CN116606833A - 一种DNA聚合酶IIIα亚基突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种DNA聚合酶IIIα亚基突变体及其应用。具体来说,本公开涉及一种DNA聚合酶IIIα亚基突变体,编码前述突变体的分离的多核苷酸,包含前述多核苷酸的载体、突变器,以及相应的重组宿主细胞,以及前述产品的用途。前述DNA聚合酶IIIα亚基突变体,编码前述突变体的分离的多核苷酸,包含前述多核苷酸的载体、突变器,以及相应的重组宿主细胞均可以提高棒杆菌属的菌株,特别是源自谷氨酸棒杆菌的菌株的随机突变频率,或者降低前述菌株的DNA复制保真率。
Description
优先权和相关申请
本公开要求2022年02月16日提交的名称为“一种DNA聚合酶IIIα亚基突变体及其应用”的中国专利申请202210141981.6的优先权,该申请包括附录在内的全部内容作为参考并入本公开。
技术领域
本公开涉及分子生物学和生物工程领域。特别的,本公开涉及一种能够提高菌株随机突变频率的突变器。具体来说,本公开涉及一种通过针对棒杆菌属的菌株,特别是谷氨酸棒杆菌的DNA聚合酶III的α亚基基因及蛋白序列的分析和突变,构建的一种能够提高棒杆菌,特别是谷氨酸棒杆菌的随机突变频率或者降低的DNA复制保真率的突变器。
背景技术
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是从土壤中分离得到的一种非致病性革兰氏阳性细菌,也是目前生产氨基酸、有机酸等大宗化学品的重要工业菌株,在食品、医药等领域应用广泛。自Kinoshita等(Journal of General&Applied Microbiology,1957,3(3):193-205)在20世纪50年代发现谷氨酸棒杆菌可以高产谷氨酸后,微生物发酵逐渐成为了氨基酸生产的主要技术方法,谷氨酸棒杆菌也成为了发酵工业的最常用菌种之一。由于具有生物安全(被美国FDA认定为GRAS,Generally regarded as safe)、生长速度快、营养需求低、底物谱广等优势,谷氨酸棒杆菌被认为是生物制造的理想微生物底盘(Applied Microbiology and Biotechnology,2018,102(22):9517-9529)。
为了不断提高工业菌种的生理性能和产物合成能力,自然筛选和人工诱变是前期主要的技术策略。这种策略虽然在早期极大的推动了发酵工业的快速发展,但也存在明显的问题,主要表现为自然筛选突变频率有限,无法满足菌株快速进化的需求,人工诱变的突变方向不确定,需要多轮反复的诱变和筛选过程。随着分子生物学和合成生物学技术的发展,基因工程和代谢工程逐渐成为菌种研究的常用技术手段,谷氨酸棒杆菌的基因编辑手段也在不断更新完善(中国科学:生命科学,2019,49(5):12)。然而,针对目前仍然存在的大量未知功能基因和生理调控机制,非理性的进化工程仍然是一种有效的快速获得目标遗传性状的技术手段。DNA的高保真复制对生物体遗传信息的稳定传递至关重要,而DNA复制过程中的低频随机突变在细菌对外部环境的适应性进化中起着重要的作用。基于DNA复制过程中的校对和错配修复机制,大肠杆菌中已经开发了多种不同的突变器,通过增加菌株生长过程中的随机突变频率,快速获得了具有目标性状的优势菌株(Biotechnology forBiofuels,2013,6(1):1-11)。在谷氨酸棒杆菌中,DNA的错配修复机制已经得到解析,但DNA聚合酶中的校对机制尚未得到明确解析,目前也没有成熟的突变器可用。
现有研究表明,分枝杆菌DNA复制过程中的校对功能并不由常见的DNA聚合酶IIIε亚基(dnaQ基因编码)催化,而是由DNA聚合酶IIIα亚基(其由dnaE基因编码)中的组氨醇磷酸酶(PHP)结构域催化,该结构域具有一种内在3’-5’核酸外切酶活性,负责DNA复制过程中的校对功能;对其PHP结构域中参与金属离子结合的关键氨基酸D23和D226残基进行突变(D23N或D226N),能够显著降低DNA复制的保真率(Nature Genetics,2015.47(6):677-681.)。但不同物种中PHP结构域的功能并不尽相同,例如大肠杆菌DNA聚合酶IIIα亚基的PHP结构域中缺少了金属离子结合关键的氨基酸残基,导致校对功能缺失(BMC StructuralBiology,2013,13),改由ε亚基承担校对功能;而链霉菌中单独在PHP结构域引入D19N突变(对应于分枝杆菌中的D23N)却不能提高菌株的自发突变频率(Nucleic Acids Research,2021,49(14):8396-8405),表明不同物种中DNA复制的校对功能可能存在较大的差异。目前棒杆菌中DNA聚合酶III的校对机制目前并不明确,也没有明确突变位点和突变体可直接参考使用。因此,本领域亟需开发人工可控的能够提高野生型菌株,例如棒杆菌,特别是谷氨酸棒杆菌的随机突变频率的突变器。
发明内容
发明要解决的问题
本公开通过对棒杆菌属的菌株,特别是谷氨酸棒杆菌DNA聚合酶IIIα亚基基因及蛋白序列的分析和突变,构建了一种能够提高棒杆菌属的菌株,特别是谷氨酸棒杆菌随机突变频率或者降低的DNA复制保真率的新型突变器。
用于解决问题的方案
本公开涉及的技术方案如下。
(1)一种DNA聚合酶IIIα亚基突变体,其中,所述突变体选自如下(i)-(iii)组成的组中的任一项:
(i)所述突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:13所示的序列,具有如下一个或多个位置处的突变的氨基酸:第20位突变为半胱氨酸(D20C)、组氨酸(D20H)、异亮氨酸(D20I)、赖氨酸(D20K)、亮氨酸(D20L)、甲硫氨酸(D20M)、天冬酰胺(D20N)、谷氨酰胺(D20Q)、精氨酸(D20R)、缬氨酸(D20V)或酪氨酸(D20Y),和/或第223位突变为丙氨酸(D223A)、谷氨酰胺(D223Q)、丝氨酸(D223S)或天冬酰胺(D223N);
(ii)与(i)所示的氨基酸序列具有至少90%,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽;并且,含有所述突变体的突变体菌株相对于野生型菌株,具有提高的随机突变频率或降低的DNA复制保真率;
(iii)如(i)或(ii)所示氨基酸序列的多肽在N端和C端的至少一端添加或缺失一个或多个氨基酸的多肽;并且,含有所述多肽的突变体菌株相对于野生型菌株,具有提高的随机突变频率或降低的DNA复制保真率。
(2)一种分离的多核苷酸,其中,所述多核苷酸编码如(1)所述的突变体。
(3)一种重组表达载体,其中,所述载体包含如(2)所述的多核苷酸。
(4)一种重组宿主细胞,其中,所述重组宿主细胞包含如(1)所述的突变体、如(2)所述的多核苷酸或者如(3)所述的重组表达载体。
(5)根据(4)所述的重组宿主细胞,其中,所述宿主细胞来源于棒状杆菌属(Corynebacterium)。
在一种具体的实施方式中,所述宿主细胞来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
(6)根据(1)所述的突变体,根据(2)所述的多核苷酸,根据(3)所述的载体,或根据(4)-(5)任一项所述的重组宿主细胞在如下(a)-(b)至少一种中的用途:
(a)制备具有提高的随机突变频率的突变体菌株;
(b)制备具有降低的DNA复制保真率的突变体菌株。
