CN110747133B - 一株头孢被孢霉、包括头孢被孢霉的菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一株头孢被孢霉、包括头孢被孢霉的菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株头孢被孢霉、包括头孢被孢霉的菌剂及其制备方法和应用，属于微生物菌剂技术领域；所述头孢被孢霉的保藏编号为：CGMCC No.18560。本发明的头孢被孢霉通过提高玉米根系活力、提高土壤环境中微生物活力和增加土壤孔隙率，能够促进玉米生长。本发明的头孢被孢霉能够在土壤中自行生长繁殖，与土著微生物群落达到生态稳定平衡，无需重复添加。本发明的头孢被孢霉来源于长期进行秸秆还田的农田土壤，可以实现绿色生态农业，以确保食品的优质性与安全性。本发明的头孢被孢霉的扩大培养过程操作简单，成本低廉，能够制备成微生物菌剂，在农业领域推广应用。

Description

一株头孢被孢霉、包括头孢被孢霉的菌剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，尤其涉及一株头孢被孢霉、包括头孢被孢霉的菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
土壤腐殖物质是经过微生物的作用后，由多酚和多醌类物质聚合而成的含芳环结构的有机高分子化合物，是土壤有机质的主体。土壤腐殖质的形成是土壤微生物活动的结果，部分学者认为腐殖质的芳香环来源于微生物的合成。真菌能够分解、利用及合成结构不同的有机碳，也可以直接和间接地影响有机碳的难降解性(Six J，2006)。研究表明土壤腐殖质中至少一半的碳来源于真菌菌丝及其代谢物而非地上部凋落物(Clemmensen et al.,2013)。土壤腐殖质形成过程中的关键酶过氧化酶，也是真菌胞外和胞内黑化素合成的关键酶，黑化素的含量与土壤有机碳的储量显著正相关(Siletti et al.,2017)。黑化素在真菌残体中的存在类似于木质素在植物残体的存在，能显著延长真菌的残体的降解时间，有效促进真菌来源的有机碳在土壤中的封存(Fernandez and Koide,2014；Fernandez et al.,2016)。
接合菌门真菌是土壤腐生真菌重要组成部分，其进化水平较低，生长迅速。在长期施加有机物料的条件下，其丰度提升幅度非常大，其中被孢霉属真菌甚至达到10倍以上，成为统治性优势真菌(Sun et al.,2016；Li et al.,2018)。然而，接合菌门真菌在土壤碳封存中的作用研究极其缺乏。被孢霉属真菌在发酵行业已经得到一些应用，其中，高山被孢霉和长孢被孢霉作为工业发酵生产花生四烯酸等不饱和脂肪酸的高效菌株。2014年日本研究者报道了头孢被孢霉在发酵产神经酸上的应用(Umemoto et al.,2014)。但是头孢被孢霉在农业上没有得到应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一株头孢被孢霉、包括头孢被孢霉的菌剂及其制备方法和应用，该株头孢被孢霉及其菌剂通过提高玉米根系活力、提高土壤环境中微生物活力和增加土壤孔隙率，能够促进玉米生长。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株头孢被孢霉Mortierella capitata F2，保藏编号为：CGMCCNo.18560。
本发明还提供了一种包括上述方案所述头孢被孢霉的菌剂。
本发明还提供了上述方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述头孢被孢霉接种于PD液体培养基，于25～30℃，120～180rpm的条件下培养7～10d，得到发酵混合物；
2)将所述发酵混合物接种于发酵培养基，于25～30℃条件下培养5～20d，得到菌剂；
所述发酵培养基包括以下重量份的成分：玉米秸秆75～85份、豆饼粉12～18份、葡萄糖醛酸2～3份、硫酸铵2～3份和水90～110份。
