CN109266627A

CN109266627A - 与植物脂肪酸代谢相关的基因PfDGAT2、表达载体、构建方法及应用

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Publication number: CN109266627A
Application number: CN201811195464.7A
Authority: CN
Inventors: 王计平; 周雅莉; 任文燕; 李润植; 安茜; 段露露; 郝月茹
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2018-10-15
Filing date: 2018-10-15
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-10-15
Also published as: CN109266627B

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与植物脂肪酸代谢相关的基因PfDGAT2、表达载体、构建方法及应用。所述基因PfDGAT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，该基因PfDGAT2与紫苏等油料作物种子中脂肪酸代谢途径相关，在种子油脂合成积累过程中能够特异性选择α‑亚麻酸分子，并将其转移整合到TAG分子上。

Description

与植物脂肪酸代谢相关的基因PfDGAT2、表达载体、构建方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与植物脂肪酸代谢相关的基因PfDGAT2、表达载体、构建方法及应用。

背景技术

紫苏(Perilla frutescens(L.)Britt.)系唇形科紫苏属一年生草本植物，适应性较强，是我国卫生部首批颁布的既是食品又是药品的60种中药植物之一。紫苏种子出油率高达45％～55％，并且含有丰富的不饱和脂肪酸，其中α-亚麻酸含量达60％以上。α-亚麻酸(a-Linolenic Acid，简称ALA)，又称为n-3(omega-3)多不饱和脂肪酸，是一种对人类健康极为重要的ω-3脂肪酸，在人体内参与磷脂的合成和代谢，研究发现α-亚麻酸对人脑神经功能及视网膜功能具有高度的保护作用，可以预防心血管疾病及冠心病等。人类健康计划建议每天食用2～3克α-亚麻酸可以有效预防心血管等疾病。综上所述，紫苏种子油既可以为人类提供基本的脂肪酸营养，还具有特殊的保健功效和医药价值，有效预防心脑血管疾病，提高记忆力和思维能力，延缓大脑衰老，是一种理想的保健食用油。

植物种子油主要成分是三酰甘油(TAG)。植物发育种子中，在脂肪酸合成等酶分子作用下，生成不同的脂肪酸。这些脂肪酸再经过酰基转移酶的催化，其脂肪酸长链(酰基)分别结合于3-磷酸甘油分子的sn-1、sn-2和sn-3位置，形成TAG。要提高某种脂肪酸在种子油中含量，不仅要合成足量的该脂肪酸，而且该脂肪酸还要能及时有效地转移整入TAG分子中。有关植物种子脂肪酸合成积累机制及代谢工程的研究已经成为当今植物油脂化学与分子生物学，生物技术和油料作物遗传育种研究的重点研究领域。目前，对普通油料作物和一些含有珍稀脂肪酸的野生植物的脂肪酸合成途径已进行了大量研究，相继鉴定和克隆了参与脂肪酸生物合成积累及其调控的一些重要基因，并应用基因工程对普通油料作物种子油中脂肪酸成分的遗传修饰进行了许多有益尝试，取得了一些可喜的成果。尽管如此，植物脂肪酸合成积累及调控机制还有许多未解之谜，也未见有关紫苏α-亚麻酸生物合成积累及调控机制的详尽研究报道。

不少研究表明，参与TAG形成最后一步酰基化反应的酶分子是目标脂肪酸及总脂类合成积累的限速酶，有三个酰基转移酶参与最后一步酰基化反应，即二酰甘油酰基转移酶(DGAT1/2)催化脂酰CoA分子中的脂酰基(如Ala)转移到二酰甘油(DAG)分子的sn-3位置，生成TAG。DGATs对某种脂肪酸底物选择性高低决定着该脂肪酸在种子油中的积累量。另一种参与TAG形成最后一步反应的酶是磷脂：二酰甘油酰基转移酶(PDAT)，PDAT可直接将结合于PC分子的脂酰基(如Ala)转移到DAG分子中，进而生成TAG。近年来有研究报道，过表达AtDGAT1基因的野生型拟南芥油脂含量明显增加，过表达DGAT1基因的玉米可明显提高种子和胚含油量，而在蓖麻和油桐种子发育过程中，DGAT2的表达水平高于DGAT1，这表明DGAT2在这些植物TAG的合成积累中发挥重要作用。

现有技术存在的问题是，在紫苏等植物种子高水平积累α-亚麻酸机制中参与TAG生物合成的基因及其功能目前尚不清楚。

发明内容

本发明提供的一种与植物脂肪酸代谢相关的基因PfDGAT2、表达载体、构建方法及应用，该基因PfDGAT2与紫苏等油料作物中植物脂肪酸的代谢途径相关，能够特异性选择α-亚麻酸分子，并将其转移整合到TAG分子上。

