CN112540077B - 一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，包括：步骤1：将待测种子经过或不经过剖切；步骤2：将待测种子置于质量百分浓度为0.90‑1.10％过碘酸溶液中浸泡不少于25min取出，用去离子水清洗后，转入显色液中浸泡不少于8min，取出；所述显色液是含有酸性品红和强还原剂的溶液；步骤3：用体视镜扫描照相，以白色为对照背景，待测样品图片上所显示的红色即对应表征不饱和脂肪酸积累和分布位点；红色集中区域表明该区域具有不饱和脂肪酸，且红色的深浅程度与所脂肪酸不饱和度呈正相关。本发明实现了在自然状态下对植物种子中不饱和脂肪酸的积累和分布模式的高灵敏度、快速、低成本、高效率、无毒、无污染的检测，用于筛选脂肪酸不饱和双键含量不同的种质资源。

Description

一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法

技术领域

本发明涉及种子脂肪酸不饱和度的检测方法，特别是一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法。

背景技术

不饱和脂肪酸是人体不可缺少的脂肪酸，人体不能合成油酸、亚油酸和α-亚麻酸，必须从膳食中补充，这些脂肪酸具有保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能。

植物中油脂的分布呈现出显著的不均匀性，除少数植物在茎、果肉中富集外(Phytochemistry2007,68:2112–2117)，几乎都积累于植物的成熟种子中，不同植物种子中含油量及脂肪酸的构成大相径庭，即使同一种子中油脂分布也不尽相同(J.Biol.Chem.2012,287:2288–2294)。无论是研究种子发育过程油脂合成相关基因的协同作用，还是揭示碳代谢流在“源”和“库”之间如何定量转移和分配的，最后都离不开鉴定油脂及脂肪酸在种子“库”中的积累和分布情况，而植物中不饱和脂肪酸所占比重较大。因此，有必要提供一种不破坏种子结构、灵敏、高效的检测植物种子中不饱和脂肪酸的新方法。

目前，检测不饱和脂肪酸的方法有近红外法、酶联免疫吸附法、碘价法、气相色谱法等(中国现代应用药学，2014，31：246–252)，除近红外法不需要破坏待测样品外，其余的方法都需要预先分离提取植物组织中的脂肪酸，但近红外法需要提前建立模型，并且依赖价格不菲的近红外分析仪(如CN201810917861.4公开一种植物油料中脂肪酸含量的近红外检测方法)；酶联免疫吸附法首先要制备质量较高的抗体，其次是较为复杂的实验流程；碘价法用到的氯化汞有剧毒，并且此方法耗时比较长。气相色谱法对进样样品要求较高，需要先进行衍生化反应，以便于仪器的检出，同样需要高昂的仪器设备平台(中国油料作物学报，2015，4：548–553)。综上所述，现有

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，实现了在自然状态下对种子中不饱和脂肪酸的积累和分布模式的高灵敏度、快速、低成本、高效率、无毒、无污染的检测。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

本发明提供一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，所述方法包括：

步骤1：将待测种子经过或不经过剖切；

步骤2：将待测种子置于质量百分浓度为0.90-1.10％过碘酸溶液中浸泡不少于25min取出，用去离子水清洗后，转入显色液中浸泡不少于8min，取出；所述显色液是含有酸性品红和强还原剂的溶液；

步骤3：用体视镜扫描照相，以白色为对照背景，待测样品图片上所显示的红色即对应表征不饱和脂肪酸积累和分布位点；红色集中区域表明该区域具有不饱和脂肪酸，且红色的深浅程度与所脂肪酸不饱和度呈正相关。

本发明测试的化学原理是基于含不饱和键的脂肪酸类物质被过碘酸氧化后可以跟Schiff试剂发生反应进而显色。

根据本发明的较佳实施例，所述待测种子为水稻种子，也可以是其他种子，本发明不限定为水稻种子，但优选是那些种子肉质为非红色的植物种子。种子肉质为红色可能会对检测有一定干扰，但也可以进一步地通过选择以该类种子的肉质颜色为第二对照背景色，取种子经步骤1-3处理前后相对白色对照背景的颜色差值为计算标准，进行定量化，再与脂肪酸不饱和度进行关联化。

