CN101050465A - 一种编码β－酮酰辅酶A合成酶的水稻基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种编码β－酮酰辅酶A合成酶的水稻基因，命名为OsKCS1，包含具有启动子功能的起始密码子上游的2186bp和1560bp的编码区，编码519个氨基酸，含有典型的FAE1 CUT1 RppA结构域。T－DNA插入获得的水稻OsKCS1基因功能缺失突变体P1424植株矮小，叶片偶有卷曲，结实率低。进一步分析发现，突变体气生器官表面的蜡质明显减少，耐旱性也受到严重影响。在突变体中表达OsKCS1基因，能够使其恢复野生型表型，从而确定了OsKCS1基因与水稻表面蜡质合成和生长发育间的直接关系。该基因功能的鉴定，不管是从单子叶植物蜡质合成的生物化学理论研究的角度，还是从水稻或其它单子叶作物的抗旱性选育种应用的角度，都具有非常重要的意义。

Description

一种编码β-酮酰辅酶A合成酶的水稻基因

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地，本发明涉及与水稻表皮结构和生长发育相关的编码β-酮酰辅酶A合成酶的水稻基因，包括该基因的重组质粒、宿主及其应用。

背景技术

在植物体中，极长链脂肪酸(≥18C，very long-chain fatty acids，VLCFAs)及其衍生物是表皮蜡质、鞘脂、种子油和根部木栓质的重要组成成分。表皮作为植物与环境间的第一道屏障，由于有蜡质晶体覆于表面和无定形蜡质嵌入其中，能够减少非气孔水分蒸发，阻挡真菌、细菌、病毒和植食性昆虫等病虫害的侵袭，抵御紫外线、霜冻等的危害，对陆生植物起着重要的保护作用(Hamilton，1995)。

在质体中进行的脂肪酸从头合成途径(de novo synthesis pathway)是以脂酰CoA为受体(第一步的受体为乙酰CoA)、丙二酸单酰-ACP为C2供体，经过一系列连续的缩合、还原、脱水和再还原四步反应，生成链长依次增加2个碳原子的脂酰-ACP的过程，其最终产物是C16或C18的饱和脂肪酸(Buchanan et al.，2000)。更长链的脂肪酸，即VLCFAs，则是以C16或C18脂肪酸为前体进一步延伸而成的。

催化VLCFAs合成的脂肪酸延伸酶(fatty acid elongase，FAE)是定位于内质网膜上的多酶复合体，包含四种酶，即β-酮酰辅酶A合成酶(KCS)、β-酮酰辅酶A还原酶(KCR)、β-羟酰辅酶A脱水酶(HCD)和烯酰辅酶A还原酶(ECR)。在多酶体系的共同作用下，每轮缩合、还原、脱水和再还原反应的产物比起始酰基CoA的碳链延长2个碳原子(C2供体为丙二酸单酰CoA)。其中，由KCS催化的缩合反应是整个延伸反应的限速步骤，同时，KCS还决定着反应的底物特异性。

尽管早在20世纪60、70年代就开始了对植物VLCFAs合成的研究，但是，酶的疏水性使得常规生物化学方法难以分离，而且单纯的遗传学方法也没有从大麦、玉米、油菜、拟南芥等植物的缺蜡突变体中成功确定相关的基因位点，因而限制了对VLCFAs合成的了解。近年来，随着基因组学的迅速发展，突变体已成为研究植物基因功能最有力的工具。

在拟南芥中克隆到的第一个β-酮酰辅酶A合成酶基因是在种子中特异表达的FAE1(James et al.，1995)。fae1突变体种子中VLCFAs的总量大幅降低，成分分析发现是C18→→C22链延伸反应受到抑制。因此推测FAE1基因编码催化拟南芥种子中VLCFAs链长由C18延伸到C20和C22反应的缩合酶。随后，相继在加州希蒙得木(Lassner et al.，1996)和油菜(Barret etal.，1998)中克隆到种子中表达的缩合酶基因。加州希蒙得木的ScKCS基因和拟南芥的FAE1基因转化的油菜种子中VLCFAs的成分都有明显改变(Lassner et al.，1996；Katavic et al.，2000)，为油菜的定向育种奠定了基础。

在拟南芥基因组中进行搜索，找到21个序列可能编码β-酮酰辅酶A合成酶，KCS1(Todd et al.，1999)是其中之一。该基因在根、茎、叶、花、果荚、种子中均有表达，但以茎、花、根和5天时子叶中的表达量为高。其突变体茎杆较细，苗期对低湿度胁迫反应强烈。不同部位蜡质或木栓层VLCFAs组分分析能够发现某些成分的含量有明显变化，但链长变化不一致，因而不能确定KCS1催化哪一步或哪几步链的延伸反应。尽管蜡质成分有变化，但突变体并没有产生光亮表型，可能是该基因突变对表面蜡质的主要成分影响不大的原因。

cer6是拟南芥中发现的缺蜡光亮表型突变体之一(Millar et al.，1999；Fiebig et al.，2000)。CER6基因只在地上部分表达。其突变体茎杆、叶片及花粉表面的蜡质中＞28C的组分明显减少，而因过量表达CER6基因蜡质合成严重受抑制的拟南芥植株茎杆表面蜡质中24C组分有明显累积现象，由此推断CER6基因在24C→→28C链延伸反应中起作用。花粉表面蜡质成分的改变使cer6突变体的育性降低。

