CN105044229A - 定性定量检测大豆脂肪酸组分的气相色谱方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种定性定量检测大豆脂肪酸组分的气相色谱方法,其特征在于,采用加热甲酯化方法对大豆种子中的脂肪酸进行提取,采用气相色谱法进行检测,并根据大豆5种脂肪酸甲酯(棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯)标准样品的标准曲线和回归方程准确检测大豆籽粒中脂肪酸组分的真实含量。该方法适用于大豆籽粒脂肪酸成分的定性和定量分析,具有操作简便、易控、易推广,不仅能检测样品中5种脂肪酸组分的相对百分比含量,还可以准确计算出籽粒中各个脂肪酸组分的绝对含量,对大豆脂肪酸检测及育种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域,具体涉及一种定性定量检测大豆脂肪酸组分的气相色谱方法。
背景技术
大豆是世界植物油的主要来源之一。脂肪酸是大豆油脂的主要成分,其含量约占脂肪总量的90%。脂肪酸按性质可分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸,其中饱和脂肪酸包括棕榈酸和硬脂酸,不饱和脂肪酸包括油酸、亚油酸和亚麻酸。大豆油脂中的不饱和脂肪酸有降低患心血管疾病的作用,可降低人体中的有害胆固醇,但多不饱和脂肪酸,尤其是亚麻酸,容易被脂肪氧化酶氧化,从而产生豆腥味。改良大豆脂肪酸组分,提高其抗氧化性是近年来大豆脂肪酸育种的主要目标。
由于研究目的不同,不同研究者所采用的脂肪酸甲酯化提取方法存在差异,所使用的提取和甲酯化试剂也各不相同。大多数研究者采用索氏提取法和超临界CO2萃取法,从不同样品中提取脂肪酸,但耗时较长,步骤繁琐。大豆脂肪酸组分的检测方法主要包括近红外反射光谱分析法(NIRS)、高效液相色谱(HPLC)法和气相色谱法(GC),而应用最为广泛的当属气相色谱法。目前,针对大豆脂肪酸的检测主要以相对百分比含量测定为主,此类方法较为简单,没有以脂肪酸标准样品作为参照,无法准确反映籽粒中脂肪酸组分的真实含量,因为相对定量的结果只是以总脂肪酸含量的百分比形式呈现的,不能表示各组分的实际含量,例如每克豆粉中究竟含有多少微克的某种脂肪酸。此外,由于不同品种总脂肪酸含量的差异,如果比较两个大豆品种的某个脂肪酸组分含量水平,只用相对百分比就不准确。因此,需要研究一种对大豆脂肪酸组分绝对定量的方法,从而准确检测大豆品种中脂肪酸的种类和含量。
发明内容
为满足上述领域的需求,本发明提供一种定性定量检测大豆脂肪酸组分的气相色谱方法,该方法能准确同时检测大豆脂肪中各种脂肪酸的含量,准确性高,安全性好,操作简便快捷,容易掌握和推广。
本发明请求保护的技术方案如下:
一种大豆总脂肪酸的提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将大豆粉装入离心管中,加入正己烷,60℃加热浸提,间隔充分摇匀;
(2)加入甲醇钠溶液进行甲酯化,充分摇匀;
(3)加入饱和氯化钠,静置,取上清液。
进一步地,所述大豆粉、正己烷、甲醇钠溶液和饱和氯化钠溶液的用量比例如下:30.0mg大豆粉:1.0mL正己烷:1.0mL甲醇钠:300μL饱和氯化钠,
其中甲醇钠溶液的浓度为0.5mol/L,所述60℃加热浸提的时长为20分钟。
一种定性定量检测大豆脂肪酸组分的气相色谱方法,包括如下步骤:
(1)获取五种脂肪酸标准曲线及标准曲线方程:
所述五种脂肪酸标准曲线的横坐标分别为棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯标准样品的梯度浓度,
所述五种脂肪酸标准曲线的纵坐标为采用气相色谱法检测梯度浓度的各种标准品所得的对应的色谱峰面积值;
(2)采用上述任一提取方法提取待测样品的总脂肪酸;
(3)对待测样品的总脂肪酸进行气相色谱检测,根据各种标准样品的色谱峰保留时间判断待测样品所形成的色谱峰包括哪些脂肪酸的色谱峰,并根据标准曲线定性定量分析待测样品中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的含量。
进一步地,所述五种脂肪酸标准曲线中,所述棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯的浓度梯度范围为0.2-20mg/mL,所述油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯的浓度梯度范围为0.2-40mg/mL。
