CN110846329B - 利用油菜BnaA6YUC6基因改良油菜分枝角度 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及利用油菜BnaA6YUC6基因改良油菜分枝角度。本发明利用过表达油菜BnaA06YUC6基因的载体转化油菜，用以改良油菜的分枝角度，其中，所述油菜BnaA06YUC6基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；其蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:2所示。以甘蓝型油菜品种中双6号为受体，构建过表达油菜BnaA06YUC6基因的转基因植株。功能验证表明，油菜BnaA06YUC6基因所表现出来的这种功能可以用来改良农作物的分枝结构，如减小分枝角度等性状。

Description

利用油菜BnaA6YUC6基因改良油菜分枝角度
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及利用油菜BnaA06YUC6基因改良油菜分枝角度的方法。
背景技术
油菜是中国第一大油料作物，种植面积和产量均居于世界前列。油菜产油量占整个国产油料作物总产量的55％以上，在国产植物油供给中占据主要地位。
理想株型是提高作物产量的关键因素。选育形态与机能兼顾的理想株型材料，打破作物单产徘徊不前的局面一直是育种的主要目标之一。单子叶作物(如水稻、玉米和小麦等)栽培中，叶倾角小以及叶直立是植物冠层的重要参数，可以使太阳光从上到下辐射整个植株，提高光合效率，从而增加种植密度(Murchie et al.,2009；Zhu et al.,2010；Murchie and Reynolds,2012；Drewry et al.,2014；Mansfield and Mumm,2014)。随着油菜直播技术的推广，通过株型改良提高种植密度对提高产量及实施机械化收割同样有重要意义。紧凑型油菜苗期叶片上挺，成株期分枝夹角小，使单个植株占用较少空间，适宜高密度种植，有利于提高群体光能利用率，增加生物学产量，提高经济系数，从而获得较高产量(Cai et al.,2016)。同时，紧凑型油菜在密植条件下分枝部位适当提高，有效分枝数及分枝长度都有部分降低，使油菜成熟期相对集中，植株间不相互交叉，更有利于开展油菜的机械化收割，降低机收造成的损失。因此，改良油菜株型，减小油菜分枝角度，不仅能提高油菜产量，也可以推动机械化生产的实施，符合我国油菜生产发展的长远目标。
YUCCA在生长素合成路径中发挥重要功能。YUCCA蛋白催化吲哚-3-丙酮酸转化为吲哚-3-乙酸，完成生长素的最终合成过程。通过过量表达及功能缺失多突变体研究发现，YUCCA基因的不正常表达都会造成植物生长发育的缺陷，这与生长素的过量合成或缺失相关(Cheng et al.,2006)。在水稻中过量表达或抑制YUCCA基因的表达，植株分别表现出生长素过量及生长素不敏感的表型(Yamamoto et al.,2007)。在拟南芥中过量表达YUCCA6基因，增强了植株的顶端优势，延缓了衰老过程(Cha et al.,2015)。研究者在土豆和烟草中过量表达YUCCA6基因，植株也表现出顶端优势，并且IAA含量和生长素相关基因的表达显著上升(Kim et al.,2013；Ke et al.,2015)。目前国内外未见利用YUCCA基因调控植物株型或分枝角度的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用油菜分枝角度调控基因BnaA06YUC6减小油菜分枝角度。本发明提供了BnaA06YUC6基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列。实施例中，本发明将过表达油菜BnaA06YUC6基因的载体用于转化甘蓝型油菜品种中双6号，使甘蓝型油菜品种中双6号表现出分枝角度变小和株型紧凑的特点。
本发明前期通过QTL-seq方法，获得了一个A06染色体上控制分枝角度的候选QTL区间，在候选 QTL区间内选取差异SNP位点，获得一个能够引起BnaA06YUC6基因的氨基酸错义突变的差异SNP位点，进而筛选到分枝角度调控基因BnaA06YUC6，并进一步通过遗传转化的方法，确定了BnaA06YUC6 基因可以减小半冬性甘蓝型油菜中双6号的分枝角度。本发明首次通过QTL-seq方法鉴定到一个分枝角度调控候选基因BnaA06YUC6，并通过超量表达该基因降低了油菜植株的分枝角度，使油菜植株株型变得更为紧凑。经文献检索，国内未见有关利用甘蓝型油菜YUCCA基因调控油菜分枝角度的研究报道，也未见相关的专利申请公开或使用。
本发明还包括：油菜BnaA06YUC6基因的分离、克隆与转基因功能研究与应用等方面。
本发明的技术方案通过以下方法实现：
1、油菜BnaA06YUC6基因来源与蛋白结构分析
本发明的前期工作通过利用分枝角度大的油菜品种沪油19(一种公知油菜品种)，和分枝角度小的油菜品种Purler(来自澳大利亚的一个油菜品种)构建了一个F2分离群体(构建F2分离群体的方法为常规方法)，通过选择极端单株利用DNA混池高通量测序技术(QTL-seq)，得到了一个位于A06 染色体上的控制分枝角度候选QTL区间。在候选QTL区间内，选取以1M窗口，95％置信区间下筛选得到的区域中的SNP位点，并对这些SNP位点进行注释。在该区间内得到了一个差异的SNP位点，能够引起油菜A06染色体上BnaA06YUC6基因氨基酸错义突变(Wang et.al.,2016)。