对器官融合型突变体fiddlehead进行基因克隆，发现FDH基因(Yephremov et al.，1999)与FAE1、KCS1、CER6、ScKCS和BnFAE在核苷酸水平上有54.5-56％的同源性，在氨基酸水平上有73-73.5％的保守性。FDH基因的突变不仅导致叶片和花等器官的融合，还阻碍了表皮毛的分化。进一步的功能分析表明，FDH基因参与的脂肪酸代谢反应是影响表皮细胞粘连和分化的原因。

拟南芥HIC基因(Gray et al.2000)是另一个改变叶片表皮结构的KCS家族成员，对气孔发育起负调控作用。气孔密度的变化影响着植株对CO₂吸收和水分蒸腾的反应。

与拟南芥、油菜等双子叶植物相比较，单子叶植物在形态结构和生长发育等方面都有很大的不同。尽管在大麦(Wettstein et al.，1987)、高粱(Jenks et al.，2000)、玉米(Bianchi et al.，1978；Evans et al.，1994；Tacke etal.，1995；Hansen et al.，1997；Xu et al.，1997)等作物中都发现了缺蜡突变体，但直到现在还没有鉴定到在蜡质合成中起重要作用的编码β-酮酰辅酶A合成酶的基因。

水稻作为世界上最重要的粮食作物，因其具有基因组较小(430Mb)且已完成全基因组测序，与其它重要经济作物(如小麦、玉米、谷子和高梁等)有共线性，遗传转化相对容易等特点，已成为研究单子叶植物功能基因的模式种(Goff，1999)。

在水稻选育种过程中，已经注意到旱稻品种表面蜡质含量高于水稻品种(O′Toole et al.，1979)，而且这一性状是稳定、可遗传的(Haque et al.，1992)。同时，表面蜡质含量与水稻品种的稻瘟菌、褐飞虱等抗性也有密切关系(Kumar and Sridhar，1987；Woodhead and Padgham，1988)。目前，只有一水稻花药表面蜡质缺失突变体被报道(Jung et al.，2006)，其叶片表面蜡质含量与野生型无明显差异。因而，在分子水平上通过改变叶片表皮结构实现水稻抗性育种还存在困难。

本发明所涉及的是一个气生器官表面蜡质减少的水稻突变体。突变体P1424的创建及OsKCS1基因功能的鉴定，不仅能够促进单子叶植物蜡质生物合成的理论研究，还可以提高农作物抗旱性育种水平。在世界范围内水资源短缺与粮食需求间矛盾日益凸显的今天，后者具有非常重要的实际意义。

发明内容

T-DNA标签技术是分离和研究植物功能基因的有效方法。本发明通过筛选自建水稻T-DNA插入突变体库(Sha et al.2004)，发现突变体P1424植株矮化，叶片短，且偶有卷曲，穗小，且结实率低。遗传分析表明这些表型是由于T-DNA插入在一基因的5′端不翻译区(un-translated region，UTR)阻断其功能引起的。该基因的编码区为1560bp，编码一个含519个氨基酸的蛋白质，与拟南芥脂肪酸延伸酶系中的KCS家族基因具有很高的同源性，含有典型的FAE1_CUT1_RppA结构域，故将其命名为OsKCS1。

鉴于拟南芥KCS家族基因的功能，推测OsKCS1基因与水稻表面蜡质合成有关。对突变体P1424的表面进行超微结构观察，发现突变体表面的蜡质有明显减少。突变体P1424的叶片卷曲表型，亦与表皮结构的改变有密切关系。而且，由于表面蜡质的减少，突变体的抗旱性明显降低。

为进一步证实OsKCS1基因功能缺失是产生突变体表型的真正原因，本发明构建了OsKCS1基因的互补载体pOsKCS1，通过根癌农杆菌介导的方法转化突变体P1424。获得的T₀代转基因植株确实如预期所料，植株和叶片形态及表面蜡质含量、结实等都恢复了野生型表型。由此表明，OsKCS1基因参与了水稻表面蜡质合成反应，并影响着水稻的生长发育过程。

因此，本发明的一个方面提供一种编码β-酮酰辅酶A合成酶的水稻基因，其核苷酸序列选自SEQ ID NO：1所示的序列和在严谨杂交条件下与SEQ ID NO：1所示的序列杂交的序列。本领域的普通技术人员可以根据具体的序列确定所述严谨杂交条件。在一个具体的实施方案中，所述严谨杂交条件如下：

2×SSC/0.1％SDS在65℃洗15min，1×SSC/0.1％SDS在65℃洗10min，0.5×SSC/0.1％SDS在65℃洗5min，然后压磷屏16hr，Storm 840(AmershamBiosciences公司)扫描样品。

本发明的另一个方面提供一种获得水稻转基因系P1424的方法，其特征在于，将植物表达载体pCAMBIA 1301的T-DNA单拷贝插入在水稻中本发明所述的OsKCS1基因编码区的5′端不翻译区。

本发明的另一个方面提供一种表达载体，其特征在于，它包含本发明所述的OsKCS1基因编码区和启动子区。还涉及所述表达载体在转化植物获得转基因植物中的应用。在一个具体的实施方案中，所述表达载体是从保藏号为CGMCC No.1965的大肠杆菌中获得的本发明所述的OsKCS1基因编码区的pOsKCS1。

本发明的另一个方面提供一种宿主细胞，其特征在于，它包含上述表达载体。优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌DH10B或根癌农杆菌EHA105。在一个具体的实施方案中，所述宿主细胞是包含上述表达载体的大肠杆菌(Escherichia coli)DH10B CGMCC No.1965。