所述获取五种脂肪酸标准曲线及曲线方程指采用已经制作好的标准曲线数据,或者进行现场实验和制作。
所述气相色谱检测的条件为:色谱柱:RTX-Wax30m×0.25mm×0.25μm;自动进样,进样量:lμL;采用分流进样,分流比:40:1;进样口温度:250℃;载气:氮气,54mL·min-1;氢气,40mL·min-1;空气,400mL·min-1;采取程序升温的方式:180℃保持1.5min,以10℃·min-1升到210℃,保持2min,然后以5℃·min-1升到220℃保持5min;检测器:火焰离子检测器,温度为300℃;每个样品检测20min,样品检测之间间隔2min。
本发明提供的大豆脂肪酸提取方法为加热甲酯化法,与索氏抽提、CO2超临界法等传统方法相比,操作简便快捷,可检测微量样品,提高大豆脂肪酸提取效率;其次,甲酯化试剂采用简易提取法中较安全的甲醇钠替代剧毒的三氟化硼甲醇,在保证甲酯化效果的同时,提高了检测过程的安全性。与简易甲酯化提取法相比,本发明的加热甲酯化法提取大豆脂肪酸可使大豆脂肪酸的甲酯化较为完全,从而准确检测出待测大豆样品中各种脂肪酸的绝对含量。与快速气相色谱分析法相比,本发明方法中脂肪酸提取液由正己烷代替石油醚等混合物,减少了测定样品中杂质的种类,提高检测结果的准确性。
本发明还提供定性定量检测大豆脂肪酸组分的气相色谱方法,以大豆5种脂肪酸甲酯(棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯)为标准样品,在制定5种脂肪酸甲酯组分的标准曲线和回归方程的基础上,采用本发明的加热甲酯化法提取待测样品中的总脂肪酸,对其进行气相色谱分析,根据5种脂肪酸标准样品的保留时间和峰面积对各个脂肪酸组分进行定性定量分析。如图1所示,棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯的出峰时间分别为5.53、7.87、8.15、8.77和9.72min,据此可对不同脂肪酸组分进行定性。依据表1中相应各组分公式计算大豆样品中各脂肪酸组分的绝对含量。
近红外光谱法虽然方便快捷,无需对样品破坏性处理,但它是一种间接的分析技术,需利用化学计量学方法建立预测模型,然后通过预测模型预测待测样品的组分含量。本发明采用五种脂肪酸甲酯作为标准样品,可以准确地定性不同脂肪酸组分,结合气相色谱进行脂肪酸检测,并制作脂肪酸甲酯标准曲线,其决定系数(R2)均大于0.99。在定性的基础上仅通过公式计算可得大豆样品各脂肪酸组分绝对含量,提高了脂肪酸试验数据的准确性。本发明方法可以利用较少的脂肪酸样品,定性和定量地检测不同脂肪酸组分,实现了脂肪酸含量检测计算方法的标准化,为大豆脂肪酸的深入研究奠定了基础,对大豆脂肪酸检测及育种具有重要意义。
附图说明
图1.不同脂肪酸甲酯标准样品和豆粉中脂肪酸甲酯组分的气相色谱图谱,
其中,图1-A、1-B、1-C、1-D、1-E和1-F分别代表棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯和豆粉所测得脂肪酸甲酯的气相色谱图谱。
图2.不同脂肪酸甲酯的气相色谱标准曲线
其中,图2-A、2-B、2-C、2-D和2-E分别代表棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯的标准线性曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行详细说明,需要理解的是,下述实施例仅作为解释和说明,而不以任何方式限制本发明的范围。
大豆品种:
4个,包括3个低油份含量的大豆品种,鲁黑豆2号(LHD2)、南汇早黑豆(NHZ)、中黄13(ZH13)和1个高油份含量的大豆品种,中黄35(ZH35)。2014年4个大豆品种种植于中国农业科学院作物科学研究所昌平试验基地。
实验试剂:
正己烷(气相色谱专用)、甲醇钠(0.5mol/L,分析纯),购自于华夏远洋公司。五种脂肪酸甲酯标准样品:棕榈酸甲酯(methylpalmitate)、硬脂酸甲酯(methylstearate)、油酸甲酯(methyloleate)、亚油酸甲酯(methyllinoleate)和亚麻酸甲酯(methyllinolenate),均购自于sigma公司。
实验仪器:
采用岛津GC-2010气相色谱仪对大豆脂肪酸进行定性定量检测。
采用近红外光谱分析仪(Bruker)检测大豆样品的粗脂肪含量。
采用近红外光谱仪(MATRIX-1)分析大豆籽粒中粗脂肪含量。
实施例1、大豆脂肪酸组分的定量检测方法
步骤1、提取大豆总脂肪酸
采用加热甲酯化法提取大豆脂肪酸,其步骤如下:
(1)将大豆研磨成粉末,准确称取大豆粉30.0mg,放入2.0mL的离心管中,加入1.0mL正己烷,60℃加热浸提20min,间隔充分摇匀;
(2)然后加入1.0mL0.5mol/L甲醇钠溶液进行甲酯化,充分摇匀10min,使其充分甲酯化;
(3)加入300μL饱和氯化钠,静置,取上清液放置于色谱专用样品瓶中,4℃冰箱保存待检测。
步骤2、制作脂肪酸甲酯的气相色谱标准曲线
采用棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯的标准样品来制作标准曲线。
(1)准确称取标准样品20.0mg放入色谱专用样品瓶中,加1.0mL正己烷至标准样品完全溶解。然后从样品瓶中取500μL溶液放入另一样品瓶中,加入等体积正己烷,混合均匀,以此类推进行半倍稀释法,制作不同梯度的标准溶液,共设7个梯度。
(2)按照下列气相色谱检测条件对稀释好的标准溶液进行气相色谱分析,得到标准样品的气相色谱图谱(图1)。
气相色谱仪分析检测条件:
色谱柱:RTX-Wax(30m×0.25mm×0.25μm);自动进样,进样量:lμL;采用分流进样,分流比:40:1;进样口温度:250℃;载气:氮气,54mL·min-1;氢气,40mL·min-1;空气,400mL·min-1;采取程序升温的方式:180℃保持1.5min,以10℃·min-1升到210℃,保持2min,然后以5℃·min-1升到220℃保持5min;检测器:火焰离子检测器(FID),温度为300℃;每个样品检测20min,样品检测之间间隔2min。
(3)使用Excel2010进行数据统计,以标准溶液浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标绘制不同浓度梯度的标准曲线(图2),并采用SAS9.1软件进行方差分析和差异显著性分析。由图2可以看出,油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯3种脂肪酸甲酯组分的浓度梯度范围在0.2-40.0mg/mL内的线性关系最好,其决定系数R2均大于0.99,而棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯的浓度梯度范围在0.2-20.0mg/mL内的线性关系表现最好,其决定系数R2也均大于0.99。依据大豆籽粒中各个脂肪酸组分的真实含量推算,该检测范围基本可以覆盖大豆籽粒中各个脂肪酸组分绝对含量浓度范围,表明在上述标准曲线浓度范围内可以准确检测出各个脂肪酸组分的绝对含量。
(4)按照上述气相色谱检测条件,对步骤1提取的大豆总脂肪酸进行气相色谱检测。检测结果经不同脂肪酸甲酯标准样品的出峰时间定性后,依据不同组分的峰面积,参照脂肪酸甲酯标准曲线和各脂肪酸组分绝对含量的计算公式(表1),可以准确计算出大豆籽粒中5种脂肪酸组分的绝对含量和脂肪酸组分的总含量。
表1.大豆籽粒中脂肪酸组分绝对含量的计算公式
注:Apa、Asa、Aoa、Ala和Alna分别代表棕榈酸、硬脂酸、油酸亚、油酸和亚麻酸标准样品单位浓度峰面积;Cs代表脂肪酸甲酯标准样品单位浓度1mg/mL;V代表样品提取时溶剂正己烷的体积;W代表所提取样品的总质量;Ampa、Amsa、Amoa、Amla和Amlna分别代表棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸亚甲酯、油酸甲酯和亚麻酸甲酯标准样品单位浓度峰面积;Mmpa、Mmsa、Mmoa、Mmla和Mmlna分别代表棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸亚甲酯、油酸甲酯和亚麻酸甲酯分子量;Mpa、Msa、Moa、Mla和Mlna分别代表棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸分子量。
实施例2、加热甲酯化法与简单甲酯化法的比较分析
分别采用简单甲酯化方法和本发明的加热甲酯化方法对四个栽培大豆品种(鲁黑豆2号、南汇早黑豆、中黄13、中黄35)种子中的脂肪酸进行提取,并利用本发明的标准曲线进行5种脂肪酸组分的定性定量分析。
简单甲酯化方法的具体步骤为:准确称取大豆粉30.0mg,放入2.0mL的离心管中,加入1.0mL正己烷浸提20min;然后加入1.0mL0.5mol/L甲醇钠溶液进行甲酯化,充分摇匀10min,使其充分甲酯化,静置,取上清液放置于色谱专用样品瓶中,4℃冰箱保存待检测。
加热甲酯化方法的具体步骤同实施例1步骤1。
采用近红外(NIRS)的方法快速测定了4个大豆品种豆粉中的粗脂肪含量,步骤如下:
取研磨好的大豆粉10.0g左右,用近红外光谱仪(MATRIX-1)分析大豆籽粒中粗脂肪含量。每个样品重复扫描3次,利用OPUS4.2软件的Quant2方法,以大豆粗脂肪豆粉为模型获得测试样品的粗脂肪含量。
结果如表2所示,利用两种方法提取的5种脂肪酸组分在所有品种中均表现出显著差异。通过比较分析发现,本发明的加热甲酯化提取法所提取的5种主要脂肪酸总含量占粗脂肪含量的94.04-97.69%,而简易提取法所提取脂肪酸含量仅占粗脂肪含量的62.43-74.00%,由此可见,本发明的加热甲酯化提取法的提取效率显著高于简易甲酯化提取法,能够更有效地提取大豆籽粒中绝大部分脂肪酸组分。
表2.四个大豆品种和两种不同脂肪酸甲酯化提取方法的比较分析
注:a和b、A和B分别代表两种不同提取方法下差异达到显著或差异极显著水平。M1表示简单甲酯化方法,M2表示加热甲酯化方法。
实施例3、本发明定量检测方法的准确性验证
为了验证本发明检测方法的实验准确性,对不同品种不同组分的重复实验数据进行方差差异显著性分析,实验步骤如下:
1、四个大豆品种(鲁黑豆2号、南汇早黑豆、中黄13、中黄35),每个品种的大豆样品设置3个重复,共12份大豆样品。
2、按照实施例1所述的大豆脂肪酸的定量检测方法,利用加热甲酯化方法提取每份大豆样品的总脂肪酸并进行气相色谱分析。
3、根据实施例1所得到的标准曲线及表1所列的公式计算每份大豆样品中各个脂肪酸组分的绝对含量。
4、采用SAS9.1软件对绝对含量进行方差分析和差异显著性分析。
结果表明,不同品种不同脂肪酸组分的实验重复间的方差均未达到显著水平,表明本发明的检测方法所检测的大豆脂肪酸组分的绝对含量准确可靠,重现性好。
表3.不同大豆品种的脂肪酸组成重复间方差分析
Claims (6)
1.一种大豆总脂肪酸的提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将大豆粉装入离心管中,加入正己烷,60℃加热浸提,间隔充分摇匀;
(2)加入甲醇钠溶液进行甲酯化,充分摇匀;
(3)加入饱和氯化钠,静置,取上清液。
2.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,
大豆粉、正己烷、甲醇钠溶液和饱和氯化钠溶液的用量比例如下:
30.0mg大豆粉:1.0mL正己烷:1.0mL甲醇钠:300μL饱和氯化钠,
其中甲醇钠溶液的浓度为0.5mol/L,所述60℃加热浸提的时长为20分钟。
3.一种定性定量检测大豆脂肪酸组分的气相色谱方法,包括如下步骤:
(1)获取五种脂肪酸标准曲线及标准曲线方程:
所述五种脂肪酸标准曲线的横坐标分别为棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯标准样品的梯度浓度,
所述五种脂肪酸标准曲线的纵坐标为采用气相色谱法检测梯度浓度的各种标准品所得的对应的色谱峰面积值;
(2)采用权利要求1或2所述的提取方法提取待测样品的总脂肪酸;
(3)对待测样品的总脂肪酸进行气相色谱检测,根据各种标准样品的色谱峰保留时间判断待测样品所形成的色谱峰包括哪些脂肪酸的色谱峰,并根据标准曲线定性定量分析待测样品中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的含量。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述五种脂肪酸标准曲线中,所述棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯的浓度梯度范围为0.2-20mg/mL,所述油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯的浓度梯度范围为0.2-40mg/mL。
5.根据权利要求3所述的方法,所述获取五种脂肪酸标准曲线及曲线方程指采用已经制作好的标准曲线数据,或者进行现场实验和制作。
6.根据权利要求3~5任一所述的方法,其特征在于,所述气相色谱检测的条件为:色谱柱:RTX-Wax30m×0.25mm×0.25μm;自动进样,进样量:lμL;采用分流进样,分流比:40:1;进样口温度:250℃;载气:氮气,54mL·min-1;氢气,40mL·min-1;空气,400mL·min-1;采取程序升温的方式:180℃保持1.5min,以10℃·min-1升到210℃,保持2min,然后以5℃·min-1升到220℃保持5min;检测器:火焰离子检测器,温度为300℃;每个样品检测20min,样品检测之间间隔2min。
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