CN102749396B - 一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法，选择GC-MS技术对动物样品中脂肪酸含量进行检测，是为了解决在实际生产、科研工作中，传统方法中样品处理步骤繁琐且价格昂贵等问题，具体步骤包括：1）动物组织样品的处理，2）提取、皂化和甲酯化脂肪酸；3）确定GC-MS检测脂肪酸的条件；4）数据分析及样品鉴定。本发明对动物组织中的脂肪酸含量进行检测具有操作简单，检测限低，实验重现性好，实验数据直观可靠等特点，特别适用于微量样品检测，并可对不同样品间的脂肪酸组成及含量进行比较，应用性更广，为科研实验、临床应用及食品质量和安全监测中对动物样品脂肪酸组成及含量的快速检测提供新的思路和方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于气相色谱-质谱联用技术（GC-MS法）快速检测动物样品中脂肪酸含量的方法。
背景技术
脂肪酸是构成人体脂肪和类脂的基本物质，是细胞膜磷脂的重要成分，直接调节细胞膜的组成及蛋白质与膜内受体。脂肪酸根据饱和度的不同可分为饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)。
短链SFA可调节肠道运动，促进结肠细胞增殖，也可增加肠道黏膜损伤处的循环血流，促进肠道黏膜结构和功能的恢复；另外，短链饱和脂肪酸可治疗转流性结肠炎、远段溃疡性结肠炎和放射性结肠炎。此外，SFA摄入过多增加高胰岛素(Ins)血症的风险以及患乳腺癌的危险。
MUFA可降低血浆总胆固醇和LDL的水平，降低血小板的聚集率，减少机体内自由基脂质超氧化物的作用，也具有降低血压的作用。MUFA改善了内皮白细胞黏附因子的基因表达，从而可预防动脉粥样硬化，降低患冠心病的危险性。MUFA还能起到降血糖的作用，另外，因为MUFA是神经元细胞膜组成成分，它能维持神经元细胞膜完整性，因此MUFA可防止记忆下降。
PUFA是脑的成长、细胞间相互作用，第二信息向乙酰胆碱的应答及神经传导功能等脑功能发育不可缺少的物质，可用于治疗精神分裂症。另外，不饱和脂肪酸有利于膜的流动性，更有利于胰岛素(Ins)的透膜吸取及与受体的结合。
在正常情况下人体内脂肪酸是一稳定的化学组分，处于相对平衡，生物体内脂肪酸的改变能诱导神经生理、认知和其他行为的变化，尤其是必需脂肪酸含量的改变。而某些脂肪酸(如亚油酸，亚麻酸等高级脂肪酸)对人体保健极为重要，但人体又不能自行合成，根据测定含量的高低，可通过饮食营养加以调节，提高人们的健康和防止疾病的发生。
血浆中游离脂肪酸的测定是先将脂肪酸与Cu2+作用，以氯仿萃取后用铜试剂测定Cu2+的浓度，进而得到游离脂肪酸的含量，该方法不仅繁琐，而且只能测定脂肪酸总量。气相色谱法虽然具有高分离能力，但对脂肪酸定性鉴定时要有标准物质对照，无标样时测定较困难。另外，脂肪酸组分复杂，难以分离，传统方法通常采用酸水解、碱水解以及皂化法等，步骤繁琐，所需样品量大，不适用于科研、临床中微量样品的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快速、实时的气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法，特别适合对动物组织中微量样品的检测。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1）样品准备：将10mg动物组织剪碎后得样品，将样品置于螺口玻璃瓶中；
2）提取、皂化及甲酯化：将质量分数为37%的浓盐酸与2,2-二甲氧基丙烷按照0.02︰0.98的体积比混合得浓盐酸2,2-二甲氧基丙烷溶液，向螺口玻璃瓶内的样品中分别加入20μL质量浓度为1mg/mL的内标物石油醚溶液，以及1mL浓盐酸2,2-二甲氧基丙烷溶液，然后充氮气保护下震荡20min，震荡后用氮气将螺口玻璃瓶内的液体吹干，吹干后向螺口玻璃瓶内加入2.5mL质量分数为13%的三氟化硼甲醇溶液，然后将螺口玻璃瓶于80-85℃水浴中加热1小时；
