JPH07143894A - タンパク質の生産方法 - Google Patents
タンパク質の生産方法Info
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- JPH07143894A JPH07143894A JP5293554A JP29355493A JPH07143894A JP H07143894 A JPH07143894 A JP H07143894A JP 5293554 A JP5293554 A JP 5293554A JP 29355493 A JP29355493 A JP 29355493A JP H07143894 A JPH07143894 A JP H07143894A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 選択マーカー遺伝子を含有し、資化性タンパ
ク質あるいは生育上必須となるタンパク質をコードする
遺伝子を欠失させたサーマス属菌を、非耐熱性タンパク
質をコードする構造遺伝子が該選択マーカー遺伝子のフ
ランキング領域ではさまれたＤＮＡで形質転換して相同
部位組換えを行い、次いで昇温して該選択マーカー遺伝
子の欠失及び非耐熱性構造遺伝子を発現する形質転換体
を選択し、更に該形質転換体を培養して、該非耐熱性構
造遺伝子のコードする非耐熱性タンパク質を耐熱性タン
パク質として発現させることによりタンパク質を生産す
る。 【効果】 本発明の方法により、耐熱性の付与が望まれ
る非耐熱性のタンパク質を、人為的に耐熱化することが
できる。
ク質あるいは生育上必須となるタンパク質をコードする
遺伝子を欠失させたサーマス属菌を、非耐熱性タンパク
質をコードする構造遺伝子が該選択マーカー遺伝子のフ
ランキング領域ではさまれたＤＮＡで形質転換して相同
部位組換えを行い、次いで昇温して該選択マーカー遺伝
子の欠失及び非耐熱性構造遺伝子を発現する形質転換体
を選択し、更に該形質転換体を培養して、該非耐熱性構
造遺伝子のコードする非耐熱性タンパク質を耐熱性タン
パク質として発現させることによりタンパク質を生産す
る。 【効果】 本発明の方法により、耐熱性の付与が望まれ
る非耐熱性のタンパク質を、人為的に耐熱化することが
できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換え技術によ
り、非耐熱性タンパク質をコードする遺伝子を高熱性菌
であるサーマス属菌中において発現させ、耐熱性タンパ
ク質を生産させる方法に関する。
り、非耐熱性タンパク質をコードする遺伝子を高熱性菌
であるサーマス属菌中において発現させ、耐熱性タンパ
ク質を生産させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする問題点】一般
に、タンパク質は熱に対して不安定である。しかし、高
熱性菌はその生育温度が５０℃以上と高く、その菌が有
する酵素は、そのような高い生育温度付近で最大活性を
示す。また、高熱性菌の構成タンパク質は、高い生育温
度において十分高次構造を保っている。
に、タンパク質は熱に対して不安定である。しかし、高
熱性菌はその生育温度が５０℃以上と高く、その菌が有
する酵素は、そのような高い生育温度付近で最大活性を
示す。また、高熱性菌の構成タンパク質は、高い生育温
度において十分高次構造を保っている。
【０００３】そこで通常の酵素に見られるように、常温
では安定だが高温では不安定なタンパク質を、高い温度
においても安定にその機能を発現するようなタンパク質
に置き換えることができれば、その酵素などのタンパク
質を使用した系が安定化され、特に発酵産業等の工業的
なプロセスにおいて有益に使用され得ると考えられた。
では安定だが高温では不安定なタンパク質を、高い温度
においても安定にその機能を発現するようなタンパク質
に置き換えることができれば、その酵素などのタンパク
質を使用した系が安定化され、特に発酵産業等の工業的
なプロセスにおいて有益に使用され得ると考えられた。
【０００４】近年、種々の高熱性菌から各種タンパク質
が分離精製され、常温で安定なタンパク質と同様な機能
を有するタンパク質が幾つか見いだされている。しかし
このような方法では見いだされるタンパク質の種類や数
は制限されており、十分には実用化されていないのが現
状である。常温では安定だが高温では不安定な酵素など
のタンパク質を、人工的に、高い温度においても安定に
その機能を発現するような耐熱性のタンパク質に変える
ことができれば、それらタンパク質の利用範囲は著しく
広がる。
が分離精製され、常温で安定なタンパク質と同様な機能
を有するタンパク質が幾つか見いだされている。しかし
このような方法では見いだされるタンパク質の種類や数
は制限されており、十分には実用化されていないのが現
状である。常温では安定だが高温では不安定な酵素など
のタンパク質を、人工的に、高い温度においても安定に
その機能を発現するような耐熱性のタンパク質に変える
ことができれば、それらタンパク質の利用範囲は著しく
広がる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、先に選
択マーカー遺伝子としてイソプロピルリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子を用いて、選択マーカー遺伝子と非耐熱
性構造遺伝子のキメラタンパク質を耐熱化する方法を発
明した（特開平４−２５２１９３号公報）。本願発明者
らは、選択マーカー遺伝子として、挿入、欠失両方にポ
ジティブ選択マーカーとなるものを用いることにより、
野生株、欠損株の両方がポジティブ選択でき、更に、非
耐熱性外来タンパク質をコードする遺伝子を開始コドン
から終止コドンまでを入れ替えると、該遺伝子がコード
する非耐熱性のタンパク質が耐熱化できることを見出
し、本発明を完成するに至った。
択マーカー遺伝子としてイソプロピルリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子を用いて、選択マーカー遺伝子と非耐熱
性構造遺伝子のキメラタンパク質を耐熱化する方法を発
明した（特開平４−２５２１９３号公報）。本願発明者
らは、選択マーカー遺伝子として、挿入、欠失両方にポ
ジティブ選択マーカーとなるものを用いることにより、
野生株、欠損株の両方がポジティブ選択でき、更に、非
耐熱性外来タンパク質をコードする遺伝子を開始コドン
から終止コドンまでを入れ替えると、該遺伝子がコード
する非耐熱性のタンパク質が耐熱化できることを見出
し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち本発明の要旨は、選択マーカー遺
伝子を含有し、資化性タンパク質あるいは生育上必須と
なるタンパク質をコードする遺伝子を欠失させたサーマ
ス属菌を、非耐熱性タンパク質をコードする構造遺伝子
が該選択マーカー遺伝子のフランキング領域ではさまれ
たＤＮＡで形質転換して相同部位組換えを行い、次いで
昇温して該選択マーカー遺伝子の欠失及び非耐熱性構造
遺伝子を発現する形質転換体を選択し、更に該形質転換
体を培養して、該非耐熱性構造遺伝子のコードする非耐
熱性タンパク質を耐熱性タンパク質として発現させるこ
とを特徴とするタンパク質の生産方法に存する。
伝子を含有し、資化性タンパク質あるいは生育上必須と
なるタンパク質をコードする遺伝子を欠失させたサーマ
ス属菌を、非耐熱性タンパク質をコードする構造遺伝子
が該選択マーカー遺伝子のフランキング領域ではさまれ
たＤＮＡで形質転換して相同部位組換えを行い、次いで
昇温して該選択マーカー遺伝子の欠失及び非耐熱性構造
遺伝子を発現する形質転換体を選択し、更に該形質転換
体を培養して、該非耐熱性構造遺伝子のコードする非耐
熱性タンパク質を耐熱性タンパク質として発現させるこ
とを特徴とするタンパク質の生産方法に存する。
