CN101560504A - 油菜超长链脂肪酸合成酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多核苷酸，它的超表达可以提高植物中超长链脂肪酸的含量，本发明还公开了这种多核苷酸表达的氨基酸序列。本发明还公开了所述多核苷酸的用途。

Description

油菜超长链脂肪酸合成酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及到一个油菜中的长链脂肪酸延长酶的功能。包含了对这个基因编码蛋白在超长链脂肪酸(very long chain fatty acid elongase)合成代谢中的作用和应用。

背景技术

植物油脂中含有多种脂肪酸，如饱和棕榈酸，硬脂酸，单不饱和油酸，多不饱和亚麻酸等，大部分都是对人体健康有利的，这一点有别于动物性油脂。

植物种子中脂类合成相关的代谢无论在生化水平上还是对于一些相关基因的研究都已经取得了很大的进展，糖类首先由母体运入胚乳，而后为胚胎所吸收。在油菜种子中油的积累过程中，可以利用蔗糖(sucrose)，葡萄糖(glucose)，果糖(fructose)等作为碳源。而蔗糖由蔗糖合酶(sucrose synthase)切开后的产物可以通过胞质糖酵解途径(cytosolic glycolytic pathway)进行代谢。同时在质体膜上还有各种转运蛋白(transportor)，如葡萄糖-6-磷酸转运蛋白(Glc-6-P translocator)，丙糖磷酸转运蛋白(triose phosphate translocator)，磷酸烯醇式丙酮酸转运蛋白(PEPtranslocator)等可以将糖酵解过程中产生的一些中间产物(intermediate)在细胞质和质体之间进行交换。油菜的质体中同时存在着一条与胞质中平行的质体糖酵解途径(plastidic glycolytic pathway)，与质体内的淀粉代谢(starch metabolism)及质体戊糖磷酸途径(plastidic OPPP pathway)具有密切关系。在胞质和质体的糖酵解途径中所生产的葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸等均有可能作为碳源参与质体内脂肪酸的合成。由丙酮酸所产生的乙酰-CoA(acetyl-CoA)作为二碳单位参与了脂肪酸的合成，此后的合成由一系列质体内的脂肪酸合酶(FAS)所催化。当脂肪酸的碳链分子达到16C或18C的时候，脂肪酸链将从酰基载体蛋白上脱离下来，进入质体脂肪酸后续加工的原核途径，或被运入内质网进入真核途径，进行去饱和、延长的后续修饰过程。

超长链脂肪酸(very long chain fatty acids，VLCFAs)在植物发育过程中起着非常重要的作用，是构成植物表面被覆的蜡质等结构的重要成分，形成植物抵御外界环境变化的屏障。另外超长链脂肪酸在工业和人类健康的领域也有重要应用。植物油中的芥酸(cis-13-Docosenoic Acid)不利于身体健康，长期食用含芥酸的植物油极易导致冠心病、脂肪肝等，利用基因工程技术降低芥酸含量将是培育低芥酸或零芥酸油菜品种的有效手段之一。另一方面，芥酸又是生产润滑剂和尼龙的重要原料，利用基因工程技术生产芥酸具巨大的经济价值。神经酸(cis-15-Tetracosenic Acid)最早发现于哺乳动物的神经组织，故命名为神经酸。神经酸在神经组织和脑组织中含量较高，是生物膜的重要组成成分，通常作为脑甙中髓质(白质)的标志物。其与生物膜有关的多种特殊生理功能。神经酸作为白质的组成成份，它的缺乏将导致大脑的损伤。况且人体自身很难生成，只能靠体外摄取来补充。神经酸在预防中风，脑瘫，帕金森，脑萎缩和延缓脑衰老等多方面都有相当疗效。

因此，本领域迫切需要提供一种与提高植物油脂中超长链脂肪酸有关的蛋白及其编码基因。

发明内容

本发明旨在提供一种编码超长链脂肪酸合成酶及其片断、衍生物和类似物的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供这种多核苷酸及其编码的蛋白的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的多肽，它包含以下氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(ii)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化延长脂肪酸链长的功能的由(i)衍生的多肽。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码如上所述的多肽。

在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有如上所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有如上所述的载体或基因组中整合有如上所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供了一种如上所述的多肽的制备方法，所述的方法包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出如上所述的多肽。

在本发明的第六方面，提供了一种提高植物油脂中超长链脂肪酸含量的方法，所述的方法包括步骤：

(1)提供携带表达载体的宿主菌，所述的表达载体含有如上所述的多核苷酸；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的宿主菌接触，从而使如上所述的多核苷酸转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入如上所述的多核苷酸的植物细胞或组织或器官再生成植株；

优选的宿主菌选自大肠杆菌、农杆菌；

优选所述的超长链脂肪酸碳链长度20-40个；更佳地碳链长度20-30个。

在本发明的第七方面，提供了一种如上所述的多肽用途，所述的多肽被用于调节植物油脂中超长链脂肪酸的含量；优选地，所述的多肽的序列如SEQ ID NO：2所示。

在另一优选例中，所述的多肽被用于提高植物油脂中超长链脂肪酸的含量；更佳地，所述的多肽的序列如SEQ ID NO：2所示。

在本发明的第八方面，提供了一种如上所述的多核苷酸的用途，所述的多核苷酸被用于调节植物油脂中超长链脂肪酸的含量；优选地，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