在一种具体的实施方式中,所述突变体菌株的来源为棒状杆菌属(Corynebacterium)。
在一种优选的实施方式中,所述突变体菌株的来源为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
(7)一种筛选突变体菌株的方法,所述方法包括使用根据(1)所述的突变体,根据(2)所述的多核苷酸,根据(3)所述的载体,或根据(4)-(5)任一项所述的重组宿主细胞进行筛选的步骤;其中,所述突变体菌株具有提高的随机突变频率或具有降低的DNA复制保真率。
在一种优选的实施方式中,所述方法还包括分离纯化突变体菌株的步骤。
(8)一种突变体菌株,其中,所述突变体菌株包含如(1)所述的突变体、如(2)所述的多核苷酸或如(3)所述的重组表达载体。
(9)一种突变器,所述突变器包含如(2)所述的多核苷酸、与(2)所述的多核苷酸可操作地连接的具有起始转录活性的多核苷酸,以及能够在宿主细胞中复制的表达载体。
在一种具体的实施方式中,所述宿主细胞来源于棒状杆菌属(Corynebacterium)。
在一种优选的实施方式中,所述宿主细胞来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
发明的效果
在一个具体的实施方式中,本公开提供的含有DNA聚合酶IIIα亚基突变体与含有野生型DNA聚合酶IIIα亚基的菌株相比,含有DNA聚合酶IIIα亚基突变体的菌株具有提高的随机突变频率或降低的DNA复制保真率。
在一个具体的实施方式中,本公开提供了含有DNA聚合酶IIIα亚基突变体的分离的多核苷酸,载体,突变器,重组宿主细胞,以及前述分离的多核苷酸,载体,突变器,重组宿主细胞的用途。其均可以用于提高菌株的随机突变频率或降低菌株的DNA复制保真率。
在一个具体的实施方式中,前述来源为棒状杆菌属(Corynebacterium)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的菌株,具有提高的随机突变频率或降低的DNA复制保真率。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时,词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”,但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的,词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的,并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中,术语“约”表示:一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”,但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外,权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时,选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点,也包括相对于前述数值端点而言,所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
如本公开所使用的,术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的,它可以包含修饰的氨基酸,并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如,二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作,如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
在本公开中,“DNA聚合酶Ⅲ”是一种多酶复合体,在DNA复制链的延长上起着主导作用,是催化DNA复制合成的主要酶。
在本公开中,“DNA聚合酶Ⅲ的α亚基”是由dnaE1基因编码。
在本公开的一个具体的实施方式中,本公开所涉及的谷氨酸棒杆菌的DNA聚合酶Ⅲ的α亚基的氨基酸序列包含dnaE1基因编码的氨基酸的序列,并且,所述dnaE1基因编码的氨基酸的序列为如SED ID NO:13所示的序列。
在本公开中,“DNA聚合酶Ⅲ的α亚基的PHP结构域”的含义为“DNA聚合酶Ⅲ的α亚基的聚合酶组氨醇磷酸酶(polymerase and histidinol phosphatase,PHP)结构域”。
如本公开所使用的,术语“内源的”指在生物体或细胞内自然表达或产生的多核苷酸、多肽或其他化合物。也就是说,内源性多核苷酸、多肽或其他化合物不是外源的。例如,当细胞最初从自然界分离时,细胞中存在一种“内源性”多核苷酸或多肽。
如本公开所使用的,术语“外源的”指在需要表达的特定细胞或有机体中天然发现或表达的任何多核苷酸或多肽。外源多核苷酸、多肽或其他化合物不是内源性的。
如本公开所使用的,术语“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如,一种存在于生物体中,可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的,“天然存在的”和“野生型的”是同义词。
如本公开所使用的,术语“突变体”是指相对于“野生型”,或者“相比较的”多核苷酸或多肽,在一个或多个(例如,若干个)位置处包含改变(即,取代、插入和/或缺失)的多核苷酸或多肽,其中,取代是指用不同的核苷酸或氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸或氨基酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸或氨基酸之后添加核苷酸或氨基酸。
如本公开所使用的,术语“突变的氨基酸”,包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个的氨基酸”。在本公开中,术语“突变”是指氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中,术语“突变”是指“取代”。
在一个实施方式中,本公开的“突变”可以选自“保守突变”。在本公开中,术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。
如本公开所使用的,术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族,并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。如本公开所使用的,“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换,此外,保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