【０００７】以下、本発明につき詳細に説明する。 選択マーカー遺伝子（以下、「マーカー遺伝子」と
略記する） 本発明で使用されるマーカー遺伝子としては、挿入、欠
失両方にポジティブ選択マーカーとなるものであれば特
に制限はされない。具体的には、オロチジン−５−フォ
スフェイトピロフォスフォリラーゼ（以下、「ｐｙｒ
Ｅ」と略記する）が挙げられる。ｐｙｒＥは、例えばサ
ーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ） ＨＢ２７が有する染色体ＤＮＡより調
製することができる。
略記する） 本発明で使用されるマーカー遺伝子としては、挿入、欠
失両方にポジティブ選択マーカーとなるものであれば特
に制限はされない。具体的には、オロチジン−５−フォ
スフェイトピロフォスフォリラーゼ（以下、「ｐｙｒ
Ｅ」と略記する）が挙げられる。ｐｙｒＥは、例えばサ
ーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ） ＨＢ２７が有する染色体ＤＮＡより調
製することができる。
【０００８】マーカー遺伝子ｐｙｒＥを含有するＤＮＡ
ライブラリーとしては、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＨＢ２７から調製してきた染色体ＤＮＡを用いて、適
当な制限酵素で切断後、ｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ，３３，
１０３−１１９（１９８５））等のプラスミドにクロー
ニングし、常法により大腸菌に形質転換する（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８２）ｐ２４９，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｓ．）。このライブラリーを用い、サーマス菌ｐｙｒＥ
欠損株の復帰を指標として、サーマス菌野生型ｐｙｒＥ
を大腸菌上にクローニングできる。更に、上記のスクリ
ーニング陽性のコロニーから、Ｓａｎｇｅｒらのジデオ
キシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４，５４６３（１９７７））によって、目的とす
るＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントの塩基配列が決定で
きる。
ライブラリーとしては、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＨＢ２７から調製してきた染色体ＤＮＡを用いて、適
当な制限酵素で切断後、ｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ，３３，
１０３−１１９（１９８５））等のプラスミドにクロー
ニングし、常法により大腸菌に形質転換する（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８２）ｐ２４９，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｓ．）。このライブラリーを用い、サーマス菌ｐｙｒＥ
欠損株の復帰を指標として、サーマス菌野生型ｐｙｒＥ
を大腸菌上にクローニングできる。更に、上記のスクリ
ーニング陽性のコロニーから、Ｓａｎｇｅｒらのジデオ
キシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４，５４６３（１９７７））によって、目的とす
るＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントの塩基配列が決定で
きる。
【０００９】 宿主 本発明で用いられる宿主は、選択マーカー遺伝子を含有
し、サーマス属菌由来でその資化性タンパク質あるいは
生育上必須となるタンパク質をコードする遺伝子を欠失
した、または欠失させたサーマス属菌である。耐熱化さ
せたい非耐熱性のタンパク質がサーマス属菌の資化にと
って必要なタンパク質の場合、宿主からそのタンパク質
をコードする遺伝子、あるいはその資化経路に関与して
それを失った場合生育できず、耐熱化の目的の外来タン
パク質が発現した場合生育できる、というようなタンパ
ク質をコードする遺伝子を欠失させなければならない。
例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を欠失させ、
フランキング領域（５’側と３’側の近傍領域）だけを
挿入したプラスミドを用いて野生株を形質転換させ、そ
の後相同部位組換えを行うことにより容易に得ることが
できる。本発明で用いられる宿主は、非耐熱性タンパク
質をコードする構造遺伝子がマーカー遺伝子のフランキ
ング領域ではさまれたＤＮＡで形質転換し、相同部位組
換えが行われるとマーカー遺伝子欠損株となる。マーカ
ー遺伝子としてｐｙｒＥを用いた場合は、ｐｙｒＥ遺伝
子欠損株となり、ウラシル要求性となる。同時に５−フ
ルオロオロト酸（以下、「５ＦＯＡ」と略記する）耐性
となる。従って、５ＦＯＡ耐性株をいくつか得、その中
から安定したウラシル要求変異株を選択することによ
り、容易に相同部位組換え体株を得ることができる。
し、サーマス属菌由来でその資化性タンパク質あるいは
生育上必須となるタンパク質をコードする遺伝子を欠失
した、または欠失させたサーマス属菌である。耐熱化さ
せたい非耐熱性のタンパク質がサーマス属菌の資化にと
って必要なタンパク質の場合、宿主からそのタンパク質
をコードする遺伝子、あるいはその資化経路に関与して
それを失った場合生育できず、耐熱化の目的の外来タン
パク質が発現した場合生育できる、というようなタンパ
ク質をコードする遺伝子を欠失させなければならない。
例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を欠失させ、
フランキング領域（５’側と３’側の近傍領域）だけを
挿入したプラスミドを用いて野生株を形質転換させ、そ
の後相同部位組換えを行うことにより容易に得ることが
できる。本発明で用いられる宿主は、非耐熱性タンパク
質をコードする構造遺伝子がマーカー遺伝子のフランキ
ング領域ではさまれたＤＮＡで形質転換し、相同部位組
換えが行われるとマーカー遺伝子欠損株となる。マーカ
ー遺伝子としてｐｙｒＥを用いた場合は、ｐｙｒＥ遺伝
子欠損株となり、ウラシル要求性となる。同時に５−フ
ルオロオロト酸（以下、「５ＦＯＡ」と略記する）耐性
となる。従って、５ＦＯＡ耐性株をいくつか得、その中
から安定したウラシル要求変異株を選択することによ
り、容易に相同部位組換え体株を得ることができる。
【００１０】 発現ベクター 上記の宿主を形質転換するために本発明で使用するＤ
ＮＡの特徴は、耐熱性タンパク質として生産させたい外
来タンパク質を、記載の選択マーカー遺伝子の５´側
と３´側の近傍領域、即ちフランキング領域で挟まれた
ＤＮＡ断片を含むことにある。本発明においては、かか
るＤＮＡは、形質転換の中で核外遺伝子として存在させ
て発現させるのではなく、後述の相同部位組換えによっ
て染色体の選択マーカー遺伝子の位置に組み込み発現さ
せるので、選択マーカー遺伝子と非耐熱性構造遺伝子が
該選択マーカー遺伝子のフランキング領域で挟まれたＤ
ＮＡ断片は、宿主の染色体と相同部位組換えし得る形態
であれば特に制限はない。もとよりかかるＤＮＡ断片を
発現ベクターに組み込んで使用してもよい。
ＮＡの特徴は、耐熱性タンパク質として生産させたい外
来タンパク質を、記載の選択マーカー遺伝子の５´側
と３´側の近傍領域、即ちフランキング領域で挟まれた
ＤＮＡ断片を含むことにある。本発明においては、かか
るＤＮＡは、形質転換の中で核外遺伝子として存在させ
て発現させるのではなく、後述の相同部位組換えによっ
て染色体の選択マーカー遺伝子の位置に組み込み発現さ
せるので、選択マーカー遺伝子と非耐熱性構造遺伝子が