在另一优选例中，所述的多核苷酸被用于提高植物油脂中超长链脂肪酸的含量；更佳地，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

在另一优选例中，所述的植物选自油菜、甘蓝、白菜、大豆、花生、芝麻、向日葵、棉花、麻疯树、或油棕榈。

据此，本发明提供了一种与提高植物油脂中超长链脂肪酸有关的蛋白及其编码基因。

附图说明

图1显示了如SEQ ID NO：1所示的基因序列。

图2显示了SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

图3显示了实施例1中cDNA芯片的点样方案。

图4显示了如SEQ ID NO：1所示序列的基因在植物种子发育过程中的表达情况。

图5显示了转入如SEQ ID NO：1所示序列的基因的拟南芥中该基因的表达检测情况；其中FAE表示脂肪酸延长酶(Fatty acid elongase)。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，首次从油菜(Brassica napus)种子中，利用反转录筛选到一个新的超长链脂肪酸合成酶基因，并对其进行了生物芯片及转基因植株的分析，显示该基因为获得植物油脂中超长链脂肪酸所必需，它的超表达(overexpression)能提高植物油脂中超长链脂肪酸的含量，因此在获得超长链脂肪酸等方面具有良好的应用前景。

具体地，发明人选取了两个阶段的未成熟油菜种子为材料，分别是3-9 DAF(dayafter flowering)(lib1)和11-19 DAF(lib2)，建立了cDNA文库并进行了测序，从中筛选到了与油菜种子发育过程中超长链脂肪酸合成相关的基因，对于改良油菜种子的品质具有重要意义。

本发明提供一种分离的多肽，它包含以下氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(ii)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化延长脂肪酸链长的功能的由(i)衍生的多肽。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，术语“包含”和“具有”指核苷酸或氨基酸序列中除了有指定的序列外，其一端或两端还可含有其它不会影响所述核苷酸或氨基酸序列生物活性的序列。在一个较佳的实施方案中，所述分离的多肽为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

如本文所用，术语“生物活性”是指使宿主细胞内延长脂肪酸链长和/或使超长链脂肪酸含量提高的功能。

在本发明中，“油菜超长链脂肪酸合成酶”，“超长链脂肪酸合成酶”，“脂肪酸延长酶”和“β-酮脂酰CoA合酶”可互换使用，都是指具有催化延长脂肪酸链长的功能的多肽，是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括超长链脂肪酸合成酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然超长链脂肪酸合成酶相同生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(I)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(II)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(III)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(IV)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的多肽还包括具有与超长链脂肪酸合成酶相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括油菜超长链脂肪酸合成酶的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与超长链脂肪酸合成酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗超长链脂肪酸合成酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供其他多肽，如包含超长链脂肪酸合成酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，如包含超长链脂肪酸合成酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了超长链脂肪酸合成酶的可溶性片段。通常，该片段具有超长链脂肪酸合成酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列好各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物好衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(一)在较低离子强度好较高温度下的杂交好洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(二)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(三)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码超长链脂肪酸合成酶的多聚核苷酸。

本发明的超长链脂肪酸合成酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或超长链脂肪酸合成酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984：224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的超长链脂肪酸合成酶。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码超长链脂肪酸合成酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，超长链脂肪酸合成酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因好翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含超长链脂肪酸合成酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点好转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的順式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得超长链脂肪酸含量高的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的好其它特性通过各种分离方法分离或纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明还涉及定量或定位检测超长链脂肪酸合成酶水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的超长链脂肪酸合成酶水平，可用于解释超长链脂肪酸合成酶在提高植物或植物油脂中超长链脂肪酸含量方面的重要性。

一种检测样品中是否存在超长链脂肪酸合成酶的方法是利用超长链脂肪酸合成酶的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与超长链脂肪酸合成酶特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成抗体复合物就表示样品中存在超长链脂肪酸合成酶。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用超长链脂肪酸合成酶特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测超长链脂肪酸合成酶的转录产物。

本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从油菜种子cDNA文库中分离出的，其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1674个碱基，编码全长为477个氨基酸的超长链脂肪酸合成酶(SEQ ID NO：2)。

超长链脂肪酸合成酶具有明确催化植物中超长链脂肪酸合成的功能，为提高植物或植物油脂中超长链脂肪酸的含量提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以导入序列如SEQ ID NO：1所示的基因，可改变现有优良农作物品种的生长发育情况，获得超长链脂肪酸的含量高的油菜、花生、甘蓝、白菜、大豆、芝麻、向日葵、棉花、麻疯树、和油棕榈等产油经济农作物，解决农业生产中存在的实际问题。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、首次从油菜种子中分离得到该编码超长链脂肪酸合成酶的核苷酸序列；