通过PCR扩增方法得到了BnaA06YUC6的全长编码序列。根据Damor基因组预测的BnaA06YUC6基因的CDS序列信息设计引物，扩增BnaA06YUC6的全长CDS序列。其中：扩增BnaA06YUC6的全长编码序列的引物序列为：(正向引物BnaA06YUC6F1:ATGGATTGGAAGAAAGAGATG；反向引物 BnaA06YUC6R1:TTAGGCTTGATCAGGTTTACT)。从甘蓝型油菜品种Purler的cDNA序列中克隆到油菜BnaA06YUC6基因，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：2所示，编码序列全长为1299bp，共编码432个氨基酸。
上述油菜BnaA06YUC6基因编码的蛋白具有典型的FMO-like结构域，具体结构见图1。
2、过表达油菜BnaA06YUC6基因载体的构建
本发明实施例中使用油菜BnaA06YUC6基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和蛋白质序列(SEQ ID NO：2)。以pBI121S载体为表达的基础载体，利用限制性酶切位点BamH I将油菜BnaA06YUC6基因序列插入到pBI121S载体35S组成型启动子的下游，得到过表达油菜BnaA06YUC6基因的表达载体。该表达载体结构图如图2所示。
3、利用油菜BnaA06YUC6基因转化拟南芥及DNA检测
本发明以野生型拟南芥品种Columbia(哥伦比亚)为受体，利用农杆菌介导的花序浸染法将油菜 BnaA06YUC6基因通过过表达载体导入野生型拟南芥品种Columbia的花序中，用卡那霉素抗性(常规方法)筛选转基因T1代种子，获得过表达油菜BnaA06YUC6基因的转基因拟南芥植株。于苗期取叶片用常规的CTAB方法提取基因组DNA。以转化载体上的标记引物NPTII(正向引物NPTIIF: GATGGATTGCACGCAGGT；反向引物NPTIIR:TCGTCAAGAAGGCGATAGA)进行PCR扩增(PCR 扩增体系为：DNA1μl，2×PCR mix 10μl，引物F及R各0.5μl，双蒸水8μl，总体积20μl；PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃40s，30循环；72℃5min，25℃1min)，检测转化材料的阳性，最终获得阳性植株。
4、油菜BnaA06YUC6基因的转化试验及DNA检测
本发明以甘蓝型油菜品种中双6号(一个公知油菜品种，中国农业科学院油料作物研究所)为转基因受体，利用农杆菌介导的侵染方法将油菜BnaA06YUC6基因过表达载体(如上所述)导入到甘蓝型油菜品种中双6号切短的下胚轴中，用卡那霉素抗性筛选阳性植株，获得过表达油菜BnaA06YUC6 基因的转基因植株。将油菜BnaA06YUC6基因转化处理的甘蓝型油菜品种中双6号移栽到生长间(人工培养室)，于苗期取叶片用常规的CTAB方法提取基因组DNA。以转化载体中的标记引物NPTII(正向引物NPTIIF:GATGGATTGCACGCAGGT；反向引物NPTIIR:TCGTCAAGAAGGCGATAGA)进行 PCR扩增(PCR扩增方法同上)，检测转化材料的阳性，最终获得阳性植株。
5、转化BnaA06YUC6基因拟南芥植株的表达量检测
采用通用的Trizol法(该方法所用的Trizol试剂购自宝生物工程大连有限公司)抽提拟南芥转化植株幼嫩单株叶片的RNA，进行反转录，再以拟南芥AtActin基因(登陆号AT5G09810.1)作内参，扩增引物为(正向引物AtActinF:GGTTCGTGGTGGTGAGTTTG；反向引物AtActinR: GTATCGGGTGACAATGCAGC)，设计BnaA06YUC6基因的特异性扩增引物(正向引物BnaA06YUC6F2:ATGGATTGGAAGAAAGAGATG；反向引物BnaA06YUC6R2:TTAGGCTTGATCAGGTTTACT)扩增油菜BnaA06YUC6基因的部分片段(PCR扩增体系为：DNA1μl，2×PCR mix 10μl，引物F及R各0.5μl，双蒸水8μl，总体积20μl；PCR反应程序为：95℃5min；95℃ 30s，57℃30s，72℃40s，32循环；72℃5min，25℃1min)，分析BnaA06YUC6基因表达量的变化情况。该基因在BnaA06YUC6转基因植株中的表达量比对照的拟南芥野生型Columbia植株的表达量有明显升高。结果见图3所示。
6、转化BnaA06YUC6基因油菜的表达量的检测
用通用的Trizol法抽提油菜幼嫩单株叶片的RNA(方法同上)，并进行反转录，以BnaA06YUC6 基因的特异性扩增引物(正向引物BnaA06YUC6F3:CTTGTCTCAAAAAGAAAGGA；反向引物 BnaA06YUC6R3:AATCAAGAGGAAACGGTCAA)扩增油菜BnaA06YUC6基因的部分片段；油菜 BnaActin基因(BnaC02g00690D)作内参，扩增引物为(正向引物BnaActinF:TCTGGCATCACACTTTCTACAACGAGC；反向引物BnaActinR: CAGGGAACATGGTCGAACCACC)，分析BnaA06YUC6基因表达量的变化情况(PCR扩增方法同上)。在BnaA06YUC6转基因植株中的表达量相比对照甘蓝型油菜品种中双6号植株中表达量有明显升高。结果见图4所示。
7、油菜BnaA06YUC6基因转化拟南芥植株分枝角度性状调查与统计
