CN110791496B

CN110791496B - 水稻基因OsTPI1-1在水稻抗病性改良中的应用

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Publication number: CN110791496B
Application number: CN201810779900.9A
Authority: CN
Inventors: 王石平; 刘艳艳
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2018-07-17
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2038-07-17
Also published as: CN110791496A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及水稻基因OsTPI1‑1在水稻抗病性改良中的应用。OsTPI1‑1基因编码一个细胞质磷酸丙糖异构酶,该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:2所示。OsTPI1‑1表达量显著上升使转化的水稻植株对白叶枯病的抗性增强。在主效抗病基因Xa3/Xa26的背景下OsTPI1‑1表达量显著下降使转化的水稻植株丧失对白叶枯病的抗性。功能验证表明，OsTPI1‑1基因是水稻抗白叶枯病反应中的正调控因子，可以通过超量表达OsTPI1‑1基因以改良水稻的抗病性。

Description

水稻基因OsTPI1-1在水稻抗病性改良中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因OsTPI1-1的功能验证及应用。该基因编码一个定位于细胞质的磷酸丙糖异构酶，它正向调控水稻对白叶枯病以及抗白叶枯病主效基因Xa3/Xa26的抗性。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为世界上一半以上的人口提供主食(Zhang，2007)。水稻的病害是限制水稻生产的重要因素，病害的盛行常导致水稻产量和品质的下降。水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌的水稻致病变种-白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的维管束病害，是世界上对水稻危害最严重的细菌性病害之一。

根据植物对病原菌侵染的响应速度和强度，水稻对病原菌的抗性主要分为两个方面，分别为质量抗性(或称完全抗性)和数量抗性(或称部分抗性)。质量抗性可以由单个主效抗病(major disease resistance，MR)基因介导，对于病原菌的抗性一般是小种特异性的，具有抗性水平高和速度快的特点。数量抗性一般为多基因或数量性状位点介导，通常具有广谱性和持久性，但是抗性水平一般较低(Kou和Wang，2010；Zhang和Wang，2013)。其中由MR基因介导的质量抗性是水稻抗病育种中已被广泛运用的主要抗性资源。到目前为止，水稻中已被克隆的抗白叶枯病主效基因有11个，包括Xa1、Xa3/Xa26、Xa4、xa5、Xa10、xa13、Xa21、Xa23、xa25、Xa27和xa41(Hu等，2017；张海涛和王石平，2016)。其中Xa3/Xa26是一个已经在我国的水稻生产中运用多年的抗病基因，可以介导对多种白叶枯病菌致病小种的高效持久抗性(Gao等，2010)。虽然MR基因介导的抗病反应强，但由于多种原因，使MR基因在植物抗性改良中的利用受到一定限制：(1)MR基因资源有限，目前已鉴定的白叶枯病MR基因只有40个左右，而其中已克隆的只有11个；(2)MR基因多具有病原菌致病小种特异性，抗病范围有限；(3)病原菌的快速变异，可能导致MR基因在进化过程中丧失抗性。介导数量抗性的基因一般被称为抗病相关基因(defense-responsive gene)，是指位于MR启动的抗病信号传导路径中的基因。据已有报道，大多数抗病相关基因在单独作用时的抗性可能比MR基因小，但由于多种原因，抗病相关基因也是值得大力开发的基因资源：(1)大多数抗病相关基因的编码产物不需要与病原菌直接互作，它们可能具有持久抗性；(2)多数抗病基因参与的抗病反应没有病原特异性，它们的抗性可能具有广谱性；(3)相对于MR基因而言，抗病相关基因的资源非常丰富。由此看出，MR基因和抗病相关基因各有优点，如果能在抗性育种中把这两种不同的抗性基因资源结合起来，通过超量对植物基础抗性和MR基因的抗性都有贡献的基因的表达，将进一步巩固和增强作物的抗病性，这是常规作物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的是从水稻品种中分离克隆OsTPI1-1基因，并利用超量表达和抑制表达遗传转化技术使该基因在水稻植株中超量表达或是抑制表达，鉴定其在水稻病原菌互作中的功能，利用该基因改良水稻抵御病菌侵害的能力。