2、首次分离得到得到一个油菜中的超长链脂肪酸合成酶(β-酮脂酰CoA合酶)，并证明它参与到了碳链长度在20以上的超长链脂肪酸的延长。

下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

转基因植物材料中目的基因的表达水平检测

植物材料总RNA的提取

一、实验步骤

1、组织在液氮中预冷，在Retsch MM301型研磨仪中研磨成粉末；

2、加入1ml的Trizol(购自Invitrogen公司，产品目录号：15596-018)，剧烈震荡，室温静置5分钟；

3、4℃，12000rpm离心10分钟，从每管中吸取上清至另一1.5ml eppendorf管；

4、加入200ul氯仿，用力震荡1分钟，室温静置3分钟；

5、4℃，12000rpm离心15分钟，从每管中吸取上清至另一1.5ml eppendorf管；

6、每一管中加入0.5ml异丙醇，混匀后室温静置10分钟(RNA沉淀)；

7、4℃，12000rpm离心10分钟；

8、弃其上清，每一管中加入1.2ml的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁；

9、4℃，7500rpm离心5min，弃上清，空气中干燥5分钟；

10、加入30ul RNase-free水，55-60℃，10分钟至完全溶解，进行紫外分析测定(OD260)。

反转录PCR合成cDNA和PCR检测基因表达水平

1、冰上，在1.5ml的eppendorf管中加入下列体系(反转录试剂盒为Toyobo公司，货号，75580N4)：

5×RT缓冲液          4ul

dNTPs                2ul

oligo dT             1ul

Rnase抑制剂(RNase inhibitor)      1ul

Rever Tra Ace        1ul

Total RNA            ≤2ug

RNase-free water    加至20ul

2、用移液器吹吸混匀，瞬时离心；

3、30℃，10分钟，42℃，1小时，95℃，5分钟，4℃，10分钟。

4、利用PCR检测基因表达水平(所用引物Actin8-S：5’-GATGCTGATGACATTCAACCT-3’，Actin8-A：5’-GAAGTGAGAAACCCTCGTAG-3’；FAE-S：5’-TCCCGCTTCAGCAGGATATG-3’，FAE-A：5’-GAACCAGAGGACCCAAAGTG-3’)。

二、仪器与设备

1、Retsch MM301型研磨仪。

2、Eppendof震荡加热器。

3、Eppendof离心机。

4、Beckman冷冻离心机。

5、Beckman DU-640分光光度计。

6、BioRad电泳仪。

7、Tanon gis-2008凝胶成像系统。

8、MJ research PTC-100 PCR仪。

植物材料中脂肪酸含量的测定

一、实验步骤

1、取330mg植物材料(拟南芥或油菜种子)，液氮迅速研磨，迅速移入2毫升离心管中，加入1.4毫升甲醇，终止酶活，充分振荡。

2、加入50微升十九酸甲酯储存液(10毫克十九酸甲酯/毫升正己烷)，加入50微升水(导电率小于0.05μs)，振荡。

3、测PH值，调整到PH5-6。

4、70℃剧烈震荡十五分钟，一分钟时轻开盖子。

5、14000g离心三分钟。

6、上清移入8毫升玻璃瓶，沉淀加1毫升氯仿，振荡，37℃摇5分钟。

7、14000g离心3分钟，上清并入8毫升玻璃瓶，加1.4毫升纯水，振荡，测PH。

8、加入1毫升氯仿，震荡，4000rpm，离心十五分钟。

9、取出脂相，加1毫升甲醇/硫酸(97∶3)，100℃，4小时。

10、加入4毫升水，振荡，4000rpm，15分，离心，弃去水相，重复两次。

11、加无水硫酸钠干燥过夜，上清转入新的玻璃瓶。

12、用氮吹仪浓缩至约80微升。

13、加10微升吡啶和10微升，MSTFA，37℃，30分钟。

14、将样品适当稀释后，用气质联用仪(gas chromatography to massspectrometry)测脂肪酸组分与含量。

二、仪器与设备

1、Retsch MM301型研磨仪。

2、Eppendof震荡加热器。

3、Eppendof离心机。

4、Wealtec HB-1加热器。

5、安普公司氮吹仪。

6、Agilent 5975 insert(HP-1色谱柱)气质联用仪。

实施例1

获得多核苷酸序列

样品全部RNA抽提

一、操作步骤

1.组织(油菜种子3-9DAF/11-19DAF，拟南芥莲座叶)放入用液氮预冷过的碾钵中，在液氮中研磨至粉末状，转至匀浆管，加入1ml的Trizol(购自GIBCO BRL公司，产品目录号：15596-026)，匀浆；

2.室温放置5分钟；

3.加入200ul氯仿，用力震荡1分钟，冰浴20分钟；

4.4℃，12000rpm，20min离心；

5.从每管中吸取上清至另一1.5ml eppendorf管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后-80℃沉淀过夜(RNA沉淀)；

6.4℃，13000rpm离心20min后，去上清；

7.加入10ml 4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁；

8.4℃，13000rpm离心5min，弃上清；

9.加入适量400ul Milli-Q水，至完全溶解，进行紫外分析测定。

操作说明：根据GIBCO BRL公司的Trizol试剂操作说明书进行。

二、质量检测

1.紫外分析(检测仪器：GENEQUIANT II，以下同类型检测使用的仪器不变)

