CN109971765A

CN109971765A - 一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77及其应用

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Publication number: CN109971765A
Application number: CN201910221636.1A
Authority: CN
Inventors: 李慧; 何林林; 朱建堂; 车荣会; 李为珺
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2039-03-22
Also published as: CN109971765B

Abstract

本发明属于生物科学技术领域，具体涉及一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77及其应用。本发明从玉米中分离和克隆到基因ZmNAC77，将ZmNAC77的cDNA序列与35S‑1300‑flag相连接，利用农杆菌花序法侵染拟南芥，实验结果表明发现该基因过表达后会降低油份含量，测定突变体籽粒中淀粉含量的变化，发现该基因过表达后会增加淀粉含量，该基因突变体对于作物育种及生产应用具有重要的生产意义和生活意义。

Description

一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77及其应用

技术领域

本发明属于生物科学技术领域，具体涉及一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77及其应用。

背景技术

玉米油不仅富含不饱和脂肪酸，而且具有较高的能量，因此高油玉米在食用油、饲料和生物能源等方面具有很高的利用价值。玉米脂肪酸代谢途径相关基因、调控整个玉米代谢途径的转录因子、玉米籽粒内各组织形态发育相关的基因等三类基因都可调控玉米籽粒含油量及其组份。至今已有多个控制玉米籽粒油份相关性状的功能基因被报道。在高油玉米群体的轮回选择过程中受到选择。尽管高油玉米的功能基因组学研究及其油脂代谢研究还处于起步阶段，但是在植物中特别是拟南芥中油脂代谢研究已相当成熟，油脂通常指脂肪酸 (Fatty acid，FA)及其天然酯类衍生物。植物籽粒油脂常以TAG 的形式存在。油脂的合成是一个非常复杂的生物代谢途径，但其基本的生化反应和步骤已经研究清楚。籽粒油份是以油质体的形式贮藏在成熟的种子中的。因此，研究玉米高油基因，明确油脂代谢调节机制，改变玉米油份含量非常重要。随着分子生物学技术的发展，将油份基因转入相关作物中，使其在目的作物中高效表达，提高作物油份的含量及品质已经成为目前研究的重点。但是，关于玉米中NAC类基因在油分代谢中的相关研究还不完善，尚没有利用玉米NAC类基因改善植物油份含量的方法。

发明内容

针对上述现有技术的情况，本发明的目的是提供了一种调控拟南芥油份和淀粉含量的玉米Zm00001d049540基因(命名为ZmNAC77) 及其应用。本发明在拟南芥中过表达玉米ZmNAC77基因，发现可以明显降低拟南芥籽粒中脂肪酸含量，提高拟南芥籽粒中的淀粉含量。

为实现上述发明目的，本发明采用一下技术方案予以实现：

一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，CDS序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列SEQ IDNO：3所示。

上述调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77引物序列为：

ZmNAC77-F：5‵-CGGGGTACCTCGATGGTGGAGATGTCTGTG-3‵；

ZmNAC77-R：5‵-GCGGGATCCGCACCGCACCAGGATAGATTT-3‵；

其中下划线处为酶切位点，上有引物的酶切位点为入Kpn1，下游引物的酶切位点为BamH1。

上述应用采用农杆菌介导的方法转化植物。

上述ZmNAC77过表达拟南芥突变体与野生型相比脂肪酸含量降低，淀粉含量增加。

有益效果

本发明将ZmNAC77基因全长cDNA连接到过表达载体启动的表达载体上，利用农杆菌侵染转化拟南芥，发现该基因过表达后会降低油份含量，测定突变体籽粒中淀粉含量的变化，发现该基因过表达后会增加淀粉含量，该基因突变体对于作物育种及生产应用具有重要的生产意义和生活意义。检索文献没有发现关于该基因功能方面的研究，鉴于该基因在禾本科植物中的保守性以及在转基因拟南芥中呈现的表型，认为该基因具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为DNA验证的结果图(DNA maker为：DL2000，目标条带长度为500bp)；

图2为过表达株系与野生型籽粒各种脂肪酸组分含量的测定图；

图3为过表达株系与野生型总含油量比较图；

图4为安捷伦气相色谱仪HP7890及脂肪酸混合标样测定图；

图5为过表达株系与野生型葡萄糖含量比较图；

图6过表达株系与野生型蔗糖含量比较图；

图7过表达株系与野生型淀粉含量比较图。

具体实施方式

以下实施例中进一步解释说明本发明的技术方案，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件；本发明将上述表达载体导入到模式植物拟南芥细胞中，导入方法为农杆菌介导的转化法。其中将上述表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法、子房注射法等。