本发明的技术方案如下所述：

首先利用酵母筛库技术筛选得到主效抗病蛋白XA3/XA26的互作蛋白，分析鉴定得到其中一个互作蛋白的编码基因OsTPI1-1，然后采用PCR技术从水稻品种中获得OsTPI1-1基因序列，进一步在大肠杆菌中表达OsTPI1-1蛋白并证明OsTPI1-1蛋白具有磷酸丙糖异构酶活性。同时采用农杆菌介导的遗传转化方法在水稻中分别超量表达和抑制表达OsTPI1-1基因，对遗传转化的水稻植株进行抗病性分析，证明OsTPI1-1基因能够增强水稻抗病性，也为主效抗病基因Xa3/Xa26抗病功能的正常发挥所必需。

本发明涉及的OsTPI1-1基因赋予水稻对白叶枯病害产生抗病反应。该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，或基本相当于SEQ ID NO:1所示的序列。对其序列进行分析表明，它编码一种磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase，TPI)。超量表达OsTPI1-1基因可以增强水稻对白叶枯病菌的抵抗能力，抑制表达OsTPI1-1基因则使Xa3/Xa26介导的水稻白叶枯病菌抗性减弱。

可以采用已经克隆的OsTPI1-1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsTPI1-1基因以及任何感兴趣的一段核苷酸或与其同源的一段核苷酸。采用以上技术，可以分离得到包含OsTPI1-1基因的序列或者包含一段OsTPI1-1基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，并超量表达OsTPI1-1基因，产生抗病转基因植物或是提高携带MR基因Xa3/Xa26的水稻材料中的抗病稳定性。

本发明为增强水稻对白叶枯病的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将OsTPI1-1基因的完整编码区与能够超量表达目标基因的载体连接、转入水稻，通过超量表达OsTPI1-1基因改良水稻对白叶枯病的抵抗能力。

在本发明在实例部分，申请人阐述了OsTPI1-1基因的鉴定分离、功能验证和该基因的特点。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因编码的蛋白质序列。

图1：本发明鉴定水稻抗病基因OsTPI1-1及验证OsTPI1-1基因功能的流程图。

图2：OsTPI1-1(即OsTPI1.1)在酵母双杂交实验中与XA3/XA26胞内区域XA3/XA26₇₆₈互作。附图标记说明：阳性对照为转化了Clontech公司提供的阳性质粒的酵母细胞；阴性对照为转化了Clontech公司提供的阴性质粒的酵母细胞。二缺培养基为缺陷亮氨酸和色氨酸的合成培养基；四缺培养基为缺陷亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的合成培养基。蛋白之间的互作通过酵母细胞在四缺培养基中的生长状况判定。

图3：OsTPI1-1(即OsTPI1.1)蛋白具有磷酸丙糖异构酶活性。附图标记说明：融合的GST-OsTPI1-1蛋白可以催化甘油醛-3-磷酸(GAP)和二羟丙酮磷酸(DHAP)之间的转换。代谢物通过液相色谱质谱联用仪检测。GST蛋白用作阴性对照。

图4：本发明所用到的遗传转化载体的结构示意图。附图标记说明：RB和LB分别表示T-DNA的右边界和左边界，GUS表示β-葡糖苷酸酶基因，Hpt表示潮霉素磷酸转移酶基因(遗传转化筛选基因)。其中：图4中的A图为OsTPI1-1(即OsTPI1.1)超量表达的遗传转化结构图，P_Ubi表示玉米泛素基因启动子，TEVL表示烟草蚀刻病毒的5′非翻译区，NOS表示胭脂碱合成酶基因的多聚腺苷酸化信号；图4中的B图为OsTPI1-1(即OsTPI1.1)抑制表达载体的遗传转化结构图，P_35S表示花椰菜花叶病毒启动子，AdhI代表pDS1301载体上的玉米乙醇脱氢酶基因内含子I，OCS代表pDS1301载体上的章鱼碱合成酸基因终止子；Waxy-a代表pDS1301载体上的水稻Waxy基因内含子。