根据本发明的较佳实施例，所述待测种子可以是来源于种子出现直到完全成熟的生长发育各个时期的种子；当待测种子是完全成熟的植物种子时，在蒸馏水中于2-4℃浸泡至易于剖切；当待测种子是开花期间且较硬(软硬度恰好可供剖切)的种子时，直接剖切开；当待测种子是开花期间且较软的种子时，先在-15℃-25℃低温冷冻(至软硬度恰好可供剖切)后进行剖切；所述剖切为横切或纵切。

根据本发明的较佳实施例，所述种子为水稻种子或其他种子。

根据本发明的较佳实施例，所述显色液含有0.4-0.6g/L酸性品红和亚硫酸氢钠的溶液，其配制完成后在2-4℃下冷藏保存备用。

根据本发明的较佳实施例，所述白色是指R、G、B均为255。

根据本发明的较佳实施例，所述方法进一步包括：使用已有软件或仪器设备对待测样品图片上红色的深浅程度进行定量化，并将定量化的数值与脂肪酸不饱和度进行关联。

根据本发明的较佳实施例，所述方法包括：

步骤一：采用色差仪测定待测种子不同区域或不同种子的颜色数据L、a、b值；L表示色差值明度、a为红绿色轴分量、b为黄蓝色轴分量；或者使用Photoshop软件获取待测种子图片上选定区域的RGB值。

步骤二：使用近红外法、酶联免疫吸附法、碘价法、气相色谱法中的一种或几种方法联合获得种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度。

步骤三：按照上述步骤获得一系列的颜色数据和不饱和度值，然后采用prism统计学软件对种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度和对应的颜色数据进行相关性分析，获得种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度与颜色数据之间的关联系数。

根据本发明的较佳实施例，所述红色的深浅程度采用由美国国立卫生研究院基于java开发的公共图片处理软件ImageJ(下载网址https://imagej.en.softonic.com/)，对种子图片进行分析，将种子图片中红色的深浅进行数值化，并将该数值与脂肪酸不饱和度进行关联。

根据本发明的较佳实施例，具体步骤如下：打开软件ImageJ，选择菜单中的file，下拉菜单选择open打开待分析图片；选择图标Rectangularselections，在图片中选择待分析的目标区域；选择菜单栏中的Analyze下拉菜单的Measure；弹出对话框中的第二列即为所选择区域的平均灰度值；

以RMGV表示相对平均灰度值，最大值定义为1；

RMGV＝(255-区域1平均灰度值)/(255-区域2平均灰度值)/……/(255-区域n平均灰度值)，由于ImageJ定义纯白色的值为255，纯黑色的值为0，公式中用255减去待测定区域的平均灰度值，转换成与颜色深浅呈正相关的数值大小，即数值越大，对应区域颜色越深；公式中“/”表示不同区域之间测定数值的比；

总脂肪酸不饱和度(DUFA)的计算公式为DUFA＝Σ[(M:n)mol×n]×10⁶＝[(M:1)mol+(M:2)mol×2+(M:3)mol×3+……

(M:n)mol×n]×10⁶，其中M为脂肪酸碳链的长度，n为双键的个数，mol为该脂肪酸的摩尔数(质量除以该种脂肪酸的分子量)，Σ表示不同碳链和不同双键脂肪酸不饱和度的和；RDUFA表示相对总脂肪酸不饱和度，各个样品值与其中最大值的比值，最大值定义为1。

本发明的方法可用于检测种子内任何不饱和脂肪酸不饱和度，不限于植物内源的不饱和脂肪酸，还可以对通过基因工程在植物种子内富集的EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)等外源不饱和脂肪酸进行快速检测。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

本发明的原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，可以在不破坏植物种子组织结构，可对植物生长发育任何时期的种子或完全成熟的种子，检测其所含有的脂肪酸不饱和度，分辨出不同种子之间不饱和脂肪酸的相对量以及种子内不同区域的脂肪酸不饱和度的分布情况。

