CN109402079A - 一种多肽在提高植物超长链脂肪酸含量中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分离的花生β‑酮脂酰‑CoA合酶(β‑ketoacyl‑CoA synthase，KCS)基因AhyA.KCS1(SEQ ID NO:2)和AhyB.KCS1(SEQ ID NO:4)，本发明还提供了一种利用本发明所述的基因制备转基因酵母和植物的方法，该方法能够提高植物超长链脂肪酸尤其是山嵛酸的含量，且最高含量达到12.3％，VLCFA总量在酵母中由0.4％提高到了6.1％提高了近15倍，在拟南芥转基因植物中提高到25.0％以上，增长了4倍以上。可见，本发明在植物脂肪酸改良及培育生产高附加值油料作物方面具有重要的应用价值。

Description

一种多肽在提高植物超长链脂肪酸含量中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及花生β-酮脂酰-CoA合酶(β-ketoacyl-CoAsynthase，KCS)及其在植物脂肪酸改良中的应用。
背景技术
人类消费的油脂中，植物油正被越来越重视，与动物油以中链饱和脂肪酸为主不同，许多植物油中含有丰富的长链脂肪酸，其中超长链脂肪酸不仅是生物体必要的组成成分，在生物体内具有重要的生物学功能，还在化工、制药、保健、营养等方面具有较高的应用价值，是重要的生产原料。利用植物油生产超长链脂肪酸是一种经济、环保、可持续发展的方式，但是18C以上的超长链饱和脂肪酸在天然植物油脂中的含量极低，一般不能直接利用植物油提取超长链饱和脂肪酸。
超长链脂肪酸(very long chain fatty acid，VLCFA)是指碳原子数超过18的脂肪酸(Millar and Kunst,1997)，根据其碳链的长度及不饱和程度，在工业、医疗、保健方面具有不同的应用价值。超长链饱和脂肪酸(very long chain saturated fatty acid，VLCSFA)由于其碳链长、疏水性强、润滑性优异等特点，是重要的化工原料。例如，山嵛酸(C22:0)是正二十二碳烷酸，经过加工可生产出多种高附加值产品，如山嵛醇、山嵛酸酰胺、山嵛酸甘油酯等，广泛用于塑料工业、清洁剂工业、化妆品工业，以及食品、药品等领域。目前，山嵛酸主要通过加工芥酸制取得。因此，提高植物中超长链饱和脂肪酸的含量也是植物油脂肪酸改良的一个重要方向。
在植物中，超长链脂肪酸的生物合成分为两个阶段，包括脂肪酸的从头合成及脂肪酸碳链的延长。脂肪酸在质体中由脂肪酸合酶催化从头合成16C或18C的脂肪酸，运输至内质网，开始脂肪酸碳链的延长，由脂肪酸碳链延长酶催化完成。脂肪酸碳链延长酶是一个跨膜多酶复合体，由4个功能不同的酶组成，包括β-酮脂酰-CoA合酶(β-ketoacyl-CoAsynthase，KCS)，β-酮脂酰-CoA还原酶(β-ketoacyl-CoA reductase，KCR)，β-羟脂酰-CoA脱氢酶(β-hydroxyacyl-CoA dehydratase，HCD)和反式烯脂酰-CoA还原酶(trans-2,3-enoyl-CoA reductase，ECR)。这4个酶依次参与脂肪酸的碳链延长反应，最终生成超长链脂肪酸。其中，KCS具有严格的底物特异性，决定了循环反应的速度和最终产物的碳链长度，是整个碳链延长过程中的限速酶。植物中，对不饱和脂肪酸具有亲和力的KCS普遍存在，而对于饱和脂肪酸具有亲和力的KCS数量较少，因此，植物油脂中超长链饱和脂肪酸的含量普遍较低。
随着人类对植物油脂需求和消费的增长，科学家使用生物技术手段改变植物种子脂肪酸含量也日益广泛。通过对转基因植物中生物合成途径的调控，培育出特殊的品种，从而生产出具有高附加值的产品。目前国际上已经在许多传统油料如大豆(US5,955,650)、油菜(US5,955,650)、玉米(US6,229,033)、向日葵(US6,084,164)和非常规油脂植物如拟南芥(US10,539,488)、烟草(Cahoon等，1992)中改变了植物种子中脂肪酸的合成或组分。国内的张猛等(CN107674876)在蒜头果中发现了MoKCS基因，在培育富含神经酸等超长链脂肪酸植物和农作物中具有应用价值。淮东欣(华中农业大学博士论文，2015)从甘蓝型油菜基因组中克隆得到了FAE1基因，研究通过调控植物中超长链脂肪酸合成途径上的关键基因提高植物种子中超长链脂肪酸的含量。何朝族等(CN101050465)虽然提供一种来源于水稻的β-酮脂酰-CoA合酶，但其关注点在于水稻抗旱性选育种的应用，并未提及该基因对植物超长链脂肪酸含量的改进。