图5：T₀代OsTPI1-1(即OsTPI1.1)超量表达遗传转化植株中OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因表达量分析。附图标记说明：WT为对照水稻品种牡丹江8(遗传转化的受体)。遗传转化植株中OsTPI1-1基因的表达量是相对于对照牡丹江8中OsTPI1-1(即OsTPI1.1)的表达量。数据表述方式为平均值±标准差。“a”和“b”表示转基因植株与对照牡丹江8相比分别在P<0.01和P<0.05水平存在显著差异。

图6：T₀代OsTPI1-1抑制表达遗传转化植株白叶枯病菌接种分析。附图标记说明：图6中的A图和B图分别为T₀代OsTPI1-1(即OsTPI1.1)抑制表达遗传转化植株接种白叶枯病菌的病斑面积和OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因的表达量。大部分OsTPI1-1(即OsTPI1.1)表达量受抑制的转基因T₀代阳性植株表现出对白叶枯病菌PXO61的抗性减弱。Rb49为携带Xa3/Xa26的转基因材料，是OsTPI1-1(即OsTPI1.1)抑制表达的遗传转化受体。WT为感病对照牡丹江8，是Rb49的遗传转化受体。数据表述方式为平均值±标准差。“a”和“b”表示转基因植株与遗传转化受体Rb49相比分别在P<0.01和P<0.05水平存在显著差异。

图7：T₁代OsTPI1-1(即OsTPI1.1)超量表达遗传转化植株对白叶枯病菌的抗性增强与OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因的表达量增加共分离。附图标记说明：图7中的A图和B图分别为19号遗传转化植株(OsTPI1-1(即OsTPI1.1)-oe19)的T₁代接种白叶枯病菌的病斑面积和OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因的表达量，图7中的C图和D图分别为25号遗传转化植株(OsTPI1-1(即OsTPI1.1)-oe25)的T₁代接种白叶枯病菌的病斑面积和OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因的表达量。病斑面积为白叶枯病菌PXO61接种两周后的调查数据。WT为对照水稻品种牡丹江8(遗传转化的受体)。数据表述方式为平均值±标准差。“a”和“b”表示转基因植株与对照牡丹江8相比分别在P<0.01和P<0.05水平存在显著差异。

图8：T₁代OsTPI1-1(即OsTPI1.1)抑制表达遗传转化植株中白叶枯病菌抗病性的减弱与OsTPI1-1基因表达量的抑制共分离。附图标记说明：图8中的A图和B图分别为19号遗传转化植株(OsTPI1-1-RNAi19(Rb49))的T₁代接种白叶枯病菌的病斑面积和OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因的表达量，图8中的C图和D图分别为42号遗传转化植株(OsTPI1-1(即OsTPI1.1)-RNAi42(Rb49))的T₁代接种白叶枯病菌的病斑面积和OsTPI1-1基因的表达量。病斑面积为白叶枯病菌PXO61接种两周后的调查数据。遗传转化植株中OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因的表达量是相对于转化受体Rb49中OsTPI1-1(即OsTPI1.1)的表达量。Rb49为携带Xa3/Xa26的转基因材料，是OsTPI1-1(即OsTPI1.1)抑制表达的遗传转化受体。WT为感病对照牡丹江8，是Rb49的遗传转化受体。数据表述方式为平均值±标准差。“a”和“b”表示转基因植株与遗传转化受体Rb49相比分别在P<0.01和P<0.05水平存在显著差异。

图9：OsTPI1-1(即OsTPI1.1)抑制表达遗传转化植株对多种白叶枯病菌小种的响应分析。附图标记说明：植株在分蘖期接种白叶枯病菌；OsTPI1-1(即OsTPI1.1)抑制表达遗传转化植株通过把载体OsTPI1-1(即OsTPI1.1)-RNAi转化入携带Xa3/Xa26的材料Rb49中而获得。数据表述方式为平均值±标准差。“a”表示转基因植株与遗传转化受体Rb49相比在P<0.01水平存在显著差异。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明。图1描述了鉴定分离OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因以及验证OsTPI1-1(即OsTPI1.1)基因功能的流程。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：筛选XA3/XA26的互作蛋白