本发明的另一个方面，提供本发明所述的OsKCS1基因在单子叶植物、优选水稻抗旱性方面的应用。

本发明的另一个方面，提供一种植物细胞，优选水稻细胞，其包含本发明所述的编码β-酮酰辅酶A合成酶的水稻基因。

本发明的再一个方面，提供一种启动子，其序列是SEQ ID NO：4所示的序列。

附图说明：

图1：突变体P1424的表型，A.植株，B.叶片，C.穗。在各组图片中，左边为日本晴(野生型)，右边为突变体P1424。

图2：T1代分离群体的共分离鉴定，是以潮霉素B抗性基因片段为探针进行的Southern分析。M：1kb Marker(NEB公司)，片段从大到小依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb；Mutant：突变体表型植株(19株)，Wild-type：野生型表型植株(20株)。

图3：T-DNA插入位点示意图。

图4：T1代分离群体的共分离鉴定，是以TAIL-PCR扩增产物为探针进行的Southern分析。M：1kb Marker(NEB公司)，片段从大到小依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb；Mutant：突变体表型(19株)，Wild-type：野生型表型(20株)。

图5：β-酮酰辅酶A合成酶氨基酸序列比对结果。*表示对应氨基酸完全相同，:表示对应氨基酸性质相似，.表示对应氨基酸性质较相似。

图6：水稻和拟南芥中β-酮酰辅酶A合成酶的进化树分析。

图7：日本晴和突变体P1424表面蜡质差异的扫描电镜照片。A、B：叶片的上表面，C、D：叶片的下表面，E、F：叶鞘的外表面，其中，A、C、E为日本晴，B、D、F为突变体P1424。

图8：扫描电镜下的突变体P1424卷曲叶片的表面融合现象。A：卷曲叶片的横切面，B：表面融合部位的局部放大，C：图片A的取样部位示意。

图9：耐旱性试验结果。DAD：干旱天数(days after drying)；DAR：恢复天数(days after recovering)。

标示植株为日本晴， 标示植株为突变体P1424。

图10：互补载体pOsKCS1的限制性内切酶酶切验证。SacI酶切产生10.4kb和2.2kb大小的2个片段，EcoRV酶切产生5.5kb、4.7kb和2.4kb大小的3个片段，BstEII酶切产生9.2kb和3.4kb大小的2个片段，NcoI酶切产生8.6kb和4kb大小的2个片段。M：1kb Marker(NEB公司)，片段从大到小依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1.5kb。

图11：载体示意图。A：转化载体pCAMBIA 2301，B：互补载体pOsKCS1。

图12：互补植株恢复野生型表型。左盆：日本晴，中盆：互补植株，右盆：P1424。

图13：互补植株的Southern分析。两互补植株都有一与突变体P1424相同的杂交带和另一因互补载体成功转化产生的杂交带。M：1kb Marker(NEB)，片段从大到小依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb；NB：日本晴，Mu：P1424，C1、C2：互补转化系。

包含1560bp的OsKCS1基因编码区(SEQ ID NO：1)和2186bp的上游启动子区(SEQ ID NO：4)的大肠杆菌DH10B于2007年3月12日送中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1965，命名为pOsKCS1。

具体实施方式

下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，并非限制本发明。本发明的保护范围由后附的权利要求所界定。

实施例1：日本晴T-DNA插入突变体P1424的获得

水稻突变体P1424是通过根癌农杆菌介导转化的方法(Hiei，et al.，1994)获得的。具体方法如下：

1.水稻愈伤组织的诱导

取成熟的水稻(日本晴)种子(International Rice Research Institute，IRRI)，脱壳，用70％乙醇处理1-2min，0.1％氯化汞处理15-20min，灭菌的去离子水冲洗4-6次。无菌滤纸吸干表面水分后，接种到含2mg/L 2，4-D(Fluka公司)的NB₀培养基(具体成分见附表1)上，parafilm膜封口，在25℃培养箱内暗培养，诱导胚性愈伤组织。7-10天后，剥离由盾片诱导出来的愈伤组织，继代培养于相同的培养基上。25℃培养箱内暗培养约20天后，得到可用于转化的旺盛生长的胚性愈伤组织。

2.农杆菌的培养与前处理

将含有pCAMBIA 1301(Hajdukiewicz et al.，1994)的EHA105(Hood etal.，1993)保存液在含有50mg/L卡那霉素(Amresco公司)和10mg/L利福平(Sigma公司)的LB固体培养基(具体成分见附表1)上划线，28℃暗培养2天，挑取单菌落到含相同抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm摇动培养约12hr至菌液浓度达到OD₅₉₅≈0.5，再以1％接种量转接于含相同抗生素的ABC培养基(具体成分见附表1)中，28℃，200rpm摇动培养约14hr至菌液浓度达到OD₅₉₅≈0.8-1.0。将菌液倒入灭菌的50mL离心管中，eppendorf 5810R离心机室温下3800rpm离心30min收集菌体，倒掉上清，用等体积的AAM培养基(具体成分见附表1)重悬菌体一次，再次离心后，用AAM培养基重悬菌体至OD₅₉₅≈0.3，备转化用。

3.水稻胚性愈伤组织和农杆菌的共培养

挑取淡黄色旺盛生长的水稻愈伤组织至无菌培养皿中，把上述农杆菌菌液倒入培养皿，轻轻搅动混匀使水稻愈伤组织充分浸泡在菌液中。15-20min后，倒掉菌液，将愈伤组织接种于2N6-AS培养基(具体成分见附表1)上，25℃培养箱内暗培养2-3天。期间检查农杆菌的生长状况，以农杆菌长满水稻愈伤组织表面为宜。