2.电泳检测

(电泳仪：FR-280，上海复日，电泳条件：1.1％琼脂糖凝胶，EB染色；100V、20min)检测合格

mRNA纯化

一、操作步骤

1)将上述抽提得到的全部RNA(total RNA)各取100ug用不含RNA酶的水(RNase-free water)溶解至指定体积500ul，将样品放65℃保温3分钟，取出振匀；

2)加入oligo-dT(QIAGEN，Cat.NO.70042)寡聚纤维素的柱子，将样品放70℃3分钟；

3)取出样品室温放20分钟，离心2分钟，上清吸出后冻存于-20℃；

4)沉淀中加入400ul清洗缓冲液(washing buffer)(kit提供，QIAGEN，Cat.NO.70042，以下相同)，至取出样品室温15分钟，离心2分钟，弃上清；

5)将离心柱(spin column)转入一新1.5ml离心管，在spin column加入400ul清洗缓冲液，离心管离心1分钟；

6)将离心柱转入一个新1.5ml离心管，在柱上加入100ul 10mM Tris-HCl，离心1分钟，收集离心液；

7)吸取10ul mRNA紫外分析。

二、质量检测

紫外分析(检测仪器：GENEQUIANT II)，检验合格。

cDNA合成、酶切及分级分离

一、操作步骤

cDNA第一链合成

1.在一个0.5ml灭菌离心管中加入以下试剂：

1μl  样品poly A⁺RNA(平行对照反应用1μl[1μg]的对照RNA)

1μl SMART IV寡核苷酸(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3’)

1μl CDS III/3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’

(N＝A，G，C，or T；N-1＝A，G，or C))

加2μl的去离子水补充体积到5μl；

2.混匀试剂并稍稍离心；

3.72℃温浴2分钟；

4.冰浴2分钟，稍稍离心后加入下列试剂：

2.0μl  5X第一条链缓冲液

1.0μl  DTT(20mM)

1.0μl  dNTP混合物(10mM)

1.0μl     PowerScript反转录酶

                           

10.0μl    总体积

5.混匀试剂并稍稍离心；

6.42℃温浴1小时；

7.将离心管置于冰上终止第一链合成。

LD PCR扩增cDNA

1.将PCR仪预热到95℃；

2.反应管中加入下列试剂：

2μl     cDNA第一链

80μl    去离子水

10μl    10X Advantage 2 PCR缓冲液

2μl     50X dNTP混合物

2μl     5’PCR引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)

2μl CDS III/3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’

(N＝A，G，C，or T；N-1＝A，G，or C))

2μl     50X Advantage 2 Polymerase Mix

100μl   总体积

3.轻拍混匀各组分，稍稍离心后放到已预热(95℃)的PCR仪(HYBAID PCREXPRESS，以下操作中使用的PCR仪不变)；

4.按下面程序开始PCR：

·95℃  1分钟

·22个循环：

95℃  15秒

68℃  6分钟

5.循环结束后取5-μl样品电泳检测(电泳仪：FR-280，上海复日，电泳条件：1.1％琼脂糖凝胶，EB染色；100V、20分钟)

蛋白酶K消化

1.吸取50μl扩增的ds cDNA(2-3μg)到一0.5-ml灭菌的离心管中，加入2μl蛋白酶K(20μg/μl)。

2.混匀试剂并稍稍离心。

3.45℃温浴20min，稍稍离心。

4.加入50μl去离子水。

5.加100μl酚∶氯仿∶异戊醇抽提。

6.14,000rpm离心5min。

7.收集上层液体到另一干净的离心管中。

8.加入等体积的氯仿∶异戊醇混匀。

9.14,000rpm离心5min。

10.收集上层液体到另一干净的离心管中。

11.加入1/10体积的3M乙酸钠，2.5倍体积95％的室温乙醇，室温条件下立即14,000rpm离心20min。

12.倒掉上清，用100μl 80％乙醇洗沉淀物。

13.空气干燥沉淀物约10min。

14.加79μl的去离子水溶解沉淀。

Sfi I消化

1.在一0.5-ml离心管中加入序列试剂：

79μl    cDNA

10μl    10X Sfi缓冲液

10μl    Sfi I酶

1μl     100X BSA

100μl   总体积

2.充分混匀，50℃温浴2hr。

3.加2μl 1％二甲苯胺染料。

cDNA的分级分离

1.准备好16个收集管，标记1-16。

2.准备好spin-400柱子(ClonTech，Cat.NO.634901的操作要求)。

3.用700μl的缓冲液洗柱子。

4.待洗柱缓冲液流完，将上面的酶切产物约100μl平稳地加到胶层中间，直到产物全部渗到胶面下。

5.加100μl缓冲液使染料层下降数毫米，放置好第一收集管。

6.加600μl的缓冲液并开始收集滴出的液体，每管收集35μl。

7.合并第9-15(1-7)管，-20℃乙醇沉淀过夜。

8.14,000rpm离心20min。弃上清，室温干燥10min。

9.加20μl去离子水溶解沉淀。

二.质量检测

电泳检测(电泳仪：FR-280，上海复日，电泳条件：1.1％琼脂糖凝胶，EB染色；100V、10min)，检测合格。

将cDNA与pBSF载体相连

操作步骤

1.反应管中加入下列试剂：

cDNA                  2.0μl

Vector(500ng/ml)      2.0μl

10X Ligation缓冲液    1.0μl

ATP(10mM)             1.0μl

T4DNA连接酶           1.0μl

去离子水              3.0μl

                       