花生含有丰富的蛋白质和脂肪，是我国主要的油料作物之一。花生油中超长链饱和脂肪酸的含量约为7％，山嵛酸的含量最高达到6％，因此从花生中克隆对饱和脂肪酸具有高亲和力的KCS对超长链饱和脂肪酸的开发利用具有重要的应用价值。尽管张欣等(山东农业科学，50(6)，2018)从栽培种花生F112-2中克隆了FAE1基因，但并未报道该基因能够提高植物超长链脂肪酸的含量，该基因距离产业中的实际应用尚需进一步证明。
基于现有技术研究的不足，以及国内产业界对油料作物的产能和附加经济价值提高的迫切需求，本发明从花生品种“中花16”中克隆得到了2个β-酮脂酰-CoA合酶基因AhyA.KCS1和AhyB.KCS1，并通过基因工程技术证实该基因编码的酶均可以在酵母中生产花生酸、山嵛酸、木蜡酸等超长链饱和脂肪酸；还进一步证实了将这两个基因分别在拟南芥中过表达，都可以显著提高拟南芥种子中山嵛酸的含量。因此，AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因可通过基因工程技术在植物中提高超长链脂肪酸尤其是山嵛酸的含量，本发明在植物脂肪酸改良及培育生产高附加值油料作物方面具有重要的应用价值，对提振国内油料作物产业界的信心及可持续发展方面具有显著意义。
发明内容
本发明一方面旨在提供一种多肽在提高植物超长链脂肪酸含量中的应用，所述多肽包括以下氨基酸序列中至少一种：
(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列；
(b)将SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的，且同时具有FAE1_CUT1_RppA和ACP_syn_III_C结构域，能够催化脂肪酸碳链延长的由(a)衍生的氨基酸序列。
在一个优选例中，所述多肽为AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因编码的花生β-酮脂酰-CoA合酶(β-ketoacyl-CoA synthase，KCS)，所述AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示。
在另一个优选例中，所述超长链脂肪酸碳链长度为20-40个，优选为20-30个。
在另一个优选例中，所述超长链脂肪酸为超长链饱和脂肪酸，如花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸等，优选为山嵛酸。
在另一优选例中，所述的植物选自花生、油菜、甘蓝、白菜、大豆、芝麻、向日葵、棉花、麻疯树、蓖麻、拟南芥或油棕榈，优选为花生。
在另一优选例中，所述的植物为植物的种子，优选为花生种子。
本发明另一方面旨在提供一种提高宿主细胞中超长链脂肪酸含量的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)β-酮脂酰-CoA合酶基因的制备：提取花生发育种子的总RNA，并获取其cDNA；设计引物，以发育种子的cDNA为模板，PCR扩增得到目的片段；测序验证得到花生β-酮脂酰-CoA合酶基因AhyA.KCS1或AhyB.KCS1；
(2)重组载体构建：将AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因连入真核表达载体中，筛选鉴定正确的重组载体；
(3)重组细胞构建及脂肪酸组成分析：将步骤(2)重组载体转入宿主细胞中，并通过气相色谱法分析宿主细胞中脂肪酸组成；
所述花生β-酮脂酰-CoA合酶基因AhyA.KCS1或AhyB.KCS1的核苷酸序列包括如下序列中至少一种：
(a)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列；
(b)将SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列经过一个或多个核苷酸取代、缺失或添加而形成的多核苷酸序列，且其编码的氨基酸序列同时具有FAE1_CUT1_RppA和ACP_syn_III_C结构域，能够催化脂肪酸碳链延长的由(a)衍生的多核苷酸序列。
在一个优选例中，所述的宿主细胞为酵母，所述的真核表达载体为酵母表达载体pYX242。
在另一个优选例中，所述超长链脂肪酸碳链长度为20-40个，优选为20-30个。
在另一个优选例中，所述超长链脂肪酸为超长链饱和脂肪酸，如花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸等，优选为山嵛酸。
本发明还提供了一种超长链脂肪酸含量提高的转基因植物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)β-酮脂酰-CoA合酶基因的制备：提取花生发育种子的总RNA，并获取其cDNA；根据花生基因组数据库中祖先二倍体野生种Arachis duranensis(AA)和Arachis ipaensis(BB)中Aradu.J6P55和Araip.S3IU8的基因序列设计引物，以发育种子的cDNA为模板，PCR扩增得到目的片段；测序验证得到花生β-酮脂酰-CoA合酶基因AhyA.KCS1或AhyB.KCS1；