4.水稻转化体的筛选和植株的再生

将共培养后的愈伤组织转移至灭菌的三角瓶中，用灭菌的去离子水清洗约15次，至液体澄清为止，再加入含500mg/L头孢霉素(Sigma公司)和200mg/L氨苄青霉素(华北制药股份有限公司)的灭菌去离子水，25℃条件下120rpm摇动清洗2hr。倒掉去离子水，并将洗后愈伤组织转移至无菌滤纸上，晾干后的愈伤组织接种于含2mg/L 2，4-D、250mg/L头孢霉素、200mg/L氨苄青霉素和50mg/L潮霉素B(Roche公司)的NB₀培养基上，parafilm膜封口，25℃培养箱内暗培养20-30天。期间时常观察愈伤状态和生长情况，避免杂菌污染。挑取潮霉素B抗性愈伤组织继代培养于相同培养基，25℃培养箱内再暗培养约15天。

将旺盛生长的潮霉素B抗性愈伤组织接种于含1.0mg/L 6-BA(Sigma公司)，2.0mg/L NAA(北京化学试剂公司)，5.0mg/L ABA(Sigma公司)和50mg/L潮霉素B的NB₀培养基上进行预分化，25℃培养箱内暗培养约15天后，再挑取白色致密的抗性愈伤组织接种于含2.0mg/L 6-BA，1.0mg/LIAA(北京化学试剂公司)，1.0mg/L NAA，1.0mg/L KT(Sigma公司)和50mg/L潮霉素B的NB₀培养基上进行分化，25℃培养箱内光照培养(2000lux，光照16hr/黑暗8hr)约20天。将分化出芽的愈伤组织接种于含0.5mg/LNAA的1/2MS固体培养基(具体成分见附表1)上，25℃光照培养(4000lux，光照16hr/黑暗8hr)约30天后，将健壮植株移至网室栽培。

5.转基因植株的表型观察

待转基因植株结实后，播种T1代种子。在生长过程中，观察记录各转基因系的植株各器官形态、数量等的变化。突变体P1424植株矮化，株高只有野生型的2/3；叶片短，偶有卷曲；开花比野生型晚15天左右，穗小，且结实率因环境条件(温度、湿度等)的不同而有很大变化(0-80％)(附图1)。在T1代分离群体中，野生型与突变体表型的比例为69∶19，经x²检验，P＞0.5，表明分离比例符合3∶1，由此推测突变体P1424的表型可能是由于T-DNA插入导致单基因突变引起的。

实施例2：突变体P1424的遗传学分析

转基因水稻植株的突变表型并不都是由于T-DNA插入引起的(An etal.，2005)，所以必须通过遗传学分析确认突变体表型与T-DNA插入是否呈现共分离。

1.水稻基因组DNA的提取与定量

水稻DNA提取按Dellaporta等所述方法(Malmberg et al.，1985)进行。具体步骤如下：

(1)取3-5g新鲜水稻叶片，液氮速冻，在研钵中快速研磨成粉末状，转入50ml离心管中；

(2)立即加入20ml预热至65℃的提取缓冲液(1M Tris-HCl(pH8.0)100ml/L，0.5M EDTA(pH8.0)100ml/L，5M NaCl 100ml/L，10％SDS 125ml/L，β-巯基乙醇1.5ml/L)中，65℃水浴30min；

(3)加入7.5ml 5M醋酸钾，轻轻颠倒混匀，冰上放置20min，eppendorf5810R离心机4000rpm离心20min，将上清转移到另一干净的50ml离心管中；

(4)加入15ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒混匀，4000rpm离心20min，将上清转移到另一干净的50ml离心管中；

(5)加入15ml冰预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min；

(6)4000rpm离心20min，弃上清，用20ml 70％乙醇洗一次，倒置离心管于干净的滤纸上，室温晾干后，将沉淀重悬于700μl ddH₂O中；

(7)转入干净的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心15min，将上清转入一干净的2ml离心管中，加入70μl 3M醋酸钠(pH5.2)和2倍体积冰预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min；

(8)12000rpm离心15min，弃上清，1ml 70％乙醇洗一遍，12000rpm离心10min，弃上清，室温晾干沉淀后，溶于100μl ddH₂O中；加入2μlRNase(10mg/ml)。

(9)DNA的定量用紫外测定法或凝胶电泳法确定。

2.Southen blotting分析

植物表达载体pCAMBIA 1301的T-DNA上有一个潮霉素B抗性基因。根据该基因序列设计探针引物Hyg-1：5′-TGCGCCCAAGCTGCATCAT-3′(SEQ ID NO：7)，Hyg-2：5′-TGAACTCACCGCGACGTCTGT-3′(SEQ IDNO：8)。以pCAMBIA 1301的质粒DNA(提取方法见《分子克隆实验指南》(Sambrook and Russell，2001))为模板进行PCR扩增(反应条件：94℃4min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环；72℃8min。反应体系：1×PCR反应缓冲液，1U Taq DNA聚合酶(Takara公司)，20ngpCAMBIA 1301质粒DNA，0.2mM dNTP，0.2μM Hyg-1，O.2μMHyg-2，ddH₂O补充至20μl)，得到一个长度为858bp的片段，用作Southern杂交的探针。

在上述T1代分离群体中，取全部突变体(19株)和部分野生型表型植株(20株)的基因组DNA各10μM，加1μl HindIII(Takara公司)和2.5μl10×M缓冲液，ddH₂O补充至25μl，37℃酶切过夜，在1％琼脂糖凝胶上以2V/cm电压电泳分离酶切后的DNA，时间约6hr。DNA胶的转膜、探针标记及杂交反应均参照《分子克隆实验指南》(Sambrook and Russell，2001)进行。具体步骤如下：DNA胶在0.25M HCI中变性约15min，至溴酚蓝指示剂变成黄色，再在0.4M NaOH中变性约20min，至溴酚蓝指示剂再变为蓝色；用0.4M NaOH上行毛细管法将DNA转移到Hybond-N+尼龙膜(Amersham公司)上。α-³²P-dCTP(北京福瑞生物工程公司)和Prime-a-Gene LabelingSystem标记试剂盒(Promega公司)标记探针后进行Southern杂交。