本发明的第一个目的是提供一种与植物脂肪酸代谢相关的基因PfDGAT2，所述基因PfDGAT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，该基因与植物脂肪酸代谢相关。

本发明的第二个目的是提供一种含有基因PfDGAT2的酵母表达载体。

本发明的第三个目的是提供一种含有基因PfDGAT2的酵母表达载体的构建方法，包括以下步骤：

S1，目的基因扩增与纯化：以连接了目的基因PfDGAT2的pMD18-T载体为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物对，进行PCR扩增，然后凝胶回收并纯化目的基因，得到目的基因PfDGAT2片段，备用；

S2，分别将目的基因PfDGAT2和表达载体pYES2.0双酶切，然后将双酶切产物连接，得到含有基因PfDGAT2的酵母表达载体。

优选的，上述的含有基因PfDGAT2的酵母表达载体的构建方法，S1中，目的基因PfDGAT2的双酶切反应体系50μL如下：目的基因PfDGAT2片段20μL、10U/μL的Kpn I 1μL、10U/μL的BamH I 1μL、FD Buffer 5μL、ddH₂O补足至50μL；

表达载体pYES2.0双酶切反应体系50μL如下：表达载体pYES2.0质粒1.5μg、10U/μL的Kpn I 1μL、10U/μL的BamH I 1μL、FD Buffer 10μL、ddH₂O补足至50μL。

本发明的第四个目的是提供一种含有所述pYES2.0-PfDGAT2表达载体的酵母表达系统。

本发明的第五个目的是提供一种所述的基因PfDGAT2在紫苏种子油脂合成积累及特异性选择α-亚麻酸分子中的应用。

与现有技术相比，本发明的与植物脂肪酸代谢相关的基因PfDGAT2全长CDS克隆、酵母表达载体及其构建方法，具有以下有益效果：

本发明证明了DGAT2基因编码蛋白属于酰基转移酶基因超家族，该基因PfDGAT2与紫苏等油料作物脂肪酸的代谢途径相关，能够特异性选择α-亚麻酸分子，并将其转移整合到TAG分子上，在TAG合成中发挥一定功能，且在植物种子油脂合成过程中发挥重要作用。pYES2.0载体具有的氨苄抗性基因使其能够方便在大肠杆菌中进行载体筛选，具有GAL1启动子，能够使用原养型尿嘧啶进行转化菌株的筛选；该转化系统与传统转化系统相比具有转化时间短、转化效率高等特点。

附图说明

图1是PfDGAT2基因PCR扩增产物电泳图；

图1中M：DL2000marker，1-5：PfDGAT2基因扩增产物；

图2是紫苏DGAT2与不同物种DGAT2蛋白的系统进化树分析；

图2中不同物种的名称如下：Oe油橄榄；Si芝麻；Nt烟草；Ga金针草；Ha向日葵；Aa黄花蒿；Co油茶；Cq藜麦；Xs文冠果；Jc麻风树；Mt蒺藜苜蓿；Ca鹰嘴豆；Ah花生；Gm大豆；Mr拉曼被孢霉；

图3是紫苏PfDGAT2基因的时空表达特性分析；

图4是pYES2.0-PfDGAT2重组子双酶切产物电泳图；

图4中M：DL12000marker，1：pYES2.0质粒，2：pYES2.0-PfDGAT2重组子双酶切产物；

图5是转基因酵母菌液PCR检测电泳图；

图5中M：DL2000marker；1-3：INVSc1转对照质粒pYES2.0酵母，扩增长度为155bp；4-6：H1246α转对照质粒pYES2.0酵母，扩增长度为155bp；7-9：H1246α转pYES2.0-PfDGAT2酵母，扩增长度为990bp；

图6是转基因酵母菌株油脂薄层层析(TLC)；

图6中1：INVSc1转对照质粒pYES2.0酵母；2：H1246α转对照质粒pYES2.0酵母；3：H1246α转pYES2.0-PfDGAT2酵母；

图7是转基因酵母油体的尼罗红染色鉴定；

图7A：INVSc1转对照质粒pYES2.0酵母荧光视野，图7B：H1246α转对照质粒pYES2.0酵母荧光视野，图7C：H1246α转pYES2.0-PfDGAT2酵母荧光视野，图7D：INVSc1转对照质粒pYES2.0酵母白光视野，图7E：H1246α转对照质粒pYES2.0酵母白光视野，图7F：H1246α转pYES2.0-PfDGAT2酵母荧光视野。

图8是紫苏PfDGAT2酶活性和底物特异性测试结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

实施例1

实施例1中大肠杆菌菌株DH5α由山西农业大学作物遗传育种重点实验室提供，pMD18-T克隆载体购自北京全式金生物技术有限公司，所用试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。所有引物均由通用生物系统(安徽)有限公司合成。紫苏材料：优选品种晋苏1号，由山西省农科院棉花研究所提供。