总体积(μl)           10.0μl

2.16℃PCR仪上过夜(HYBAID PCR EXPRESS)。

*注：克隆载体pBSF为pBluescript II SK的改造载体，具体是将EcoR I和NotI之间的序列改造为Sfi I A和Sfi I B接头序列，酶切后可定向插入cDNA片断(SfiI A→Sfi I B)

重组质粒的转化

一.操作步骤

1.取200ul感受态宿主菌(大肠杆菌DH-5α)至灭菌的50ml离心管中，放置冰水浴融化；。

2.加入上述1ul连接液，轻轻混匀后置于冰上45min。；

3.42℃水浴热休克90sec，迅速放入冰上2min；

4.加入2ml LB培养基(不含抗生素)，37℃摇床，转速≤150rpm，复苏45min；

5.取200ul菌液涂布于9cm培养皿上(Ap^r-IPTG/x-gal  LB固体培养基)，37℃过夜。

IPTG和x-gal为上海生工生物工程技术有限公司的产品

cDNA芯片的制备

一、试验方法

1.操作步骤：目的基因(质粒形式)PCR扩增

1.1从-20℃冰箱中取出油菜基因模板，在室温条件下静置至完全溶解，混匀后再置于96孔板离心机上稍做离心；

1.2用单道微量移液器在PCR反应液专用加样槽中加入适量的通用引物、dNTP、PCR缓冲液、MgCl₂及Taq酶(均为TAKARA公司产品)配制成Mixture，混匀。

依次用相应的12道微量移液器在PCR板中加入ddH₂O、反应Mixture及模板，封上Tape膜，置于96孔板离心机稍离心，放入96孔板PCR仪中，按下列程序进行PCR反应。

①        94℃            30秒；

②        94℃            30秒；

③        56℃            30秒；

④        72℃            2分钟；

⑤        回到②          35个循环；

⑥        72℃            6分钟；

⑦        10℃(或4℃)     保持。

1.3PCR完毕，取出产物板，放于-20℃冰柜中有序保存，备电泳(如需立刻电泳放于4℃保存)。

2.操作步骤：电泳

2.1配制1％(质量/体积比)的琼脂糖凝胶。

2.2用12道微量移液器从PCR产物板每孔中取1μl样品加入到1.25×上样缓冲液r中混匀，按顺序将样液逐排加到凝胶点样孔内。150V电泳0.5hr。

2.3在电泳成像仪上拍摄电泳图谱，并用热敏打印机打印出图谱照片，质检确认PCR产物的产量和质量。

3.操作步骤：PCR产物纯化(异丙醇纯化法)

3.1将质检合格的PCR产物板揭去Tape膜，用12道微量移样器取适量NaAc(pH＝7.0，3mol/L)和异丙醇依次加入PCR产物板中，混匀，于-20℃冰柜或冰箱中沉淀过夜(或-20℃静置3hr以上)。

3.2沉淀完毕，将96孔板置96孔板离心机，4500rpm离心30min，倾去上清液，倒置5分钟。

3.3每孔中加入75％乙醇100μl，轻轻混匀后置96孔板离心机中4500rpm离心20分钟。倾去上清液，室温静置干燥4小时以上。

4.操作步骤：点样

4.1将96孔PCR板中干燥的PCR产物溶于点样稀释液(博星基因芯片公司生产)中(每孔加16μl左右点样稀释液)，充分溶解。

4.2用十二道微量移液器将96孔PCR板中的样品按一定顺序移至384孔板(Genetix公司生产)中。

4.3打开OmniGrid点样仪，装上MicroQuill 2000点样针(Majer Precision公司生产)，按点样方案设计程序(点样方案见附图一)，放上384孔样品板及待点样基片(博星基因芯片公司自产)，运行程序开始点样。

5.操作步骤：点样后处理

5.1点样完成的芯片置点样仪中水合30分钟、室温干燥2小时。

5.2以封闭液(博星基因芯片公司生产)封闭15分钟、水冲洗、室温干燥后备用。

说明：

本芯片共点有8192个基因(每基因1个点)，其中包括8095个待研究基因和控制系统(空白对照81个、阴性对照16个)

所点制成的芯片共8192个点，分为32个亚矩阵，每个亚矩阵中有16*16个点，点间距为0.281mm。

二、材料与设备

1.TAKARA公司引物(T3：5’AATTAACCCTCACTAAAGGG 3’，T7：5’GTAATACGACTCACTATAGGGC 3’)

2.TAKARA公司dNTP

3.TAKARA公司PCR缓冲液

4.TAKARA公司MgCl2

5.TAKARA公司Taq酶

6.博星基因芯片公司基片

7.博星基因芯片公司点样稀释液

8.博星基因芯片公司封闭液

9.Genetix公司384孔板

10.MJ Research公司MJ Research PTC-225PCR仪

11.Sigma公司Sigma 4-15C离心机

12.GeneMachines公司OmniGrid点样仪

13.Gilson公司Gilson单道微量移液器

14.Eppendorf公司Eppendorf十二道微量移液器

通过cDNA芯片研究基因表达谱流程

一、试剂

1.UNIzol                   2.异丙醇

3.氯仿                     4.75％乙醇(RNase-free)