从Southern杂交结果(附图2)看，全部突变体都有一条杂交带，野生型表型的植株由于包括纯合体和杂合体两种基因型，表现出有一条杂交带和无杂交带两种表型。这一结果表明，突变体P1424基因组中的T-DNA为单拷贝插入，且突变体的植株矮化等表型与T-DNA插入呈现共分离，从而证实了突变体P1424的表型是T-DNA插入的结果。

实施例3：T-DNA插入位点分析

T-DNA在基因组DNA中是随机插入的。突变体P1424中T-DNA的插入位点是由热不均一交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)方法(Liu et al.，1995)确定的。TAIL-PCR反应中的三个特异引物分别为：

SP1：5′-GGTGACCAGCTCGAATTTCCC-3′(SEQ ID NO：9)

SP2：5′-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3′(SEQ ID NO：10)

SP3：5′-GCGCGCGGTGTCATCTATGT-3′(SEQ ID NO：11)

随机引物为AD4：5′-TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3′(SEQ ID NO：12)。以P1424基因组DNA为模板进行扩增，扩增程序参照文献(Liu et al.，1995)。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(申能博彩生物科技有限公司)回收约800bp的特异扩增条带，并连接到pGEM-T easy载体(Promega公司)上进行测序(三博远志生物有限责任公司)。

将测序结果在Genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行blastn分析，发现T-DNA插入在水稻基因组的第6号染色体P0642B07.46基因上。将T-DNA插入位点的侧翼序列在日本的粳稻cDNA注释网站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)上进行blastn分析，发现T-DNA插入在编号为AK101377的cDNA的5′-UTR的内含子上(附图3)。比较AK101377的cDNA序列与基因组DNA序列，发现该基因有2个外显子和1个内含子，最长编码区为1560bp。内含子长226bp，位于5′-UTR上，距起始密码子6bp，T-DNA插入位点距起始密码子93bp。

实施例4：TI代分离群体共分离的再验证

TAIL-PCR扩增产物序列包括部分T-DNA及其插入位点侧翼的水稻基因组DNA，因此，以其为探针对T1代分离群体进行共分离验证具有更明显的优势。Southern杂交结果(附图4)显示，突变体和野生型纯合体各有一条大小不同的杂交带，杂合体则具有这两条杂交带。该结果与潮霉素B抗性基因探针的杂交结果相一致，且更进一步将同样表现为野生型表型的纯合体和杂合体区分开来。

实施例5：阻断基因的功能分析

1.阻断基因功能的生物信息学预测

AK101377的最长编码区编码一个含519个氨基酸的蛋白质。将其序列在http://www.sanger.ac.uk/Sofiware/Pfam网站上进行功能结构域分析，发现在第99-388个氨基酸间具有典型的FAE1_CUT1_RppA结构域，可能编码β-酮酰辅酶A合成酶(KCS)。目前，在拟南芥中已鉴定的KCS家族基因有FAE1、KCS1、CER6、FDH和HIC。氨基酸序列比对分析(bl2seq)结果表明，突变体P1424中由于T-DNA插入阻断功能基因编码的蛋白质与它们的序列同源性(identity)高达49％-59％。因此，将该阻断基因命名为OsKCS1。

在粳稻的cDNA数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中搜索，找到2个与OsKCS1基因在氨基酸水平上同源性高达78.2％和76.5％的序列(编号分别为AK067907和AK070754)，暂将其命名为OsKCS2和OsKCS3。尽管三者间有如此高的同源性，单独OsKCS1基因的功能缺失即可导致表型发生明显变化，说明OsKCS2和OsKCS3基因功能与OsKCS1不同，彼此间不能形成功能互补。

应用Clustal W 1.83软件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)对水稻和拟南芥中8个β-酮酰辅酶A合成酶(OsKCS1、OsKCS2和OsKCS3及FAE1、CER6、FDH、KCS1和HIC)进行多重序列比对分析，结果见附图5。拟南芥KCS家族的21个成员与粳稻的cDNA数据库中检索到的18个具FAE1_CUT1_RppA结构域的成员进行进化树分析，结果如附图6所示。从各分支成员来看，两种植物的KCS家族成员分布不是随机的，而是有一定的偏向性。由此推测KCS家族在单、双子叶植物分化前就已存在，并在分化后的进化过程中沿各自的途径发生演变。

2.OsKCS1在水稻气生器官表面蜡质的合成中起重要作用

根据生物信息学分析结果，推测OsKCS1可能编码β-酮酰辅酶A合成酶(KCS)。拟南芥KCS家族基因的研究结果显示，该酶在VLCFAs链的延伸反应中起作用，可能影响植物表面蜡质的生物合成。据此，我们应用Quanta200扫描电子显微镜(FEI公司)观察比较了水稻突变体P1424与野生型的表面蜡质。

电镜观察样品采用干燥法(Jenks et al.，1992)制备。水稻突变体P1424与日本晴生长约8周后，采集其完全伸展的叶片、叶鞘和茎杆，室温下空气中干燥48-72hr。从各材料的中间部位取适当大小，分上下表面用导电胶粘至载样台上，喷金(30sec/次，5次)后，即可在扫描电镜下进行观察。