3）加热结束后向螺口玻璃瓶内加入2.5mL去离子水，然后用石油醚萃取2次，取石油醚层，将石油醚层用无水Na2SO4干燥，干燥后过滤得滤液，将滤液减压浓缩至体积不再减少得检测样，向检测样充入氮气进行保护；
4）采用气相色谱-质谱联用仪对检测样内的脂肪酸进行测定；
5）数据分析及样品鉴定：经过步骤4）后，根据获得的原始光谱数据及质谱数据，计算检测样内各脂肪酸组分的相对含量以及绝对含量。
所述动物组织包括大脑、肝脏、肾脏、心脏、血液或肌肉组织。
所述动物组织的来源包括小鼠、大鼠、比格犬、恒河猴、猪、牛、鸡、鸭、鱼或人。
所述气相色谱的工作条件为：检测样溶于500μL正己烷后上样，进样量为1μL，进样方式为不分流，载气为流速1.5mL/min的氦气，升温程序为：初始温度为60℃，保持4min，然后以5℃/min升至150℃，然后以4℃/min升至300℃，保持5min。
所述质谱的工作条件为：采用EI源、正离子检测，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，单四级杆温度为150℃，扫描方式为全扫描方式，电子倍增器电压为1070V，溶剂延迟为3.75min。
所述相对含量采用面积归一化方法进行计算。
所述绝对含量的计算方法为：脂肪酸组分对应的峰面积与内标物峰面积的比值乘以内标物的浓度。
所述内标物包括十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸、二十一烷酸或二十三烷酸。
本发明所述气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法与传统常用的动植物、微生物油脂检测方法相比，具有以下优点：
1）本发明利用2,2-二甲氧基丙烷-浓盐酸对动物组织中脂类进行提取和皂化，将提取与皂化合并，简化了操作步骤，再利用三氟化硼甲醇溶液甲酯化获得脂肪酸甲酯，最后利用石油醚提取脂肪酸组分，检测组织的样品用量与现有技术相比显著降低，提高了检测的灵敏度，同时，每批次样品检测仅需要约2小时左右，节省了人力、物力、财力，可以达到快速检测的目的，提高了工作效率。
2）本发明可同时测定动物组织中几乎所有的脂肪酸，碳数从碳9到碳26，分子量从100到400，且对功能性的多不饱和脂肪酸（PUFA）如含有1-6和双键或三键的PUFA具有非常好的分离和定性、定量检测效果；同时，对于具有相同碳数、相同分子量，而结构不同的PUFA的同分异构体（在生理调解和体内信号转导等方面具有非常重要的作用），本方法具有独特的优势；同时，本发明可对不同样品间的脂肪酸组成及含量进行比较，应用性更广，为科研实验、临床应用及食品质量和安全监测中对动物样品脂肪酸组成及含量的快速检测提供新的思路和方法。
3）本发明采用质谱仪作为气相色谱的检测信号，与普通的FID和TCD检测器相比有两大优势：其一是灵敏度高，且没有校正因子的影响，色谱峰的峰面积真正代表了试样中脂肪酸甲酯的质量，这一优点对于未知脂肪酸的定量检测尤为重要；其二是检出限低，本发明直接检测的信号是物质的质荷比（m/z），与氢火焰离子和热导检测器相比，省去了将离子浓度（FID）或导热系数(TCD)转化为浓度的步骤，因此，不但降低了检测限，而且还缩短了响应时间。另外，本发明解决了气相色谱法（GC）定性定量分析检测脂肪酸所需标准品数量众多且价格昂贵等问题。
附图说明
图1为小鼠肝脏样品GC-MS检测的总离子流图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明，以昆明小鼠肝脏中脂肪酸的检测为例，但本发明的保护范围不局限于该实验。
本发明提供了一种基于分步一锅法提取及气相色谱-质谱联用法检测微量动物脂肪酸含量的方法，具体步骤如下：