优选的，所述PD液体培养基包括以下质量份的成分：去皮马铃薯180～220份、葡萄糖18～22份和水900～1100份。
本发明还提供了上述方案所述头孢被孢霉或者所述菌剂在促进玉米生长中的应用。
本发明还提供了上述方案所述头孢被孢霉或者所述菌剂在提高玉米根系活力中的应用。
本发明还提供了上述方案所述头孢被孢霉或者所述菌剂在增加土壤孔隙率中的应用。
本发明还提供了上述方案所述头孢被孢霉或者所述菌剂在提高土壤环境中微生物活力中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一株头孢被孢霉Mortierella capitata F2，保藏编号为：CGMCC No.1850。本发明的头孢被孢霉通过提高玉米根系活力、提高土壤环境中微生物活力和增加土壤孔隙率，能够促进玉米生长。本发明的头孢被孢霉具有长效性，能够在土壤中自行生长繁殖，与土著微生物群落达到生态稳定平衡，无需重复添加。本发明的头孢被孢霉具有生态环境安全性，该株头孢被孢霉来源于长期进行秸秆还田的农田土壤，可以实现绿色生态农业，以确保食品的优质性与安全性。本发明的头孢被孢霉具有可操作性，该株头孢被孢霉的扩大培养过程操作简单，成本低廉，能够制备成微生物菌剂，在农业领域推广应用。应用结果表明，土壤环境下，接种本发明的头孢被孢霉，抽雄期玉米生物量提高了20.1％，玉米叶绿素指标SPDA值增加了17.4％，说明该菌株直接促进了玉米的生长；耕作层土壤孔隙度增加了2.25个百分点，氧含量显著降低了0.34个百分点，表明玉米根系和土壤微生物呼吸作用增强；基因组数据表明，头孢被孢霉含有大量的碳固定基因和黑化素合成基因，有提高土壤有机碳的潜力。
附图说明
图1为基因组测序显示的头孢被孢霉F2关键基因；
图2为头孢被孢霉F2在PDA平板上的生长情况及显微结构；
图3为头孢被孢霉F2在土壤表层生长情况；
图4为头孢被孢霉F2在无碳源培养基上的生长情况；
图5为实施例2和对比例1的玉米的实物图，其中右边三株为实施例2中的玉米植株，左边三株为对比例1中的玉米植株。
生物保藏说明
头孢被孢霉(Mortierella capitata)F2，于2019年10月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.18560。
具体实施方式
本发明提供了一株头孢被孢霉Mortierella capitata F2，保藏编号为：CGMCCNo.18560。所述头孢被孢霉是从河南省原阳县的国家潮土肥力肥效试验中长期秸秆还田处理耕层土壤中分离、培养获得，ITS1区Sanger测序序列为：CATAGCTTTCGTACGTGACCTGCGGAAGGTCATTCACAATAAGAGTGTTTATGGCACTCTTTCAAAAAATCCATACCCACCTTGTGTGCAATGTAAAAAAAAAAAGGAGTTTTCTTGTGGTTTGGGAGTGAAAGTTGTTTTACAACGCTCATTTTTTTTTCCCTCAAAAAACACTTTTTTTTCATTTCATATACCCCTTTCTATAATTTTCCTATTGTCTGAAGTACTTGGAATAAATATAATTCTAAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATAAAAAACGCAACC，基因组测序显示的头孢被孢霉关键基因参见图1，由图1可以看出，头孢被孢霉F2含有大量的碳固定基因和黑化素合成基因，并且在无碳源培养基上出现较快的生长，具有有提高土壤有机碳累积的潜力。图2显示所述头孢被孢霉F2为莲花状菌落，从显微结构看，部分菌丝呈藕节，接合孢子较少，多为2条菌丝接合，测量发现接合孢子直径10um左右，菌丝直径2～6um，菌丝少分叉，圆形孢囊孢子多顶生或侧生，直径4～7um；图3显示所述头孢被孢霉可以在土壤中快速生长；所述头孢被孢霉在在无碳源培养基上的生长情况参见图4。其耕作制度为小麦-玉米轮作；该土壤质地组成为：粘粒16.1％、粉粒50.7％、砂粒33.2％，粘土矿物组成(<2μm)为：蒙脱石10.0％、高岭石21.0％、绿泥石25％、水云母29％、蛭石10％、其它5.0％，表层土壤养分指标为：pH 8.1、土壤有机碳10.42g/kg、全氮12.53g/kg、有效磷24.85mg/kg。