电镜观察显示，水稻叶片的上、下表面覆盖有薄片层状的蜡质晶体，叶鞘的外表面蜡质晶体片层较厚，而叶鞘的内表面和茎杆的内外表面没有类似结构。与日本晴相比较，在突变体P1424中，蜡质晶体结构无明显变化，而晶体数量有明显减少(附图7)。由此推断OsKCS1基因在水稻表面蜡质合成过程中起着重要作用。表面蜡质作为植物与环境间的第一道屏障，对植物体起着重要的保护作用。推测蜡质的减少使得突变体P1424对环境条件(温度、湿度、光照等)变得敏感，因而产生植株矮化等表型。

实施例6：表面融合导致突变体P1424的叶片卷曲

突变体P1424的叶片变短，且有些叶片中间部分发生卷曲，数天内即干枯凋落。叶片卷曲部分依靠外力也不能展开。为了了解叶片卷曲的原因，我们取叶片卷曲部分，横切，在Quanta 200扫描电子显微镜下进行观察。发现叶片边缘某部分上表面与叶片另外部分的下表面发生融合，导致中间未融合部分卷曲其间，不能正常展开(附图8)。突变体P1424发生表面融合现象是其表皮结构发生变化的结果。因为并非全部突变体P1424的叶片都呈卷曲状，推测表面融合现象的发生还与生长环境条件有关。

实施例7：突变体P1424的耐旱性降低

植物表面蜡质的主要功能之一是阻止体内水分的非气孔损失，因此进行了突变体P1424和日本晴的耐旱性比较试验。具体过程如下：每盆各种植4株日本晴和4株P1424(目的是消除种植条件对试验的影响)，共种植5盆。在网室生长约6周后，将它们移至玻璃温室内(目的是避免雨水等影响)干燥处，并停止浇水。待干燥12天后，将它们再移至网室内正常浇水，恢复生长10天。结果是20株日本晴中有13株抽出新的绿色叶片，突变体则全部干枯死亡(附图9)。由此表明，表面蜡质减少确实导致突变体P1424的耐旱性明显降低。

实施例8：突变体P1424的互补实验

1.OsKCS1基因表达载体pOsKCS1的构建

根据OsKCS1基因的cDNA序列(AK101377)，设计PCR引物1424S-1：5′- GAGCTCTCCAGAGATGGAGACCTCGG-3′(SEQ ID NO：2)和1424S-2：5′-G GGT(A/T)ACCCCACTCAACCCACCATACTTTT-3′(SEQ IDNO：3)，5′端分别加了SacI限制性酶切位点和BstEII限制性酶切位点(以斜体、下划线表示)。引物由英骏生物技术有限公司合成。以水稻基因组DNA为模板，在含有1x扩增缓冲液，0.2μM扩增引物，0.2mM dNTPs，1U Easy-A高保真DNA聚合酶(Stratagene公司)的20μl扩增体系中进行PCR扩增反应。扩增条件为：94℃，4min；94℃，1min，60℃，1min，72℃，2min，循环35次；72℃，8min。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，回收约1.6kb大小的条带，与pGEM-T easy载体16℃连接过夜。取2μl连接产物电击转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在含x-gal(Amresco公司)、IPTG(Sigma公司)和100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜。挑取白色菌落摇菌提质粒。限制性内切酶分析，确定连接成功后，进行测序。插入片段序列与Genbank数据库中的水稻基因组序列进行比对，直至确认扩增产物片段序列完全正确。

根据OsKCS1基因的启动子区序列(SEQ ID NO：4)，设计PCR引物1424Pr-1：5′-GC TCTAGAATCTGCTCGGCCTTGG-3′(SEQ ID NO：5)和1424Pr-2：5′- GAGCTCCTCTGGCTGATGCAAAAA-3′(SEQ ID NO：6)，5′端分别加了XbaI限制性酶切位点和SacI限制性酶切位点(以斜体、下划线表示)。如上所述方法扩增启动子区并测序。启动子区片段长度为2186bp。

分别用SacI/BstEII和XbaI/SacI从pGEM-T easy载体上切下OsKCS1基因的编码区和启动子区，再与XbaI/BstEII切下的约8.8kb的pCAMBIA 2301片段(附图11A)进行连接。连接产物电击转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上进行筛选。挑取单菌落，37℃摇菌过夜，提取质粒，限制性内切酶酶切验证。结果见附图10。成功连接的互补载体被命名为pOsKCS1(附图11B)。将质粒电击转化到根癌农杆菌EHA105菌株中，在含50mg/L卡那霉素和10mg/L利福平的LB培养基上28℃生长2天，挑取单菌落，即可按如前所述方法培养农杆菌，用于转化突变体P1424。

2.突变体P1424的遗传转化

用互补载体pOsKCS1转化水稻突变体P1424，方法如前所述。不同之处在于筛选用抗生素为G418(浓度为150mg/L)，而不是潮霉素B，因为突变体P1424已具有潮霉素B抗性。

3.互补植株的Southern blot分析

将转基因植株移栽至网室，生长约8周时，观察其表型。发现植株高度及叶片形态等均与日本晴相似，无叶片卷曲等表型(附图12)。

选取两个转基因系(C1、C2)进行Southern blot分析。Southern杂交步骤如前所述，探针为TAIL-PCR扩增产物，基因组DNA分别用HindIII和EcoRI进行酶切。杂交结果(附图13)显示表型正常的植株均有一条约6kb的杂交带，表明这些植株是由突变体P1424转化而来的。另外一条则表明OsKCS1基因成功转化到突变体P1424中。OsKCS1基因能够使突变体P1424恢复野生型表型，进一步证实了OsKCS1基因功能缺失是导致突变体P1424表型产生的原因。