本发明可同时对多个同种或不同种类型植物种子进行检测，不同类型种子之间无相互影响，因此是一种简便易行的高通量原位检测植物开花期或成熟种子中脂肪酸不饱和度及分布的方法，对于探讨不饱和脂肪酸合成遗传调控机制，探索种子中不饱和脂肪酸超富集的新途径，改良种子的不饱和脂肪酸品质、快速筛选高不饱和度脂肪酸的目标突变株，培育富含不饱和脂肪酸的新种质资源提供灵敏、高效、实用的检测方法和检测平台(可设计为计算机程序软件，在显色后用体视镜扫描照相，然后由计算机程序处理得到种子中不饱和脂肪酸的分布区域和不饱和度值)；并对设计其它油料作物的脂类代谢调控方面的研究，具有建立技术体系的指导性意义。

附图说明

图1为以野生型3个不同生长发育期的水稻种子、FAD2-1(FAD2基因敲除)突变体水稻种子、FAD3过量表达的水稻种子为测试材料，经过碘酸处理后在显色液中浸泡显色，用体视镜扫描照相的图片。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例

下述内容将以野生型3个不同生长发育期的水稻种子、FAD2-1(FAD2基因敲除)突变体水稻种子、FAD3过量表达的水稻种子为测试材料，对本发明的原位测试种子脂肪酸不饱和度的方法进行说明。测试方法可以按照如下步骤进行：

(一)试剂配制

(1)过碘酸溶液：

1％过碘酸溶液，货号：DG0002-100ml，购自北京润泽康生物科技有限公司，4℃保存。

(2)显色液：

0.05g酸性品红(货号：S19025-25g，购自上海源叶生物科技有限公司)加去离子水100ml使其溶解，加亚硫酸氢钠(货号：S111720-500g，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，使其溶解，5分钟后即可使用，4℃保存。

(二)测试材料制备

(1)野生型3个不同生长发育期的水稻种子：分别选取kitaake水稻(商品化)开花后10天、15天、20天的种子。

(2)FAD3基因过量表达的水稻种子：为FAD3基因过量表达的kitaake水稻种子。详细制作过程参考2013年3月20日授权公告的CN102277375B-一种提高转基因植物种子中α-亚麻酸含量的方法和文章JExpBot.2012,63:3279–3287。FAD3基因过量表达使水稻种子中脂肪酸不饱和度相对野生型对照显著增加。

(3)FAD2-1(FAD2基因敲除)突变体水稻种子：对野生型龙稻5号水稻种子(商品化)敲除FAD2基因的突变体。水稻种子中Δ12FAD是催化油酸生成亚油酸的关键酶(Yueetal.,2007)，因此定点敲除FAD2基因的突变体中油酸含量增加，相应的亚油酸含量降低，水稻种子中脂肪酸不饱和度相对野生型显著下降。

(三)水稻种子中脂肪酸不饱和度的原位检测

(1)对于开花期的种子，用锋利的单面刀片横切或纵切，对于成熟种子用蒸馏水于4℃浸泡至便于切割后备用。

(2)将待测样品置于1％过碘酸溶液中，保证切面与溶液充分接触，30分钟后，去离子水清洗样品2-3次。

(3)将待测样品转入显色液中10分钟，体视镜扫描照像，以白色对照背景，种子上红色即为不饱和脂肪酸积累和分布位点，红色越深，表明该区域脂肪酸不饱和度越高。

如图1所示，其中A为未染色野生型kitaake水稻(商品化)体视镜照片；B为开花10天的野生型kitaake水稻种子经显色液浸泡的体视镜照片；C为开花15天的野生型kitaake水稻种子经显色液浸泡的体视镜照片；D为开花20天的野生型kitaake水稻种子经显色液浸泡的体视镜照片；G为D所示体视镜照片的局部放大图片。E为FAD2-1(FAD2基因敲除)突变体水稻种子经显色液浸泡的体视镜照片；F为FAD3基因过量表达的水稻种子经显色液浸泡的体视镜照片。