5.Milli-Q水(RNase-free)    6.无水乙醇

7.dNTPs                    8.Cy5-dCTP和Cy3-dCTP

9.杂交试剂1                10.标记试剂I

11.杂交试剂2               12.标记试剂II

13.反转录酶                14.标记试剂III

15.反转录引物              16.洗片试剂1

17.反转录酶缓冲液          18.洗片试剂2

19.DTT                     20.洗片试剂3

二、仪器与设备

1.电动玻璃匀浆机     2.电子天平

3.低温高速离心机     4.低温高速台式离心机

5.超净工作台         6.制冰机

7.电热恒温水槽       8.电泳槽

9.电泳仪             10.微波炉

11.凝胶成像仪        12.台式离心机

13.核酸定量分析仪    14.移液枪

15.可调电炉          16.旋涡混合器

17.杂交箱            18.杂交舱

19.S-200纯化柱       20.真空浓缩仪

21.盖玻片            22.芯片扫描仪

三、探针标记与杂交

1、预杂交

1)配制预杂交液：杂交试剂1加入到的Eppenderf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2混匀。

2)将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2分钟，将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30sec，玻片取出后即放入无水乙醇中30sec，晾干。

3)将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5-6小时。

2、标记探针(以下在冰浴中进行)

1)于一已灭菌的1.5mL Eppendorf管内依次加入以下试剂(反应终体积为50L，以下试剂均为RNase-free)：

ddH2O         23μL

逆转录引物    5μL(Oligo dt)

总RNA         30-50μg

振荡混匀，置于70℃水浴10分钟。取出后，迅速置于冰上。

2)分别加入以下试剂：

逆转录酶缓冲液      10μL

DTT                 5μL

dNTPs               4μL

3)而后在暗室中加入以下试剂：

逆转录酶            2μL

Cy5-dCTP或Cy3-dCTP  3μL

4)用手指弹打管壁以混匀样品，水浴2分钟。将Eppendorf管置于42℃水浴2小时。

5)依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4μl，65℃水浴10分钟后加入标记试剂II 4μl。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50μL左右。

6)乙醇沉淀纯化DNA。

7)将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头。

8)将柱置于一个1.5ml的Eppendorf管中，以3000rpm离心1分钟将柱置于另一个新的1.5ml Eppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间，注意不要搅动柱体。以3000rpm离心2分钟，经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。

9)加入标记试剂III 8μl，真空抽干。

3、杂交

1)在抽干的探针管中加6.5μL杂交试剂I，充分混匀，使探针溶解。再加入6.5μL杂交试剂II，混匀备用。

2)将预杂交的玻片取出，用ddH2O冲去盖玻片。

3)将探针置于95℃水浴中变性2分钟；玻片置于95℃水浴中变性30sec，玻片取出浸无水乙醇30sec，探针取出后迅速置于冰上。

4)将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42℃杂交箱内杂交过夜(16-18h)。

4、洗片

1)用0.5％的洗涤液1冲洗玻片，去除盖玻片。

2)准备两个染色缸，分别装有0.5％的洗片试剂1+2％的洗片试剂2、5％的洗片试剂3，放入60℃水浴锅中。

3)将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10分钟。

4)用0.5％的洗涤液1冲洗玻片，晾干后扫描。

二.实验结果

1.计算菌落数及蓝白斑比例

菌落数：1700/板；其中蓝斑：40；重组率约97.6％

2.库容量：

库容量＝菌落数×连接产物量＝1600×10×10×7≈1.0×10⁶

试验结果：

发明人通过对克隆的测序分离到了这个脂肪酸延长酶基因，并对其进行了生物芯片及转基因植株的分析。结果如下：

fatty acid elongase，β-Ketoacyl-CoA synthase，Clone NO.b038h061

脂肪酸延长酶(β-酮脂酰-CoA-合酶，fatty acid elongase，β-Ketoacyl-CoAsynthase)

基因序列如图1所示；该基因的蛋白序列如图2所示。

实施例2

基因在种子发育过程中的表达

通过实施例1所述的芯片实验的过程，得到如图4所示的结果。

结果表明，该脂肪酸延长酶在油菜种子发育早期表达并逐渐降低到花后17天几乎不表达，而后到种子发育后期又逐渐升高。

实施例3

基因过量表达植株中脂肪酸含量I

材料和方法

异源转化拟南芥(col-0)，购自植生所。植物表达载体为改造后的pCAMBIA2301载体，具体为在多克隆位点前加入CaMV 35S启动子，pCAMBIA2301载体购自CAMBIA公司。

1、发明人将实施例1中的脂肪酸延长酶基因的全长cDNA序列构建于改造过的植物表达载体p2301(在多克隆位点前加入35S强启动子)中，转入拟南芥(col-0)中得到该基因的过量表达植株。在CaMV 35 S启动子的驱动下，该基因强表达于转基因植株中。