該選択マーカー遺伝子のフランキング領域で挟まれたＤ
ＮＡ断片は、宿主の染色体と相同部位組換えし得る形態
であれば特に制限はない。もとよりかかるＤＮＡ断片を
発現ベクターに組み込んで使用してもよい。
【００１１】 外来非耐熱性構造遺伝子 耐熱化される外来非耐熱性構造遺伝子とは、常温では正
常な蛋白機能を有するが、温度を上げるに従ってその機
能が低下し、ついには失われてしまうようなタンパク質
をコードするような遺伝子である。好ましくは、そのタ
ンパク質の機能がサーマス属菌の資化にとって必要であ
るもの、あるいは生育のために必須であるものである。
例えば、Ｃ源としてラクトースのみを用いたとき必要と
なるβ−ガラクトシターゼや、生育培地に抗生物質カナ
マイシンを入れたとき必須となるカナマイシンヌクレオ
チジルトランスフェラーゼなどが挙げられる。
常な蛋白機能を有するが、温度を上げるに従ってその機
能が低下し、ついには失われてしまうようなタンパク質
をコードするような遺伝子である。好ましくは、そのタ
ンパク質の機能がサーマス属菌の資化にとって必要であ
るもの、あるいは生育のために必須であるものである。
例えば、Ｃ源としてラクトースのみを用いたとき必要と
なるβ−ガラクトシターゼや、生育培地に抗生物質カナ
マイシンを入れたとき必須となるカナマイシンヌクレオ
チジルトランスフェラーゼなどが挙げられる。
【００１２】宿主の形質転換 宿主の形質転換は、例えば、Ｙ．Ｋｏｙａｍａら（Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６６，３３８−３４０（１９
８６））の報告した方法に従って行うことができる。形
質転換させる時、ＤＮＡまたは、形質転換させたい遺伝
子を持つプラスミドを保持する菌（例えば大腸菌）を培
養液に混ぜるが、その時の温度は約５０℃から８０℃の
適度なものを選び培養する。また、形質転換に用いる培
養液としてはサーマス属菌用最少培地を用い、カルシウ
ムイオン、マグネシウムイオン等の２価のイオン濃度
を、それぞれ１〜３ｍＭに調製することにより、形質転
換の効率を上げることができるので好ましい。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６６，３３８−３４０（１９
８６））の報告した方法に従って行うことができる。形
質転換させる時、ＤＮＡまたは、形質転換させたい遺伝
子を持つプラスミドを保持する菌（例えば大腸菌）を培
養液に混ぜるが、その時の温度は約５０℃から８０℃の
適度なものを選び培養する。また、形質転換に用いる培
養液としてはサーマス属菌用最少培地を用い、カルシウ
ムイオン、マグネシウムイオン等の２価のイオン濃度
を、それぞれ１〜３ｍＭに調製することにより、形質転
換の効率を上げることができるので好ましい。
【００１３】 相同部位組換え 上記のようにして形質転換し、約５０〜８０℃の温度
の条件下において相同部位組換えを行う。例えば、染色
体ＤＮＡの選択マーカー遺伝子のフランキング領域と発
現ベクター中の該フランキング領域との相同の２つの領
域が組換えを起こし、染色体上に発現ベクター中の非耐
熱性構造遺伝子が組み込まれる。
の条件下において相同部位組換えを行う。例えば、染色
体ＤＮＡの選択マーカー遺伝子のフランキング領域と発
現ベクター中の該フランキング領域との相同の２つの領
域が組換えを起こし、染色体上に発現ベクター中の非耐
熱性構造遺伝子が組み込まれる。
【００１４】この組換えは、形質転換後、サーマス属菌
用最少培地プレートで、約５０〜７０℃の温度の条件下
で２４〜４８時間培養している間に起こる。充分に相同
組換えを行わせるため、再度、同じ培地プレートで同じ
条件下で培養し、続いてサーマス属菌用栄養培地で約６
０〜７０℃で１２〜２４時間培養後、最後にサーマス属
菌用最少培地で約６０〜８０℃の温度の条件の下で４８
〜９６時間培養する。このように、培養を繰り返し行う
ことは、相同組換えを充分に行わせるのに効果的である
のと同時に、導入した非耐熱性構造遺伝子を、耐熱性の
構造遺伝子に変えるのに効果的である。また、効率よく
非耐熱性構造遺伝子を耐熱性の構造遺伝子に変えるため
には、培養菌体に変異処理を行えばよい。具体的には、
例えば、紫外線照射、エチジウムブロマイド処理、ニト
ロソグアニジン処理等が挙げられる。ニトロソグアニジ
ン処理の場合、好熱菌を好熱菌栄養培地に植え継ぎ、ニ
トロソグアニジン（０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ程度）を加
え、生育限界温度より高い温度で一晩からに二晩培養す
ればよい。
用最少培地プレートで、約５０〜７０℃の温度の条件下
で２４〜４８時間培養している間に起こる。充分に相同
組換えを行わせるため、再度、同じ培地プレートで同じ
条件下で培養し、続いてサーマス属菌用栄養培地で約６
０〜７０℃で１２〜２４時間培養後、最後にサーマス属
菌用最少培地で約６０〜８０℃の温度の条件の下で４８
〜９６時間培養する。このように、培養を繰り返し行う
ことは、相同組換えを充分に行わせるのに効果的である
のと同時に、導入した非耐熱性構造遺伝子を、耐熱性の
構造遺伝子に変えるのに効果的である。また、効率よく
非耐熱性構造遺伝子を耐熱性の構造遺伝子に変えるため
には、培養菌体に変異処理を行えばよい。具体的には、
例えば、紫外線照射、エチジウムブロマイド処理、ニト
ロソグアニジン処理等が挙げられる。ニトロソグアニジ
ン処理の場合、好熱菌を好熱菌栄養培地に植え継ぎ、ニ
トロソグアニジン（０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ程度）を加
え、生育限界温度より高い温度で一晩からに二晩培養す
ればよい。
【００１５】 目的のタンパク質が発現している形質
転換体を得る手順 上記のように形質転換を行った後、例えば、後述の実施
例に示すようなサーマス属用最少培地プレートで形質転
換の時より５〜１５℃程度低いか同じ温度で、２４〜４
８時間位培養する。生育してきたものを、同培地プレー
トで今度は、形質転換後の最初の培養より５〜１０℃高
いか、同じくらいの温度で、２４〜４８時間培養する。
ここで生育してきた菌をサーマス属菌用の栄養培地で充
分培養し、該菌が生育できる範囲のなるべく高い温度
（この場合は組み込む非耐熱性タンパク質の性質によ
る）の条件下でサーマス属菌用最少培地を用い、４８〜
９６時間培養する。
転換体を得る手順 上記のように形質転換を行った後、例えば、後述の実施
例に示すようなサーマス属用最少培地プレートで形質転
換の時より５〜１５℃程度低いか同じ温度で、２４〜４
８時間位培養する。生育してきたものを、同培地プレー
トで今度は、形質転換後の最初の培養より５〜１０℃高
いか、同じくらいの温度で、２４〜４８時間培養する。
ここで生育してきた菌をサーマス属菌用の栄養培地で充
分培養し、該菌が生育できる範囲のなるべく高い温度
（この場合は組み込む非耐熱性タンパク質の性質によ
る）の条件下でサーマス属菌用最少培地を用い、４８〜
９６時間培養する。
【００１６】このような、培養の繰り返しや培地の種類
を途中で変えることは、必ずしもこの通りやらなくても
よいが、重要なのはこのような方法を行うことによって
相同部位組換えや、導入された非耐熱性構造遺伝子を耐
熱性構造遺伝子に転換させることを、充分に行わせるこ
とにある。生育してきた菌を単離して染色体に目的の該
遺伝子が組み込まれているかどうかをサザンハイブリダ
イゼーション等の方法を用いて調べ、該形質転換体から
組み込まれた非耐熱性構造遺伝子がコードするタンパク
質を精製し耐熱性を調べる。例えば、それが酵素なら、
高い温度（５０−８０℃）における活性を調べて耐熱度
を測定し、耐熱性を持った目的のタンパク質が得られて
いることを確認する。
を途中で変えることは、必ずしもこの通りやらなくても
よいが、重要なのはこのような方法を行うことによって