一、样品准备
将取得的小鼠脏肝组织至于冰冻缓冲液中保存；准确称量10.00mg（±0.02mg）的肝脏组织，剪至1mm左右，然后将样品置于5mL的螺口玻璃瓶中。检测实验中该螺口玻璃瓶可替代传统的加热回流装置，其具有以下特征：体积小，所需样品量少（1-10mg），有较好的密封效果（具螺口瓶盖且耐压0.2-0.3Mpa）。
二、样品的提取、皂化及甲酯化
取10mg十七烷酸溶于石油醚（60-90），10mL容量瓶定容，配置成1mg/mL的十七烷酸石油醚溶液，作为内标物标准液；
将质量分数为37%的浓盐酸与2,2-二甲氧基丙烷按照0.02︰0.98的体积比混合得2%的浓盐酸2,2-二甲氧基丙烷溶液；
向螺口玻璃瓶内的样品中分别加入20μL质量浓度为1mg/mL的十七烷酸石油醚溶液，以及1mL浓盐酸2,2-二甲氧基丙烷溶液，然后充氮气保护、室温下于SK-I漩涡振荡器上震荡20min，震荡后用氮气将螺口玻璃瓶内的液体（反应中产生的丙酮、甲醇以及2,2-二甲氧基丙烷）吹干，吹干后向螺口玻璃瓶内加入2.5mL质量分数为13%的三氟化硼甲醇溶液，然后将螺口玻璃瓶于80-85℃水浴中加热1小时；加热结束后向螺口玻璃瓶内加入2.5mL去离子水，然后用石油醚萃取2次，取石油醚层，将石油醚层用无水Na2SO4干燥，干燥后过滤得滤液，将滤液于循环真空水泵上减压浓缩（减压浓缩条件为常温、-0.01Mpa）至体积不再减少，得检测样品，冲入氮气保护。
与其他的甲酯化方法相比，本发明采用的方法具有以下优点：a酯化时间短，相同条件下，HCl甲醇溶液反应需两小时；b反应易处理，若采用硫酸催化，因其强氧化性，则需要增加一步水洗处理；c皂化产物较少，更真实的反应脂肪酸的实际含量，相对于碱催化的酯化方法，本发明几乎没有皂化产物。
三、分离、检测
色谱：
检测采用安捷伦7890A/5975C，检测样溶于500μL正己烷后上样；
①分析柱是HP-5MS弹性石英毛细管柱（30m*0.25id*0.25um）；
②载气：氦气，流速为1.5mL/min；
③进样量1μL，可自动进样，也可手动进样，进样方式为不分流；
④进样口温度290℃，传输线温度300℃；
⑤程序升温，初始温度60℃，保持4min，以5℃/min升至150℃，然后以4℃/min升至300℃，保持5min；
质谱：
①EI源，正离子检测，电子能量为70eV；
②离子源温度230℃，单四级杆温度150℃；
③扫描方式为全扫描方式；
④电子倍增器电压1070V，溶剂延迟3.75min；
四、数据分析及处理
色谱图的保留时间和积分面积由工作站自动完成，利用NIST08谱库定性色谱峰。各脂肪酸组分的相对含量通过面积归一化法得到；绝对含量由对应的峰面积和内标物峰面积的比值乘以内标物的浓度得到。
参见图1，本检测样中可辨认的脂肪酸甲酯的峰为18个，其余峰为小分子溶剂、化合物或胆固醇等甾体。可辨认的脂肪酸甲酯及其保留时间列于表1。保留时间及峰面积用安捷伦Chemstation计算，相对含量用面积归一化的方法计算，绝对含量（mg/g组织）采用与内标物标准液脂肪酸C17:0的峰面积比获得。
表1.小鼠肝脏中脂肪酸的含量
五、准确度、精密度、重现性及稳定性实验
1.准确度实验，取浓度为1mg/mL的十七烷酸内标物标准液1mL用本发明的方法衍生化、制样；本发明的气质条件分离检测，采用NIST08软件定性。结果表明，该方法可以完全分离、鉴定十七烷酸准确度非常高。
2.精密度实验，取制备好的样品1份，按照上述方法连续进样5次，对相对峰面积大于0.5%的12个色谱峰进行分析，其相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0-0.11%和0.01%-0.38%之间，说明该方法精密度良好。