2、转基因植株中该基因的表达检测：

按上述的转基因植物材料中目的基因的表达水平检测方法进行检测，结果：见图5。

由转基因植物中基因表达水平可以看出在160，166，168三个株系中目的基因表达是比较高的。

3.转基因植株种子中脂肪酸含量和组分的测定

用上述植物材料中脂肪酸含量测定方法进行。发明人检测了这三个株系种子中的脂肪酸组份与变化，见表1。

表1

表1的结果表明，在三个独立的转基因株系中，和野生型相比脂肪酸组份有较为一致的变化，即碳链长度在20及以上的脂肪酸组份在三个株系中都有一致的升高，尤其是FA24:1和FA24:0的百分含量是野生型的二倍以上。证明了该基因在长链脂肪酸的合成中起到了一定的作用。

实施例4

基因过量表达植株中脂肪酸含量II

材料和方法

油菜种子，

植物表达载体为改造后的pCAMBIA2301载体发明人按实施例3的方法将该p2301载体同时进行了油菜的转化(35S强启动子)，并得到了一个转基因株系，该株系得脂肪酸成份变化如表2。

表2

表2的结果表明，和野生型相比脂肪酸组份在转基因株系中也有变化，即是FA24:1和FA24:0的百分含量是野生型的将近两倍。证明了该基因在长链脂肪酸的合成中起到了一定的作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>油菜超长链脂肪酸合成酶及其应用

<130>081647

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1673

<212>DNA

<213>Brassica napus

<400>1

gggccacaac acagcttact aagagcaaac acaacaaact ttttctactc ttctttccac    60

tgtttaggga aaaactccaa tgaagaattt aaagatgttt ttcttcaaga tcttgttcat    120

ctcattaatg gtagcattat ccatgaaagg atctgggatc aacttagaag atctacaaaa    180

cttttttcac cataacctag aaaccataac ccttctttca tttcctctgc ttttcctgtt    240

gaccatctac atgttaagcc gacccaaacc cgtttacctc gtcgacttct cctgctacct    300

cccaccgtcc catctcaagg tcagtgtcaa aacactgatg gaacatgcga gacgtgcaag    360

agaagcaggc gtgtgttgga agaacaaaga gaacgactat ttgattgagt ttcagcagaa    420

gactcttgaa cgttccggtc tcggtcaaga aacatgtatc cccgagggtc tccaatgctt    480

cccgcttcag caggatatgg cggcttcacg taaagagacg gcggaagtca tattcggagc    540

gcttgacaat ctcttccgca acaccggtgt aaagcctggc gagatcggta tcttggtggt    600

gaattctagc acatttaatc caactccatc acttgcttcc atgattgtta acaaatacaa    660

actcagagac aacatcaaga gtctaaatct tggaggaatg ggttgcagtg ctggagtcat    720

agccattgat gttgcaaagg gattattaca agttcatagg aacacttacg ccatcgtagt    780

aagcacagag aacatcactc agaacttgta tctggggaaa aacaaatcaa tgctagtcac    840

caactgtttg ttccgggtcg gtggagccgc tattctgctc tctaacagat ctagagaccg    900

gtcacgcgcg aagtacgagc ttcttcatac cgtaaggatc cataccggat ctgatgatag    960

gtcctttgag tgtgcaacac aggaagaaga tgaagatggt ataatcggag ttaccttgac    1020

aaagaatcta ccaatggtgg ctgcaaggac tcttaagatc aatatcgcca ctttgggtcc    1080

tctggttctt ccaatgaaag agaagctagc tttctttgtg acattcctca agaagaagta    1140

ttttaggccg gagttgaaaa actatacacc ggacttcaaa ctcgcctttg agcatttctg    1200

tatccacgct ggtggaagag ctctaataga tgagcttgag aagaatctta agctgtctcc    1260

attacacgtt gaggcgtcta gaatgacact tcacaggttt ggtaatactt cttcgagctc    1320

gatttggtat gagttggctt atacagaagc taaaggaagg atgaaggaag gcgacaggat    1380

ttggcaaatt gctttgggat caggttttaa gtgtaacagc tctgtttggg tggctctacg    1440

aaacgttaag ccttcggttc acaatccgtg ggaagattgt atggacagat atccggttga    1500

gattgatatt taattttgtg gtttaggcca tgttggctat ttatcgaact atctatcttt    1560

gtttggtttg tggaccattt cttacgtttg ttcttcagag agtttcgcat cgtatgttta    1620

ttcatgtctc atggttgttt ttgtatggta cttgttccaa gtaagaattg atg           1673

<210>2

<211>477

<212>PRT

<213>Brassica napus

<400>2

Met Lys Asn Leu Lys Met Phe Phe Phe Lys Ile Leu Phe Ile Ser Leu

1               5                   10                  15

Met Val Ala Leu Ser Met Lys Gly Ser Gly Ile Asn Leu Glu Asp Leu

            20                  25                  30

Gln Asn Phe Phe His His Asn Leu Glu Thr Ile Thr Leu Leu Ser Phe

        35                  40                  45

Pro Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Tyr Met Leu Ser Arg Pro Lys Pro