相同部位組換えや、導入された非耐熱性構造遺伝子を耐
熱性構造遺伝子に転換させることを、充分に行わせるこ
とにある。生育してきた菌を単離して染色体に目的の該
遺伝子が組み込まれているかどうかをサザンハイブリダ
イゼーション等の方法を用いて調べ、該形質転換体から
組み込まれた非耐熱性構造遺伝子がコードするタンパク
質を精製し耐熱性を調べる。例えば、それが酵素なら、
高い温度（５０−８０℃）における活性を調べて耐熱度
を測定し、耐熱性を持った目的のタンパク質が得られて
いることを確認する。
【００１７】
【発明の効果】本発明の方法により、耐熱性の付与が望
まれる非耐熱性のタンパク質を、人為的に耐熱化するこ
とができる。
まれる非耐熱性のタンパク質を、人為的に耐熱化するこ
とができる。
【００１８】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実
施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例に
おける操作は、特に記載する場合を除き次のＩ−VII の
方法に従った。 Ｉ 制限酵素によるＤＮＡの切断は、市販されている制
限酵素を用い、その標品に示されている組成の緩衝液を
用い、１μｇのＤＮＡに対して２単位の酵素を使用し
て、３７℃で１時間反応させた。
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実
施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例に
おける操作は、特に記載する場合を除き次のＩ−VII の
方法に従った。 Ｉ 制限酵素によるＤＮＡの切断は、市販されている制
限酵素を用い、その標品に示されている組成の緩衝液を
用い、１μｇのＤＮＡに対して２単位の酵素を使用し
て、３７℃で１時間反応させた。
【００１９】II 大腸菌の形質転換はＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）ｐ２４９，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ．に記載の方法
に、大腸菌からのプラスミドの精製は、同ｐ．８６の記
載の方法に従った。
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）ｐ２４９，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ．に記載の方法
に、大腸菌からのプラスミドの精製は、同ｐ．８６の記
載の方法に従った。
【００２０】III Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの
連結は、以下のようにして行った。連結する２個の断片
は、１μｇ／１０μｌになるように、連結緩衝液（６６
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６．６ｍＭの
ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのジチオスレイトールからなる）
に溶解し、６６μＭのＡＴＰを加え、さらにＴ４リガー
ゼを０．１単位／μｇ−ＤＮＡとなるように加えて、４
℃で１８時間反応させた。
連結は、以下のようにして行った。連結する２個の断片
は、１μｇ／１０μｌになるように、連結緩衝液（６６
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６．６ｍＭの
ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのジチオスレイトールからなる）
に溶解し、６６μＭのＡＴＰを加え、さらにＴ４リガー
ゼを０．１単位／μｇ−ＤＮＡとなるように加えて、４
℃で１８時間反応させた。
【００２１】IV ＤＮＡ溶液からのＤＮＡ精製のために
は、次のような操作を行う。反応液等のＤＮＡを含む溶
液に対し等量のフェノール／クロロホルムを加えた後激
しく混和し、遠心分離操作により核酸を含む水層を回収
するいわゆるフェノール／クロロホルム抽出を行う。こ
の様にして得られた水層に、１／１０量の３Ｍ酢酸ナト
リウムもしくは等量の４Ｍ酢酸アンモニウムと水層の２
倍容のエタノールを加えて混和し、−２０℃で一晩もし
くは−８０℃で１５分以上静置した後、１５０００回転
で遠心を行い核酸を沈澱物として回収する、いわゆるエ
タノール沈澱を行う。
は、次のような操作を行う。反応液等のＤＮＡを含む溶
液に対し等量のフェノール／クロロホルムを加えた後激
しく混和し、遠心分離操作により核酸を含む水層を回収
するいわゆるフェノール／クロロホルム抽出を行う。こ
の様にして得られた水層に、１／１０量の３Ｍ酢酸ナト
リウムもしくは等量の４Ｍ酢酸アンモニウムと水層の２
倍容のエタノールを加えて混和し、−２０℃で一晩もし
くは−８０℃で１５分以上静置した後、１５０００回転
で遠心を行い核酸を沈澱物として回収する、いわゆるエ
タノール沈澱を行う。
【００２２】Ｖ ＤＮＡのゲルからの切り出しは、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）ｐ１６
４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｓ．に記載の方法に従った。
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）ｐ１６
４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｓ．に記載の方法に従った。
【００２３】VI 好熱菌サーマス属の形質転換は、基本
的にはＹ．Ｋｏｙａｍａら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１６６，３３８−３４０（１９８６））の記載の
方法に従った。また培地組成については、２価イオンの
濃度による影響を考え次のようなものを用いることもで
きる。これをサーマス属菌用最少培地（８ｇポリペプト
ン、４ｇ酵母エキス、２ｇＮａＣｌ／滅菌水１リット
ル；上記組成の他に２ｍＭＭｇＣｌ2 、２ｍＭ ＣａＣ
ｌ2 の濃度で２価イオンが含まれている。これらを混合
後、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調製した）と呼び、用いる
ことにした。またプレートを作製する場合、１Ｌ用の組
成にまず滅菌水５００ｃｃを加え、それとは別にジュラ
ンガム１０ｇ／５００ｃｃを調製し、別々にオートクレ
ーブ後混ぜ合わせ、冷めないうちに（約６０−７０℃以
上あるうちに）シャーレにまく。またジュランガムを溶
かすときに水を加熱しながら、スターラーで攪はんし、
ジュランガムを少しずつ入れ溶かすようにして泡を作ら
ないようにする。この操作は好熱菌を死滅させるのに有
効である。また形質転換する場合でなく、普通の培養の
時は、Ｔａｎａｋａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８
９，６７７−６８２（１９８１））に従い、これをサー
マス属菌用栄養培地として以下に用いた。この培地での
プレートの作製は、前記のプレートの作製方法と同様に
して行った。
的にはＹ．Ｋｏｙａｍａら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１６６，３３８−３４０（１９８６））の記載の
方法に従った。また培地組成については、２価イオンの
濃度による影響を考え次のようなものを用いることもで
きる。これをサーマス属菌用最少培地（８ｇポリペプト
ン、４ｇ酵母エキス、２ｇＮａＣｌ／滅菌水１リット
ル；上記組成の他に２ｍＭＭｇＣｌ2 、２ｍＭ ＣａＣ
ｌ2 の濃度で２価イオンが含まれている。これらを混合