本发明的前期研究结果显示，抗病主效基因Xa3/Xa26可以介导对白叶枯病的广谱和持久抗性(Sun等，2004)，且该基因在中国的水稻育种中已被运用多年(Gao等，2010)。但目前鉴定到的与该基因相关或参与该基因介导的抗病反应的作用因子还非常有限，而且它们的作用机理也还很不清楚。

Xa3/Xa26基因编码产物为细胞膜定位的受体蛋白激酶(曹应龙，2007)，包含胞外LRR结构域、跨膜区以及胞内近膜和激酶结构域(Sun等，2004)，这类受体激酶的胞内近膜和激酶结构域被认为能把胞外接受到的信号往胞内传递。为了更好的利用Xa3/Xa26基因的抗病性并挖掘更多与抗病相关的基因，本发明研究人员用XA3/XA26蛋白胞内区域(第768到1103个氨基酸，XA3/XA26₇₆₈)筛选水稻品种中花11的酵母cDNA文库。对四缺培养基(缺陷亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的合成培养基)中生长出来的酵母单克隆进行扩大培养，抽提其中的质粒重新转入大肠杆菌菌株DH10B中，抽提大肠杆菌质粒，并利用美国AppliedBiosystems公司的测序试剂盒，以双脱氧核苷酸末端终止法(美国Applied Biosystems公司)进行测序鉴定。将测序得到的序列在水稻全基因组序列数据库(Rice GenomeAnnotation Project，http://rice.plantbiology.msu.edu/)中检索，发现其中一个克隆包含的cDNA片段属于一个预测的细胞质磷酸丙糖异构酶编码基因，在水稻全基因组序列数据库中的注册号为LOC_Os01g05490，本发明研究人员把它命名为OsTPI1-1(即OsTPI1.1)。把对应克隆中分离出来的质粒与XA3/XA26胞内区域质粒重新转化到酵母细胞中进行酵母双杂交的互作验证实验，通过观察酵母细胞在缺陷培养基的生长情况判定两个蛋白的互作情况。分析结果显示，OsTPI1-1(即OsTPI1.1)的蛋白片段确实在酵母细胞内与XA3/XA26的胞内区域(XA3/XA26₇₆₈)存在互作(图2)。

酵母双杂交实验中所用的培养基组分及其配方如下：

(1)二缺培养基的配制：

加ddH₂O定容至250ml，用1M氢氧化钾(KOH)调PH至5.8

(2)四缺培养基的配制：

加ddH₂O定容至250ml，用1M氢氧化钾(KOH)调PH至5.8

实施例2：水稻品种牡丹江8中的OsTPI1-1(即OsTPI1.1，本说明书该基因的命名下同，全部改为(即OsTPI1-1)是一个基因，修改的目的是由于专利电子申请系统不接受名称中有小数点的命名和名称)cDNA序列及蛋白活性的确定

1、水稻品种牡丹江8中的OsTPI1-1cDNA序列的确定

为了获得牡丹江8中OsTPI1-1基因的全长cDNA，参照前人的方法(Zhou等，2002)，研究人员首先提取了牡丹江8叶片中的总RNA，然后取5μg总RNA，加入DNaseI(美国Invitrogen公司)去除基因组DNA后作为模板，用oligo(dT)₁₅寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录得到总cDNA。OsTPI1-1在水稻全基因组序列数据库中的注册号为LOC_Os01g05490(水稻品种日本晴)。根据日本晴中已公布的序列信息，设计了两条PCR引物K16-oxF(5′-CGGGGTACCATGGGCCGCAAGTTCTTC-3′)(下划线代表用于载体连接的接头中KpnI限制性内切酶消化位点)和K16-oxR(5′-GCTGGATCCTTAGGCGGACTTCACGGTG-3′)(下划线代表用于载体连接的接头中BamHI限制性内切酶消化位点)。利用这两条PCR引物，以水稻品种牡丹江8的总cDNA为模板，扩增得到包含OsTPI1-1基因全长cDNA的片段。对PCR产物进行测序，得到水稻品种牡丹江8中OsTPI1-1基因全长cDNA的序列信息(见序列表SEQ ID NO:1)。