如本公开所使用的,术语“突变体菌株”是指对“野生型菌株”或“出发菌株”进行随机突变,获得的与“野生型菌株”或“出发菌株”不同的菌株,即“突变体菌株”的多核苷酸或多肽,相对于“野生型菌株”或“出发菌株”的多核苷酸或多肽在一个或多个(例如,若干个)位置处包含改变(即,取代、插入和/或缺失)。在具体的实施方式中,本公开所述的“突变体菌株”是指在“野生型菌株”或“出发菌株”中,利用本公开的DNA聚合酶Ⅲ的α亚基突变体对其进行随机突变获得的不同与“野生型菌株”或“出发菌株”的菌株。
如本公开所使用的,术语“突变器”具有本领域技术人员公知的含义,是指能够提高菌株随机突变频率的元件。在具体的实施方式中,突变器包括编码本公开所述的DNA聚合酶Ⅲ的α亚基突变体的多核苷酸、与编码本公开所述的DNA聚合酶Ⅲ的α亚基的基因可操作地连接的具有起始转录活性的多核苷酸,以及能够在宿主细胞中复制的表达载体。
如本公开所使用的,术语“可操作连接”是指将具有起始转录活性的多核苷酸与本公开的DNA聚合酶Ⅲ的α亚基突变体编码基因序列功能性连接以启动和介导DNA聚合酶Ⅲ的α亚基突变体的转录。可使用本领域已知的基因重组技术实现可操作的连接,并且可以使用本领域已知的限制酶和连接酶进行位点特异性DNA切割和连接,但不限于此。
如本公开所使用的,术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式,也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分,其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的,能够通过标准分子生物学方法(例如,使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时,这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C),其中“U”取代“T”。换句话说,“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物,或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分,如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。“重组多核苷酸”属于“多核苷酸”中的一种。
如本公开所使用的,术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定:将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分,且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言,可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
在一些实施方式中,当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时,两个或多个序列或子序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。在某些实施方式中,所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(例如,多核苷酸)的整个长度上基本相同。
本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说,“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后,一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此,例如,就“对应于序列1所示氨基酸序列的第150位的氨基酸残基”而言,如果在序列1所示氨基酸序列的一端加上6×His标签,那么所得突变体中对应于序列1所示氨基酸序列的第150位就可能是第156位。
如本公开所使用的,术语“表达载体”指的是DNA构建体,其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列,从而在合适的宿主中表达目的基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需外源多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括,例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合,例如启动子和增强子;ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列;以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要,并可以使用任何载体,包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列,例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体,来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。例如,作为质粒载体,可以使用基于pDZ、pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等,具体地,可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pXMJ19载体等,但不限于此,只要其可以在谷氨酸棒杆菌中复制表达即可。作为噬菌体载体,可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等。
本公开中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的突变体,或包含编码突变体的多核苷酸、重组表达载体、突变器的任何细胞类型。
本公开中的术语“重组宿主细胞”涵盖导入外源多核苷酸、核酸构建体或重组表达载体、突变器后不同于亲本细胞的宿主细胞,重组宿主细胞具体通过转化来实现。
本公开中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思,即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法,这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本公开的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行,包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等,并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是,应当理解的是,详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出,因为在阅读该详细说明后,在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰,对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法,如无特殊说明均为常规技术方法,例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可通过正规商业渠道获得。