从图1中各图可知，FAD3基因过量表达的水稻种子的红色区域最多且红色最深。野生型kitaake水稻(商品化)种子在开花20天后，其红色分布区域少于FAD3基因过量表达的水稻种子，红色深度也比FAD3基因过量表达的水稻种子更浅。

由图1B至D图可知，在野生型kitaake水稻开花后10天便可以检测到阳性信号，主要局限于幼胚，随后依次向内扩展到糊粉层、亚糊粉层和胚乳的外部(图1的B-D)。随着种子的成熟度增加，不饱和脂肪酸含量也不断增加，逐渐延伸到胚乳内部，但相比之下，胚乳中心部位不饱和脂肪酸含量明显较低。由此可知，通过本发明原位检测方法可以灵敏的检测到初期至成熟期整个发育过程中的不饱和脂肪酸积累分布情况。

由图1中D和G图可知，野生型kitaake水稻种子的4个区域：胚、糊粉层、亚糊粉层、胚乳中心部位的显色结果为：胚(数字1标记)中红色最深；糊粉层(数字2标记)中红色较深；亚糊粉层(数字3标记)中颜色较浅；胚乳中心部位(数字4标记)颜色最浅。说明野生型kitaake水稻种子的胚层中脂肪酸不饱和度最高，其次是糊粉层、亚糊粉层，脂肪酸不饱和度最低的是胚乳中心部位。

由图E和F可知，FAD2-1(FAD2基因敲除)突变体水稻种子的红色很浅，表明不饱和脂肪酸中不饱和双键含量较少，不饱和度较低；FAD3基因过量表达的水稻种子中，红色区域颜色明显加强，表明不饱和脂肪酸中不饱和双键含量较多，不饱和度较高。此外，虽然野生型kitaake水稻种子、FAD2-1突变体水稻种子、FAD3基因过表达水稻种子三种不同水稻种子中脂肪酸不饱和度有所改变，但是FAD2基因敲除及FAD3基因过量表达并没有影响不饱和脂肪酸的积累部位，体现了FAD2和FAD3基因的表达特性(见图1，D-F)。这与气相色谱法的检测结果恰好吻合，表明：本发明的原位检测的方法能够筛选检测不饱和脂肪酸不饱和双键含量不同的水稻种质资源。

(4)将种子红色的深浅度与脂肪酸不饱和度进行数学关联

这个步骤可以采用多种方式实现，一般情况下可以采用已有软件或仪器设备对待测样品图片上红色的深浅程度进行定量化(数值化)，然后采用其他已有检测手段，包括使用目前已经成熟的近红外法、酶联免疫吸附法、碘价法、气相色谱法等中的一种或几种方式联合，测量不同种子或同一种子不同区域脂肪酸不饱和度，获得一系列红色的深浅程度数值与相应的脂肪酸不饱和度，采用prism统计学软件对种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度和对应的颜色数据进行相关性分析，获得种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度与颜色数据之间的关联系数。例如，采用色差仪测定待测种子图片选定区域的颜色数据L、a、b值(L表示色差值明度、a为红绿色轴分量、b为黄蓝色轴分量)或使用Photoshop软件获取待测种子图片上选定区域的RGB值，然后采用气相色谱法测量该种子对应区域的脂肪酸不饱和度，用prism统计学软件得到颜色数据与脂肪酸不饱和度进行数学关联。得到数学关联关系后，运用本发明的方法，借助计算机程序的自我学习能力，可将经过显色液浸泡后的待测种子红色深浅程度，直接转化成对应脂肪酸不饱和度的量化值。

在本实施例中，还可采用由美国国立卫生研究院基于java开发的公共图片处理软件ImageJ(下载网址https://imagej.en.softonic.com/)，对种子图片进行分析，具体步骤如下：

打开软件ImageJ，选择菜单中的file，下拉菜单选择open打开待分析图片；选择图标Rectangularselections，在图片中选择待分析的目标区域；选择菜单栏中的Analyze下拉菜单的Measure；弹出对话框中的第二列即为所选择区域的平均灰度值。