实施例1拟南芥过表达株系的构建

拟南芥过表达载体使用35S-1300-flag，载体重组的方式采用酶切连接，侵染拟南芥的方法是花浸法。在拟南芥过表达实验中，为方便后期实验筛选，通常称被侵染的野生型col拟南芥为T₀代，侵染后拟南芥得到的种子为T₁代种子，T₁代种子种下后萌发的幼苗为T1代苗， T₁代苗收获的种子为T₂代种子，T₂代种子出现基因型分离，即在T2 代时筛选纯合阳性苗，并测定不同基因表达量，得到不同基因表达量的过表达株系。

(一)构建重组载体

(1)基因扩增和酶切连接

通过在ZmNAC77基因的起始位点(ATG)设计引物引入Kpn1 酶切位点，在3’末端引入BamH1酶切位点，通过PCR扩增得到基因的全长cDNA序列，基因扩增使用的引物序列为：

ZmNAC77-Kpn1F：CGGGGTACCTCGATGGTGGAGATGTCTGTG

ZmNAC77-BamH1R：GCGGGATCCGCACCGCACCAGGATAGATTT

将得到的扩增产物进行胶回收，测定浓度。载体和目的基因必须采用相同的酶切位点，然后用Kpn1和BamH1双酶切目的基因片段和载体，重新回收后。使用NEB的T4连接酶，将目的基因与过表达载体35S-1300-flag相连接，连接体系如下：

将上述反应液置于PCR仪16℃反应过夜，即可得到重组载体，用于大肠杆菌的转化。

(2)大肠杆菌感受态的制备

1)大肠杆菌(E.coli)DH5α菌种用接种环在LB培养基平板上划线，37℃，培养过夜；

2)挑取新鲜的单菌落接种到5MlLB液体培养基中，37℃， 250rpm振荡培养过夜；

3)稀释100倍，接种到50mLLB液体培养基中，37℃，250rpm 培养3～5h至细菌生长对数期；

4)将菌液转入50mL离心管中，放置在冰上10min；

5)4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；

6)用50mL 0.1M CaCl(24℃预冷)重悬细胞，4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；

7)向沉淀中加入25mL 0.1M CaCl(24℃预冷)，重悬沉淀，4℃， 4000rpm，10min，弃上清；

8)每管中加入2.5mL0.1MCaCl2(含15％甘油)，重悬沉淀；

9)分装至1.5mlEP离心管中，100μL/管；

10)保存到-70℃冰箱中，备用。

(3)重组载体的转化

1)冰上融化大肠杆菌感受态细胞；

2)将连接产物加入感受态细胞中，约10μL重组载体加入至 50μL感受态中轻轻旋转混匀，在冰上放置30min；

3)在42℃的水浴中热激90sec，不要摇动，立即放回冰上冷却2min；

4)加入600μLLB培养基，37℃，150rpm振荡培养60～90min；

5)室温4000rpm离心5min，吸出部分LB培养基，剩余约200 μL体积；

6)将剩余液体和沉淀混匀，均匀涂布于含100mg/mLSpec+抗性的LB培养基平板上；

7)37℃倒置培养12～16h，直至出现菌落。

(4)阳性菌落筛选及测序

1)挑取单菌落于含有0.6mL LB(Spec+抗性)的1.5mL离心管中，37℃，220rpm震荡培养约6h；

2)用通用引物T7/SP6进行PCR扩增。取1μL菌液作为模板，退火温度为52℃。阳性克隆的PCR产物应在1kb左右；如果克隆为假阳性(载体自连)，PCR产物片段约为300bp；

3)挑取3个阳性菌落，送公司测序，挑选测序正确的菌株用于后序实验。

(5)质粒的提取

1)挑取含有载体质粒的大肠杆菌单菌落，在含有Spec+抗性的LB液体培养基中于37℃200rpm振荡过夜培养；

2)将菌液倒于1.5mL离心管中，12000rpm离心1min，弃上清液，收集细菌沉淀；

3)用移液器吸去上清，在管中加100μL预冷的SolutionI充分振荡，冰浴5min；

4)加入200μL新配制的SolutionII(室温)，盖紧管口，轻轻颠倒2～3次，使其混合均匀，不要剧烈振荡，冰浴放置不超过5min；

5)加入150μL预冷的SolutionIII，充分混合，冰浴5min； 4℃,12000rpm离心5min；

6)将上清移至离心管中，加入等体积苯酚、氯仿(1:1)抽提， 12000rpm离心5min,取上清；

7)再用等体积苯酚、氯仿(1:1)抽提一次；转移上清至一新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放2h沉淀；