结论：

OsKCS1基因编码β-酮酰辅酶A合成酶，是水稻中第一个被鉴定功能的KCS家族基因。该基因在水稻气生器官表面蜡质的合成过程中起重要作用，能够导致表皮结构的改变，进而影响植株的抗旱性。该基因功能的阐明，能够促进单子叶植物蜡质合成的生物化学理论研究，加快水稻或其它单子叶作物的抗旱性选育种进程，因而具有重要的理论与实践意义。

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附表1培养基成分表

名称	成分
		LB	胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，PH7.0(固体培养基需加15g/L琼脂粉)
NB0	N6大量盐，B5微量盐和B5有机，300mg/L酪蛋白水解物，500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L Phytagel，PH5.8
		ABC	A液：20×磷酸缓冲液(60g/L K2HPO4，20g/L NaH2PO4)B液：20×盐溶液(20g/L NH4Cl，6g/L MgSO4·7H2O，3g/LKCl，0.2g/L CaCl2，0.05g/L FeSO4·7H2O，pH7.0)C液：5g蔗糖/900ml水临用前，按5∶5∶90比例混合。
AAM	AA盐和氨基酸，MS维生素，0.5g/L酪蛋白水鲜物，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，100μM乙酰丁香酮，PH5.2
		2N6-AS	N6大量盐，N6微量盐和维生素，2mg/L 2.4-D，1g/L酪蛋白水鲜物，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，2.0g/L Phytagel，100μM乙酰丁香酮，PH5.2
1/2MS	1/2MS无机盐和维生素，30g/L蔗糖，3.0g/Phytagel，PH 5.8

                                IB071015-序列表

                SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种编码β-酮酰辅酶A合成酶的水稻基因

<130>IB071015

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1560

<212>DNA

<213>水稻

<400>1

atggagacct cggcggcggc ggcgcccaat ggcggcgcgg cggcggcgga gcagcagcag    60

cggcgtcggc tgccggactt ccagcagtcg gtgaggctca agtacgtgaa gctggggtac    120

cactacctca tctcccacgg catgtacctg ctgctgtcgc cgctgatggc gctggtggcc    180

gtgcagctct ccaccgtgtc cccgggcgac atcgccgacc tgtgggagca gctccgcttc    240

aacctcctct ccgtcgtcgc ctgctccacc ctcctcgtct tcctctccac cctctacttc    300

ctcacccgcc cccgccccgt ctacctcctc gacttcgcct gctacaagcc cgacccccag    360

cgcaagtgca cccgcgagac cttcatgcgc tgctccagcc tcaccggctc cttcaccgac    420

gccaacctcg acttccagcg caagatcctc gagcgctccg gcctcggcga ggacacctac    480

ctccctcccg ccgtgctgcg cgtcccgccc aacccgtgca tggacgaggc ccgcaaggag    540

gcccgcaccg tcatgttcgg cgccattgac cagcttcttg agaagacggg tgtgaagccc    600

aaggacattg gtgtggttgt cgtcaattgc agcttgttca acccgacgcc gtcgctgtcc    660

gccatggttg tgaaccacta caagctgagg gggaatgtca tcagctacaa cctcggcggg    720

atggggtgca gtgccggctt gctgtccgtc gatctcgcca aggacttgct gcaggtgcac    780

ccaaactcgt acgcgctggt ggtcagcatg gagaacatca cgctcaattg gtactttggc    840

aacaaccggt cgatgctcgt gtcgaattgc ctgttccgga tgggcggcgc cgccatcctg    900

ctgtcgaaca ggcggtccga ccgccggagg tccaagtatg agcttgtgca caccgtgcgc    960

acgcacaagg gcgccaacga caagtgcttt ggctgtgtca cccaggagga agacgagatc    1020

ggcaagatcg gcgtgtcgct ctccaaggac ctgatggcgg tggccggaga cgcgctgaag    1080

acgaacatca ccaccctcgg gccgctcgtg ctcccgttgt cggagcagct gctcttcatg    1140

gccacattgg ttgccaagaa ggtcctcaag atgaagatca agccatacat tcccgatttc    1200

                                               IB071015-序列表

aagctggcat ttgagcattt ctgcatccat gccggtggcc gtgccgtgct ggatgagctg    1260

gagaagaact tggagttgac tgactggcac atggagccat ctaggatgac actgtaccgg    1320

tttggcaaca catcgagcag ctcactctgg tatgagctgg cgtacaccga ggcgaagggg    1380

aggatcagga agcgggacag gatctggcag attgcatttg gatctggttt caagtgcaac    1440

agcgcagtct ggaaggcgct gcaaacagtg aatccagcga aggagaagaa cccctggatg    1500

gatgagattg acaacttccc ggttgaagtt ccaaagatat caaaggttgg aaatgcatga    1560

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gagctctcca gagatggaga cctcgg                                         26