本发明提供的一种与植物脂肪酸代谢相关的基因PfDGAT2，所述基因PfDGAT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，由1249个碱基组成。

基因PfDGAT2按照以下步骤制备：

S1，提取紫苏叶片总RNA，合成cDNA第一链

用液氮将新鲜紫苏叶片速冻，用研钵研磨成粉末，研磨时要迅速，最好不要超过1min，加入1mL TRNzol试剂，TRNzol试剂用于保持RNA的完整性；将匀浆在15～30℃金属浴中放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；4℃，12,000rpm，离心10min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；4℃，12,000rpm，离心15min，取上清转移至新离心管中；加入等体积异丙醇，混匀，-20℃放置30min，回收沉淀RNA；4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清；加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀，75％乙醇用灭菌的质量分数1‰DEPC水配制；4℃，5,000rpm离心3min；弃乙醇，用移液枪尽量吸干液体，晾干但不要过分干燥，否则RNA难以溶解，加30μLRNase-Free Water，混匀、充分溶解RNA，得到紫苏叶片总RNA，用于后续实验或-80℃超低温冰箱保存备用。以该紫苏叶片总RNA为模板，使用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)反转录合成所需的cDNA第一链。

选择18S rRNA作为内参并设计引物检验反转录所获得的cDNA第一链的质量，由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成引物对，扩增所获得的cDNA第一链。SEQID NO.1序列为CGGCTACCACATCCAAGGAA，SEQ ID NO.2序列为GCTGGAATTACCGCGGCT。PCR程序完成后，琼脂糖凝胶电泳检测反转录的cDNA第一链质量。

S2，设计特异引物，PCR反应合成基因PfDGAT2

S21，设计特异引物：从紫苏不同发育时期种子表达谱中筛选上调表达基因，获得编码DGAT2蛋白的基因(Unigene26242_Perilla)，通过紫苏转录组测序数据库查询并在线序列比对获得该基因全长编码序列。用NCBI提供的在线ORF Finder，寻找基因的开放阅读框(ORF)，并设计ORF引物：由序列表中SEQ ID NO.3：ATGGAGTCCGAGCCCAAC和SEQ ID NO.4：TTAGAGAATCCTGAGCTCTAAGTCG的核苷酸序列组成的引物对，引物对命名为DGAT2-1，序列表中的SEQ ID NO.3由18个碱基组成，序列表中的SEQ ID NO.4由25个碱基组成。

S22，合成基因PfDGAT2：以反转录后获得的紫苏叶片的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，PCR反应体系20μL：dd H₂O 12.9μL，10×Pfu Buffer 2μL，2.5mM的dNTP Mixture 1.6μL，10μM的SEQ ID NO.3引物、SEQ ID NO.4引物各0.5μL，cDNA第一链2μL，Pfu DNAPolymerase 0.5μL。扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。

S3，基因PfDGAT2连接至质粒保存，质粒转化、菌液PCR反应、序列分析

S31，基因PfDGAT2连接至质粒保存：对S22的PCR产物进行割胶回收，纯化，按照全式金生物技术有限公司的连接试剂盒说明书操作方法，将PCR回收纯化产物与pMD18-T载体连接，22℃反应20min，得到的连接产物为pMD18-T-PfDGAT2，保存备用。

S32，质粒转化：取10μL S31的连接产物加到100μL DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，感受态细胞应刚从-80℃冰箱取出放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一；将离心管置于42℃恒温90s，取出管后立即置于冰浴中放置2～3min，其间不要摇动离心管；向离心管中加入500μL 37℃预热的不含抗生素的LB培养基，150rpm、37℃振荡培养45min，使菌体复苏；4000rpm，离心5min收集菌体，弃掉上清，将剩余LB溶液重悬菌体；将离心管中的菌液混匀，吸取100μL用涂布器均匀涂到含Amp的LB固体培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平板，放入恒温培养箱中，37℃培养12～16h；待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板，放于4℃数小时，使显色完全，挑取白色单菌落于3mL含有100mg/mL Amp的LB液体培养基中，用封口膜封口，37℃，200rpm，过夜培养10～12h，获得菌液备用。

S33，菌液PCR反应：取2μL S32获得的菌液作为模板进行PCR扩增，反应体系20μL中含有dd H₂O 12.9μL、10×Pfu Buffer 2μL、2.5mM dNTP Mixture 1.6μL、Pfu DNAPolymerase 0.5μL、10μM SEQ ID NO.3引物0.5μL和10μM SEQ ID NO.4引物0.5μL。菌液PCR检测的反应程序为：94℃3min预变性后，94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环。72℃总延伸5min后，于4℃保存用于后续电泳检测。