本发明还提供了一种包括上述方案所述头孢被孢霉的菌剂。
本发明还提供了上述方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述头孢被孢霉接种于PD液体培养基，于25～30℃，120～180rpm的条件下培养7～10d，得到发酵混合物；
2)将所述发酵混合物接种于发酵培养基，于25～30℃条件下培养5～20d，得到菌剂，活菌数量达到105cfu/g；
所述发酵培养基包括以下重量份的成分：玉米秸秆75～85份、豆饼粉12～18份、葡萄糖醛酸2～3份、硫酸铵2～3份和水90～110份。
本发明首先将所述头孢被孢霉接种于PD液体培养基，于25～30℃，120～180rpm的条件下培养7～10d，得到发酵混合物；所述头孢被孢霉保存于PDA培养基；本发明对所述头孢被孢霉的接种量没有特殊限制，采用本领域常规接种量即可；所述PD液体培养基优选的包括以下质量份的成分：去皮马铃薯180～220份、葡萄糖18～22份和水900～1100份，pH自然；更优选的，所述PD液体培养基包括以下质量份的成分：去皮马铃薯200份、葡萄糖20份和水1000份；所述培养的温度优选为28℃；所述培养的转速优选为150rpm；所述培养的时间优选为8～9d，以出现大量白色絮状菌丝球为准。
得到发酵混合物后，本发明将所述发酵混合物接种于发酵培养基，于25～30℃条件下培养5～10d，得到菌剂；所述发酵混合物的接种量优选为每100mL发酵培养基接种5～10mL发酵培养物，更优选的接种6mL发酵培养物；所述培养的时间优选为28℃；所述培养的时间优选为10～15d，本发明具体实施过程中，所述培养的方式为静置培养，在培养2d时对培养的混合物混合摇匀一次以增加菌的生长点，再进行培养；所述发酵培养基优选的包括以下质量份的组分：玉米秸秆80份、豆饼粉15份、葡萄糖醛酸2.5份、硫酸铵2.5份和水100份，pH自然；所述玉米秸秆优选的经过粉碎处理，秸秆长度范围2～5mm；所述发酵培养基优选的采用以下方法制备获得：将所述葡萄糖醛酸、硫酸铵和水混合得到溶液，将所述溶液和豆饼粉、玉米秸秆混合后，于121℃条件下灭菌20min，得到发酵培养基。
本发明还提供了上述方案所述头孢被孢霉或者所述菌剂在促进玉米生长中的应用。
本发明还提供了上述方案所述头孢被孢霉或者所述菌剂在提高玉米根系活力中的应用。
本发明还提供了上述方案所述头孢被孢霉或者所述菌剂在增加土壤孔隙率中的应用。
本发明还提供了上述方案所述头孢被孢霉或者所述菌剂在提高土壤环境中微生物活力中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1一种包括本发明所述头孢被孢霉的菌剂
1.接种在PDA培养基上生长旺盛的菌丝块(头孢被孢霉在PDA平板上的生长情况及显微结构参见图2)至PD液体培养基中，置于恒温摇床28℃、150rpm培养8d，出现大量菌丝球，得到发酵混合物；
2.无菌条件下取6mL发酵混合物加入100g发酵培养基(秸秆-豆饼粉-葡萄糖醛酸培养基)中，立即摇匀；置于28℃静置培养2d，之后再次摇匀；28℃培养箱继续培养5～10d，即得到菌剂。
采用的PD液体培养基配方为：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL；发酵培养基(秸秆-豆饼粉-葡萄糖醛酸培养基)配方为：粉碎玉米秸秆80g、豆饼粉15g、葡萄糖醛酸2.5g、硫酸铵2.5g，水100mL，水溶解葡萄糖醛酸和硫酸铵后加入豆饼粉湿润30min后，再加入秸秆拌匀，装入500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
实施例2
1.将生长良好的头孢被孢霉接种至PD液体培养基中，28℃、220rpm摇床黑暗培养5d，得到发酵混合物。
2.将发酵混合物接种到灭过菌的发酵培养基(秸秆-豆饼粉-葡萄糖醛酸培养基)中，28℃静置黑暗培养，直到菌丝完全覆盖培养基。
