CN1839199A - 脂质生产菌的育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供不通过抗生素且可以有效并高效地进行被孢霉属脂质生产菌的育种的育种方法。该方法以被孢霉属(Mortierella)脂质生产菌的营养缺陷型菌株例如尿嘧啶缺陷型菌株为宿主，进行转化过程。具体来说，采用与此营养缺陷性互补的基因作为标记基因，将该标记基因导入宿主(基因导入步骤)。然后，以上述宿主营养缺陷性的回复为标记，筛选转化株(筛选步骤)。作为上述脂质生产菌，可以是高山被孢霉(M.alpina)。

Description

脂质生产菌的育种方法
技术领域
本发明涉及脂质生产菌的育种方法，尤其涉及不采用抗生素筛选而是通过转化进行被孢霉属(Mortierella)脂质生产菌的育种的方法。
背景技术
一直以来，人们不断地开发并实际应用通过微生物的代谢来生产有用化合物的技术(广义的发酵技术)。具体来说，例如，具有通过代谢大量地生产脂质的能力的脂质生产菌。作为代表性脂质生产菌，可列举高山被孢霉(Mortierella alpina)等被孢霉属菌类。已知被孢霉属菌类可以生产以花生四烯酸为代表的多不饱和脂肪酸(PUFA)，且被孢霉属菌类是工业上尤其有用的菌类(例如，参照日本特公平7-34752(公告日：1995年4月19日，公开公报：日本特开昭63-44891，公开日：1988年2月25日))。
人们对各种有用生物也包含上述脂质生产菌等的微生物进行育种，即改良(品种改良)有用生物的遗传性状，使其具有人们所希望的更好的性状。尤其在发酵技术中，从提高微生物的化合物生产效率、降低该化合物的制造成本等角度出发，育种是非常重要的。
育种方法基本上包括：制备含有遗传变异的群体的过程(方便起见，称作群体制备过程)和从该群体中筛选出性状更优良的品种的过程(方便起见，称作筛选过程)。无论是群体制备过程还是筛选过程，都可以根据将要进行育种的有用生物的种类采用各种各样的方法，上述脂质生产菌等的微生物的群体制备过程中，主要利用(1)突变处理法和(2)转化法。
(1)突变处理法
通过突变处理进行群体制备过程时，用各种各样的方法使微生物发生突变来制备群体，但突变本身会随机产生多种突变。因此，即使通过之后的筛选过程能够获得表现目的遗传特征的品种(株)，与目的遗传特征相关的基因以外的其他基因可能发生预料之外的损伤。例如上述脂质生产菌，虽然生产得到的脂质的种类发生变化，但增殖或孢子形成能力等可能会下降。因此，采用通过突变处理来制备群体的过程，并不一定能够得到生产性能好的菌株。
而且该方法如上所述，形成群体的个体会随机产生多种突变。因此，在之后的筛选过程中，为了得到表现目的性状的突变体(株)，当没有适宜的筛选方法时，必须对形成上述群体的全部个体的突变种类进行分析，需要耗费庞大的劳动力。
(2)转化法
而通过转化进行群体制备过程时，以将要育种的有用生物为宿主，导入必须的DNA片段(转化)来获得目的性状，从而得到转化体的群体。即制备只控制与目的吻合的特定基因的表达的群体。因此，在之后的筛选过程中，只要从得到的转化体中筛选更优良品种(株)即可，不仅筛选变得容易，还可以避免上述其他基因产生预料之外的损伤。因此，可以明显减少在育种上花费的劳力。
因此，在育种的群体制备过程中，优选转化法。例如，报道了许多与被孢霉属菌类所属的丝状菌的转化方法相关的技术。
具体来说，(a)在下述文献1～3等公开了通过颗粒轰击法转化钩巢曲霉(Aspergillus nidulans)或粗糙链孢霉(Neurospora crassa)等丝状菌的技术。在这些技术中，采用尿嘧啶缺陷型菌株作为转化的宿主株，同时采用与尿嘧啶缺陷性互补的基因作为标记基因，选择转化株。
此外，(b)作为上述高山被孢霉(M.alpina)的转化方法，已知有下述文献4中公开的技术。在该技术中，将孢子原生质体化，通过电穿孔法将基因导入细胞内。而且，转化体的筛选以来自大肠菌的潮霉素B抗性基因(hpt)为标记基因。因此可以筛选出能够在含有潮霉素的培养基中生长的转化体。
文献1：Fungaro M.H.et al.Fems microbial Lett.，25，293-297，1995
文献2：Herzog R.W.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.，45，333-337，1996
文献3：Armaleo，D.et al.Curr.Genet.，17，97-103，1990
文献4：Mackenzie D.A.et al.Appl.Environ.Microbiol.，66，4655-4661.2000
但是存在这样的问题：利用了上述转化的技术难以有效且高效地对生产PUFA的脂质生产菌进行育种。
具体来说，采用上述(a)通过颗粒轰击法转化丝状菌的技术时，作为转化对象的上述A.nidulans或N.crassa等丝状菌的脂质生产性能低，因此不适用于工业生产PUFA等脂质。
而在上述(b)文献4中公开的技术是对公知的可以在工业上利用的脂质生产菌M.alpina进行转化的技术。因此，与上述(a)的技术相比，可认为该技术更适合在工业上应用。
然而，以M.alpina为代表的被孢霉属的菌类，并不全是潮霉素敏感性。因此用该技术进行育种时，当作为宿主的被孢霉属菌是潮霉素抗性时，就不能用潮霉素抗性作为标记。
大多数PUFA是必须脂肪酸，因参与生物体内复杂的生理功能，近年来作为重要的营养素而受到关注。因此，人们渴求能更加高效地生产PUFA的发酵技术，为此，高效且有效地对可靠性高的脂质生产菌被孢霉属菌类进行育种的技术成为必须。
本发明鉴于上述课题而完成，其目的在于提供不通过抗生素且可以有效并高效地进行被孢霉属脂质生产菌的育种的育种方法。
发明内容
本发明人等鉴于上述课题进行了潜心研究，结果发现：若能获得作为脂质生产菌的被孢霉属菌类的营养缺陷型菌株，并以与该营养缺陷性互补的基因为标记基因建立可转化的系统，那么不仅可以高效且有效地转化被孢霉属菌类的全部菌株，利用该系统还可以自身克隆，能够更加高效且有效地进行育种，从而完成了本发明。
本发明涉及的脂质生产菌的育种方法是被孢霉属(Mortierella)脂质生产菌的育种方法，其特征为，其包含具有基因导入步骤和筛选步骤的转化过程，所述基因导入步骤以上述脂质生产菌的营养缺陷型菌株为宿主，以与上述营养缺陷性互补的基因为标记基因，将该标记基因导入宿主；所述筛选步骤以上述宿主营养缺陷性的回复为标记，筛选转化株。