S34，序列分析：将S33电泳检测阳性克隆菌液取1mL，加入50％甘油送往北京金诺锐杰基因科技有限公司测序，剩余菌液加入甘油-80℃保存；

SEQ ID NO.11的紫苏PfDGAT2基因长为1249bp，包含990bp的开放阅读框(OpenReading Frame,ORF)，共编码329个氨基酸，含有长度为166bp的5’非编码区(5’UTR)和92bp的3’非编码区(3’UTR)。图1是PfDGAT2基因PCR扩增产物电泳图；图1中M：DL2000marker，1-5：PfDGAT2基因扩增产物。该基因编码的蛋白质分子量为37017.69Da，理论等电点pI为9.46，通过NCBI-CDD功能结构域预测结果表明，该蛋白质肽段中有1个活性位点，位于22-329氨基酸残基之间(PLN02783Specific hits,diacylglycerol O-acyltransferase)；基因PfDGAT2所编码的蛋白质属于LPLAT super family超家族中的成员。

为了检测PfDGAT2蛋白和其他物种(芝麻、油橄榄、烟草、向日葵、花生、麻风树、鹰嘴豆、蒺藜苜蓿等)的序列同源性，基于ClustalW多序列比对，利用MEGA7软件构建进化树，参见图2。比对结果表明：紫苏DGAT2蛋白序列与芝麻DGAT2蛋白序列同源性最高，达78％，与油橄榄同源性达76％、与金针草同源性达74％、与蒺藜苜蓿的同源性达73％。所有这些生物信息学分析表明，紫苏DGAT2基因编码DGAT2蛋白，且在不同物种之间具有较高的同源性。

S4，基因PfDGAT2在紫苏不同组织及种子发育不同时期的时空表达分析

取紫苏根、茎、叶、花，并于盛花期标记始开花朵，开花后10d、20d、30d、40d后分别取发育中的蒴果，提取RNA，并反转录成cDNA，以18S rRNA作为内参基因，进行实时荧光定量PCR分析。扩增所用引物为SEQ ID NO.5序列为ACCGCTTGTTCATTCCATTC，SEQ ID NO.6序列为TAACCAACCGCATGCTTACA。分析结果如图3：PfDGAT2基因在紫苏不同组织中均有表达，但种子中表达量最高，说明种子作为紫苏TAG合成的主要场所，PfDGAT2在种子总油脂合成积累过程中行使重要功能。

实施例2

实施例2中所使用大肠杆菌感受态菌株为DH5α，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)野生型菌株为INVSc1，突变体菌株为H1246α，酵母表达载体pYES2.0，均由山西农业大学作物遗传育种重点实验室提供。所用试剂为Pfu DNA Polymerase(天根生化科技公司)，琼脂凝胶DNA回收试剂盒(Aidlab公司)，质粒提取试剂盒(来自OMEGA公司)，酶切试剂与酶连接试剂(Takara公司)，酵母转化试剂盒(Coolaber公司)，T4DNA连接酶(NEBiolabs)；氨苄青霉素(Amp)(索莱宝生物公司)，LB培养基(青岛日水生物)，YPD培养基(青岛宾得生物技术有限公司)，SC-Ura培养基(Coolaber公司)，半乳糖(D-(+)-Galactose)(Coolaber公司)，细菌学琼脂粉(青岛尼赛欣合生物技术有限公司)。所有引物均由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

基于同一种发明构思，本发明还提供了一种含有基因PfDGAT2的酵母表达载体，所述酵母表达载体按照以下步骤构建：

步骤1，目的基因扩增与纯化：以连接了目的基因PfDGAT2的pMD18-T载体为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物对，进行PCR扩增，然后凝胶回收并纯化目的基因，得到目的基因PfDGAT2片段，备用；具体如下：

步骤11，引物设计：以实施例1中S31制备的连接了目的基因PfDGAT2的pMD18-T载体(即连接产物pMD18-T-PfDGAT2)为模板，设计加入KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物，设计合成由SEQ ID NO.7(GGTACCATGGAGTCCGAGCCCAAC)和SEQ ID NO.8(GGATCCTTAGAGAATCCTGAGCTCTAAGTCG)的核苷酸序列组成的引物对，使用该引物对来扩增并且富集目的基因PfDGAT2片段。

将SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的核苷酸序列组成的引物对命名为DGAT2-2，SEQID NO.7由24个碱基组成，SEQ ID NO.8由31个碱基组成。

步骤12，PCR扩增：PCR扩增反应体系50μL：10×Pfu Buffer 5μL、2.5mM dNTPMixture 1μL、Pfu DNA Polymerase 0.4μL、10μM SEQ ID NO.5引物1μL、10μM SEQ ID NO.6引物1μL、含目的基因PfDGAT2的pMD18-T载体7μL、dd H₂O补足50μL。PCR反应程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，22个循环。72℃延伸5min后，于4℃保存或用于电泳检测。