将转BnaA06YUC6拟南芥阳性植株中，表达量相比野生型对照拟南芥野生型Columbia升高显著的两个家系收获种子，种植下一代，于苗期取叶片用常规的CTAB方法提取基因组DNA。以转化载体上的标记引物NPTII(正向引物NPTIIF:GATGGATTGCACGCAGGT；反向引物 NPTIIR:TCGTCAAGAAGGCGATAGA)进行PCR扩增，检测植株阳性。用量角器量取阳性单株从最下面到最上面每一个分枝与主枝之间的夹角，取平均值作为该单株的分枝角度。在BnaA06YUC6转基因阳性植株中分枝角度比对照拟南芥野生型Columbia的分枝角度显著减小。具体结果见图5所示。
8、油菜BnaA06YUC6基因转化油菜植株分枝角度性状调查与统计
将转BnaA06YUC6甘蓝型油菜阳性植株中，表达量相比对照甘蓝型油菜中双6号升高显著的两个家系收获种子，种植下一代，于苗期取叶片用常规的CTAB方法提取基因组DNA。以转化载体上的标记引物NPTII(正向引物NPTIIF:GATGGATTGCACGCAGGT；反向引物NPTIIR:TCGTCAAGAAGGCGATAGA)进行PCR扩增，检测植株阳性。用量角器量取阳性单株从最下面到最上面每一个分枝与主枝之间的夹角，取平均值作为该单株的分枝角度。在BnaA06YUC6转基因阳性植株中分枝角度明显小于对照甘蓝型油菜中双6号的分枝角度。具体结果见图6所示。
9、油菜BnaA06YUC6蛋白的酶活性测定
本实施例中使用油菜BnaA06YUC6基因的核苷酸序列(如SEQ ID NO：1所示)及蛋白质序列(如 SEQ ID NO：2所示)。以原核表达载体pCold-TF(一种常见商业化原核表达载体，购买于Takara公司)为基础载体，利用限制性酶切位点BamH I和EcoR I，将BnaA06YUC6基因全长CDS序列插入到 pCold-TF载体的CSPA启动子及His标签下游，得到BnaA06YUC6基因的原核表达载体，该表达载体结构图如图7所示。将构建好的原核表达载体利用常规的热激法导入大肠杆菌菌株BL21中，加IPTG进行诱导表达。确定BnaA06YUC6蛋白可以诱导表达之后，使用通用的亲和层析法，利用His标签将蛋白纯化出来，同时诱导表达及纯化空载体标签蛋白。
在1×PBS缓冲液(购于索莱宝公司，pH7.4)中加入纯化的蛋白溶液，同时加入终浓度为40μM的 FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)、100μM的IPA(吲哚-3-丙酮酸)和1mM的NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，30℃水浴锅中反应30分钟，之后用1/10体积的HCl(1N)终止反应。将反应完成的样品和IPA、IAA(吲哚-3-乙酸)标准品一起利用液相色谱-质谱联用仪测定各组分含量。含有 BnaA06YUC6蛋白反应体系中，可以检测到一个很明显的IAA产物峰，而加入对照His标签蛋白的反应体系则没有产生明显的IAA峰，表明本发明克隆的BnaA06YUC6蛋白可以将前体物质IPA转化为IAA。结果见图8所示。
附图说明
图1：油菜BnaA06YUC6基因的结构图谱。
图2：过表达油菜BnaA06YUC6基因的表达载体结构图谱。
图3：转油菜BnaA06YUC6基因拟南芥的半定量RT-PCR检测结果。
图4：油菜BnaA06YUC6转基因植株的半定量RT-PCR检测结果。
图5：BnaA06YUC6转化拟南芥植株T2家系分枝角度调查结果。
图6：油菜BnaA06YUC6转基因植株T0代分枝角度测量结果。
图7：体外表达油菜BnaA06YUC6基因的原核表达载体结构图谱。
图8：体外表达油菜BnaA06YUC6蛋白的酶活性测定结果。附图标记说明：图8中的A图表示IPA 和IAA标准品的洗脱峰(其中a代表IPA，b代表IAA)；图8中的B图表示反应体系中加入空载体标签蛋白后，可以检测到底物IPA，但检测不到IAA；图8中的C图表示在反应体系中加入BnaA06YUC6蛋白后，既可以检测到底物IPA，也可以检测到产物IAA。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO:1是BnaA06YUC6基因的核苷酸序列(其中1-1296bp是该基因的编码区)。
序列表SEQ ID NO:2是BnaA06YUC6基因编码的蛋白质序列。
实施例1基因的分离及克隆
本发明通过构建分枝角度大的油菜品种沪油19(上海市农业科学院)和分枝角度小的油菜品种 Purler(澳大利亚油菜品种)的F2遗传群体，选取极端单株构建混池，采用QTL-seq的方法得到了一个A06染色体上控制分枝角度的候选QTL区间，在候选QTL区间内，选取以1M窗口，95％置信区间下筛选区域中的差异SNP位点，得到分枝角度调控基因BnaA06YUC6(Wang et al.,2016)。根据Damor基因组预测的BnaA06YUC6基因的CDS序列信息，设计BnaA06YUC6全长扩增引物(正向引物 BnaA06YUC6F1:ATGGATTGGAAGAAAGAGATG；反向引物BnaA06YUC6R1:TTAGGCTTGATCAGGTTTACT)，在分枝角度小的甘蓝型油菜Puler的cDNA中扩增BnaA06YUC6基因CDS序列。经测序，其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
蛋白结构域分析表明，BnaA06YUC6编码的蛋白具有典型的FMO结构域，结构见图1。
实施例2转化载体的构建