8)4℃，12000rpm，离心15min弃上清，收集沉淀；用1mL70％乙醇洗沉淀2次；

9)4℃，12000rpm，离心2min，吸干液体；室温干燥沉淀， 50μLddH2O溶解沉淀，-20℃保存。

(6)农杆菌感受态的制备

1)农杆菌EHA105菌种在含有100μg/mLRif+的YEB平板划线，28℃培养36～48h至长出菌落；

2)挑取单菌落接种于5mL含有100μg/mL mLRif+的YEB液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养16～24h；

3)将0.5mL菌液转接于50mL含有50μg/mL Rif+的YEB液体培养基中，28℃，250rpm，振荡培养至对数期，OD600＝0.5左右，约8～16h；

4)将菌液转移至50mL离心管中，冰浴30min，5000rpm离心 10min，沉淀细胞；

5)加入10mL预冷的0.15M Nacl，轻轻悬浮细胞，4℃，5000rpm 离心5min，去上清；

6)重复步骤(5)一次；

7)用1mL预冷的含15％甘油的Cacl₂重悬细胞，分装至1.5mL 离心管中，100μL/管，液氮中速冻，保存到-70℃，备用。

(7)农杆菌转化及阳性菌落筛选

1)取-70℃冻存的感受态细胞EHA105，冰上融化；加入5-10 μl待转化质粒于50-100μl感受态中，轻轻混匀，冰浴30min；

2)将离心管置于液氮中速冻1min，立即放入37℃，3min，

3)立即加入800ml YEP培养基，混匀，28℃，180rpm振荡培养3h；

4)室温下5000rpm离心1min，沉淀细胞；

5)吸去多余的培养基，保留约200μL涂布于YEB(含100mg/L 利福平，50mg/L卡那霉素)平板；

6)28℃倒置培养2～3天，直至菌落出现

7)阳性菌落筛选的方法参照上述大肠杆菌阳性菌落的筛选，得到阳性菌落ZmNAC77-35s-1300flag，经以上实验得到的 ZmNAC77-35S-1300flag阳性农杆菌保存在-80℃超低温冰箱备用。

(二)农杆菌侵染拟南芥

(1)农杆菌的活化及扩配

1)取ZmNAC77-35S-flag阳性农杆菌500ul加入至10ml含有 Rif⁺和Kan⁺的YEP液体培养基中，29℃，200rpm，过夜培养。

2)取过夜培养的ZmNAC77-35S-flag农杆菌1ml，加入至50ml 含有Rif⁺和Kan⁺的YEP液体培养基中，29℃，200rpm培养，在培养过程中不间断的监测菌液OD值，摇菌至OD600＝1.2。

3)将菌液转移至50ml离心管中，10000rpm，离心10min，收集菌液备用。

(2)花序法侵染拟南芥

1)用蒸馏水配制600mL Insalts sucrose溶液：Insalts 1.32g， Sucrose 30g，Silwet L-770.18mL(侵染时再加，现用现加)；先取30mL Insalts sucrose溶液重悬离心后的菌体，倒入干净的烧杯中，用Insalts sucrose溶液稀释至OD值1.1-1.2；侵染前，再用剩下的Insalts sucrose 溶液调节OD值于0.7-0.9之间，静置20min后进行侵染。

2)拟南芥因是自花授粉，开花前植株已经完成授粉，因此要获得较多的转基因种子，盛花期拟南芥在农杆菌侵染之前，最好在转化前一天修剪掉果荚和已经开放的花，再进行农杆菌的侵染。

3)将带有未开放花苞的花枝浸泡至含有农杆菌的Insalts sucrose溶液中，浸泡30s-60s，拿出晾干，捆绑后置于22℃黑暗处理 24h，取出放入光照培养间正常生长即可。

(三)拟南芥过表达纯合株系的筛选

待侵染后的拟南芥种子成熟收获，即可得到T1代种子，将T1 代种子置于28℃烘箱干燥3天，再置于室温晾晒10天，拟南芥种子后熟完成再进行种子萌发可以提高种子萌发率。

1.T1代阳性苗筛选

(1)潮霉素筛选

1)将后熟的T1代种子消毒灭菌，先将T1代种子放入75％乙醇中消毒5min，再用75％乙醇+Tration 100消毒5min，最后用无水乙醇重悬，铺于灭菌的滤纸上自然风干；