步骤13，PCR产物回收、纯化：使用DNA纯化回收试剂盒，将步骤12的PCR产物割胶回收目的条带，得到纯化产物。操作步骤如下：在紫外凝胶成像仪下尽可能准确的切下所需要的目的条带，置于离心管中，加入3倍体积的DB溶液溶解，置于56℃金属浴中10min，隔2min摇晃一次使其充分溶解；将凝胶溶液冷却至室温后转到吸附柱中静置1min，离心机转速设置为12,000rpm离心1min，然后倒掉收集管中的废液；向吸附柱中加入700μL漂洗液，确保提前加入无水乙醇，使用12,000rpm离心1min，重复此步骤；将吸附柱放回空收集管中，仍以12,000rpm的转速离心2min，确保尽可能除干净吸附柱内残留的漂洗液；将吸附柱放入新的离心管中，加入50μL洗脱缓冲液，洗脱缓冲液提前70℃预热后在使用，室温放置2min后以12,000rpm离心1min，纯化后得到目的基因PfDGAT2片段，-20℃冷冻保存。

步骤2，分别将目的基因PfDGAT2和表达载体pYES2.0双酶切，然后将双酶切产物连接，得到含有基因PfDGAT2的酵母表达载体；具体如下：

步骤21，提取表达载体pYES2.0质粒

使用OMEGA质粒提取试剂盒提取表达载体pYES2.0，方法如下：将菌液置于1.5mL离心管中，以10,000rpm离心1min，弃掉废液，加入250μL的SolutionⅠ/RNaes A混合液，混匀后使细胞悬浮；加入SolutionⅡ溶液，颠倒数次混匀，裂解时间不超过5min；加入350μLSolutionⅢ溶液，混匀至产生白色沉淀，10,000rpm离心10min；吸取上清至HiBind DNA结合柱中，离心1min后弃去废液；加入700μL DNA Wash Buffer至吸附柱内，10,000rpm离心1min，倒掉滤液，重复操作；使用离心机将带有收集管的吸附柱以10,000rpm的转速离心2min，尽量除去柱中残留的Wash Buffer；将吸附柱放入新的离心管中，加入30μL ElutionBuffer，室温放置3min后10,000rpm离心1min，将质粒收集到离心管中，﹣20℃保存备用。

步骤22，目的基因PfDGAT2和表达载体pYES2.0双酶切及连接

步骤221，目的基因PfDGAT2和表达载体pYES2.0双酶切：对目的基因PfDGAT2(990bp)进行双酶切，得到目的基因PfDGAT2酶切产物；对表达载体pYES2.0进行双酶切，得到pYES2.0酶切产物；

目的基因PfDGAT2的双酶切反应体系50μL如下：目的基因PfDGAT2片段20μL、10U/μL的Kpn I 1μL、10U/μL的BamH I 1μL、FD Buffer 5μL、ddH₂O补足至50μL；37℃恒温水浴锅中反应3h后，通过电泳回收含有目的基因PfDGAT2的条带，得到目的基因PfDGAT2酶切产物；

表达载体pYES2.0双酶切反应体系50μL如下：表达载体pYES2.0质粒1.5μg、10U/μL的Kpn I 1μL、10U/μL的BamH I 1μL、FD Buffer 10μL、ddH₂O补足至50μL；37℃恒温水浴锅中反应3h后，通过电泳回收并纯化长序列的目的条带，得到片段长度为5.9kb的pYES2.0酶切产物。

步骤222，目的基因PfDGAT2酶切产物和pYES2.0酶切产物的连接，得到pYES2.0-PfDGAT2重组子(即含有基因PfDGAT2的酵母表达载体)，具体如下：

目的基因PfDGAT2酶切产物(990bp)和pYES2.0酶切产物连接反应体系20μL如下：目的基因PfDGAT2酶切产物6μL(30ng)、pYES2.0酶切产物5μL(50ng)、10×T4DNAligaseBuffer 2μL、T4DNAligase 1μL(5U/μL)、dd H₂O补足至20μL；连接条件：16℃金属浴2h即可；连接反应后得到pYES2.0-PfDGAT2重组子。

将pYES2.0-PfDGAT2重组子转化至大肠杆菌感受态DH5α，得到大肠杆菌菌液，方法如下：将10μL重组产物加至100μL DH5α感受态细胞菌液中，用枪头搅拌均匀后冰浴30min；42℃金属浴中孵育90s，立刻置于冰上3min；加入500μL LB液体培养基，LB液体培养基37℃预热后使用，150rpm、37℃振荡培养45min；4000rpm室温离心5min，倒掉上清，加少量LB溶液重悬菌体；吸取100μL菌液至LB固体培养基，涂板；37℃倒置暗培养12-16h；挑取单一菌落置于含50mg/L Kan LB液体培养基中，培养12h，得到大肠杆菌菌液，备用。