2、OsTPI1-1蛋白具有磷酸丙糖异构酶活性检测

OsTPI1-1基因编码253个氨基酸，根据水稻全基因组序列数据库的注释信息，其编码产物为细胞质磷酸丙糖异构酶。磷酸丙糖异构酶是参与糖酵解过程的重要催化酶，介导甘油醛-3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate，GAP)和二羟丙酮磷酸(dihydroxyacetonephosphate，DHAP)之间的转换(Wierenga等，2010)。为了验证OsTPI1-1蛋白是否具有磷酸丙糖异构酶活性，研究人员在大肠杆菌中表达并纯化了OsTPI1-1融合GST标签的蛋白(GST-OsTPI1-1)，用于体外酶活分析。具体操作如下：以水稻品种牡丹江8的总cDNA为模板，用PCR引物K16-Y2HF(5′-GCTGGATCCATGGGCCGCAAGTTCTTC-3′)(下划线为BamHI酶切位点)和实施例2-1中所述K16-oxR扩增OsTPI1-1的全长cDNA。连接到TA克隆载体pGEM-T easy(美国Promega公司)后，对阳性克隆进行测序，测序无突变的克隆质粒用BamHI消化切下目的片段，用T4-DNA连接酶将其连入表达载体pGEX-6p-1对应位置处。随后把构建好的表达载体用常规的电转化的方法转入表达菌株BL21(DE3)中进行原核蛋白的表达和纯化。体外酶活检测用液相色谱质谱联用仪(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析法，具体步骤如下：取130mg GST-OsTPI1-1蛋白或其GST对照蛋白，加入到含有5mMGAP(购自Sigma公司)或者DHAP(购自Sigma公司)的PBS缓冲液中，反应体系30μl，室温反应5sec到5min，用120μl甲醇终止反应。再用70％甲醇稀释200倍，在LC-MS/MS上检测。LC-MS/MS检测方法及条件参照已发表的文献(Bennette等，2011)

体外磷酸丙糖异构酶活性检测实验结果显示，不管是以GAP为底物还是以DHAP为底物，OsTPI1-1蛋白均能介导DHAP与GAP之间的结构转换(图3)，说明OsTPI1-1蛋白是一个有功能的磷酸丙糖异构酶。

实施例3：OsTPI1-1基因的功能验证

本发明采用农杆菌介导的遗传转化方法，通过在水稻品种牡丹江8中超量表达OsTPI1-1基因以及在携带Xa3/Xa26的材料Rb49中抑制OsTPI1-1基因的表达，进一步验证该基因的功能。

1、遗传转化载体的构建

本发明所用的超量表达载体是pU1301(Qiu等，2007)是携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子(P_Ubi)的农杆菌介导的遗传转化载体。以水稻品种牡丹江8的总cDNA为模板，用实施例2-1所述的引物K16-OxF和K16-oxR扩增OsTPI1-1基因的全长cDNA。连接到TA克隆载体pGEM-T easy(美国Promega公司)后，对阳性克隆进行测序，测序无突变的克隆质粒用KpnI和BamHI消化切下目的片段，用T4-DNA连接酶将其连入pU1301，即为OsTPI1-1的超量表达载体OsTPI1-1-oe(图4中的A图)。