实施例1:pXMJ19Ts-ccdB质粒的构建
根据文献报道的pXMJ19-nCas9(D10A)NG-AID-gRNA-ccdB-Ts载体信息(MetabolicEngineering,2018,47:200-210;其通过引用并入本公开),设计pXMJ19-F1/R1、pXMJ19-F2/R2和pXMJ19-F3/R3三对引物,并以上述载体为模板,分别扩增出三种片段,回收后利用ClonExpress One Step Multis Cloning kit重组试剂盒进行重组,37℃反应30min,连接产物转化入DB 3.1感受态细胞,涂布于含34μg/mL氯霉素的LB抗性平板,过夜培养,挑阳性克隆进行菌落PCR和测序验证,获得温敏载体pXMJ19Ts-ccdB。
上述三对引物的具体序列如表1所示。
表1.pXMJ19扩增引物
引物名称 | 序列信息 | SEQ ID NO |
pXMJ19-F1 | GCGGTGGAATAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGT | SEQ ID NO:1 |
pXMJ19-R1 | CGTGGTCTCACATTCTCAACTCCTTTAAGCTTAATTAATTCTG | SEQ ID NO:2 |
pXMJ19-F2 | GTTGAGAATGTGAGACCACGCGTGGATCCGGCTTACT | SEQ ID NO:3 |
pXMJ19-R2 | CGACCTGCAGTGAGACCTTATATTCCCCAGAACATCAGG | SEQ ID NO:4 |
pXMJ19-F3 | TAAGGTCTCACTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCC | SEQ ID NO:5 |
pXMJ19-R3 | CACGAGATTTATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGG | SEQ ID NO:6 |
实施例2:DnaE1过表达载体构建
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组序列设计引物CgdnE1-F和CgdnE1-R,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板,通过PCR扩增获得野生型dnaE1片段。根据文献报道的Goldengate克隆方法(Biotechnology and Bioengineering,2019,116:3016-3029;其通过引用并入本公开),将纯化回收的dnaE1片段与pXMJ19Ts-ccdB质粒进行Goldengate克隆(Golden Gate组装试剂盒,#E1601),连接产物转化Trans T1感受态细胞,涂布于含34μg/mL氯霉素的LB抗性平板,过夜培养,挑阳性克隆进行菌落PCR和测序验证,验证正确的重组载体命名为pXMJ19Ts-dnaE1WT。
上述一对引物的具体序列如表2所示。
表2.DnaE1扩增引物
引物名称 | 序列信息 | SEQ ID NO |
CgdnE1-F | TACGTGGTCTCGAATGgccaagcaatcctcatttgta | SEQ ID NO:7 |
CgdnE1-R | TGCATAGGTCTCAGCAGttaaccgaggatgcctggc | SEQ ID NO:8 |
实施例3:DnaE1突变体表达载体构建
以pXMJ19Ts-dnaE1WT重组载体为模板,利用引物D20N-F1/R1和D223N-F1/R1扩增得到突变体DnaE1-D20N和DnaE1-D223N片段。片段纯化回收后利用T4多聚合核苷酸激酶(T4PNK)进行末端磷酸化处理,然后使用T4连接酶自身环化连接,将连接产物转化Trans T1感受态细胞,涂布于含34μg/mL氯霉素的LB抗性平板,过夜培养,挑阳性克隆进行菌落PCR和测序验证,验证正确的重组载体命名为pXMJ19Ts-dnaE1D20N和pXMJ19Ts-dnaE1D223N。
上述两对引物的具体序列如表3所示。
表3.DnaE1突变体扩增引物
引物名称 | 序列信息 | SEQ ID NO |
D20N-F1 | acggaatggccaagatcgatatg | SEQ ID NO:9 |
D20N-R1 | taagcatggaaaactcggtgtg | SEQ ID NO:10 |
D223N-F1 | aactgccactatgtgctggaatc | SEQ ID NO:11 |
D223N-R1 | gttggtgaccaggggtggca | SEQ ID NO:12 |
实施例4:DnaE1野生型和突变体过表达菌株构建
采用文献报道的方法制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞(BiotechnologyLetters,2015,37:2445-52;其通过引用并入本公开),向上述制备获得的感受态细胞分别电转化1μg的pXMJ19Ts-dnaE1WT、pXMJ19Ts-dnaE1D20N、pXMJ19Ts-dnaE1D223N质粒,加入1mL 46℃预热的TSB培养基,46℃孵育6min,30℃孵育2h,涂布于含有5μg/mL氯霉素的TSB固体培养基,30℃培养1天,获得转化子,得到重组菌株ATCC 13032/pXMJ19Ts-dnaE1WT、ATCC 13032/pXMJ19Ts-dnaE1D20N和ATCC 13032/pXMJ19Ts-dnaE1D223N。
实施例5:过表达DnaE1突变体对谷氨酸棒杆菌突变频率的影响
参考文献报道的利福平抗性的方法测试过表达DnaE1及突变体对谷氨酸棒杆菌突变频率的影响(Nucleic Acids Research,2018,46(12):6206-6217;其通过引用并入本公开)。将实施例4构建得到的重组菌株ATCC 13032/pXMJ19Ts-dnaE1WT、ATCC 13032/pXMJ19Ts-dnaE1D20N和ATCC13032/pXMJ19Ts-dnaE1D223N分别接入含有5μg/mL氯霉素和0.5mM IPTG的TSB液体培养基中过夜培养,培养至OD600为9-10之间,用TSB液体培养基稀释5×106倍,涂布于含有5μg/mL氯霉素的TSB固体培养基上,另取100μL菌液涂布于含有5μg/mL氯霉素和2μg/mL利福平的TSB固体培养基上,30℃过夜培养,待长出单克隆后进行计数,使用以下公式计算突变频率。
过表达不同DnaE1菌株的突变频率如表4所示,与过表达野生型DnaE1的菌株相比,DnaE1D20N突变体过表达能够将突变频率提高约28倍,过表达DnaE1D223N突变体能够将突变频率提高约37倍。可见,DnaE1D20N和DnaE1D223N这两种突变体均能降低谷氨酸棒杆菌DNA复制的保真性,提高谷氨酸棒杆菌突变频率,在谷氨酸棒杆菌的生物工程应用中有较好的前景。
表4.过表达DnaE1野生型和突变体菌株的突变频率
菌株 | 突变频率 |