步骤223，pYES2.0-PfDGAT2重组子的PCR鉴定：取2μL步骤222的大肠杆菌菌液作为PCR模板，PCR扩增体系20μL如下：PCR产物2μL、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8引物各0.5μL、10×Pfu Buffer 2μL、2.5mM的dNTP Mixture 1.6μL、Pfu DNA Polymerase 0.5μL、dd H₂O12.9μL；PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min后，于4℃保存。琼脂糖凝胶电泳检测后为阳性菌株的进行分装，加入50％甘油后送往北京金诺锐杰基因科技有限公司测序，剩余菌液加入甘油于-80℃冰箱保存；

使用扩增目的基因完整ORF的引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对，先进行PCR扩增基因PfDGAT2鉴定质粒，PCR产物为一条长约990bp的条带，参见图4。再对质粒进行Kpn I和BamH I双酶切鉴定，产物为一条长约5.9kb和一条长约990bp的条带，参见图4。由此可知pYES2.0-PfDGAT2重组子构建成功。

基于同一种发明构思，本发明还提供了一种含有所述pYES2.0-PfDGAT2重组子的酵母表达系统，该酵母表达系统按照以下步骤制备：

步骤a，酵母感受态细胞的制备：参照酵母转化试剂盒(Coolaber公司)制备酵母感受态细胞，具体操作如下：先取酵母菌种接种于3mL YPD液体培养基中，于恒温摇床30℃过夜培养。第二天接种到含有30mL液体YPD培养基的三角瓶中继续培养，当OD₆₀₀达到0.4～0.5范围时，1000g，5min离心收集细胞，弃上清。用30～50mL的无菌水重悬细胞，1000g，离心5min，弃上清。用适当体积的100m/M LiAc溶液悬浮酵母细胞后分装至1.5mL离心管中，每管分装100μL用于转化一个质粒即一个反应。1000g，离心5min，弃上清，酵母感受态细胞制备好，备用。

步骤b，酵母转化：首先配制预混液，每转化一个质粒需要360μL的预混液(50％PEG240μL，1M LiAc 36μL，10mg/mL Carrier DNA 5μL，约200ng/μL质粒5μL；ddH₂O补足至总体积360μL)。吸取360μL预混液加入感受态细胞中，用枪头反复吹吸沉淀，充分混匀。30℃水浴孵育30min，10min混匀一次；42℃水浴热激30min，10min混匀一次。12,000rpm，离心1min，弃上清，加入100μL无菌水重悬沉淀，取等份的酵母细胞悬浮液涂于选择平板培养基上(SC-Ura诱导培养基)，30℃培养2～4天。

酵母培养所用培养基(含Amp 50mg/L)如下：

YPD液体培养基1L：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g。高温高压蒸汽灭菌，121℃20min。

YPD固体培养基1L：在1L的YPD液体培养基中加入20g细菌学琼脂粉。

SC-Ura抑制培养基1L：SC-Ura 8g，葡萄糖20g；固体培养基需加入20g细菌学琼脂粉。调节pH约为5.8，高温高压蒸汽灭菌，121℃20min。

SC-Ura诱导培养基1L：SC-Ura 8g，半乳糖20g；固体培养基需加入20g细菌学琼脂粉。调节pH约为5.8，高温高压蒸汽灭菌，121℃20min。

阳性转基因酵母菌株鉴定：

①酵母培养：将转化后的酵母菌株在SC-Ura平板诱导培养基(含质量分数2％半乳糖)上30℃暗培养2～4天，待长出明显单菌落后挑取部分单克隆于SC-Ura液体抑制培养基(含质量分数2％葡萄糖)中，30℃振荡培养。

②酵母破壁处理：待酵母菌液培养至OD₆₀₀约0.4～0.6时，对其进行破壁处理，基本操作如下：取酵母菌液100μL于1.5mL离心管中，13,000rpm，离心1min，去上清；加100μLddH₂O重悬沉淀，13,000rpm，离心1min，去上清；再加100μL TE缓冲液(1M Tris-HCl 5mL，0.5M EDTA0.1mL，加无菌水定容至50mL)，混匀，100℃金属浴10min，冰浴10min；13,000rpm，离心10min；最后取上清存于﹣20℃或用于后续试验。

③PCR扩增：以破壁后的酵母上清为模板，对其进行PCR检测：图5为分别采用pYES2.0引物对SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10以及DGAT2-1引物对SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4进行PCR验证后产物凝胶电泳图，产物长度分别在155bp和990bp，说明已经转化成功。

以pYES2.0载体设计引物，由SEQ ID NO.9(TAATACGACTCACTATAGGG)和SEQ IDNO.10(GTGACATAACTAATTACATGATG)的核苷酸序列组成的引物对，命名为pYES2.0，SEQ IDNO.9由20个碱基组成，SEQ ID NO.10由23个碱基组成。