在上述育种方法中，上述脂质生产菌优选Mortierella alpina、Mortierella hygrophila或Mortierella chlamydospora，上述营养缺陷型菌株优选尿嘧啶缺陷型菌株，上述标记基因优选采用乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因或乳清酸核苷酸焦磷酰酶基因。
而且，在上述育种方法中，基因导入步骤可以采用电穿孔法或颗粒轰击法。
进而，在上述育种方法中，还可以包含从原种的脂质生产菌中获得营养缺陷型菌株的营养缺陷型菌株获得过程。
本发明的其他目的、特征及优点，可以通过以下说明而充分理解。而且，通过以下结合附图的说明，可以明白本发明的有益效果。
具体实施方式
下面说明本发明的实施方式之一，但本发明并不限于此。
在本发明中，作为育种中制备含有遗传变异的群体的过程(群体制备过程)，实施以营养缺陷性为标记的转化过程。具体为获得作为脂质生产菌的被孢霉属菌类的营养缺陷型菌株，将其作为宿主，导入与上述营养缺陷性互补的基因(转化)。然后，以上述宿主营养缺陷性的回复为标记，从上述群体中筛选转化株。
下面，对作为本发明对象的被孢霉属的菌类、本发明涉及的育种方法及其利用，分别详细地进行说明
(1)被孢霉属的菌类
作为本发明育种方法的对象的被孢霉属菌类，没有特殊限制，可以是归类于被孢霉属的各种丝状菌。被孢霉属可分为Mortierella和Micromucor两个亚属。Mortierella亚属的菌类均生产花生四烯酸等碳原子数为20的脂肪酸，而Micromucor亚属只生产碳原子数为18或18以下的脂肪酸。作为本发明的对象的被孢霉属菌类，可以是上述两个亚属中的任何一种。
作为被孢霉属的菌类，具体来说，已知有：M.alpina、M.elongata、M.exigua、M.hygrophila、M.isabelina、M.turficola、M.gamsii、M.cogitans、M.capitata、M.vinacea、M.chlamydospora等，当然并不限于这些。其中，在本发明中，可优选采用作为脂质生产菌被广泛使用的M.alpina。已知M.alpina在菌体内蓄积以花生四烯酸(ARA)为代表的PUFA，而且M.alpina不仅被用于PUFA生物合成的研究，还被广泛地用于PUFA的工业生产。
对包含上述M.alpina的被孢霉属菌类的获得方法，没有特殊限制，可以从财团法人发酵研究所或ATCC(American Type Culture Collection)等的微生物等的寄存机关获得。或者，如果是进行了专利申请的菌株，可以从独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄存中心获得。此外，还可以使用从自然环境中通过公知的筛选方法获得的被孢霉属的未知菌株。
(2)本发明涉及的脂质生产菌的育种方法
本发明涉及的育种方法，优选包含在上述群体制备过程中实施转化的转化过程，更优选包含营养缺陷型菌株获得过程。当然，还可以包含其他的过程。下面，对各个过程进行详细说明。
<营养缺陷型菌株获得过程>
对营养缺陷型菌株获得过程没有特殊限制，只要是从原种的被孢霉属菌中获得营养缺陷型菌株(营养缺陷型突变株)的过程即可，可以采用用于获得营养缺陷型菌株的公知技术。特别是，当与营养缺陷性相关的基因明了时(例如，全长基因组解读等)，通过破坏其基因就可以容易地获得营养缺陷型菌株，因此成为优选方法。
对营养缺陷型菌株的具体种类没有特殊限制，例如，可以列举：亮氨酸、组氨酸、蛋氨酸、精氨酸、色氨酸、赖氨酸等的氨基酸缺陷型菌株；尿嘧啶、腺嘌呤等的核酸碱基缺陷型菌株；维生素缺陷型菌株等。在本发明中，如后述实施例中所述，采用尿嘧啶缺陷型菌株。尿嘧啶缺陷型菌株具有以下优点：特别是被孢霉属菌类，可实施以5-氟乳清酸(5-FOA)抗性为正筛选标记的筛选。
因此，在营养缺陷型菌株获得过程中，可以只通过得到在缺损特定营养素的合成培养基中不能生长的菌株，获得营养缺陷型菌株，也可以通过实施限定突变基因的筛选，获得营养缺陷型菌株。例如尿嘧啶缺陷型菌株的获得，其采用上述5-FOA实施筛选，可以获得URA3基因或URA5基因发生了突变的尿嘧啶缺陷型菌株。同样地例如赖氨酸缺陷型菌株的获得，其采用氨基己二酸实施筛选，可以获得LYS2基因或LYS5基因发生了突变的赖氨酸缺陷型菌株。按上述方法，只要获得限定了突变基因的营养缺陷型菌株，就可以确定在之后的转化过程中使用的标记基因，因此成为优选方法。
<转化过程1·基因导入步骤>
转化过程如上所述，其为在育种的群体制备过程中实施转化的过程，至少包括基因导入步骤和筛选步骤这两个步骤。当然，根据需要，还可以包括除了这些步骤以外的其他步骤。
对本发明中的基因导入步骤没有特殊限制，只要是以被孢霉属菌类(脂质生产菌)的营养缺陷型菌株为宿主，采用与上述营养缺陷性互补的基因作为标记基因，将该标记基因导入宿主的步骤即可。
对上述标记基因没有特殊限制，只要是与营养缺陷型菌株的突变(营养缺陷性突变)互补的基因即可。具体可列举：亮氨酸缺陷型菌株时可采用leu2基因；组氨酸缺陷型菌株时可采用his3基因；赖氨酸缺陷型菌株时可采用lys2基因；色氨酸缺陷型菌株时可采用trp1基因；尿嘧啶缺陷型菌株时可采用ura3基因或ura5基因；腺嘌呤缺陷型菌株时可采用ade2基因等。在本发明中，如后述实施例中所述，以尿嘧啶缺陷型菌株为宿主，用ura5基因作为标记基因。
对上述各标记基因的获得方法也没有特殊限制，可以采用公知的方法从酵母等异种(微)生物中获得，也可以利用市售的标记基因。此外，在本发明中，可以自身克隆，因此还可以从作为宿主的被孢霉属菌中获得标记基因。例如，在后述的实施例中，利用三种酵母中ura5基因的碱基序列，从作为宿主的M.alpina中获得ura5基因。
对上述基因导入步骤中使用的基因导入方法(转化方法)没有特殊限制，可采用电穿孔法或颗粒轰击法等以往公知的方法。采用电穿孔法转化被孢霉属的菌类时，优选先将菌体原生质体化。另外，作为上述颗粒轰击法的具体例子之一，可以是基因枪法，当然并不限于此。
上述标记基因只要以能够表达的方式被导入被孢霉属菌体内即可，因此对其具体结构没有特殊限制。在本发明中，构建至少连有启动子的表达盒，进而在该表达盒上连接与染色体重组的区域(称为重组区域)，构建成基因构建物。因此，上述基因构建物可以插入载体后再被导入上述宿主，也可以以原样被直接导入。