本发明所用的抑制表达载体为pDS2301(Ma等，2017)，它携带新霉素磷酸转移酶编码基因，能对抗生素G418产生抗性，并携带具有组成型表达特征的花椰菜花叶病毒启动子，能够组成型抑制目的基因的表达。OsTPI1-1双链抑制载体的构建步骤如下：以上述OsTPI1-1-oe载体为模板，用PCR引物K16-RNAiF(5′-GGGACTAGTGGTACCCCTGGGTTATTCTTGGACACTC-3′)(下划线为SpeI和KpnI酶切位点)和K16-RNAiR(5′-GGGGAGCTCGGATCCGATGAATTCAGGCTTCAATGAAG-3′)(下划线为SacI和BamHI酶切位点)扩增得到一个458bp的cDNA片段。将此片段连入TA克隆载体pGEM-T easy，电转化入大肠杆菌菌株DH10B后，酶切筛选阳性克隆并进行测序。测序正确的质粒用限制性内切酶BamHI和KpnI切下并回收，此为OsTPI1-1双链抑制载体的第一链。将其与同样经过BamHI和KpnI酶切成线性的抑制载体pDS2301连接，得到的大肠杆菌克隆用酶切法检测阳性并测序。测序正确的携带第一链的载体用SacI和SpeI再次酶切成线性，同时用同样的限制性内切酶组合从上述携带OsTPI1-1部分cDNA片段的TA克隆载体上切下OsTPI1-1双链抑制载体的第二链，片段回收后与携带第一链的阳性载体连接，电转化入大肠杆菌菌株DH10B，然后采用酶切法对克隆进行阳性检测，测序正确的质粒即为OsTPI1-1双链抑制载体OsTPI1-1-RNAi(图4中的B图)。

2、遗传转化和T₀代植株分析

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将OsTPI1-1-oe和OsTPI1-1-RNAi分别导入水稻品种牡丹江8和携带Xa3/Xa26的转基因材料Rb49(Sun等，2004；Xiang等，2006)。具体的操作步骤如下：

(1)诱导愈伤组织：将水稻品种牡丹江8或者携带Xa3/Xa26基因的转基因材料Rb49的成熟种子去壳后，用75％的乙醇处理1分钟，再用0.15％的氯化汞(HgCl₂)浸泡消毒20分钟，每隔5分钟剧烈震荡一次。之后在无菌操作台上用灭菌蒸馏水清洗种子5次。将种子放置在诱导培养基上(成分见后)，置于暗室培养30-40天，温度为25±1℃。

(2)愈伤组织继代：在无菌操作台上挑取亮黄色、质地紧密且干燥的愈伤组织，放置在继代培养基上(成分见后)，置于暗室培养2周，温度为25±1℃。

(3)愈伤组织预培养：在无菌操作台上挑取亮黄色、质地紧密且干燥的愈伤组织，放置在预培养基上(成分见后)，置于暗室培养4天，温度为25±1℃。

(4)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养含有OsTPI1-1-oe或OsTPI1-1-RNAi载体的农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)，培养时间为2天，培养温度为28℃；之后将上述农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)，于28℃摇床上培养2-3小时。

(5)农杆菌侵染愈伤组织：调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀数值为0.8-1.0，将预培养后的愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟，之后转移至无菌滤纸上吸干，然后放置在共培养基(成分见后)上于黑暗处培养2-3天，培养温度为19℃。

(6)愈伤组织选择培养：用灭菌蒸馏水彻底清洗愈伤，之后转移愈伤至无菌滤纸上吸干，将愈伤转移至选择培养基(成分见后)上培养2-3次，每次2周。

(7)愈伤组织分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上于黑暗处培养5-7天，之后转移至分化培养基上(成分见后)，于光照培养室内培养，温度为26℃。

(8)遗传转化苗生根处理：剪去分化得到的遗传转化苗的一部分根，将其转移至生根培养基中，于光照培养室内培养2-3周，温度为26℃。之后将遗传转化苗移栽在土壤中。

本发明最终获得的超量表达遗传转化植株被命名为OsTPI1-1-oe，共获得独立转化植株15株。在抽穗期取OsTPI1-1-oe植株的剑叶，抽提RNA，采用qRT-PCR技术检测转化植株中OsTPI1-1基因的表达量。结果显示，与对照牡丹江8相比，10株遗传转化阳性植株中有7株OsTPI1-1基因的表达量显著升高(P<0.05)(图5)。