参照步骤a～b的方法，分别以野生型菌株INVSc1和突变体菌株H1246α作为酵母菌种，制备INVSc1酵母感受态细胞和H1246α酵母感受态细胞；然后分别以pYES2.0-PfDGAT2重组子或者pYES2.0对照质粒作为步骤b中所述“质粒”，分别转化INVSc1酵母感受态细胞和H1246α酵母感受态细胞，得到INVSc1转对照质粒pYES2.0酵母、H1246α转对照质粒pYES2.0酵母和H1246α转pYES2.0-PfDGAT2酵母。

实施例3PfDGAT2基因功能验证

试验材料：INVSc1转对照质粒pYES2.0酵母，H1246α转对照质粒pYES2.0酵母，H1246α转pYES2.0-PfDGAT2酵母。

(1)油脂薄层层析(TLC)

将转基因酵母在SC-Ura抑制培养基中250r/min 30℃过夜培养，紫外分光光度计测定OD₆₀₀为0.4～0.5,13,000rpm离心收集菌体，用SC-Ura诱导培养基重悬至OD₆₀₀为0.4,250r/min 30℃继续培养，离心收集诱导表达培养36h的转基因酵母菌液，真空冷冻干燥后研磨成粉末备用。转基因酵母为INVSc1转对照质粒pYES2.0酵母、H1246α转对照质粒pYES2.0酵母和H1246α转pYES2.0-PfDGAT2酵母。

称取20mg冻干样品于指型玻璃管中，加入1ml氯仿:甲醇(体积比2:1)溶液，继续用玻璃棒搅拌几分钟后静置或稍离心；加质量分数0.9％的KCl溶液0.5ml，混匀；再加入1ml氯仿，混匀，4000rpm,离心3-5min。用玻璃吸管将底部氯仿相吸出，并移至另一个新的指型玻璃管。将含有氯仿相的玻璃管放置于通风橱中，氮吹仪吹干。再加入100μL氯仿，溶解，吹吸混匀。将提取到的脂质移至GC小瓶中，编号，-20℃冰箱保存待用。

将提取到的脂质用薄层色谱展开，在薄层板底部约1.5cm处划线并点样，配制适量展开剂(正己烷：乙醚：甲酸体积比为80:20:2)倒入展开槽中，展开剂液面高度大概1cm左右，不要超过点样的线，密封，待展开剂前沿至薄层板另一端约1cm处时取出薄层板，通风橱中阴干。将薄层板放入碘缸中，显色较深后取出，拍照记录，结果参见图6。结果表明：基因PfDGAT2能恢复酵母H1246α的TAG合成能力，显示基因PfDGAT2在油脂合成中发挥作用，基因PfDGAT2与植物脂肪酸代谢相关。

(2)油体的尼罗红(Nile Red)染色

吸取1mL转基因酵母培养液，10,000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤沉淀2次，无菌水重悬菌体至OD₆₀₀约0.2-0.3。每100μL菌液加入10μL尼罗红染液，50μL二甲基亚砜(DMSo)和850μL无菌水，尼罗红染液浓度是5mg/mL，尼罗红染液溶剂是丙酮，剧烈混匀5s，避光染色10min，取10μL制作玻片，在荧光显微镜下观察，并拍照记录。转基因酵母为INVSc1转对照质粒pYES2.0酵母、H1246α转对照质粒pYES2.0酵母和H1246α转pYES2.0-PfDGAT2酵母。结果参见图7：转对照质粒的野生型菌株INVSc1能够检测到油体，转对照质粒的H1246α中检测不到油体，转pYES2.0-PfDGAT2的H1246α中可以检测到油体，表明基因PfDGAT2的表达恢复了H1246α油体缺陷的表型，说明克隆所得的基因PfDGAT2编码具有DGAT酶活性的蛋白，说明基因PfDGAT2与植物脂肪酸代谢相关。

(3)基因PfDGAT2酶活性及底物特异性鉴定

DGAT蛋白酶催化二酰甘油(sn-1,2-DAG)和酰基辅酶A(acyl-CoA)生成三酰甘油(sn-1,2,3-TAG)。分别合成了[¹⁴C]16:0-DAG，18:0-DAG，18:1-DAG，18:2-DAG，18:3-DAG和16:0-CoA，18:0-CoA，18:1-CoA，18:2-CoA，18:3-CoA。通过不同的底物DAG和acyl-CoA组合，在加入缓冲液和标的PfDGAT1微体蛋白或者PfDGAT2微体蛋白的试管中进行生化反应来鉴定PfDGAT的酶活性和底物特异性。从反应液中提取总脂类，经TLC层析分离后，将层析板置于紫外线下观察。标记目标放射性带(TAG)，然后收取标记的带。目标带所含放射性用同位素液闪分析仪进行定量测定。放射性量即反映了新合成TAG的多少，由此评定PfDGAT2酶蛋白的活性及底物特异性。空载体转化的酵母细胞所提取的微体蛋白作为对照。