上述基因构建物中含有的标记基因的表达盒，在标记基因上游至少连有启动子，优选还在标记基因的下游连有终止子。而且，在上述基因构建物中，除了上述标记基因的表达盒以及重组区域外，可以导入使各种基因表达的表达盒，因此还可以含有多克隆位点。在上述基因构建物中还可以含有除了上述标记基因的表达盒(启动子、标记基因、终止子)、重组区域或多克隆位点以外的DNA片段，对上述基因构建物的更加具体的结构没有特殊限制。
对上述各DNA片段的具体种类也没有特殊限制。例如，启动子只要能使标记基因有效地表达即可，对其没有特殊限制，可以采用适宜的公知启动子。在后述的实施例中，采用hisH4.1启动子，当然并不限于此。同样地，对终止子也没有特殊限制，只要其具有转录终止部位的功能即可，可以是公知的终止子。在后述的实施例中，采用trpC终止子，当然并不限于此。此外，对重组区域也没有特殊限制，只要是把被导入到被孢霉属菌体内的标记基因整合到染色体内的DNA片段即可。在后述的实施例中，采用18S核糖体DNA(18Sr)。
对上述基因构建物整合到载体中构成表达载体，也没有特殊限制，一般的重组表达载体即可。可采用质粒、噬菌体或黏粒等制备重组表达载体，并没有特殊限制。而且，可以采用公知的方法制备重组表达载体。通常，可以优选使用质粒。
<转化过程2·筛选步骤>
对转化过程中的筛选步骤没有特殊限制，只要是以上述宿主营养缺陷性的回复为标记筛选转化体的步骤即可，可以采用适宜的公知方法。即，基于营养缺陷性标记，除去合成培养基中特定的营养素，将经上述基因导入步骤后得到的转化体在合成培养基中培养即可。按上述方法，可以容易且高效地筛选转化体。
如上所述，在本发明的转化过程中，采用营养缺陷性作为标记。营养缺陷性标记具有操作简便、背景低、能够利用来自作为宿主的被孢霉属菌的基因等优点。而且，与抗生素抗性标记相比，营养缺陷性标记还具有适用于食品开发等优点。
具体来说，例如以背景技术中所述上述文献4的技术即以潮霉素抗性作标记为例，为了使筛选得到的转化体稳定地生长，须在培养基中添加潮霉素。因此，用该转化体生产得到的脂质中有可能混入潮霉素，但当脂质在食品中使用时，应该避免潮霉素的混入。
在此以营养缺陷性为尿嘧啶缺陷性的尿嘧啶缺陷型菌株为例，在实际生产中，采用尿嘧啶缺损的培养基实施培养，因此在筛选导入了与ura5基因等的营养缺陷性互补的基因的菌体的同时，可以生产脂质。即，如果以营养缺陷性作为标记，不仅可以避免潮霉素的混入，还可以在培养时经常地进行筛选。因此，更优选如本发明这样采用营养缺陷性标记。
<筛选过程>
在本发明涉及的脂质生产菌的育种方法中，上述转化过程以营养缺陷性为标记，通过导入各种各样的基因，可以获得表现各种性状的菌株的群体。因此，在本发明中，在上述转化过程后，可以实施筛选过程，即从获得的群体中筛选性状更优良的品种。另外，这里所谓的“筛选过程”与上述转化过程中的“筛选步骤”不同，这里所谓的“筛选过程”不是以营养缺陷性为标记筛选转化株，是从得到的多株转化株中筛选性状更优良的转化株。
对筛选过程的具体方法没有特别限制，根据育种的目的，设定能够筛选出性状优良的转化株的条件，通过公知的方法筛选优良的转化株即可。
(3)本发明的利用
本发明涉及的脂质生产菌的育种方法如上所述，以营养缺陷性为标记，从含有遗传变异的群体中筛选性状更优良的品种。因此，以被孢霉属的脂质生产菌为原种，可以高效且有效地生产新品种(新菌株)。被孢霉属菌类作为脂质生产菌而广为人知，因其包含M.alpina这样可靠性高的菌类，可以容易且高效地生产脂质生产性能进一步提高的菌株。
而且，在本发明涉及的育种方法中，只采用将要进行转化的脂质生产菌的基因就可以转化，因而可以自身克隆。因此，在本发明中，从原种的被孢霉属菌类中获得适宜的DNA片段，将该DNA片段导入营养缺陷型菌株，可以调节特定基因的表达(高表达、调节表达的时期、抑制表达等)，可以获得新菌株即获得能使脂质生产量增加、生产的脂质的种类改变、组成改变等的转化体。当然，本发明也可以不通过自身克隆，将来自其他种的DNA片段导入营养缺陷型菌株。
在本发明涉及的育种方法中，例如在自身克隆时，对从原种(宿主)被孢霉属菌类中获得适宜的DNA片段的方法没有特殊限制，可以采用公知的方法。而且，对这里所述的适宜的DNA片段(例如，想要导入的基因等)没有特殊限制，只要是在被孢霉属宿主菌中可以表现更优良的目的性状的DNA片段，或有可能表现该性状的DNA片段即可。
该DNA片段与上述ura5基因一样，至少与启动子连接、优选还与终止子连接构建表达盒后，插入到重组表达载体中，但并不限于此。在后述的实施例中，采用GLELO基因作为上述DNA片段，当然，本发明并不限于此。
下面，结合实施例更加具体地说明本发明，但本发明并不限于此。
[实施例1]
在本实施例中，对本发明涉及的育种方法的例子之一即获得尿嘧啶缺陷型菌株、将其转化后实施筛选的具体例子进行说明。
(1)尿嘧啶缺陷型菌株的获得(营养缺陷型菌株获得过程)
为了形成M.alpina的孢子，将本菌植菌到Czapek-Dox培养基(3％蔗糖、0.2％NaNO3、0.1％KH2PO4、0.05％KCl、0.05％MgSO4·7H2O、0.001％FeSO4·7H2O、2％琼脂、pH值调至6.0)，在28℃下，培养约2周。将其悬浮在吐温80水溶液中(1drop/100mL H2O)，通过玻璃过滤器(GlassFilter)(岩城硝子公司制造，商品号：3G1)除去菌丝，制成孢子液。采用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，按照Jareonkitmongkol等的方法(S.Jareonkitmongkol et al.JAOCS，69，939-944，1992)，对1×108～1×109个孢子进行突变处理。
将经突变处理后的孢子涂布在含有1.0mg/mL 5-FOA和0.05mg/mL尿嘧啶的GY培养基上(2％葡萄糖、1％酵母提取物、2％琼脂、pH值调至6.0)，在28℃下，培养4天，得到6株5-FOA抗性株。对这些菌株进行尿嘧啶缺陷性的评价。
即，比较这些菌株在SC培养基(无氨基酸无硫酸铵酵母氮源(Difco公司制造)5.0g、(NH4)2SO41.7g、葡萄糖20g、琼脂20g、腺嘌呤20mg、酪氨酸30mg、蛋氨酸1.0mg、精氨酸2.0mg、组氨酸2.0mg、赖氨酸4.0mg、色氨酸4.0mg、苏氨酸5.0mg、异亮氨酸6.0mg、亮氨酸6.0mg、苯基丙氨酸6.0mg/L)和添加了尿嘧啶的SC培养基(尿嘧啶50mg/L)上的生长情况。
其结果为，6株5-FOA抗性株与亲株一样均可以在含尿嘧啶的培养基上生长，而在不含尿嘧啶的培养基上，生长情况不好，其中有2株完全不能生长。将这两株分别命名为Δura-1株、Δura-2株。