後、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調製した）と呼び、用いる
ことにした。またプレートを作製する場合、１Ｌ用の組
成にまず滅菌水５００ｃｃを加え、それとは別にジュラ
ンガム１０ｇ／５００ｃｃを調製し、別々にオートクレ
ーブ後混ぜ合わせ、冷めないうちに（約６０−７０℃以
上あるうちに）シャーレにまく。またジュランガムを溶
かすときに水を加熱しながら、スターラーで攪はんし、
ジュランガムを少しずつ入れ溶かすようにして泡を作ら
ないようにする。この操作は好熱菌を死滅させるのに有
効である。また形質転換する場合でなく、普通の培養の
時は、Ｔａｎａｋａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８
９，６７７−６８２（１９８１））に従い、これをサー
マス属菌用栄養培地として以下に用いた。この培地での
プレートの作製は、前記のプレートの作製方法と同様に
して行った。
【００２４】VII ＤＮＡの突出末端を平滑末端化する
方法は次のようにして行った。つまり約０．１−２μｇ
のＤＮＡに２０μｌの滅菌水、１０×ｎｉｃｋ ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（この溶液の組成は、
次の文献ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８
２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒの記載の方
法に従った）２．５μｌを加え、更にこの溶液にｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰのそれぞれの濃度が
２ｍＭになっている溶液を１μｌを加え、最後に東洋紡
（株）製のＫｌｅｎｏｗフラグメントを０．５μｌ（５
単位）加え、１６℃、３０分反応させた。
方法は次のようにして行った。つまり約０．１−２μｇ
のＤＮＡに２０μｌの滅菌水、１０×ｎｉｃｋ ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（この溶液の組成は、
次の文献ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８
２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒの記載の方
法に従った）２．５μｌを加え、更にこの溶液にｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰのそれぞれの濃度が
２ｍＭになっている溶液を１μｌを加え、最後に東洋紡
（株）製のＫｌｅｎｏｗフラグメントを０．５μｌ（５
単位）加え、１６℃、３０分反応させた。
【００２５】実施例１ ｐｙｒＥ遺伝子のクローニン
グ 基質となるサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ＨＢ２７の染色体ＤＮ
Ａを、常法に従って調製した。すなわち培養菌体よりフ
ェノール−クロロホルム法 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒに従い、若干の改良を加え以下のごとく調製し
た。
グ 基質となるサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ＨＢ２７の染色体ＤＮ
Ａを、常法に従って調製した。すなわち培養菌体よりフ
ェノール−クロロホルム法 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒに従い、若干の改良を加え以下のごとく調製し
た。
【００２６】サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＢ２７を上記の培地
１００ｍｌに植菌して培養した後集菌し、この菌体をＴ
ＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭＮａＣｌ）で洗浄後ＴＥ（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤ
ＴＡ）５ｍｌに懸濁し、リゾチーム１０ｍｇを加えて３
７℃で３０分間インキュベートした後、凍結−再融解を
繰り返して細胞を破壊した。次に１／２量の１％（ｗ／
ｖ）のＳＤＳを穏やかに振とうしながら加え、更にプロ
テイナーゼＫ（シグマ社製）を終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ
になるように加えて、６０℃で５時間インキュベートす
る。次に等量のＴＥ飽和フェノール・クロロホルムを加
え、一晩室温で穏やかに振とうする。遠心後、上層をと
り等量のクロロホルムを加え再抽出する。遠心後の上層
に等量のエタノールを加えた後ガラス棒でＤＮＡを巻き
とり、７０％、８５％、９９．５％のエタノールで順次
脱水する。次にＤＮＡを３ｍｌのＴＥバッファーに溶解
させた後１００℃、１０分間の加熱処理したＲＮａｓｅ
Ａ水溶液を終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて３
７℃で１時間保温する。その後、フェノール処理、エタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収する。この結果７００μ
ｇの染色体ＤＮＡが得られた。
ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＢ２７を上記の培地
１００ｍｌに植菌して培養した後集菌し、この菌体をＴ
ＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１
ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭＮａＣｌ）で洗浄後ＴＥ（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤ
ＴＡ）５ｍｌに懸濁し、リゾチーム１０ｍｇを加えて３
７℃で３０分間インキュベートした後、凍結−再融解を
繰り返して細胞を破壊した。次に１／２量の１％（ｗ／
ｖ）のＳＤＳを穏やかに振とうしながら加え、更にプロ
テイナーゼＫ（シグマ社製）を終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ
になるように加えて、６０℃で５時間インキュベートす
る。次に等量のＴＥ飽和フェノール・クロロホルムを加
え、一晩室温で穏やかに振とうする。遠心後、上層をと
り等量のクロロホルムを加え再抽出する。遠心後の上層
に等量のエタノールを加えた後ガラス棒でＤＮＡを巻き
とり、７０％、８５％、９９．５％のエタノールで順次
脱水する。次にＤＮＡを３ｍｌのＴＥバッファーに溶解
させた後１００℃、１０分間の加熱処理したＲＮａｓｅ
Ａ水溶液を終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて３
７℃で１時間保温する。その後、フェノール処理、エタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収する。この結果７００μ
ｇの染色体ＤＮＡが得られた。
【００２７】上記のように調製した染色体ＤＮＡ５μｇ
を、制限酵素ＢａｍＨＩでＩの方法に従い反応し、IVの
方法によりＤＮＡを回収した。この切断したＤＮＡを、
Ｉの方法に従い制限酵素ＢａｍＨＩで切断しIVの方法に
よりＤＮＡを回収したプラスミドｐＵＣ１９とIII の方
法で連結した。この連結ベクターを大腸菌ＨＢ１０１に
IIの方法で形質転換した。次にサーマス・サーモフィラ
ス ＨＢ２７を、ウラシル（５０μｇ／ｍｌ）を含むVI
の好熱菌培地プレート上で生育後、紫外線照射を６０秒
行い、７０℃で３時間培養した。ニトロセルロースフィ