由于ImageJ定义纯白色的值为255，纯黑色的值为0，公式中用255减去待测定区域的平均灰度值，转换成数值的大小与颜色深浅呈正相关，即数值越大，对应区域颜色越深。公式中“/”表示不同区域之间测定数值的比。

以RMGV表示相对平均灰度值，最大值定义为1；RMGV＝(255-区域1平均灰度值)/(255-区域2平均灰度值)/……/(255-区域n平均灰度值)。总脂肪酸不饱和度(DUFA)的计算公式为：

DUFA＝∑[(M:n)mol×n]×10⁶＝[(M:1)mol+(M:2)mol×2+(M:3)mol×3+……(M:n)mol×n]×10⁶；

其中M为脂肪酸碳链的长度，n为双键的个数，mol为该脂肪酸的摩尔数(质量除以该种脂肪酸的分子量)，Σ表示不同碳链和不同双键脂肪酸不饱和度的和；RDUFA表示相对总脂肪酸不饱和度，各个样品值与其中最大值的比值，最大值定义为1。公式中乘以10⁶是由于原始得数较小，故统一扩大10⁶倍。

例如：称取植物种子质量为0.02g，其只含有油酸和亚油酸，油酸是十八个碳中含有一个不饱和键，表示为18:1，油酸分子量282.46；亚油酸是十八个碳含有两个不饱和键，表示为18:2，亚油酸分子量280.44。

该样品总脂肪酸不饱和度DUFA＝[(18:1)mol+(18:2)mol×2]×10⁶＝[0.02/282.46+(0.02/280.44)×2]×10⁶＝213.44。

按照上述方法，对图1中D图和G图中野生型kitaake水稻开花20天的种子用阿拉伯数字标记的4个区域，即胚(数字1标记)、糊粉层(数字2标记)、亚糊粉层(数字3标记)、胚乳中心部位(数字4标记)原位检测脂肪酸不饱和度，同时还检测了FAD2-1突变体的胚、FAD3基因过量表达的水稻种子的脂肪酸不饱和度。

结果如下表：

DUFA总脂肪酸不饱和度的计算方式如下：

DUFA＝[(18:1)mol+(18:2)mol×2+(18:3)mol×3]×10⁶。

RDUFA表示相对总脂肪酸不饱和度，即某待测种子或待测种子选定区域的DUFA值与FAD3(胚)(DUFA＝526.79)的比值，其最大值定义为1。

RMGV＝(255-区域1平均灰度值)/(255-区域2平均灰度值)/……/(255-区域n平均灰度值)；RMGV表示相对平均灰度值，为某待测种子或待测种子选定区域的灰度值与FAD3(胚)灰度值的比值，其最大值定义为1。

由上表可知，野生型kitaake水稻开花20天的种子胚乳中心部位的不饱和度最低，其次是FAD2-1突变体的胚，而野生型kitaake水稻开花20天的种子胚和FAD3(胚)脂肪酸不饱和度均较高。

由上述实验可知，本发明的方法可用于检测种子内任何不饱和脂肪酸不饱和度，不限于植物内源的不饱和脂肪酸，还可以对通过基因工程在植物种子内富集的EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)等外源不饱和脂肪酸进行快速检测。

(四)方法验证

采用气相色谱法(具体步骤参考MolBreeding2014,33:987–996和JExpBot.2012,63:3279–3287)检测水稻种子中脂肪酸不饱和度。

对图1的D图和G图中标注的野生型kitaake水稻(商品化)种子的4个区域：胚(数字1)、糊粉层(数字2)、亚糊粉层(数字3)、胚乳中心部位(数字4)，每个区域随机选择三个点，测试脂肪酸不饱和度。结果显示，胚(数字1)中红色最深，其相应脂肪酸不饱和度为406.86，糊粉层(数字2)中红色较深，其相应脂肪酸不饱和度为396.88；亚糊粉层(数字3)中颜色较浅，其相应脂肪酸不饱和度为290.67；胚乳中心部位(数字4)颜色最浅，其相应脂肪酸不饱和度仅为215.90。