(2)酶活性的测定
可以认为当表现5-FOA抗性且尿嘧啶缺陷性这样的表型时，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(由ura3基因编码的酶，略写为ura3p)或乳清酸核苷酸焦磷酰酶(由ura5基因编码的酶，略写为ura5p)失活。因此，测定了上述Δura-1株以及Δura-2株中这些酶的活性。
将各菌株在添加了尿嘧啶的GY培养基中在28℃下振荡培养4天。改良Wynn等的方法(J.P.Wynn et al.Microbiology，146，2325-2331，2000)制备菌体的无细胞提取液。
即，把在含有0.05mg/mL尿嘧啶的GY液体培养基中在28℃下培养了4天的菌体，悬浮在含有5mMβ-巯基乙醇的0.1M Tris缓冲液(pH 7.5)中。然后，在35MPa下用弗氏压碎器(French press)破碎细胞，离心。得到的上清液作为无细胞提取液。再于100,000×g超离心60min除去细胞器，得到可溶性组分。
用得到的可溶性组分，根据Yoshimoto等的方法(A.Yoshimoto etal.Methods in Enzymology Vol 51，74-79，ACADEMIC PRESS 1978)，测定了ura3p的活性。用同样得到的可溶性组分，根据Umezu等的方法(K.Umezu et al.J.Biochem.，70，249-262，1971)，测定了ura5p的活性。其结果即与嘧啶生物合成相关的酶的活性的比较在表1中显示。表1的结果表明，这两株任何一株的ura3p的活性都与亲株相同，但均未检测出ura5p的活性。
进而又对另外制备好的108～109个孢子进行了同样的突变处理，得到5株5-FOA抗性株，其中，有3株在不含尿嘧啶的培养基中完全不生长。
[表1]
  株   Ura3p(mU/mg)   Ura5p(mU/mg)
  wild type   15.2   20.2
  Δura-1   12.6   -
  Δura-2   21.2   -
※-：不被查出
(3)M.alpina的基因组DNA的获得以及cDNA文库的制作
分别将M.alpina和以此为原种(wild type)诱导的尿嘧啶缺陷型菌株(上述Δura-1株及Δura-2株)在GY液体培养基中在28℃下培养5天，按照Sakuradani等的方法(E.Sakuradani etal.Eur.J.Biochem.，260，208-216，1999)，从得到的菌体中制备基因组DNA。
将M.alpina的孢子植菌到液体培养基(2％葡萄糖、1％酵母提取物、pH值调至6.0)，在28℃下培养4天。回收菌体，用盐酸胍/氯化铯法制备总RNA。用Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(From TotalRNA)(商品名，TAKARABIO公司制造)从总RNA中纯化mRNA，用ZAP-cDNASynhesis Kit(商品名、STRATAGENE公司制造)制作cDNA文库。
(4)从M.alpina中获得ura5cDNA
关于三种酵母Glomerella graminicola、Saccharomyces cerevisiae以及Sordaria macrospora的ura5p的氨基酸序列，基于其同源性极高的两个区域的以下氨基酸序列，
区域1：FGPAYKGIP(参照序列号1)
区域2：KEAKDHGEG(参照序列号2)合成了含有以下碱基序列的正义引物和反义引物。另外，下述引物中的I表示次黄苷(inosine)。此外，在序列表中，与次黄苷相当的部位用n表不。
正义引物：5’-TTYGGHCCIGCITAYAARGGHATYCC-3’(序列号3)
反义引物：5’-CCCTCDCCRTGRTCYTTIGCYTCYTT-3’(序列号4)
接着，通过T Gradient Thermocycler(商品名，Biometra公司制造)，以M.alpina的基因组DNA为模板，采用上述两个引物，采用Ex Taqpolymerase(TAKARABIO公司制造)进行PCR。此时的PCR条件为：以94℃下1分钟、52℃下1分钟以及72℃下2分钟为一个循环，35个循环后，在72℃下延伸10分钟。
结果得到约130bp的DNA片段，并确定了该DNA片段的碱基序列。该DNA片段显示出了与已知ura5基因的高同源性。以该DNA片段为探针，通过噬菌斑杂交筛选(3)中制备的M.alpina的cDNA文库，从而获得了质粒pBMAURA5，该质粒含有M.alpina的ura5基因的eDNA。
另外，ura5基因的cDNA含有序列号5所示的碱基序列，由该ura5基因所编码的ura5p含有序列号6所示的氨基酸序列。
(5)ura5基因组DNA的克隆
基于上述ura5基因的cDNA序列(序列号5)，合成了以下所示引物CRON1和CRON2，
引物CRON1：CTTCTCTTCAGCCCCCAGCCGCATCGGTCC(序列号7)
引物CRON2：GAGTCCACGAAAACTGCTGATGAGCAGCAC(序列号8)以M.alpina的基因组DNA为模板，通过PCR克隆了ura5基因组DNA。此时的PCR条件为：以94℃下1分钟、55℃下1分钟以及72℃下2分钟为一个循环，30个循环后，在72℃下延伸10分钟。其结果表明，在ura5基因组基因上不存在内含子。
(6)营养缺陷型菌株的突变部位的确定
用上述引物CRON1以及CRON2，分别以尿嘧啶缺陷型菌株Δura-1株以及Δura-2株的基因组DNA为模板，进行PCR，克隆了各菌株的ura5基因组基因。此时的PCR条件为：以94℃下1分钟、55℃下1分钟以及72℃下2分钟为一个循环，30个循环后，在72℃下延伸10分钟。其结果为，在Δura-1株中，从启始密码子开始数的第93位碱基位点插入了一个腺嘌呤碱基，在ORF内引起移码突变(frame shift)。而在Δura-2株中，第398位的鸟嘌呤被腺嘌呤取代，基序内第133位的甘氨酸被天冬氨酸取代。这些突变的结果说明上述两株菌株的ura5p已经失活。
(7)重组表达载体：pDura5的构建