图8是紫苏PfDGAT2酶活性和底物特异性测试结果，体外生化测试结果表明，所克隆的PfDGAT2编码酶蛋白具有较强的DGAT酶活性，且对底物α-亚麻酸(18:3)具有高度选择性(图8)。

上述试验充分证实了基因PfDGAT2在紫苏种子等作物油脂代谢及特异性选择α-亚麻酸分子中的应用。

需要说明的是，当本发明给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 与植物脂肪酸代谢相关的基因PfDGAT2、表达载体、构建方法及应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggctaccac atccaaggaa 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctggaatta ccgcggct 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggagtccg agcccaac 18

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttagagaatc ctgagctcta agtcg 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

accgcttgtt cattccattc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taaccaaccg catgcttaca 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtaccatgg agtccgagcc caac 24

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggatccttag agaatcctga gctctaagtc g 31

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

taatacgact cactataggg 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtgacataac taattacatg atg 23

<210> 11

<211> 1249

<212> DNA

<213> 紫苏

<400> 11

aaaacgtgtg tgtgtgtgtg tgtgctgaca tgtgaaaagt tttaggcagc gtccagaaag 60

tatgtaataa taaattgatt gagaattggc gttggcgttg gcgttgtttc ccacacgcca 120

tctctctgca tcaatccatt tcacgtgctc gcttactgct acttcaatgg agtccgagcc 180

caacggcgat gtcaggcggc ggaaatcgcc ctcggcagag gcggcggagc tcaagggcac 240

tccgggaccg cttgttcatt ccattcttgc aattgttttg tggctcggct cgatccattt 300

catcgttttc atcgtcctcg cctcgttttt cttcctccct tttcccaaat cactcggagg 360

tattgtgttc cttttgatat ttatggtgat tccgattaat gaccggagca aatggggccg 420

gagtttgtcc aggtatatat gtaagcatgc ggttggttat tttccggtga ctttgtatgt 480

ggaggatatc aaagcctttg atcccaacga ggcctatgtt tttggctatg aaccacattc 540

agtttggcct ataggagtag tttcacttgc agaccttact ggtttcatgc ctttaccaaa 600

gatcaaggtt ctcgctagta ctgctgtatt ctacactcca ttcatgcgac acatatggtc 660

gtggttggga ctttcccctg ccactaggaa aaattttact tcccttttgt catctggtta 720

tagctgcatc ataataccag ggggagtcca ggaggcctgc tatatggagc atggttctga 780

ggttgccttt cttcaaaata gaagaggatt tgttcgtatt gctatggaga ccggcaaacc 840

tctggttccg gttttctgct ttggtcagtg tgatgcatat aagtggtgga aaccgggtgg 900

gaaactgttc agggaattcg ctagagccat aaagttcaca cccattgttt tctggggcgt 960

actcggttca cctctacctt ttagacttcc gattcatgtg gtggttggtc gaccaattct 1020

gctcaagaaa accccaacac ctaccacgga agaggttgcg aaggtccatg tggagtttgt 1080

ggaagcactt aaagatcttt tcgagaggca caaagcaagg gttgggcatc ccgacttaga 1140

gctcaggatt ctctaattga cgtctattat caatcatcat tcatcaatca tcaatcatca 1200

attctgttgt tgtatattcc tcgctaacat agaacatcta tttatccta 1249

Claims

1.一种与植物脂肪酸代谢相关的基因PfDGAT2，其特征在于，所述基因PfDGAT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，该基因与植物脂肪酸代谢相关。

2.一种含有基因PfDGAT2的酵母表达载体。

3.根据权利要求2所述的含有基因PfDGAT2的酵母表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，目的基因扩增与纯化：以连接了目的基因PfDGAT2的pMD18-T载体为模板，以SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6为引物对，进行PCR扩增，然后凝胶回收并纯化目的基因，得到目的基因PfDGAT2片段，备用；

4.根据权利要求3所述的含有基因PfDGAT2的酵母表达载体的构建方法，其特征在于，S1中，目的基因PfDGAT2的双酶切反应体系50μL如下：目的基因PfDGAT2片段20μL、10U/μL的Kpn I 1μL、10U/μL的BamH I 1μL、FD Buffer 5μL、ddH₂O补足至50μL；

5.一种含有权利要求2所述pYES2.0-PfDGAT2表达载体的酵母表达系统。

6.一种权利要求1所述的基因PfDGAT2在紫苏种子油脂代谢及特异性选择α-亚麻酸分子中的应用。