(2)重组质粒构建：将AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因连接到pBinGlyRed2载体中的种子特异表达启动子oleosin后，构建完成重组质粒pBinGlyRed2-AhyA.KCS1和pBinGlyRed2-AhyB.KCS1；
(3)农杆菌转化筛选转基因植物：将pBinGlyRed2-AhyA.KCS1和pBinGlyRed2-AhyB.KCS1分别导入农杆菌GV3101中，再使用农杆菌介导的花序浸泡转化法，将AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因导入植物细胞或组织中，待植株成熟后，收获转化种子，晾干；在暗光条件下，使用绿色荧光照射种子，透过红色滤光片观察，如果种子发红色荧光，即为转化阳性种子，用镊子将其挑出，使用气相色谱法分析拟南芥阳性种子中的脂肪酸组成；
所述花生β-酮脂酰-CoA合酶基因AhyA.KCS1或AhyB.KCS1的核苷酸序列包括如下序列中至少一种：
(a)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列；
(b)将SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列经过一个或多个核苷酸取代、缺失或添加而形成的多核苷酸序列，且其编码的氨基酸序列同时具有FAE1_CUT1_RppA和ACP_syn_III_C结构域，能够催化脂肪酸碳链延长的由(a)衍生的多核苷酸序列。
在另一个优选例中，所述超长链脂肪酸碳链长度为20-40个，优选为20-30个。
在另一个优选例中，所述超长链脂肪酸为超长链饱和脂肪酸，如花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸等，优选为山嵛酸。
在另一优选例中，所述植物选自花生、油菜、甘蓝、白菜、大豆、芝麻、向日葵、棉花、麻疯树、蓖麻、拟南芥或油棕榈，优选为花生。
本发明还提供了由上述方法制备的植物产生的粗粉、饲料或食物，所述植物为不可再生的植物种子，经过本领域公知技术加工后，获得可食用的粗粉、饲料或食物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明从花生中分离了AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因，并且在酵母及模式生物拟南芥中证实了转化AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因后，能够提高超长链脂肪酸的产量，尤其是提高山嵛酸的产量，不必通过加工芥酸得到山嵛酸，提高了油料作物产品附加经济价值的同时也降低了生产成本。
(2)本发明分离的AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因编码的KCS酶是对饱和脂肪酸有较高亲和力的脂肪酸碳链延长酶。
(3)本发明在转化AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因的酵母细胞中，超长链脂肪酸(VLCFA)总量由0.4％提高到了6.1％，提高了近15倍。
(4)本发明在转化AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因的拟南芥中，均出现了对照组中没有的山嵛酸的积累，且最高含量达到12.3％；VLCFA总量提高到25.0％以上，增长了4倍以上，在产业实际应用中具有重要的意义。
(5)本发明在AhA和AhB阳性转化种子中VLCSFA的总量由3.2％分别提高到了18.7％和19.5％，提高了近5倍。
附图说明
图1为pYX242-AhyA.KCS1和pYX242-AhyB.KCS1的酵母表达载体示意图。其中，TPI为磷酸丙糖异构酶启动子，Ter为终止子，f1ori为噬菌体复制起始点，LEU2为LEU2基因，2μori为酵母复制起始点，Ampicillin为抗氨苄霉素基因，pUC ori为大肠杆菌的复制起始点。
图2为空载体pYX242(A)、AhyA.KCS1(B)和AhyB.KCS1(C)转化酵母细胞中提取的总脂肪酸甲酯的气相色谱图。其中，气相色谱图中不同的峰分别鉴定为：1＝C16:0；2＝C16:1；3＝C18:0；4＝C18:1；5＝C26:0；6＝C20:0；7＝C22:0；8＝C22:1；9＝C24:0。花生AhKCS转化的阳性酵母细胞可以生产新的超长链脂肪酸，特别是花生酸(C20:0)、山嵛酸(C22:0)、芥酸(C22:1)和木蜡酸(C24:0)。