用限制酶NcoI以及BamHI酶解质粒pD4(D.B.Archer等转让，参照前述文献4)，用DNA Blunting Kit(商品名，TAKARABIO公司制造)将末端平滑化后，用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(商品名、AMERSHAM BIOSCIENCE公司制造)纯化除去潮霉素B抗性基因hptmod片段的5.4kbp DNA片段。用限制酶EcoRI以及XhoI酶解在(4)中得到的上述pBMAURA5，末端平滑化后，纯化含有ura5 cDNA的约0.65kbp的片段。将上述两个片段用ligation high(商品名，东洋纺公司制造)连接。确认ura5基因的方向，选择ura5基因的5’上游连有his H 4.1启动子且3’下游连有trpC终止子的作为质粒pDura5。
(8)pDura5的转化(转化过程)
用SC琼脂培养基作为转化株的选择培养基。将作为宿主的Δura-1株的108个孢子涂布在SC琼脂培养基上。通过颗粒轰击法将上述pDura5导入(转化)宿主。PDS-1000/He Particle Delivery System(商品名，BIO RAD公司制造)的基因导入在氦气压力为7590kPa(1100psi)、轰击室(chamber)内真空且为28英寸汞柱、目标距离为3cm、钨颗粒的粒径为1.1μm的条件下进行。基因导入后，在28℃下，培养2～3天，长出4个菌落，即得到转化株。另外，为方便起见，对这些转化株编号，编为#1～#4。
通过PCR确认了在转化株#1～#4中有无导入基因。即，制备各转化株的基因组DNA，以此作为模板，采用以下所示引物RDNA1以及RDNA2
引物RDNA1：ACAGGTACACTTGTTTAGAG(序列号9)
引物RDNA2：CGCTGCGTTCTTCATCGATG(序列号10)
和Ex Taq polymerase(TAKARABIO公司制造)进行PCR。此时的PCR条件为：以94℃下1分钟、54℃下1分钟以及72℃下1分钟为一个循环，35个循环后，在72℃下延伸10分钟。另外，作为对比，同样地通过PCR确认了Δura-1株中有无导入基因。
其结果为，在Δura-1宿主株中没有发现DNA的扩增，而在转化株#1～#4中均发现有1.5kbp的DNA片段的扩增。由此可证实，上述#1～#4的18SrDNA区域发生了与质粒pDura5的重组，ura5基因被导入。
此外，将上述转化株#1～#4在SC液体培养基中在28℃下振荡培养4天，测定ura5p酶活性。其结果即ura5p酶活性的比较在表2中显示。表2的结果表明，在转化株#1～#4中，ura5p酶活性回复到与野生型(wildtype)相同或是其数倍，导入的ura5基因有效地起作用。
[表2]
  株   Ura5p
  wild type   59.0
  转化株#1   556.0
  转化株#2   45.6
  转化株#3   55.2
  转化株#4   295.0
进而又对约108个Δura-1株的孢子进行了两次相同的基因导入操作，在28℃下培养2～3天，分别长出3个及4个菌落，证实了转化具有再现性。
[实施例2]
在本实施例中，对通过利用了实施例1中构建的尿嘧啶缺陷型菌株的育种方法而研制出新菌株即GLELO基因导入菌株的例子进行说明。
(1)pDura5GLELO载体的构建
将γ-亚麻酸转化成双高-γ-亚麻酸的脂肪酸碳链延长酶的编码基因，基于J.M.Parker-Barnes et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97(15)，8284-8289，2000上记载的序列GB的ID为AF206662的碱基序列，以M.alpina的cDNA为模板，通过PCR扩增获得。此时，采用以下所示引物MAGLELO1和MAGLELO2。
引物MAGLELO1：CCATGGATGGAGTCGATTGCGCCATTCC(序列号11)
引物MAGLELO2：GGATCCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(序列号12)
扩增后的GLELO基因用限制酶NcoI以及BamHI酶解，得到约1kb的片段。用限制酶NcoI以及BamHI酶解pD4，得到约7.7kb的片段。用ligation high(商品名，东洋纺公司制造)连接上述各片段，得到质粒pDGLELO。
另一方面，用EcoRI部分酶解pDura5，纯化得到在两个EcoRI位点中只有一个被切割的约6.2kb的DNA片段。通过DNA Bluntiong Kit(商品名，TAKARABIO公司制造)将该片段末端平滑化后，用ligation high(商品名，东洋纺公司制造)让其自连(self ligation)，选择只留有成为组蛋白4.1启动子的5’上游的位点的作为pDura5’。此外，用EcoRI酶解上述pDGLELO，得到2.7kb的片段，将该片段插入上述pDura5’的EcoRI位点。从中选择GLELO表达盒和ura5表达盒在相同方向上排列的质粒，以此作为重组表达载体pDura5GLELO。
(2)pDura5GLELO的转化(转化过程)
通过与实施例1中的(8)相同的方法，转化Δura-1株，获得3株转化株。另外，为方便起见，对这些转化株编号，编为#5～#7。
与实施例1中的(8)一样，用引物RDNA1以及RDNA2通过PCR确认了这些转化株#5～#7中是否导入了pDura5GLELO。其结果为，3株均有1.5kbp的DNA片段的扩增。由此可知，在上述3株的18SrDNA区域与发生了与pDura5GLELO的重组，ura5基因被导入。
(3)GLELO基因的表达分析
从实施例1中得到的两种ura5基因导入株#1·#2和上述(2)中得到的GLELO基因导入株#5～#7(与进行了脂质分析的菌株同样的培养条件的菌体)中，用RNeasy plant mini kit(商品名，QIAGEN公司制造)提取总RNA。通过SuperScript First-Strand Synthesis System forRT-PCR(商品名，Invitrogen公司制造)，以6碱基随机引物(randomhexamer)为引物，对1μg的总RNA进行逆转录反应，合成了cDNA。以1μL合成的cDNA(1/20量)为模板，采用以下所示引物MAGLELO5以及MAGLELO6
引物MAGLELO5：CTTTGTGGGCATGCAGATCA(序列号13)
引物MAGLELO6：TGAAGATGGAGCTGTGGTGGTA(序列号14)
和Ex Taq polymerase(TAKARABIO公司制造)进行PCR。此时的PCR条件为：94℃下1分钟、55℃下1分钟以及72℃下2分钟为一个循环，20个循环后，在72℃下延伸10分钟。