    50                  55                  60

Val Tyr Leu Val Asp Phe Ser Cys Tyr Leu Pro Pro Ser His Leu Lys

65                  70                  75                  80

Val Ser Val Lys Thr Leu Met Glu His Ala Arg Arg Ala Arg Glu Ala

                85                  90                  95

Gly Val Cys Trp Lys Asn Lys Glu Asn Asp Tyr Leu Ile Glu Phe Gln

            100                 105                 110

Gln Lys Thr Leu Glu Arg Ser Gly Leu Gly Gln Glu Thr Cys Ile Pro

        115                 120                 125

Glu Gly Leu Gln Cys Phe Pro Leu Gln Gln Asp Met Ala Ala Ser Arg

    130                 135                 140

Lys Glu Thr Ala Glu Val Ile Phe Gly Ala Leu Asp Asn Leu Phe Arg

145                 150                 155                 160

Asn Thr Gly Val Lys Pro Gly Glu Ile Gly Ile Leu Val Val Asn Ser

                165                 170                 175

Ser Thr Phe Asn Pro Thr Pro Ser Leu Ala Ser Met Ile Val Asn Lys

            180                 185                 190

Tyr Lys Leu Arg Asp Asn Ile Lys Ser Leu Asn Leu Gly Gly Met Gly

        195                 200                 205

Cys Ser Ala Gly Val Ile Ala Ile Asp Val Ala Lys Gly Leu Leu Gln

    210                 215                 220

Val His Arg Asn Thr Tyr Ala Ile Val Val Ser Thr Glu Asn Ile Thr

225                 230                 235                 240

Gln Asn Leu Tyr Leu Gly Lys Asn Lys Ser Met Leu Val Thr Asn Cys

                245                 250                 255

Leu Phe Arg Val Gly Gly Ala Ala Ile Leu Leu Ser Asn Arg Ser Arg

            260                 265                 270

Asp Arg Ser Arg Ala Lys Tyr Glu Leu Leu His Thr Val Arg Ile His

        275                 280                 285

Thr Gly Ser Asp Asp Arg Ser Phe Glu Cys Ala Thr Gln Glu Glu Asp

    290                 295                 300

Glu Asp Gly Ile Ile Gly Val Thr Leu Thr Lys Asn Leu Pro Met Val

305                 310                 315                 320

Ala Ala Arg Thr Leu Lys Ile Asn Ile Ala Thr Leu Gly Pro Leu Val

                325                 330                 335

Leu Pro Met Lys Glu Lys Leu Ala Phe Phe Val Thr Phe Leu Lys Lys

            340                 345                 350

Lys Tyr Phe Arg Pro Glu Leu Lys Asn Tyr Thr Pro Asp Phe Lys Leu

        355                 360                 365

Ala Phe Glu His Phe Cys Ile His Ala Gly Gly Arg Ala Leu Ile Asp

    370                 375                 380

Glu Leu Glu Lys Asn Leu Lys Leu Ser Pro Leu His Val Glu Ala Ser

385                 390                 395                 400

Arg Met Thr Leu His Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ser Ser Ser Ile Trp

                405                 410                 415

Tyr Glu Leu Ala Tyr Thr Glu Ala Lys Gly Arg Met Lys Glu Gly Asp

            420                 425                 430

Arg Ile Trp Gln Ile Ala Leu Gly Ser Gly Phe Lys Cys Asn Ser Ser

        435                 440                 445

Val Trp Val Ala Leu Arg Asn Val Lys Pro Ser Val His Asn Pro Trp

    450                 455                 460

Glu Asp Cys Met Asp Arg Tyr Pro Val Glu Ile Asp Ile

465                 470                 475

Claims (10)

1.一种分离的多肽，其特征在于，它包含以下氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽，或

(ii)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化延长脂肪酸链长的功能的由(i)衍生的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码如权利要求1所述的多肽。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列如SEQ IDNO：1所示。

4.一种载体，其特征在于，它含有如权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有如权利要求4所述的载体或基因组中整合有如权利要求2所述的多核苷酸。

6.一种如权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养如权利要求5所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出如权利要求1所述的多肽。

7.一种提高植物油脂中超长链脂肪酸含量的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)提供携带表达载体的宿主菌，所述的表达载体含有如权利要求2所述的多核苷酸；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的宿主菌接触，从而使如权利要求2所述的多核苷酸转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入如权利要求2所述的多核苷酸的植物细胞或组织或器官再生成植株；

优选的宿主菌选自大肠杆菌、农杆菌；

优选所述的超长链脂肪酸碳链长度20-40个；更佳地碳链长度20-30个。

8.一种如权利要求1所述的多肽用途，其特征在于，所述的多肽被用于调节植物油脂中超长链脂肪酸的含量；优选所述的多肽的序列如SEQ ID NO：2所示。

9.一种如权利要求2所述的多核苷酸的用途，其特征在于，所述的多核苷酸被用于调节植物油脂中超长链脂肪酸的含量；优选所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

10.如权利要求8或9任一所述的用途，其特征在于，所述的植物选自油菜、甘蓝、白菜、大豆、花生、芝麻、向日葵、棉花、麻疯树、或油棕榈。

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