本发明最终获得的抑制表达遗传转化植株被命名为OsTPI1-1-RNAi(Rb49)，共获得独立转化植株16株。在孕穗期对所获得的遗传转化植株接种白叶枯病菌PXO61，结果发现，与含有Xa3/Xa26的对照材料Rb49相比，10株遗传转化阳性植株中有9株表现出对白叶枯病菌PXO61抗性的显著减弱(图6)。取OsTPI1-1-RNAi(Rb49)植株剑叶，抽提RNA，采用qRT-PCR技术检测转化植株中OsTPI1-1基因的表达量，结果显示，这些遗传转化植株中OsTPI1-1的表达量与植株的病斑面积呈现极显著的负相关(相关系数为–0.730，n＝16，P<0.01)。

3、遗传转化中所用的培养基组分及其配方如下：

(1)试剂和溶液的缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

于室温下逐一溶解，最后定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制：

于室温下逐一溶解，最后定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制：

准备800ml的去离子水并加热至70℃，加入3.73克的乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，最后定容至1000ml。

4)维生素贮存液(100X)的配制：

加去离子水定容至1000ml。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制：

室温下逐一溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制：

室温下逐一溶解并定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

称取2,4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

称取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

称取AS 0.392g，加入DMSO 10ml，溶解后分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液的配制：

称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入对应抗生素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入对应抗生素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

4、T₁代遗传转化植株抗病表型分析

对于OsTPI1-1-oe材料，为进一步确定OsTPI1-1基因表达量升高的遗传转化植株是否对水稻白叶枯病菌的侵染产生影响，研究人员选取T₀代OsTPI1-1基因表达量升高的2株遗传转化植株的T₁代家系进行表达量检测和抗病性分析。在孕穗期接种白叶枯病菌PXO61，接种两周后调查病斑面积，并取叶片抽提RNA，采用qRT-PCR技术检测转化植株中的基因表达量。结果显示，与对照牡丹江8相比，T₁代遗传转化家系植株中OsTPI1-1表达量升高的植株表现出对白叶枯病菌PXO61抗性的显著增强(P<0.05)，病斑面积与OsTPI1-1的表达量之间呈现显著负相关(OsTPI1-1-oe19：相关系数为–0.932，n＝16，P<0.01；OsTPI1-1-oe25：相关系数为–0.740，n＝11，P<0.01)(图7)。这些结果说明，OsTPI1-1基因是水稻对白叶枯病抗性的正调控因子，超量表达OsTPI1-1能够增强水稻对白叶枯病的抗性。

对于OsTPI1-1-RNAi(Rb49)材料，为进一步确定Xa3/Xa26材料中抗性的减弱是否由OsTPI1-1基因的抑制表达所造成，研究人员随机选择2个T₁代家系进行下一步的基因表达量检测和抗病性分析。在孕穗期接种水稻白叶枯病菌PXO61，两周后调查病斑面积，并取叶片抽提RNA，用qRT-PCR技术检测植株中OsTPI1-1基因的表达量。结果显示，与含有Xa3/Xa26基因的对照Rb49相比，OsTPI1-1基因表达量受抑制的植株对白叶枯病菌的抗性显著降低(P<0.01)，病斑面积与OsTPI1-1表达量之间呈现显著的负相关(OsTPI1-1-RNAi19(Rb49)：相关系数为–0.821，n＝14，P<0.01；OsTPI1-1-RNAi42(Rb49)：相关系数为–0.896，n＝14，P<0.01)(图8)。Xa3/Xa26介导对白叶枯病菌的广谱抗性，为确定OsTPI1-1基因表达量的抑制是否影响Xa3/Xa26的广谱抗性，在分蘖期对OsTPI1-1-RNAi19(Rb49)植株接种除PXO61之外的多个白叶枯病菌致病小种，包括3个菲律宾致病小种、2个中国致病小种和一个日本致病小种共6个白叶枯病菌致病小种，接种两周后调查病斑面积。结果显示，相对于携带Xa3/Xa26的材料Rb49，两个OsTPI1-1-RNAi19(Rb49)家系均表现出对所有6个致病小种的抗病性减弱(图9)。这些结果说明，OsTPI1-1基因是Xa3/Xa26基因发挥抗病功能所必需的正向调控因子，OsTPI1-1基因的表达量抑制使广谱抗白叶枯病的主效基因Xa3/Xa26抗病功能显著降低，可以通过OsTPI1-1基因的超量表达来稳定主效抗病基因Xa3/Xa26的抗病功能。