对得到的PCR产物进行电泳，比较了约300bp片段的条带的荧光浓度。其结果可知，在ura5基因导入株中，两株条带的荧光浓度均非常稀薄，而在GLELO基因导入株中，3株均有明确浓度的条带。另一方面，同样地进行了30个PCR循环后，在任何一株中均可以检出明确浓度的条带。由此可知，在GLELO基因导入株中，GLELO基因的表达量增加。
(4)GLELO基因导入株的脂质分析
分别将实施例1中得到的两种ura5基因导入株#1·#2和上述(2)中得到的GLELO基因导入株#5～#7的孢子植菌到液体培养基上(5％葡萄糖、1％酵母提取物、pH值调至6.0)，在28℃下，振荡培养7天。培养后，通过过滤收集菌体，干燥，称量。用盐酸甲醇法使菌体内的脂肪酸残基甲酯化后，用己烷提取，馏去己烷，用气相色谱法分析得到的脂肪酸甲酯。结果即上述各基因导入株(转化体)培育后的干燥菌体重量、各株菌体内的脂肪酸组成及总脂质生产量在表3中显示。
另外，表中的16:0表示棕榈酸，18:0表示硬脂酸，18:1表示油酸，18:2表示亚油酸，18:3表示γ-亚麻酸，20:3表示双高-γ-亚麻酸，20:4表示花生四烯酸，24:0表示二十四烷酸。
[表3]
  菌株   ura5基因导入株   GLELO基因导入株
  #1   #2   #5   #6   #7
  干燥菌体的重量(mg/培养基1mL)   14.8   11.7   18.1   18.6   16.8
  脂肪酸組成(％)16:018:018:118:218:320:320:424:0其它 23.05.734.06.53.83.816.32.64.3 21.15.933.88.04.13.614.52.66.4 23.16.532.84.51.93.819.33.74.4 22.36.132.45.82.74.120.33.03.3 22.88.130.05.12.44.320.73.03.6
  脂质生产量(mg/培养基1mL)总脂质20:320:4 5.070.200.82 3.480.130.50 7.320.281.41 7.940.331.61 6.330.271.31
  脂质含量(mg/干燥菌体1g)总脂质20:320:4 34213.255.6 29710.642.9 40615.578.1 42717.986.7 37716.178.0
  20:3/18:3比   1.01   0.88   1.99   1.57   1.77
  (20:3+20:4)/18:3比   5.3   4.4   12.0   9.2   10.3
表3的结果表明，导入GLELO基因使干燥菌体的重量增加、双高-γ-亚麻酸和花生四烯酸在总脂肪酸中所占的比例增加、同时γ-亚麻酸的比例减少。而且，总脂质生产量和总脂质含量也增加了，此外，双高-γ-亚麻酸和花生四烯酸的生产量及含量也增加了。碳链延长反应的产物双高-γ-亚麻酸与其底物γ-亚麻酸的比(20:3/18:3的比)，或双高-γ-亚麻酸与双高-γ-亚麻酸的代谢产物花生四烯酸的和与γ-亚麻酸的比((20:3+20:4)/18:3的比)，在GLELO基因导入株中显示出了很大的值。
[实施例3]
在本实施例中，对将本发明涉及的育种方法适用于M.alpina以外的被孢霉属菌类的具体例子进行说明。
(1)尿嘧啶缺陷型菌株的获得(营养缺陷型菌株获得过程)
为了形成M.hygrophila和M.chlamydospora的孢子，将这些菌分别植菌到Czapek-Dox培养基(3％蔗糖、0.2％NaNO3、0.1％KH2PO4、0.05％KCl、0.05％MgSO4·7H2O、0.001％ FeSO4·7H2O、2％琼脂、pH值调至6.0)，在28℃下，培养约2周。将其悬浮在吐温80溶液中(1drop/100mL H2O)，通过玻璃过滤器(Glass Filter)(岩城硝子公司制造，商品号：3G1)除去菌丝，制成孢子液。用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，按照Jareonkitmongkol等的方法(S.Jareonkitmongkol etal.JAOCS，69，939-944，1992)，对1×108～109个孢子进行突变处理。
将突变处理后的孢子涂布在含有1.0mg/mL 5-FOA和0.05mg/mL尿嘧啶的GY培养基上(2％葡萄糖、1％酵母提取物、2％琼脂、pH值调至6.0)，在28℃下培养4天，可以生长的5-FOA抗性株中有2株来自M.hygrophila，有1株来自M.chlamydospora。对这些菌株进行尿嘧啶缺陷性的评价。
即，比较这些菌株在SC培养基(无氨基酸无硫酸铵酵母氮源(Difco公司制造)5.0g、(NH4)2SO41.7g、葡萄糖20g、琼脂20g、腺嘌呤20mg、酪氨酸30mg、蛋氨酸1.0mg、精氨酸2.0mg、组氨酸2.0mg、赖氨酸4.0mg、色氨酸4.0mg、苏氨酸5.0mg、异亮氨酸6.0mg、亮氨酸6.0mg、苯基丙氨酸6.0mg/L)以及添加了尿嘧啶的SC培养基(尿嘧啶50mg/L)上的生长情况。
其结果为，在含有尿嘧啶的培养基上，获得的5-FOA抗性株与亲株一样均可以生长，而在不含尿嘧啶的培养基上，生长情况不好，其中1株M.hygrophila(命名为MH-Δura-1)和1株M.chlamydospora(命名为MC-Δura-1)完全不能生长。
(2)酶活性的测定
将上述2株菌株在添加有尿嘧啶的GY培养基中在28℃下振荡培养4天。改良Wynn等的方法(J.P.Wynn et al.Microbiology，146，2325-2331，2000)制备菌体的无细胞提取液。
即，把在含有0.05mg/mL尿嘧啶的GY液体培养基中在28℃下培养了4天的菌体，悬浮在含有5mMβ-巯基乙醇的0.1M Tris缓冲液(pH 7.5)中。然后，在35MPa下用弗氏压碎器(French press)破碎细胞，离心。得到的上清液作为无细胞提取液。再于100,000×g超离心60min除去细胞器，得到可溶性组分。
用得到的可溶性组分，按照Umezu等的方法(K.Umezu etal.J.Biochem.，70，249-262，1971)，测定乳清酸核苷酸焦磷酰酶(ura5p)活性。其结果为，任意一株的ura5p活性均在检出限以下。
(3)pDura5的转化(转化过程)