2)配制1/2MS固体培养基，灭菌后，待温度约50-60℃时，加入潮霉素使终浓度为30mg/L，混匀后倒入灭菌的培养皿中，在超净台中吹晾约2h；

3)将灭菌后的拟南芥种子均匀地置于培养基表面，用封口膜将培养皿密封，置于4℃冰箱放置3day，再置于光照培养间22℃， 16h光照，8h黑暗培养；

4)待生长10day左右，含有转基因的拟南芥幼苗会在潮霉素培养基中生长良好，叶片绿色，植株较大；不含转基因的拟南芥幼苗叶片发黄，植株较小；

5)将生长良好的含转基因的拟南芥幼苗转移到不含潮霉素的正常1/2MS固体培养基中，正常生长一周左右，移至松软的土壤中生长。

(2)DNA验证

将筛选出的98棵阳性苗，取样提取DNA，以DNA为模板，以 35s-1300-flag载体上的通用引物为模板，进行PCR扩增，验证初筛阳性苗是否含有转入的重组载体。DNA的提取采用CTAB法提取，实验方法如下：

1)将少许玉米叶片放入2mL离心管，装入直径4mm的钢珠，置于液氮中冷冻，利用高通量组织研磨仪将其破碎成粉末状。

2)加500mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液(1.17MNaCL、0.0016M EDTA-8.0,0.835MTtis-7.5,1.6％CTAB,1％β-疏基乙醇)，混匀。

3)在65℃水浴锅内反应45min，每隔15min小心摇动离心管。

4)取出离心管，待冷至室温后(25℃)，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，小心摇动试管50min，至有机相由无色→绿色→黑色(深绿色),静置10min。

5)室温下(≥25℃)，8000rpm离心10min，用剪去头部的枪头将上清转移至另一1.5mL离心管中，若上清仍为绿色应重复上一步骤。

6)加2/3体积异丙醇(-20℃)，上下颠倒数次小心混匀，12000rpm， 4℃，10min。

7)倒掉上清液，加入400μL70％乙醇，洗两次，用枪头吸去剩余乙醇，室温干燥至乙醇挥发尽。

8)待DNA干燥至透明，加入20μL TE(PH 8.0)，以溶解DNA。

9)吸取2μL DNA，加入Loading buffer，用1.0％的琼脂糖胶检测DNA质量，NANO检测DNA浓度。

10)DNA存于-20℃冰箱中备用。

11)已提取的DNA为模板，通过35s-1300-flag载体上的通用引物，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后，得到目标条带，有目标条带的即为含有重组载体的植株，剔除不含有重组载体的植株。

12)含有重组载体的植株继续生长至种子成熟，收取T2代种子。

2、不同表达量的纯合株系鉴定

(1)纯合株系鉴定

1)筛选纯合不分离

将单株收获的T2代种子晾晒10天，消毒，在含有潮霉素的1

/2MS培养基中萌发，每个阳性单株选取200粒种子，萌发完成后，统计萌发率(因T2代种子已出现分离，只有全部萌发的种子才是纯合阳性株系)，筛选萌发率接近1的株系作为候选纯合株系；

(2)不同表达量纯合株系筛选

挑取6个纯合株系的拟南芥叶片，每个株系选取9棵样品，取叶片提取RNA，反转录为cDNA，利用RT-PCR实验，分别测定不同株系的基因表达量，筛选出不同表达量的纯合株系，选定三个表达量高、中、低的株系，分别为OE1、OE2、OE3。

实施例2转基因株系籽粒脂肪酸含量降低

籽粒脂肪酸的提取、GC检测及计算方法脂肪酸的提取

拟南芥籽粒脂肪酸含量测定：脂肪酸经气相色谱测定后，用 HP7890气相色谱仪附带的HP-chemstation软件进行自动积分后，分别用公式(1)和(2)计算脂肪酸各成分含量和总含油量。

具体检测结果见图2-图4。

在col和OE1、OE2、OE3中检测拟南芥籽粒的11种脂肪酸组分 (图2)，分别为软脂酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、烯酸(C20:1)、山嵛酸(C22:0)和木蜡酸(C24:0)等。

其中C16:0(15.7％)、C18:0(2.1％)、C18:1(28.0％)、C18:2 (51.2％)和C18:3(1.4％)等五种脂肪酸含量达到含油量的98.4％。相关分析表明5种主要脂肪酸组分均与含油量降低，这表明任一组分含量的降低都可降低籽粒含油量。11种脂肪酸组分的变异范围广泛，最大值与最小值的比值倍数在1.3(C14:0)至8(C18:2)之间。根据各脂肪酸组分在代谢途径中的上下游转化关系，从饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比率(saturated fattyacid/unsaturated fatty acid， SFA/USFA)的2.4倍差异到C16:0/C18:0(C16:0与C18:0含量比率)的12.2倍差异。