ATCC 13032/pXMJ19Ts-dnaE1WT | 2.14±0.86×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19Ts-dnaE1D20N | 61.31±22.01×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19Ts-dnaE1D223N | 80.84±43.85×10-7 |
实施例6:谷氨酸棒杆菌DnaQ同源基因缺失菌株构建
为了进一步测试谷氨酸棒杆菌中DNA聚合酶IIIε亚基(DnaQ)在突变器开发中的应用,从而对谷氨酸棒杆菌基因组进行了分析,发现有3个注释为可能的DnaQ编码基因:Cgl0247、Cgl1289、Cgl2116,但氨基酸一致性较低,分别只有13.3%、9.8%、11.8%,因此,本实施例首先验证了上述3个基因是否具备校对的功能。
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组序列,分别设计引物Cgl0247-F1/R1、Cgl1289-F1/R1、Cgl2116-F1/R1,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板,通过PCR分别扩增获得Cgl0247、Cgl1289和Cgl2116的上游同源臂DNA片段;设计引物Cgl0247-F2/R2、Cgl1289-F2/R2、Cgl2116-F2/R2,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板,通过PCR分别扩增获得Cgl0247、Cgl1289和Cgl2116的下游同源臂DNA片段。根据质粒pK18mobsacB的序列信息设计引物pK-F/R,以质粒pK18mobsacB为模板,通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。将Cgl0247的上、下游同源臂DNA片段和线性化载体片段回收后重组连接,获得敲除Cgl0247的编辑载体pK18-ΔCgl0247。按照上述相同的方法分别获得敲除Cgl1289、Cgl2116的编辑载体pK18-ΔCgl1289、pK18-ΔCgl2116。
上述七对引物的具体序列如表5所示。
表5.DnaQ敲除扩增引物
引物名称 | 序列信息 | SEQ ID NO |
Cgl0247-F1 | tgacatgattacgaattcTAAGCTTTACGACGCCTCCC | SEQ ID NO:14 |
Cgl0247-R1 | GACGGAAACAAAAGGAGCCGC | SEQ ID NO:15 |
Cgl1289-F1 | tgacatgattacgaattcATCTCCACCTTCCATTCCTGGATTA | SEQ ID NO:16 |
Cgl1289-R1 | GCGTGTCGACGCCCCCGG | SEQ ID NO:17 |
Cgl2116-F1 | tgacatgattacgaattcGTAGCTTCCATGGTGTTTCCTGGTT | SEQ ID NO:18 |
Cgl2116-R1 | CACGAAATTCAGACCAGCAACAG | SEQ ID NO:19 |
Cgl0247-F2 | TTTGTTTCCGTCAAAGGAATTCCGCTGCTGTCC | SEQ ID NO:20 |
Cgl0247-R2 | cgacggccagtgccaagcttGAGGTAACGAGGACGTCGTCGCAGT | SEQ ID NO:21 |
Cgl1289-F2 | GCGTCGACACGCGCATTAACCGACGCTTTGGC | SEQ ID NO:22 |
Cgl1289-R2 | cgacggccagtgccaagcttCCAAGTCGATGGAGTTGATGTCAGT | SEQ ID NO:23 |
Cgl2116-F2 | CTGAATTTCGTGGAGTTGAAAGAAAAAGGACAGGACA | SEQ ID NO:24 |
Cgl2116-R2 | cgacggccagtgccaagcttCCGTGCCTATAAACAAGAAGCTTAT | SEQ ID NO:25 |
pK-F | AAGCTTGGCACTGGCCGTCG | SEQ ID NO:26 |
pK-R | GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT | SEQ ID NO:27 |
采用文献报道的方法制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞(BiotechnologyLetters,2015,37:2445-52),向上述制备获得的感受态细胞分别电转化1μg的pK18-ΔCgl0247、pK18-ΔCgl1289、pK18-ΔCgl2116质粒,加入1mL 46℃预热的TSB培养基,46℃孵育6min,30℃孵育3h,涂布含有25ug/mL卡那霉素的TSB固体培养基,30℃培养1天,获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养,然后转接含有100g/L蔗糖的TSB培养基,30℃培养6h后涂布于添加100g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选,获得敲除菌株13032ΔCgl0247、13032ΔCgl1289、13032ΔCgl2116,分别命名为SMQ1、SMQ2、SMQ3。
实施例7:谷氨酸棒杆菌DnaQ同源基因缺失对自发突变频率的影响
参考文献报道的利福平抗性的方法测试DnaQ同源基因缺失菌株的自发突变频率(Nucleic Acids Research,2018,46(12):6206-6217;其通过引用并入本公开)。将上述重组菌株分别接入TSB液体培养基中过夜培养,培养至OD600为10左右,用TSB液体培养基稀释5×106倍,涂布于TSB固体培养基上,另取100μL菌液涂布于含有2μg/mL利福平的TSB固体培养基上,30℃过夜培养,待长出单克隆后进行计数,使用与实施例5相同的公式计算突变频率。结果如表6所示,与野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株相比,上述菌株没有明显提高谷氨酸棒杆菌突变频率,尽管Cgl2116敲除菌株的突变频率与对照菌株相比提高了3倍,但提升幅度与上述过表达DnaE1突变体相比较为有限。上述结果与分枝杆菌以及链霉菌中报道的结论基本一致(Nature Genetics,2015.47(6):677-681;Nucleic Acids Research,2021,49(14):8396-8405),表明谷氨酸棒杆菌中DnaQ的校对功能相对有限,敲除或者改造DnaQ无法用于突变器的开发。
表6.DnaQ敲除菌株的突变频率
菌株 | 突变频率 |
ATCC 13032 | 1.10±0.70×10-7 |
SMQ1 | 2.00±0.74×10-7 |
SMQ2 | 2.03±0.93×10-7 |
SMQ3 | 4.40±1.12×10-7 |
实施例8:谷氨酸棒杆菌DnaE1突变菌构建
上述结果证明了谷氨酸棒杆菌中DNA聚合酶IIIα亚基的PHP结构域可能承担了主要的校对功能,但鉴于分枝杆菌和链霉菌中DnaE1相同位点的突变产生了不同的作用效果(Nature Genetics,2015.47(6):677-681.;Nucleic Acids Research,2021,49(14):8396-8405),故推测将谷氨酸棒杆菌DnaE1 PHP结构域中的D20和D223位谷氨酸突变为其他氨基酸,可能会获得更多以及更高突变频率的突变,因此接着对上述氨基酸残基进行了染色体原位突变筛选。