用带酶切位点BamH I的引物(正向引物BnaA06YUC6F2：GGATCCATGGATTGGAAGAAAGAGATG；反向引物BnaA06A6YUC6R2:GGATCCTCAATTCCCACCACGATCAC)克隆油菜BnaA06YUC6基因的CDS片段，用限制性内切酶 BamH I酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，再利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，按试剂盒说明书操作)回收该片段。用限制性内切酶BamH I消化植物过表达载体pBI121S，加入去磷酸化酶SAP去磷酸化，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(来源见上)回收载体片段，将酶切好的外源片段和载体片段用DNA T4连接酶连接。采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在50μl感受态细胞中加入5μl连接产物，冰上放置30min，42℃水浴90s，加入400μl的LB液体培养基，37℃摇床复苏 30min，菌体离心后涂布于含有50mg/L卡那霉素的LA平板上。挑取大肠杆菌单菌落，在加入有50mg/L 卡那霉素的LB培养基中震荡培养12小时，然后用常规碱裂解法抽提质粒，BamHI酶切检测阳性并测序验证，最后将油菜BnaA06YUC6基因基因插入到35S启动子的下游，得到转化载体，其结构见图2。
实施例3利用转化载体转化根癌农杆菌
取1μl油菜BnaA06YUC6基因过表达载体质粒DNA，加入到50μl的GV3101感受态细胞中，冰浴30 min，液氮中迅速冷冻5min，37℃水浴5min，再冰上静置5min，加入500μl的LB液体培养基，28℃震荡复苏2小时。菌体离心后涂布于含有卡那霉素50mg/L、利福平25mg/L和链霉素25mg/L的YEP平板上，于28℃培养2天。挑取鉴定结果为阳性的农杆菌单菌落，接种至含有上述浓度抗生素的YEP培养液中，于28℃，200rpm摇床培养16个小时，至农杆菌培养至对数期，用含30g/L蔗糖的液体MS基本培养基(MS 基本培养基配方请参见：Murashige和Skoog，1962年发表的文献，MS基本培养基是本领域的公知常识)将其重悬至OD600为0.3-0.4。
实施例4转基因甘蓝型油菜植株的获得
本实施例采用甘蓝型油菜中双6号下胚轴为受体材料。具体操作步骤为：取甘蓝型油菜中双6号的种子若干，去除干瘪破损的种子，用75％的酒精灭菌4min，再用0.1％HgCl2表面灭菌15min，最后用无菌水冲洗6-8次，吸干种子水分后，将种子置于1/2MS基本培养基(每升含1/2MS基本培养基和7.5g 琼脂，调培养基的pH至6.0，此处1/2MS是指MS基本培养基中的无机盐成分用量减半)上暗培养发芽 4-5天，取出无菌幼苗，将下胚轴切成1cm左右的片段，将培养到一定浓度的农杆菌菌液侵染油菜下胚轴30分钟，期间每隔五分钟左右摇动一次三角瓶，将外植体转至放有灭菌滤纸的空培养皿中，铺开，用小滤纸片将菌液吸干后，将外植体转到M1培养基(每升培养基中含MS基本培养基附加30g蔗糖， 18g甘露醇，1mg的2,4-D，0.3mg的激动素(KT)，100μM乙酰丁香酮，7.5g琼脂糖,调培养基的pH至5.8)中，在24℃暗培养两天(48h)。将共培养两天的外植体转入M2培养基(每升含MS培养基和30g蔗糖，附加18g甘露醇，1mg 2,4-D，0.3mg激动素，20mg AgNO3，7.5g琼脂糖，并加入25 mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素；调培养基的pH至5.8)，在光温可控的培养室中(光照16h，黑暗8h，培养温度为24℃)培养三周，然后将外植体转入M3培养基(每升培养基含MS基本培养基，附加10g葡萄糖，0.25g/木糖，0.6g MES，2mg玉米素(ZT)，0.1mg吲哚乙酸(IAA)，7.5g琼脂糖，并加入25mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素，调培养基的pH至5.8)，继续以上述条件进行光照培养，每两周用新鲜M3培养基继代一次以保证营养充分，一般在第二次继代后可看到分化出再生苗；。将长出再生苗的愈伤组织移入一灭菌的空皿中，用灭菌的镊子和手术刀将再生苗从愈伤组织上切下来(尽量切干净)，再转入M4培养基(每升培养基含MS基本培养基，附加10g蔗糖，7.5g琼脂粉,调培养基的pH至5.8)以上述条件进行光照培养，约三到四周使再生苗生根，得到再生植株。
实施例5转基因植株的阳性检测
在2ml离心管中加入0.1g左右的新鲜拟南芥叶片，分别加入600μl的2％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液(CTAB法抽提植物DNA为本领域常规方法)，将样品磨碎，放入65℃水浴锅中孵育 30分钟，期间颠倒混匀3次。取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24：1)，摇匀，室温10000rpm离心10分钟。吸取上清至另一洁净的空离心管中，加入2倍体积的95％乙醇，轻柔颠倒混匀，-20℃放置30分钟以上。12000rpm离心15分钟，用75％浓度的乙醇溶液洗涤沉淀一次，吹干后加100μl灭菌的双蒸水溶解DNA。取前述的拟南芥DNA 1μl扩增转化载体上的标记基因NPTII进行阳性检测，PCR扩增体系为：DNA1μl，2×PCR mix 10μl，引物F及R各0.5μl，双蒸水8μl，总体积 20μl；PCR扩增的条件：95℃5min后，95℃30s，57℃30s，72℃30s，28个循环，之后用72℃5min。 NPTII引物序列(正向引物NPTIIF:GATGGATTGCACGCAGGT；反向引物NPTIIR:TCGTCAAGAAGGCGATAGA)，PCR产物通过凝胶电泳检测，获得BnaA06YUC6转基因阳性甘蓝型油菜植株。
采用上述相同方法，抽提甘蓝型油菜叶片DNA，并采用上述PCR方法扩增转化载体上的标记基因 NPTII进行阳性检测，PCR产物通过凝胶电泳检测，获得BnaA06YUC6转基因阳性甘蓝型油菜植株。