3.将不同三角瓶中菌丝取出，混匀后即为菌剂。
4.充分浇水后进行玉米(登海605)种植，于三叶期定苗，每盆留1株。玉米于人工气候室中进行培养。培养条件为14h光照(28℃)，10h黑暗(20℃)，相对湿度70％。期间按需浇水除草。抽雄期进行土壤有机质养分、玉米植株生物量以及玉米根系激素含量的测定。测定结果参见表1和图5。
对比例1
1.准确称取灭菌处理的秸秆豆饼粉葡萄糖醛酸培养基20g，加入10kg土壤中，充分混匀后装盆。
2.充分浇水后进行玉米(登海605)种植，于三叶期定苗，每盆留1株。玉米于人工气候室中进行培养。培养条件为14h光照(28℃)，10h黑暗(20℃)，相对湿度70％。期间按需浇水除草。抽雄期进行土壤有机质养分、玉米植株生物量以及玉米根系激素含量的测定。测定结果参见表1和图5(图5为实施例2和对比例1的玉米的实物图，其中右边三株为实施例2中的玉米植株，左边三株为对比例1中的玉米植株)。
表1接种头孢被孢霉对土壤和植物指标的影响
Figure BDA0002277238280000061
N＝4.*表示p＜0.05水平上的显著性，**表示p＜0.01水平上的显著性。
由表1可以看出，土壤环境下，接种头孢被孢霉，抽雄期玉米生物量提高了20.1％，玉米叶绿素指标SPDA值增加了17.4％，说明该菌株直接促进了玉米的生长；耕作层土壤孔隙度增加了2.25个百分点，氧含量显著降低了0.34个百分点，氧气含量降低的原因是由于根系和土壤微生物呼吸作用的增强引起的。
由图5可以看出，对照处理玉米处于营养生长阶段，头孢被孢霉的加入显著促进了玉米株高的增加，促进玉米的发育，玉米开始抽雄。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一株头孢被孢霉、包括头孢被孢霉的菌剂及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catagctttc gtacgtgacc tgcggaaggt cattcacaat aagagtgttt atggcactct 60
ttcaaaaaat ccatacccac cttgtgtgca atgtaaaaaa aaaaaggagt tttcttgtgg 120
tttgggagtg aaagttgttt tacaacgctc attttttttt ccctcaaaaa acactttttt 180
ttcatttcat ataccccttt ctataatttt cctattgtct gaagtacttg gaataaatat 240
aattctaaaa tacaactttc aacaacggat ctcttggctc tcgcatcgat aaaaaacgca 300
acc 303

Claims (6)

1.一株头孢被孢霉（Mortierella capitata）F2，保藏编号为：CGMCC No.18560。
2.一种包括权利要求1所述头孢被孢霉的菌剂。
3.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1）将所述头孢被孢霉接种于PD液体培养基，于25~30℃，120~180rpm的条件下培养7~10d，得到发酵混合物；
2）将所述发酵混合物接种于发酵培养基，于25~30℃条件下培养5~20d，得到菌剂；
所述发酵培养基包括以下重量份的成分：玉米秸秆75~85份、豆饼粉12~18份、葡萄糖醛酸2~3份、硫酸铵2~3份和水90~110份。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述PD液体培养基包括以下质量份的成分：去皮马铃薯180~220份、葡萄糖18~22份和水900~1100份。
5.权利要求1所述头孢被孢霉或者权利要求2所述菌剂在促进玉米生长中的应用。
6.权利要求1所述头孢被孢霉或者权利要求2所述菌剂在增加耕作层土壤孔隙率中的应用。
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