ルター（ミリポア社製）にレプリカをとり、５ＦＯＡ
（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含むVIの好熱菌培地プレート上
に移し、７０℃で３時間培養した。このプレート上に生
えてきた５ＦＯＡ耐性株１７個をピックアップし、更に
ウラシルを含まない培地で生えなかった４個のコロニー
をｐｙｒＥ欠損株として選んだ（ＦＯＲ１，４，１３，
１７）。これら４個の株のオロチジン−５−フォスフェ
イト ピロフォスフォリラーゼ（以下「ＯＭＰｐｐａｓ
ｅ」と略記する）、オロチジン−５−フォスフェイト
デカルボキシラーゼ（以下「ＯＭＰｄｃａｓｅ」と略記
する）活性を調べた。ウラシル要求性となるのは、これ
らのどちらかが欠失した場合で、ｐｙｒＥ欠損株はＯＭ
Ｐｐｐａｓｅ活性を失ったものである。各コロニー、Ｆ
ＯＲ１，４，１３，１７をウラシルと５ＦＯＡを含むVI
の好熱菌培地１０ｍｌで一晩培養後、３０００回転、１
０分間で集菌し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）１ｍｌに溶解し、超音波破砕（１００Ｗ，１０
分）行った。ＯＭＰｄｃａｓｅの活性測定は、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ
2 、０．２ｍＭ ＯＭＰをトータル１ｍｌとし、そこに
上記好熱菌抽出物５０μｌを加えて、５０℃でインキュ
ベートし、吸光度２８５ｎｍの減少を測定した。ＯＭＰ
ｐｐａｓｅの活性測定は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．３ｍＭ オ
ロテイト ナトリウム、０．１ｍＭ ＰＲＰＰ（５−ホ
スホリボシル−１−ピロリン酸）をトータル１ｍｌと
し、そこに上記の好熱菌抽出物５０μｌを加えて、５０
℃でインキュベートし、吸光度２９５ｎｍの減少を測定
した。表１に示すように、ＦＯＲ４以外はＯＭＰｐｐａ
ｓｅを失い，ＯＭＰｄｃａｓｅ活性を持っていた。ここ
で１ｕｎｉｔは１μｍｏｌの基質が生産物となる活性を
表す。
を、制限酵素ＢａｍＨＩでＩの方法に従い反応し、IVの
方法によりＤＮＡを回収した。この切断したＤＮＡを、
Ｉの方法に従い制限酵素ＢａｍＨＩで切断しIVの方法に
よりＤＮＡを回収したプラスミドｐＵＣ１９とIII の方
法で連結した。この連結ベクターを大腸菌ＨＢ１０１に
IIの方法で形質転換した。次にサーマス・サーモフィラ
ス ＨＢ２７を、ウラシル（５０μｇ／ｍｌ）を含むVI
の好熱菌培地プレート上で生育後、紫外線照射を６０秒
行い、７０℃で３時間培養した。ニトロセルロースフィ
ルター（ミリポア社製）にレプリカをとり、５ＦＯＡ
（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含むVIの好熱菌培地プレート上
に移し、７０℃で３時間培養した。このプレート上に生
えてきた５ＦＯＡ耐性株１７個をピックアップし、更に
ウラシルを含まない培地で生えなかった４個のコロニー
をｐｙｒＥ欠損株として選んだ（ＦＯＲ１，４，１３，
１７）。これら４個の株のオロチジン−５−フォスフェ
イト ピロフォスフォリラーゼ（以下「ＯＭＰｐｐａｓ
ｅ」と略記する）、オロチジン−５−フォスフェイト
デカルボキシラーゼ（以下「ＯＭＰｄｃａｓｅ」と略記
する）活性を調べた。ウラシル要求性となるのは、これ
らのどちらかが欠失した場合で、ｐｙｒＥ欠損株はＯＭ
Ｐｐｐａｓｅ活性を失ったものである。各コロニー、Ｆ
ＯＲ１，４，１３，１７をウラシルと５ＦＯＡを含むVI
の好熱菌培地１０ｍｌで一晩培養後、３０００回転、１
０分間で集菌し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）１ｍｌに溶解し、超音波破砕（１００Ｗ，１０
分）行った。ＯＭＰｄｃａｓｅの活性測定は、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ
2 、０．２ｍＭ ＯＭＰをトータル１ｍｌとし、そこに
上記好熱菌抽出物５０μｌを加えて、５０℃でインキュ
ベートし、吸光度２８５ｎｍの減少を測定した。ＯＭＰ
ｐｐａｓｅの活性測定は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．３ｍＭ オ
ロテイト ナトリウム、０．１ｍＭ ＰＲＰＰ（５−ホ
スホリボシル−１−ピロリン酸）をトータル１ｍｌと
し、そこに上記の好熱菌抽出物５０μｌを加えて、５０
℃でインキュベートし、吸光度２９５ｎｍの減少を測定
した。表１に示すように、ＦＯＲ４以外はＯＭＰｐｐａ
ｓｅを失い，ＯＭＰｄｃａｓｅ活性を持っていた。ここ
で１ｕｎｉｔは１μｍｏｌの基質が生産物となる活性を
表す。
【００２８】
【表１】 表 １ ──────────────────────────────────── wild FOR1 FOR4 FOR13 FOR17 ──────────────────────────────────── OMPdcase(unit/mg protein) 0.398 0.538 0.004 0.679 0.414 OMPppase(unit/mg protein) 0.090 0.005 0.084 0.008 0.004 ──────────────────────────────────── ＦＯＲ１３をVIの好熱菌培地で培養し、対数増殖期の菌
を３０００回転、１０分間で集菌し、VIの最小培地で２
回洗った後、ウラシルの入ってないVIの好熱菌培地プレ
ート上に２×１０7 ｃｅｌｌｓになるようにまき、上記
のように調製した、大腸菌ライブラリーのレプリカフィ
ルター（ミリポア社製）をその上に載せた。４個の陽性
コロニーが確認された。この位置に相当する大腸菌のマ
スタープレート上のコロニーから、プラスミドをIIの方
法によりプラスミドを精製し、ジデオキシ法により目的
のＤＮＡの塩基配列を決定した。このプラスミドをｐＯ
Ｍ１７とする。
を３０００回転、１０分間で集菌し、VIの最小培地で２
回洗った後、ウラシルの入ってないVIの好熱菌培地プレ
ート上に２×１０7 ｃｅｌｌｓになるようにまき、上記
のように調製した、大腸菌ライブラリーのレプリカフィ
ルター（ミリポア社製）をその上に載せた。４個の陽性
コロニーが確認された。この位置に相当する大腸菌のマ
スタープレート上のコロニーから、プラスミドをIIの方
法によりプラスミドを精製し、ジデオキシ法により目的
のＤＮＡの塩基配列を決定した。このプラスミドをｐＯ
Ｍ１７とする。
【００２９】実施例２ インテグレーションベクターの
作製 ベクターｐＵＣ１９を制限酵素ＫｐｎＩでＩの方法によ
り切断した後、１０×ＣＩＰバッファー、アルカリフォ
スファターゼ（東洋紡社製）を加え３７℃、１時間イン
キュベートし、脱リン酸化した（以下、「脱リン酸化処
理」と略記する）。次に、ｐｙｒＥ遺伝子を持つベクタ
ーｐＯＭ１７をＫｐｎＩでＩの方法により切断した後、
電気泳動を行い、Ｖの方法で１．７ｋｂｐのフラグメン
トを回収し、IVによりＤＮＡを精製した。このフラグメ
ントと先ほどのベクターをIII の方法で連結し、大腸菌
ＪＭ１０９にIIの方法で形質転換した。得られたコロニ
ーをランダムにピックアップして培養後、IIの方法でプ
ラスミドを精製し、制限酵素ＫｐｎＩ、ＸｂａＩでＩの
方法で切断、電気泳動により、フラグメントの挿入を確
認し、ｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターの向きとｐｙｒ
Ｅ遺伝子の向きが逆向きなプラスミドｐＵＫ２を製作し
た。
作製 ベクターｐＵＣ１９を制限酵素ＫｐｎＩでＩの方法によ
り切断した後、１０×ＣＩＰバッファー、アルカリフォ
スファターゼ（東洋紡社製）を加え３７℃、１時間イン
キュベートし、脱リン酸化した（以下、「脱リン酸化処
理」と略記する）。次に、ｐｙｒＥ遺伝子を持つベクタ
ーｐＯＭ１７をＫｐｎＩでＩの方法により切断した後、