实施例6转基因植株BnaA06YUC6基因表达量的检测
取新鲜的拟南芥叶片加入液氮研磨，取0.1g左右粉末加入RNAase free的离心管中，加入1ml Trizol 试剂(购自宝生物工程大连有限公司)，混匀后在室温下放置5分钟，然后加入200μl的氯仿，剧烈震荡30次，放置至液相分层，然后4℃，12000rpm下离心15分钟，吸取上清约500μl到一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，室温下放置15分钟，4℃，10000rpm下离心10分钟，倒掉上清，加入75％乙醇 (用灭菌的DEPC水配制，购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)洗涤1次，吹干后加入灭菌的 DEPC水溶解，测定RNA浓度。用试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，按试剂盒说明书操作)进行反转录，获得cDNA样品。以引物(BnaA06YUC6F3:CTTGTCTCAAAAAGAAAGGA；BnaA06YUC6R3:AATCAAGAGGAAACGGTCAA)扩增油菜BnaA06YUC6基因的部分片段，PCR扩增体系为：cDNA5μl，2×PCR mix 10μl，引物F及R各0.5μl，双蒸水4μl，总体积20μl，PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃40s，32个循环；72℃5min，25℃1min；以引物(正向引物AtActinF:GGTTCGTGGTGGTGAGTTTG；反向引物AtActinR: GTATCGGGTGACAATGCAGC)扩增拟南芥AtActin(登录号AT5G09810.1)基因做内参，分析 BnaA06YUC6基因转化拟南芥表达量变化情况，PCR扩增体系同上，PCR反应程序为95℃5min；95℃ 30s，57℃30s，72℃40s，28个循环；72℃5min，25℃1min。转化BnaA06YUC6基因的拟南芥的阳性转化植株，目的基因相比对照有明显的上升表达，结果见图3。
采用上述相同方法，抽提转基因阳性甘蓝型油菜植株的叶片总RNA，并进行翻转率。将得到的cDNA 以引物以引物(BnaA06YUC6F3:CTTGTCTCAAAAAGAAAGGA；BnaA06YUC6R3:AATCAAGAGGAAACGGTCAA)扩增油菜BnaA06YUC6基因的部分片段，PCR扩增方法与前述以拟南芥cDNA为模板扩增BnaA06YUC6基因部分片段相同。同时扩增油菜BnaActin基因(BnaC02g00690D)作内参(正向引物BnaActinF:TCTGGCATCACACTTTCTACAACGAGC；反向引物BnaActinR: CAGGGAACATGGTCGAACCACC)，分析BnaA06YUC6基因转化甘蓝型油菜表达量的变化情况，PCR 反应体系及程序与油菜BnaActin基因的扩增相同。转化BnaA06YUC6基因的甘蓝型油菜的阳性转化植株，目的基因相比对照有明显的上升表达，结果见图4。
实施例7转基因材料分枝角度的测量
将转BnaA06YUC6拟南芥阳性植株中，表达量相比野生型对照即拟南芥野生型Columbia显著升高的两个家系收获种子，种植下一代，于苗期取叶片用常规的CTAB方法提取基因组DNA。以转化载体上的标记引物NPTII(正向引物NPTIIF:GATGGATTGCACGCAGGT；反向引物 NPTIIR:TCGTCAAGAAGGCGATAGA)进行PCR扩增(PCR扩增的方法为通用方法)，检测植株阳性。用量角器量取阳性单株从最下面到最上面每一个分枝与主枝之间的夹角，取平均值作为该单株的分枝角度。结果显示，BnaA06YUC6转基因阳性植株的分枝角度比对照拟南芥野生型Columbia的分枝角度显著减小。结果见图5所示。
将转BnaA06YUC6甘蓝型油菜阳性植株中，表达量相比对照甘蓝型油菜中双6号显著升高的两个家系上收获种子，种植下一代，于苗期取叶片用常规的CTAB方法提取基因组DNA。以转化载体上的标记引物NPTII(正向引物NPTIIF:GATGGATTGCACGCAGGT；反向引物NPTIIR:TCGTCAAGAAGGCGATAGA)进行PCR扩增(PCR扩增的方法为通用方法)，检测植株阳性。用量角器量取阳性单株从最下面到最上面每一个分枝与主枝之间的夹角，取平均值作为该单株的分枝角度。结果表明：BnaA06YUC6转基因阳性植株中的分枝角度要明显小于对照甘蓝型油菜中双6 号的分枝角度。结果见图6所示。
实施例8 BnaA06YUC6基因的酶活分析试验
以原核表达载体pCold-TF(常见商业化原核表达载体，购于Takara公司)为基础载体，利用限制性酶切位点BamH I和EcoR I，将BnaA06YUC6基因全长CDS序列插入到pCold-TF载体的CSPA启动子及 His标签下游，得到BnaA06YUC6基因的原核表达载体，载体结构见图7。将构建好的表达载体利用常规的热激法导入大肠杆菌菌株BL21中，加IPTG进行诱导表达(16℃,18h)。收集诱导完成的菌体 (40ml)，于4℃，7000-8000g离心10分钟(经低温冻存的菌体待其在4℃融化后再进行后续操作)，加入2ml PBS缓冲液(购于索莱宝公司，pH7.4)，涡旋或用枪头吸打至细胞悬浮液呈匀浆状态。把装有菌体的离心管放在冰水中进行超声破碎：每次10s，总共四次，中间间隔2分钟以冷却破碎液，防止样品发热造成蛋白降解，于4℃，12000rpm离心15min，将上清液转移到新的10ml的离心管中。