图3为pBinGlyRed2-AhyA.KCS1和pBinGlyRed2-AhyB.KCS1的T-DNA示意图。其中，A.pBinGlyRed2-AhyA.KCS1的T-DNA片段包含AhyA.KCS1的种子特异表达盒和Ds-Red选择标记；B.pBinGlyRed2-AhyB.KCS1的T-DNA片段包含AhyB.KCS1的种子特异表达盒和Ds-Red选择标记。
图4为AhKCS1转化拟南芥fad2/fae1T1代收获的种子中VLCFA的含量。其中，VLCFA＝C20:0+C20:1+C22:0。fad2/fae1为拟南芥fad2/fae1双突变体，AhA为AhyA.KCS1转化的拟南芥，AhB为AhyB.KCS1转化的拟南芥。*表示经单因素方差分析检验差异达到显著水平，*代表P<0.05，**代表P<0.01。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1花生脂肪酸碳链延长酶基因AhyA.KCS1和AhyB.KCS1的制备方法
收集花生品种“中花16”发育中的荚果，取出发育中的种子，用液氮速冻。参照RNA提取试剂盒(全式金公司，北京)说明书，提取花生发育种子的总RNA。按照反转录试剂盒(全式金公司，北京)操作说明获得cDNA。根据花生基因组数据库PeanutBase(https://peanutbase.org/)中，其祖先二倍体野生种Arachis duranensis(AA)和Arachis ipaensis(BB)中Aradu.J6P55和Araip.S3IU8的基因序列设计引物。利用上游引物5’-ATGGCTGATGCAAAAGCA-3’(SEQ ID NO:5)和下游引物5’-TCAGATGGCAGATACCCTTGGA-3’(SEQID NO:6)，以发育种子的cDNA为模板，PCR扩增得到约1.5kb片段。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(全式金公司，北京)回收目的片段，连入pEASY-Blunt CloningVector载体，再将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1中。使用M13正向和反向引物检测单克隆，挑选阳性单克隆送专业公司(北京擎科新业生物技术有限公司(武汉))测序。根据测序结果得到花生脂肪酸碳链延长酶基因AhyA.KCS1和AhyB.KCS1，其中AhyA.KCS1的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，AhyB.KCS1的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。
实施例2AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因的结构分析
因为栽培种花生(Arachis hypogaea L.)是异源四倍体(AABB)，AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因分别是其A、B基因组相对应的拷贝。AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因的DNA编码区均为1533bp，编码510个氨基酸，其DNA序列和氨基酸序列同源性都达到99％以上。AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因都同时具有FAE1_CUT1_RppA和ACP_syn_III_C结构域，这两个结构域是KCS酶行使功能必备的结构域。
实施例3在酵母细胞中生产超长链饱和脂肪酸
利用AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因在酵母细胞中生产超长链饱和脂肪酸。将AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因分别连入酵母表达载体pYX242中，构建完成pYX242-AhyA.KCS1和pYX242-AhyB.KCS1酵母表达载体。如图1pYX242-AhyA.KCS1和pYX242-AhyB.KCS1的载体示意图，TPI为磷酸丙糖异构酶启动子，Ter为终止子，f1ori为噬菌体复制起始点，LEU2为LEU2基因，2μori为酵母复制起始点，Ampicillin为抗氨苄霉素基因，pUC ori为大肠杆菌的复制起始点。
使用酵母转化试剂盒(Invitrogen公司，USA)分别将pYX242、pYX242-AhyA.KCS1和pYX242-AhyB.KCS1转入酵母细胞Inv Sci1(Invitrogen公司，USA)中。在缺亮氨酸的培养基上培养转化的酵母菌，PCR挑选阳性单菌落，使用气相色谱法分析酵母单菌落中脂肪酸组成。