特别说明：OsTPI1-1基因，即OsTPI1.1基因，OsTPI1-1基因与OsTPI1.1基因是同一个基因，该基因命名修改的原因是由于专利电子申请系统中不接受名称中有“小数点”的命名和名称。

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<141> 2018-07-12

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 762

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(762)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(762)

<400> 1

atg ggc cgc aag ttc ttc gtt ggt ggc aac tgg aaa tgc aat ggg acc 48

Met Gly Arg Lys Phe Phe Val Gly Gly Asn Trp Lys Cys Asn Gly Thr

1 5 10 15

act gat cag gtg gac aaa att gtg aaa att ctg aat gag gga cag att 96

Thr Asp Gln Val Asp Lys Ile Val Lys Ile Leu Asn Glu Gly Gln Ile

20 25 30

gct tct aca gat gtc gtt gag gtg gtt gtc agc ccg cct tat gtg ttc 144

Ala Ser Thr Asp Val Val Glu Val Val Val Ser Pro Pro Tyr Val Phe

35 40 45

ctt cct gtg gtc aag agt cag ctg cgc ccg gag atc caa gtt gct gct 192

Leu Pro Val Val Lys Ser Gln Leu Arg Pro Glu Ile Gln Val Ala Ala

50 55 60

cag aat tgt tgg gtg aag aag ggc ggg gct ttc acc ggt gag gtc agc 240

Gln Asn Cys Trp Val Lys Lys Gly Gly Ala Phe Thr Gly Glu Val Ser

65 70 75 80

gct gag atg ctt gtc aac ctt agt att ccc tgg gtt att ctt gga cac 288

Ala Glu Met Leu Val Asn Leu Ser Ile Pro Trp Val Ile Leu Gly His

85 90 95

tct gaa agg agg agc ttg ttg ggt gaa tca aat gag ttt gtt gga gac 336

Ser Glu Arg Arg Ser Leu Leu Gly Glu Ser Asn Glu Phe Val Gly Asp

100 105 110

aaa gtg gca tat gcg ctc tct cag ggc ttg aag gtc att gca tgt gtt 384

Lys Val Ala Tyr Ala Leu Ser Gln Gly Leu Lys Val Ile Ala Cys Val

115 120 125

ggt gag acc ctc gag cag agg gaa tct gga tcg acc atg gat gtt gtt 432

Gly Glu Thr Leu Glu Gln Arg Glu Ser Gly Ser Thr Met Asp Val Val

130 135 140

gct gca caa aca aaa gca att gct gaa agg atc aag gat tgg act aat 480

Ala Ala Gln Thr Lys Ala Ile Ala Glu Arg Ile Lys Asp Trp Thr Asn

145 150 155 160

gtg gtt gtt gcc tat gaa cct gtg tgg gcc att gga act ggt aaa gtt 528

Val Val Val Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala Ile Gly Thr Gly Lys Val

165 170 175

gct aca cca gat caa gca caa gaa gtg cat gat ggc ctg agg aag tgg 576

Ala Thr Pro Asp Gln Ala Gln Glu Val His Asp Gly Leu Arg Lys Trp

180 185 190

ctc gct gct aat gtc agt gca gag gtt gct gaa tca aca agg atc atc 624

Leu Ala Ala Asn Val Ser Ala Glu Val Ala Glu Ser Thr Arg Ile Ile

195 200 205

tat gga ggt tcc gta act ggt gcg aac tgc aag gag ctg gca gca aag 672

Tyr Gly Gly Ser Val Thr Gly Ala Asn Cys Lys Glu Leu Ala Ala Lys

210 215 220

cct gat gtt gat ggt ttt ctc gtc ggt ggt gct tca ttg aag cct gaa 720

Pro Asp Val Asp Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro Glu

225 230 235 240

ttc atc gac atc atc aac tcc gcc acc gtg aag tcc gcc taa 762

Phe Ile Asp Ile Ile Asn Ser Ala Thr Val Lys Ser Ala

245 250

<210> 2

<211> 253

<212> PRT