轻轻摇动盛有NickelChelated Agarose的试剂瓶(购买自GE Healthcare)使镍珠均匀悬浮，用剪口枪头吸取200ul镍珠至盛有上清的离心管中，4℃，于静音混合器上转动1h，使蛋白与镍珠充分结合；在2000g离心5min，弃上清，加入250ul Wash Buffer(含有25mM咪唑的PBS缓冲液，PH7.4)，重悬后转移悬浮液到离心柱中，外面套上收集管，2000g离心2min，将离心柱转移到新的收集管中，往离心柱中加入 500ul Wash Buffer,4℃温育5min,1000～2000g离心2min，将离心柱转移到新的收集管中，中央加入100ul Elution Buffer(含有200mM咪唑的PBS缓冲液，PH7.4)，4℃温育5min，1000～2000g离心2mim，共洗脱4次，分别收集洗脱液；取少量收集到的洗脱蛋白，加入SDS-PAGE Sample Loading Buffer，90℃变性10min，SDS-PAGE电泳检测是否有目的蛋白条带。同时用前述方法诱导表达，并纯化得到pCold-TF 载体空标签蛋白。
在PBS缓冲液(pH7.4)中加入纯化的蛋白溶液，同时加入终浓度为40μM的FAD、100μM的IPA 和1mM的NADPH，30℃水浴锅中反应30分钟，之后用1/10体积的HCl(1N)终止反应。将反应完成的样品和IPA、IAA标准品一起利用液相色谱-质谱联用仪测定各组分含量。在含有BnaA06YUC6蛋白反应体系中，可以检测到一个很明显的IAA产物峰，而加入对照His标签蛋白的反应体系则没有产生明显的IAA峰，表明BnaA06YUC6蛋白可以将前体物质IPA转化为IAA。结果见图8所示。
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序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 利用油菜BnaA06YUC6基因改良油菜分枝角度
<141> 2019-10-05
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1299
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1299)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1296)
<400> 1
atg gat tgg aag aaa gag atg gaa ggt aac cta gcg aat gac tac ttg 48
Met Asp Trp Lys Lys Glu Met Glu Gly Asn Leu Ala Asn Asp Tyr Leu
1 5 10 15
tcc tcc aac cac ggc atg atg acg tca caa cgc cgc atc tgc gtc ttc 96
Ser Ser Asn His Gly Met Met Thr Ser Gln Arg Arg Ile Cys Val Phe
20 25 30
acc ggt ccg gtg atc gta ggc gcc gga ccg tcg gga cta gcg acg gcg 144
Thr Gly Pro Val Ile Val Gly Ala Gly Pro Ser Gly Leu Ala Thr Ala
35 40 45
gct tgt ctc aaa aag aaa gga ata act tcg gta tta ctc gag aga tca 192
Ala Cys Leu Lys Lys Lys Gly Ile Thr Ser Val Leu Leu Glu Arg Ser
50 55 60
aac tgc ata gcg tca cta tgg cag ctc aag aca tac gac cgc ctc agt 240
Asn Cys Ile Ala Ser Leu Trp Gln Leu Lys Thr Tyr Asp Arg Leu Ser
65 70 75 80
ctc cac ctt cca aag caa ttc tgc gag ctt ccg ctt atg ccc ttt ccc 288
Leu His Leu Pro Lys Gln Phe Cys Glu Leu Pro Leu Met Pro Phe Pro
85 90 95
gct gac ttc cca act tat ccg aca aaa cag cag ttc atc gag tac ctc 336
Ala Asp Phe Pro Thr Tyr Pro Thr Lys Gln Gln Phe Ile Glu Tyr Leu
100 105 110
gag gac tac gct cgt agg ttc gat ata cga ccg gag ttt ggt cag acg 384
Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Phe Asp Ile Arg Pro Glu Phe Gly Gln Thr
115 120 125
gtc gag tcg gcg gag ttt gat gag aaa ctc ggg atg tgg cga gtg agg 432
Val Glu Ser Ala Glu Phe Asp Glu Lys Leu Gly Met Trp Arg Val Arg
130 135 140
agc gtg ggt aaa gaa ggc atg acg gag tat gtt tgc cgg tgg ttg gtg 480