实施例3转基因株系籽粒总淀粉含量升高

淀粉总含量的测定主要根据Megazyme总淀粉测定试剂盒 (K-TSTA 04/2009)，具体检测结果见图5-图7。

从葡萄糖、蔗糖、淀粉提取的含量变化都可以看出在OE1、OE2、 OE3比col的含量都有明显增加。

序列表

<120> 一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4052

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 1

gaggcactcg ctttcttcca caccacgtct cctccgcctg cgtctgcgtc ccttcctcac 60

gcggacgccc tcctaaaatc cccaaaatcc gatccgacca ccaaacccta accccatccc 120

gcactccccc cctccccccc ccccccaaca cgcgcgcgct ttcttagccg ctaagcatat 180

ccctctccgc cacgatctcg atggtggaga tgtctgtggt ggagctcagg acgctgccgc 240

tcggcttccg cttccacccc accgacgagg agctcgtcac ccactacctc aagggcaaga 300

tcaccggcag gatcaactcc gagtccgagg tcatccccga gatcgacgtc tgcaagtgcg 360

agccgtggga cctcccaggt aatacttgct tctgctaact gcccgcgtcg cttgatcgcc 420

cctctctgct ctcgattttt tatccgttcc ttcaagtaat tttgtgctcg ctggtcgtac 480

acggtaatct ctactgggat tgctgagttc ttcttgttct ggggctactc gttgcttcga 540

gttttttctg cgattttctt tcatcgggat ttgcttcgat gtacttttgc gagagtgtga 600

cgcgtttgtg ctgggaaaaa aagccgagca gatcacaacc cgctgcttcc tctgttctga 660

ttcgcgactg tttgcactag cggttcctca cgagatattt ctccgtgggc ggggcgggac 720

gggacgccgt gctgtgctgg ttcgatgcga ttcctcgaac tccgctgaat cctttcttta 780

ataccgcgtc ccccctttcc aagatgcgtt ttgattttgt gcgatgcagc tgaacaaaat 840

ccttgcgctg atccattttg ttgttgatcc gcgtgtcgag tcgagcaaac tcccgggaaa 900

gattattcag ttttcctgat cagatcctgg gtactgatga cgtgactgtg tatatgcaga 960

taagtccctg atccggtccg atgatcccga gtggttcttc ttcgccccca aggaccgcaa 1020

gtaccccaac ggtagcaggt ctaacagggc caccgaggcg ggatactgga aggctactgg 1080

caaggacagg ataatcaagt ccaagggcga caagcgcaag cagcatacca tcggtatgaa 1140

gaagaccctc gtcttccacc gcggtcgtgc ccccaagggc gagcgcacgg ggtggattat 1200

gcacgagtac cgcaccaccg agcctgagtt cgagtccggc gagcaggtat gaagctatta 1260

ttctcggtgc agcttatggt tgtcaagttc tctagtgtta gtatctgtac agagatgtgt 1320

gctttgtact tgagaactta agtttgtctt ggataaatat aacatagtag tctgttcact 1380

gaagaatgtg cccctaaaca ctagtttgat ttctggtggt taaaagaatt gagttctaat 1440

catcttcaca attagttctg tacagtataa gcacatagta aatgattttt ttgtgttgtg 1500

tctcatggca aatgtttact aaaatcacct ggtgcttgtg tatctgattt tccagggtgg 1560

ttatgttctt tatcgcctct tccgtaagca agaggagaaa actgagcgct ccagcccaga 1620

ggaagtggat agaagtggct actcacctac tccttctcgt tcttcacctg acaacctaga 1680

ggcgaatgag gaagctaata caccattaaa taaggaatct ccagaatctg ctctgcatga 1740

aagcccgatt gagctgccaa aatctgttga aaccaatggt ggttcaatga caaggtggct 1800

ggcggacaga aatgataact tgatggttac tgcaccagat gtttcccata tacctttcca 1860

cggacatgct gctggtgtag ctaaggtgag catcagagta aagagcctat taacatatca 1920

gcattcaaca tttgtctgta tgctatccac catcataatt ataattttat aactgaattt 1980

ctcctaacaa ttccctcatc tttattatta caagcaggtt gatccttctg ttggtgcttc 2040

aggccactta gttaatcccc acaatggaaa tgatgattat aacaaatttg tgtctgattt 2100

cactcccatt ctaccacttg aaaatgcatt cttcactgat atacaacaag gagcttttgg 2160

ttttgatggc atcatgaatc ctcttgatcc ccttgatgct ttcttgaatc aaacacttgt 2220