检测发现，转入空载体pYX242的酵母细胞(CK)中，仅检测到5种脂肪酸：棕榈酸(C16:0)、棕榈烯酸(C16:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)和蜡酸(C26:0)，而在转入pYX242-AhyA.KCS1和pYX242-AhyB.KCS1的酵母细胞中，均检测到9种脂肪酸：除以上5种脂肪酸外，还检测到花生酸(C20:0)、山嵛酸(C22:0)、芥酸(C22:1)和木蜡酸(C24:0)，而且蜡酸的含量比CK中的含量有所提高，如图2空载体pYX242(A)、AhyA.KCS1(B)和AhyB.KCS1(C)分别转化酵母细胞中提取的总脂肪酸甲酯的气相色谱图所示，气相色谱图中不同的峰分别鉴定为：1＝C16:0；2＝C16:1；3＝C18:0；4＝C18:1；5＝C26:0；6＝C20:0；7＝C22:0；8＝C22:1；9＝C24:0。花生AhKCS1转化的阳性酵母细胞可以生产新的超长链脂肪酸，特别是花生酸(C20:0)、山嵛酸(C22:0)、芥酸(C22:1)和木蜡酸(C24:0)，其中，花生酸、山嵛酸、木蜡酸和蜡酸含量分别提高到约0.5％、0.4％、0.9％和3.7％，超长链饱和脂肪酸(VLCSFA)总量由0.4％提高到了5.4％；而对于超长链不饱和脂肪酸来说，仅检测到芥酸一种单不饱和脂肪酸，其含量提高到了0.7％，与VLCSFA相比，AhyA.KCS1和AhyB.KCS1对饱和脂肪酸亲和力更高。超长链脂肪酸(VLCFA)总量由0.4％提高到了6.1％，提高了近15倍，参见表1。以上结果均表明，AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因编码脂肪酸碳链延长酶，且对饱和脂肪酸亲和力较高，可以在酵母细胞中生产超长链饱和脂肪酸。
表1 AhKCS1转化酵母细胞中超长链脂肪酸的含量
平均值±标准差，*表示经单因素方差分析检验差异达到显著水平，*代表P<0.05，**代表P<0.01。VLCSFA＝C20:0+C22:0+C24:0+C26:0；VLCFA＝C20:0+C22:0+C22:1+C24:0+C26:0。
实施例4含AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因的转基因植物
以本领域模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为例，利用AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因提高拟南芥种子中超长链饱和脂肪酸的含量。将AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因分别连接到种子特异表达启动子oleosin后，分别构建完成pBinGlyRed2-AhyA.KCS1和pBinGlyRed2-AhyB.KCS1，如图3中pBinGlyRed2-AhyA.KCS1和pBinGlyRed2-AhyB.KCS1的T-DNA重组载体构建图谱所示，A为重组载体pBinGlyRed2-AhyA.KCS1的T-DNA片段，包含AhyA.KCS1的种子特异表达盒和Ds-Red选择标记；B为pBinGlyRed2-AhyB.KCS1的T-DNA片段，包含AhyB.KCS1的种子特异表达盒和Ds-Red选择标记。
将pBinGlyRed2-AhyA.KCS1和pBinGlyRed2-AhyB.KCS1分别导入农杆菌GV3101中，再使用农杆菌介导的花序浸泡转化法，将AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因分别导入拟南芥fad2/fae1双突变体中。将转pBinGlyRed2-AhyA.KCS1载体得到的转基因拟南芥命名为AhA，将转pBinGlyRed2-AhyB.KCS1载体得到的转基因拟南芥命名为AhB。待植株成熟后，收获转化种子，晾干。将收获的拟南芥种子平铺在纸上，在暗光条件下，使用绿色荧光照射种子，透过红色滤光片观察。因为pBinGlyRed2载体中带有DsRed荧光蛋白，如果种子发红色荧光，即为转化阳性种子，用镊子将其挑出，使用气相色谱法分析拟南芥阳性种子中的脂肪酸组成。