首先,根据文献报道的Goldengate克隆方法(Biotechnology andbioengineering,2019,116:3016-3029,其通过引用并入本公开),构建靶向dnaE1基因第20位和第223位氨基酸残基密码子的pCas9gRNA质粒,sgRNA的靶DNA结合区分别为CTTGGCCATTCCATCAAGCA和CAGCACATAGTGGCAGTCGT。具体方法如下:将20-F/20-R和223-F/223-R进行变性退火,得到带有粘性末端的DNA双链产物,再与pCas9gRNA-ccdB质粒(参考CN112111469B,其通过引用并入本公开)进行Goldengate克隆(Golden Gate组装试剂盒,#E1601),获得pCas9gRNA-DnaE1D20和pCas9gRNA-DnaE1D223质粒,该质粒表达Cas9蛋白和靶向定点突变区的sgRNA。
然后,利用基于单链重组的CRISPR/Cas9基因组编辑系统(基础质粒构建过程参考专利CN112111469A,其通过引用并入本公开),对谷氨酸棒杆菌DNA聚合酶IIIα亚基(dnaE1基因编码)第20位和第223位位点进行饱和突变。制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞,将重组辅助质粒pRecT质粒电转化至氨酸棒杆菌ATCC 13032,获得13032-pRecT菌株,并制备得到13032-pRecT感受态细胞。
最后,为了对dnaE1基因第20位和第223位的氨基酸密码子突变为野生型以外的19种突变,分别设计了DNA单链DNA ss20-A、ss20-R、ss20-N、ss20-C、ss20-Q、ss20-E、ss20-G、ss20-H、ss20-I、ss20-L、ss20-K、ss20-M、ss20-F、ss20-P、ss20-S、ss20-T、ss20-W、ss20-Y、ss20-V和ss223-A、ss223-R、ss223-N、ss223-C、ss223-Q、ss223-E、ss223-G、ss223-H、ss223-I、ss223-L、ss223-K、ss223-M、ss223-F、ss223-P、ss223-S、ss223-T、ss223-W、ss223-Y、ss223-V,用于突变体构建的重组模板。向上述制备获得的13032-pRecT感受态细胞分别电转化1μg pCas9gRNA-DnaE1D20或pCas9gRNA-DnaE1D223质粒以及10μg对应的单链DNA,加入1mL 46℃预热的TSB培养基,46℃孵育6min,30℃孵育3h,涂布于添加5μg/mL氯霉素、15μg/mL卡那霉素和0.01mM IPTG的TSB平板,培养2天,获得克隆。将上述获得的单克隆分别采用引物D20-JD-F/D20-JD-R和D223-JD-F/D223-JD-R进行菌落PCR鉴定,通过测序确认正确的转化子,最终获得第20位D20C、D20H、D20I、D20K、D20L、D20M、D20N、D20Q、D20R、D20V、D20Y共11种突变体,第223位D223A、D223C、D223Q、D223S、D223N共5种突变体,分别命名为SME1至SME16,对应的突变体分别为D20C、D20H、D20I、D20K、D20L、D20M、D20N、D20Q、D20R、D20V、D20Y、D223A、D223C、D223Q、D223S、D223N。其余突变体未获得,可能突变后对菌体生长造成较大毒性。
上述引物及单链DNA的具体序列如表7所示。
表7.DnaQ敲除扩增引物
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实施例9:不同DnaE1突变菌对谷氨酸棒杆菌自发突变频率的影响
利用与实施例7相同的方法,测试上述DnaE1突变菌株的自发突变频率,结果如表8所示,与野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株相比,突变体D20H、D20I、D20K、D20L、D20M、D20N、D20Q、D20R、D20V、D20Y、D223A、D223Q、D223S、D223N均能显著提高谷氨酸棒杆菌的自发突变频率。说明谷氨酸棒杆菌DnaE1第20位和第223位的氨基酸的多种突变均能够降低谷氨酸棒杆菌DNA复制的保真率。
表8.DnaE1野生型和突变菌株的突变频率
菌株 | 氨基酸突变 | 突变频率 |
ATCC 13032 | WT | 1.10±0.70×10-7 |
SME1 | D20C | 5.39±1.94×10-7 |
SME2 | D20H | 722.89±106.90×10-7 |
SME3 | D20I | 626.40±128.03×10-7 |
SME4 | D20K | 1584.99±33.78×10-7 |
SME5 | D20L | 597.30±126.62×10-7 |
SME6 | D20M | 720.06±131.48×10-7 |
SME7 | D20N | 574.50±95.45×10-7 |
SME8 | D20Q | 975.67±166.15×10-7 |
SME9 | D20R | 1567.86±32.11×10-7 |
SME10 | D20V | 19.45±11.21×10-7 |
SME11 | D20Y | 578.07±273.19×10-7 |
SME12 | D223A | 73.52±0.06×10-7 |
SME13 | D223C | 1.81±0.48×10-7 |
SME14 | D223Q | 99.81±31.24×10-7 |
SME15 | D223S | 636.86±42.27×10-7 |
SME16 | D223N | 500.87±188.48×10-7 |
实施例10:基于DnaE1突变体的突变器构建
根据上述DnaE1突变菌株的突变频率结果,选择突变频率较高的部分突变体构建突变器载体。首先,构建野生型DnaE1表达载体。根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组序列设计引物CgdnE1-F和CgdnE1-R,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板,通过PCR扩增获得野生型dnaE1片段。根据质粒pXMJ19(Biotechnology Techniques,1999,13(6),437-441)序列,设计引物P19-F/R,以质粒pXMJ19为模板,通过PCR扩增得到pXMJ19线性化载体片段。将上述两片段回收后重组连接,连接产物转化Trans T1感受态细胞,涂布于含34μg/mL氯霉素的LB抗性平板,过夜培养,挑阳性克隆进行菌落PCR和测序验证,正确的重组载体命名为pXMJ19-DnaE1WT。