将M.hygrophila MH-Δura-1或M.chlamydospora MC-Δura-1植菌到Czapek-Dox培养基，在28℃下培养2周，形成孢子。根据上述(1)中所述的方法，回收孢子。
用SC琼脂培养基作为转化株的选择培养基。用颗粒轰击法将pDura5导入(转化)宿主。采用PDS-1000/He Particle Delivery System(商品名，BIO RAD公司制造)进行基因导入，基因导入的条件为：氦气压力为7590kPa(1100psi)、轰击室内真空：28英寸汞柱、目标距离为3cm、钨颗粒的粒径为1.1μm。基因导入后，在28℃下，培养2～3天，分别长出十多个菌落，即获得转化株。
另外，实施发明的最佳方案中的具体实施方式或实施例能完全说明本发明的技术内容，但不应局限于那样具体的例子被狭义地解释，可根据本发明的精神和所述权利要求项，进行各种改变后实施。
本发明涉及的脂质生产菌的育种方法如上所述，包括转化过程，该转化过程以上述脂质生产菌的营养缺陷型菌株为宿主，采用与所述营养缺陷性互补的基因作为标记基因，将该标记基因导入宿主(基因导入步骤)，以上述宿主营养缺陷性的回复作为标记，筛选转化株(筛选步骤)。由此，本发明可以得到以下效果：以被孢霉属的脂质生产菌为原种，可以高效且有效地生产新品种(新菌株)。本发明还可以得到以下效果：因可以自身克隆，从原种的被孢霉属菌中获得适宜的DNA片段，将其导入营养缺陷型菌株，可以调节特定基因的表达(高表达、调节表达的时期、抑制表达等)，可以获得新菌株即获得可以使脂质生产量增加、改变生产的脂质的种类、改变组成等的转化体。
被孢霉属的菌类作为脂质生产菌而广为人知，而且还包含M.alpina这样可靠性高的菌类。由此，通过本发明可以容易且高效地生产脂质生产性能进一步提高的菌株等。
因此，本发明可以应用在与利用了被孢霉属菌类的各种发酵技术相关的工业、采用了该发酵技术的食品工业、医药品工业上。
                            序列表
<110>三得利株式会社(SUNTORY LIMITED)
<120>脂质生产菌的育种方法(Breeding method of Lipid product mold)
<130>SU0410/PCT
<150>JP 2003-299345
<151>2003-08-22
<160>14
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：引物序列的基序(Description of Artificial Sequence：Motif for Primer Sequence)
<400>1
Phe Gly Pro Ala Tyr Lys Gly Ile Pro
  1               5
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述：引物序列的基序(Description of Artificial Sequence：Motif for Primer Sequence)
<400>2
Lys Glu Ala Lys Asp His Gly Glu Gly
  1               5
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>n
<222>9
<220>
<221>n
<222>12
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequence：Artificially Synthesized Primer Sequence)
<400>3
ttygghccng cntayaargg hatycc                                         26
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>n
<222>18
<220>
<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequence：Artificially Synthesized Primer Sequence)
<400>4
ccctcdccrt grtcyttngc ytcytt                                         26
<210>5
<211>925
<212>DNA
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>5
acaaccttct cctcagcccc cagccgcatc ggtcccaccg ccgcaaccca tcagcacaca   60
atggccatca aggattacca gcgcgagttc attgagtttg ccatcaagaa cgaggtcttg   120
aagtttggag agttcaccct caagtccggc cgtatctccc cctacttcct gaacgcgggt   180
ctcttcaaca ctggcgcttc gctctccaag atcggaaagt tctacgccgc tgccgtcaac   240
gactcgggca ttgagcacga catcatcttt ggccccgctt acaagggtgt ccctcttgcc   300
tgcaccaccg tcattgcctt ggccgaggcc ccctacaaca aggacacgcc ttactgcttc   360
aaccgcaagg aaaagaagga ccatggcgag ggtggcacga ttgtcggatc ggcgttggag   420
ggcaaggtcc tggtcattga cgatgttatc accgccggta ccgccatccg cgagtctgtt   480
caaatcatcg aggactgcaa ggcccaattg gccggtgttt tggtggcggt ggatcgtcag   540
gagactggca agaacggcga catgtctgct atccaggagg tcgagaggga tttcggtgtc   600
cctgtcaagg ccattgtgac catgacccac atcatgcagt acatggagga gaagggtacc   660
tatggcgagc acttgactca gatgcgcacc taccgcgaga agtacggtgt ttaaggcaaa   720