检测发现，拟南芥fad2/fae1双突变体中，共检测到7种脂肪酸：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、花生酸和花生烯酸(C20:1)。其中，花生酸的含量约为3.2％，花生烯酸的含量约为2.2％，超长链脂肪酸的总量约为5.5％。而在AhA和AhB阳性转化种子中，共检测到8中脂肪酸，除在拟南芥fad2/fae1双突变体中可检测到的7种脂肪酸以外，转化阳性种子中出现了山嵛酸的积累，且最高含量达到12.3％。不仅如此，花生酸和花生烯酸的含量也有所提高，都提高到约7.0％，增长了1倍以上。VLCFA总量提高到25.0％以上，增长了4倍以上，结果如图4所示，VLCFA＝C20:0+C20:1+C22:0。值得注意的是，在fad2/fae1双突变体中新出现的超长链脂肪酸为山嵛酸(C22:0)，是超长链饱和脂肪酸，在AhA和AhB阳性转化种子中VLCSFA的总量由3.2％分别提高到了18.7％和19.5％，提高了近5倍；而超长链不饱和脂肪酸，仅检测到花生烯酸(C20:1)一种，其含量从2.2％提高到了7.1％，仅提高了2倍，参见表2。以上结果表明，在拟南芥fad2/fae1双突变体中过表达AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因，可以显著提高其种子中超长链脂肪酸的含量，特别是可以显著提高山嵛酸的含量。
表2 AhKCS1转化拟南芥fad2/fae1双突变体收获的T1种子中脂肪酸组成
平均值±标准差，*表示经单因素方差分析检验差异达到显著水平，*代表P<0.05，**代表P<0.01。VLCSFA＝C20:0+C22:0+C24:0+C26:0；VLCFA＝C20:0+C22:0+C22:1+C24:0+C26:0。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 申请人名称：中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种多肽在提高植物超长链脂肪酸含量中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Ala Asp Ala Lys Ala Asp Ala Pro Leu Val Pro Ser Ser Ser Arg
1 5 10 15
Asn Leu Pro Asp Phe Lys Lys Ser Val Arg Leu Lys Tyr Val Lys Leu
20 25 30
Gly Tyr His Tyr Leu Ile Ser His Gly Met Tyr Leu Phe Leu Ser Pro
35 40 45
Leu Val Val Leu Ile Ser Ala Gln Leu Ser Thr Phe Ser Leu Gln Asp
50 55 60
Leu His Asp Leu Trp Gln His Leu Gln Tyr Asn Leu Ile Ser Val Ile
65 70 75 80
Leu Cys Ser Thr Leu Leu Val Phe Leu Ser Thr Leu Tyr Phe Leu Thr
85 90 95
Arg Pro Arg Pro Val Tyr Leu Val Asn Phe Ala Cys Tyr Lys Pro Glu
100 105 110
Glu Ser Arg Lys Cys Thr Lys Arg Val Phe Met Glu His Ser Arg Leu
115 120 125
Ala Gly Thr Phe Thr Glu Glu Asn Leu Ala Phe Gln Gln Lys Ile Leu
130 135 140
Glu Arg Ser Gly Leu Gly Glu Asn Thr Tyr Leu Pro Glu Ala Val Leu
145 150 155 160
Asn Ile Pro Pro Asn Pro Thr Met Lys Glu Ala Arg Lys Glu Ala Glu
165 170 175
Thr Val Met Phe Gly Ala Ile Asp Glu Leu Phe Ala Lys Thr Ser Val
180 185 190
Asn Pro Lys Asp Ile Gly Ile Leu Ile Val Asn Cys Ser Leu Phe Asn
195 200 205
Pro Thr Pro Ser Leu Ser Ala Met Val Val Asn His Tyr Lys Leu Arg
210 215 220
Gly Asn Ile Arg Ser Tyr Asn Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Ser Ile Asp Leu Ala Lys Asp Leu Leu Gln Ala His Pro Asn
245 250 255
Ser Tyr Ala Leu Ile Ile Ser Met Glu Asn Ile Thr Leu Asn Trp Tyr
260 265 270