3.重现性实验，取同一批次的样品5份，按照上述方法连续进样5次。结果12个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0-0.21%和0.11%-0.38%之间，说明该方法重现性良好。
4.稳定性实验，取制备好的样品1份，分别在0、1、3、5、10、24、48h进样测定，结果12个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于1%，说明该方法在48h内测定是稳定的。
六检测限测定
取浓度为1mg/mL的十七烷酸内标物标准液，分别稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，即终浓度分别为0.1mg/mL，0.01mg/mL，0.001mg/mL，0.0001mg/mL，0.00001mg/mL，分别进样，在检出限附近，即S/N=3时，确定其检出浓度为0.00001mg/mL，说明该方法的检出限很低，是气相色谱法的10-100倍。
在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）样品准备：将10mg动物组织剪碎后得样品，将样品置于螺口玻璃瓶中；
2）提取、皂化及甲酯化：将质量分数为37%的浓盐酸与2,2-二甲氧基丙烷按照0.02︰0.98的体积比混合得浓盐酸2,2-二甲氧基丙烷溶液，向螺口玻璃瓶内的样品中分别加入20μL质量浓度为1mg/mL的内标物石油醚溶液，以及1mL浓盐酸2,2-二甲氧基丙烷溶液，然后充氮气保护下震荡20min，震荡后用氮气将螺口玻璃瓶内的液体吹干，吹干后向螺口玻璃瓶内加入2.5mL质量分数为13%的三氟化硼甲醇溶液，然后将螺口玻璃瓶于80-85℃水浴中加热1小时；
3）加热结束后向螺口玻璃瓶内加入2.5mL去离子水，然后用石油醚萃取2次，取石油醚层，将石油醚层用无水Na2SO4干燥，干燥后过滤得滤液，将滤液减压浓缩至体积不再减少得检测样，向检测样充入氮气进行保护；
4）采用气相色谱-质谱联用仪对检测样内的脂肪酸进行测定；
5）数据分析及样品鉴定：经过步骤4）后，根据获得的原始光谱数据及质谱数据，计算检测样内各脂肪酸组分的相对含量以及绝对含量；
所述气相色谱的工作条件为：检测样溶于500μL正己烷后上样，进样量为1μL，进样方式为不分流，载气为流速1.5mL/min的氦气，升温程序为：初始温度为60℃，保持4min，然后以5℃/min升至150℃，然后以4℃/min升至300℃，保持5min；
所述质谱的工作条件为：采用EI源、正离子检测，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，单四级杆温度为150℃，扫描方式为全扫描方式，电子倍增器电压为1070V，溶剂延迟为3.75min；
所述内标物为十七烷酸。
2.根据权利要求1所述一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法，其特征在于：所述动物组织包括大脑、肝脏、肾脏、心脏、血液或肌肉组织。
3.根据权利要求2所述一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法，其特征在于：所述动物组织的来源包括小鼠、大鼠、比格犬、恒河猴、猪、牛、鸡、鸭、鱼或人。
4.根据权利要求1所述一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法，其特征在于：所述相对含量采用面积归一化方法进行计算。
5.根据权利要求1所述一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方法，其特征在于：所述绝对含量的计算方法为：脂肪酸组分对应的峰面积与内标物峰面积的比值乘以内标物的浓度。
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