tctaaatggg ataaggtccg gtataatgcg gcgagggaag gttctgttgg aaaatctcat   780
aatgcgggga gattgacatc ggggaacgat gtgctgctca tcagcagttt tcgtggactc   840
tcgggacagg ccttcctggg aatccagaca ataatcatta ataaatacca ataacaatca   900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                                         925
<210>6
<211>217
<212>PRT
<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400>6
Met Ala Ile Lys Asp Tyr Gin Arg Glu Phe Ile Glu Phe Ala Ile Lys
  1               5                  10                  15
Asn Glu Val Leu Lys Phe Gly Glu Phe Thr Leu Lys Ser Gly Arg Ile
             20                  25                  30
Ser Pro Tyr Phe Leu Asn Ala Gly Leu Phe Asn Thr Gly Ala Ser Leu
         35                  40                  45
Ser Lys Ile Gly Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Val Asn Asp Ser Gly Ile
    50                  55                  60
Glu His Asp Ile Ile Phe Gly Pro Ala Tyr Lys Gly Val Pro Leu Ala
65                  70                  75                  80
Cys Thr Thr Val Ile Ala Leu Ala Glu Ala Pro Tyr Asn Lys Asp Thr
                 85                  90                  95
Pro Tyr Cys Phe Asn Arg Lys Glu Lys Lys Asp His Gly Glu Gly Gly
            100                 105                 110
Thr Ile Val Gly Ser Ala Leu Glu Gly Lys Val Leu Val Ile Asp Asp
        115                 120                 125
Val Ile Thr Ala Gly Thr Ala Ile Arg Glu Ser Val Gln Ile Ile Glu
    130                 135                 140
Asp Cys Lys Ala Gln Leu Ala Gly Val Leu Val Ala Val Asp Arg Gln
145                 150                 155                 160
Glu Thr Gly Lys Asn Gly Asp Met Ser Ala Ile Gln Glu Val Glu Arg
                165                 170                 175
Asp Phe Gly Val Pro Val Lys Ala Ile Val Thr Met Thr His Ile Met
            180                 185                 190
Gln Tyr Met Glu Glu Lys Gly Thr Tyr Gly Glu His Leu Thr Gln Met
        195                 200                 205
Arg Thr Tyr Arg Glu Lys Tyr Gly Val
    210                 215
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Claims (6)

1.脂质生产菌的育种方法，其为被孢霉属(Mortierella)脂质生产菌的育种方法，其特征为，其包含具有基因导入步骤和筛选步骤的转化过程，所述基因导入步骤，以所述脂质生产菌的营养缺陷型菌株为宿主，以与所述营养缺陷性互补的基因作为标记基因，将该标记基因导入宿主；所述筛选步骤，以所述宿主营养缺陷性的回复为标记，筛选转化株。
2.如权利要求1所述的脂质生产菌的育种方法，其特征为，所述脂质生产菌为Mortierella alpina、Mortierella hygrophila或Mortierella chlamydospora。
3.如权利要求1或2所述的脂质生产菌的育种方法，其特征为，所述营养缺陷型菌株为尿嘧啶缺陷型菌株。
4.如权利要求3所述的脂质生产菌的育种方法，其特征为，所述标记基因采用乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因或乳清酸核苷酸焦磷酰酶基因。
5.如权利要求1～4任意一项所述的脂质生产菌的育种方法，其特征为，所述基因导入步骤采用电穿孔法(Electroporation)或颗粒轰击法(Particle Delivery)。
6.如权利要求1～5任意一项所述的脂质生产菌的育种方法，其特征为，还包含从原种的脂质生产菌中获得营养缺陷型菌株的营养缺陷型菌株获得过程。
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