其次,以上述pXMJ19-DnaE1WT重组载体为模板,分别利用引物D20H/I/K/L/M/N/Q/R/Y-F和D20X-R扩增得到突变体DnaE1-D20H/I/K/L/M/N/Q/R/Y的片段,分别利用引物D223A/Q/S/N-F和D223X-R扩增得到突变体DnaE1-D223A/Q/S/N的片段。将上述获得的突变体的片段分别纯化回收后利用T4多聚合核苷酸激酶(T4 PNK)进行末端磷酸化处理,然后使用T4连接酶自身环化连接,将连接产物转化Trans T1感受态细胞,涂布于含34μg/mL氯霉素的LB抗性平板,过夜培养,挑阳性克隆进行菌落PCR和测序验证,正确的重组载体分别命名为pXMJ19-DnaE1D20H、pXMJ19-DnaE1D20I、pXMJ19-DnaE1D20K、pXMJ19-DnaE1D20L、pXMJ19-DnaE1D20M、pXMJ19-DnaE1D20N、pXMJ19-DnaE1D20Q、pXMJ19-DnaE1D20R、pXMJ19-DnaE1D20Y、pXMJ19-DnaE1D223A、pXMJ19-DnaE1D223Q、pXMJ19-DnaE1D223S和pXMJ19-DnaE1D223N。
上述引物及的具体序列如表9所示。
表9.过表达DnaE1野生型和突变体扩增引物
引物名称 | 序列信息 | SEQ ID NO |
CgdnE1-F | TACGTGGTCTCGAATGgccaagcaatcctcatttgta | SEQ ID NO:74 |
CgdnE1-R | TGCATAGGTCTCAGCAGttaaccgaggatgcctggc | SEQ ID NO:75 |
P19-F | CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATC | SEQ ID NO:76 |
P19-R | TCTCAACTCCTTTAAGCTTAATT | SEQ ID NO:77 |
D20H-F | gagttttccatgcttCACggaatggccaagatcgat | SEQ ID NO:78 |
D20I-F | gagttttccatgcttATCggaatggccaagatcgat | SEQ ID NO:79 |
D20K-F | gagttttccatgcttAAGggaatggccaagatcgat | SEQ ID NO:80 |
D20L-F | gagttttccatgcttCTGggaatggccaagatcgat | SEQ ID NO:81 |
D20M-F | gagttttccatgcttATGggaatggccaagatcgat | SEQ ID NO:82 |
D20N-F | gagttttccatgcttAACggaatggccaagatcgat | SEQ ID NO:83 |
D20Q-F | gagttttccatgcttCAGggaatggccaagatcgat | SEQ ID NO:84 |
D20R-F | gagttttccatgcttCGCggaatggccaagatcgat | SEQ ID NO:85 |
D20Y-F | gagttttccatgcttTACggaatggccaagatcgat | SEQ ID NO:86 |
D20X-R | ggtgtggttgtgaagatgtacaaat | SEQ ID NO:87 |
D223A-F | cccctggtcaccaacGCAtgccactatgtgctggaatc | SEQ ID NO:88 |
D223Q-F | cccctggtcaccaacCAGtgccactatgtgctggaatc | SEQ ID NO:89 |
D223S-F | cccctggtcaccaacAGCtgccactatgtgctggaatc | SEQ ID NO:90 |
D223N-F | cccctggtcaccaacAACtgccactatgtgctggaatc | SEQ ID NO:91 |
D223X-R | tggcaaattgagcttgcgtcc | SEQ ID NO:92 |
实施例11:不同突变器突变频率检测
按照与实施例4相同的方法,将实施例10中构建的重组载体分别转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032中,构建得到过表达DnaE1野生型和突变体的菌株;再利用与实施例5相同的方法,测试实施例10中构建的突变器的突变频率。
结果如表10所示,与过表达野生型DnaE1的重组菌株相比,上述突变器引入后重组菌株的突变频率提升1-54倍。本发明公开的不同突变频率的突变器,在谷氨酸棒杆菌的生物工程应用中有较好的前景。
表10.不同突变器的突变频率
菌株 | 突变频率 |
ATCC 13032/pXMJ19 | 2.40±1.16×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1WT | 10.14±2.76×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D20H | 101.71±4.76×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D20I | 48.00±3.69×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D20K | 522.05±153.36×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D20L | 30.82±11.23×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D20M | 103.34±26.39×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D20N | 190.22±27.86×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D20Q | 155.80±36.71×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D20R | 555.32±71.66×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D20Y | 24.20±11.70×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D223A | 60.10±20.06×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D223Q | 119.04±14.07×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D223S | 17.66±2.04×10-7 |
ATCC 13032/pXMJ19-DnaE1D223N | 273.21±4.82×10-7 |
实施例12:DnaE1突变器在甲醇耐受进化中的应用
为了测试DnaE1突变器在菌株适应性进化中的应用,本发明选择了D223N的突变体,将上述带有突变器的菌株ATCC 13032/pXMJ19Ts-DnaE1D223N及其对照菌株分别进行甲醇耐受进化。通过不断提升甲醇浓度的适应性进化,携带突变器的菌株最终在70g/L甲醇的浓度下的生长明显优于对照菌株。将具有生长优势的培养液进行单菌落分选和测试后,得到了多株在70g/L甲醇的条件下生长明显优于出发菌株的甲醇耐受菌株,表明本发明开发的突变器在菌株适应性进化中具有良好的应用效果,具体应用效果可见中国发明专利202210833003.8,申请日2022年07月14日。