電気泳動を行い、Ｖの方法で１．７ｋｂｐのフラグメン
トを回収し、IVによりＤＮＡを精製した。このフラグメ
ントと先ほどのベクターをIII の方法で連結し、大腸菌
ＪＭ１０９にIIの方法で形質転換した。得られたコロニ
ーをランダムにピックアップして培養後、IIの方法でプ
ラスミドを精製し、制限酵素ＫｐｎＩ、ＸｂａＩでＩの
方法で切断、電気泳動により、フラグメントの挿入を確
認し、ｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターの向きとｐｙｒ
Ｅ遺伝子の向きが逆向きなプラスミドｐＵＫ２を製作し
た。
【００３０】ｐＵＫ２のｐＵＣ１９部分のマルチクロー
ニングサイトにあるＸｂａＩサイトを取り除くために、
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII でＩの方法で反応後、IVによ
りＤＮＡを精製し、ＴＥに溶解し、ＤＮＡの平滑末端反
応をVII の方法で行った後III の方法で連結し、IIによ
り大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。得られたコロニー
をランダムにピックアップして培養後、IIによりプラス
ミドを精製、ＸｂａＩでＩの方法で反応し、切断され
ず、サイトがなくなったものをｐＵＫ２−４とした。
ニングサイトにあるＸｂａＩサイトを取り除くために、
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII でＩの方法で反応後、IVによ
りＤＮＡを精製し、ＴＥに溶解し、ＤＮＡの平滑末端反
応をVII の方法で行った後III の方法で連結し、IIによ
り大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。得られたコロニー
をランダムにピックアップして培養後、IIによりプラス
ミドを精製、ＸｂａＩでＩの方法で反応し、切断され
ず、サイトがなくなったものをｐＵＫ２−４とした。
【００３１】実施例３ カナマイシン耐性遺伝子とイン
テグレーションベクターの連結 カナマイシン耐性遺伝子は、Ｈ．Ｌｉｏａら（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏ
ｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ，８３，５７６−５８０
（１９８６））のＴＫ１０１株由来のものを用いた。こ
のカナマイシン耐性遺伝子をポリメラーゼ チェイン
リアクション法（以下「Ｐ．Ｃ．Ｒ．法」と略記する）
（Ｓｃｉｅｃｅ，２３９，４８７−４９１（１９８
３））によりＸｈｏＩ，ＥｃｏＲＩサイトを持ったフラ
グメントとして得た。Ｐ．Ｃ．Ｒ．法は、パーキンエル
マーシータス ＤＮＡサーマルサイクラーを使用して、
その使用説明書に基づき、ジーンアンプキットを使って
行った。すなわち基質ＤＮＡｐＢＳＴ１６を１μｌ
（０．５μｇ相当量）、１０倍濃度の反応緩衝液（５０
０ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３）１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．１％（ｗ／ｖ）ゼ
ラチン）１０μｌ、１．２５ｍＭ ４ｄＮＴＰ １６μ
ｌ、５０μＭ プライマー１、２（配列表の配列番号
１、２）各５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌを
加えて１００μｌの系とする。反応は９４℃で２分間
（変性ステップ）、５５℃で２分間（アニーリングステ
ップ）、７２℃で２分３０秒（伸長ステップ）のインキ
ュベーションを２５サイクル行った。反応後、電気泳動
し、Ｖにより７９０ｂｐのＤＮＡを回収、IVによりＤＮ
Ａを精製し、ＴＥに溶解した。このＤＮＡをＸｈｏＩ，
ＥｃｏＲＩでＩの方法により切断、IVにより精製後、VI
I によりＤＮＡ平滑末端反応を行った。次に、ｐＵＫ２
−４をＸｂａＩで反応し、IVにより精製後、ＴＥに溶解
して、VII によりＤＮＡ平滑末端反応を行った。反応
後、IVにより精製、ＴＥに溶解して、脱リン酸化処理し
た。このベクターと上記の７９０ｂｐのフラグメントを
III により連結し、IIの方法で形質転換した。得られた
コロニーをランダムにピックアップして培養後、IIの方
法でプラスミドを精製、ジデオキシ法により配列を決定
し、カナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。このプ
ラスミドをｐＫＭ３とした。
テグレーションベクターの連結 カナマイシン耐性遺伝子は、Ｈ．Ｌｉｏａら（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏ
ｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ，８３，５７６−５８０
（１９８６））のＴＫ１０１株由来のものを用いた。こ
のカナマイシン耐性遺伝子をポリメラーゼ チェイン
リアクション法（以下「Ｐ．Ｃ．Ｒ．法」と略記する）
（Ｓｃｉｅｃｅ，２３９，４８７−４９１（１９８
３））によりＸｈｏＩ，ＥｃｏＲＩサイトを持ったフラ
グメントとして得た。Ｐ．Ｃ．Ｒ．法は、パーキンエル
マーシータス ＤＮＡサーマルサイクラーを使用して、
その使用説明書に基づき、ジーンアンプキットを使って
行った。すなわち基質ＤＮＡｐＢＳＴ１６を１μｌ
（０．５μｇ相当量）、１０倍濃度の反応緩衝液（５０
０ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３）１５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．１％（ｗ／ｖ）ゼ
ラチン）１０μｌ、１．２５ｍＭ ４ｄＮＴＰ １６μ
ｌ、５０μＭ プライマー１、２（配列表の配列番号
１、２）各５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ ０．５μｌを
加えて１００μｌの系とする。反応は９４℃で２分間
（変性ステップ）、５５℃で２分間（アニーリングステ
ップ）、７２℃で２分３０秒（伸長ステップ）のインキ
ュベーションを２５サイクル行った。反応後、電気泳動
し、Ｖにより７９０ｂｐのＤＮＡを回収、IVによりＤＮ
Ａを精製し、ＴＥに溶解した。このＤＮＡをＸｈｏＩ，
ＥｃｏＲＩでＩの方法により切断、IVにより精製後、VI
I によりＤＮＡ平滑末端反応を行った。次に、ｐＵＫ２
−４をＸｂａＩで反応し、IVにより精製後、ＴＥに溶解
して、VII によりＤＮＡ平滑末端反応を行った。反応
後、IVにより精製、ＴＥに溶解して、脱リン酸化処理し
た。このベクターと上記の７９０ｂｐのフラグメントを
III により連結し、IIの方法で形質転換した。得られた
コロニーをランダムにピックアップして培養後、IIの方
法でプラスミドを精製、ジデオキシ法により配列を決定
し、カナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。このプ
ラスミドをｐＫＭ３とした。
【００３２】実施例４ 好熱菌への導入、相同組換え サーマス・サーモフィラス ＨＢ２７に、上記作製ベク
ターｐＫＭ３をＶの方法で形質転換し、５ＦＯＡプレー
トにまき、７０℃で２４〜４８時間培養した。発現した
５ＦＯＡ耐性コロニーをカナマイシン濃度を２５μｇ／
ｍｌとしたプレートに撒き、４８℃で一晩培養した。得
られたコロニーを再度、５ＦＯＡプレートにまき、７０
℃で２４〜４８時間培養した。得られたコロニーから常
法により、染色体ＤＮＡを調製し、上記Ｐ．Ｃ．Ｒ．法
で作製したカナマイシン耐性遺伝子を含む７９０ｂｐＤ
ＮＡ断片をプローブとして、常法によりサザンハイブリ
ダイゼーションを行い、陽性の結果を得た。こうして得