tgatcctgat gaacattcat caacaacatc aaaagttcag tatgattctg acattccaac 2280

agaatttgag aaccattgga atatgaaggt actggttttc tattcatatt gagtatttga 2340

gtttgccatc cgatgttttg gttatggtta atccagcaat ccttatattt tgctatattt 2400

gcaggttgag cctcaagatg atcaatgctg gtgggcaaac ataggatttg agccagacga 2460

accaaatcct ctgcttcctt gtgacaccac tgaccaagac atactttctg ttgactctgg 2520

tgctgattcc ttcaatgagc ttttcaatag tatggaagag actggaatta ttgttaggcc 2580

tcaacagttg gactccactg tgcaaccaaa ccatgtgttc gctagccagg gcaatgcagc 2640

acggaggctg cggctacagg ttgagtctag ggagatcata actaaagatg agagtgaaga 2700

tgaagtatca tgtgttctaa ctccagactg tttgaacgat tctgttgagg agtccactgc 2760

agagaaggat gtggcttctg atggggatga ggctgagtca acagggattg ttattagaag 2820

ccatcaccct gctccaagat caagctcaga gagttcattc actcaacagg gaactgctat 2880

gcaaaggctg cggctacagt caggccttaa caaaggccag cgtcctagta ctgatgattc 2940

atcaagctgc attatagacg aaccaggaag tcagcacaaa gcagaaaaag cagaggtgat 3000

tgttcttttt gttacccaga agctaaattt acatctgttt tttatgctag tgatgatcgg 3060

tatctaggat attccataga tactagttct gttagtgtac tgctactatt ttgcagtgtt 3120

ttcttaaatc ttcattgatc ctggccctgg gtgatctatt ttagtaaatg ataccatctg 3180

acctttttta tgttatgtca gattgaagag gatgcgagta caaacctcgc tggaagtgct 3240

gatgatctac ctggtaatat ccatgatgat gagcaaaaga acatccctga acatggtaat 3300

atgctttgga acttctgtat attgtgtctc ttgtgatgac ttctgttttt gctaaactag 3360

ttaaatatgt tgttgaactg aaggtgctga aatgacttct ccagaagcca aatctgttct 3420

gaggttgcgg aagacttctg aggaaggcaa caaggatgtc aagcaggaga gttgtctcga 3480

gccacacgtg agagcaccaa tgcagaaggg aggcttccaa tcatacatca tctggctggt 3540

tcttccggtg gctctgctcc tgcttctctg tgttgggaca tatggatggg tatgaaatct 3600

atcctggtgc ggtgcaaggc atgacatttt gcgcacatgg gttcctggcg tcaacctggt 3660

gtgcggtctt ctgtacataa cctgtggcat cctttcaaca gccgtaccct gcagtaagac 3720

atcccggcat tgccaaggca gctgaaaaat aaataaaaaa acaagtggta gaaatgacaa 3780

ggtggaaaag agcgaggtgt gttattgttg gttttagtac atcgtagtct tcttttgctg 3840

ttgttgtaga tgtcttgcta atgttgtcgc tgttgtgtag ttgcaattca agcccagggc 3900

tgccagtttt atttcctaat gtaatgtagc aagagcgaga ccctgttaga cgggtgcgct 3960

gaaattctga acctctgtaa tatctgatgt tcttgtggat acctgtttca gaattttcgg 4020

ttcctgaacc cagttactga tggcttgttg at 4052

<210> 2

<211> 1983

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 2

atggtggaga tgtctgtggt ggagctcagg acgctgccgc tcggcttccg cttccacccc 60

accgacgagg agctcgtcac ccactacctc aagggcaaga tcaccggcag gatcaactcc 120

gagtccgagg tcatccccga gatcgacgtc tgcaagtgcg agccgtggga cctcccagat 180

aagtccctga tccggtccga tgatcccgag tggttcttct tcgcccccaa ggaccgcaag 240

taccccaacg gtagcaggtc taacagggcc accgaggcgg gatactggaa ggctactggc 300

aaggacagga taatcaagtc caagggcgac aagcgcaagc agcataccat cggtatgaag 360

aagaccctcg tcttccaccg cggtcgtgcc cccaagggcg agcgcacggg gtggattatg 420

cacgagtacc gcaccaccga gcctgagttc gagtccggcg agcagggtgg ttatgttctt 480