通过相对总脂肪酸不饱和度与相对平均灰度值之间的对应关系表明：本发明原位检测方法与经典气相色谱法结果相符合(t检验P>0.05)，能够通过颜色的深浅准确展示出不饱和脂肪酸的分布区域及不饱和双键相对含量。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种原位检测种子中脂肪酸不饱和度的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1：将待测种子经过或不经过剖切；

步骤2：将待测种子置于质量百分浓度为0.90-1.10%过碘酸溶液中浸泡不少于25min取出，用去离子水清洗后，转入显色液中浸泡不少于8min，取出；所述显色液是含有酸性品红和强还原剂的溶液；

步骤3：用体视镜扫描照相，以白色为对照背景，待测样品图片上所显示的红色即对应表征不饱和脂肪酸积累和分布位点；红色集中区域表明该区域具有不饱和脂肪酸，且红色的深浅程度与所脂肪酸不饱和度呈正相关；

所述白色是指R、G、B均为255；

所述方法进一步包括：使用已有软件或仪器设备对待测样品图片上红色的深浅程度进行定量化，并将定量化的数值与脂肪酸不饱和度进行关联；

所述关联方法包括如下两种方法之一：

方法一，包括如下步骤：

步骤一：采用色差仪测定待测种子不同区域或不同种子的颜色数据L、a、b值；L表示色差值明度、a为红绿色轴分量、b为黄蓝色轴分量；或者使用Photoshop软件获取待测种子图片上选定区域的RGB值；

步骤二：使用近红外法、酶联免疫吸附法、碘价法、气相色谱法中的一种或几种方法联合获得种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度；

步骤三：按照上述步骤获得一系列的颜色数据和不饱和度值，然后采用prism统计学软件对种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度和对应的颜色数据进行相关性分析，获得种子不同部位或不同种子的脂肪酸不饱和度与颜色数据之间的关联系数；

方法二，包括如下步骤：

将图片中红色的深浅进行数值化，并将该数值与脂肪酸不饱和度进行关联的方法如下：

打开软件ImageJ，选择菜单中的file，下拉菜单选择open打开待分析图片；选择图标Rectangularselections，在图片中选择待分析的目标区域；选择菜单栏中的Analyze下拉菜单的Measure；弹出对话框中的第二列即为所选择区域的平均灰度值；

以RMGV表示相对平均灰度值，最大值定义为1；RMGV=(255-区域1平均灰度值)/(255-区域2平均灰度值)/……/(255-区域n平均灰度值)，由于ImageJ定义纯白色的值为255，纯黑色的值为0，公式中用255减去待测定区域的平均灰度值，转换成与颜色深浅呈正相关的数值大小，即数值越大，对应区域颜色越深；公式中“/”表示不同区域之间测定数值的比；

DUFA表示总脂肪酸不饱和度，其计算公式为DUFA=Σ[(M:n)mol×n]×10⁶=[(M:1)mol+(M:2)mol×2+(M:3)mol×3+……（M:n）mol×n]×10⁶，其中M为脂肪酸碳链的长度，n为双键的个数，mol为该脂肪酸的摩尔数，摩尔数等于质量除以该种脂肪酸的分子量，Σ表示不同碳链和不同双键脂肪酸不饱和度的和；RDUFA表示相对总脂肪酸不饱和度，各个样品值与其中最大值的比值，最大值定义为1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测种子为水稻种子。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测种子可以是来源于种子出现直到完全成熟的生长发育各个时期的种子；

当待测种子是完全成熟的植物种子时，在蒸馏水中于2-4℃浸泡至易于剖切；当待测种子是开花期间且较硬的种子时，直接剖切开；当待测种子是开花期间且较软的种子时，先在-15℃-25℃低温冷冻后进行剖切；所述剖切为横切或纵切。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子为水稻种子。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述显色液含有0.4-0.6g/L酸性品红和亚硫酸氢钠的溶液。

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