Ser Val Gly Lys Glu Gly Met Thr Glu Tyr Val Cys Arg Trp Leu Val
145 150 155 160
gct gcg acg ggg gag aat gca gag ccg gtg gtc cct agg ttt gag ggg 528
Ala Ala Thr Gly Glu Asn Ala Glu Pro Val Val Pro Arg Phe Glu Gly
165 170 175
atg gag aag ttt gcg gcc acg ggg gta gtt aag cac acg agt cat tat 576
Met Glu Lys Phe Ala Ala Thr Gly Val Val Lys His Thr Ser His Tyr
180 185 190
aag acc ggt gga gat ttc gca gga aaa agg gtt ttg gtc gtc gga tgt 624
Lys Thr Gly Gly Asp Phe Ala Gly Lys Arg Val Leu Val Val Gly Cys
195 200 205
gga aac tcc ggc atg gag gtt tgt ttg gat cta tgc aac ttc ggt gct 672
Gly Asn Ser Gly Met Glu Val Cys Leu Asp Leu Cys Asn Phe Gly Ala
210 215 220
cag cct tct ctc gtt gtc aga gac gct gtg cac gtc cta cca cga gag 720
Gln Pro Ser Leu Val Val Arg Asp Ala Val His Val Leu Pro Arg Glu
225 230 235 240
atg ttg ggt act tca act ttt ggg ctg tcc atg ttg tta ctc aaa tgg 768
Met Leu Gly Thr Ser Thr Phe Gly Leu Ser Met Leu Leu Leu Lys Trp
245 250 255
ttg ccc atc cgg ctt gtt gac cgt ttc ctc ttg att gtt tcc cgg ttc 816
Leu Pro Ile Arg Leu Val Asp Arg Phe Leu Leu Ile Val Ser Arg Phe
260 265 270
atc ctc ggg gat acc acc ctg tta ggt ctt aac cga ccc cgg tta ggt 864
Ile Leu Gly Asp Thr Thr Leu Leu Gly Leu Asn Arg Pro Arg Leu Gly
275 280 285
cca ttg gag ctc aaa aat ctc acc ggc aaa acc ccg gtt ctc gac gtg 912
Pro Leu Glu Leu Lys Asn Leu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Asp Val
290 295 300
ggg acg ctt gcc aag atc aaa aca gga gat atc aag gtg tgt tct ggg 960
Gly Thr Leu Ala Lys Ile Lys Thr Gly Asp Ile Lys Val Cys Ser Gly
305 310 315 320
ata aga agg tta aaa cgg cac gaa gtt gag ttc gat aac ggg aaa aag 1008
Ile Arg Arg Leu Lys Arg His Glu Val Glu Phe Asp Asn Gly Lys Lys
325 330 335
gag aga ttt gat gcc ata ata ttg gca act ggc tac aaa agc aac gta 1056
Glu Arg Phe Asp Ala Ile Ile Leu Ala Thr Gly Tyr Lys Ser Asn Val
340 345 350
ccc tct tgg cta aag gag aat aaa atg ttt agt aag aaa gat gga ttc 1104
Pro Ser Trp Leu Lys Glu Asn Lys Met Phe Ser Lys Lys Asp Gly Phe
355 360 365
cca ata caa gag ttt ccg gag gga tgg aga ggg gaa tgt ggg cta tat 1152
Pro Ile Gln Glu Phe Pro Glu Gly Trp Arg Gly Glu Cys Gly Leu Tyr
370 375 380
gcg gtg ggg ttc aca aaa cgt ggg att tcg gga gca tca atg gat gca 1200
Ala Val Gly Phe Thr Lys Arg Gly Ile Ser Gly Ala Ser Met Asp Ala
385 390 395 400
aag aga ata gct caa gat ata tac gag tgt tca aga aaa tct gat caa 1248
Lys Arg Ile Ala Gln Asp Ile Tyr Glu Cys Ser Arg Lys Ser Asp Gln
405 410 415
gcc cat aga cat atc caa gtg ttc atg tca agt aaa cct gat caa gcc taa 1299