tatcgcctct tccgtaagca agaggagaaa actgagcgct ccagcccaga ggaagtggat 540

agaagtggct actcacctac tccttctcgt tcttcacctg acaacctaga ggcgaatgag 600

gaagctaata caccattaaa taaggaatct ccagaatctg ctctgcatga aagcccgatt 660

gagctgccaa aatctgttga aaccaatggt ggttcaatga caaggtggct ggcggacaga 720

aatgataact tgatggttac tgcaccagat gtttcccata tacctttcca cggacatgct 780

gctggtgtag ctaaggttga tccttctgtt ggtgcttcag gccacttagt taatccccac 840

aatggaaatg atgattataa caaatttgtg tctgatttca ctcccattct accacttgaa 900

aatgcattct tcactgatat acaacaagga gcttttggtt ttgatggcat catgaatcct 960

cttgatcccc ttgatgcttt cttgaatcaa acacttgttg atcctgatga acattcatca 1020

acaacatcaa aagttcagta tgattctgac attccaacag aatttgagaa ccattggaat 1080

atgaaggttg agcctcaaga tgatcaatgc tggtgggcaa acataggatt tgagccagac 1140

gaaccaaatc ctctgcttcc ttgtgacacc actgaccaag acatactttc tgttgactct 1200

ggtgctgatt ccttcaatga gcttttcaat agtatggaag agactggaat tattgttagg 1260

cctcaacagt tggactccac tgtgcaacca aaccatgtgt tcgctagcca gggcaatgca 1320

gcacggaggc tgcggctaca ggttgagtct agggagatca taactaaaga tgagagtgaa 1380

gatgaagtat catgtgttct aactccagac tgtttgaacg attctgttga ggagtccact 1440

gcagagaagg atgtggcttc tgatggggat gaggctgagt caacagggat tgttattaga 1500

agccatcacc ctgctccaag atcaagctca gagagttcat tcactcaaca gggaactgct 1560

atgcaaaggc tgcggctaca gtcaggcctt aacaaaggcc agcgtcctag tactgatgat 1620

tcatcaagct gcattataga cgaaccagga agtcagcaca aagcagaaaa agcagagatt 1680

gaagaggatg cgagtacaaa cctcgctgga agtgctgatg atctacctgg taatatccat 1740

gatgatgagc aaaagaacat ccctgaacat ggtgctgaaa tgacttctcc agaagccaaa 1800

tctgttctga ggttgcggaa gacttctgag gaaggcaaca aggatgtcaa gcaggagagt 1860

tgtctcgagc cacacgtgag agcaccaatg cagaagggag gcttccaatc atacatcatc 1920

tggctggttc ttccggtggc tctgctcctg cttctctgtg ttgggacata tggatgggta 1980

tga 1983

<210> 3

<211> 660

<212> PRT

<213> 玉米

<400> 3

Met Val Glu Met Ser Val Val Glu Leu Arg Thr Leu Pro Leu Gly Phe

1 5 10 15

Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Thr His Tyr Leu Lys Gly

20 25 30

Lys Ile Thr Gly Arg Ile Asn Ser Glu Ser Glu Val Ile Pro Glu Ile

35 40 45

Asp Val Cys Lys Cys Glu Pro Trp Asp Leu Pro Asp Lys Ser Leu Ile

50 55 60

Arg Ser Asp Asp Pro Glu Trp Phe Phe Phe Ala Pro Lys Asp Arg Lys

65 70 75 80

Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Ser Asn Arg Ala Thr Glu Ala Gly Tyr Trp

85 90 95

Lys Ala Thr Gly Lys Asp Arg Ile Ile Lys Ser Lys Gly Asp Lys Arg

100 105 110

Lys Gln His Thr Ile Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe His Arg Gly

115 120 125

Arg Ala Pro Lys Gly Glu Arg Thr Gly Trp Ile Met His Glu Tyr Arg

130 135 140

Thr Thr Glu Pro Glu Phe Glu Ser Gly Glu Gln Gly Gly Tyr Val Leu

145 150 155 160

Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Gln Glu Glu Lys Thr Glu Arg Ser Ser Pro

165 170 175

Glu Glu Val Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Pro Thr Pro Ser Arg Ser Ser