られた株をＫＢ３０５とした。
ターｐＫＭ３をＶの方法で形質転換し、５ＦＯＡプレー
トにまき、７０℃で２４〜４８時間培養した。発現した
５ＦＯＡ耐性コロニーをカナマイシン濃度を２５μｇ／
ｍｌとしたプレートに撒き、４８℃で一晩培養した。得
られたコロニーを再度、５ＦＯＡプレートにまき、７０
℃で２４〜４８時間培養した。得られたコロニーから常
法により、染色体ＤＮＡを調製し、上記Ｐ．Ｃ．Ｒ．法
で作製したカナマイシン耐性遺伝子を含む７９０ｂｐＤ
ＮＡ断片をプローブとして、常法によりサザンハイブリ
ダイゼーションを行い、陽性の結果を得た。こうして得
られた株をＫＢ３０５とした。
【００３３】実施例４ ニトロソグアニジンによる変異
導入 ＫＢ３０５株をVIの好熱菌培地に植え継ぎ、ニトロソグ
アニジン（２．５ｍｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２００
μｇ／ｍｌ）を加え６４℃で３日間培養した。得られた
株をＫＮ５０２株とした。 実施例５ 温度耐性試験 野生株ＨＢ２７、カナマイシン耐性遺伝子導入株ＫＢ３
０５、変異処理した株ＫＮ５０２を、カナマイシン１５
０μｇ／ｍｌを含む培地で、種々の温度で培養した（表
２）。その結果、ＫＢ３０５株は５６℃、ＫＮ５０２株
は少なくとも６６℃まで耐性を示すことがわかった。
導入 ＫＢ３０５株をVIの好熱菌培地に植え継ぎ、ニトロソグ
アニジン（２．５ｍｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２００
μｇ／ｍｌ）を加え６４℃で３日間培養した。得られた
株をＫＮ５０２株とした。 実施例５ 温度耐性試験 野生株ＨＢ２７、カナマイシン耐性遺伝子導入株ＫＢ３
０５、変異処理した株ＫＮ５０２を、カナマイシン１５
０μｇ／ｍｌを含む培地で、種々の温度で培養した（表
２）。その結果、ＫＢ３０５株は５６℃、ＫＮ５０２株
は少なくとも６６℃まで耐性を示すことがわかった。
【００３４】
【表２】 表 ２ ─────────────────────────── 菌 株 温度（℃） ５６ ６４ ６６ ７２ ─────────────────────────── ＨＢ２７ − − − − ＫＢ３０５ ＋ − − − ＫＮ５０２ ＋ ＋ ＋ ± ───────────────────────────
【００３５】実施例６ 耐熱化酵素からの遺伝子回収及
び変異部位 耐熱化したＫＮ５０２株から、常法により染色体ＤＮＡ
を調製し、制限酵素ＫｐｎＩでＩの方法で切断し、IVの
方法によりＤＮＡを精製、ｐＵＣ１９のＫｐｎＩサイト
にIII の方法で連結し、大腸菌ＪＭ１０９にIIの方法で
形質転換しカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）入りのＬＢ
プレートに撒いた。得られた陽性コロニーから、IIの方
法でプラスミドを精製しジデオキシ法でカナマイシン耐
性遺伝子の配列を決定した。開始コドンから５１３ｂｐ
の塩基配列をＴＫ１０１株由来の同配列と比較したとこ
ろ、３８９番目のＡがＧに変異しており、それによりア
ミノ酸がＬｙｓからＡｒｇに変わっていた。
び変異部位 耐熱化したＫＮ５０２株から、常法により染色体ＤＮＡ
を調製し、制限酵素ＫｐｎＩでＩの方法で切断し、IVの
方法によりＤＮＡを精製、ｐＵＣ１９のＫｐｎＩサイト
にIII の方法で連結し、大腸菌ＪＭ１０９にIIの方法で
形質転換しカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）入りのＬＢ
プレートに撒いた。得られた陽性コロニーから、IIの方
法でプラスミドを精製しジデオキシ法でカナマイシン耐
性遺伝子の配列を決定した。開始コドンから５１３ｂｐ
の塩基配列をＴＫ１０１株由来の同配列と比較したとこ
ろ、３８９番目のＡがＧに変異しており、それによりア
ミノ酸がＬｙｓからＡｒｇに変わっていた。
【００３６】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCTACTCGAG CAAATCTAAA 20
【００３７】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCTAGAATTC CGTAACCAAC 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (2)
- 【請求項１】 選択マーカー遺伝子を含有し、資化性タ
ンパク質あるいは生育上必須となるタンパク質をコード
する遺伝子を欠失させたサーマス属菌を、非耐熱性タン
パク質をコードする構造遺伝子が該選択マーカー遺伝子
のフランキング領域ではさまれたＤＮＡで形質転換して
相同部位組換えを行い、次いで昇温して該選択マーカー
遺伝子の欠失及び非耐熱性構造遺伝子を発現する形質転
換体を選択し、更に該形質転換体を培養して、該非耐熱
性構造遺伝子のコードする非耐熱性タンパク質を耐熱性
タンパク質として発現させることを特徴とするタンパク
質の生産方法。 - 【請求項２】 選択マーカー遺伝子が、ウラシル合成酵
素オロチジン−５−フォスフェイトピロフォスフォリラ
ーゼ（ｐｙｒＥ）であることを特徴とする請求項１記載
のタンパク質の生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5293554A JPH07143894A (ja) | 1993-11-24 | 1993-11-24 | タンパク質の生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5293554A JPH07143894A (ja) | 1993-11-24 | 1993-11-24 | タンパク質の生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07143894A true JPH07143894A (ja) | 1995-06-06 |
Family
ID=17796258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5293554A Pending JPH07143894A (ja) | 1993-11-24 | 1993-11-24 | タンパク質の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07143894A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005019437A1 (ja) * | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Suntory Limited | 脂質生産菌の育種方法 |
-
1993
- 1993-11-24 JP JP5293554A patent/JPH07143894A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005019437A1 (ja) * | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Suntory Limited | 脂質生産菌の育種方法 |
| JPWO2005019437A1 (ja) * | 2003-08-22 | 2007-11-01 | サントリー株式会社 | 脂質生産菌の育種方法 |
| CN100381558C (zh) * | 2003-08-22 | 2008-04-16 | 三得利株式会社 | 脂质生产菌的育种方法 |
| JP4537319B2 (ja) * | 2003-08-22 | 2010-09-01 | サントリーホールディングス株式会社 | 脂質生産菌の育種方法 |
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