene公司(专利申请人)；发明人：Davies，H.M.，Hawkins，D.，Nelsen，J.，Lassner，M.；PCT申请公开号：WO95/27791。“植物溶血磷脂酸酰基转移酶。”

2.Calgene公司被授权的一项美国专利(WPI登记号：91-348069-48；Biotech Patent News，6，1992)，在植物细胞中使用反义基因技术。

3.duPont de Nemours and Company(专利申请人)；发明人：Lightner，J.E.，Okuley，J.J.；PCT申请公开号WO 94-11516；欧洲专利申请公布号：EP0668919。“微粒体δ-12脂肪酸脱氢酶和来自植物的有关的酶的基因。”

4.Nickerson Biocem.Ltd.(专利授让人)；发明人：SlabasA.R.and Brown，A.P.；PCT申请公开号WO 94/13814；欧洲专利申请公布号EP 067 3424。“编码2-酰基转移酶的DNA。”

5.University of Kentucky Research Foundation(专利申请人)；作者：Dickson，R.et al.；未公布的待审美国专利申请No.434,039.“证明脂肪酸在酰基甘油脂的sn-2位的技术。”

Claims

1.转基因油料种子植物，其特征在于所述植物具有掺入了可表达的酵母SLC1-1或SLC1基因的基因组。

2.根据权利要求1所述的植物，其特征在于与相同类型不含所述基因的植物相比，所述植物显示具有提高的种子油产量和/或具有不同于相同类型植物的种子油组成。

3.根据权利要求1所述的植物，其特征在于所述基因具有SEQ IDNO：1的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的植物，其特征在于所述基因具有SEQ IDNO：3的核苷酸序列。

5.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的植物，其特征在于所述植物产生非食用油。

6.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的植物，其特征在于所述植物产生食用油。

7.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的植物，其特征在于所述植物是被修饰为含有所述基因的Arabidopsisthaliana。

8.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的植物，其特征在于所述植物是被修饰为含有所述基因的芸苔科的成员。

9.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的植物，其特征在于所述植物是被修饰为含有所述基因的Brassicanapus。

10.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的植物，其特征在于所述植物是被修饰为含有所述基因的Brassicacarinata。

11.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的植物，其特征在于所述植物选自于由下列成员组成的组：琉璃苣(Borago spp.)、canola、蓖麻(Ricinus communis)、可可豆(Theobroma cacao)、玉米(Zea mays)、棉花(Gossypium spp)、两芦荠、萼距花、亚麻(Linum spp.)、类斯克懒勒和池花、Linola、田芥属(Tropaeolum spp.)、月见草、橄榄(木樨榄属spp.)、棕榈(Elaeis spp.)、花生(Arachis spp)、rapeseed、红花(Carthamus spp.)、大豆(Glycine和Sojaspp.)、向日葵(Helianthus spp.)、烟草(烟草属spp.)和斑鸠菊。

12.转基因油料种子植物的种子，其特征在于所述植物具有掺入了可表达的酵母SLC1-1或SLC1基因的基因组。

13.根据权利要求11所述的种子，其特征在于所述基因具有SEQID NO：1的核苷酸序列。

14.根据权利要求11所述的种子，其特征在于所述基因具有SEQID NO：3的核苷酸序列。

15.根据权利要求12、权利要求13或权利要求14所述的种子，其特征在于所述种子产生非食用油。

16.根据权利要求12、权利要求13或权利要求14所述的种子，其特征在于所述种子产生食用油。

17.根据权利要求12、权利要求13或权利要求14所述的种子，其特征在于所述种子是被修饰为含有所述基因的Arabidopsisthaliana。

18.根据权利要求12、权利要求13或权利要求14所述的种子，其特征在于所述种子是被修饰为含有所述基因的芸苔科的成员。

19.根据权利要求12、权利要求13或权利要求14所述的种子，其特征在于所述种子是被修饰为含有所述基因的Brassicanapus。

20.根据权利要求12、权利要求13或权利要求14所述的种子，其特征在于所述种子是被修饰为含有所述基因的Brassicacarinata。

21.根据权利要求12、权利要求13或权利要求14所述的种子，其特征在于所述种子选自下列植物的种子：琉璃苣(Borago spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、可可豆(Theobroma cacao)、玉米(Zea mays)、棉花(Gossypium spp)、两芦荠、萼距花、亚麻(Linum spp.)、类斯克懒勒和池花、田芥属(Tropaeolumspp.)、月见草、橄榄(木樨榄属spp.)、棕榈(Elaeis spp.)、花生(Arachis spp)、红花(Carthamus spp.)、大豆(Glycine和Soja spp.)、向日葵(Helianthus spp.)、烟草(烟草属spp.)和斑鸠菊。

22.质粒pSLC1-1/pRD400(ATCC 97545)。

23.根癌土壤杆菌GV3101菌株，其特征在于所述菌株已经被修饰为含有酵母SLC1-1基因。

24.生产转基因油料种子植物的方法，其特征在于将可表达的酵母SLC1-1或SLC1基因导入到所述植物的基因组中。

25.根据权利要求24所述的方法，其进一步的特征在于负调节在转基因油料种子植物中已经存在的编码溶血磷脂酸酰基转移酶的固有基因。

26.根据权利要求24所述的方法，其进一步的特征在于进行第二次转化，以便导入用于修饰转化植物特性的其它基因。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于所述其它基因是来自于蓖麻或Lespuerella spp.的羟化酶基因。

28.根据权利要求24所述的方法，其特征在于所述的进一步引入其它基因包括将转基因油料种子植物与相关的油料种子转化体杂交，以生产产生修饰的脂肪酸的油料种子植物，所述转化体已经含有可表达的外源或内源性的影响油料种子组成的转基因。

29.生产转化油料种子植物的方法，与相同类型的非转化植物相比，所述植物对生物或非生物植物应力的耐受性有了改善，其特征在于将可表达酵母SLC1-1基因或SLC1等位基因导入到所述植物的基因组中。

30.获得可食用或非食用植物种子油的方法，包括生产油料种子植物、收获所述植物的种子并从所述油料种子提取种子油，其特征在于所述油料种子植物是转基因油料种子植物，其基因组中掺入了可表达酵母SLC1-1基因或SLC1基因。

31.权利要求28所述的方法，其特征在于已经存在于所述转基因油料种子植物中的编码溶血磷脂酸酰基转移酶的内源性基因被负调节。