Phe Gly Asn Asp Arg Ser Lys Leu Val Ser Asn Cys Leu Phe Arg Met
275 280 285
Gly Gly Ala Ala Val Leu Leu Ser Asn Lys Ser Ser Asp Arg Arg Arg
290 295 300
Ser Lys Tyr Arg Leu Val Thr Thr Val Arg Thr Asn Lys Gly Ala Asp
305 310 315 320
Asp Lys Cys Phe Ser Cys Val Thr Gln Glu Glu Asp Glu Ala Gly Lys
325 330 335
Ile Gly Val Thr Leu Ser Lys Asp Leu Met Ala Val Ala Gly Asp Ala
340 345 350
Leu Lys Thr Asn Ile Thr Thr Leu Gly Pro Leu Val Leu Pro Met Ser
355 360 365
Glu Gln Leu Leu Phe Phe Ala Thr Leu Val Gly Lys Lys Leu Leu Lys
370 375 380
Met Lys Ile Lys Pro Tyr Ile Pro Asp Phe Lys Leu Ala Phe Glu His
385 390 395 400
Phe Cys Ile His Ala Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Glu Leu Glu Lys
405 410 415
Asn Leu Gln Leu Ser Pro Trp His Met Glu Pro Ser Arg Met Thr Leu
420 425 430
Tyr Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ser Ser Ser Leu Trp Tyr Glu Leu Ala
435 440 445
Tyr Thr Glu Ala Lys Gly Arg Ile Arg Lys Gly Asp Arg Thr Trp Gln
450 455 460
Ile Ala Phe Gly Ser Gly Phe Lys Cys Asn Ser Ala Val Trp Lys Ala
465 470 475 480
Leu Lys Thr Ile Asn Pro Ala Lys Glu Lys Asn Pro Trp Met Asp Glu
485 490 495
Ile His Lys Phe Pro Val Glu Val Pro Arg Val Ser Ala Ile
500 505 510
<210> 2
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列()
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<210> 3
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6

Claims (10)

1.一种多肽在提高植物超长链脂肪酸含量中的应用，所述多肽包括以下氨基酸序列中至少一种：
(a)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列；
(b)将SEQ ID NO：1或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的，且同时具有FAE1_CUT1_RppA和ACP_syn_III_C结构域，能够催化脂肪酸碳链延长的由(a)衍生的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述多肽为AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因编码的花生β-酮脂酰-CoA合酶(β-ketoacyl-CoA synthase，KCS)，所述AhyA.KCS1和AhyB.KCS1基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述超长链脂肪酸碳链长度为20-40个，优选为20-30个；所述超长链脂肪酸为超长链饱和脂肪酸，如花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸等，优选为山嵛酸。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的植物选自花生、油菜、甘蓝、白菜、大豆、芝麻、向日葵、棉花、麻疯树、蓖麻、拟南芥或油棕榈，优选为花生。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的植物为植物的种子，优选为花生种子。