本公开中,谷氨酸棒杆菌的dnaE1基因编码的氨基酸的序列如下(SEQ ID NO:13):MAKQSSFVHLHNHTEFSMLDGMAKIDMLADEVKAQGMPAVGITDHGNMYGSNPFYRKMTEMGIKPIIGIETYMAPESRFKKERVRWGEPHQKSDDVSGSGAYLHQTMLAENTTGLRNLFYLSSMASYEGQLGKWPRMDADIIAEHAEGIIATTGCPSGDVQTRLRLGQFDEALEAAAMWQDIYGRDNYFLELMDHGLDIETRVRSELLEIGRKLNLPPLVTNDCHYVLESQAQAHEAMLCVQTGKTLHDEDRFKFGGTGYYVKSAEQMRALWDDMVPDGCDNTLWIAERVQSYDEIWEEHSHDRMPIADVPEGYTPTTWLHHEVMAGLEDRFSGQQVPEDYIERAEYEISVIDMKGYPSYFLIVAEIIKHARSIGIRVGPGRGSAAGALVAYALTITNIDPMEHGLLFERFLNPERPSAPDIDIDFDDRRRGEMIRYAADRWGEDKIAQVITFGTVKTKQALKDSARVQMGQPGYQIADRVIKELPPAIMAKDIPLSGITDPDHPRFNEAGAVRQLIETDPDVKRIYDTARGLEGVVRQSGVHACAVIMSSVPLLDCIPMWKRPADGALITGWDYPACEAIGLLKMDFLGLRNLTVIGDAIENIKANRDGEVLDLENLAIEDEETYKLLGRGETLGVFQLDGGGMQELLKRMQPTGFNDIVAALALYRPGPMGVNAHWDYADRKNGRKPITPIHPELEEALEEILGETYGLIVYQEQIMRISQKVANYTAGQADGFRKAMGKKKPEVLEKEFANFEGGMKANGYSDAAIKTLWDTILPFAGYAFNKSHAAGYGLVSFWTAYLKAHYAPEYMAALLTSVGDNKDKSAIYLSDCRHLGIRVLSPDINESSLNFLPVGTDIRYGLGAIRNVGAEVVDSILDTRKEKGLFKDFSDYLDKIDTLPCNKRITESLIKGGAFDSLGHARKGLMLVFEDAVDSVIATKKAADKGQFDLFAAFDSDNNDDVASFFQITVPDDEWDRKHELALEREMLGLYVSGHPLDGYEDAIAAQVDTALTTIVAGELKHGAEVTVGGIISGVDRRFSKKDGSPWAIVTIEDHNGASVELLVFNKVYSIVGSMIVEDNIILAKAHISIRDDRMSLFCDDLRVPELGPGNGQGLPLRLSMRTDQCTMSNIAKLKQVLVDNKGESDVYLNLIDGDNSTVMILGDHLRVNRSASLMGDLKATMGPGILG
本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此,除非特殊说明,所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外,从上述描述中,本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征,在不脱离本公开的精神及范围的情况下,可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件,因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
Claims (9)
1.一种DNA聚合酶IIIα亚基突变体,其中,所述突变体选自如下(i)-(iii)组成的组中的任一项:
(i)所述突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:13所示的序列,具有如下一个或多个位置处的突变的氨基酸:第20位突变为半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸或酪氨酸,和/或第223位突变为丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸或天冬酰胺;
(ii)与(i)所示的氨基酸序列具有至少90%,可选至少95%,优选至少97%,更优选至少98%,最优选至少99%的序列同一性的多肽;并且,含有所述突变体的突变体菌株相对于野生型菌株,具有提高的随机突变频率或降低的DNA复制保真率;
(iii)如(i)或(ii)所示氨基酸序列的多肽在N端和C端的至少一端添加或缺失一个或多个氨基酸的多肽;并且,含有所述多肽的突变体菌株相对于野生型菌株,具有提高的随机突变频率或降低的DNA复制保真率。
2.一种分离的多核苷酸,其中,所述多核苷酸编码如权利要求1所述的突变体。
3.一种重组表达载体,其中,所述载体包含如权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种重组宿主细胞,其中,所述重组宿主细胞包含如权利要求1所述的突变体、如权利要求2所述的多核苷酸或如权利要求3所述的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组宿主细胞,其中,所述宿主细胞来源于棒状杆菌属(Corynebacterium);优选的,所述宿主细胞来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
6.根据权利要求1所述的突变体,根据权利要求2所述的多核苷酸,根据权利要求3所述的载体,或根据权利要求4-5任一项所述的重组宿主细胞在如下(a)-(b)至少一种中的用途:
(a)制备具有提高的随机突变频率的突变体菌株;
(b)制备具有降低的DNA复制保真率的突变体菌株;
可选的,所述突变体菌株的来源为棒状杆菌属(Corynebacterium);优选的,所述突变体菌株的来源为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
7.一种筛选突变体菌株的方法,所述方法包括使用根据权利要求1所述的突变体,根据权利要求2所述的多核苷酸,根据权利要求3所述的载体,或根据权利要求4-5任一项所述的重组宿主细胞进行筛选的步骤;其中,所述突变体菌株具有提高的随机突变频率或具有降低的DNA复制保真率;
可选的,所述方法还包括分离纯化突变体菌株的步骤。
8.一种突变体菌株,其中,所述突变体菌株包含如权利要求1所述的突变体、如权利要求2所述的多核苷酸、如权利要求3所述的重组表达载体或权利要求4-5任一项所述的重组宿主细胞。
9.一种突变器,所述突变器包含如权利要求2所述的多核苷酸、与权利要求2所述的多核苷酸可操作地连接的具有起始转录活性的多核苷酸,以及能够在宿主细胞中复制的表达载体;
可选的,所述宿主细胞来源于棒状杆菌属(Corynebacterium);优选的,所述宿主细胞来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
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