180 185 190

Pro Asp Asn Leu Glu Ala Asn Glu Glu Ala Asn Thr Pro Leu Asn Lys

195 200 205

Glu Ser Pro Glu Ser Ala Leu His Glu Ser Pro Ile Glu Leu Pro Lys

210 215 220

Ser Val Glu Thr Asn Gly Gly Ser Met Thr Arg Trp Leu Ala Asp Arg

225 230 235 240

Asn Asp Asn Leu Met Val Thr Ala Pro Asp Val Ser His Ile Pro Phe

245 250 255

His Gly His Ala Ala Gly Val Ala Lys Val Asp Pro Ser Val Gly Ala

260 265 270

Ser Gly His Leu Val Asn Pro His Asn Gly Asn Asp Asp Tyr Asn Lys

275 280 285

Phe Val Ser Asp Phe Thr Pro Ile Leu Pro Leu Glu Asn Ala Phe Phe

290 295 300

Thr Asp Ile Gln Gln Gly Ala Phe Gly Phe Asp Gly Ile Met Asn Pro

305 310 315 320

Leu Asp Pro Leu Asp Ala Phe Leu Asn Gln Thr Leu Val Asp Pro Asp

325 330 335

Glu His Ser Ser Thr Thr Ser Lys Val Gln Tyr Asp Ser Asp Ile Pro

340 345 350

Thr Glu Phe Glu Asn His Trp Asn Met Lys Val Glu Pro Gln Asp Asp

355 360 365

Gln Cys Trp Trp Ala Asn Ile Gly Phe Glu Pro Asp Glu Pro Asn Pro

370 375 380

Leu Leu Pro Cys Asp Thr Thr Asp Gln Asp Ile Leu Ser Val Asp Ser

385 390 395 400

Gly Ala Asp Ser Phe Asn Glu Leu Phe Asn Ser Met Glu Glu Thr Gly

405 410 415

Ile Ile Val Arg Pro Gln Gln Leu Asp Ser Thr Val Gln Pro Asn His

420 425 430

Val Phe Ala Ser Gln Gly Asn Ala Ala Arg Arg Leu Arg Leu Gln Val

435 440 445

Glu Ser Arg Glu Ile Ile Thr Lys Asp Glu Ser Glu Asp Glu Val Ser

450 455 460

Cys Val Leu Thr Pro Asp Cys Leu Asn Asp Ser Val Glu Glu Ser Thr

465 470 475 480

Ala Glu Lys Asp Val Ala Ser Asp Gly Asp Glu Ala Glu Ser Thr Gly

485 490 495

Ile Val Ile Arg Ser His His Pro Ala Pro Arg Ser Ser Ser Glu Ser

500 505 510

Ser Phe Thr Gln Gln Gly Thr Ala Met Gln Arg Leu Arg Leu Gln Ser

515 520 525

Gly Leu Asn Lys Gly Gln Arg Pro Ser Thr Asp Asp Ser Ser Ser Cys

530 535 540

Ile Ile Asp Glu Pro Gly Ser Gln His Lys Ala Glu Lys Ala Glu Ile

545 550 555 560

Glu Glu Asp Ala Ser Thr Asn Leu Ala Gly Ser Ala Asp Asp Leu Pro

565 570 575

Gly Asn Ile His Asp Asp Glu Gln Lys Asn Ile Pro Glu His Gly Ala

580 585 590

Glu Met Thr Ser Pro Glu Ala Lys Ser Val Leu Arg Leu Arg Lys Thr

595 600 605

Ser Glu Glu Gly Asn Lys Asp Val Lys Gln Glu Ser Cys Leu Glu Pro

610 615 620

His Val Arg Ala Pro Met Gln Lys Gly Gly Phe Gln Ser Tyr Ile Ile

625 630 635 640

Trp Leu Val Leu Pro Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Gly Thr

645 650 655

Tyr Gly Trp Val

660

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 4

cggggtacct cgatggtgga gatgtctgtg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 5

gcgggatccg caccgcacca ggatagattt 30

Claims

1.一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，CDS序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列SEQ IDNO：3所示。

2.根据权利要求1所述的玉米基因ZmNAC77，其特征在于：玉米基因ZmNAC77引物序列为：

ZmNAC77- F：5‵-CGGGGTACCTCGATGGTGGAGATGTCTGTG-3‵；

ZmNAC77- R：5‵-GCGGGATCCGCACCGCACCAGGATAGATTT-3‵。

3.一种权利要求1或2所述的玉米基因ZmNAC77在调控拟南芥脂肪酸或淀粉含量中的应用，其特征在于，采用农杆菌介导的方法转化植物。

4.根据权利要求3所述的玉米基因ZmNAC77在调控拟南芥脂肪酸或淀粉含量中的应用，其特征在于，ZmNAC77过表达拟南芥突变体与野生型相比脂肪酸含量降低，淀粉含量增加。