Ala His Arg His Ile Gln Val Phe Met Ser Ser Lys Pro Asp Gln Ala
420 425 430
<210> 2
<211> 432
<212> PRT
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 2
Met Asp Trp Lys Lys Glu Met Glu Gly Asn Leu Ala Asn Asp Tyr Leu
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Ser Ser Asn His Gly Met Met Thr Ser Gln Arg Arg Ile Cys Val Phe
20 25 30
Thr Gly Pro Val Ile Val Gly Ala Gly Pro Ser Gly Leu Ala Thr Ala
35 40 45
Ala Cys Leu Lys Lys Lys Gly Ile Thr Ser Val Leu Leu Glu Arg Ser
50 55 60
Asn Cys Ile Ala Ser Leu Trp Gln Leu Lys Thr Tyr Asp Arg Leu Ser
65 70 75 80
Leu His Leu Pro Lys Gln Phe Cys Glu Leu Pro Leu Met Pro Phe Pro
85 90 95
Ala Asp Phe Pro Thr Tyr Pro Thr Lys Gln Gln Phe Ile Glu Tyr Leu
100 105 110
Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Phe Asp Ile Arg Pro Glu Phe Gly Gln Thr
115 120 125
Val Glu Ser Ala Glu Phe Asp Glu Lys Leu Gly Met Trp Arg Val Arg
130 135 140
Ser Val Gly Lys Glu Gly Met Thr Glu Tyr Val Cys Arg Trp Leu Val
145 150 155 160
Ala Ala Thr Gly Glu Asn Ala Glu Pro Val Val Pro Arg Phe Glu Gly
165 170 175
Met Glu Lys Phe Ala Ala Thr Gly Val Val Lys His Thr Ser His Tyr
180 185 190
Lys Thr Gly Gly Asp Phe Ala Gly Lys Arg Val Leu Val Val Gly Cys
195 200 205
Gly Asn Ser Gly Met Glu Val Cys Leu Asp Leu Cys Asn Phe Gly Ala
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Gln Pro Ser Leu Val Val Arg Asp Ala Val His Val Leu Pro Arg Glu
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Met Leu Gly Thr Ser Thr Phe Gly Leu Ser Met Leu Leu Leu Lys Trp
245 250 255
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275 280 285
Pro Leu Glu Leu Lys Asn Leu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Asp Val
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Pro Ile Gln Glu Phe Pro Glu Gly Trp Arg Gly Glu Cys Gly Leu Tyr
370 375 380
Ala Val Gly Phe Thr Lys Arg Gly Ile Ser Gly Ala Ser Met Asp Ala
385 390 395 400
Lys Arg Ile Ala Gln Asp Ile Tyr Glu Cys Ser Arg Lys Ser Asp Gln
405 410 415
Ala His Arg His Ile Gln Val Phe Met Ser Ser Lys Pro Asp Gln Ala
420 425 430

Claims (1)

1.BnaA06YUC6基因片段在甘蓝型油菜分枝角度调控中的应用，其特征在于，所述BnaA06YUC6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过超量表达该基因降低了油菜植株的分枝角度。
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Non-Patent Citations (1)

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甘蓝型油菜分枝角度和茎秆倒伏性状的遗传基础解析;李洪戈;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)农业科技辑》;20190115;第4.4.1节 *

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