6.一种提高宿主细胞中超长链脂肪酸含量的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)β-酮脂酰-CoA合酶基因的制备：提取花生发育种子的总RNA，并获取其cDNA；设计引物，以发育种子的cDNA为模板，PCR扩增得到目的片段；测序验证得到花生β-酮脂酰-CoA合酶基因AhyA.KCS1或AhyB.KCS1；
(2)重组载体构建：将AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因连入真核表达载体中，筛选鉴定正确的重组载体；
(3)重组细胞构建及脂肪酸组成分析：将步骤(2)重组载体转入宿主细胞中，并通过气相色谱法分析宿主细胞中脂肪酸组成；
所述花生β-酮脂酰-CoA合酶基因AhyA.KCS1或AhyB.KCS1的核苷酸序列包括如下序列中至少一种：
(a)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列；
(b)将SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列经过一个或多个核苷酸取代、缺失或添加而形成的多核苷酸序列，且其编码的氨基酸序列同时具有FAE1_CUT1_RppA和ACP_syn_III_C结构域，能够催化脂肪酸碳链延长的由(a)衍生的多核苷酸序列。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的宿主细胞为酵母，所述的真核表达载体为酵母表达载体pYX242；所述超长链脂肪酸碳链长度为20-40个，优选为20-30个；所述超长链脂肪酸为超长链饱和脂肪酸，如花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸等，优选为山嵛酸。
8.一种超长链脂肪酸含量提高的转基因植物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)β-酮脂酰-CoA合酶基因的制备：提取花生发育种子的总RNA，并获取其cDNA；根据花生基因组数据库中祖先二倍体野生种Arachis duranensis(AA)和Arachis ipaensis(BB)中Aradu.J6P55和Araip.S3IU8的基因序列设计引物，以发育种子的cDNA为模板，PCR扩增得到目的片段；测序验证得到花生β-酮脂酰-CoA合酶基因AhyA.KCS1或AhyB.KCS1；
(2)重组质粒构建：将AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因连接到pBinGlyRed2载体中的种子特异表达启动子oleosin后，构建完成重组质粒pBinGlyRed2-AhyA.KCS1和pBinGlyRed2-AhyB.KCS1；
(3)农杆菌转化筛选转基因植物：将pBinGlyRed2-AhyA.KCS1和pBinGlyRed2-AhyB.KCS1分别导入农杆菌GV3101中，再使用农杆菌介导的花序浸泡转化法，将AhyA.KCS1或AhyB.KCS1基因导入植物细胞或组织中，待植株成熟后，收获转化种子，晾干；在暗光条件下，使用绿色荧光照射种子，透过红色滤光片观察，如果种子发红色荧光，即为转化阳性种子，用镊子将其挑出，使用气相色谱法分析拟南芥阳性种子中的脂肪酸组成；
所述花生β-酮脂酰-CoA合酶基因AhyA.KCS1或AhyB.KCS1的核苷酸序列包括如下序列中至少一种：
(a)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列；
(b)将SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列经过一个或多个核苷酸取代、缺失或添加而形成的多核苷酸序列，且其编码的氨基酸序列同时具有FAE1_CUT1_RppA和ACP_syn_III_C结构域，能够催化脂肪酸碳链延长的由(a)衍生的多核苷酸序列。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于：所述超长链脂肪酸碳链长度为20-40个，优选为20-30个；所述超长链脂肪酸为超长链饱和脂肪酸，如花生酸、山嵛酸、木蜡酸、蜡酸等，优选为山嵛酸；所述植物选自花生、油菜、甘蓝、白菜、大豆、芝麻、向日葵、棉花、麻疯树、蓖麻、拟南芥或油棕榈，优选为花生。
10.由权利要求8或9所述方法制备的植物产生的粗粉、饲料或食物，所述植物为经过加工的植物种子。
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