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>n＝a或t

<400>3

gggtnacccc actcaaccca ccatactttt                                     30

<210>4

<211>2186

<212>DNA

<213>水稻

<400>4

atctgctcgg ccttggtagc tcataggtgt gcgtgcttta ctacggatga ctatattttg    60

atatgaaaaa aaatgattat gtgaagatag taaaaaaaca acacaagcca aatttttgta    120

tctccaaaca caaaatttgt ccagtggtat atatttgcat ttacccatcc tcagtcaaaa    180

gatcagacca acaatatgga catatggttc aattccggtc aaaatttgta aaccttgaaa    240

agggcttgag aaaagtactc cttgcaaaat tattttcagc ttaaaaggaa aaggtttcca    300

catataaaaa aactattatt attcacttcc agcctttcag gacaacaact ggccccacct    360

ttggccccat attcagcaat gtagcgtttc cagcccatgt gggccccaca tgcgagccga    420

                                               IB071015-序列表

aaaaaaaata gtgggtgacc atcgctgctg atacaagttg atcccagccg tccatttgga    480

tcccaacgag atagtggccg tcgatctggc agaccggcac tggatttccg gtgcacaaaa    540

tagccgaaaa cgtgtgttgt tttacccgtg tgtcctggcg cttgcagaaa attacacgta    600

catgtacagg cattgggtcc ttgtgtttat acaaaattac acacatagaa agggatagtt    660

gtttgtgttg tttgcttgtt ttgcaattag gatactcgtt ttgcttttgg aattcgaagt    720

tatacctcaa ctaggtgatg tgtttccaca gtgtactatg gacctataat atttatattt    780

taaaacggag aaagtataat tttcaaacta tttgcaacgt gttaatctta tcccctctac    840

ctccaaatct tatttatggt atacaccacc acccaaaatt tttattagtg gtagtacata    900

aaatgagttt ttttatgtgt ttgtttctgt ttttggttcc ttttgcaaca tgaagttttc    960

catgcaaact aagaggtgag acaaacaaat caaaactaca ctaccaaaag ccataattag    1020

atggtccaaa tgattttgct tgttacaaga ctgaagagat gttatgcagt ccacaaacaa    1080

aaaggaaaca atatattcta atataatata aaaccgttta taccagttat caattgtttg    1140

ccaaatccat ataaccatat aaacgcattt gctacatgct atatcaaaga aggtgaaatt    1200

tacccatcca caaaatgcaa acaactggaa gttgaaactc caaatataag agaaattgag    1260

ggtgagattt actcatccat gaaacacaaa cacaattgga agtcggaatt gtaaatagca    1320

gaggaataga aggtgagatt tacttgtcca taaagatgaa aaaacatata gtgcaaatca    1380

catatataat gaaaacttgt aaactaacat tagatctaaa aataaacgct tcagatttat    1440

ccactgcact caaagtaaaa ttttactccc agattcaacc atgagtaatt tttttactct    1500

cggtgacgtg gacaaatctt atgtgtctat ttctaaatcc aacggtagtt tctaagtttt    1560

cactagatat atatggtttg cactaaatac cttgctataa aacataagat aactggaagt    1620

tgagaacgca agcatgagag gaattgaggg gtgagattta ctcatccaaa taaaaaaaaa    1680

caaaatgcaa acacttggga ggttgaaact gcaaaatagc acaaggattt agggcgaatt    1740

ttctccccct cttccagtag tttccacctt ttccctctct tcctccgctt attaaaaggc    1800

ggcgtccctc cccgtggtgc tcgccgccgt attcaagcgg aggaagagag agagagagag    1860

agaatcaagg cagtagtcgt cttcctctcc tctcgccgcc gcatccgacc ggagaaagat    1920

cccttctttc cctcctccaa gcccgcctcg gtatgtatgt actcgctttg cctcaaaaaa    1980

atccccccct tttctccgcc cccgcattgc ggccgcctgg accttctctt cgattcgcaa    2040

atctggtttc ttttcgcgat ttcgcatctc atctcaattc ctagaccctc ggagatctcg    2100

ccatttcgct tctcgcggcg caaatctgcg atctttttta aacctcttgt ttcttgtttt    2160

tttcttgttt tttgcatcag ccagag                                         2186

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gctctagaat ctgctcggcc ttgg                                           24

                                  IB071015-序列表

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gagctcctct ggctgatgca aaaa                                          24

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tgcgcccaag ctgcatcat                                                19

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tgaactcacc gcgacgtctg t                                             21

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ggtgaccagc tcgaatttcc c                                             21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tgaatcctgt tgccggtctt g                                             21

<210>11

<211>20

                                 IB071015-序列表

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gcgcgcggtg tcatctatgt                                                20

<210>12

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>n＝a或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>n＝a，g，c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>n＝a或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>n＝a，g，c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>n＝a或t

<400>12

tgngnagnan canaga                                                    16

Claims (12)

1.一种编码β-酮酰辅酶A合成酶的水稻基因，其核苷酸序列选自SEQ IDNO：1所示的序列和在严谨杂交条件下与SEQ ID NO：1所示的序列杂交的序列。

2.一种获得水稻转基因系P1424的方法，其特征在于，将植物表达载体pCAMBIA 1301的T-DNA单拷贝插入在水稻中的权利要求1所述OsKCS1基因编码区的5′端不翻译区。

3.一种表达载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的OsKCS1基因编码区。

4.权利要求3所述的表达载体，它是从保藏号为CGMCC No.1965的大肠杆菌(Escherichia coli)中获得的包含权利要求1所述的OsKCS1基因编码区的pOsKCS1。

5.一种宿主细胞，其特征在于，它包含权利要求3或4所述的表达载体。

6.权利要求5所述的宿主细胞，它是包含权利要求4所述载体的大肠杆菌(Escherichia coli)DH10B CGMCC No.1965。

7.权利要求5所述的宿主细胞，它是大肠杆菌(Escherichia coli)DH10B或根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。

8.权利要求1所述的OsKCS1基因在单子叶植物抗旱性方面的应用。

9.权利要求8所述的应用，其中所述单子叶植物是水稻。

10.权利要求3所述的表达载体在转化植物获得转基因植物中的应用。

11.一种植物细胞，其包含权利要求1所述的编码β-酮酰辅酶A合成酶的水稻基因。

12.一种启动子，其序列是SEQ ID NO：4所示的序列。

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